WO2006013921A1 - プロテアーゼ反応促進剤及び／又は色素の安定化剤を含む試薬 - Google Patents

プロテアーゼ反応促進剤及び／又は色素の安定化剤を含む試薬 Download PDF

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protease
hemoglobin
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glycated
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Takuji Kouzuma
Yoko Nagai
Shigeyuki Imamura
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Asahi Kasei Pharma Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to a protease reaction accelerator and a protease reaction promotion method.
  • the present invention also relates to a reagent and a measuring method using a protease reaction accelerator, and more specifically, to a reagent and a measuring method for measuring hemoglobin, glycoprotein or glycoprotein ratio using a protease reaction accelerator.
  • the present invention also relates to a reagent and a measuring method for quantitatively measuring hemoglobin, hemoglobin Ale, and glycated hyalbumin, which are useful for clinical examinations, accurately, simply and rapidly.
  • the present invention relates to a dye stabilizer used for detecting an enzyme reaction characterized by containing cyclodextrin, a reagent containing a cyclodextrin and a dye used for detecting an enzyme reaction, and used for detecting an enzyme reaction.
  • the present invention relates to a method for stabilizing dyes.
  • the present invention relates to a reagent and method for measuring glycoprotein or glycoprotein ratio using the dye stabilized with cyclodextrin.
  • the present invention relates to a reagent and a method for measuring a ratio of a glycated protein or a glycated protein using a protease reaction accelerator and a dye used for detecting an enzyme reaction stabilized with cyclodextrin, and is useful for clinical examination.
  • the present invention relates to a reagent and a measuring method for accurately, simply and rapidly quantifying sugar-hemoglobin, hemoglobin Ale and sugar-hycoalbumin.
  • Glycoalbumin and hemoglobin Ale can be quantified by electrophoresis, ion exchange chromatography, affinity chromatography, or immunoassay. In recent years, however, research and development have been conducted on enzyme methods that can more easily process a large amount of samples more easily (Non-patent Documents 1 and 2).
  • the most well-known enzyme method is a method for measuring a sugar amino acid or a peptide produced by degrading a glycoprotein in a sample with a protease. Even if a large amount of protease, which is generally slow, is used, it was difficult to achieve 100% protein degradation in a short time.
  • the generated hydrogen peroxide has the ability to develop and quantify the dye using varoxidase. At this time, the dye, particularly the leuco dye, has a problem that it is not stable.
  • Tetrazolium salts (Non-patent Document 2, Patent Documents 1 to 7), sulfonate compounds, and Z or -tro compounds are additives that denature the protein to be measured and accelerate the protease reaction when measuring glycoproteins.
  • a method using Patent Documents 8 and 9) is known.
  • tetrazolium salts react strongly with reducing compounds, such as glycoproteins ascorbic acid, etc., and cause coloration, so samples that contain high concentrations of glycoproteins show abnormal values in samples containing ascorbic acid. become.
  • Sulfony compounds are often used as enzyme inhibitors, and sodium lauryl sulfate, sodium dodecylbenzenesulfonate, lithium lauryl sulfate, etc., which are often used, act on sugar amino acids and / or sugar peptides. It is an inhibitor that is powerful enough to be an enzyme reaction terminator. In addition, the nitro compound is colored, causing the reagent blank to rise and the measurement accuracy to decrease.
  • DA64 N- (carboxymethylaminocarbol) -4,4-bis (dimethylamino) biphenylamine
  • Patent Literature l WO 02/27012
  • Patent Document 2 WO 02/27330
  • Patent Document 3 WO 2002/027331
  • Patent Document 4 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2000-93199
  • Patent Document 5 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2001-292795
  • Patent Document 6 Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-232789
  • Patent Document 7 WO 2000/210100
  • Patent Document 8 WO 2004/007760
  • Patent Document 9 WO 03/107011
  • Non-patent document 1 Kouzuma et.al., “Ancient method for the measurement of glycated albumin inbiological sampl” e.) ”, Clinica Chimica Acta, 2002, 324, p. 61—71
  • Non-Patent Document 2 Ikunosuke Sakurabayashiet.al.,“ New Enzymatic Atssay New clinical assay for gly catedhemoglobin, Clinic Chemistry 2003, 49th, No. 2, p. 269-274
  • Sarakuko uses a reagent useful for the measurement of clinical biochemical tests, particularly hemoglobin Ale and glycosyl albumin, and a measurement method using the same, using the protease reaction accelerator and Z or the stabilizer. It is to provide.
  • the present inventors are a protease reaction accelerator that does not act on a reducing substance and does not easily affect the enzyme activity and has no coloring, and is a protease other than a tetrazolium salt.
  • the reaction accelerator was examined.
  • the literature Korean (Kyonosuke Shinnosuke et al., Klini force chemistry, 2003, No. 49, No. 2, p. 269-274) [disclosed!] Using leuco dyes including DA64 The storage stability of reagents with the same composition was examined. It was found that the dye was remarkably colored when stored for 3 days at ° C, making measurement difficult. Therefore, it is known as a stabilizer for dyes used to detect enzyme reactions.
  • a reagent for measuring hemoglobin, glycoprotein and glycoprotein ratio characterized by using the protease reaction accelerator and Z or a stabilizer of the dye, and a method using the same, and further, We examined the usefulness of measurement reagents and methods using them for clinical biochemical tests, especially hemoglobin Ale and sugar albumin.
  • the inventors focused on selecting a compound that denatures hemoglobin or glycoprotein, changes the color of hemoglobin, and promotes the reaction of protease.
  • we selected compounds that do not affect the action of the enzyme those that do not inhibit the enzyme action, and those that do not cause the blank to rise.
  • compounds containing acetate groups, N-acyl taurine salts, or polyoxyethylene alkyls It was found that ether sulfates have a protease reaction promoting action, and furthermore, it was found that hemoglobin or glycoprotein / glycoprotein ratio can be accurately measured using them.
  • the coloring dye when the dye is left as it is incorporated, the coloring dye may be prevented from occurring.
  • a leuco dye that develops color by the action of peroxidase the dye is unexpectedly stabilized.
  • the inventors have found that the coloring reaction is sufficiently maintained.
  • the dye used for the detection of the enzyme reaction can be made more stable by coexisting catalase and lowering the concentration of the buffer, and can be further improved by using the dye stabilization method and reagent of the present invention. ⁇ More sensitive and accurate measurement of proteins I found out.
  • the present invention has found a reagent useful for clinical biochemical tests using the protease reaction accelerator and Z or the dye stabilizer, particularly for measuring hemoglobin Ale and glycosyl albumin, and a measurement method using the same. It was completed.
  • the present invention provides:
  • Protease reaction accelerator containing at least one of a compound containing an acetic acid group or a salt thereof, N-acyltaurine or a salt thereof, or polyoxyethylene alkyl ether sulfate or a salt thereof,
  • N-acylamino acid or a salt thereof is represented by the following general formula (1)
  • R 1 represents an alkyl group or a alkenyl group
  • R 2 represents an amino acid or a monovalent group obtained by removing a hydrogen atom from an amino group in an amino acid derivative.
  • a protease reaction promoter according to 2) above which is a compound represented by the following formula: or a salt thereof; [0014] 4) a protease reaction promoter according to I) and Z or ii) below in 3):
  • DR 1 is CH (CH) — (where n is an integer from 10 to 14) or heptades — 8—
  • amino acid or amino acid derivative is N-methylalanine or sarcosine
  • R 3 represents an alkyl group
  • m represents an integer of 3 to 10
  • M represents a hydrogen atom or a metal that forms a salt with carboxylic acid.
  • the protease reaction accelerator according to 2) above which is a compound represented by
  • the reaction is promoted by coexisting at least a protease and a protease reaction accelerator.
  • a protease reaction promoter characterized by increasing the protease reaction rate by a factor of 1.5 or more.
  • a reagent comprising the protease reaction accelerator according to any one of 1) to 7) above,
  • the reagent according to 8) or 9) above which comprises a protease stabilizer and a stabilizer for an enzyme that acts on Z or a glycated amino acid and / or glycated peptide,
  • Protease and hemoglobin j8 chain as the first reagent, and glycamino amino acid that does not form from the terminus and zymoamino acid that eliminates Z or glycine peptide and enzyme that acts on Z or glycine peptide The glycated amino acid produced from the hemoglobin ⁇ chain terminus and the saccharide or amino acid that detects the saccharide or glycine peptide and the enzyme that acts on the moth or glycine peptide.
  • a kit having the ability of the first reagent and the second reagent is characterized in that the protease and catalase are contained in the same reagent and the catalase is contained, but the reagent contains azido sodium. Reagents as described in 8) to 18) above,
  • a synthetic peptide selected from glycated valylhistidine, glycated valylhistidyl leucine, glycated valyl histidyl oral isylthreonine, and glycated valylhistidyl oral isylthreonylproline at a known concentration as a calibrator
  • the hemoglobin Ale concentration in the sample is calculated based on the measured value using this, and then the hemoglobin Ale value (%) is calculated by simultaneously dividing it by Z or the total hemoglobin concentration measured separately. It relates to the calculation method of Ale value (%).
  • the present invention is particularly useful for the purpose of accurately, simply, rapidly and inexpensively quantifying hemoglobin, glycoprotein and glycoprotein ratio in blood samples using enzymes.
  • the present invention relates to a protease reaction accelerator, a protease reaction promotion method, a reagent containing the protease reaction accelerator, and a method for measuring the proportion of hemoglobin, glycoprotein or glycoprotein.
  • a reagent in which the protease reaction promoter described in 1) above is added to the reagent used in the method for continuously measuring glycated protein using the same reaction tank, and a measuring method using the reagent About.
  • the ratio of glycated protein is usually measured separately in terms of protein and glycoprotein, and the present inventors separately measure these separately in the same reaction vessel. (See JP 2001-204495, etc.). If the method and the protease reaction accelerator of the present invention are combined, it becomes possible to measure more quickly and accurately. This combination is also the present invention.
  • the present invention also provides:
  • a dye stabilizer used for detection of enzyme reaction characterized by containing cyclodextrin,
  • the dye used to detect the enzyme reaction is colored by the action of peroxidase 30) to 32) V above, characterized in that it is a dye,
  • the coloring power generated by the action of peroxidase The stabilizing agent according to the above 33), characterized in that it is a leuco dye.
  • Glycoprotein is Glycoalbumin, Glycohemoglobin, or Hemoglobin Ale, and Glycoprotein ratio is Glycoalbumin, Glycohemoglobin, or Hemoglobin Ale 43) the method described above,
  • the present invention provides a method for stabilizing a dye used for detection of an enzymatic reaction and a method for stabilizing the dye.
  • the present invention relates to a defined reagent, and in particular to a reagent and a measuring method for quantifying the sugar protein and sugar protein ratios in a blood sample accurately, simply, rapidly and inexpensively. The invention's effect
  • the reagent containing the protease reaction accelerator of the present invention has the effect of being able to perform the measurement accurately, simply and quickly by adding it to the glycated protein and glycated protein ratio measuring reagent. It has the effect of making it possible to provide a large amount of measurement reagents at low cost.
  • a dye stabilizer for use in the detection of an enzyme reaction, a method for stabilizing the dye, a reagent containing the dye that has excellent storage stability during distribution, and saccharification using the same. It is possible to provide a method for measuring the ratio of protein and glycated protein and a reagent for measurement.
  • the reagent including the protease reaction accelerator of the present invention and the dye stabilizer used for detecting the enzyme reaction accurately, conveniently, and rapidly quantifies hemoglobin, hemoglobin Ale, and glycoalbumine, which are useful for clinical examinations. It is possible to provide a reagent that has excellent storage stability during distribution.
  • any protease reaction promoter can be used as long as it promotes the protease reaction, is not affected by the reducing substance, does not simultaneously inhibit the activity of the enzyme used, and does not cause blanks. Even if an anionic surfactant is preferred, a compound containing an acetate group or a salt thereof, N-acyl taurine or a salt thereof, polyoxyethylene alkyl ether sulfate or a salt thereof is more preferable.
  • a composition containing at least one protease reaction accelerator that can be used in the present invention can be used as a reagent for promoting protease reaction.
  • N-acyl amino acid or a salt thereof N-acyl amino acid or a salt thereof, an alkyl ether carboxylic acid or a salt thereof, a betaine acetate type amphoteric surfactant, or an imidazoline type amphoteric surfactant is preferred.
  • N-acyl amino acid or a salt thereof, an alkyl ether carboxylic acid or a salt thereof is more preferable.
  • N-acyl amino acid or a salt thereof is particularly preferable.
  • alkyl ether carboxylic acids or salts thereof are very preferred.
  • the compound containing an acetic acid group is free of carboxylic acid, and the salt thereof may be any salt as long as it is a salt of carboxylic acid and a metal ion forming the salt.
  • N-amino acid or a salt thereof that can be used in the present invention includes the following general formula (1):
  • R 1 represents an alkyl group or a alkenyl group
  • R 2 represents an amino acid or a monovalent group obtained by removing a hydrogen atom from an amino group in an amino acid derivative.
  • R 1 is an alkyl group or a alkenyl group.
  • R 1 a linear or branched alkyl group having 11 to 15 carbon atoms is preferred, and a linear chain having 11 to 11 carbon atoms is preferred.
  • alkyl groups i.e., CH (CH)-(where n is an integer from 10 to 14).
  • alkenyl group having 11 to 15 carbon atoms, preferably a straight chain carbon number 17 or a 19 alkenyl group is more preferable a straight chain carbon number 17
  • the alkenyl group is particularly preferred.
  • the number of double bonds 2 or 1 is preferable, and 1 is particularly preferable. That is, a single C H or a single C H group is particularly preferred. Double bond
  • R 1 is CH (CH) — (where n is an integer from 10 to 14) or heptades — 8
  • a heptades 8-enyl group which is preferably a-group.
  • CH (CH) — (where n is an integer of 10 to 14) may be preferable, and CH (CH
  • R 2 is a monovalent group obtained by removing an amino group or an amino group in an amino acid derivative from a hydrogen atom.
  • the monovalent group portion obtained by removing the hydrogen atom from the hydrogen atom is the same as CO in the general formula (1).
  • the amino acid or amino acid derivative may be any compound having an amino group and a carboxylic acid group, but a standard amino acid or a derivative thereof is preferred.
  • Non-polar side chain amino acids are preferred as standard amino acids.
  • Specific examples are glycine, alanine, norine, leucine, isoleucine, methionine, proline, phenylalanine, and tryptophan.
  • ⁇ Glycine which is more preferable to phosphorus or alanine is most preferable.
  • N-alkyl substitution product of a standard amino acid is preferred, and an N-methyl substitution product is preferred.
  • sarcosine is preferred, with N-methylalanine or sarcosine being preferred. In another embodiment, N-methylalanine may be preferable.
  • the compound represented by the general formula (1) is preferably a free form or a salt thereof.
  • the metal that forms a salt may be any metal that forms a salt with a carboxylic acid, and examples thereof include lithium, sodium, potassium, magnesium, calcium, norium, and cesium.
  • the metal forming the salt is particularly preferably lithium, sodium, potassium, magnesium, sodium preferred for strength or sodium more preferred for potassium.
  • potassium may be preferable as another aspect.
  • a free form is also preferable as the compound represented by the general formula (1).
  • Specific examples of the compound represented by the general formula (1) include cocoyl sarcosine sodium, lauroyl sarcosine, lauroyl sarcosine sodium, lauroyl sarcosine potassium, myristyl sarcosine sodium, palmitoyl sarcosine sodium, oleoyl Preferred examples include sarcosine or sodium lauroylmethylalanine, cocoyl sarcosine sodium, myristoyl sarcosine sodium, palmitoyl sarcosine sodium
  • lauroylmethylalanine sodium is a more preferred example, and lauroylmethylalanine sodium is the most preferred example.
  • the compound represented by the general formula (1) can be synthesized by a known method.
  • commercially available long chain fatty acid R 1 —COOPER 1 is as defined above
  • commercially available amino acids It can be obtained by reacting noic acid R 2 — H (R 2 is as defined above) under known peptide conditions.
  • R 2 is as defined above
  • a commercial product can be used, for example, Also available from Nikko Chemical Co., Ltd. These can also be used after being made rubonic acid-free or salted with metal as necessary.
  • alkyl ether carboxylic acid or a salt thereof may be represented by the following general formula (2)
  • R 3 represents an alkyl group
  • m represents an integer of 3 to 10
  • M represents a hydrogen atom or a metal that forms a salt with carboxylic acid.
  • Preferred is a compound represented by
  • R 3 is an alkyl group.
  • a linear or branched alkyl group having 11 to 12 carbon atoms which is preferably a linear alkyl group having 11 to 12 carbon atoms, that is, CH ( CH 2) ⁇ (where Q is 10 or 11) is particularly preferred.
  • R 3 is preferably CH (CH 3 ) —. Yet another embodiment is CH (CH) —
  • n is an integer of 3-10. As m, 3 to 10 children, 3, 6, and 10 are preferable 6, and 10 is more preferable 6, and 6 is particularly preferable. Further, as another aspect, it is also preferable that it is 10.
  • M represents a hydrogen atom or a metal that forms a salt with a carboxylic acid.
  • the metal that forms a salt may be any metal that forms a salt with a carboxylic acid, and examples thereof include lithium, sodium, potassium, magnesium, calcium, sodium, and cesium.
  • M is particularly preferably a hydrogen atom, sodium, or sodium, more preferably a hydrogen atom, lithium, sodium, potassium, magnesium, or calcium.
  • a hydrogen atom may be preferable.
  • potassium may be preferred.
  • Specific examples of the compound represented by the general formula (2) include polyoxyethylene (3) sodium tridecyl ether acetate, polyoxyethylene (6) sodium tridecyl ether acetate, polyoxyethylene (3) tridecyl Ether acetic acid, polyoxyethylene (7) tridecyl ether acetic acid, polyoxyethylene (4.5) sodium lauryl ether acetate, polyoxyethylene (4.5) lauryl ether acetic acid, polyoxyethylene (10) sodium lauryl ether, or poly A suitable example is oxyethylene (10) lauryl ether acetic acid.
  • Polyoxyethylene (3) sodium tridecyl ether acetate, polyoxyethylene (6) sodium tridecyl ether acetate, or polyoxyethylene (10) lauryl ether acetic acid are particularly preferred examples.
  • the compound represented by the general formula (2) can be synthesized by a known method.
  • the compound represented by the general formula (2) can be a commercially available product, for example, Nikko Chemical Co., Ltd. can be obtained and used. These can be used after making free from carboxylic acid or salting with a metal as required.
  • N-acyltaurine or a salt thereof usable in the present invention includes N-cocoylmethyltaurine sodium, N-lauroylmethyltaurine sodium, N-myristoylmethyltaurine sodium, N-palmitoylmethyltaurine sodium, or N -Stearoyl methyl taurine sodium, etc.
  • N-lauroyl methyl taurine sodium, or N-steayl methyl taurine sodium is a particularly suitable example. Any compound can be used as long as it is N-acyl taurine or a salt thereof. It is also possible to use free N-acyl taurine.
  • N-acyl taurine or a salt thereof that can be used in the present invention can be synthesized by a known method. For example, it can be obtained by reacting commercially available taurine with a commercially available acylating agent.
  • N-acyltaurine or a salt thereof that can be used in the present invention can be a commercially available product, for example, Nikko Chemical Co., Ltd. can also obtain and use it. These can be used by making them carboxylic acid-free or chlorinating with metals as needed.
  • polyoxyethylene alkyl ether sulfuric acid or a salt thereof usable in the present invention includes polyoxyethylene (2) sodium lauryl ether sulfate, polyoxyethylene (3) sodium lauryl ether sulfate, polyoxyethylene (4 ) Sodium lauryl ether sulfate, polyoxyethylene (2) Triethanolamine lauryl ether sulfate, polyoxyethylene (4) Triethanolamine lauryl ether sulfate, polyoxyethylene (3) alkyl Examples thereof include sodium ether sulfate, polyoxyethylene (3) sodium alkyl ether sulfate, and polyoxyethylene (4) sodium sodium sulfate ether sulfate.
  • a particularly suitable example is lauryl ether triethanolamine sulfate or polyoxyethylene (3) alkyltriethanolamine triethanolamine.
  • Any compound can be used as long as it is a polyoxyethylene alkyl ether sulfate or a salt thereof. You can also use polyoxyethylene alkyl ether sulfuric acid, which is free of charge.
  • the polyoxyethylene alkyl ether sulfuric acid or a salt thereof that can be used in the present invention can be a commercially available product, and can be obtained and used by Nikko Chemical Co., Ltd., for example.
  • cocoyl sarcosine sodium myristoyl sarcosine sodium, palmitoyl sarcosine sodium, lauroyl methylalanine sodium
  • any concentration may be used as long as the effect of the protease on the protein is increased.
  • the lower limit is usually 0.01% or more, preferably 0.05%. Or more, most preferably 0.1% or more.
  • the limit is 50% or less, preferably 40% or less, and most preferably 30% or less.
  • the protease reaction promoter of the present invention may be any which accelerates the protease reaction rate by 1.25 times or more, but preferably 1.5 when used for the measurement of hemoglobin Ale. It is more than twice, more preferably more than twice, and most preferably more than 2.5 times. When used for the measurement of glycated albumin, protease is likely to act, so it is only necessary to obtain a rate of 1.5 times or more.
  • Example 1 The method of Example 1 was used to confirm the degree of promotion of the protease reaction.
  • the hemoglobin Ale value was high, the sample was low! It is better to calculate how many times the difference in absorbance of the sample is when no reaction accelerator is added (control).
  • a control a test solution in which a saccharide such as sorbitol, for example, is added instead of the reaction accelerator may be used.
  • the sample When screening for a protease reaction promoter for albumin, the sample may be replaced with a sample having a high glycated albumin level, a sample with a low level, and a sample.
  • the substance produced as a result of the protease reaction in which the protease and the protease reaction promoter in the present invention coexist at least is a sugar amino acid, a glycated peptide, an amino acid, a peptide, etc.
  • a sugar amino acid or a glycated peptide is used, and a method for measuring a product resulting from the reaction of the protease that has been promoted by coexisting at least a protease and a protease reaction accelerator includes, for example, hemoglobin Ale and sugar albumin Can be used for other measurement methods.
  • any protease can be used as long as it effectively acts on a glycoprotein and effectively produces a glycoprotein and Z or glycopeptide derived from the protein.
  • suitable proteases are It is done.
  • Suitable examples of proteases derived from microorganisms belonging to the genus Bacillus include subtilisin meta-protease.
  • glycosylate protein to be measured is glycosylate albumin
  • a protease derived from microorganisms belonging to the genus Bacillus and Streptomyces is preferred because it has a large effect on human albumin.
  • Proteases such as Subtilisin, Protease—Type VIII, — IX, — X, —XV ⁇ XXIV, XXVII, — XXXI (above Sigma), Thermolysin, Nagase (Nagarse) Kojun Pharmaceutical Co., Ltd.), Orientase 90N, 1 10NL, 1 22BF, 1 Y, 1 5BL, Nucleicin (above Hankyu Bioindustry), Pro Leather, Protease—N, —NL, —S “Amano” (Above Amano Pharmaceutical Co., Ltd.), GODO—BNP, —BAP (purified from the above joint sake company), Protin A, —P, Deskin, Devilais, Biosouk, Samoaze (above) (Kawasei Co., Ltd.), Toyoteam NE P (Toyobo Co., Ltd.), Neutase, Esperase, Sabinas
  • glycoprotein ⁇ to be measured is hemoglobin Ale
  • proteases derived from the genera Bacillus, Aspergillus, Streptomyces, Trityratium, and Lysobacter have an effect on human hemoglobin.
  • a protease derived from Rhizopactor is preferred, and a protease derived from the genus Nottilis, Aspergillus, Streptomyces, and Trityratium is more preferred.
  • Preferred specific proteases include, for example, thermolysin derived from Bacillus thermoproteolyticus Rokko, Samoaze (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.), Toyoteam NEP (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), Bacillus sp. Protease derived from Bacillus sp. (Bacillus sp. ASP-842 FERM BP-08641), Lysobacter enzymogenes (Lysobacter
  • Thermolysin particularly preferred is a thermolysin and a protease derived from Rhizopacter zymogenes.
  • a protease derived from Rhizopathogen zymogenes is particularly preferred.
  • the activity of the protease that can be used in the present invention was measured using the casein forin method.
  • the glycated ⁇ -chain N-terminal force of glycated hemoglobin or a fragment thereof is also glycated and glycated ⁇ -terminal glycans without substantially cleaving the amino acid and Z or glycated peptide.
  • the enzyme substrate specificity for cleaving amino acids and ⁇ or glycopeptides can be confirmed using the method described in WO 2004/104203 or 2003-344052.
  • a glycation peptide having 5 residues of ex chain ⁇ end and ⁇ chain ⁇ end of hemoglobin is used, and a glycopeptide such as glycated valyl at the j8 chain ⁇ end is used.
  • Any protease may be used as long as it produces only histidine, glycated valyl histidyl leucine, glycated valyl histidyl oral isyl threonine, and does not produce glycated noryl leucine, glycated valyl leucyl serine, or glycated valyl leucyl seryl proline.
  • glycated valyl histidyl para-diamide is used by using glycated valyl histidyl para-tro-lide and glycated valyl leucyl para nitro dilide. As long as troanilide only liberates para ditroa dilin.
  • Examples of the enzyme that acts on a saccharide amino acid and / or saccharide peptide that can be used in the present invention include: Any enzyme can be used as long as it effectively acts on the glycated amino acid and Z or glycopeptide produced from the glycated protein by the action of the protease and can substantially measure the glycoprotein.
  • examples thereof include glycated amino acids and sugars or amino acids that act well on peptides in which ⁇ or ⁇ -amino groups are glycated, and enzymes that act on ⁇ or glycopeptides.
  • an oxidase that has been extensively studied, such as dehydrogenase, oxidase, and kinase is preferable.
  • Examples of enzymes that act on glycated amino acids and / or glycosylation peptides that act well on glycated amino acids and ⁇ or glycated peptides of ⁇ amino groups include Gibberella. (Gibberella) genus, Aspergillus genus, Candida genus, Penicillium genus, Fusarium genus, Acremonium genus, or Debaryomyces genus oxidase Etc.
  • a recombinant ketamine amidase (KAOD; manufactured by Asahi Kasei Pharma; Clinica Chimica) Acta, 2002, 324, p. 61-71) and mutant KAOD (KAOD-V; manufactured by Asahi Kasei Pharma Co., Ltd .; WO 02/27330, which has significantly reduced sugar valine reactivity.
  • KAOD-V mutant KAOD
  • a transformed microorganism JM109 ′ pcm FOD5 (FERM BP-7848) containing the described FOD gene.
  • the activity of enzymes acting on glycated amino acids and Z or glycated peptides was measured by the method described in the literature (Clinia Chimica Acta, 2002, 324, p. 61-71).
  • Examples of enzymes that act on glycated amino acids and / or glycated peptides that act well on amino acids and glycated amino acids on which an aamino group is glycated are exemplified by corynebacteria ( Corynebacterium) -derived oxidase, the above-described genetically modified ketoamine oxidase (KAOD; manufactured by Asahi Kasei Pharma; described in Clinica Chimica Acta, 2002, 3 24, p.
  • corynebacteria Corynebacterium
  • KOD genetically modified ketoamine oxidase
  • glycation useful for measuring hemoglobin Ale Stefirum, Neocosmosbola, Akaetomyum, Etomyum, Konioe Eta, Koniocaetizum, and Arsulinum, which are more active on glycated valylhistidine than valylleucine And enzymes derived from the genus Pyrenoketa, Leptosperia, Preospora, Ophiobora, Carbaria, and Forma.
  • an enzyme that acts on a glycated valylhistidine and / or a glycated valylhistidine that is more useful than glycated valylleucine which is useful for measuring hemoglobin Ale, Strain, Neocosmospora vasinfecta; IFO7590 strain, Neocosmospora vasinfecta as described in WO 2004/104203.
  • an enzyme derived from a carbularia 'clavater YH923 (Curvulalia clavata FERM BP-10009) is most preferable.
  • the substrate specificity can be confirmed by confirming its action using glycated valylhistidine and glycated valylleucine as substrates.
  • any substance that suppresses a decrease in protease activity during storage of the reagent may be used. In particular, during storage of the reagent in a liquid state. Any substance that suppresses the decrease in protease activity is preferred.
  • preferred protease stabilizers include dimethyl sulfoxide, alcohol, calcium, sodium chloride, quaternary ammonium salts and quaternary ammonium salt type cationic surfactants. It is done.
  • alcohols include ethanol, propanol, ethylene glycol, glycerin and the like.
  • Examples of quaternary ammonium salt type cationic surfactants include triethanolamine lauryl sulfate, salt lauryl trimethyl. Ammoum etc.
  • the protease stabilizer may be used at any concentration that suppresses the decrease in protease activity during storage of the reagent.
  • the reagent may be stored in a liquid state.
  • U if it is a concentration that suppresses the decrease in protease activity.
  • the preferred concentration is, for example, when DMSO is added as a stabilizer, the lower limit concentration is 5% or more, preferably 10% or more, and the upper limit concentration is 50% or less, preferably 40% or less. What is necessary is just to add.
  • a stabilizer for an enzyme acting on a sugar amino acid and / or a sugar peptide that can be used in the present invention, it acts on at least a sugar amino acid and / or a sugar peptide during storage of the reagent.
  • Any substance that suppresses the decrease in enzyme activity may be used.In particular, during the storage of the reagent in the liquid state, it suppresses at least the decrease in the activity of enzymes that act on saccharide amino acids and Z or saccharide peptides. If it is a substance, it is preferable.
  • sugar alcohols sucrose, magnesium, calcium, ammonium sulfate, amino acids, sarcosine are listed as examples of enzyme stabilizers that act on sugar amino acids and Z or glycopeptides.
  • sugar alcohols include sorbitol, mannitol, trehalose, glycerin and the like.
  • amino acids all amino acids have a strong stabilizing effect.
  • proline, dartamic acid, alanine, norin, glycine, lysine and the like are more preferable.
  • the use concentration of these glycated amino acids and enzyme stabilizers acting on Z or glycated peptides is such that the enzyme activity acting on glycated amino acids and Z or glycated peptides decreases during storage of the reagent.
  • Any concentration that suppresses the activity of the enzyme that acts on sugar amino acids and Z or glycopeptides during storage in the liquid state is particularly acceptable. If there is, it is preferable.
  • concentration for example, sorbite
  • the lower limit concentration is 0.1% or more, preferably 0.2% or more
  • the upper limit concentration is 30% or less, preferably 20% or less.
  • the stability of the reagent in the present invention can be determined, for example, as follows.
  • the liquid reagent is stored refrigerated (2-10 ° C), preferably at 4 ° C for 6 months (alternatively, the conditions for storage at 37 ° C for 4 days may be substituted).
  • glycated albumin or hemoglobin Ale or glycated hemoglobin
  • serum or hemolyzed blood As a sample, compare the concentration of the reagent before storage with the reagent after storage. It is very preferable that the difference is less favorable.
  • the method for promoting protease reaction using the protease reaction accelerator of the present invention is very useful.
  • Examples of the dye used for detection of the enzymatic reaction that can be used in the present invention include coenzymes, tetrazolium salts, Trinder reagents, leuco reagents, and the like. Particularly preferred are leuco-type reagents that are more preferred to dyes that develop color by the action of peroxidase, such as Trinder reagent and leuco-type reagent.
  • a coenzyme such as NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide), or -trotazolam blue, tetrazolium blue, 2- (4- 3-(4--Trophenyl) 5-(2, 4 Disulfophenyl) 2H-Tetrazolium: WST-1, 2-(4 Cordhoeel)-3 (2, 4-Di-Trophe) -L) —5 (2, 4-Disulfophenol) — 2H—Tetrazolium: WST-3, 2- (2-Methoxy-1-tetraphenyl) 3— (4 Nitrophenol) 5— (2, 4 Disulfophenol) 2H-tetrazolium: Various tetrazolium salts represented by WSR-8 (manufactured by Doujin Chemical Laboratory Co., Ltd.) can be used.
  • N- (3-sulfopropyl) aniline sodium 1 water HLPS
  • HDAOS N-ethyl N— (3-sulfopropyl) -3,5 dimethoxy-phosphate sodium 1 water
  • DAPS N-ethyl-N— (2 hydroxy-3-sulfopropyl) -3,5-dimethoxy-phosphate sodium
  • DAOS hydroxy-3-sulfopropyl
  • DAOS hydroxy-3-sulfopropyl
  • DAOS hydroxy-3-sulfopropyl
  • DAOS
  • any dye may be used.
  • N- (carboxymethylaminocarbol) -4,4-bis (dimethylamino) is readily available.
  • SAT-3 3, 3, 5, 5, 5, tetratetrabenzidine (TMBZ), N— (3-sulfopropyl) 3, 3 ', 5, 5, monotetramethylbenzidine' Na (TMBZ-PS ), N, ⁇ ', ⁇ ', ⁇ ", , ,, monohexa (3-sulfopropyl) -4, 4 ', 4"-triaminotrifluoromethane' 6Na (T PM-PS) (manufactured by Doujin Chemical Laboratory Co., Ltd.).
  • any substance may be used as long as it improves the stability of the dye, but cyclodextrin is preferred. Any cyclodextrin may be used as long as it provides the effect of stabilizing the dye used for detecting the enzyme reaction.
  • ⁇ -cyclodextrins, ⁇ -cyclodextrins, and ⁇ -cyclodextrins can be mentioned, and 13-cyclodextrins and ⁇ -cyclodextrins are preferred, and j8-cyclodextrins are particularly preferred.
  • Examples of a-cyclodextrins include a-cyclodextrins.
  • Examples of y-cyclodextrins include ⁇ -cyclodextrin and carboxymethyl- ⁇ -cyclodextrin, and ⁇ -cyclodextrin is preferred, but carboxymethyl mono- ⁇ -cyclodextrin may be preferred.
  • Examples of cyclodextrins include ⁇ -cyclodextrin, carboxymethyl-13-cyclodextrin, dimethyl-13-cyclodextrin, monoamino-13-cyclodextrin, 2-hydroxypropyl-1- ⁇ -cyclodextrin, methyl-13-cyclodextrin.
  • 2-Hydroxypropyl mono- ⁇ -cyclodextrin and methyl 1 / 3-cyclodextrin are preferred 2-hydroxypropyl 13-cyclodextrin is particularly preferred. In some cases, methyl-j8-cyclodextrin is highly preferred.
  • cyclodextrin a-cyclodextrin, j8-cyclodextrin, ⁇ -cyclodextrin, carboxymethyl-1- ⁇ -cyclodextrin, carboxymethyl-1-beta-cyclodextrin, dimethyl-1-beta-cyclodextrin, monoamino-1- ⁇ - Cyclodextrin (available from Sigma Co., Ltd.), 2-hydroxypropyl mono- ⁇ -cyclodextrin or methyl- ⁇ -cyclodextrin (available from Nippon Food Processing Co., Ltd.) 2-hydroxypropyl— 13-cyclodextrin, methyl- ⁇ -cyclodextrin is more preferred 2-hydroxypropyl mono- ⁇ -cyclodextrin is particularly preferred. In some cases, methyl- ⁇ -cyclodextrin is highly preferred.
  • the cyclodextrin can be used as a stabilizer for a dye used for detecting an enzymatic reaction.
  • cyclodextrin can be used to stabilize the dye used for detecting the enzyme reaction.
  • stabilization of dyes used to detect enzyme reactions Cyclodextrins can be used to produce the reagents.
  • the concentration of the dye used to detect the enzyme reaction can be used as long as the color is sufficiently maintained during storage of the reagent.
  • the reagent can be used in a liquid state during refrigerated storage. It is preferable if the color density is sufficiently maintained.
  • the concentration is preferably 1 ⁇ or more, preferably 2 ⁇ or more, and the upper limit is lOO mM or less, preferably 50 mM or less.
  • the concentration of cyclodextrin used may be any concentration that suppresses the deterioration of the dye used to detect the enzyme reaction during storage of the reagent.
  • the deterioration of the dye may occur during storage of the reagent in the liquid state. It is preferable if the concentration is to be suppressed.
  • the concentration for example, when methyl ⁇ -cyclodextrin is added as a stabilizer, the lower concentration is 0.5% or more, preferably 1.0% or more, and the upper concentration is 50% or less. Add it at a concentration of preferably 40% or less.
  • soot buffering agents include Good's buffering agents, such as 3- [4 mono (2-hydroxyethyl) -1-piperadul] propanesulfonic acid. (EPPS), 2- [4- (2 Hydroxyethyl) -1-piperadul] ethanesulfonic acid (H EPES), 2-hydroxyl 3- [4- (2-hydroxyethyl) 1-piperadur] Propanesulfonic acid (HEPPSO), N— (2-acetamido) — 2-aminoethanesulfonic acid (ACES), N— (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA), N, N bis (2-hydroxyethyl) — 2-Aminoethanesulfonic acid (BES), N, N Bis (2-hydroxyethyl) glycine (Bicine), Bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane (Bis-Tris), N cyclohex
  • buffers having a buffering action near neutral pH such as EPPS, HEPES, HEPPSO, ACES, ADA, BES, Bicine, Bis-Tris, CHES, DIPSO, MES, MOPS, MOPSO, PIPES, POPSO, TAPS, TAPSO, TES, Tricine, Tris, ACES, ADA, boric acid, ammonia, glycine, phosphoric acid, diethanolamine, p-phenolsulfonic acid, 2 amino-2-methylpropane-1, 3, Diol, strong codylic acid, citrate, maleic acid, veronal, 3,3-dimethyldaltaric acid and the like, most preferably 3,3-dimethyldaltaric acid.
  • the reagent used for the detection of the enzyme reaction of the present invention in a stabilized state includes at least the dye stabilizer used for the detection of the enzyme reaction of the present invention and the detection of the enzyme reaction. If it is a reagent containing the pigment
  • catalase be allowed to coexist with the reagent of the present invention.
  • the meaning of coexisting catalase is to eliminate peroxyhydrogen generated during storage and to suppress the color development of the dye during storage as much as possible.
  • any enzyme having catalase activity may be used.
  • an enzyme derived from Aspergillus niger, an enzyme derived from cattle liver is preferred.
  • -Gur-derived enzymes are particularly preferred.
  • an enzyme derived from bovine liver may be particularly preferable. Enzymes derived from Aspergillus niger and cattle liver are available from Sigma.
  • V is a reagent and a measuring method for measuring hemoglobin using the protease reaction accelerator of the present invention.
  • a reagent containing an acetic acid group or a salt thereof, N-acyl taurine or a salt thereof, or a polyoxyethylene alkyl ether sulfate or a salt thereof and a measurement method using the reagent are preferred.
  • a reagent containing the N-acylamino acid or a salt thereof, or an alkyl ether carboxylic acid or a salt thereof as a compound containing an acetic acid group or a salt thereof, and a measurement method using the reagent are particularly preferred.
  • concentration of these protease reaction promoters any concentration may be used as long as hemoglobin can be measured.
  • the lower limit is usually 0.01% or more, preferably 0.05% or more, and most preferably. It is 0.1% or more, and the upper limit is 50% or less, preferably 40% or less, and most preferably 30% or less.
  • 0.001 to 0.5 ml of a test solution is added to the hemoglobin quantification reagent and reacted at a temperature of 37 ° C. Measure the color tone (absorbance)! For example, the color of hemoglobin is 200 ⁇ !
  • the absorbance may be measured at ⁇ 1000 nm, preferably 280 nm to 800 nm.
  • the amount of hemoglobin in the test solution can be determined by comparing with the change in absorbance when measured using a known concentration of hemoglobin.
  • reagents for measuring glycoproteins examples include the protease reaction promoter of the present invention and the dye stabilizer used for the detection of enzyme reactions typified by Z or cyclodextrin of the present invention. Any reagent can be used as long as it is a reagent used to measure glycoprotein, but a reagent containing the aforementioned protease and an enzyme that acts on a glycoprotein and / or glycopeptide is preferred.
  • Proteases and enzymes that act on sugar amino acids and / or glycated peptides may be formulated in the same solution, but protease reagents that contain protease, enzymes that act on sugar amino acids and / or peptides, Protease reaction accelerators that preferably use reagents that also include detection reagent power may be used, but it is sufficient that the protease reaction accelerator exists when the protease acts on the glycoprotein or in advance. .
  • Protease stabilizers are included in reagents containing proteases, and enzymes that act on sugar amino acids and / or peptides are included. It is more preferable to add a glycated amino acid and / or an enzyme stabilizer that acts on the glycated peptide to the reagent.
  • the dye used for detecting the enzyme reaction and the dye stabilizer used for detecting the enzyme reaction typified by the cyclodextrin of the present invention are allowed to coexist with catalase, and baroxidase is added to another reagent for measurement. More preferably, it is sometimes mixed. This is a force that, when the dye and peroxidase coexist, the reaction may progress during storage and color may develop.
  • the pH, buffer and protease concentration are determined so that the proteolytic reaction proceeds efficiently, and then the protease reaction accelerator, protease stabilization
  • the agent should be prepared appropriately and added to an effective concentration.
  • any buffering agent may be used as long as it does not affect the stability of the dye used for detecting the enzyme reaction. That's right. It is important to set the concentration to be used as the buffer concentration at the time of measurement.
  • the upper limit of the buffer concentration at the time of measurement is 80 mM or less, more preferably 50 mM or less, and the lower limit is O.lmM or more. Preferably, it may be ImM or higher.
  • the protein is hemoglobin and the measurement target is sugar hemoglobin or hemoglobin Ale
  • the proteolytic activity power 3 ⁇ 4H6.0 to 9.0 Because of the strongness in the vicinity, it is preferable to select pH 6.0-9.0 for the reaction pH!
  • the lower limit of the protease concentration is not less than lOU / ml, preferably not less than lOOU / ml, as long as it is a concentration capable of sufficiently degrading the protein in the test solution during the reaction time actually used. Most preferably, it is 500 U / ml, and the upper limit is 1.0 X 106 U / ml or less, preferably 5.0 X 10 5 U / ml or less, and most preferably 3.0 X 105 U / ml or less.
  • the protease reaction accelerator is the protease reaction accelerator of the present invention! May be used.
  • the concentration used may be any concentration as long as it effectively denaturates the protein and increases the action of the protease on the protein.
  • the lower limit is usually 0.01% or more, preferably 0.05% or more.
  • the upper limit is most preferably 0.1% or more, and the upper limit is 50% or less, preferably 40% or less, and most preferably 30% or less.
  • the concentration of the protease used as a stabilizer may be any concentration that exhibits stable reagent performance for 6 months when stored in a refrigerated state in liquid form.
  • dimethyl sulfoxide may be used.
  • the lower limit is usually 1% or more, preferably 5% or more, and the upper limit is 60% or less, preferably 50% or less.
  • any concentration can be used as long as the concentration of the dye used for detecting the enzyme reaction becomes unstable so that hydrogen peroxide and the like can be eliminated.
  • the derivatization of the enzyme acting on the glycated amino acid and / or glycated peptide to be used is used. Select the pH so that the reaction proceeds efficiently considering the appropriate pH, and determine the amount of enzyme that acts on the glycated amino acid and / or glycopeptide.
  • catalase is used as an enzyme stabilizer or protease reagent that acts on peroxidase, sugar amino acids and / or glycopeptides, add azide such as sodium azide to stop the action. Good.
  • the protein is albumin and the measurement target is sugar albumin
  • the KAOD or KAOD-V manufactured by Asahi Kasei Pharma
  • the region force showing the above activity is as wide as 3 ⁇ 4H6.5-10, it is preferable to select the pH of the reaction as 6.5-10.
  • the pH of the reaction is 6.5-10.
  • the reaction pH is preferably 6.0 to 10!
  • any concentration can be used as long as the concentration of the glycoprotein can be measured.
  • the lower limit is 0.5 U / ml or more, preferably 1U / ml or more, and the upper limit is 1000 U / ml or less, preferably 500 U / ml or less.
  • the peroxidase concentration any concentration can be used as long as hydrogen peroxide generated from the measurement system can be measured.
  • the lower limit is usually 0.01 U / ml or more, preferably 0.1 lU / ml or more.
  • the upper limit is lOOU / ml or less, preferably 50 U / ml or less.
  • the concentration of the enzyme stabilizer that acts on the glycine amino acid and / or glycine peptide may be any concentration as long as the reagent performance is stable for 6 months when stored in a refrigerated state in a liquid state.
  • the lower limit is usually 0.1% or more, preferably 1% or more, and the upper limit is 30% or less, preferably 20% or less.
  • any concentration may be used as long as the force tarase activity is sufficiently stopped.
  • the concentration used in the case of using sodium azide is usually 0.01% or more, preferably 0.05% or more, and the upper limit is 10% or less, preferably 5% or less.
  • the detection of the action is performed using, for example, dehydrogenase.
  • the amount of change in coenzyme for example, the amount of change produced using NAD as a coenzyme
  • reduced NAD which is a reduced coenzyme
  • Direct quantification using a known technique such as measurement with a colorimeter, or the resulting reduced coenzyme is an electron carrier such as various diaphorases or phenazine methosulfate and -trotetrazolium, 2- (4 Lodophenyl) 3— (4 nitroph enyl) 5— (2,4— disulfophenyl) — 2H tetrazolium, monosoaium
  • a reducing coloring reagent such as various tetrazolium salts such as salt (WST-3; manufactured by Dojin Chemical Research Co., Ltd.) or directly by other known methods. Alternatively, it may be measured indirectly.
  • oxidase when used, it is preferable to measure the amount of oxygen consumed or the amount of reaction products.
  • ketoamine oxidase is used as the reaction product, hydrogen peroxide and dalcosone are produced by the reaction, and both hydrogen peroxide and dalcosone can be measured directly and indirectly by known methods. .
  • the amount of hydrogen peroxide may be determined by coloration, luminescence, fluorescence, or the like by producing pigments using, for example, peroxidase, or by an electrochemical method.
  • aldehyde may be produced from alcohol using catalase or the like, and the amount of aldehyde produced may be quantified.
  • the hydrogen peroxide coloring system consists of couplers such as 4-aminoantipyrine (4 AA) or 3-methyl 2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) and chromogens such as phenol in the presence of peroxidase.
  • Trinder reagent that produces a dye by acid-acid condensation with leuco-type reagent that directly oxidizes and colors in the presence of peroxidase (N— (carboxymethylaminocarbole) —4, 4 bis (dimethylamino) bif ⁇ -Luamine (DA64), 10 (Carboxymethylaminomino) 3, 7 Bis (dimethylamino) phenothiazine (DA67);
  • the material of the electrode is not particularly limited as long as it is a material that can exchange electrons with hydrogen peroxide. , Gold or silver.
  • an electrode measurement method a known method such as amperometry, potentiometry, coulometry, etc. can be used.
  • an oxidase or a reaction between the substrate and the electrode is made to intervene an electron carrier, and the resulting oxidation, reduction current or Or you can measure the amount of electricity! / ⁇ .
  • Any substance having an electron transfer function can be used as the electron carrier, and examples thereof include phthalene derivatives and quinone derivatives.
  • the oxidation or reduction current or the amount of electricity obtained by interposing an electron carrier between the hydrogen peroxide peroxydase produced by the oxidase reaction and the electrode may be measured.
  • Surfactants include 0.01 to 10%, preferably 0.05 to 5%, such as polyoxyethylene alkyl ethers, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, polybulu alcohol, etc., various metal salts such as lithium chloride, salt ⁇ Sodium, potassium chloride, mangan chloride, cobalt chloride, zinc chloride, calcium chloride, etc.lmM to 5M, preferably 10 mM to 1 M, various preservatives, for example 0.01 to 10% of sodium azide, preferably 0.05 to 1% may be added as appropriate. As various preservatives, 0.01-10%, preferably 0.02-5% of Procrine (suppelco) may be added as appropriate!
  • various metal salts such as lithium chloride, salt ⁇ Sodium, potassium chloride, mangan chloride, cobalt chloride, zinc chloride, calcium chloride, etc.lmM to 5M, preferably 10 mM to 1 M
  • various preservatives for example 0.01 to 10% of sodium azide, preferably 0.05 to 1%
  • a method for measuring glycoprotein that can be used in the present invention, 0.001 to 0.5 ml of a test solution is added to the composition of the enzyme reaction reagent for measuring glycoprotein of the present invention, and When reaction is performed at a temperature of C and rate assembly is performed, a few minutes to a few tens of minutes after a certain time after the start of the reaction, for example, 1 minute after 3 minutes and 4 minutes, or 3 minutes later In the case of end-point assay, the amount of coenzyme, dissolved oxygen, hydrogen peroxide, or other products changed in 5 minutes after 8 minutes may be measured directly or indirectly by the above method.
  • the amount of coenzyme, dissolved oxygen, hydrogen peroxide or other products that have changed after a certain period of time from the start of the detection reaction may be measured in the same manner.
  • the amount of glycoprotein in the test solution can be determined by comparing with changes in absorbance and the like when measured using a known concentration of glycoprotein.
  • a known amino acid or glycopeptide other than the aforementioned known protein may be used.
  • a glycated amino acid or glycopeptide a commercially available synthetic peptide may be used.
  • hemoglobin Ale glycated valylhistidine, glycated valylhistidyl leucine proline, etc. may be used. I can do it.
  • the concentration of the peptide in the calibrator may be a concentration that can sufficiently measure the concentration of the peptide generated from the sample.
  • composition of the glycoprotein ratio measuring reagent that can be used in the present invention
  • a composition for measuring a protein separately or simultaneously with the above-mentioned reagent composition for measuring glycoprotein is used. Add it.
  • the protein is glycated albumin, measure albumin separately, and if the protein is glycated hemoglobin or hemoglobin Ale, measure hemoglobin separately. Measurement of albumin and hemoglobin may be performed using a known method.
  • any known method for measuring albumin may be used. Such methods include, for example, bromcresol green (hereinafter abbreviated as BCG), bromtalesol purple (hereinafter abbreviated as BCP), bromophenol blue (hereinafter abbreviated as BPB), methyl orange (hereinafter abbreviated as MO). ), Or 2- (4,1-hydroxybenzeneazo) benzoic acid (hereinafter abbreviated as HABA).
  • BCG bromcresol green
  • BCP bromtalesol purple
  • BPB bromophenol blue
  • MO methyl orange
  • HABA 2- (4,1-hydroxybenzeneazo) benzoic acid
  • any method may be used as long as it is a known method for measuring hemoglobin.
  • Examples of such a method include a methemoglobin method, a cyan methemoglobin method, an azide methemoglobin method, a green chromophore formation method, and an oxyhemoglobin method.
  • the green chromophore formation method is a method in which a green chromophore forming reagent and hemoglobin are reacted to form a stable product (green chromophore).
  • the green chromophore is an alkaline substance described in British Patent Publication No. 2052056.
  • a reagent containing the protease reaction accelerator of the present invention may be used.
  • a specific method can be used.
  • a sample is added to the first reaction reagent containing a protease reaction accelerator, and after a certain time, for example, 3 minutes or 5 minutes.
  • Absorption specific to hemoglobin for example 220 ⁇ ! ⁇ 900nm, preferably 280 ⁇ !
  • the hemoglobin concentration and hemoglobin Ale concentration can be converted into hemoglobin concentration and hemoglobin Alc concentration by comparing with the absorbance of a sample having a known hemoglobin concentration and hemoglobin Ale concentration. Normal hemoglobin Ale value is relative to total hemoglobin concentration Therefore, the hemoglobin Ale concentration is divided by the total hemoglobin concentration and converted into a proportion.
  • the method characterized by continuously measuring hemoglobin and hemoglobin Ale in the same reaction vessel of the present invention is to measure hemoglobin and hemoglobin Ale using the same wavelength and separately from a sample. It is preferable to measure the sub-wavelength and subtract from the measured wavelength for the purpose of subtracting the influence of dust. Any wavelength may be used as the measurement wavelength, but the vicinity of the absorption maximum of the coloring dye is preferred. For example, when DA67 is used, measurement is possible from 500 nm to 700 nm, preferably from 550 nm to 660 nm. The sub-wavelength is 600 ⁇ ! Measurement is possible using ⁇ 800nm, preferably 650nm ⁇ 750nm
  • the reagent of the present invention can be provided as a liquid product, a frozen product of a liquid product, a freeze-dried product of a liquid product, or a dried product of a liquid product (by heat drying and Z or air drying and Z or vacuum drying, etc.)
  • the dosage form is a liquid product.
  • any test solution containing at least hemoglobin or glycoprotein is used, and preferably, a blood component is used as a test solution.
  • a blood component examples thereof include serum, plasma, blood cells, whole blood, separated erythrocytes, and the like.
  • a protease-treated solution (hemolyzed blood) in which the separated erythrocytes and sugar hemoglobin are concentrated and fragmented by a protease is also preferable, and can be used as a test solution.
  • Red blood cells can be separated by a known centrifugation method, for example, in about 3000 rpm for 3 minutes. As a method for lysing the separated blood cells, it is sufficient to lyse with distilled water.
  • glycoproteins to be measured in the glycoprotein measuring reagent and method of the present invention include glycoprotein albumin or hemoglobin Ale (which may contain glycoprotein hemoglobin).
  • glycoprotein albumin or hemoglobin Ale which may contain glycoprotein hemoglobin.
  • the glycated protein to be measured is not limited to these, and any glycoprotein can be measured.
  • the sample contains sugar glycoprotein or sugar glycopeptide in addition to the target glycoprotein, such as hemoglobin Ale or sugar albumin, and affects the measurement, for example, high calorie Measuring amino acid samples from patients receiving amino acid infusions Or when measuring hemoglobin Ale, if there is a large amount of sugar amino acid in the molecule and the enzyme specificity alone cannot specifically measure the target ⁇ chain ⁇ terminal sugar It is necessary to eliminate these unintended components for measurement.
  • the target glycoprotein such as hemoglobin Ale or sugar albumin
  • the elimination reaction may be carried out using an enzyme that acts on sugar amino acid and sugar or sugar peptide.
  • an enzyme that acts on sugar amino acid and sugar or sugar peptide For example, in the case where the sugar amino acid and / or sugar peptide is included in advance, the measurement is affected. If the first reagent contains a sugar amino acid and an enzyme that acts on the sugar or peptide, and the second reagent contains a protease.
  • the first reagent contains a glycated amino acid and an enzyme that acts on sputum or glycated peptide, and the prescription of the reagent contains the protease contained in the second reagent!
  • Reagents and sugar amino acid measuring reagents can be used, but the mixing ratio of the first reagent and the second reagent is not 1: 1, for example 1: 3, 1: 4 or 1: 5.
  • the concentration may be appropriately adjusted so that each component has an effective working concentration during mixing. In other words, when the mixing ratio of the first reagent and the second reagent is 1: 4, the components prescribed for the first reagent are in the concentration range of 5 to 4, and the components prescribed for the second reagent are in the concentration range five times the concentration range described above. You can do it.
  • the first reagent contains a protease, a sugar-amino acid that does not form from the end of the hemoglobin chain, and a sugar-amino acid that eliminates Z or glycopeptide, and an enzyme that acts on Z or glycopeptide.
  • the second reagent contains a glycosylated amino acid that is detected from the hemoglobin ⁇ -chain ⁇ -terminal and ⁇ or saccharide peptide, and an enzyme that acts on the ⁇ or saccharide peptide.
  • the protease reagent of the reagent that does not contain the elimination reaction described above, the sugar chain amino acid and / or the sugar chain peptide that eliminates the sugar chain amino acid and / or the sugar chain peptide that does not originate from the hemoglobin ⁇ chain An enzyme acting on a peptide containing 0.5 to 1000 U / ml, preferably 1.0 to 500 U / ml, and a glycated amino acid measuring reagent can be used, but the mixing ratio of the first reagent and the second reagent 1: 1, nag example 1: 3, 1: 4 or 1: 5 If there etc. may be appropriately adjusted so that each component is the concentration works effectively at the time of mixing.
  • the mixing ratio of the first reagent and the second reagent is 1: 4, the components prescribed for the first reagent are in the 5Z4 concentration range, and the components prescribed for the second reagent are five times the concentration range above. A range should be used.
  • peroxyhydrogen generated in the elimination reaction has an adverse effect on the detection reaction. Therefore, if catalase and Z or peroxidase are prescribed as the first reagent, they should be decomposed.
  • Catalase may be prescribed in an amount of 1 to 2000 U / ml, preferably 5 to 1000 U / ml.
  • Sodium azide may be treated in the second reagent in an amount of 0.001 to 0.1%, preferably 0.02 to 0.09%.
  • Peroxidase is 0.1-100 U / ml, preferably 0.2-50 U / ml, but other amounts may be prescribed! ,.
  • the concentration in () indicates the final concentration in R.
  • Table 1 shows the evaluation results of the protease reaction promoting effect of the above test samples.
  • AH-AL shown in Table 1 shows the absorbance AL obtained from the primary calibrator level 2 (5.38%) from the primary calibrator level 4 (9.88%) force. Is the difference after subtracting.
  • AH-AL is large, it can be judged that there is an effect of promoting protease reaction. In particular, when AH-AL is 20 or more, there is an excellent promoting effect.
  • sarcosinate CN-30 which is an N-acyl amino acid, sarcosinate MN, sarcosinate PN, alcoholate LN-30, alkyl ether carboxylic acid E CTD-3NEX, ECTD-6NEX, AKYPO-RLM100, N-acyl tauric acid LMT, SMT, polyoxyethylene alkyl ether sulfate
  • SBL-2T-36, SBL-4 ⁇ and SBL-203-27 were effective.
  • a compound containing an acetic acid group or a salt thereof, ⁇ -acyl taurine or a salt thereof, or polyoxyethylene alkyl ether sulfate or a salt thereof clearly has an effect of promoting a protease reaction
  • a compound containing an acetic acid group Or, as a salt thereof it was clear that ⁇ -amino acid or a salt thereof, or an alkyl ether carboxylic acid or a salt thereof has a protease reaction promoting effect.
  • ⁇ -Acylamino acid or a salt thereof is represented by the following general formula (1)
  • R 1 represents an alkyl group or a alkenyl group
  • R 2 represents an amino acid or a monovalent group obtained by removing a hydrogen atom from an amino group in an amino acid derivative.
  • R 1 is CH (CH) — (where n is an integer of 10 to 14) or heptades—
  • alkyl ether carboxylic acid or a salt thereof is represented by the following general formula (2)
  • R 3 represents an alkyl group
  • m represents an integer of 3 to 10
  • M represents a hydrogen atom or a metal that forms a salt with carboxylic acid.
  • a reagent using AKYPO-RLM100, SMT, or SBL-2Z-36 was separately prepared.
  • the specificity of the protease of this reagent was confirmed using glycated valyl histidyl oral isylthrole proline and glycated valyl leucyl serylprolylanalanin, and the specificity of hemoglobin j8 chain is higher at the N-terminus. It was clear that it did not work. Furthermore, the morimoricin, samolyze (manufactured by Daiwa Kasei Co., Ltd.), and Bacillus sp. (Bacillus thermoproteolyticus Rokko) from Bachinlus thermoproteolyticus Rokko.
  • Tris buffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) pHLO 4000U / ml Neutral protease (TOYOBO)
  • Neocosmospora vasinfecta (Neocosmospora vasinfecta) 474 strain described in WO 2004/104203
  • Neocosmospora vasinfecta (Neocosmospora vasinfecta) 474 strain described in WO 2004/104203
  • the first reagent includes a protease and a hemoglobin chain, a sugar amino acid that does not form from the terminus, a sugar or amino acid that eliminates the sugar or sugar peptide, and an enzyme that acts on the sugar or peptide.
  • Example 7 A reagent containing a sugar-containing amino acid and an enzyme acting on a sugar-containing peptide in the first reagent, and a protease containing a protease in the second reagent.
  • Example 8 Protease reaction promoter, protease, enzyme acting on glycated amino acid and / or glycated peptide, protease stabilizer and enzyme stabilizing on Z or glycated amino acid and / or glycopeptide Reagent containing agent (for GA)
  • a standard product with a known hemoglobin concentration was measured using the reagent of Example 2.
  • Measurement was performed using an automatic analyzer (Hitachi 7170S type automatic analyzer; Hitachi, Ltd.). The absorbance change at 660 nm was measured by adding sample 1801 to reagent 1801. Add water to the control for 5 minutes The subsequent absorbance difference was calculated. The sample used was a hemoglobin standard diluted 5 levels.
  • hemoglobin could be quantified using the protease reaction accelerator (sarcosinate MN, AKYPO-RLM100, SMT, SBL-2Z-36) in the present invention.
  • a storage test was performed at 37 ° C for 4 days using a reagent using sarcosinate MN as a protease reaction accelerator.
  • the actual sample standard for HbAlc measurement was diluted 30 times and measured.
  • the measured value of hemoglobin was before the storage test (54 mAbs, 4.5 g / L) and after the storage test (50 mAbs, 4.6 g / L). From these results, it was estimated that this reagent was stable for more than 6 months when refrigerated.
  • Measurement was performed using an automatic analyzer (Hitachi 7170S type automatic analyzer; Hitachi, Ltd.).
  • Sample 201 was added to Reagents 1 to 1 180 1 and incubated at 37 ° C, and the change in absorbance at the main wavelength of 660 nm and subwavelength of 700 nm was measured. After 5 minutes, it was added to Reagent R-2 45 1 and kept at 37 ° C., and the change in absorbance at a main wavelength of 660 ⁇ m and a subwavelength of 700 nm was measured.
  • the measured value is the actual sample standard substance for HbAlc measurement (primary calibrator JDS
  • the calibration curves for hemoglobin and HbAlc are shown in Figs.
  • the HbAlc concentration was calculated from the HbAlc% and HbAlc concentrations of the actual sample standard for HbAlc measurement.
  • hemoglobin Ale could be quantified using the protease reaction accelerator in the present invention.
  • hemoglobin could be quantified at the same time. From these, it was clear that hemoglobin and HbAlc could be measured continuously in the same reactor using the present invention.
  • Carbularia 'crabator YH923 made by Asahi Kasei Pharma, described in JP 2004-275013 A
  • Neocosmospora basin fuekta described in WO 2004/104 203
  • Ketoamine oxidase from 474 strain showed the same result.
  • the reagents R-1 and R-2-A were stored in a liquid state at 37 ° C for 4 days to evaluate the stability.
  • R-2-B was stored in a refrigerator, and R-2-A and R-2-B were mixed immediately before use.
  • the hemoglobin quantitative value of the 30-fold diluted product of primary calibrator JDS HbAlc Lot2 level 3 (hemoglobin concentration 145 g / L, HbAlc value 7.32%) is stored before the test (reagent 58 mAbs in Example 4, 4.8 g / L, Example 5 reagent 55 mAbs, 4.8 g / L) After storage test (Example 4 reagent 56 mAbs, 4.7 g / L, Example 5 reagent 54 mAbs, 4.7 g / L) It was.
  • the reagents of Examples 4 and 5 are glycated without effectively cleaving the glycated amino acid and Z or the glycated peptide as the protease.
  • ⁇ -chain Protease that cleaves glycated amino acid and ⁇ or glycated peptide from ⁇ end is an enzyme that acts on glycated ⁇ amino acid and ⁇ or glycated peptide.
  • hemoglobin Ale is accurately measured based on the fact that the level 3 quantitative value of JDS HbAlc Lot2 is consistent with the displayed value.
  • HbAlc Lot2 Level 3 (HbAlc value 7.32%, manufactured by Welfare and Medical Technology Promotion Association) 30-fold diluted product, 9 volumes of 1 sugar sugar amino acid was added to prepare a sample. As a control, distilled water was added instead of glycated amino acid. The concentration of sugar amino acid added is 2 mM of sugar-Z-lysine aqueous solution (FZL), 2 mM of sugar aqueous solution (FV) (sugar amino acid was synthesized and purified by the method of Hasiba et al. Hashiba
  • the sample was measured by the same procedure as in Example 10.
  • the HbAlc quantitative value of Level 3 (HbAlc value 7.32%) of the primary calibrator JDS HbAlc Lot2 was 7.2, 7.3 in the order of control, FZL addition, and FV supplemented calorie when using the reagent of Example 6. 7.1%, and the reagents of Example 7 were 7.3, 7.4, and 7.1%. The elimination reaction was performed, and it was confirmed that an accurate value was measured.
  • the reagent of Example 5 was used. R-1 incubated at 37 ° C; control serum H to 240 1 (manufactured by BML Inc .; prepared according to the usage method and diluted with distilled water in 5 steps) 8 1 was added, and the dominant wavelength was 546 nm Absorbance at a wavelength of 700 nm) was measured. The reaction was started at 37 ° C, and R-2; 801 was added exactly 5 minutes later. Absorbance was measured before addition of R-2 and 5 minutes after addition. In addition, the measurement using distilled water instead of the substrate solution was used as a blank, and the absorbance change power obtained by subtracting the absorbance change of the blank sample was calculated.
  • Conversion of the value was performed by simultaneously measuring a caliber for Lucika GA (manufactured by Asahi Kasei Pharma) and comparing the absorbance.
  • the albumin was measured from the difference in absorbance obtained by subtracting the absorbance immediately after adding the sample and immediately before adding R-2.
  • Glycoalbumin was measured from the difference in absorbance obtained by subtracting the absorbance immediately before addition of R-2 from the absorbance 5 minutes after addition of R-2.
  • Protease reaction is slow when protease reaction promotion (aradinate LN-30) is not included.
  • GA sensitivity of control serum (manufactured by BML, undiluted) is 32m Abs Yes, and 66% of (48mAbs) when included. The reaction rate was accelerated 1.5 times.
  • Figure 4 shows the measured values of the control serum diluted in five stages. As shown in Fig. 4, albumin and glycated albumin were quantified at the same wavelength in the same reaction tank using this reagent, and the glycated albumin value (%) was successfully measured.
  • Tween-20 (1%), Brij35 (l%), TritonX-100 (1%), Deoxycholic acid (1%), Iminodiacetic acid (IDA; lmM), ZnSO4 (0.1 mM), AlC13 (0.1 mM) , Potassium ferrocyanide (ferrocyanide K; 0.01 mM), sorbitol (5%), glucose (5%), sodium nitrite (2 mM), dimethyl sulfoxide (DMSO; 10%) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), 2 —Hydroxypropyl— ⁇ -cyclodextrin (2HP j8 CD; 0.5%, 2%, 5%), methyl 13-cyclodextrin (M ⁇ CD; 0.5%, 2%, 5%) Company-made)
  • R-1; 500 ⁇ 1 and R-2; 500 ⁇ 1 incubated at 37 ° C were mixed, warmed at 37 ° C-2 minutes, measured for absorbance (AO), and 10 1 hydrogen peroxide 500 M or distilled water was added. After heating at 37 ° C and adding hydrogen peroxide exactly 5 minutes later, the absorbance was measured (A1), and the absorbance change ⁇ ⁇ ( ⁇ - ⁇ ) was calculated. Absorbance was measured at 750 nm when DA64 was used as the dye, 660 nm when DA67 was used, and 570 nm when 4-AA-TOOS was used.
  • the sensitivity of the blank and hydrogen peroxide was measured when the reagent was stored at 37 ° C for 2 to 9 days and distilled water was measured.
  • Tables 2-1 and 2-2 show the relationship between storage of the blank and the dye used to detect the enzyme reaction. As can be seen from Tables 2-1 and 2-2, metal blanks, 2-hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, and methyl mono- ⁇ -cyclodextrin were found to have the effect of suppressing blanks. Table 3 shows the relationship between the dye and metal salt and the concentration of the dye and cyclodextrin and storage when measuring 500 hydrogen peroxide. From Table 2-2, the metal salt has a strong force with no increase in blanks. From Table 3, the sensitivity of hydrogen peroxide per hydrogen has disappeared. Further, from Table 3, a stabilizing effect of the dye was observed at a concentration of 0.5% or more of cyclodextrin. [0120] [Table 2-1]
  • the reagent is 2 days and 9 days at 37 ° C.
  • Reagent R-1 180 ⁇ 1 was added to 20 ⁇ 1 of the sample, kept at 37 ° C, and the change in absorbance at the main wavelength of 660 nm and the subwavelength of 700 nm was measured. After 5 minutes, 1 kg of reagent R-2 45 was added, and the mixture was kept at 37 ° C., and the change in absorbance at the main wavelength of 660 nm and the sub wavelength of 700 nm was measured.
  • the sample contains an actual sample standard for HbAlc measurement (primary calibrator JDS
  • the reagent was stored at 37 ° C for 2, 4, and 6 days, and the sensitivity at level 5 to level 1 was calculated.
  • Example 18 Measurement of hemoglobin Ale, calculation of hemoglobin Ale ratio, and stability of reagent A sample was measured using the reagent of Example 16.
  • HbAlc actual sample reference material Primary calibrator JDS HbAlc Lot2 Welfare 'Medical Technology Promotion Level 1; hemoglobin concentration 135g / L, HbAlc value 4.04% and level 5; hemoglobin concentration 132g / L, HbAlc value 12.63%) was used as a calibrator, and values were converted. Hemoglobin was quantified using A1, and HbAlc was calculated using A2-A1.
  • hemoglobin Alc and hemoglobin could be quantified using the dye stability method used for detecting the enzyme reaction in the present invention.
  • the ability to quantify hemoglobin Alc and hemoglobin The ability to calculate the hemoglobin Ale ratio is obvious.
  • the reagent of Example 17 was used. Rl; incubated at 37 degrees; 240 1 with control serum H (manufactured by BML, Inc .; prepared according to the usage method and diluted with distilled water in 5 steps). The reaction was started, and Shaku-2; 801 was added exactly 5 minutes later. The absorbance, main wavelength 660 nm, and subwavelength 700 nm were measured before and after R-2 addition. Also substrate solubility The measurement using distilled water instead of the liquid was used as a blank, and the absorbance change power obtained from the control substrate solution power was also calculated by subtracting the absorbance change of the blank sample.
  • control serum L manufactured by BML, Inc .; undiluted
  • the sensitivity of GA measurement was 150 mAb, and the GA value was 18.3%.
  • the GA measurement sensitivity was 146 mAb, and the GA value was 18.2%. Based on these results, it was estimated that this reagent was stable for more than 6 months when refrigerated.
  • the measuring reagent and measuring method in the present invention are used for clinical examination.
  • FIG. 1 is a measurement result of hemoglobin based on Example 9 of the present invention.
  • FIG. 2 is a measurement result of hemoglobin Ale based on Example 10 of the present invention.
  • FIG. 3 is a measurement result of hemoglobin based on Example 10 of the present invention.
  • FIG. 4 is a measurement result of sugar albumin based on Example 12 of the present invention.
  • FIG. 5 is a calibration curve of hemoglobin Ale based on Example 18 of the present invention.
  • FIG. 6 is a calibration curve of hemoglobin based on Example 18 of the present invention.
  • FIG. 7 is a measurement result of glycoalbumin based on Example 19 of the present invention.
  • closed dross indicates albumin concentration
  • closed diamond indicates glycoalbumin concentration
  • closed ⁇ indicates glycoalbumin value.

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Abstract

【課題】　従来から知られているプロテアーゼ反応促進剤よりも有用なプロテアーゼ反応促進剤の提供し、酵素反応の検出に使用する色素の安定化試薬、方法を提供し、それ（ら）を用いた糖化タンパク質及び糖化タンパク質割合測定試薬、測定方法を提供する。 【解決手段】　酢酸基を含む化合物又はその塩、Ｎ－アシルタウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩のうち少なくとも１種類を含有するプロテアーゼ反応促進剤、及び該プロテアーゼ反応促進剤を用いたプロテアーゼ反応促進方法の提供。また、酵素反応の検出に使用する色素を安定化するためシクロデキストリンを添加した安定化試薬の提供。また、シクロデキストリンと該色素を共存させることにより安定化する方法を提供。さらには、該プロテアーゼ反応促進剤及び／又はシクロデキストリンを含有する試薬を用いた糖化タンパク質及び糖化タンパク質割合測定試薬、測定方法の提供。    

Description

プロテアーゼ反応促進剤及び z又は色素の安定化剤を含む試薬 技術分野
[0001] 本発明は、プロテアーゼ反応促進剤、及びプロテアーゼ反応促進方法に関する。
また本発明は、プロテアーゼ反応促進剤を用いた試薬、測定方法に関し、さらに詳し くは、プロテアーゼ反応促進剤を用いたヘモグロビン、糖ィ匕タンパク質若しくは糖ィ匕 タンパク質割合の測定用試薬、測定方法に関し、臨床検査に有用なヘモグロビン、 ヘモグロビン Ale及び糖ィヒアルブミンを正確、簡便、迅速に定量的に測定する試薬 及び測定方法に関する。
さらに本発明は、シクロデキストリンを含有することを特徴とする酵素反応の検出に 使用する色素の安定化剤、シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素 を含有する試薬、酵素反応の検出に使用する色素の安定ィ匕方法に関する。さらには 、シクロデキストリンを用いて安定化された該色素を用いた糖ィ匕タンパク質若しくは糖 ィ匕タンパク質割合測定試薬、方法に関する。
さらに本発明は、プロテアーゼ反応促進剤、及びシクロデキストリンを用いて安定化 された酵素反応の検出に使用する色素を用いた糖化タンパク質若しくは糖化タンパ ク質割合測定試薬、方法に関し、臨床検査に有用な糖ィ匕ヘモグロビン、ヘモグロビン Ale及び糖ィヒコアルブミンを正確、簡便、迅速に定量する試薬及び測定方法に関す る。
本出願は、特願 2004— 229498号、及び特願 2004— 281226号に基づく優先 権主張して出願されたものであり、これらの出願の記載内容は本出願においてその まま引用できる。
背景技術
[0002] 糖尿病の診断及び管理を行う上で糖ィ匕タンパク質の測定は非常に重要であり、中 でも糖ィ匕アルブミンやヘモグロビン Aleは、臨床の現場でなくてはならな!ヽ指標とし て多用されている。糖ィ匕アルブミンやヘモグロビン Aleの定量法としては、電気泳動 法、イオン交換クロマトグラフィー法、ァフィ二ティークロマトグラフィー法、免疫法で測 定されてきたが、近年、より簡便に大量検体の大量処理が可能な酵素法の開発研究 が行われている (非特許文献 1、 2)。
[0003] 酵素法で最もよく知られている方法は、試料中の糖ィ匕タンパク質をプロテアーゼで 分解し生じた糖ィ匕アミノ酸若しくは糖ィ匕ペプチドを測定する方法であるが、プロテア ーゼの反応は一般的に遅ぐ大量のプロテアーゼを使用しても、短時間にタンパク質 の分解を 100%進行させることは困難であった。また、発生した過酸化水素はバーオ キシダーゼを用いて色素を発色させ定量できる力 この際、色素、特にロイコ型の色 素は安定性が良くないという問題もあった。
[0004] 糖ィ匕タンパク質測定時に測定対象のタンパク質を変性させプロテアーゼの反応を 促進させる添加物としてはテトラゾリゥム塩 (非特許文献 2、特許文献 1〜7)、スルホ ン化合物及び Z又は-トロ化合物（特許文献 8、 9)を用いた方法が知られている。し かしテトラゾリゥム塩は還元性を有する化合物、例えば糖ィ匕タンパク質ゃァスコルビン 酸等と強く反応し呈色することから糖ィ匕タンパク質濃度の高い試料ゃァスコルビン酸 を含む試料で異常値を示す原因になる。またスルホンィ匕合物は酵素の阻害剤になる ものが多ぐ特によく使用されるラウリル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼンスルホン酸 ナトリウム、ラウリル硫酸リチウム等は糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する 酵素の反応停止剤となるほど強力な阻害剤である。さらにニトロ化合物は着色してお り、試薬ブランクが上昇し測定精度が低下する原因となる。
[0005] 以上のとおり、現在使用されている「測定対象のタンパク質を変性させプロテアーゼ の反応を促進させる添加物」は満足の!/、くものではなかった。
また、ロイコ型の色素を用いて測定を行っている例としては、 N— (カルボキシメチ ルァミノカルボ-ル）—4, 4—ビス（ジメチルァミノ）ビフエ-ルァミン（以下、 DA64と記 載することがある）を添加したヘモグロビン Aleの測定 (非特許文献 2)があるが、試 薬の安定性や保持に関する記載は一切な ヽ。これまで液状で長期安定なロイコ型色 素を含む試薬は知られて!/ヽなかった。
[0006] 特許文献 l :WO 02/27012号公報
特許文献 2 :WO 02/27330号公報
特許文献 3 :WO 2002/027331号公報 特許文献 4 :特開 2000— 93199号公報
特許文献 5 :特開 2001— 292795号公報
特許文献 6 :特開 2003— 232789号公報
特許文献 7 :WO 2000/210100号公報
特許文献 8 :WO 2004/007760号公報
特許文献 9 :WO 03/107011号公報
非特許文献 1 :高妻等（Kouzuma et.al.)、「アン ェンザィマティック メソッド フォー ザ メジャーメント ォブ グリケィティッド アルブミン イン バイオロジカル サンプ ノレ (An enzymatic method for the measurement of glycated albumin inbiological sampl e.)」、タリ-力 キミ力 ァクタ（Clinica Chimica Acta) , 2002年、 324、 p. 61— 71 非特許文献 2 :櫻林 郁之介等（Ikunosuke Sakurabayashiet.al.)、「ニューェンザイマ ティック アツセィ フォー グリケィティッドヘモグロビン (New enzymatic assay for gly catedhemoglobin)、タリ-カル ケミストリー（Clinic Chemistry)ゝ 2003年、第 49卷、 第 2号、 p. 269 - 274
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0007] 本発明の課題は、従来から知られているプロテアーゼ反応促進剤よりも有用なプロ テアーゼ反応促進剤を提供することにある。また、酵素反応の検出に使用する色素 の安定化剤を提供することにある。
さら〖こは、該プロテアーゼ反応促進剤及び Z又は該安定化剤を用いて、臨床生化 学検査、特にヘモグロビン Aleや糖ィ匕アルブミンの測定に有用な試薬及びそれを用 V、た測定方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者等は、上記の課題を解決するために、還元性物質と作用せず、酵素活性 に影響を与えにくぐ着色のないプロテアーゼ反応促進剤であって、テトラゾリゥム塩 以外のプロテアーゼ反応促進剤について検討した。また、文献 (櫻林 郁之介等、ク リニ力ノレ ケミストリー、 2003年、第 49卷、第 2号、 p. 269 - 274)【こ開示されて!ヽる DA64を含むロイコ型色素を用いて同じ組成の試薬の保存安定性を調べたところ、 37 °C3日の保存で色素が著しく発色し、測定が困難となることを見出した。そこで、酵素 反応の検出に使用する色素の安定化剤としては知られて 、な 、ィ匕合物にっ 、て検
B、Jした。
また、該プロテアーゼ反応促進剤及び Z又は該色素の安定化剤を用いることを特 徴とするヘモグロビン、糖ィ匕タンパク質及び糖ィ匕タンパク質割合測定用試薬及びそ れを用いた方法、さらには、臨床生化学検査、特にヘモグロビン Aleや糖ィ匕アルブミ ンの測定に有用な測定用試薬及びそれを用いた測定方法にっ 、て検討した。
[0009] その結果、本発明者等は、ヘモグロビン若しくは糖ィ匕タンパク質を変性し、へモグロ ビンの色調を変化させ、かつプロテアーゼの反応を促進する化合物を選択すること に着目し、還元性物質の影響を受けないもの、酵素作用を阻害しないもの、ブランク の上昇の原因にならないものを選択することに留意して鋭意検討した結果、酢酸基 を含む化合物、 N—ァシルタウリン塩若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル 硫酸塩にプロテアーゼ反応促進作用があることを見出し、さらには、これらを用いて 正確にヘモグロビン若しくは糖ィ匕タンパク質、糖ィ匕タンパク質割合を測定できることを 見出した。
[0010] また、酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤のスクリーニングを鋭意検討し た。一般的に安定化剤として有用であることが知られている糖類や界面活性剤は安 定化効果が少ないか、或いは安定化が可能であっても発色を阻害してしまう化合物 が多い中で、酵素反応の検出に使用する色素の安定化効果が強ぐ且つ、該色素 の発色反応を阻害しない化合物としてシクロデキストリンを見出した。ところで、シクロ デキストリンは、化合物を包み込む包接作用によって化合物を安定に保つことが知ら れているが、また、一度包接された化合物はシクロデキストリン内に取り込まれたまま となる場合が多いことも知られている。本発明においては、取り込まれたままの場合は 、発色反応が起こらなくなる懸念もあった力 色素、特にパーォキシダーゼの作用に より発色するロイコ型の色素は、意外にも、色素が安定化され、かつ発色反応も充分 に保たれることを見出した。さらに、酵素反応の検出に使用する色素はカタラーゼを 共存させ、かつ緩衝剤の濃度を低くすることでさらに安定になること、また本発明の色 素の安定ィ匕方法及び試薬を用いて糖ィ匕タンパク質をより高感度にまた正確に測定で きることを見出した。
さらに、該プロテアーゼ反応促進剤及び Z又は該色素の安定化剤を用いた臨床生 化学検査、特にヘモグロビン Aleや糖ィ匕アルブミンの測定に有用な試薬及びそれを 用いた測定方法を見出して本発明の完成に至った。
[0011] すなわち、本発明は、
1)酢酸基を含む化合物又はその塩、 N—ァシルタウリン又はその塩、若しくはポリ ォキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩のうち少なくとも 1種類を含有する プロテアーゼ反応促進剤、
[0012] 2)酢酸基を含む化合物又はその塩が N—ァシルアミノ酸又はその塩、若しくはァ ルキルエーテルカルボン酸又はその塩である上記 1)に記載のプロテアーゼ反応促 進剤、
[0013] 3) N—ァシルアミノ酸又はその塩が下記一般式（1)
R1 - CO - R2 (1)
[式中、 R1はアルキル基、又はァルケ-ル基を示し、 R2はアミノ酸、又はアミノ酸誘導 体中のァミノ基から水素原子を除した一価基を示す。 ]
で示される化合物又はその塩である上記 2)に記載のプロテアーゼ反応促進剤、 [0014] 4)上記 3)にお 、て、下記 I)及び Z又は Π)であるプロテアーゼ反応促進剤、
DR1が CH (CH ) —(但し、 nは 10〜14の整数）である力、もしくはヘプタデス— 8—
3 2 n
ェ-ル基である
II)アミノ酸、又はアミノ酸誘導体が N—メチルァラニン若しくはサルコシンである、
5)アルキルエーテルカルボン酸又はその塩が下記一般式（2)
R— O— (CH— CH -0) -CH COOM (2)
3 2 2 m 2
[式中、 R3はアルキル基を示し、 mは 3〜10の整数を示し、 Mは、水素原子、又はカル ボン酸と塩を形成する金属を示す。 ]
で示される化合物である上記 2)に記載のプロテアーゼ反応促進剤、
[0015] 6)R3が CH (CH ) —(但し、 Qは 10又は 11)である上記 5)に記載のプロテア
3 2 Q 一 ゼ反応促進剤、
7)プロテアーゼとプロテアーゼ反応促進剤を少なくとも共存させ、反応促進され たプロテアーゼ反応の結果生じる生成物を測定する方法にぉ 、て、プロテアーゼ反 応率を 1. 5倍以上早くすることを特徴とするプロテアーゼ反応促進剤、
8)上記 1)〜7)いずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤を含有することを特徴 とする試薬、
9)下記 i)〜iii)を含有することを特徴とする試薬、
i) 1)〜8) V、ずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤
ii)プロテアーゼ
iii)糖化アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素
10)プロテアーゼ安定化剤、及び Z又は糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに 作用する酵素の安定化剤を含有することを特徴とする上記 8)若しくは 9)に記載の試 薬、
11)試薬が液状であり、冷蔵で 6ヶ月以上安定であることを特徴とする上記 8)〜1 0) V、ずれかに記載の試薬、
12)プロテアーゼが糖ィ匕ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖ィ匕された a鎖 N末端力 糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを実質的に切り出すことなぐ糖ィ匕 された β鎖 Ν末端カゝら糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを切り出すものである上 記 9)〜： L 1)記載の試薬、
13)糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素が糖化バリルロイシン よりも糖化バリルヒスチジンに作用が高いことを特徴とする上記 9)〜12)記載の試薬
14)ロイコ型色素及び色素安定化剤を含むことを特徴とする上記 8)〜 13)に記載 の試薬、
15)色素の安定化剤がシクロデキストリンである上記 14)記載の試薬、
16)第一試薬にプロテアーゼ、及びヘモグロビン j8鎖 Ν末端より生じない糖ィ匕アミ ノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを消去する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドに作 用する酵素を含み、第二試薬にヘモグロビン β鎖 Ν末端より生じた糖化アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを検出する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵 素を含むことを特徴とする上記 8)〜15)に記載の試薬、 17)第一試薬に糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素を含み、 第二試薬にプロテアーゼを含むことを特徴とする上記 8)〜 15)に記載の試薬、
18)第一試薬にさらにカタラーゼ及び/又はパーォキシダーゼを含むことを特徴 とする上記 16)又は 17)に記載の試薬、
19)第一試薬と第二試薬力もなるキットにぉ 、て、プロテアーゼ及びカタラーゼを 同一試薬中に含有し、かつカタラーゼの含まれて 、な 、試薬にアジィ匕ナトリウムを含 むことを特徴とする上記 8)〜18)に記載の試薬、
[0017] 20)上記 1)〜7)いずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤を用いたプロテア一 ゼ反応促進方法、
21)上記 7)に記載のプロテアーゼ反応促進剤を用い、プロテアーゼ反応率を 1. 5倍以上に早くすることを特徴とする上記 20)記載のプロテアーゼ反応促進方法、 [0018] 22)上記 8)〜19)いずれかに記載の試薬を用いたヘモグロビン、ヘモグロビン A lc若しくは糖ィ匕アルブミン測定方法、
23)同一反応槽中でヘモグロビンの測定及びヘモグロビン Aleの測定を連続し て行うことを特徴とする上記 22)記載の方法、
24)ヘモグロビンの測定及びヘモグロビン Aleの測定を同一波長で行うことを特 徴とする上記 23)に記載の方法、
25)副波長を設定し測定波長力 差し引くことを特徴とする上記 24)に記載の方 法、
26)ヘモグロビン Aleの /3鎖 N端の糖ィ匕ペプチドを特異的に測定することを特徴 とする上記 22)〜25)に記載の方法、
27)ヘモグロビン Ale測定時に溶血液、ヘモグロビン溶液もしくはヘモグロビン β 鎖 Ν端の糖ィ匕ペプチドをキヤリブレーターとして測定しその検量線力 定量値を計算 することを特徴とする上記 22)〜26)記載の方法、
28)同一反応槽中でアルブミンの測定及び糖ィ匕アルブミンの測定を連続して行う ことを特徴とする上記 22)記載の方法、
29)アルブミンの測定及び糖ィ匕アルブミンの測定を同一波長で行うことを特徴と する上記 28)に記載の方法、 に関する。
[0019] また、既知濃度の糖化バリルヒスチジン、糖化バリルヒスチジルロイシン、糖化バリル ヒスチジル口イシルスレオニン、糖化バリルヒスチジル口イシルスレオニルプロリンから 選ばれた 、ずれかの合成ペプチドをキヤリブレーターとして、これを用いた測定値を 元に試料中のヘモグロビン Ale濃度を算出したのち、さらに同時に Z又は別に測定 した総ヘモグロビン濃度で除すことによりヘモグロビン Ale値 (%)として算出することを 特徴とするヘモグロビン Ale値 (%)の算出方法に関する。
[0020] また別の態様として、本発明は、特に血液試料中のヘモグロビン、糖ィ匕タンパク質 及び糖ィ匕タンパク質割合を酵素を用いて正確、簡便、迅速、安価に定量する目的に おいて有用なプロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ反応促進方法、該プロテア一 ゼ反応促進剤を含有する試薬、及びヘモグロビン、糖ィ匕タンパク質若しくは糖ィ匕タン パク質割合を測定する方法に関する。具体的には、同一反応槽を用いて連続して糖 化タンパク質を測定する方法に用いる試薬に、上記 1)に記載のプロテアーゼ反応促 進剤を追加した試薬、及び該試薬を用いた測定方法に関する。さらに詳細には、糖 化タンパク質割合の測定は通常はタンパク質の測定と糖ィ匕タンパク質の測定を別々 に行い割合換算するが、本発明者等は別途、これらを同一反応槽で連続して測定す る方法を開発している（特開 2001— 204495号公報等を参照)。該方法と本件発明の プロテアーゼ反応促進剤とを組み合わせれば、より早ぐ正確に測定することが可能 になるが、この組み合わせ等も本件発明である。
[0021] また、本発明は、
30)酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤であって、シクロデキストリンを 含有することを特徴とする色素の安定化剤、
31)シクロデキストリン力 β—シクロデキストリン類であることを特徴とする上記 30 )に記載の安定化剤、
32) β—シクロデキストリン類力 メチル一 j8—シクロデキストリンもしくは 2—ヒドロ キシプロピル一 β—シクロデキストリンであることを特徴とする上記 31)に記載の安定 化剤、
33)酵素反応の検出に使用する色素が、パーォキシダーゼの作用により発色す る色素であることを特徴とする上記 30)から 32) V、ずれかに記載の安定化剤、
34)パーォキシダーゼの作用により発色する色素力 ロイコ型色素であることを特 徴とする上記 33)に記載の安定化剤、
[0022] 35)上記 30)から 34)いずれかに記載の安定化剤、及び酵素反応の検出に使用 する色素を含有する試薬、
36)カタラーゼを含有することを特徴とする上記 35)に記載の試薬、
37)測定時の緩衝剤濃度が 80mM以下であることを特徴とする上記 35)又は 36) に記載の試薬、
38)プロテアーゼを含有することを特徴とする上記 35)から 37) V、ずれかに記載 の試薬、
39)プロテアーゼ反応促進剤を含有することを特徴とする上記 38)記載の試薬、
40)測定時のシクロデキストリンの濃度が 0.5重量％以上であることを特徴とする上 記 35)から 39) V、ずれかに記載の試薬、
41)試薬が液状であり、冷蔵で 6ヶ月以上安定であることを特徴とする上記 35)か ら 40) V、ずれかに記載の試薬、
[0023] 42)上記 30)から 34)記載の安定化剤を用いることを特徴とする酵素反応の検出 に使用する色素の安定化方法、
[0024] 43)上記 35)から 41)記載の試薬を用いることを特徴とする糖ィ匕タンパク質若しく は糖ィ匕タンパク質割合の測定方法、
44)糖ィ匕タンパク質が糖ィ匕アルブミン、糖ィ匕ヘモグロビン、又はヘモグロビン Ale であり、糖ィ匕タンパク質割合が糖ィ匕アルブミン値、糖ィ匕ヘモグロビン値、又はへモグロ ビン Ale値であることを特徴とする上記 43)記載の方法、
45)酵素反応の検出に使用する色素を安定ィ匕させるための、シクロデキストリンの 使用、
[0025] 46)上記 35)から 41)いずれかに記載の試薬を製造するための、シクロデキストリ ンの使用、
に関する。
[0026] さらに、本発明は、酵素反応の検出に使用する色素の安定化方法及び該色素を安 定ィ匕した試薬、さらにそれを用いた特に血液試料中の糖ィ匕タンパク質及び糖ィ匕タン パク質割合を正確、簡便、迅速、安価に定量する試薬、及び測定方法に関する。 発明の効果
[0027] 本発明のプロテアーゼ反応促進剤を含む試薬は、糖化タンパク質及び糖化タンパ ク質割合測定試薬に添加することで、該測定を正確、簡便、迅速に行える効果を有 し、該効果によって、測定用試薬を大量、安価に提供する事を可能とする効果を有 する。
また、酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤を提供することで、該色素の安 定化方法、該色素を含有する流通時の保存安定性に優れた試薬、さらにそれを用い た糖化タンパク質及び糖化タンパク質割合測定方法及び測定用試薬を提供する事 が可能になる。
本発明のプロテアーゼ反応促進剤、及び酵素反応の検出に使用する色素の安定 ィ匕剤を含む試薬は、臨床検査に有用なヘモグロビン、ヘモグロビン Ale及び糖ィ匕ァ ルブミンを正確、簡便、迅速に定量的に測定する、流通時の保存安定性に優れた試 薬を提供する事が可能になる。
発明を実施するための最良の形態
[0028] 発明の構成及び好ましい形態について、以下更に詳しく説明する。
本発明に使用しうるプロテアーゼ反応促進剤としてはプロテアーゼ反応を促進し、か つ還元性物質の影響を受けず、同時に使用する酵素の活性を阻害せず、ブランクの 原因にならないものであればいかなるものでも使用できる力 例えばァニオン界面活 性剤が好ましぐ中でも酢酸基を含む化合物又はその塩、 N—ァシルタウリン又はそ の塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩がさらに好ましい。少な くとも 1種類の本発明に使用しうるプロテアーゼ反応促進剤を含有する組成物を、プ 口テアーゼ反応促進用試薬として用いることができる。
[0029] 酢酸基を含む化合物又はその塩としては、 N—ァシルアミノ酸又はその塩、アルキ ルエーテルカルボン酸又はその塩、酢酸べタイン型両性界面活性剤、イミダゾリン型 両性界面活性剤が好ましぐ N—ァシルアミノ酸又はその塩、アルキルエーテルカル ボン酸又はその塩がより好ましぐ N—ァシルアミノ酸又はその塩が特に好ましい。ま た別の態様として、アルキルエーテルカルボン酸又はその塩が大変に好まし 、場合 もある。尚、酢酸基を含む化合物は、カルボン酸フリーであり、その塩は、カルボン酸 と塩を形成する金属イオンとの塩であれば何でもよい。
[0030] 本発明に使用しうる N ァシルアミノ酸又はその塩としては下記一般式（1)
R1 - CO - R2 (1)
[式中、 R1はアルキル基、又はァルケ-ル基を示し、 R2はアミノ酸、又はアミノ酸誘導 体中のァミノ基から水素原子を除した一価基を示す。 ]
で示される化合物又はその塩が好まし 、。
[0031] R1はアルキル基、もしくはァルケ-ル基である。 R1が示すアルキル基としては、直 鎖状、又は分枝状の炭素数 11〜15のアルキル基が好ましぐ直鎖状の炭素数 11〜
15のアルキル基、すなわち、 CH (CH ) - (但し、 nは 10〜14の整数）が特に好まし
3 2 n
く、中でも直鎖状の炭素数 11のアルキル基 (CH (CH ) 一；ゥンデシル基）（CH (
3 2 10 3
CH ) —CO 基としてラウロイル基）が最も好ましい。 R1が示すアルケニル基として
2 10
は、直鎖状、又は分枝状の炭素数 11〜15のアルケニル基が好ましぐ直鎖状の炭 素数 17、又は 19のァルケ-ル基がより好ましぐ直鎖状の炭素数 17のアルケニル基 が特に好ましい。二重結合の数としては、 2、又は 1が好ましぐ 1が特に好ましい。つ まり、 C H 一、又は C H 一基が好ましぐ C H 一基が特に好ましい。二重結合
17 31 17 33 17 33
の位置としては、少なくとも 8位に二重結合があることが好ましい。 R1が示すァルケ- ル基の具体例としては、ォレイン酸力 カルボン酸を除した基（CH (CH ) CH = C
3 2 7
H (CH ) ；ヘプタデス 8—ェ-ル基）、リノール酸からカルボン酸を除した基（C
2 7
H (CH ) CH = CH (CH ) CH = CH (CH ) —；ヘプタデ力— 8, 11—ジェ -ル基
3 2 4 2 2 7
)等が挙げられる。
[0032] R1としては、 CH (CH ) —(但し、 nは 10〜14の整数)もしくはヘプタデス— 8 ェ
3 2 n
-ル基が好ましぐヘプタデス 8—ェニル基が特に好ましい。また別の態様としては 、 CH (CH ) —(但し、 nは 10〜14の整数）が好ましい場合もあり、中でも CH (CH
3 2 n 3 2
) —が特に好ましい。
10
[0033] R2はアミノ酸、又はアミノ酸誘導体中のアミノ基カも水素原子を除した一価基である 。該ァミノ基力 水素原子を除した一価基部分が、一般式（1)中の CO とべプチ ド結合を形成する。アミノ酸、又はアミノ酸誘導体としては、ァミノ基とカルボン酸基を 有する化合物であれば何でもよいが、標準アミノ酸、又はその誘導体が好ましい。標 準アミノ酸としては非極性側鎖アミノ酸が好ましぐ具体的には、グリシン、ァラニン、 ノ リン、ロイシン、イソロイシン、メチォニン、プロリン、フエ二ルァラニン、トリプトファン が好ましぐグリシン、了ラニン、又はノ《リンがより好ましぐグリシン、又はァラニンが最 も好ましい。
標準アミノ酸の誘導体としては、標準アミノ酸の N—アルキル置換体が好ましぐ具 体的には、 N—メチル置換体が好ましい。また、標準アミノ酸の誘導体としては、 N- メチルァラニン若しくはサルコシンが好ましぐサルコシンが特に好ましい。また、別の 態様としては N—メチルァラニンが好ましい場合もある。
[0034] 一般式（1)が示す化合物としてはフリー体、又はその塩が好ましい。塩を形成する 金属としては、カルボン酸と塩を形成する金属であれば何でもよいが、例えば、リチウ ム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ノ リウム、又はセシウムが挙げられ る。塩を形成する金属としては、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、又は力 ルシゥムが好ましぐナトリウム、又はカリウムがより好ましぐナトリウムが特に好ましい 。また、別の態様としてはカリウムが好ましい場合もある。一般式（1)で示される化合 物としては、フリー体も好ましい。
[0035] 一般式（1)で示される化合物としては、具体的にはココイルサルコシンナトリウム、ラ ゥロイルサルコシン、ラウロイルサルコシンナトリウム、ラウロイルサルコシンカリウム、ミ リストィルサルコシンナトリウム、パルミトイルサルコシンナトリウム、ォレオイルサルコシ ン、又はラウロイルメチルァラニンナトリウム等が好適な例として挙げられ、ココイルサ ルコシンナトリウム、ミリストイルサルコシンナトリウム、パルミトイルサルコシンナトリウム
、又はラウロイルメチルァラニンナトリウムがさらに好ましい例として挙げられ、ラウロイ ルメチルァラニンナトリウムが最も好ましい例として挙げられる。
一般式（1)で示される化合物は、公知の方法で合成することができ、例えば、巿販 で入手可能な長鎖脂肪酸 R1— COOPER1は前記と同義)と、市販で入手可能なアミ ノ酸 R2— H (R2は前記と同義）とを公知のペプチドィ匕条件下で反応させて得ることが できる。また、一般式（1)で示される化合物は、市販品を使用することもでき、例えば 、 日光ケミカル社など力も入手して使用することができる。これらを、必要に応じて力 ルボン酸フリー化、又は金属との塩ィ匕を行って使用することもできる。
[0036] また、アルキルエーテルカルボン酸又はその塩としては下記一般式（2)
R3-0- (CH -CH -0) -CH COOM (2)
2 2 m 2
[式中、 R3はアルキル基を示し、 mは 3〜10の整数を示し、 Mは、水素原子、又はカル ボン酸と塩を形成する金属を示す。 ]
で示される化合物が好まし 、。
[0037] R3はアルキル基である。 R3が示すアルキル基としては、直鎖状、又は分枝状の炭 素数 11〜12のアルキル基が好ましぐ直鎖状の炭素数 11〜12のアルキル基、すな わち、 CH (CH ) - (但し、 Qは 10又は 11)が特に好ましい。
3 2 Q
R3としては、 CH (CH ) —が好ましい。さらに別の態様としては CH (CH ) —が
3 2 10 3 2 11 好ましい場合もある。
mは 3〜 10の整数である。 mとしては、 3〜10カ 子ましく、 3、 6、 10が好ましぐ 6、 1 0がより好ましぐ 6が特に好ましい。また、別の態様としては 10である場合も好ましい
[0038] Mは、水素原子、又はカルボン酸と塩を形成する金属を示す。塩を形成する金属と しては、カルボン酸と塩を形成する金属であれば何でもよいが、例えば、リチウム、ナ トリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、ノ リウム、又はセシウムが挙げられる。 M としては、水素原子、リチウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、又はカルシウムが 好ましぐ水素原子、ナトリウム、又はカリウムがより好ましぐナトリウムが特に好ましい 。また、水素原子が好ましい場合もある。別の態様としてはカリウムが好ましい場合も ある。
[0039] 一般式（2)で示される化合物としては、具体的にはポリオキシエチレン（3)トリデシ ルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（6)トリデシルエーテル酢酸ナトリウム 、ポリオキシエチレン（3)トリデシルエーテル酢酸、ポリオキシエチレン（7)トリデシル エーテル酢酸、ポリオキシエチレン（4. 5)ラウリルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキ シエチレン（4. 5)ラウリルエーテル酢酸、ポリオキシエチレン（10)ラウリルエーテル 酢酸ナトリウム、又はポリオキシエチレン（10)ラウリルエーテル酢酸等が好適な例とし て挙げられ、ポリオキシエチレン（3)トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシェ チレン（6)トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、又はポリオキシエチレン（10)ラウリルェ 一テル酢酸が特に好ましい例として挙げられる。
一般式（2)で示される化合物は公知の方法で合成することができ、例えば、市販で 入手可能な R3— O— (CH -CH — O) - 1 -CH — CH — OH (R3、mは前記と
2 2 m 2 2
同義）と、市販で入手可能なハロ酢酸誘導体 X— CH COOM (Mは前記と同義、 X
2
は臭素原子、又は塩素原子を示す)とを公知のエーテルィヒ条件下で反応させて得る ことができる。また、一般式 (2)で示される化合物は市販品を使用することもでき、例 えば、 日光ケミカル社など力 入手して使用することができる。これらを、必要に応じ てカルボン酸フリー化、又は金属との塩ィ匕を行って使用することもできる。
[0040] 本発明に使用しうる N—ァシルタウリン又はその塩としては、 N—ココイルメチルタウ リンナトリウム、 N—ラウロイルメチルタウリンナトリウム、 N—ミリストイルメチルタウリンナ トリウム、 N—パルミトイルメチルタウリンナトリウム、又は N—ステアロイルメチルタウリ ンナトリウム等が挙げられ、 N—ラウロイルメチルタウリンナトリウム、又は N—ステア口 ィルメチルタウリンナトリウムが特に好適な例として挙げられる力 N—ァシルタウリン 又はその塩であればいかなる化合物を用いてもよぐフリーの N—ァシルタウリンを用 いてもよい。
本発明に使用しうる N—ァシルタウリン又はその塩は公知の方法で合成することが でき、例えば、市販で入手可能なタウリンを市販で入手可能なァシル化剤と反応させ て得ることができる。また、本発明に使用しうる N—ァシルタウリン又はその塩は巿販 品を使用することもでき、例えば、 日光ケミカル社など力も入手して使用することがで きる。これらを、必要に応じてカルボン酸フリー化、又は金属との塩化を行って使用す ることちでさる。
[0041] また、本発明に使用しうるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩とし てはポリオキシエチレン（2)ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（3) ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン (4)ラウリルエーテル硫酸ナトリウ ム、ポリオキシエチレン（2)ラウリルエーテル硫酸トリエタノールァミン、ポリオキシェチ レン（4)ラウリルエーテル硫酸トリエタノールァミン、ポリオキシエチレン（3)アルキル エーテル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（3)アルキルエーテル硫酸ナトリウム、又 はポリオキシエチレン (4)ノユルフェ-ルエーテル硫酸ナトリウム等が挙げられ、ポリ ォキシエチレン（2)ラウリルエーテル硫酸トリエタノールァミン、ポリオキシエチレン（4 )ラウリルエーテル硫酸トリエタノールァミン、又はポリオキシエチレン（3)アルキルェ 一テル硫酸トリエタノールァミンが特に好適な例として挙げられる力 ポリオキシェチ レンアルキルエーテル硫酸又はその塩であればいかなる化合物を用いてもよぐフリ 一のポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸を用いてもよ 、。
本発明に使用しうるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩は巿販 品を使用することができ、例えば、 日光ケミカル社など力も入手して使用することがで きる。
[0042] 結局、本発明のプロテアーゼ反応促進剤としては、具体的には、ココイルサルコシ ンナトリウム、ミリストイルサルコシンナトリウム、パルミトイルサルコシンナトリウム、ラウ ロイルメチルァラニンナトリウム、ポリオキシエチレン（3)トリデシルエーテル酢酸ナトリ ゥム、ポリオキシエチレン（6)トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（ 10)ラウリルエーテル酢酸、 N—ラウロイルメチルタウリンナトリウム、 N—ステアロイル メチルタウリンナトリウム、ポリオキシエチレン（2)ラウリルエーテル硫酸トリエタノール ァミン、ポリオキシエチレン (4)ラウリルエーテル硫酸トリエタノールァミン、又はポリオ キシエチレン（3)アルキルエーテル硫酸トリエタノールァミンが好ましぐラウロイルメ チルァラニンナトリウム、ポリオキシエチレン（3)トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポ リオキシエチレン（6)トリデシルエーテル酢酸ナトリウム、ポリオキシエチレン（10)ラウ リルエーテル酢酸、 N—ラウロイルメチルタウリンナトリウム、 N—ステアロイルメチルタ ゥリンナトリウム、ポリオキシエチレン（2)ラウリルエーテル硫酸トリエタノールァミン、ポ リオキシエチレン (4)ラウリルエーテル硫酸トリエタノールァミン、又はポリオキシェチ レン（3)アルキルエーテル硫酸トリエタノールァミンがより好ましぐラウロイルメチルァ ラニンナトリウムが最も好まし 、。
[0043] これらのプロテアーゼ反応促進剤の使用濃度としては、プロテアーゼのタンパク質 への作用が大きくなる濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、例えば通常下 限は 0.01%以上、好ましくは 0.05%以上であり、最も好ましくは 0.1%以上であり、上 限は 50%以下であり、好ましくは 40%以下であり、最も好ましくは 30%以下である。
[0044] また、本発明のプロテアーゼ反応促進剤としてはプロテアーゼ反応率を 1. 25倍以 上に速くするものであれば良いが、ヘモグロビン Aleの測定に用いる場合は、好まし くは 1. 5倍以上であり、より好ましくは 2倍以上でありもっとも好ましくは 2. 5倍以上で ある。糖ィ匕アルブミンの測定に用いる場合にはプロテアーゼが作用しやすいことから 、 1. 5倍以上の速度が得られれば良い。
[0045] プロテアーゼ反応促進度の確認は実施例 1の方法を用いて、ヘモグロビン Ale値 の高 、試料と低！、試料の吸光度差が反応促進剤無添加の場合 (コントロール)の何 倍になるかを計算すると良い。ちなみにコントロールは無添加若しくは反応促進効果 の認められな 、糖類、たとえばソルビトールを反応促進剤の代わりに添加した試験溶 液を用いると良い。アルブミンに対するプロテアーゼ反応促進剤のスクリーニングを 行う場合には試料を糖ィ匕アルブミン値の高 、試料と低 、試料に置き換えて行えばよ い。
[0046] また、本発明におけるプロテアーゼとプロテアーゼ反応促進剤を少なくとも共存さ せ、反応促進されたプロテアーゼ反応の結果生じる物質とは糖ィヒアミノ酸、糖化ぺプ チド、アミノ酸、ペプチド等のことであり、好ましくは糖ィ匕アミノ酸、糖化ペプチドであり 、プロテアーゼとプロテアーゼ反応促進剤を少なくとも共存させ、反応促進されたプロ テアーゼ反応の結果生じる生成物を測定する方法とは、たとえばヘモグロビン Ale 及び糖ィ匕アルブミンを測定する方法が挙げられるが、その他の測定方法に使用して も良い。
[0047] 本発明に使用しうるプロテアーゼとしては、糖ィ匕タンパク質に有効に作用し、かつ当 該タンパク質由来の糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを有効に生成するもので あればいかなるものを用いてもよいが、例えば動物、植物由来のプロテアーゼ、バチ ルス (Bacillus)属、ァスペルギルス (Aspergillus)、リゾパス (Rhizopus)、ぺ-シリウム (Peni cillium)、ストレプトマイセス (Streptomyces)、スタフイロコッカス (Staphylococcus^クロス トリジゥム (Clostridium)、リソパクター (Lysobacter)、グリフオラ (Glifila)、酵母 (Yeast)、トリ チラチウム (Tritirachium)、サーマス (Thermus)、シユードモナス (Pseudomonus)、ァクロ モパクター (Achromobacter)等の微生物由来のプロテアーゼ等が好適な例として挙げ られる。バチルス (Bacillus)属の微生物由来のプロテアーゼとしては例えばズブチリシ ンゃメタ口プロテアーゼ等が好適な例として挙げられる。
[0048] また測定対象である糖ィ匕タンパク質が糖ィ匕アルブミンである場合にはバチルス属及 びストレプトマイセス属の微生物由来プロテアーゼがヒトアルブミンに対する作用が大 きい為より好ましぐバチルス属由来プロテアーゼ、たとえばズブチリシン (Subtilisin)、 プロテアーゼ—タイプ VIII、— IX、— X、—XVゝ 一 XXIV、 一 XXVII、—タイプ XXXI ( 以上シグマ社製）、サーモリシン (Thermolysin)、ナガーゼ (Nagarse) (以上和光純薬社 製）、オリエンターゼー 90N、 一 10NL、 一 22BF、 一 Y、 一 5BL、ヌクレイシン（以上阪急 バイオインダストリ一社製）、プロレザー、プロテアーゼ— N、— NL、— S「ァマノ」（以上 天野製薬社製）、 GODO— BNP、—BAP (以上合同酒清社精製）、プロチン A、—P 、デスキン、デビレイス、ビォソーク、サモアーゼ（以上大和化成社製）、トヨチーム NE P (東洋紡績社製）、ニュートラーゼ、エスペラーゼ、サビナーゼ、デユラザィム、バイオ フィードプロ、ァノレカラーゼ、 NUE、ピラーゼ、クリア一レンズプロ、エバラーゼ、ノボザ ィム一 FM、ノボラン（以上ノボノルディスクバイオインダストリ一社製）、ェンチロン一 N BS、 一SA (以上洛東ィ匕成工業社製）、アルカリプロテアーゼ GL440、ォプテイクリー ン—M375プラス、—L1000、ー 03440 (以上協和発酵社製）、ビォプラーゼ 03—30 、 SP— 4FG、 XL— 416F、 AL—15FG (以上ナガセ生化学工業社製）、ァロアーゼ AP — 10、プロテアーゼ YB、（以上ヤクルト薬品工業社製）、コロラーゼー N、—7089、ベ ロン W (以上樋口商会社製）、キラザィム P— 1 (ロシュ社製)等が特に好ましぐズブ チリシン、ナガーゼ、プロテアーゼータイプ XXVII、又はキラザィム P— 1が最も好 ましい。
[0049] また測定対象である糖ィ匕タンパク質がヘモグロビン Aleである場合には、バチルス 属、ァスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属、リゾパクター (Lysobact er)属由来のプロテアーゼがヒトヘモグロビンに対する作用が大き 、為に好ましく、 ノ チルス属、ァスペルギルス属、ストレプトマイセス属、トリチラチウム属由来のプロテア ーゼがより好ましぐリゾパクター属由来のプロテアーゼがより好ましい態様もある。糖 化ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖化された a鎖 N末端から糖化アミノ酸及 び Z又は糖ィ匕ペプチドを実質的に切り出すことなぐ糖化された β鎖 Ν末端から糖化 アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを切り出すバチルス属、又はリゾパクター (Lysobact er)属由来のプロテアーゼがさらに好ましぐバチルス 'エスピー (Bacillus sp.)、バチル ス 'サーモリティカス'ロッコ一 (Bacillus thermoproteolyticus Rokko)もしくはリゾバクタ 一ェンザィモゲネス (Lysobacter enzymogenes)由来のプロテアーゼが最も好まし!/ヽ。 なお、好ましい具体的なプロテアーゼとしては、例えばバチルス 'サ一モリティカス'口 ッコー (Bacillus thermoproteolyticus Rokko)由来のサーモリシン、サモアーゼ (大和化 成社製)、トヨチーム NEP (東洋紡績社製）、バチルス 'エスピー (Bacillus sp.)由来であ るプロテアーゼ（Bacillus sp. ASP- 842 FERM BP- 08641)、リゾパクターェンザィモ クィくス (Lysobacter enzymogenes) (Lysobacter
enzymogenes YK366 FERM BP— 10010)由来のプロテアーゼ等が挙げられ、サー モリシン、リゾパクターェンザィモゲネス由来のプロテアーゼが好ましぐサーモリシン が特に好ましい。また、リゾパクターェンザィモゲネス由来のプロテアーゼが特に好ま しい別の態様もある。
[0050] なお、本発明に用いることの出来るプロテア一ゼの活 ¾測定はカゼインーフォリン 法を用いて測定した。また、糖ィ匕ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖ィ匕された α鎖 N末端力も糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを実質的に切り出すことなぐ 糖化された β鎖 Ν末端カゝら糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを切り出す酵素基 質特異性は WO 2004/104203号公報、若しくは 2003-344052号公報に記されている 方法を用いて確認することができる。たとえば WO 2004/104203号公報記載の確認 方法としては例えばヘモグロビンの ex鎖 Ν末端及び β鎖 Ν末端 5残基の糖化べプチ ドを用いて、 j8鎖 Ν末端の糖ィ匕ペプチド、たとえば糖化バリルヒスチジン、糖化バリル ヒスチジルロイシン、糖化バリルヒスチジル口イシルスレオニンのみが生成され、糖ィ匕 ノ リルロイシン、糖化バリルロイシルセリン、糖化バリルロイシルセリルプロリンを生じな いプロテアーゼであれば良い。また、たとえば 2003-344052号公報に記されている確 認方法としては、糖化バリルヒスチジルパラ-トロア-リド及び糖化バリルロイシルパラ 二トロア二リドを用いて、糖化バリルヒスチジルパラ二トロアニリドのみ力らパラ二トロア 二リンを遊離するものであれば良 、。
[0051] 本発明に使用しうる糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素としては、 前記プロテアーゼの作用により、糖化タンパク質から生成される糖化アミノ酸及び Z 又は糖ィ匕ペプチドに有効に作用し、実質的に糖ィ匕タンパク質が測定できる酵素であ れば如何なるものを用いてもよいが、好ましくは、 αアミノ基が糖ィ匕されたアミノ酸及 び Ζ又は ocァミノ基が糖ィ匕されたペプチドによく作用する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖 化ペプチドに作用する酵素、 εァミノ基が糖化されたアミノ酸及び Ζ又は εアミノ基 が糖ィ匕されたペプチドによく作用する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用 する酵素等が挙げられる。酵素の種類としてはデヒドロゲナーゼ、ォキシダーゼ及び キナーゼ等がある力 広く研究されているォキシダーゼが好ましい。
[0052] εァミノ基が糖化されたアミノ酸及び Ζ又は εァミノ基が糖化されたペプチドによく 作用する糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の例としては、ギべレ ラ（Gibberella)属、ァスペルギルス（Aspergillus)属、カンジダ（Candida)属、ぺ -シリ ゥム（Penicillium)属、フサリウム（Fusarium)属、アクレモ -ゥム（Acremonium)属又は デバリオマイゼス (Debaryomyces)属由来のォキシダーゼ等が挙げられる。
[0053] さらに、プロテアーゼと共存させた状態でも充分な活性を有し、かつ安価に製造可 能な酵素の例としては、遺伝子組み換え型ケトァミンォキシダーゼ (KAOD；旭化成フ ァーマ社製； Clinica Chimica Acta, 2002年、 324、 p. 61— 71に記載）及びカ卩えて糖 ィ匕バリン反応性を著しく低下させた変異型 KAOD (KAOD -V ;旭化成ファーマ社製； WO 02/27330号公報に記載の FOD遺伝子を含有する形質転換微生物 JM109 ' pcm FOD5(FERM BP— 7848)が生産する KAOD)が挙げられる。尚、糖化アミノ酸及び Z 又は糖化ペプチドに作用する酵素の活性は文献 (Clinia Chimica Acta, 2002年、 32 4、 p. 61— 71)記載の方法で測定した。
[0054] また aァミノ基が糖化されたアミノ酸及び Z又は aァミノ基が糖ィ匕されたペプチドに よく作用する糖化アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の例としては、コリ ネバクテリゥム（Corynebacterium)由来のォキシダーゼ、前記遺伝子^み換え型ケト アミンォキシダーゼ（KAOD ;旭化成ファーマ社製； Clinica Chimica Acta, 2002年、 3 24、 p. 61— 71に記載)及びヘモグロビン Ale測定時に有用な糖化バリルロイシンよ りも糖化バリルヒスチジンに作用が高いステフイリゥム属、ネオコスモスボラ属、ァカェ トミゥム属、力エトミゥム属、コニォ力エタ属、コニォカェチジゥム属、ァルスリニゥム属 、ピレノケータ属、レプトスフェリァ属、プレオスポラ属、オフィオボラス属、カーブラリア 属、フォーマ属由来の酵素が挙げられる。
[0055] また、ヘモグロビン Ale測定時に有用な糖化バリルロイシンよりも糖化バリルヒスチ ジンに作用が高い糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素のより好まし い例としては、ステフイリゥム 'エスピー菌株、ネオコスモスポラ 'バシンフエクタ（Neoco smospora vasinfecta) ;IFO7590菌株、 WO 2004/104203記載のネオコスモスボラ. ノ シンフエクタ（Neocosmospora vasinfecta) 474菌株、ァカエトミゥム 'エスピー菌株、 力エトミゥム .エスピー、コ-ォ力エタ .エスピー菌株又はコ-ォカェチジゥム .サボリ A TCC菌株、ァルスリュウム 'エスピー T06、ァルスリュウム 'ファェォスペルマム NBR C31950、ァルスリュウム 'ファェォスペルマム NBRC6620、ァルスリュウム'ジャポ 二カム NBRC31098、ピレノケータ 'エスピー YH807、ピレノケータ 'ゲンチアニコラ MAFF425531、ピレノケータ 'テレストリス NBRC30929、レプトスフエリア'ノドラム（ 分生子世代名フォーマ ·ヘンネレルギ一） NBRC7480、レプトスフエリア ·ドリオラム J CM2742、レプトスフエリア ·マクランス（分生子世代名フォーマ 'リンガム） MAFF72 6528、プレオスポラ 'ノヽーブラム NBRC32012、プレオスポラ 'ベタエ（分生子世代 名フォーマ'ベタエ） NBRC5918、オフィオボラス'へルポトリカス NBRC6158、カー ブラリア'クラベータ YH923 (Curvulalia clavata FERM BP-10009)などの菌株由来 の酵素が挙げられ、特に好ましくはネオコスモスポラ 'バシンフエクタ（Neocosmospora vasinfecta) ;IFO7590菌株、 WO 2004/104203記載のネオコスモスポラ 'バシンフ ェクタ（Neocosmospora vasinfecta) 474菌株、カーブラリア'クラベータ YH923 (Curv ulalia clavata FERM BP- 10009)由来の酵素が挙げられ、最も好ましくはネオコスモ スポラ 'バシンフエクタ（Neocosmospora vasinfecta) ;IFO7590菌株由来の酵素が挙 げられる。また、カーブラリア'クラベータ YH923 (Curvulalia clavata FERM BP-100 09)由来の酵素が最も好ましい別の態様もある。なお基質特異性の確認は基質に糖 ィ匕バリルヒスチジン及び糖化バリルロイシンを用いてその作用を確認すればよ 、。
[0056] 本発明に使用しうるプロテアーゼの安定化剤としては、試薬保存中にプロテアーゼ の活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いてもよぐ特に試薬を液体の状 態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える物質であれば好ま 、。 [0057] 好ましいプロテアーゼの安定化剤の例としてはジメチルスルホォキシド、アルコール 、カルシウム、食塩、第四級アンモ-ゥム塩及び第四級アンモ-ゥム塩型陽イオン界 面活性剤が挙げられる。アルコールの例としては、エタノール、プロパノール、ェチレ ングリコール、グリセリン等が挙げられ、第四級アンモ-ゥム塩型陽イオン界面活性剤 の例としてはラウリル硫酸トリエタノールァミン、塩ィ匕ラウリルトリメチルアンモ-ゥム等 が挙げられる。
[0058] また、これらのプロテアーゼ安定化剤の使用濃度としては、試薬保存中にプロテア ーゼの活性低下を抑える濃度であればいかなる濃度で用いてもよぐ特に試薬を液 体の状態で保存中にプロテアーゼの活性低下を抑える濃度であれば好ま U、。好ま しい濃度としては、例えば DMSOを安定化剤として添加する場合には、下限濃度は 5 %以上、好ましくは 10%以上であり、上限の濃度は 50%以下、好ましくは 40%以下の濃度 で添加すればよい。
[0059] 本発明に使用しうる糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の安定ィ匕 剤としては、試薬保存中に少なくとも糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用す る酵素の活性低下を抑える物質であればいかなるものを用いてもよぐ特に試薬を液 体の状態で保存中に少なくとも糖ィヒアミノ酸及び Z又は糖ィヒペプチドに作用する酵 素の活性低下を抑える物質であれば好まし 、。
[0060] 好ま 、糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の安定化剤の例と しては糖アルコール、スクロース、マグネシウム、カルシウム、硫安、アミノ酸、ザルコ シンが挙げられる。糖アルコールの例としては、ソルビトール、マン-トール、トレハロ ース、グリセリン等が挙げられる。また、アミノ酸としては全てのアミノ酸に強い安定ィ匕 効果があるが、特に標準アミノ酸が好ましぐ中でもより好ましくは、プロリン、ダルタミ ン酸、ァラニン、ノ リン、グリシン、リジン等が挙げられる。
[0061] また、これらの糖化アミノ酸及び Z又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤の 使用濃度としては、試薬保存中に糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドに作用する 酵素の活性低下を抑える濃度であればいかなる濃度で用いてもよぐ特に試薬を液 体の状態で保存中にぉ 、て糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素 の活性低下を抑える濃度であれば好ましい。好ましい濃度としては、例えばソルビト ールを安定化剤として添加する場合には、下限濃度は 0.1%以上、好ましくは 0.2%以 上であり上限の濃度は 30%以下、好ましくは 20%以下の濃度で添加すればよい。
[0062] 本発明における、試薬の安定性は、例えば以下のように判定することができる。液 状試薬を、冷蔵 (2〜10°C)保存、好ましくは 4°Cで、 6ヶ月保存する（あるいは、 37°C、 4日間保存の条件を代用してもよい)。この保存後の試薬と、保存前の試薬を用いて 、濃度既知の糖ィ匕アルブミンあるいはヘモグロビン Ale (あるいは糖ィ匕ヘモグロビン） をキヤリブレーターとして測定し、血清若しくは溶血液 (溶血処理した血液)を試料とし て測定し、保存前の試薬と保存後の試薬で濃度を比較する。その差異が少ない方が 好ましぐ差異がないことが大変に好ましい。
[0063] 本発明のプロテアーゼ反応促進剤を用いたプロテアーゼ反応促進方法は、大変に 有用である。
[0064] 本発明に使用しうる酵素反応の検出に使用する色素としては、例えば、補酵素、テ トラゾリゥム塩、トリンダー試薬、ロイコ型試薬等が挙げられるが、補酵素、トリンダー試 薬、ロイコ型試薬が好ましぐトリンダー試薬、ロイコ型試薬等のパーォキシダーゼの 作用により発色する色素がさらに好ましぐロイコ型試薬が特に好ましい。
例えばデヒドロゲナーゼを用いて糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを測定する 場合には、 NAD (Nicotinamide adenine dinucleotide)等の補酵素、若しくは-トロテト ラゾリゥムブルー、テトラゾリゥムブルー、 2- (4—ョードフエ-ル） 3— (4— -トロフ ェニル） 5— (2, 4 ジスルフォフエ-ル） 2H—テトラゾリゥム： WST- 1、 2— (4 ョ ードフエ-ル）—3 (2, 4—ジ-トロフエ-ル）—5 (2, 4—ジスルフォフエ-ル）― 2H—テトラゾリゥム： WST- 3、 2- (2—メトキシ一 4 -トロフエ-ル） 3— (4 ニトロ フエ-ル） 5— (2, 4 ジスルフォフエ-ル） 2H—テトラゾリゥム： WSR- 8 (以上同 人化学研究所社製）に代表される各種テトラゾリゥム塩を用いることが出来る。
[0065] また例えばォキシダーゼを用いて糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを測定す る場合には、はォキシダーゼの作用の結果生じた過酸ィヒ水素をパーォキシダーゼの 存在下、 4—ァミノアンチピリン (4-AA)若しくは 3—メチル 2—ベンゾチアゾリノンヒド ラゾン (MBTH)等のカップラーとフエノール等の色原体との酸ィ匕縮合により色素を生 成するトリンダー試薬、或いは、ロイコ型試薬を用いることができる。 [0066] トリンダー型試薬の水素供与体としては、フエノール誘導体、ァ-リン誘導体、トルイ ジン誘導体等が使用可能であり、具体例として、 N—（3—スルホプロピル)ァニリンナ トリウム 1水（HALPS)、 N ェチルー N— (3 スルホプロピル）ー3—メチルァ-リンナ トリウム 1水（TOPS)、 N—ェチルー N— (2 ヒドロキシ— 3—スルホプロピル） - 3, 5 —ジメトキシァ-リンナトリウム 1水（MAOS)、 N— (3—スルホプロピル） - 3, 5 ジメト キシァ-リンナトリウム 1水（HDAPS)、 N— (2—ヒドロキシ— 3—スルホプロピル）—3, 5—ジメトキシァ-リンナトリウム（HDAOS)、 N ェチル N— (3—スルホプロピル） - 3, 5 ジメトキシァ-リンナトリウム 1水（DAPS)、 N ェチル—N— (2 ヒドロキシ —3—スルホプロピル） - 3, 5—ジメトキシァ-リンナトリウム（DAOS)、 N—ェチル— N— (3—スルホプロピル）ァ-リンナトリウム（ALPS)、 N ェチル—N— (3—スルホ プロピル） 3—メトキシァ-リンナトリウム 1水（ADPS)、 N ェチル N— (2 ヒドロ キシ— 3—スルホプロピル）—3—メトキシァ-リンナトリウム 2水（ADOS)、 N—ェチル -N- (2—ヒドロキシ一 3—スノレホプロピノレ） m—トノレイジン（TOOS)、 N, N ビス (4—スルホブチル） - 3 メチルァ-リン 2ナトリウム (TODB；以上同人化学研究所社 製)等が挙げられる。
[0067] 本発明に使用しうるロイコ型色素としては、いかなる色素を用いても良いが、たとえ ば入手が容易な N— (カルボキシメチルァミノカルボ-ル）—4, 4—ビス（ジメチルアミ ノ）ビフエ-ルァミン（DA64)、 10 （カルボキシメチルァミノカルボ-ル）ー 3, 7 ビス (ジメチルァミノ)フエノチアジン (DA67)；以上和光純薬社製等） 2, 2'ーァミノビス (3 ェチルベンゾチアゾリノン 6—スルホン酸 (ABTS)、ビス一（4ージェチルアミノフ ェ -ル） 2—スルフォフエ-ルメタン（BSPM)、ビス [3 ビス（4 クロ口フエ-ル）メチ ルー 4 ジメチルァミノフエ-ル]ァミン（BCMA)、 10— N—メチルカルバモイルー 3, 7 ジメチルァミノ一 10H フエノチアジン（MCDP)；以上和光純薬社製、 o トリジン 、 3, 3，一ジァミノべンジジン '4HC1 (DAB)、 3— (4—ヒドロキシフエ-ル）プロピオン 酸（HPPA)、N, N，—ビス（2 ヒドロキシ— 3—スルフォフエ-ル）トリジン '2Na'4H 0
2
(SAT-3)、3, 3，， 5, 5，一テトラメチルベンジジン（TMBZ)、N— (3—スルフォプロピ ル） 3, 3' , 5, 5，一テトラメチルベンジジン 'Na (TMBZ- PS)、 N, Ν' , Ν' , Ν" , Ν ，，一へキサ（3—スルフォプロピル） -4, 4' , 4"—トリアミノトリフエ-ルメタン '6Na(T PM-PS) (以上同人化学研究所社製)等が挙げられる。
[0068] 本発明に使用しうる色素の安定化剤としては、色素の安定性を向上させるものであ ればいかなる物質を用いても良いが、好ましくはシクロデキストリンである。シクロデキ ストリンは酵素反応の検出に使用する色素の安定化効果が得られるシクロデキストリ ンであればいかなるものを用いても良い。たとえば α—シクロデキストリン類、 βーシ クロデキストリン類、 Ίーシクロデキストリン類が挙げられるが、 13ーシクロデキストリン 類、 γ —シクロデキストリン類が好ましぐ j8—シクロデキストリン類が特に好ましい。 a—シクロデキストリン類としては、 a—シクロデキストリンが挙げられる。 y—シクロ デキストリン類としては、 γ—シクロデキストリン、カルボキシメチルー γ—シクロデキ ストリンが挙げられ、 Ί—シクロデキストリンが好ましいが、カルボキシメチル一 γ—シ クロデキストリンが好ましい場合もある。 —シクロデキストリン類としては、 β—シクロ デキストリン、カルボキシメチルー 13ーシクロデキストリン、ジメチルー 13ーシクロデキ ストリン、モノアミノ一 13—シクロデキストリン、 2—ヒドロキシプロピル一 β—シクロデキ ストリン、メチル一 13—シクロデキストリンが挙げられる力 2—ヒドロキシプロピル一 β —シクロデキストリン、メチル一 /3—シクロデキストリンが好ましぐ 2—ヒドロキシプロピ ルー 13ーシクロデキストリンが特に好ましい。また、メチルー j8—シクロデキストリンが 大変に好ましい場合もある。
結局、シクロデキストリンとしては、 a—シクロデキストリン、 j8—シクロデキストリン、 γ—シクロデキストリン、カルボキシメチル一 γ—シクロデキストリン、カルボキシメチ ル一 β—シクロデキストリン、ジメチル一 β—シクロデキストリン、モノアミノ一 β—シク ロデキストリン（以上シグマ社等力も入手可能）、 2—ヒドロキシプロピル一 β—シクロ デキストリンもしくはメチル— β—シクロデキストリン（以上日本食品加工株式会社等 から入手可能）が好ましぐ 2—ヒドロキシプロピル— 13—シクロデキストリン、メチル— β—シクロデキストリンがより好ましぐ 2—ヒドロキシプロピル一 β—シクロデキストリン が特に好ましい。また、メチル— β—シクロデキストリンが大変に好ましい場合もある。
[0069] 該シクロデキストリンを酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤として使用する ことができる。又、酵素反応の検出に使用する色素を安定ィ匕させるためにシクロデキ ストリンを使用することができる。さらには、酵素反応の検出に使用する色素の安定化 試薬を製造するためにシクロデキストリンを使用することができる。
酵素反応の検出に使用する色素の使用濃度としては、試薬保存中に発色が十分 に保たれる濃度であれば 、かなる濃度で用いても良ぐ特に試薬を液体の状態で冷 蔵保存中に発色が十分に保たれる濃度であれば好まし 、。好ま U、濃度の例として は、たとえば DA67を用いた場合には 1 μ Μ以上、好ましくは 2 μ Μ以上であり、上限 は lOOmM以下、好ましくは 50mM以下である。
シクロデキストリンの使用濃度としては、試薬保存中に酵素反応の検出に使用する 色素の劣化を抑える濃度であればいかなる濃度で用いても良ぐ特に試薬を液体の 状態で保存中に色素の劣化を抑える濃度であれば好まし 、。好まし 、濃度の例とし ては、例えばメチル一 β—シクロデキストリンを安定化剤として添加する場合には、下 限濃度は 0.5%以上、好ましくは 1.0%以上であり上限の濃度は 50%以下、好ましくは 40% 以下の濃度で添加すればょ 、。また色素とシクロデキストリンの重量比として好ま ヽ 比を示すと、下限としては、該色素：シクロデキストリン = 1 : 0. 01以上、好ましくは 1 : 0. 04以上であり、上限としては、 1 : 500万以下、好ましくは 1 : 3300000以下が好ま しい。
本発明に使用しうる好まし ヽ緩衝剤の具体的な例としては、グッドの緩衝剤が好ま しぐ例えば、 3— [4一（2 ヒドロキシェチル）一 1ーピぺラジュル]プロパンスルホン 酸（EPPS)、 2— [4— (2 ヒドロキシェチル）—1—ピぺラジュル]エタンスルホン酸（H EPES)、 2 ヒドロキシ一 3— [4— (2 ヒドロキシェチル） 1—ピぺラジュル]プロパン スルホン酸（HEPPSO)、 N— (2—ァセトアミド）— 2—アミノエタンスルホン酸 (ACES)、 N— (2—ァセトアミド)イミノジ酢酸 (ADA)、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル）—2— アミノエタンスルホン酸（BES)、 N, N ビス（2—ヒドロキシェチル）グリシン（Bicine)、 ビス（2—ヒドロキシェチル)イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン（Bis- Tris)、 N シクロ へキシル 3 ァミノプロパンスルホン酸（CAPS)、 N シクロへキシル 2 ヒドロキ シ— 3—ァミノプロパンスルホン酸（CAPSO)、 N -シクロへキシル - 2-アミノエタンス ルホン酸（CHES)、 3— [N, N ビス（2 ヒドロキシェチル）ァミノ] 2 ヒドロキシプ 口パンスルホン酸（DIPSO)、 2 モルフイリノエタンスルホン酸（MES)、 3 モルフイリ ノプロパンスルホン酸（MOPS)、 2 ヒドロキシ一 3 モルフィリノプロパンスルホン酸（ MOPSO)、ピペラジン一 1, 4 ビス（2 エタンスルホン酸（PIPES)、ピペラジン一 1, 4 ビス（2 ヒドロキシ一 3 プロパンスルホン酸）（POPSO)、 N トリス（ヒドロキシメ チル)メチル 3 ァミノプロパンスルホン酸（TAPS)、 2 ハイド口キシ— N トリス（ヒ ドロキシメチル)メチル—3—ァミノプロパンスルホン酸（TAPSO)、 N トリス（ヒドロキ シメチル)メチルー 2—ァミノプロパンスルホン酸（TES)、 N—[トリス（ヒドロキシメチル） メチル]グリシン（Tricine)、及びトリスヒドロキシメチルァミノメタン（Tris)、 N— (2—ァ セトアミド） 2—アミノエタンスルホン酸 (ACES)、 N— (2—ァセトアミド）イミノジ酢酸（ ADA)等を用いた緩衝剤、又はホウ酸、アンモニア、グリシン、炭酸、酢酸、リン酸、ジ エタノールァミン、 p フエノールスルホン酸、 2 アミノー 2—メチルプロパン一 1, 3 ージオール、力コジル酸、クェン酸、マレイン酸、ベロナール及び 3, 3—ジメチルダ ルタル酸等が挙げられる。
さらに好ましい緩衝剤の例としては、 pH中性付近に緩衝作用をもつ緩衝剤、例え ば EPPS、 HEPES、 HEPPSO、 ACES, ADA, BES、 Bicine、 Bis- Tris、 CHES、 DIPSO、 M ES、 MOPS, MOPSO, PIPES, POPSO、 TAPS, TAPSO, TES、 Tricine, Tris、 ACES, ADA,ホウ酸、アンモニア、グリシン、リン酸、ジエタノールァミン、 p フエノールスル ホン酸、 2 アミノー 2—メチルプロパン— 1, 3 ジオール、力コジル酸、クェン酸、マ レイン酸、ベロナール及び 3, 3—ジメチルダルタル酸等であり、最も好ましくは 3, 3— ジメチルダルタル酸である。
[0071] 本発明の酵素反応の検出に使用する色素が安定化された状態で含有されている 試薬としては、少なくとも本発明の酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤及び 酵素反応の検出に使用する色素を含有する試薬であれば何ら限定されない。
[0072] また、上記本発明の試薬に対して、さらにカタラーゼを共存させることも大変に好ま しい。カタラーゼを共存させる意味は保存中に生じる過酸ィ匕水素を消去し保存中の 色素の発色を極力抑えることにある。本発明に使用しうるカタラーゼとしてはカタラー ゼ活性をもつ酵素であれば 、かなるものを用いても良 、が、例えばァスペルギルス · 二ガー由来の酵素、牛肝由来の酵素が好ましぐァスペルギルス ·-ガー由来の酵素 が特に好ましい。また、牛肝由来の酵素が特に好ましい場合もある。尚、ァスペルギ ルス'二ガー由来の酵素、牛肝由来の酵素はシグマ社など力 入手可能である。 [0073] 本発明に使用しうるヘモグロビン測定用試薬、及び測定方法としては本発明のプロ テアーゼ反応促進剤を用いてヘモグロビンを測定する試薬及び測定方法であれば V、かなる試薬及び測定方法を用いてもよ!、が、前記酢酸基を含む化合物又はその 塩、 N—ァシルタウリン又はその塩、若しくはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫 酸又はその塩を含有する試薬及び該試薬を用いた測定方法が好ましぐ酢酸基を含 む化合物又はその塩として前記 N—ァシルアミノ酸又はその塩、若しくはアルキルェ 一テルカルボン酸又はその塩を含有する試薬及び該試薬を用いた測定方法が特に 好ましい。これらのプロテアーゼ反応促進剤の使用濃度としては、ヘモグロビンが測 定できる濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、例えば通常下限は 0.01%以 上、好ましくは 0.05%以上であり、最も好ましくは 0.1%以上であり、上限は 50%以下 であり、好ましくは 40%以下であり、最も好ましくは 30%以下である。
[0074] 本発明に使用しうるヘモグロビン測定の操作としては前記ヘモグロビン定量試薬に 被検液 0.001〜0.5mlをカ卩え、 37°Cの温度にて反応させ、反応開始後一定時間後の ヘモグロビンの色調（吸光度）を測定すればよ!、。ヘモグロビンの色調としては例え ば 200ηπ！〜 1000nm、好ましくは 280nm〜800nmの吸光度を測定すればよい。この場 合、既知濃度のヘモグロビンを用いて測定した場合の吸光度変化と比較すれば被 検液中のヘモグロビンの量を求めることができる。
[0075] 本発明に使用しうる糖ィ匕タンパク質測定用試薬としては本発明のプロテアーゼ反応 促進剤及び Z又は本発明のシクロデキストリンに代表される酵素反応の検出に使用 する色素の安定化剤を用いて糖ィ匕タンパク質を測定する試薬であればいかなる試薬 を用いてもよいが、前述のプロテアーゼ、及び糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチド に作用する酵素を含む試薬が好ましい。プロテアーゼと、糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖 化ペプチドに作用する酵素は同一溶液に処方されてもよいが、プロテアーゼを含む プロテアーゼ試薬、糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素を含む検 出試薬力も成る試薬を用いることが好ましぐプロテアーゼ反応促進剤はどちらに処 方されてもよいが、プロテアーゼが糖ィ匕タンパク質に作用する時に若しくは前もって プロテアーゼ反応促進剤が存在すればよい。また、プロテアーゼを含有する試薬に プロテアーゼ安定化剤を、糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素を含 有する試薬に糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素の安定化剤を添 加するとより好ましい。
なお、酵素反応の検出に使用する色素、及び本発明のシクロデキストリンに代表さ れる酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤と、カタラーゼを共存させ、バーオ キシダーゼは別の試薬に添加し測定時に混合されるようにするとより好ましい。これ は色素とパーォキシダーゼが共存すると、保存中に反応が進み発色してしまう可能 性がある力 である。
[0076] 具体的な本発明に使用しうるプロテアーゼ試薬としては、タンパク質分解反応が効 率よく進行するように pH、緩衝剤及びプロテアーゼ濃度を決定し、その後プロテア一 ゼ反応促進剤、プロテアーゼ安定化剤を有効な濃度になるように適宜調製して添カロ すればよい。
本発明に使用しうる緩衝剤としては、酵素反応の検出に使用する色素の安定性に 影響を与えな 、緩衝剤であれば 、かなる緩衝剤を用いても良 、が、具体例は前述し た通りである。その使用濃度は、測定時の緩衝剤濃度として設定することが重要であ り、測定時の緩衝剤濃度の上限が 80mM以下、さらに好ましくは 50mM以下であり、ま たその下限は O.lmM以上好ましくは ImM以上であれば良い。
例えばタンパク質がアルブミンであり測定対象が糖ィ匕アルブミンである場合におい て、プロテアーゼタイプ XXIV (シグマ社製）を用いる場合には pHが？〜 10付近でタン ノ ク質分解活性が強いため、反応の pHは？〜 10を選択することが好ましい。
[0077] また、例えばタンパク質がヘモグロビンであり測定対象が糖ィ匕ヘモグロビンもしくは ヘモグロビン Aleである場合において、前記トヨチーム NEP (東洋紡績社製)を用いる 場合には、タンパク質分解活性力 ¾H6.0〜9.0付近で強いことから、反応の pHは pH6. 0〜9.0を選択することが好まし!/、。
[0078] プロテアーゼ濃度は実際に使用される反応時間中に被検液中のタンパク質を十分 に分解し得る濃度で有ればよぐ下限は lOU/ml以上、好ましくは lOOU/ml以上であり 、最も好ましくは 500U/mlであり、上限は 1.0 X 106U/ml以下であり、好ましくは 5.0 X 10 5U/ml以下であり、最も好ましくは 3.0 X 105U/ml以下である。
[0079] プロテアーゼ反応促進剤は本発明のプロテアーゼ反応促進剤であれば!/ヽかなるも のを用いてもよい。使用濃度としては、タンパク質を効果的に変性させプロテアーゼ のタンパク質への作用が大きくなる濃度であればいかなる濃度を用いてもよいが、例 えば通常下限は 0.01%以上、好ましくは 0.05%以上であり、最も好ましくは 0.1%以上 であり、上限は 50%以下であり、好ましくは 40%以下であり、最も好ましくは 30%以下 である。
[0080] プロテアーゼの安定化剤としての使用濃度としては、液状状態の冷蔵保存で 6ヶ月 安定な試薬性能を示す濃度であれば 、かなる濃度を用いてもょ 、が、例えばジメチ ルスルホキシドを用いた場合には、通常下限は 1%以上、好ましくは 5%以上であり、上 限は 60%以下、好ましくは 50%以下である。
[0081] カタラーゼの使用濃度としては、酵素反応の検出に使用する色素が不安定になる 過酸化水素等を消去できる濃度であれば 、かなる濃度を用いても良 、が、例えば通 常下限は O.lU/ml以上、好ましくは lU/ml以上であり、最も好ましくは 2U/ml以上であ り、上限は 3000U/ml以下であり、好ましくは 1500U/ml以下であり、最も好ましくは 150 OU/mlである。
[0082] 本発明に使用しうる糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する酵素を含有す る測定試薬の組成にっ ヽては、使用する糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作 用する酵素の至適 pHを考慮し反応が効率よく進行するように pHを選択し、糖化アミノ 酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素量を決定すればょ 、。次 、でパーォキシ ダーゼ、糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の安定化剤及びプロ テアーゼ試薬にカタラーゼを用いた場合にはその作用を止めるアジィ匕ナトリウム等の ァザイドを添加すれば良 、。
例えばタンパク質がアルブミンであり測定対象が糖ィ匕アルブミンである場合におい て、例えば前記の KAOD若しくは KAOD—V (旭化成ファーマ社製)を使用する場合、 最大活性の 50%
以上の活性を示す領域力 ¾H6.5〜10と広いので、反応の pHは 6.5〜10を選択するこ とが好ましい。また、例えばタンパク質がヘモグロビンであり測定対象が糖ィ匕へモグロ ビンもしくはヘモグロビン Aleである場合において、例えば前記のカーブラリア'クラ ベータ YH923由来 KAODを使用する場合、最大活性の 50%以上の活性を示す領域 力 ¾H6.0〜10と広!、ので、反応の pHは 6.0〜10を選択することが好まし!/、。
[0083] 糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の使用濃度としては、糖ィ匕タ ンパク質が測定できる濃度であれば 、かなる濃度を用いてもょ 、が、通常下限は 0.5 U/ml以上、好ましくは lU/ml以上であり、上限は 1000U/ml以下、好ましくは 500U/ml 以下である。
パーォキシダーゼ使用濃度としては、測定系より生じた過酸化水素が測定できる濃 度であればいかなる濃度を用いても良いが、通常下限は 0.01U/ml以上、好ましくは 0 .lU/ml以上であり、上限は lOOU/ml以下、好ましくは 50U/ml以下である。
糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の安定化剤の使用濃度とし ては、液状状態の冷蔵保存で 6ヶ月安定な試薬性能を示す濃度であればいかなる 濃度を用いてもよいが、例えばソルビトールを用いた場合には、通常下限は 0.1%以上 、好ましくは 1%以上であり、上限は 30%以下、好ましくは 20%以下である。
[0084] カタラーゼ反応を止める目的でァザイドを使用する場合のァザイドとしては、力タラ ーゼ活性が十分にとまる濃度であれば 、かなる濃度を用いてもょ 、。たとえばアジィ匕 ナトリウムを用いる場合の使用濃度としては、通常下限は 0.01%以上好ましくは 0.05% 以上であり、上限は 10%以下、好ましくは 5%以下である。
[0085] 本発明に基づく糖ィ匕タンパク質の測定方法にぉ ヽて、糖化アミノ酸及び/又は糖ィ匕 ペプチドに作用する酵素を用いる場合に、その作用の検出は、例えばデヒドロゲナ ーゼを用いた場合には補酵素の変化量を、例えば補酵素として NADを用いて生成 される変化の量として還元型補酵素である還元型 NADをその極大吸収波長域であ る 340nm付近の波長にて比色計で測定する等公知の技術を用い直接定量するか、 若しくは生じた還元型補酵素を各種ジァフオラーゼ、またはフエナジンメトサルフエ一 ト等の電子キャリアー及び-トロテトラゾリゥム、 2— (4 Lodophenyl) 3— (4 nitroph enyl) 5— (2,4— disulfophenyl)― 2H tetrazolium, monosoaium
salt (WST— 1)、 2— (4— Lodophenyl)— 3— (2 ,4— dinitrophenyl)— 5— (2 ,4— disulfophe nyl)― 2H—tetrazolium, monosodium
salt (WST— 3;以上同仁ィ匕学研究所社製)に代表される各種テトラゾリゥム塩等の還 元系発色試薬を用い間接的に定量してもよぐまたこれ以外の公知の方法により直 接、間接的に測定してもよい。
また例えばォキシダーゼを用いた場合には、酸素の消費量又は反応生成物の量を 測定することが好ましい。反応生成物として、例えばケトァミンォキシダーゼを用いた 場合には反応により過酸ィ匕水素及びダルコソンが生成し、過酸化水素及びダルコソ ン共に公知の方法により直接、間接的に測定する事が出来る。
[0086] 上記過酸化水素の量は、例えばパーォキシダーゼ等を用いて色素等を生成し、発 色、発光、蛍光等により定量してもよぐまた電気化学的手法によって定量してもよく 、カタラーゼ等を用いてアルコールからアルデヒドを生成せしめて、生じたアルデヒド の量を定量してもよい。
[0087] 過酸化水素の発色系は、パーォキシダーゼの存在下で 4ーァミノアンチピリン (4 AA)若しくは 3 メチル 2 -ベンゾチアゾリノンヒドラゾン (MBTH)等のカップラーと フエノール等の色原体との酸ィ匕縮合により色素を生成するトリンダー試薬、パーォキ シダーゼの存在下で直接酸化、呈色するロイコ型試薬 (N— (カルボキシメチルァミノ カルボ-ル）—4, 4 ビス（ジメチルァミノ）ビフヱ-ルァミン（DA64)、 10 （カルボキ シメチルァミノカルボ-ル） 3, 7 ビス（ジメチルァミノ）フエノチアジン（DA67)；以 上和光純薬社製等)等を用いることが出来る。
[0088] また過酸ィ匕水素を電極を用いて測定する場合、電極の材料としては、過酸化水素 との間で電子を授受する事の出来る材料である限り特に制限されないが、例えば白 金、金若しくは銀等が挙げられる。電極測定方法としてはアンべロメトリー、ポテンショ メトリー、クーロメトリー等の公知の方法を用いることが出来る力 さらにォキシダーゼ 又は基質と電極との間の反応に電子伝達体を介在させ、得られる酸化、還元電流或 いはその電気量を測定してもよ!/ヽ。電子伝達体としては電子伝達機能を有する任意 の物質が使用可能であり、例えばフ 口セン誘導体、キノン誘導体等の物質が挙げら れる。またォキシダーゼ反応により生成する過酸ィ匕水素と電極の間に電子伝達体を 介在させ得られる酸化、還元電流又はその電気量を測定してもよ ヽ。
さらに本発明の測定方法、試薬において、プロテアーゼを単独で使用することはも ちろんであるが、加えてその反応前後若しくは同時に他のエンドプロテアーゼ、又は 他のェキソプロテアーゼを作用させてもよ 、。 [0089] また本発明に基づく糖ィ匕タンパク質を測定する酵素反応試薬の組成には、例えば 界面活性剤、塩類や防腐剤などを適宜選択して添加してもよ!ヽ。
界面活性剤としてはポリオキシエチレンアルキルエーテル類、ポリオキシエチレンソ ルビタン脂肪酸エステル類、ポリビュルアルコール、等の 0.01〜10%、好適には 0.05 〜5%、各種金属塩類、例えば塩化リチウム、塩ィ匕ナトリウム、塩ィ匕カリウム、塩化マン ガン、塩化コバルト、塩化亜鉛、塩化カルシウム等の lmM〜5M、好適には 10mM〜l M、各種防腐剤、例えばアジ化ナトリウムの 0.01〜10%、好適には 0.05〜1%を適宜添 加すればよい。各種防腐剤としては、プロクリン（SUPELCO社製）の 0.01〜10%、好適 には 0.02〜5%を適宜添カ卩してもよ!、。
[0090] 本発明に使用しうる糖ィ匕タンパク質の測定方法としては、前記本発明の糖ィ匕タンパ ク質測定する酵素反応試薬の組成物に被検液 0.001〜0.5mlを加え、 37°Cの温度に て反応させ、レートアツセィを行う場合には、反応開始後一定時間後の 2点間の数分 ないし数十分間、例えば 3分後と 4分後の 1分間、又は 3分後から 8分後の 5分間にお ける変化した補酵素、溶存酸素、過酸ィヒ水素若しくはその他生成物の量を直接又は 間接的に前記の方法で測定すればよぐエンドポイントアツセィの場合には検出反応 開始後一定時間後の変化した補酵素、溶存酸素、過酸化水素若しくはその他生成 物の量を同様に測定すればよい。この場合既知濃度の糖ィ匕タンパク質を用いて測定 した場合の吸光度等の変化と比較すれば被検液中の糖ィ匕タンパク質の量を求めるこ とがでさる。
本発明の測定方法に使用しうるキヤリブレーターとしては前記既知濃度のタンパク 質のほかに既知濃度の糖ィ匕アミノ酸、又は糖ィ匕ペプチドを用いても良い。糖化アミノ 酸、又は糖ィ匕ペプチドの例としては、市販の合成ペプチドを用いればよいが、へモグ ロビン Aleを測定する場合には糖化バリルヒスチジン、糖化バリルヒスチジルロイシン プロリン等を用いることが出来る。キヤリブレーター中のペプチドの濃度は試料より生 じるペプチドの濃度が十分に測定できる濃度であれば良い。
[0091] 本発明に使用しうる糖ィ匕タンパク質割合測定用試薬の組成物としては、前記糖ィ匕タ ンパク質測定用試薬の組成物に、別途若しくは同時にタンパク質を測定する組成を 追加すればよい。例えばタンパク質が糖ィ匕アルブミンであれば、別途アルブミンを、 またタンパク質が糖ィ匕ヘモグロビン若しくはヘモグロビン Aleである場合には別途へ モグロビンを測定すればょ 、。アルブミンやヘモグロビンの測定は公知の方法を用い て行えばよい。
[0092] 別途アルブミンを測定する組成物としては公知のアルブミンを測定する方法であれ ば如何なる方法を用いてもよい。このような方法には、例えばブロムクレゾールグリー ン（以下 BCGと略す。）、ブロムタレゾールパープル（以下 BCPと略す。）、ブロモフエノ ールブルー（以下 BPBと略す。 )、メチルオレンジ（以下 MOと略す。）、又は 2—（4，一 ヒドロキシベンゼンァゾ)安息香酸（以下 HABAと略す。 )等のアルブミン特異的な色 素を用いる方法等が挙げられる。さらにまた、対象となるタンパク質がヘモグロビンで ある場合には、公知のヘモグロビンを測定する方法であれば如何なる方法を用いて もよい。このような方法には、例えばメトヘモグロビン法、シアンメトヘモグロビン法、ァ ザイドメトヘモグロビン法、緑色発色団形成法又はォキシヘモグロビン法等が挙げら れる。緑色発色団形成法とは、緑色発色団形成試薬とヘモグロビンを反応せしめ、 安定な生成物 (緑色発色団）を形成する方法であり、緑色発色団は英国特許公開第 2052056号に記述されるアルカリ性へマチン D— 575と同様な吸収スペクトルを有す る。
[0093] 本発明に使用しうる同一反応槽中でヘモグロビンの測定及びヘモグロビン Aleの 測定を連続しておこなう方法としては、本発明のプロテアーゼ反応促進剤が含有され て 、る試薬を用いるものであれば 、かなる方法を用いてもょ 、が、具体的な方法とし ては、プロテアーゼ反応促進剤を含む第 1反応試薬に試料を添加し、一定時間後、 例えば 3分若しくは 5分後等にヘモグロビンに特有な吸収例えば 220ηπ！〜 900nm、好 ましくは 280ηπ！〜 800nmの吸光度を測定し、続いてケトァミンォキシダーゼを含有する 第 2反応試薬を添加し、一定時間後、例えば 3分若しくは 5分後等に発色色素の吸 収極大付近の吸光度を測定すればよい。この場合プロテア一ゼは第 1反応試薬、第 2反応試薬どちらに含まれていてもよい。また、別途ヘモグロビン濃度、ヘモグロビン Ale濃度が既知の試料の吸光度と比較することでヘモグロビン濃度、ヘモグロビン A lc濃度に変換が可能である。通常ヘモグロビン Ale値は総ヘモグロビン濃度に対す るヘモグロビン Ale濃度の割合で表現されることから、ヘモグロビン Ale濃度を総へ モグロビン濃度で除し、割合換算すればよい。
[0094] さらに本発明の同一反応槽中でヘモグロビンの測定及びヘモグロビン Aleの測定 を連続しておこなうことを特徴とする方法としては同一波長を用いてヘモグロビン及 びヘモグロビン Aleを測定し、別途試料由来のにごり等の影響を差し引く目的で副 波長を測定し、測定波長から差し引くことが好ましい。測定波長としてはいかなる波 長を用いてもよいが、発色色素の吸収極大付近が好ましぐ例えば前記 DA67を用い る場合には 500nm〜700nmで測定が可能であり、好ましくは 550nm〜660nmであり、副 波長としては 600ηπ！〜 800nm、好ましくは 650nm〜750nmを用いて測定が可能である
[0095] 本発明の試薬は液状品、液状品の凍結物、液状品の凍結乾燥品、又は液状品の 乾燥品 (加熱乾燥及び Z又は風乾及び Z又は減圧乾燥等による）として提供できる 力 好ましい剤形は液状品である。
本発明の測定対象となる試料としては、少なくともヘモグロビン若しくは糖ィ匕タンパ ク質を含有する被検液であれば如何なるものを用いてもょ ヽが、好まし ヽ被検液とし ては血液成分、例えば血清、血漿、血球、全血若しくは分離された赤血球等が挙げ られる。また分離された赤血球や糖ィ匕ヘモグロビンをあら力じめプロテアーゼにより断 片化したプロテアーゼ処理液 (溶血液)も好まし 、被検液として用いることができる。 尚赤血球の分離は公知の遠心分離法によって、例えば 3000回転 3分程度で分離す ることが可能である。また分離した血球の溶血方法としては蒸留水で溶血させれば十 分である。
[0096] 本発明の糖ィ匕タンパク質測定試薬及び方法における測定対象である糖ィ匕タンパク 質としては、例えば糖ィ匕アルブミン又はヘモグロビン Ale (糖ィ匕ヘモグロビンを含ん でもよい）が挙げられるが、測定対象となる糖化タンパク質は何らこれらに限定される ものではなく、何れの糖ィ匕タンパク質を測定してもよ 、。
[0097] 試料中に目的とする糖ィ匕タンパク質、たとえばヘモグロビン Ale若しくは糖ィ匕アル ブミン以外にあらかじめ糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドが含まれ測定に影響 を与える場合、たとえば高カロリーアミノ酸輸液を受けて 、る患者の試料を測定する 場合若しくはヘモグロビン Aleを測定する場合に、分子内に大量の糖ィ匕アミノ酸が 存在し酵素の特異性のみでは目的とする β鎖 Ν末端の糖ィ匕を特異的に測定できな い場合にはこれらの目的外の成分を消去して測定する必要がある。
消去反応は糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素を用いて行えば よぐたとえば前記あらかじめ糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドが含まれ測定に 影響を与える場合には、第一試薬に糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用す る酵素を含み、第二試薬に含むプロテアーゼを含む試薬を用いればょ 、。
第一試薬に糖化アミノ酸及び Ζ又は糖化ペプチドに作用する酵素を含み、第二試 薬に含むプロテアーゼを含む試薬の処方につ!、ては前記の消去反応を含まな!/、試 薬のプロテアーゼ試薬、及び糖ィ匕アミノ酸測定試薬を用いることが出来るが、第一試 薬、第二試薬の混合比率が 1 : 1ではなぐ例えば 1 : 3、 1 :4又は 1 : 5などである場合 は、混合時に各成分が有効に働く濃度になるように適宜調整すればよい。つまり第 一試薬、第二試薬の混合比が 1 :4の場合、第一試薬に処方する成分は 5Ζ4の濃度 範囲に、第二試薬に処方する成分は前記の濃度範囲の 5倍の濃度範囲にすればよ い。
また、第一試薬にプロテアーゼ、及びヘモグロビン 鎖 Ν末端より生じない糖ィ匕アミ ノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを消去する糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドに作 用する酵素を含有し、第二試薬に第二試薬にヘモグロビン β鎖 Ν末端より生じた糖 化アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを検出する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ぺプチ ドに作用する酵素を含有する試薬処方については、前記の消去反応を含まない試 薬のプロテアーゼ試薬にヘモグロビン β鎖 Ν末端より生じない糖ィ匕アミノ酸及び/又 は糖ィ匕ペプチドを消去する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素を 0.5〜1000U/ml、好ましくは 1.0〜500U/ml添カ卩したもの、及び糖化アミノ酸測定試薬 を用いることが出来るが、第一試薬、第二試薬の混合比率が 1 : 1ではなぐ例えば 1 : 3、 1 :4又は 1 : 5などである場合は、混合時に各成分が有効に働く濃度になるように 適宜調整すればよい。つまり第一試薬、第二試薬の混合比が 1 :4の場合、第一試薬 に処方する成分は 5Z4の濃度範囲に、第二試薬に処方する成分は前記の濃度範 囲の 5倍の濃度範囲にすればよい。 [0099] さらに、消去反応で生じた過酸ィ匕水素は検出反応に悪影響を及ぼすことから第一 試薬にカタラーゼ及び Z又はパーォキシダーゼを処方し分解すればょ 、。カタラー ゼは l〜2000U/ml、好ましくは 5〜1000U/mlで処方すればよぐこれ以外の量処方し ても良い。アジ化ナトリウムは第二試薬中に 0.001〜0.1%好ましくは 0.02〜0.09%処 方すれば良い。またパーォキシダーゼは 0.1〜100U/ml、好ましくは 0.2〜50U/ml処 方すればょ 、がこれ以外の量処方しても良！、。
実施例
[0100] 本発明を実施例に基づいて説明する力 本発明は以下の例に限定されるものでは ない。
[実施例 1]プロテアーゼ反応促進剤のスクリーニング
<試薬 >
D R- 1 タンパク質分解試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO
4000U/ml 中性プロテアーゼ（TO YOBO社製）
1.5mM CaCl (和光純）
2
+ 試験サンプル
2) R-2 糖ィ匕アミノ酸検出試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
30U/ml KAOD (カーブラリア ·クラベータ YH923由来；旭化成ファーマ社製、 特開 2004-275013号公報に製法記載）
80U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
80 M DA-67 (和光純薬社製）
試験サンプルとしては以下のものをそれぞれ独立して用いた。尚（ ）内の濃度は R 中の最終濃度を示す。
[0101] Tween— 20(1%)、 Brij35(l%)、 TritonX— 100(1%)、デォキシコール酸 (1%)、ィミノ 2酢酸 (IDA; lmM)、 ZnSO4(0.1mM)、 AlC13(0.1mM),フエロシアン化カリウム (0.01mM)、ソル ビトール (5%)、グルコース (5%)、亜硝酸ナトリウム（2mM)、ジメチルスルホキシド（10%) 、 Adenosine 5'— triphosphate(ATP ;2mM)、 nicotinamide adenine dinucleotide(NAD ;2mM)、 flavin adenine dinucleotide(FAD ;2mM)、 （以上和光純薬社製)、ココイルサ ルコシンナトリウム（サルコシネート CN— 30 ; 1%)、ミリストイルサルコシンナトリウム（サ ルコシネート MN; 1%)、パルミトイルサルコシンナトリウム（サルコシネート PN; 1%)、ラウ ロイルメチルァラニンナトリウム（ァラ二ネート LN— 30； 1%)、ポリオキシエチレン（3)トリ デシルエーテル酢酸ナトリウム（ECTD— 3NEX； 1%)、ポリオキシエチレン（6)トリデシ ルエーテル酢酸ナトリウム（ECTD— 6NEX； 1%)ポリオキシエチレン（10)ラウリルエー テル酢酸（ 1^^0— 1¾^1100 ; 1%)、ラゥリルリン酸（ホステン1"[1^; 1%)、？^ーラゥロィル メチルタウリンナトリウム（LMT； 1%)、 N—ステアロイルメチルタウリンナトリウム（SMT； 1 %)ラウリル硫酸ナトリウム (SLS ; 1%)、ポリオキシエチレン（2)ラウリルエーテル硫酸トリ エタノールァミン（SBL -2T-36 ; 1%)、ポリオキシエチレン（4)ラウリルエーテル硫酸ト リエタノールアミン（SBL—4T; 1%)、ポリオキシエチレン（3)アルキルエーテル硫酸トリ エタノールァミン（SBL- 203- 27 ; 1%)、ラウリルジメチルァミノ酢酸べタイン (AM— 301； 1 %)、モノステアリン酸ポリオキシエチレン（15)グリセリル（TMGS— 15 ; 1%)、 3— [(3— C holamidopropyl) dimethyl― ammonio]propanesulfonic
acid (CHAPS; 1%), (以上日光ケミカル社製）、 WST— 3(2mM :同仁ィ匕学研究所社製） <操作方法 >
37度にインキュベートされた R— 1;180 1に HbAlc測定用実試料標準物質（1次キヤ リブレーター JDS
HbAlc Lot2福祉'医療技術振興会製、 30倍希釈品）20 1を添加し、 37°Cで反応を 開始し、正確に 5分後に R— 2;45 1を添カ卩した。 R— 2添加前及び添加 5分後の 660nm の吸光度を測定した。表 1に、上記試験サンプルのプロテアーゼ反応促進効果の評 価結果を示した。表 1中に示した AH—ALは、 1次キヤリブレーターのレベル 4 (9.88 %)力 得られた吸光度 AHから、 1次キヤリブレーターのレベル 2 (5.38%)から得ら れた吸光度 ALを差し引いた差である。ここで AH— ALが大きければプロテアーゼ反 応促進効果があると判定できる。特に、 AH—ALが 20以上の場合には優れた促進 効果がある。
表 1に示すように N—ァシルアミノ酸であるサルコシネート CN— 30、サルコシネート MN、サルコシネート PN、ァラ-ネート LN— 30、アルキルエーテルカルボン酸である E CTD— 3NEX、 ECTD— 6NEX、 AKYPO— RLM100、 N—ァシルタウリン酸である LMT 、 SMT、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩である SBL— 2T— 36、 SBL— 4Τ 、 SBL— 203— 27に効果が見られた。
このこと力 酢酸基を含む化合物又はその塩、 Ν—ァシルタウリン又はその塩、若し くはポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩にプロテアーゼ反応促進 効果があることが明白であり、酢酸基を含む化合物又はその塩としては Ν—ァシルァ ミノ酸又はその塩、若しくはアルキルエーテルカルボン酸又はその塩にプロテアーゼ 反応促進効果があることが明白であった。
Ν—ァシルアミノ酸又はその塩としては下記一般式（1)
R1 - CO - R2 (1)
[式中、 R1はアルキル基、又はァルケ-ル基を示し、 R2はアミノ酸、又はアミノ酸誘導 体中のァミノ基から水素原子を除した一価基を示す。 ]
で示される化合物又はその塩にプロテアーゼ反応促進効果があることが明白であり、 中でも、 R1が CH (CH ) —(但し、 nは 10〜14の整数)もしくはヘプタデス— 8—ェ-
3 2 n
ル基である、及び/又は、 R2が標準アミノ酸、 N—メチルァラニン若しくはサルコシン である、化合物が好ましいことが明ら力となった。
アルキルエーテルカルボン酸又はその塩としては下記一般式（2)
R3— O— (CH— CH— O) — CH COOM (2)
2 2 m 2
[式中、 R3はアルキル基を示し、 mは 3〜10の整数を示し、 Mは、水素原子、又はカル ボン酸と塩を形成する金属を示す。 ]
で示される化合物にプロテアーゼ反応促進効果があることが明白であり、中でも、 R3 が CH (CH ) —(但し、 Qは 10又は 11)である化合物が好ましいことが明ら力となつ
3 2 Q
た。尚、 DA67のかわりに TPM- PSを用いても結果はほぼ同じであった。また、糖の添 加はプロテアーゼ反応を促進しな 、が、ソルビトールの添カ卩をコントロールとするとコ ントロールの吸光度変化は 6.5mAbsであり N—ァシルアミノ酸、アルキルエーテル力 ルボン酸、 N—ァシルタウリン酸、及びポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩 では約 4.3倍の反応促進効果が確認された。尚 lOmAbs以上の吸光度変化が得られ れば測定は可能であるが、その場合は反応促進効果が 1.5倍と計算され、 1.5倍以上 の反応促進効果が得られれば良 ヽと考えられる。
[表 1]
Figure imgf000040_0001
[実施例 2]プロテアーゼ反応促進剤を含有する試薬
<試薬 >
ヘモグロビン測定試薬 50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO
1% サルコシネート MN
0.05% アジ化ナトリウム
上記試薬において、サルコシネート MNを用いる代わりに、 AKYPO- RLM100、 SMT 、又は SBL-2Z-36を用いた試薬も別途調製した。
[0105] [実施例 3]プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼを含有する試薬
<試薬 >
DR- 1 タンパク質分解試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO
4000U/ml 中性プロテアーゼ（TOYOBO社製；トヨチーム NEP)
1.5mM CaCl (和光純薬社製）
2
1% ァラ-ネート LN— 30
0.05% アジ化ナトリウム
本試薬のプロテアーゼの特異性は糖化バリルヒスチジル口イシルスレオ-ルプロリン 及び糖化バリルロイシルセリルプロリルァラニンを用いて確認し、ヘモグロビン j8鎖 N 端に特異性が高ぐ α鎖 N端には実質的に作用しないことが明らかであった。さらに ノ チノレス'サーモリティカス'ロッコ一 (Bacillus thermoproteolyticus Rokko)由来のサ 一モリシン、サモアーゼ (大和化成社製)、バチルス 'エスピー (Bacillus
sp. ASP- 842 FERM BP- 08641)由来であるプロテアーゼ、リゾパクターェンザィモ ゲネス (Lysobacter enzymogenes YK366 FERM BP— 10010)由来のプロテアーゼ につ 、ても同様の基質特異性が確認され、中性プロテアーゼ (TOYOBO社製；トヨ チーム NEP)の代わりに処方できることが確認された。
[0106] [実施例 4]プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸及び/又は糖化べ プチドに作用する酵素、プロテアーゼ安定化剤及び z又は糖化アミノ酸及び/又は 糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の安定化剤を含有する試薬 (HbAlc用）
<試薬 >
DR- 1 タンパク質分解試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO 4000U/ml 中性プロテアーゼ（TOYOBO社製）
1.5mM CaCl (和光純薬社製）
2
1% ァラ-ネート LN— 30
6% DMSO
0.05% アジ化ナトリウム
2) R-2 糖ィ匕アミノ酸検出試薬
2- D R-2-A
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
60U/ml KAOD (カーブラリア ·クラベータ YH923由来；旭化成ファーマ社製、 特開 2004-275013号公報に製法記載)若しくは WO 2004/104203 記載のネオコスモスポラ ·バシンフエクタ（Neocosmospora vasinfecta) 474菌株由来
160U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
10% ソルビトール
0.1% アジ化ナトリウム
2- 2) R-2-B
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
160 M DA-67 (和光純薬社製）
[実施例 5]プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸及び/又は糖化べ プチドに作用する酵素、プロテアーゼ安定化剤及び Z又は糖化アミノ酸及び/又は 糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の安定化剤を含有する試薬 (HbAlc用）
<試薬 >
D R- 1 タンパク質分解試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO
4000U/ml 中性プロテアーゼ（TOYOBO社製）
1.5mM CaCl (和光純薬社製）
2
1% ァラ-ネート LN— 30
6% DMSO 0.05% アジ化ナトリウム
2) R-2 糖ィ匕アミノ酸検出試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
60U/ml KAOD (カーブラリア ·クラベータ YH923由来；旭化成ファーマ社製、 特開 2004-275013号公報に製法記載)若しくは WO 2004/104203 記載のネオコスモスポラ ·バシンフエクタ（Neocosmospora vasinfecta) 474菌株由来
160U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
10% ソルビトール
0.1% アジ化ナトリウム
160 M DA-67 (和光純薬社製）
2% 2-ヒドロキシプロピル— β —シクロデキストリン
(日本食品加工株式会社製）
[実施例 6]第一試薬にプロテアーゼ及びヘモグロビン 鎖 Ν末端より生じない糖ィ匕 アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを消去する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチド に作用する酵素を含み、第二試薬にヘモグロビン β鎖 Ν末端より生じた糖ィ匕アミノ酸 及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを検出する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用 する酵素を含む試薬。
<試薬 >
D R- 1 タンパク質分解試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO
4000U/ml 中性プロテアーゼ（TOYOBO社製）
1.5mM CaCl (和光純薬社製）
2
1% ァラ-ネート LN— 30
6% DMSO
0.05% アジ化ナトリウム
10U/ml KAOD (旭化成ファーマ社製）
2) R-2 糖ィ匕アミノ酸検出試薬 50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
60U/ml KAOD (カーブラリア ·クラベータ YH923由来；旭化成ファーマ社製、 特開 2004-275013号公報に製法記載）
160U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
10% ソルビトール
0.1% アジ化ナトリウム
160 M DA- 67 (和光純薬社製）
2% 2 -ヒドロキシプロピル— β —シクロデキストリン
(日本食品加工株式会社製）
[実施例 7]第一試薬に糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素を含み 、第二試薬に含むプロテアーゼを含む試薬。
<試薬 >
D R- 1 タンパク質分解試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO
12U/ml KAOD (カーブラリア ·クラベータ YH923由来；旭化成ファーマ社製、 特開 2004-275013号公報に製法記載）
32U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
6% ソルビトール
0.05% アジ化ナトリウム
32 μ Μ DA- 67 (和光純薬社製）
2% 2—ヒドロキシプロピル一 β—シクロデキストリン
(日本食品加工株式会社製）
1 % ァラ-ネート LN— 30
2) R- 2 糖ィ匕アミノ酸検出試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
20000U/ml 中性プロテアーゼ（TO YOBO社製）
1.5mM CaCl (和光純薬社製） 30% DMSO
0.05% アジ化ナトリウム
[0110] [実施例 8]プロテアーゼ反応促進剤、プロテアーゼ、糖化アミノ酸及び/又は糖化べ プチドに作用する酵素、プロテアーゼ安定化剤及び Z又は糖化アミノ酸及び/又は 糖ィ匕ペプチドに作用する酵素の安定化剤を含有する試薬 (GA用）
D R- 1 タンパク質分解試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO
8mM 4-AA
10% DMSO
lOOOOU/ml Bacillus licheniformis由来プロテアーゼ（シグマ社製）
(DEAE—セファロース榭脂で精製、脱塩したものを使用）
0.001675% BCP (和光純薬社製）
0.05% アジ化ナトリウム
0.5% Tween20
(± 1% ァラニネート LN— 30)
2) R-2 糖ィ匕アミノ酸検出試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
5% ソルビトール
20U/ml KAOD (旭化成ファーマ社製）
5U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
1 OmM N― Ethyl— N— (2— hydroxy— 3— sulfopropyl)— 3— metylaniline .sodium salt, dihydride (TO OS ;同仁化学研究所）
0.05% アジ化ナトリウム
[0111] [実施例 9]ヘモグロビンの測定と試薬の安定性
実施例 2の試薬を用いてヘモグロビン濃度が既知の標準品を測定した。
<ヘモグロビン測定試薬の反応手順 >
自動分析計（日立 7170S型自動分析計；日立製作所)を用いて測定を行った。試料 20 1に試薬 180 1に添カ卩して 660nmの吸光度変化を測定した。対照に水をおき 5分 後の吸光度差を計算した。試料はヘモグロビン標準品を 5段階希釈したものを用い た。
[0112] 結果を図 1に示す。図 1に示すように本発明におけるプロテアーゼ反応促進剤（サ ルコシネート MN、 AKYPO— RLM100、 SMT、 SBL— 2Z— 36)を用いてヘモグロビンの 定量が可能であった。またサルコシネート MNをプロテアーゼ反応促進剤として使用 した試薬の 37°C、 4日間の保存試験を行った。ヘモグロビン標準品 5.5g/dlをキヤリブ レーターとして HbAlc測定用実試料標準物質（1次キヤリブレーター JDS HbAlc Lot 2福祉'医療技術振興会製 レベル 1 ヘモグロビン濃度 135g/L)を 30倍希釈して測 定したところ、ヘモグロビンの測定値は保存試験前（54mAbs、 4.5g/L)であり、保存 試験後（50mAbs、 4.6g/L)であった。これらの結果より本試薬は冷蔵で 6ヶ月以上安 定であると推定された。
[0113] [実施例 10]ヘモグロビン Aleの測定、ヘモグロビン Ale割合の計算
実施例 4、 5の試薬を用いて試料を測定した。
<試料 >
1) HbAlc測定用実試料標準物質（1次キヤリブレーター JDS HbAlc Lot2福祉.医 療技術振興会製) 30倍希釈品
2) 1次キヤリブレーター JDS HbAlc Lot2 30倍希釈品 9容に 乳ビ（2000度；干 渉チェック；シスメッタス社製） 1容を添加した乳ビ混入ヘモグロビン
< R— 2試薬の調製〉 実施例 4の試薬は R— 2— A試薬、 R— 2— B試薬を使用前に 1 ： 1で混合し使用した。実施例 5の試薬はそのまま使用した。
<ヘモグロビン Ale測定試薬の反応手順 >
自動分析計（日立 7170S型自動分析計；日立製作所)を用いて測定を行った。試料 20 1に試薬1? 1 180 1に添加し、 37°Cに保温し主波長 660nm、副波長 700nmの吸 光度変化を測定した。 5分後、試薬 R— 2 45 1に添加し、 37°Cに保温し主波長 660η m、副波長 700nmの吸光度変化を測定した。また、測定値は HbAlc測定用実試料標 準物質（1次キヤリブレーター JDS
HbAlc Lot2福祉'医療技術振興会製 レベル 1；ヘモグロビン濃度 135g/L、 HbAlc 値 4.04%とレベル 5；ヘモグロビン濃度 132g/L、 HbAlc値 12.63%)をキヤリブレーターと して使用し値を換算した。ヘモグロビンの定量は R2試薬添加直前の測光で行い、 Hb Aleの定量は R2添加後 5分後の測光より計算した。
ヘモグロビン及び HbAlcの検量線を図 2、及び図 3に示す。 HbAlc濃度は HbAlc測 定用実試料標準物質の HbAlc%と HbAlc濃度より算出した。図 2より明らかなように 本発明におけるプロテアーゼ反応促進剤を用いてヘモグロビン Aleの定量が可能で あった。また図 3より明らかなようにさらにヘモグロビンの定量も同時に定量が可能で あった。これらのことから本発明を用いて同一反応槽中でヘモグロビン及び HbAlcを 連続して測定できることが明白であった。
[0114] また、乳ビ混入ヘモグロビンの測定では副波長を差し引かない場合には試料と R— 1が混合された時点での計算された吸光度が高ぐ 1次キヤリブレーター JDS HbAlc Lot2のレベル 1、 HbAlc値 4.04%を 5回測定した場合の再現性は CV値 3. 5%であり、 一方副波長を差し引いた場合には再現性 1. 5%と正確性が向上していた。このこと 力もヘモグロビン及び HbAlcを同一波長で測定し、副波長を差し引くことにより正確 に HbAlcが測定できることが明らかである。また、カーブラリア'クラベータ YH923由 来 (旭化成ファーマ社製、特開 2004-275013号公報に製法記載)及び WO 2004/104 203記載のネオコスモスポラ ·バシンフエクタ（Neocosmospora
vasinfecta) 474菌株由来のケトァミンォキシダーゼでは同じ結果が示された。
[0115] さらに本試薬 R— 1及び R— 2— Aを液体状態で 37°C4日間保存し安定性を評価した 。なお実施例 4の試薬は R— 2— Bは冷蔵にて保存し、 R— 2— Aと R— 2— Bは使用直 前に混合した。測定の結果、 1次キヤリブレーター JDS HbAlc Lot2のレベル 3 (へモ グロビン濃度 145g/L、 HbAlc値 7.32%)の 30倍希釈品のヘモグロビン定量値は保存 試験前（実施例 4の試薬 58mAbs、 4.8g/L、実施例 5の試薬 55mAbs、 4.8g/L)であり、 保存試験後（実施例 4の試薬 56mAbs、 4.7g/L、実施例 5の試薬 54mAbs、 4.7g/L)で あった。また HbAlcの計算値は保存試験前 (実施例 4の試薬 7.5%、実施例 5の試薬 7. 6%)であり、保存試験後（実施例 4の試薬 7.6%、実施例 5の試薬 7.5%)であった。また 冷蔵保存 3ヶ月のデーターでは測定値に差は見られな力つた。これらの結果より実施 例 4の試薬の R—l、 R—2— A、及び実施例 5の試薬は冷蔵で 6ヶ月以上安定であると 推定された。一般的にロイコ型の色素は反応性が高い半面不安定であり実施例 4の 試薬ではその他の成分と分離して保存する必要があった力 シクロデキストリンの添 加により色素が安定化され、その他の成分と同じ容器に処方することが可能であるこ とが明白であった。
また、実施例 4、及び 5の試薬はプロテアーゼとして糖ィ匕ヘモグロビン若しくはその フラグメントの糖化された a鎖 N末端力も糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを実 質的に切り出すことなぐ糖化された β鎖 Ν末端から糖化アミノ酸及び Ζ又は糖化べ プチドを切り出すプロテアーゼを、糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用する 酵素として糖化バリルロイシンよりも糖化バリルヒスチジンに作用が高いことを特徴と する酵素を用いているが JDS HbAlc Lot2のレベル 3の定量値が表示値と一致してい ること力ら、正確にヘモグロビン Aleを測定していることが明白である。
[実施例 11 ]消去系を組み込んだ試薬の性能
<試薬 >
実施例 6、 7の試薬を用いた。
<試料 >
HbAlc測定用実試料標準物質（1次キヤリブレーター JDS
HbAlc Lot2レベル 3 (HbAlc値 7.32%)福祉'医療技術振興会製) 30倍希釈品、 9容 に糖ィ匕アミノ酸 1容を添加して試料とした。またコントロールとしては、糖化アミノ酸の 代わりに蒸留水を添加したものを用いた。添加する糖ィ匕アミノ酸濃度としては、糖ィ匕 —Z—リジン水溶液 (FZL) 2mM、糖ィ匕ーノ リン水溶液 (FV) 2mM (糖ィ匕アミノ酸はハ シバらの方法により合成、精製した。 Hashiba
H、 J.Agric.Food Chem.24 : 70、 1976)を用いた。
<反応手順 >
実施例 10と同じ手順で試料を測定した。
測定の結果、 1次キヤリブレーター JDS HbAlc Lot2のレベル 3 (HbAlc値 7.32%)の の HbAlc定量値は、実施例 6の試薬を用いた場合コントロール、 FZL添加、 FV添カロ の順に 7.2、 7.3、 7.1%であり、実施例 7の試薬は 7.3、 7.4、 7.1%であり消去反応が行わ れ、正確な値が測定されて 、ることが確認された。
[実施例 12]糖ィ匕アルブミンの測定、糖ィ匕アルブミン割合の計算及び試薬の安定性 <糖ィ匕アルブミン測定試薬の反応手順 >
実施例 5の試薬を使用した。 37度にインキュベートされた R— 1 ;240 1にコントロー ル血清 H (株式会社 BML社製；用法に基づき調製し 5段階に蒸留水で希釈した。） 8 1を添加し、主波長 546nm (副波長 700nm)の吸光度を測定した。 37°Cで反応を開始 し、正確に 5分後に R— 2;80 1を添加した。 R— 2添加前及び添加 5分後の吸光度を 測定した。また基質溶液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、コントロール 基質溶液力 得られた吸光度変化力 ブランク試料の吸光度変化を差し引いた ΔΑ 0を算出した。値の換算はルシカ GA用キヤリブレーター (旭化成ファーマ社製)を同 時に測定し吸光度を比較して行った。アルブミンの測定は試料添加直後から R— 2添 加直前の吸光度を引いた吸光度差より求めた。糖ィ匕アルブミンの測定は R— 2添加 5 分後の吸光度より R— 2添加直前の吸光度を引いた吸光度差より求めた。
[0117] プロテアーゼ反応促進（ァラ二ネート LN— 30)を含まない場合、プロテア一ゼの反 応は遅ぐコントロール血清 (株式会社 BML社製;希釈なし)の GA測定の感度は 32m Absであり、含んだ場合 (48mAbs)の 66%であった。反応率は 1. 5倍に加速されてい た。
また、 5段階希釈した管理血清の測定値を図 4に示す。図 4から分力るように本試薬 を用いて同一反応槽中、同一波長でアルブミン、糖ィ匕アルブミンを定量し、糖化アル ブミン値 (％)を良好に測定することが出来た。
[0118] さらに本試薬を液体状態で 37°C4日間保存した結果、コントロール血清 (株式会社 BML社製;希釈なし）を測定したところ、 GA測定の感度は 48mAbs、アルブミンの測定 感度 60mAbs、 GA値 44.8%であり、保存後は GA測定の感度は 46mAbs、アルブミンの 測定感度 61mAbs GA値 44.5%であった。これらの結果より本試薬は冷蔵で 6ヶ月以上 安定であると推定された。
[0119] [実施例 13]酵素反応の検出に使用する色素安定化剤のスクリーニング
<試薬 >
D R- 1 色素含有試薬
200mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pH7.5
200 μ M DA64、 DA67もしくは 0.04%の MBTH (和光純薬社製） +試験サンプル
2) R- 2 パーォキシダーゼ含有試薬
200mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
10U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
0.04% TOOS (和光純薬社製；ただし R-1に MBTHを用いた場合にのみ添加） 試験サンプルとしては以下のものを用いた。尚（ ）内の濃度は R1中の最終濃度を 示す。
Tween- 20(1%)、 Brij35(l%)、 TritonX- 100(1%)、デォキシコール酸 (1%)、ィミノ 2酢酸 (I DA ; lmM)、 ZnSO4(0.1mM)、 AlC13(0.1mM),フエロシアン化カリウム (フエロシアン化 K ; 0.01mM)、ソルビトール (5%)、グルコース (5%)、亜硝酸ナトリウム（2mM)、ジメチルスル ホキシド（DMSO ; 10%) (以上和光純薬社製)、 2—ヒドロキシプロピル— β—シクロデ キストリン (2HP j8 CD ; 0.5%、 2%、 5%)、メチル一 13—シクロデキストリン (M β CD ; 0.5%、 2 %、5%) (以上、 日本食品加工株式会社製）
<操作方法 >
37°Cにインキュベートされた R-1 ;500 μ 1と R- 2;500 μ 1を混合し、 37°C- 2分加温し吸 光度を測定し (AO)、 10 1の過酸化水素 500 Mもしくは蒸留水を添加した。 37°Cに 加温し過酸化水素添加後正確に 5分後に吸光度を測定し (A1)を測定し、吸光度変 化 Δ Α (ΑΙ-ΑΟ)を計算した。吸光度は色素に DA64を用いた場合には 750nm、 DA67 を用いた場合には 660nm、 4-AA-TOOSを用いた場合には 570nmを測定した。
測定は試薬調製直後、試薬を 37°Cで 2日、 9日保存して蒸留水を測定した場合の ブランク及び過酸化水素の感度を測定した。
表 2— 1、及び表 2— 2にブランクと酵素反応の検出に使用する色素の保存の関係 を示す。表 2—1、及び表 2— 2から判るように金属塩及び 2—ヒドロキシプロピル— β —シクロデキストリン、メチル一 β—シクロデキストリンにブランクを抑える効果が確認 された。また過酸ィ匕水素 500 Μを測定した場合の該色素と金属塩及び該色素とシク ロデキストリン濃度と保存の関係を表 3に示す。金属塩は表 2— 2よりブランク上昇は 認められな力つた力 表 3より過酸ィ匕水素の感度そのものが出なくなつていた。また、 表 3よりシクロデキストリン 0.5%以上の濃度で該色素の安定ィ匕効果が認められた。 [0120] [表 2-1]
単位 Abs
Figure imgf000051_0001
[0121] [表 2- 2]
単位 Abs
Figure imgf000051_0002
[0122] [表 3]
Figure imgf000051_0003
[実施例 14]シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含む試薬に及 ぼすカタラーゼ添加効果
<試薬 >
DR- 1 色素含有試薬
200mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pH7.5
200 /z M DA67 (和光純薬社製）
2% 2—ヒドロキシプロピル一 β—シクロデキストリン（日本食品加工株式会社製） ±500U/ml カタラーゼ (和光純薬社製）
2) R-2 パーォキシダーゼ含有試薬
200mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pH7.5
10U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
0.05% アジィ匕ナトリウム (和光純薬社製）
<操作方法 >
実施例 13に同じ。測定は試薬調製直後、試薬を 37°Cで 2日、 9日
保存して蒸留水を測定した場合のブランク及び過酸ィ匕水素の感度を測定した。結果 は表 4に示す。表 4から判るようにカタラーゼの添カ卩により保存時のブランクが有意に 低下し、酵素反応の検出に使用する色素の安定性も上昇した。
[0124] [表 4]
Figure imgf000052_0001
[0125] [実施例 15]シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含む試薬に及 ぼす緩衝剤濃度の効果
<試薬 >
D R- 1 色素含有試薬
50mM、 80mM、 100mM、 200mM トリス緩衝液（和光純薬社製） pH7.5 10 /z M DA67 (和光純薬社製）
2% 2—ヒドロキシプロピル一 β—シクロデキストリン（日本食品加工株式会社製） 4000U/ml トヨチーム NEP (東洋紡績社製）
500U/ml カタラーゼ (和光純薬社製）
1 % サルコシネート LN (日光ケミカルズ社製）
2) R-2 パーォキシダーゼ含有試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5 78U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
26U/ml カーブラリア'クラベータ YH923由来 KAOD (旭化成ファーマ社製、 特開 2004-275013号公報に製法記載）
0.05% アジィ匕ナトリウム (和光純薬社製）
<操作方法 >
自動分析計（日立 7170S型自動分析計；日立製作所)を用いて測定を行った。試料 20 μ 1に試薬 R-1 180 μ 1に添加し、 37°Cに保温し主波長 660nm、副波長 700nmの吸 光度変化を測定した。 5分後、試薬 R-2 45 1〖こ添加し、 37°Cに保温し主波長 660nm 、副波長 700nmの吸光度変化を測定した。また、試料には HbAlc測定用実試料標準 物質（1次キヤリブレーター JDS
HbAlc Lot2福祉'医療技術振興会製 レベル 1； 135g/L-4.04%とレベル 5； 132g/L- 12.63%)の 30倍希釈品を用いた。
測定は試薬調製直後、試薬を 37°Cで 2日、 4日、 6日保存してレベル 5の感度ーレ ベル 1の感度を計算した。
結果は表 5に示す。表 5から判るように緩衝剤の濃度 80mM以下で、有意に酵素反 応の検出に使用する色素の安定性が上昇した。
[表 5]
Figure imgf000053_0001
[実施例 16]シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含む試薬 (H bAlc用）
<試薬 >
D R- 1 色素含有試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
10 /z M DA67 (和光純薬社製）
2% 2—ヒドロキシプロピル一 β—シクロデキストリン（日本食品加工株式会社製） 4000U/ml トヨチーム NEP (東洋紡績社製）
500U/ml カタラーゼ (和光純薬社製）
1 % サルコシネート LN (日光ケミカルズ社製）
2) R-2 パーォキシダーゼ含有試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
78U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
26U/ml カーブラリア'クラベータ YH923由来 KAOD (旭化成ファーマ社製、 特開 2004-275013号公報に製法記載）
0.05% アジィ匕ナトリウム (和光純薬社製）
[0128] [実施例 17]シクロデキストリン及び酵素反応の検出に使用する色素を含む試薬 (G A用）
D R- 1 タンパク質分解試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHLO
10 /z M DA67 (和光純薬社製）
2% 2—ヒドロキシプロピル一 β—シクロデキストリン（日本食品加工株式会社製) 10% DMSO
10000U/ml Bacillus licheniformis由来プロテアーゼ（シグマ社製）
(DEAE-セファロース榭脂で精製、脱塩したものを使用）
500U/ml カタラーゼ (和光純薬社製）
2) R-2 糖ィ匕アミノ酸検出試薬
50mM トリス緩衝液（和光純薬社製) pHL5
5% ソルビトール
20U/ml KAOD (旭化成ファーマ社製）
5U/ml パーォキシダーゼ (シグマ社製）
0.05% アジ化ナトリウム
[0129] [実施例 18]ヘモグロビン Aleの測定、ヘモグロビン Ale割合の計算及び試薬の安 定性実施例 16の試薬を用いて試料を測定した。
<試料 > D HbAlc測定用実試料標準物質（1次キヤリブレーター JDS HbAlc Lot2福祉.医 療技術振興会製) 30倍希釈品
<ヘモグロビン Ale測定試薬の反応手順 >
自動分析計（日立 7170S型自動分析計；日立製作所)を用いて測定を行った。試料 20 μ 1【こ試薬 R— 1 180 μ 1【こ添カ卩し、 37QG【こ保温した。試料添カ卩 5分後、試薬 R— 2 45 μ 1 に添加し、 37°Cに 5分間保温した。吸光度の測定は R-2試薬添加直前 (A1)及び添 カロ 5分後（A2)に主波長 660nm、副波長 700nmを測定した。また、測定値は HbAlc測 定用実試料標準物質（1次キヤリブレーター JDS HbAlc Lot2福祉'医療技術振興 会製 レベル 1；ヘモグロビン濃度 135g/L、 HbAlc値 4.04%とレベル 5；ヘモグロビン濃 度 132g/L、 HbAlc値 12.63%)をキヤリブレーターとして使用し値を換算した。へモグロ ビンの定量は A1で行 、、 HbAlcの定量は A2-A1より計算した。
ヘモグロビン及び HbAlcの検量線を図 5及び図 6に示す。図 5、図 6より明らかなよう に本発明における酵素反応の検出に使用する色素の安定ィ匕方法を用いてへモグロ ビン Alc、及びヘモグロビンの定量が可能であった。ヘモグロビン Alc、及びへモグロ ビンの定量が可能であること力 ヘモグロビン Ale割合の計算が可能であることは明 白である。
さらに本試薬を液体状態で 37°C4日間保存した結果、 1次キヤリブレーター JDS H bAlc Lot2のレベル 3 (ヘモグロビン濃度 145g/L、 HbAlc値 7.32%)の 30倍希釈品の ヘモグロビン定量値は保存試験前 (40mAbs、 4.8g/L)であり、保存試験後（38mAbs 、 4.7g/L)であった。また HbAlcの計算値は保存試験前（7.2%)であり、保存試験後（7 .3%)であった。また冷蔵保存 3ヶ月のデータでは測定値に差は見られな力つた。これ らの結果より本試薬は冷蔵で 6ヶ月以上安定であると推定された。
[実施例 19]グリコアルブミンの測定、グリコアルブミン割合の計算及び試薬の安定性 <グリコアルブミン測定試薬の反応手順 >
実施例 17の試薬を使用した。 37度にインキュベートされた R-l;240 1にコントロー ル血清 H (株式会社 BML社製；用法に基づき調製し 5段階に蒸留水で希釈した。） 8 μ 1を添カ卩し、 37°Cで反応を開始し、正確に 5分後に尺-2;80 1を添カ卩した。 R-2添カロ 前及び添加 5分後の吸光度、主波長 660nm、副波長 700nmを測定した。また基質溶 液の代わりに蒸留水を用いた測定をブランクとし、コントロール基質溶液力 得られた 吸光度変化力もブランク試料の吸光度変化を差し引いた ΔΑ0を算出した。値の換算 はルシカ GA用キヤリブレーター (旭化成ファーマ社製)を同時に測定し吸光度を比較 して行った。アルブミンの測定はアクアオートカイノス ALB試薬 (カイノス社製)を用 いて試薬の用法容量に従い測定を行った。 5段階希釈した管理血清の測定値を図 7 に示す。図 7から分力るように本試薬を用いてアルブミン、グリコアルブミンを定量し、 グリコアルブミン値（％)を良好に測定することが出来た。
さらに本試薬を液体状態で 37°C4日間保存した結果、コントロール血清 L (株式会 社 BML社製；希釈なし）を測定したところ、 GA測定の感度は 150mAb、 GA値 18.3%で あり、保存後は GA測定の感度は 146mAb、 GA値 18.2%であった。これらの結果より本 試薬は冷蔵で 6ヶ月以上安定であると推定された。
産業上の利用可能性
[0131] 本発明における測定用試薬及び測定方法は臨床検査に用いられる。
図面の簡単な説明
[0132] [図 1]本発明の実施例 9に基づくヘモグロビンの測定結果である。
[図 2]本発明の実施例 10に基づくヘモグロビン Aleの測定結果である。
[図 3]本発明の実施例 10に基づくヘモグロビンの測定結果である。
[図 4]本発明の実施例 12に基づく糖ィ匕アルブミンの測定結果である。
[図 5]本発明の実施例 18に基づくヘモグロビン Aleの検量線である。
[図 6]本発明の実施例 18に基づくヘモグロビンの検量線である。
[図 7]本発明の実施例 19に基づくグリコアルブミンの測定結果である。 図中、クロー ズドロはアルブミン濃度を示し、クローズド菱形はグリコアルブミン濃度を示し、クロー ズド△はグリコアルブミン値を示す。

Claims

請求の範囲
[1] 酢酸基を含む化合物又はその塩、 N—ァシルタウリン又はその塩、若しくはポリオキ シエチレンアルキルエーテル硫酸又はその塩のうち少なくとも 1種類を含有するプロ テアーゼ反応促進剤。
[2] 酢酸基を含む化合物又はその塩が N—ァシルアミノ酸又はその塩、若しくはアルキ ルエーテルカルボン酸又はその塩である請求項 1に記載のプロテアーゼ反応促進剤
[3] N—ァシルアミノ酸又はその塩が下記一般式（1)
R1 - CO - R2 (1)
[式中、 R1はアルキル基、又はァルケ-ル基を示し、 R2はアミノ酸、又はアミノ酸誘導 体中のァミノ基から水素原子を除した一価基を示す。 ]
で示される化合物又はその塩である請求項 2に記載のプロテアーゼ反応促進剤。
[4] 請求項 3にお 、て、下記 I)及び Z又は Π)であるプロテアーゼ反応促進剤。
DR1が CH (CH ) —(但し、 nは 10〜14の整数）である力、もしくはヘプタデス— 8—
3 2 n
ェ-ル基である
II)アミノ酸、又はアミノ酸誘導体が N—メチルァラニン若しくはサルコシンである
[5] アルキルエーテルカルボン酸又はその塩が下記一般式（2)
R3— O— (CH— CH— O) — CH COOM (2)
2 2 m 2
[式中、 R3はアルキル基を示し、 mは 3〜10の整数を示し、 Mは、水素原子、又はカル ボン酸と塩を形成する金属を示す。 ]
で示される化合物である請求項 2に記載のプロテアーゼ反応促進剤。
[6] R3が CH (CH ) —(但し、 Qは 10又は 11)である請求項 5に記載のプロテアーゼ
3 2 Q
反応促進剤。
[7] プロテアーゼとプロテアーゼ反応促進剤を少なくとも共存させ、反応促進されたプロ テアーゼ反応の結果生じる生成物を測定する方法にぉ 、て、プロテアーゼ反応率を 1. 5倍以上早くすることを特徴とする請求項 1〜6記載のプロテアーゼ反応促進剤。
[8] 請求項 1〜7 ヽずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤を含有することを特徴とす る S¾薬。
[9] 下記 i)〜iii)を含有することを特徴とする試薬。
i)請求項 1〜7 、ずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤
ii)プロテアーゼ
iii)糖化アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素
[10] プロテアーゼ安定化剤、及び Z又は糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに作用 する酵素の安定化剤を含有することを特徴とする請求項 8若しくは 9に記載の試薬。
[11] 試薬が液状であり、冷蔵で 6ヶ月以上安定であることを特徴とする請求項 8〜 10い ずれかに記載の試薬。
[12] プロテアーゼが糖ィ匕ヘモグロビン若しくはそのフラグメントの糖ィ匕された a鎖 N末端 力も糖ィ匕アミノ酸及び Z又は糖ィ匕ペプチドを実質的に切り出すことなぐ糖化された β鎖 Ν末端カゝら糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを切り出すものである請求項 9 〜 11記載の試薬。
[13] 糖化アミノ酸及び Ζ又は糖化ペプチドに作用する酵素が糖化バリルロイシンよりも 糖化バリルヒスチジンに作用が高いことを特徴とする請求項 9〜 12記載の試薬。
[14] ロイコ型色素及び色素安定化剤を含むことを特徴とする請求項 8〜 13に記載の試 薬。
[15] 色素の安定化剤がシクロデキストリンである請求項 14記載の試薬。
[16] 第一試薬にプロテアーゼ、及びヘモグロビン |8鎖 Ν末端より生じない糖ィ匕アミノ酸 及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを消去する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用 する酵素を含み、第二試薬にヘモグロビン β鎖 Ν末端より生じた糖化アミノ酸及び Ζ 又は糖ィ匕ペプチドを検出する糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素 を含むことを特徴とする請求項 8〜 15に記載の試薬。
[17] 第一試薬に糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドに作用する酵素を含み、第二試 薬にプロテアーゼを含むことを特徴とする請求項 8〜 15に記載の試薬。
[18] 第一試薬にさらにカタラーゼ及び/又はパーォキシダーゼを含むことを特徴とする 請求項 16又は 17に記載の試薬。
[19] 第一試薬と第二試薬力もなるキットにおいて、プロテアーゼ及びカタラーゼを同一 試薬中に含有し、かつカタラーゼの含まれて 、な 、試薬にアジィ匕ナトリウムを含むこ とを特徴とする請求項 8〜 18に記載の試薬。
[20] 請求項 1〜7 、ずれかに記載のプロテアーゼ反応促進剤を用いたプロテアーゼ反 応促進方法。
[21] 請求項 7に記載のプロテアーゼ反応促進剤を用い、プロテアーゼ反応率を 1. 5倍以 上に早くすることを特徴とする請求項 20記載のプロテアーゼ反応促進方法。
[22] 請求項 8〜19いずれかに記載の試薬を用いたヘモグロビン、ヘモグロビン Ale若 しくは糖ィ匕アルブミン測定方法。
[23] 同一反応槽中でヘモグロビンの測定及びヘモグロビン Aleの測定を連続して行う ことを特徴とする請求項 22記載の方法。
[24] ヘモグロビンの測定及びヘモグロビン Aleの測定を同一波長で行うことを特徴とす る請求項 23に記載の方法。
[25] 副波長を設定し測定波長力も差し引くことを特徴とする請求項 24に記載の方法。
[26] ヘモグロビン Aleの β鎖 Ν端の糖ィ匕アミノ酸及び Ζ又は糖ィ匕ペプチドを特異的に 測定することを特徴とする請求項 22〜25に記載の方法。
[27] ヘモグロビン Ale測定時に溶血液、ヘモグロビン溶液もしくはヘモグロビン 13鎖 N 端の糖ィ匕ペプチドをキヤリブレーターとして測定しその検量線から定量値を計算する ことを特徴とする請求項 22〜26記載の方法。
[28] 同一反応槽中でアルブミンの測定及び糖ィ匕アルブミンの測定を連続して行うことを 特徴とする請求項 22記載の方法。
[29] アルブミンの測定及び糖ィ匕アルブミンの測定を同一波長で行うことを特徴とする請 求項 28に記載の方法。
[30] 酵素反応の検出に使用する色素の安定化剤であって、シクロデキストリンを含有す ることを特徴とする色素の安定化剤。
[31] シクロデキストリン力 β—シクロデキストリン類であることを特徴とする請求項 30に 記載の安定化剤。
[32] β—シクロデキストリン類力 メチル一 j8—シクロデキストリンもしくは 2—ヒドロキシプ 口ピル一 β—シクロデキストリンであることを特徴とする請求項 31に記載の安定化剤
[33] 酵素反応の検出に使用する色素が、パーォキシダーゼの作用により発色する色素 であることを特徴とする請求項 30〜32いずれかに記載の安定化剤。
[34] パーォキシダーゼの作用により発色する色素力 ロイコ型色素であることを特徴とす る請求項 33に記載の安定化剤。
[35] 請求項 30〜34いずれかに記載の安定化剤、及び酵素反応の検出に使用する色 素を含有する試薬。
[36] カタラーゼを含有することを特徴とする請求項 35に記載の試薬。
[37] 測定時の緩衝剤濃度が 80mM以下であることを特徴とする請求項 35又は 36に記 載の試薬。
[38] プロテアーゼを含有することを特徴とする請求項 35〜37 ヽずれかに記載の試薬。
[39] プロテアーゼ反応促進剤を含有することを特徴とする請求項 38記載の試薬。
[40] 測定時のシクロデキストリンの濃度が 0.5重量％以上であることを特徴とする請求項
35〜39 、ずれかに記載の試薬。
[41] 試薬が液状であり、冷蔵で 6ヶ月以上安定であることを特徴とする請請求項 35〜4
O ヽずれかに記載の試薬。
[42] 請求項 30〜34記載の安定化剤を用いることを特徴とする酵素反応の検出に使用 する色素の安定化方法。
[43] 請求項 35〜41記載の試薬を用いることを特徴とする糖ィ匕タンパク質若しくは糖ィ匕 タンパク質割合の測定方法。
[44] 糖ィ匕タンパク質が糖ィ匕アルブミン、糖ィ匕ヘモグロビン、又はヘモグロビン Aleであり
、糖ィ匕タンパク質割合が糖ィ匕アルブミン値、糖ィ匕ヘモグロビン値、又はヘモグロビン
Ale値であることを特徴とする請求項 43記載の方法。
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