JPH11221097A - ペルオキシダーゼ活性の測定方法 - Google Patents
ペルオキシダーゼ活性の測定方法Info
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- JPH11221097A JPH11221097A JP32606098A JP32606098A JPH11221097A JP H11221097 A JPH11221097 A JP H11221097A JP 32606098 A JP32606098 A JP 32606098A JP 32606098 A JP32606098 A JP 32606098A JP H11221097 A JPH11221097 A JP H11221097A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ
活性の高感度測定が可能な化学発光系を用いてペルオキ
シダーゼ活性を測定する新規な方法を提供することを目
的とする。 【解決手段】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物と接触させることにより得られる化学発光試薬を用い
る化学発光系により、水素受容体の存在下にペルオキシ
ダーゼ活性を高感度に測定する方法。
活性の高感度測定が可能な化学発光系を用いてペルオキ
シダーゼ活性を測定する新規な方法を提供することを目
的とする。 【解決手段】 Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアク
リジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合
物と接触させることにより得られる化学発光試薬を用い
る化学発光系により、水素受容体の存在下にペルオキシ
ダーゼ活性を高感度に測定する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、化学発光法を利用
するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関する。
するペルオキシダーゼ活性の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペルオキシダーゼは水素受容体の存在下
で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このよ
うな触媒活性は例えばヘモグロビンのような非酵素物質
においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称され
る。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度に検
出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみ
ならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬と
して幅広い分野で利用されている。このようにペルオキ
シダーゼを標識物質として用いる分析方法には、抗原抗
体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用
する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他に
アビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−
レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系に用いら
れる。
で水素供与体の酸化反応を触媒する酵素である。このよ
うな触媒活性は例えばヘモグロビンのような非酵素物質
においても観察され、ペルオキシダーゼ活性と総称され
る。ペルオキシダーゼの触媒活性は微量でも高感度に検
出しやすいので、ペルオキシダーゼ酵素活性の検出のみ
ならず、種々の検出対象物質の指標となる分析用試薬と
して幅広い分野で利用されている。このようにペルオキ
シダーゼを標識物質として用いる分析方法には、抗原抗
体反応を利用する免疫学的測定法、核酸の相補性を利用
する核酸ハイブリダイゼーションアッセイ法、その他に
アビジン−ビオチン、ホルモン−ホルモン受容体、糖−
レクチン等の特異的な親和性を利用する分析系に用いら
れる。
【０００３】また、このようなペルオキシダーゼ活性の
測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を
酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で
測定する比色法、または蛍光物質を生成させてその蛍光
を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行なわれてい
る。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性の測定に比色
法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域で
の定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する
目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に
関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する
目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定
法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ
酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て
励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出
される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵
素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノ
ールを、水素受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤
にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発され
ており、ペルオキシダーゼ活性を高感度に定量すること
が可能になっている。
測定には、過酸化水素を水素受容体として水素供与体を
酸化し、色素を生成させてその発色量を分光光度計等で
測定する比色法、または蛍光物質を生成させてその蛍光
を蛍光分光光度計で測定する蛍光法等が行なわれてい
る。しかしながら、ペルオキシダーゼ活性の測定に比色
法を用いる場合には、ペルオキシダーゼの低濃度領域で
の定量性に欠けると云う問題点があり、これを解決する
目的で蛍光法が開発されたが、低濃度領域での定量性に
関しては未だ充分とは言えない。この問題点を解決する
目的で、化学発光法によるペルオキシダーゼ活性の測定
法が開発されている。化学発光法は、ペルオキシダーゼ
酵素の触媒活性によって化学発光性物質が中間体を経て
励起状態となり、この状態から基底状態に戻る際に放出
される発光量を測定することによりペルオキシダーゼ酵
素活性を定量する方法であり、化学発光性物質にルミノ
ールを、水素受容体に過酸化水素を、そして発光増強剤
にｐ−ヨードフェノールを用いる化学発光系が開発され
ており、ペルオキシダーゼ活性を高感度に定量すること
が可能になっている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、ペルオ
キシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する
場合には、酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必
要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性
測定の更なる高感度化が望まれていた。本発明は、上記
事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測定
可能な化学発光法による新規な測定系を提供することを
目的とする。
キシダーゼ酵素活性の測定を酵素免疫測定法に応用する
場合には、酵素の低濃度領域での定量性を更に高める必
要性が生じるケースが多く、ペルオキシダーゼ酵素活性
測定の更なる高感度化が望まれていた。本発明は、上記
事情に鑑み、ペルオキシダーゼ活性をより高感度で測定
可能な化学発光法による新規な測定系を提供することを
目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光性
試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類−Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物複
合体を用い、水素受容体として過酸化水素をそして発光
増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる化学発
光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる系より高
感度にペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なこ
とを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達した
ものである。
を達成するために鋭意検討を行なった結果、化学発光性
試薬としてＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジ
ニウム塩類−Ｎ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物複
合体を用い、水素受容体として過酸化水素をそして発光
増強剤として特定のフェノール系化合物を用いる化学発
光系が、化学発光性物質にルミノールを用いる系より高
感度にペルオキシダーゼ活性を定量することが可能なこ
とを見い出し、これらの知見に基いて本発明に到達した
ものである。
【０００６】従って、本発明の第一は、下記一般式
（１）
（１）
【化３】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキ
ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ
3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、ア
リール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン
原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるも
のでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２
である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物と接触させて調製した化学発光試薬を用い、
水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定
することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダー
ゼ活性の測定方法に関するものである。
ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ
3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、ア
リール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン
原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるも
のでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２
である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物と接触させて調製した化学発光試薬を用い、
水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定
することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダー
ゼ活性の測定方法に関するものである。
【０００７】また、本発明の第二は、下記一般式（１）
【化４】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキ
ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ
3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、ア
リール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン
原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるも
のでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２
である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物と接触させて調製した化学発光試薬を用い、
水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ活性を測定する
際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いるこ
とを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性
の測定方法に関するものである。
ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ
3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、ア
リール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン
原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるも
のでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２
である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物と接触させて調製した化学発光試薬を用い、
水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ活性を測定する
際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用いるこ
とを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ活性
の測定方法に関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明につき更に詳しく説
明する。本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
とＮ，Ｎ’−ジ置換カルボン酸アミド化合物とを接触さ
せて調製した化学発光試薬を水素受容体の存在下に、そ
して場合により、発光増強剤の存在下にペルオキシダー
ゼ酵素活性を測定するものであり、その測定方法は任意
であるが、一般に、化学発光試薬、発光増強剤及びペル
オキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩
基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発
光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する
方法等が行なわれている。次に本発明のペルオキシダー
ゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬について説
明する。化学発光試薬の成分であるＮ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、下記一般式
（１）
明する。本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方法は、
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
とＮ，Ｎ’−ジ置換カルボン酸アミド化合物とを接触さ
せて調製した化学発光試薬を水素受容体の存在下に、そ
して場合により、発光増強剤の存在下にペルオキシダー
ゼ酵素活性を測定するものであり、その測定方法は任意
であるが、一般に、化学発光試薬、発光増強剤及びペル
オキシダーゼ酵素を含有する測定試料を混合し、特定塩
基性ｐＨ領域において水素受容体溶液を添加して化学発
光反応させ、この化学発光量を発光測定装置で測定する
方法等が行なわれている。次に本発明のペルオキシダー
ゼ活性の測定方法に用いられる化学発光試薬について説
明する。化学発光試薬の成分であるＮ，Ｎ’−ジ置換−
９，９’−ビスアクリジニウム塩類は、下記一般式
（１）
【０００９】
【化５】 で表され、一般式（１）において、Ｒ１ 及びＲ２
は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基
からなる群より選択され、各々、互いに同一でも異なる
ものでもよい。
は、アルキル基、アリール基及びハロゲン化アリール基
からなる群より選択され、各々、互いに同一でも異なる
ものでもよい。
【００１０】アルキル基、アリール基及びハロゲン化ア
リール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ま
しいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例え
ば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペン
チル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル
基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐
状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基
は、炭素数６〜２０のものが好ましく、フェニル基、ト
リール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにア
ルキル基で置換されたものでもよい。アリール基として
は、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール
基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル
基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特
に、クロロフェニル基が好ましい。
リール基は、炭素数１〜２０を有するものであり、好ま
しいアルキル基は炭素数１〜１０のものである。例え
ば、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペン
チル基、ヘキシル基、ヘプチル基、オクチル基、ノニル
基及びデシル基等の直鎖状アルキル基又はこれらの分岐
状アルキル基を挙げることができる。また、アリール基
は、炭素数６〜２０のものが好ましく、フェニル基、ト
リール基、キシリル基等を挙げることができ、さらにア
ルキル基で置換されたものでもよい。アリール基として
は、特に、フェニル基が好ましい。ハロゲン化アリール
基としてはハロゲン化フェニル基、ハロゲン化トリル
基、ハロゲン化キシリル基等を挙げることができ、特
に、クロロフェニル基が好ましい。
【００１１】一般式（Ｉ）において、Ｒ３ 、Ｒ４ 、
Ｒ５ 及びＲ６ は、水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、各々、互いに同一でもまたは異
なるものでよい。炭化水素基の炭素数としては、例えば
１〜２０、好ましくは１〜１４を挙げることができる。
また、上記一般式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオン
であり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、具体
的には硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫
酸イオン、スルホン酸イオン等が挙げられる。これらの
なかで、特に、硝酸イオンが好ましい。
Ｒ５ 及びＲ６ は、水素原子、アルキル基、アリール
基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン原子か
らなる群より選択され、各々、互いに同一でもまたは異
なるものでよい。炭化水素基の炭素数としては、例えば
１〜２０、好ましくは１〜１４を挙げることができる。
また、上記一般式（１）において、Ｘはｎ価の陰イオン
であり、ｎは１又は２である。陰イオンとしては、具体
的には硝酸イオン、ハロゲンイオン、リン酸イオン、硫
酸イオン、スルホン酸イオン等が挙げられる。これらの
なかで、特に、硝酸イオンが好ましい。
【００１２】上記Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスア
クリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル
−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジエチル
−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニ
ル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−
ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩
等を挙げることができ、対イオンとして上記の陰イオン
が好ましいが、特に、硝酸イオンが好適である。Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とし
ては、これらに限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ’−
ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレー
ト（ルシゲニン）が好ましい。
クリジニウム塩類の具体例としては、Ｎ，Ｎ−ジメチル
−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジエチル
−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ−ジフェニ
ル−９，９’−ビスアクリジニウム塩、Ｎ，Ｎ’−ジ−
ｍ−クロロフェニル−９，９’−ビスアクリジニウム塩
等を挙げることができ、対イオンとして上記の陰イオン
が好ましいが、特に、硝酸イオンが好適である。Ｎ，
Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とし
ては、これらに限定されるものではないが、Ｎ，Ｎ’−
ジメチル−９，９’−ビスアクリジニウムジナイトレー
ト（ルシゲニン）が好ましい。
【００１３】化学発光試薬の製造に用いられるＮ，Ｎ−
ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプ
ロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−
メチル−２−ピロリドン等が比限定的に挙げられるが、
特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が好ま
しい。
ジ置換カルボン酸アミド化合物としては、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、
Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルプ
ロピオンアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルベンズアミド、Ｎ−
メチル−２−ピロリドン等が比限定的に挙げられるが、
特に、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチ
ルアセトアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン等が好ま
しい。
【００１４】これらのＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド
化合物のうち、常温で液体のものは溶媒を兼ねて大過剰
に用いることもできるし、他の適当な溶媒を用いてもよ
い。また、室温で固体のものは加熱溶融させて用いても
よく、また、適当な溶媒を用いることもできる。このよ
うな溶媒としては、ジメチルスルホキサイド、ヘキサメ
チルホスホアミド等を挙げることができる。
化合物のうち、常温で液体のものは溶媒を兼ねて大過剰
に用いることもできるし、他の適当な溶媒を用いてもよ
い。また、室温で固体のものは加熱溶融させて用いても
よく、また、適当な溶媒を用いることもできる。このよ
うな溶媒としては、ジメチルスルホキサイド、ヘキサメ
チルホスホアミド等を挙げることができる。
【００１５】化学発光試薬の製造においては、Ｎ，Ｎ’
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ
−ジ置換カルボン酸アミド化合物とを接触させることに
より、その接触時間により発光強度が増大し、ピークを
形成して減衰していく現象が観察されることから、Ｎ，
Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物がＮ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類と反応して活性化
状態を形成した後、経時的に変化して不活性化するもの
と考えられる。
−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類とＮ，Ｎ
−ジ置換カルボン酸アミド化合物とを接触させることに
より、その接触時間により発光強度が増大し、ピークを
形成して減衰していく現象が観察されることから、Ｎ，
Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物がＮ，Ｎ’−ジ置換
−９，９’−ビスアクリジニウム塩類と反応して活性化
状態を形成した後、経時的に変化して不活性化するもの
と考えられる。
【００１６】従って、上記化学発光試薬は、基本的には
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との接触処理
により製造されるものであり、以下に述べる反応条件下
において両者を混合、保持することに行なわれる。具体
的には本発明の化学発光試薬を用いて化学発光分析を行
なう際に、これらの化学発光試薬の各成分を調合して所
定時間反応させてから使用する方法が採用される。
Ｎ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類
とＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物との接触処理
により製造されるものであり、以下に述べる反応条件下
において両者を混合、保持することに行なわれる。具体
的には本発明の化学発光試薬を用いて化学発光分析を行
なう際に、これらの化学発光試薬の各成分を調合して所
定時間反応させてから使用する方法が採用される。
【００１７】上記の反応条件として、反応温度は用いら
れる試薬及び溶媒の種類によって異なるが、一般的に−
１０〜＋２００℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ま
しくは２０〜６０℃の範囲の温度である。反応時間は１
分〜一昼夜、好ましくは５分〜１２時間、特に好ましく
は１０分〜５時間の範囲の時間を採用することができ
る。また、化学発光試薬の各成分の割合は、Ｎ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類１モルに対
してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物当モルから
大過剰の範囲でよい。
れる試薬及び溶媒の種類によって異なるが、一般的に−
１０〜＋２００℃、好ましくは０〜１２０℃、特に好ま
しくは２０〜６０℃の範囲の温度である。反応時間は１
分〜一昼夜、好ましくは５分〜１２時間、特に好ましく
は１０分〜５時間の範囲の時間を採用することができ
る。また、化学発光試薬の各成分の割合は、Ｎ，Ｎ’−
ジ置換−９，９’−ビスアクリジニウム塩類１モルに対
してＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸アミド化合物当モルから
大過剰の範囲でよい。
【００１８】上記のようにして得られる化学発光試薬
は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において過剰の水
素受容体の存在下ペルオキシダーゼの濃度に依存した量
で発光する。この発光はフェノール性化合物等の発光増
強剤によって増強することが認められる。このようなフ
ェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ
−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フ
ェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ
−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェ
ノール、ｐ−プロモフェノール、ｐ−クロロフェノー
ル、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトー
ル、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げることがで
きる。上記水素受容体としては、ペルオキシダーゼの基
質になり得るものであれば特に限定されるものではない
が、有機過酸化物、無機過酸化物等を任意に用いること
ができるが、特に、過酸化水素が好ましい。
は、ｐＨ７．５〜１３の塩基性条件下において過剰の水
素受容体の存在下ペルオキシダーゼの濃度に依存した量
で発光する。この発光はフェノール性化合物等の発光増
強剤によって増強することが認められる。このようなフ
ェノール性化合物としては、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸、ｐ
−フェニルフェノール、ｐ−（４−クロロフェニル）フ
ェノール、ｐ−（４−ブロモフェニル）フェノール、ｐ
−（４−ヨードフェニル）フェノール、ｐ−ヨードフェ
ノール、ｐ−プロモフェノール、ｐ−クロロフェノー
ル、６−ヒドロキシベンゾチアゾール、２−ナフトー
ル、ホタルルシフェリン等を非限定的に挙げることがで
きる。上記水素受容体としては、ペルオキシダーゼの基
質になり得るものであれば特に限定されるものではない
が、有機過酸化物、無機過酸化物等を任意に用いること
ができるが、特に、過酸化水素が好ましい。
【００１９】本発明のペルオキシダーゼ酵素活性の測定
方法において用いられる化学発光試薬の濃度は、１０-6
〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲でよく、そ
の使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００
μｌの範囲が望ましい。発光増強剤の使用量は、化学発
光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜
１０倍モルの範囲である。また、化学発光反応に用いら
れる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質
となり得るものであれば特に限定されるものではない
が、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられ、
特に、過酸化水素が好ましい。この水素受容体の使用量
は、化学発光物質に対して充分に過剰な量で用いること
が必要であり、化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、
好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲が好ましい。
方法において用いられる化学発光試薬の濃度は、１０-6
〜１Ｍ、好ましくは１０-4〜１０-2Ｍの範囲でよく、そ
の使用量は１０〜５００μｌ、好ましくは５０〜３００
μｌの範囲が望ましい。発光増強剤の使用量は、化学発
光試薬の０．０１〜１００倍モル、好ましくは０．１〜
１０倍モルの範囲である。また、化学発光反応に用いら
れる水素受容体としては、ペルオキシダーゼ酵素の基質
となり得るものであれば特に限定されるものではない
が、有機過酸化物、無機過酸化物等が任意に用いられ、
特に、過酸化水素が好ましい。この水素受容体の使用量
は、化学発光物質に対して充分に過剰な量で用いること
が必要であり、化学発光試薬に対して３〜１万倍モル、
好ましくは１０〜１０００倍モルの範囲が好ましい。
【００２０】上記化学発光反応に用いられる塩基性緩衝
液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝
液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等
を挙げることができ、これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜
１Ｍの範囲が望ましい。また、反応時に界面活性剤、キ
レート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
液としては、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ほう酸緩衝
液、炭酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液等
を挙げることができ、これらの緩衝液の濃度は１ｍＭ〜
１Ｍの範囲が望ましい。また、反応時に界面活性剤、キ
レート剤等の添加剤を任意に用いることができる。
【００２１】
【実施例】以下、参考例及び比較例と共に、実施例を示
し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記に限定
されるものではない。
し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記に限定
されるものではない。
【００２２】［実施例１］ルシゲニン１ｍｇを試験管に
採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌを加
えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍ
ｌを加えて混合することによりルシゲニンとＮ，Ｎ’−
ジメチルホルムアミドとの複合体からなる化学発光試薬
を得た。
採り、これにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド２ｍｌを加
えて溶解させた後、室温で９０分静置してから純水２ｍ
ｌを加えて混合することによりルシゲニンとＮ，Ｎ’−
ジメチルホルムアミドとの複合体からなる化学発光試薬
を得た。
【００２３】［ペルオキシダーゼ活性の測定］ルシゲニ
ン−Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド複合体を４．０×
１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度
で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１
００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混合し、これに０．
００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミ
ノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９００
０Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示す
如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定
することが可能であった。
ン−Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド複合体を４．０×
１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度
で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１
００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワサビペルオキシダ
ーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混合し、これに０．
００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、ルミ
ノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９００
０Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表１に示す
如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測定
することが可能であった。
【００２４】
【表１】 ［実施例２］ルシゲニン１ｍｇを試験管に採り、これに
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド２ｍｌを加えて溶解させ
た後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混
合することによりルシゲニンとＮ，Ｎ’−ジメチルアセ
トアミドとの複合体からなる化学発光試薬を得る。次
に、このルシゲニン−Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
複合体を４．０×１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノール
を１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．４）１００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混
合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０
μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミ
ナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した
結果、表２に示す如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａ
ｓｓａｙまで測定することが可能であった。
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド２ｍｌを加えて溶解させ
た後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混
合することによりルシゲニンとＮ，Ｎ’−ジメチルアセ
トアミドとの複合体からなる化学発光試薬を得る。次
に、このルシゲニン−Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
複合体を４．０×１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノール
を１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．４）１００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混
合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０
μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミ
ナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した
結果、表２に示す如くＨＲＰを１×１０-18 ｍｏｌ／ａ
ｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００２５】
【表２】 ［実施例３］ルシゲニン１ｍｇを試験管に採取し、これ
にＮ−メチル−２−ピロリドン２ｍｌを加えて溶解させ
た後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混
合することによりルシゲニンとＮ，Ｎ’−ジメチルアセ
トアミドとの複合体からなる化学発光試薬を得た。次
に、このルシゲニンとＮ−メチル−２−ピロリドンとの
複合体を４．０×１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノール
を１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．４）１００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混
合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０
μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミ
ナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した
結果、表３に示す如くＨＲＰを５×１０-18 ｍｏｌ／ａ
ｓｓａｙまで測定することが可能であった。
にＮ−メチル−２−ピロリドン２ｍｌを加えて溶解させ
た後、室温で９０分静置してから純水２ｍｌを加えて混
合することによりルシゲニンとＮ，Ｎ’−ジメチルアセ
トアミドとの複合体からなる化学発光試薬を得た。次
に、このルシゲニンとＮ−メチル−２−ピロリドンとの
複合体を４．０×１０-5Ｍ、及びｐ−ヨードフェノール
を１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍトリス塩酸緩衝液
（ｐＨ８．４）１００μｌに、種々の濃度水準の西洋ワ
サビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）水溶液１００μｌを混
合し、これに０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０
μｌを加え、ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミ
ナスＣＴ−９０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した
結果、表３に示す如くＨＲＰを５×１０-18 ｍｏｌ／ａ
ｓｓａｙまで測定することが可能であった。
【００２６】
【表３】 ［比較例１］ルミノールを５．６×１０-5Ｍ、及びｐ−
ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌを種々の濃
度水準のＨＲＰ水溶液１００μｌを混合した後、これに
０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、
ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９
０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表４に
示すようなＨＲＰを１０-17 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測
定できることが認められた。
ヨードフェノールを１０-3Ｍの濃度で含有する０．１Ｍ
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．４）１００μｌを種々の濃
度水準のＨＲＰ水溶液１００μｌを混合した後、これに
０．００３４重量％過酸化水素水溶液５０μｌを加え、
ルミノメーター（ダイアヤトロン社製ルミナスＣＴ−９
０００Ｄ）で０〜５秒間発光量を積算した結果、表４に
示すようなＨＲＰを１０-17 ｍｏｌ／ａｓｓａｙまで測
定できることが認められた。
【００２７】
【表４】
【００２８】
【発明の効果】本発明のペルオキシダーゼ活性の測定方
法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を、従来から広く
使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度
で測定することが可能になり、ペルオキシダーゼを標識
物質に用いる酵素免疫測定法により抗原、抗体類を、ハ
イブリダイゼーションアッセイ法により核酸類を、各々
より高感度に検出もしくは定量することができる。
法により、ペルオキシダーゼ酵素活性を、従来から広く
使用されているルミノールを用いる測定系よりも高感度
で測定することが可能になり、ペルオキシダーゼを標識
物質に用いる酵素免疫測定法により抗原、抗体類を、ハ
イブリダイゼーションアッセイ法により核酸類を、各々
より高感度に検出もしくは定量することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 葛城 寿史 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内 (72)発明者 佐藤 未央 東京都足立区堀之内一丁目９番４号 大日 精化工業株式会社技術研究センター内
Claims (5)
- 【請求項１】 下記一般式（１） 【化１】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキ
ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ
3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、ア
リール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン
原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるも
のでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２
である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物と接触させて調製した化学発光試薬を用い、
水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定
することを特徴とする化学発光法によるペルオキシダー
ゼ活性の測定方法。 - 【請求項２】 下記一般式（１） 【化２】 （上記一般式（１）において、Ｒ1 及びＲ2 は、アルキ
ル基、アリール基及びハロゲン化アリール基からなる群
より選択され、互いに同一でも異なるものでもよく、Ｒ
3 、Ｒ4 、Ｒ5 及びＲ6 は、水素原子、アルキル基、ア
リール基、アルコキシ基、アリーロキシ基及びハロゲン
原子からなる群より選択され、互いに同一でも異なるも
のでもよく、Ｘはｎ価の陰イオンであり、ｎは１又は２
である。）で表わされるＮ，Ｎ’−ジ置換−９，９’−
ビスアクリジニウム塩類をＮ，Ｎ−ジ置換カルボン酸ア
ミド化合物と接触させて調製した化学発光試薬を用い、
水素受容体の存在下にペルオキシダーゼ酵素活性を測定
する際に、発光増強剤としてフェノール性化合物を用い
ることを特徴とする化学発光法によるペルオキシダーゼ
活性の測定方法。 - 【請求項３】 前記Ｎ，Ｎ−ジ置換−９，９’−ビ
スアクリジニウム塩類がルシゲニンであり、Ｎ，Ｎ’−
ジ置換カルボン酸アミド化合物が、Ｎ，Ｎ’−ジメチル
ホルムアミドまたはＮ，Ｎ’−ジメチルアセトアミドで
ある請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 前記水素受容体が過酸化水素である
請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項５】 前記発光増強剤がｐ−ヨードフェノ
ール、ｐ−フェニルフェノール、６−ヒドロキシベンゾ
チアゾールから選ばれる少なくとも１種のフェノール性
化合物である請求項２に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32606098A JP4028644B2 (ja) | 1997-10-31 | 1998-10-31 | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9-315790 | 1997-10-31 | ||
| JP31579097 | 1997-10-31 | ||
| JP32606098A JP4028644B2 (ja) | 1997-10-31 | 1998-10-31 | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11221097A true JPH11221097A (ja) | 1999-08-17 |
| JP4028644B2 JP4028644B2 (ja) | 2007-12-26 |
Family
ID=26568425
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32606098A Expired - Fee Related JP4028644B2 (ja) | 1997-10-31 | 1998-10-31 | ペルオキシダーゼ活性の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4028644B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1038939A1 (en) * | 1998-08-14 | 2000-09-27 | Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co. Ltd. | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
-
1998
- 1998-10-31 JP JP32606098A patent/JP4028644B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1038939A1 (en) * | 1998-08-14 | 2000-09-27 | Dainichiseika Color & Chemicals Mfg. Co. Ltd. | Chemiluminescent reagents and chemiluminescence analysis methods with the use of the same |
| EP1038939A4 (en) * | 1998-08-14 | 2005-08-17 | Dainichiseika Color Chem | CHEMOLUMINESCENT REAGENTS AND METHODS OF CHEMOLUMINESCENCE ANALYSIS USING THE SAID REAGENTS |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP4028644B2 (ja) | 2007-12-26 |
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