JPH03285697A - 化学発光検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、アルスロマイセス属またはコプリヌス属に属
する真菌に由来するペルオキシダーゼを触媒酵素として
用いる化学発光反応における発光の増強および安定化方
法に関する。

近年、とみに健康維持管理、あるいは生体の異常状態の
早期発見の重要性が認識され、生体の微細な代謝変動・
異常を把握する手段として生化学的指標となる生体成分
の簡便で迅速な定量分析法、とくに特異選択性に優れた
酵素学的手法を用いた方法が開発および応用されつつあ
る。その際、生化学的指標となる生体成分は、選択的酵
素を用いて、測定可能なシグナル化合物（例えば、過酸
化水素やＮＡＤ　（Ｐ）＋など）に変換して定量される
。このような最終シグナル化合物として特に頻繁に利用
されているのは過酸化水素であり、過酸化水素を与える
酵素共役反応系の開発も精ツＪ的に行われている。最終
シグナル化合物である過酸化水素を定量するためには、
ペルオキシダーゼ（以下、ＰＯＤと略す）を触媒酵素と
して用いる化学発光反応が広く利用されている。本願発
明はこの化学発光反応における発光の増強および安定化
方法に関する。

（従来の技術） ＰＯＤによる化学発光反応を、酸化剤として例えば過酸
化水素を用いた場合を例にして示せば、次の反応式で表
される： ０Ｄ Ｈ２０□＋ＡＨ２−→　２Ｈ，、Ｏ＋Ａ（式中、Ａｌ１
はＰＯＤの反応基質を表す）この反応により定量可能な
発光（光子の放出）を導き出すことができる。なお、反
応式で生じるＡが色素や蛍光物質である方法も知られて
いるが、発光量を測定する方法はもっとも感度が高いの
で、生体サンプル例えば、定期診断時における採血量な
どの少量化が可能であるし、生体サンプルを十分に希釈
して反応を行うことができるためサンプル中の反応妨害
物質の影響も少なくできるなどの種々の利点を有する。

また、発光量を測定する方法の持つ高い測定感度は、従
来測定域に到達していないために生化学的指標と成り得
なかった生体成分についても測定対象にすることを可能
にするであろうと期待されている。

ＰＯＤによる化学発光の詳細なメカニズムは完全には解
明されていないが、西洋わさび由来のペルオキシダーゼ
（以下、ＨＲＰと略す）を用いた検討が広く行われてい
る。しかしながら、ＨＲＰは他の無機発光触媒に比べて
より穏和な条件で発光が起きるという利点があるものの
、ＨＲＰの発光触媒能は、生体成分の微量定量反応に使
用するためには不十分である。この問題を解決する一手
段として、ＨＲＰの化学発光を増強する化合物が種々見
出されているが（特開昭５９−１７１８３９号および特
表昭５９−５００２５２号公報）、そのような増感剤を
使用しても、ＨＲＰの化学発光触媒能は未だ必ずしも満
足すべきレベルに達していない。

さらに、入手可能なＨＲ，Ｐは多くの場合複数のアイゾ
ザイムの混合物であるため、定量反応の精度や再現性に
影響を与え、さらにＨＲＰは発光反応の挙動が複雑であ
り、例えば、発光反応速度が経時的に変動して脈打つ発
光パターンを示すなどして、定量的測定を行う上で反応
の制御が困難であるという問題もある。

そこで、本発明者らはＨＲＰよりも発光触媒能ニ優れた
ＰＯＤの探索を試み、アルスロマイセス属およびコプリ
ヌス属に属する真菌の生産するペルオキシダーゼ（以下
、これらをＡＲＰおよびＣｃｐと略す）を見出し、特開
昭６１−０４３９８７号公報に開示している。ＡＲＰお
よびＣＣＰの化学発光に対する触媒能は、ＨＲＰに比べ
て少なくとも１００〜３００倍優れていることも本発明
者らによって見出されている（特開昭６３−２１９３９
８号公報）。

（発明が解決しようとする課題） 本発明はＡＲＰあるいはＣＣＰの優れた発光触媒能を、
増感剤を用いてさらに高め、生体成分等を微量定量する
ために一層適するようにした化学発光定量法を提供する
ことを目的とする。

本発明はまた、ＡＲＰまたはＣＣＰが触媒して生じる発
光（シグナル）と非特異的発光（ノイズ）の比、即ちシ
グナル／ノイズ比が高い条件で、これら酵素の触媒能を
増強することにより、微量成分の定量のために特に適し
た化学発光定量法を提供することを目的とする。

さらに、増感された化学発光反応はしばしば短時間で停
止してしまうので、本発明はこのような欠点をなくして
、ＡＲＰあるいはＣＣＰが触媒する増強された発光をで
きるだけ長時間持続させ、より簡略化された分析装置で
の定量を可能にした化学発光定量法を提供することを目
的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明者らは、上記目的のために、種々の検討を重ねた
結果、ＡＲＰあるいはＣＣＰに対する化学発光増感剤と
して、ヒドラゾベンゼン、インジゴ、３−メチル−２−
ベンゾチアゾリノン　ヒドラゾン・ＨＣＩ、α−ナフト
キノン、インドフェノール、フェニルヒドラジン、８−
ヒドロキシキノリン、フェノールフタリン、Ｌ−トリプ
トファン、Ｎ、Ｎ−ジメチルインドアニリン、カルセイ
ン、インジゴ　カルミンおよびレゾルシンを見出した。

これらの増感剤の中で、ヒドラゾベンゼン、インジゴお
よび３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン　ヒドラジン
・ＨＣＩは、増強された化学発光を長時間持続させる点
、およびシグナル／ノイズ比が高い点で特に好ましい。

従って本発明は、ペルオキシダーゼ；酸化剤；ルミノー
ルおよびイソルミノールからなる群から選択される発光
基質を反応させて化学発光を生じさせ、該反応に関与す
る成分のいずれかを定量する方法において、上記増感剤
の存在下で化学発光を生じさせることを特徴とする方法
である。

本発明で使用するペルオキシダーゼは、アルスロマイセ
ス属由来のペルオキシダーゼ（ＡＲＰ）またはコプリヌ
ス属の真菌由来のペルオキシダーゼ（ｃｃｐ）である。

その例は特開昭６１−０４３９８７号公報に記載されて
いる。ペルオキシダーゼには、遺伝子工学的に製造され
たものも含まれる。なお、西洋わさび由来のペルオキシ
ダーゼ（ＨＲＰ）は本発明では使用されない。

本発明の方法を、行うための一例として下記の条件を設
定できる： イ）ＡＲＰあるいはＣＣＰ ０．０１μｇ〜１０００■／１ 口）酸化剤 ０．０１　ｎｍｏｌ−１００ｍｍｏｌ／　１ハ）ルミノ
ールあるいはイソルミノール０　、　５　μｍｏｌ　−
２００ｍｍｏｌ／　（に）化学発光反応増感剤 １　μｍｏ１〜１００ｍｍｏｌ／　１ ホ）ｐＨ８〜１１ へ）温度　　１０〜６０°Ｃ 上記イ）〜二）の主要反応成分のうち測定対象とする少
なくとも一つを除いた混合液を作製し、反応槽（例えば
試験管など）に入れる。次に、欠けていた主要反応成分
を反応槽に添加して化学発光反応を開始させる。反応に
より生じた光は、標準的測定装置、例えば光電子倍増管
によって定量され、そのシグナルは記録計、オシロスコ
ープあるいはスカラーに送られ表示または記録される。

あるいは所望により肉眼観察してもよく、さらに写真乾
板上において反応させ定量化することもできる。本発明
者らは、発光量をルミノメータ−（ルマック／３Ｍ　　
バイオカウンターＭ２Ｏ１０型、スリーエム薬品社製）
を用い測定した。

本発明の方法によれば、酸化剤、発光基質、ペルオキシ
ダーゼおよび化学発光増感剤のいずれも検出および定量
可能であるが、酸化剤としては過酸化水素および過酸化
物質（例えば、過酸化脂質などの生体過酸化物質）が重
要な測定対象である。

生体試料中の蛋白質、ホルモン、ステロイド、核酸、代
謝中間体のような成分を酵素抗体法により定量する場合
には、測定対象に対する抗体にペルオキシダーゼを直接
結合させ過酸化水素を添加することによって、あるいは
抗体に結合させたアルカリホスファターゼあるいはグル
コースオキシダーゼのような酵素（共役酵素）の作用に
よって、反応系中に発生させた過酸化水素であってよく
、その結果に基づいて生体試料中の元の成分量を知るこ
とができる。本発明の方法は直接あるいはシグナルとし
て生成する過酸化水素を指標とすることができる分析項
目について、生体成分の微量定量以外にも種々の分析目
的に使用可能である。

以下、実施例を示して本発明をより具体的に説明するが
、本発明の範囲は実施例にのみ限定されるものではない
。

実施例１　　　　光量の増大　ＡＲＰに　してＡＲＰは
特開昭６１．−０４３９８７号公報に記載された方法で
精製したＲＺ＝２．Ｏのものを使用した（ＲＺはＡ４０
３のＡ２０５に対する比である）。ルミノールおよび過
酸化水素はナカライテスク社から購入した。化学発光反
応増感剤はすカライテスク社、東京化成工業社、シグマ
社またはアルドチッチ社から購入した。その他の試薬は
ナカライテスク社から購入した。

反応は、あらかじめ５０ｍＭビロリン酸・ＨＣＩ緩衝液
（ｐＨ９，６）に２０μｇ／ｊ２のＡＲＰおよび１　ｍ
ｍｏｌｅ　／　Ｉｌのルミノールを溶解した液を作製し
、この６５０μｍを使い捨てプラスチック試験管の中で
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に０６１〜１ｍＭと
なるように溶解した化学発光反応増感剤あるいは対照の
ＤＭＳｏ　　５０μｍと混合したのち、」二記ルミノメ
ータ−の発光測定部位に設置し、上記緩衝液で調製した
０、１５ｍＭ過酸化水素１００μｍを添加することによ
り反応を開始させた。反応温度は２５℃で行った。発光
はルミノメータ−に内蔵された平均発光積算計（本実施
例では３０秒間の平均発光積算量で結果を示す）および
ルミノメータ−からの外部出力シグナルを記録計によっ
て記録した。観察された平均発光量およびシグナル／ノ
イズ比（Ｓ／Ｎ）を第１表に示す。

第１表 添加濃度（ｍＭ）　　発光量 １７９ ０．１　　３４９８６ １．０　２５６６０４ ０．１　　３６７０２ １．０　１６８８６０ ０．１　１７６８７８ １．０　　５２６４９ ０．１　１７５０２７ １．０　２３５１８２ ０．１　　３０４８９ １．０　　６６８５９ ０．１　２７５８３４ １．０　　８０９６０ ８−ヒドロキシキノリン　１．０　　４２４６２Ｌ−ト
リプトファン　　１．０　　１５６８４Ｎ、Ｎ−ジメチ
ルインドアニリン　　　　　　　０．１　　　　３２０
２７カルセイン　　　　　　１．０　　２２６２フイン
ジゴ　カルミン　　１．０　　３３４８２レゾルシン　
　　　　　１．０　　２５０８３とドラシン・ＭＣｌ ３−メチル−２−ベンゾチアゾリノン 無添加 増感剤 フェニルヒドラジン インジゴ インドフェノール α−ナフトキノン ヒドラゾベンゼン Ｓ／Ｎ ３９ ７７ ７５１ ７６ ７３ ４２２ ３１６ ６４ １ ０８２ ５７２ ９５ ０ ８３１ ５４ ４６４ １１ ９７ ６７２ 反応は、あらかじめ５０ｍＭピロリン酸・ＨＣＩ緩衝液
（ｐＨ９，６）に１μｇおよび５μｇ／ｌのＡＲＰ、　
１ｍｍｏｌｅ　／Ｉｔのルミノールを溶解した液を作製
し、この６５０μｍを使い捨てプラスチック試験管の中
でＤＭＳＯに０．１〜１ｍＭとなるように溶解した化学
発光反応増感剤あるいは対照としてのＤＭＳＯ５０１１
１と混合したのち、実施例１と同様に行った。反応開始
後３分間にわたり反応を追跡し、３０秒ごとの積算光量
として発光反応の持続性を比較した。結果を第２表に示
す。

実施例３　増感剤ｐ垂迦１鴻。

１ｍＭの過酸化水素を添加することにより反応を開始さ
せたこと以外、実施例１と同じ測定条件において、ＡＲ
Ｐを触媒として化学発光反応にりＪする本発明の増感剤
の一つであるヒドラゾヘン七′ノの添加濃度の効果を調
へた。６０秒間の平均発光積算量として測定した結果、
０．５〜１ｍＭ（最終濃度として３０〜６０μＭ）にお
いて最大の増感効果が得られた。結果を第１図に示す。

実施例４　増薬孔学逸芳叉応仁−た−す（餅卑１本発明
の増感剤の一つであるヒドラゾベンゼ：７１ｍＭを添加
した場合の増・感化早発光反応におＨＪるｐＨの影響を
、増感剤を加λないＩ）ＭＳＯ（対照）の場合と比較し
て実施例３と同様の条件下−（’　１ｉｉｌｉ定した。

ｐＨの影響を調べるため、５０ｍＭ１・リス・１１Ｃ１
緩衝液（ｐＨ８，３−９，５）　、５０ｍＭビロリン酸
・ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８，７へ９．６）、１００ｍＭグ
リシン・ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９，０−１１゜０）を用
いた。その結果、ヒドラゾベンゼン無添加の場合に比べ
、至適ｐＨは中性側にシフトし、ピロリン酸・ＨＣＩ緩
衝液ｐＨ９，６近辺で発光反応が最大となることがわか
った。結果を第２図に示す。第２図において、ヒドラゾ
ベンゼンで増感された化学発光を実線、ヒドラゾベンゼ
ンを加えない場合の化学発光を破線で示し２、白丸は）
・リス・ＨＣＩ緩衝液、黒丸はピロリン酸・ＨＣＩ緩衝
液、二重丸はグリシン・ＮａＯＨ緩衝液での化学発光を
示す。

実施例５ＡＲＰの増感　光による定量可本発明の増感剤
の一つであるヒドラゾベンゼンを用い、増感発光反応に
基づ＜ＡＲＰの定量可能域を以下に示す条件下で調べた
。同時に、ＨＲＰ（ＲＺ＝３．５・東洋紡社製）におｉ
Ｊる化学発光、特にＨＲＰの増感剤として既に知られで
いる６ヒトロキシベンゾチアゾールによるＨ　ＲＰの増
感発光系（ソープ（Ｔｈｏｒｐｅ）ら、Ａｎａｌ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　１４５　９６．１９８５）との比
較を行った。

反応は、あらかじめＡＲＰの場合には５０ｍＭビロリン
酸・ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ９，６）　、ＨＲＰの　６− 場合にはＯ，ＩＭ　トリス・ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８゜５
）に２μｇ〜４ｍｇ／Ｉ！（反応液の最終濃度としＴＯ
，ｉ６μｇ−３２５，ｃｚｇ／ｆｆ１．ｍ相当）　（７
）ＰＯＤ、　１ｍｍｏｌｅ　／　ｌのルミノールを溶解
した影響を作製し、この６５０μｍを使い捨てプラスチ
ック試験管の中でＤＭＳＯに１ｍＭとなるように溶解し
た上記増感剤あるいは対照のＤＭＳｏ　　５０μｍと混
合し、１ｍＭの過酸化水素１００μｍを添加することに
より反応を開始させた。その他の反応条件は実施例１と
同様にした。増感剤としてヒドラゾベンゼンを加えたＡ
　ＲＰによる増感発光系においては、ＨＲＰによる増感
発光系に比べ、より低濃度域における定量が可能であり
、定量可能域がより広範であることがわかった（反応最
終ＡＲＰ濃度として０．１６μｇ〜１６．３μｇ／ｊ２
において定量可能であった）。結果を第３図に示す。

第３図において、白丸はＡＲＰ　（ヒドラゾベンゼン添
加）、×の入った丸はＡＲＰ　（増感剤無添加）、黒丸
はＨＲＰ　（６−ヒドロキシベンゾチアゾール添加）、
二重丸はＨＲＰ　（増感剤無添加）の定量可能域をそれ
ぞれ示している。

実施例６　　ＡＲＰの増感　光による過　　水　の」 ＡＲＰの濃度を２．５ｍｇ／１、反応開始のために添加
する過酸化水素を１ｎＭ〜４．　ｍＭとした以外は実施
例５と同じ条件において、本発明の方法による過酸化水
素の定量可能域を調べた。増感剤としてヒドラゾベンゼ
ンを添加したＡＲＰによる増感発光系において、反応最
終濃度として０．２５〜５００ｎＭの過酸化水素が定量
可能であった。結果を第４図に示す。

実施例７　　　　　量の増　　ＣＣＰに　してＣＣＰに
ついてもＡＲＰと同様に化学発光が本発明の増感剤で増
大することを確認するため、ＡＲ，Ｐの代わりにＣＣＰ
を用いて実施例１と同様の試験を行った。ＣＣＰはＲＺ
が２．１のものを使用した。その結果、本発明の増感剤
はＣＣＰにおいてもＡＲＰの場合と同様の増感効果を示
した。

結果を第３表に示す。

第３表 増感剤 添加濃度 発光量 Ｓ／Ｎ 無添加 ヒドラゾベンゼン インジゴ ＭＢＴＨ＊ ０．１ｍＭ １．０ｍＭ ０．１ｍＭ １．０ｍＭ ０．１ｍＭ １９４ １６３９ ３２６３ ８０１９ １５９３５ １０６４３ ９３ ９４０ ７７１ ７２ ５５ ９１４９ 反応は、１μｇ／ｌのＣＣＰを用いそして増感剤を０．
１ｍＭとなるようにＤＭＳＯに溶解させた以外、実施例
２と同様に行った。その結果、ＡＲＰにおいて発光反応
の持続化を示す化合物はＣＣＰに置いても同様の効果を
示した。結果を第４表に示す。

９ ０ 実施例９　Ｋへ旦旦至定量 本発明の方法によるＮＡＤＨの定量を行った。

発光増感剤としてはヒドラゾベンゼンを用いた。

あらかじめ５０ｍＭビロリン酸・ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ９
，３）にＡＲＰｏ、１■／１およびルミノール１　ｍｍ
ｏｌｅ　／　Ｉｌを溶解した液６００μｍ、上記緩衝液
に０．１ｍＭ〜１ｍＭ（最終濃度として６゜２５μＭ〜
６２．５μＭ）となるよう溶解したＮＡＤＨ溶液５０μ
１１および１ｍＭヒドラゾベンゼン／ＤＭＳＯ溶液５０
μｍからなる混合液に１００μｍの１．６μＭ１−メト
キシ　５−メチルツェナジニウムメチルサルフェート（
上記緩衝液に溶解）を添加することにより発光反応を開
始させた。

発光測定方法は、６０秒間の平均発光量で測定したこと
を除き、実施例１と同様である。結果を第５図に示す。

実施例１０　クメンヒドロペルオキシドの　量ＡＲＰを
用いた化学発光反応における酸化剤として、過酸化物の
−っであるクメンヒドロペルオキシドを定量した。増感
剤としてはヒドラゾベンゼンを用いた。ＡＲＰを０．４
ｍｇ〜１０■／ｌの濃度で５０ｍＭピロリン酸・ＨＣＩ
緩衝液（ｐＨ９゜３）に溶解したこと、過酸化水素の代
わりに１ｍＭのクメンヒドロペルオキシド溶液を１００
μｌ添加することにより反応を開始したこと以外、実施
例１と同様の方法で発光測定を行った。６０秒間の平均
発光量として得られたヒドラゾベンゼンによる増感発光
の結果を第５表に示す。

第５表 ０　　４　　　　　　８２　　　　　　１１９５１．０
　　　　　１１２　　　　　　４４３２２．０　　　　
　１６４　　　　　　８６０７４．０　　　　　１６８
　　　　　１１６９７１０　　０　　　　　２０１　　
　　　１５３２８実施例」−１増感斉によるー゛′　応
の、゛性ＡＲＰの濃度を２μｇ／ｆｆとした以外は実施
例１と同じ条件で反応させ、ルミノメータ−から出た外
部出力シグナルを記録計によって追跡し、増感剤の一つ
であるヒドラゾベンゼン添加による増感発光パターンを
調べた。第６図に結果を示す。

この図から明らかなとおり、増感剤により増強された化
学発光は、１０分間あるいはそれ以」二にわたって安定
に持続した。

実施例１２　　ＶｍａｘおよびＫｍに　　る増感　の■ ＡＲＰあるいはＨＲＰの濃度を１００μｇ／１、反応開
始のために添加する過酸化水素を１μＭ〜１ｍＭとして
以外は、実施例５と同じ条件において化学発光反応を行
った。これにより得られた過酸化水素の各濃度における
発光量をもとに、ラインウィーバーφバーク（Ｌ　ｉ　
ｎ　ｅｗｅ　ａ　ｖ　ｅ　ｒ　−Ｂｕｒｋ）のプロット
（二重逆数プロット）から、ミカエリス定数（Ｋｍ）お
よび最大速度（ｖｍａｘ）を求めた。その結果、本発明
の化学発光増感剤の添加はミカエリス定数にほとんど変
化を与えないが、最大速度（Ｖｍａｘ）を顕著に増大さ
せることがわかった。結果を第６表に示す。

第６表 Ｖｍａｘ（１０−”’Ｍ　　ＰＯＤあたり）ＲＰ ００ ＡＲＰ＋ヒドラソ゛ヘンゼン １５０ ベンゾチアゾール （発明の効果） 本発明によれば、化学発光触媒能がＨＲＰよりも高い、
ＡＲＰおよびＣＣＰの触媒能をさらに増強する化学発光
増感剤を使用することにより、極めて感度の高い過酸化
水素や過酸化脂質等の測定方法が可能になった。本発明
の方法はシグナル／ノイズ比の高い条件で測定を行うこ
とが可能である。また、本発明の方法は、増感された化
学発光が安定に長時間持続するので、測定の精度にも優
れており、臨床検査等の生体成分の分析のために非常に
適するものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は増感剤ヒドラゾベンゼンと化学発光の量の関係
を示すグラフである。 第２図は増感剤の存在下におけるｐＨと化学発光の量の
関係を示すグラフである。 第３図は増感剤の存在下で化学発光を行う場合に使用さ
れるＰＯＤの濃度範囲を調べた結果を示すグラフである
。 第４図は本発明の方法で過酸化水素量を定量した結果を
示すグラフである。 第５図は本発明の方法でＮＡＤＨを定量した結果を示す
グラフである。 第６図は増感剤の存在下における化学発光の持続を示す
グラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ペルオキシダーゼ；酸化剤；ルミノールおよびイソ
   ルミノールからなる群から選択される発光基質；を反応
   させて化学発光を生じさせ、該反応に関与する成分のい
   ずれかを検出もしくは定量する方法において、ヒドラゾ
   ベンゼン、インジゴ、３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
   ノンヒドラゾン・ＨＣ１、α−ナフトキノン、インドフ
   ェノール、フェニルヒドラジン、８−ヒドロキシキノリ
   ン、フェノールフタリン、Ｌ−トリプトファン、Ｎ，Ｎ
   −ジメチルインドアニリン、カルセイン、インジゴカル
   ミンおよびレゾルシンからなる群から選択される化学発
   光増感剤の存在下で化学発光を生じさせることを特徴と
   する方法。 ２、増感剤が、ヒドラゾベンゼン、インジゴ、３−メチ
   ル−２−ベンゾチアゾリノンヒドラゾン・ＨＣ１からな
   る群から選択される、請求項１記載の方法。 ３、ペルオキシダーゼがアルスロマイセス属またはコプ
   リヌス属に属する真菌由来の酵素である、請求項１また
   は２記載の方法。 ４、検出もしくは定量される成分が、酸化剤としての過
   酸化水素であり、該過酸化水素が他の物質から酵素の作
   用によって生成したものである、請求項１ないし３のい
   ずれか１項記載の方法。