JPS60500648A - 新規の表現ベクタ−及びそれらのヒトのα↓1抗トリプシンの活性のあるプロテイン調整への応用 - Google Patents
新規の表現ベクタ−及びそれらのヒトのα↓1抗トリプシンの活性のあるプロテイン調整への応用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
新規の表現ベクター及びそれらのヒトのα1抗トこの発明はとくに新規のクロ/
ベクター及び表現ベクター、これらのベクターによって形質転換した細菌及びそ
れらのヒトのα、抗トリブ/ン活性のあるプロディンの調製のだめの応用に関す
る。
α、抗トリブ/ンはヒトの血清中のα1グロブリンの90%を代表する血清グリ
コプロティンである。正常な血清中には130乃至150〜7dlの濃度で存在
している。
分子量が47−52000ダルトンの単純なポリペプチド鎖であり、その10乃
至15重量係が炭水化物の側鎖である。ヒトのα1抗トリプシンにはいくつかの
変形が公知であり、これらの多形の大部分はそれぞれ単一のアミノ酸置換に由来
すると思われる。抗α、−1・lJプ/ンは主に肝臓において合成される。
α1抗トリプシンの機能(ri抗プロテアーゼのものである。これが多数の変形
のプロテアーゼと結合してそれらを、とくにトリゾ7)、トロンビン、キモトリ
プシン及びプラスミンを不活性とする。
しかしその本質的な機能は、中性好性エラスターゼを阻害することであり、後者
は組織プロティ/の大部分とくに結合組織の構成部分を分解させる性能の幅広い
スペクトルのあるプロテアーゼである。
循環する血清プロティンであるけれども、α1抗トリプ/ンは脈管外エラスター
ゼ阻害剤として極めて重要である。このことは本質的にはその大きさが小さく、
より粗大な血清抗エラスターゼ・α2−マクログロブリンと違って組織の大部分
を貫いて拡散し得ることによる。
こうしてα1抗トリプシンのほぼ44係が脈管外にあり、α1抗トリプ/ンによ
って保護される最重要な器官は肺である。
α1抗トリプ/ンの不足は、プロテアーゼ/抗プロテアーゼの不均衡を惹起こす
ことがあり、前記の理由から臨床上張も重要な結果は肺のレベルに現われる。
これらの器官中においては実際に、過剰のエラスターゼ活性が高頻度で気腫など
の肺を損なう病気へ導く。
最もよく知られだα1抗トリプ/ン不足のケースは、若干の変形のα1抗トリプ
シン表現型が、血清α1抗l・リプンンの著しい不足と結ひついている遺伝的障
害によるものである。最もよく研究された変形、Z型はアミノ酸置換(す/ンが
プロティンの末端炭素から53の位置のグルタミン酸に代る)である。この変化
がα1抗トリプシン分子のグリコ/ル化の重要性に影響を及ぼし、このことが分
子分泌欠如、肝細胞内の蓄積及び対照のものの10乃至15係を示す血清中α1
抗トリプシン含有量へ導く。この欠陥は40乃至50歳の人びとの気腫の進行と
、寸だそれより頻度は低いが肝臓障害と関連している。対立遺伝子Zは米国なら
びに欧州のコーカサス系住民の間で]/3000乃至1/4000の頻度である
。これは米国における同型接合体ZZ 50000にほぼ相当する。その米国に
おいて800人のうちのほぼ1人が正常なものの35チにしかすぎない血清中α
1抗トリプンン含有量と結びついた表現型SZを呈する。この含有量は多分プロ
テアーゼ/抗プロテアーゼ不均衡による肺のレベルでの破壊進行に相当する開側
であり、米国の罹患者の数は250000のオーダである。欧州における頻度は
ほぼ同じオーダである(文献1乃至3)。
官能的なα、抗トリプシンの含有量を下げる因子はすべて、プロテアーゼ/抗ブ
ロテアーゼ不均衡へ導き、それによって肺の傷害への傾向があることは明かであ
る。今ではこの種の障害が紙巻煙草で喫煙する人びとに現われ、紙巻煙草の煙が
非遺伝性の気腫の原因と見なされる大きな因子の一つであることは確証されてい
る。同時に、紙巻煙草の煙の成分がエラスターゼ阻害の部位に近くにおいてメチ
オニン残渣を酸化させて官能的にα1抗トリプシンを阻害できること(文献4)
及びα、抗トリプンンの官能活性が喫煙者の肺内では少なくとも2倍低減される
こと(文献5)も立証された。
喫煙者は血清のα1抗トリプシンの低下を示さず、この不足は肺内に局限されて
おり、それは紙巻煙草の煙の直接作用によることに留意するのは興味がある。
紙巻煙草の煙が肺内の中性好性エラスターゼの含有量を高くし、こうして肺の一
蛋白質加水分解負担を増大させ肺はα、抗ドリブン/の不活性化を考慮に入れて
、より少なく保護されるようになることもあり得るのは極めて確からしい。
他のさまざ捷な病理状態が血清のα1抗トリプノン含有量低下と結びついている
可能性があり、最も重要なものはとくに新生児及−び成人における急性呼吸器系
障害症候群、リューマチ2、関節炎、ステロイド依存の喘息及び多分嚢胞性繊維
症(文献I)である。
臨床の面に現われ得るプロテアーゼ/抗プロテアiゼ不均衡(文献6)はすべて
置換治療によって処理できるに違いないことは明かである。
この技法の初期の取組み方は遺伝性欠如のある人びとの正常な血清から調製した
ヒトのα、抗トリブ/ンの静脈注入を行なうことにあった(同型接合体22 )
。
これら初期の研究の結果は、血清のα1抗トリプ/ン含有量は70■/diを超
える値すなわち肺の抗エラスターゼ保護を保証するのに十分なレベルに維持でき
ることを示しだ。α1抗トリプノン欠如はすべてこうして治療的に取組みできる
ことは明かである。
この種の型の治療のためには大量の極めて純粋なヒトのα、ATを用意する必要
がある。しかし血清からのα、ATの抽出は天然媒体から抽出したプロティンの
精製の問題に遭遇し、また基質としての血清の使用に関する問題、主として汚染
の問題にも遭遇する。
これらさ捷ざまな問題は以下に示すとおり細菌醗酵によって得られる材料を用い
て解決することができる。
実際に酵素・抗原及びホルモンなどポリペプチドを、これらのポリペプチドにと
ってコードとなる遺伝子がクローン化しであるプラスミドなど表現ベクターを合
体する細菌の培養から精製することは公知である。
この明細書の枠内において用いる若干の用語要素を明確にするため遺伝子の表現
を支配する主要な要素を簡潔に思い起こすのがよい。
クローン化された遺伝子が表現され得る、すなわち該遺伝子によってコード化さ
れる所望の生成物が細菌によって合成されるためには、用いられるベクターが遺
伝子の表現に関連した若干の特性を呈するのが好都合である。
クローン化した遺伝子の表現には二つの大段階があるニ
−1ずベクターのDNAによるコード化された情報のメソセンジャRNA(mR
NA)への転写−次にこのmRNAのリポソームのレベルにあるポリペプチドへ
の形質導入
転写の段階は、情報のゝ読取り”を保証する酵素RNAポリメラーゼの転写を開
始する1プロモーター′と呼ばれるベクターのDNAの部分への固定によって始
まる。
この固定はさまざまな型の制御を受ける。とくに−RNAポリメラーゼ(でよる
転写は゛リプレッサー″と呼ばれるプロティンの固定によって抑制さね得、その
リプレッサーはプロモーター(負の対照)の近くにある・オペレーター″と呼ば
れる配列−ヒに固定される。
RNAポリメラーゼが転写を開始てきるのはリプレッサーが不活性化されている
ときのみである。
リプレッサーの不活性化又は誘導は、リプレッサーに作用する物質によるなり、
他の手段、熱などによるなりして行なわれる。
一旦DNAがRIJAポリメラーゼを介してmRNAに転写を行なうと、mRN
Aはりボノームのレベルでポリペプチド鎖へ形質導入される。
この形質導入が行なわれ得るためにはm RN Aにリポソームの固定域及び形
質導入開始の部位がわかっていることを要する。ベクターのDNAは以下に気形
質導入開始域′と呼ばれる対応の配列がなくてはならない。
先にあげた要素が、クローン化した遺伝子の表現のために必要であると表現のベ
クターは寸だ別の重要な特性も保有する。実際に若干の細菌細胞いわゆる3宿主
細胞′において写しをとらせ複製し、それによってクローン化した遺伝子の゛コ
ピー“の数を増すことができる。このことが遺伝子の表現される多くの場合にお
いてプロティンの増加産生へ導く。
最後に表現のベクターは、とくにそれがプラスミドであるとき、一般にさまざま
な抗生物質に対する耐性にとってコートとなる遺伝子があシ、この型の耐性は形
質変換細菌の株の選択を可能にする゛標識“とじて用いられる。
表現ベクターのその他の有用な要素は以下の記述中において説明する。
この発明はグラム陰性の細菌とくに大腸菌の株中のプロティン及び/又はペプチ
ドの改良された産生を可能にする新規のクローン化の及び表現のベクターに関す
る。
とぐにグラム陰性細菌中の特定の遺伝子のクローン化及び表現ベクターであって
一細菌プラスミド複製の原型
一ハクテリオファージλのプロモータ’PL、PR又はP′R
−翻訳開始のためのコート化域
一独特の制限部位(複数)を包含しているクローン化域
を包含していることを特徴とするものに関する。
先に示したとおり、プラスミド複製原型の存在は対応の細菌細胞内のベクター複
製を可能にするため重要である。とくに大腸菌の場合優先的にプラスミド、BR
322の複製原型が用いられる。実際にプラスミドpBR322は多数のコピー
を与え、こうして所望のプロティンを産生ずるプラスミドの量を増大させる利点
がある。
もち、ろん他の複製原型とくに何らかの耐性因子にとってコートとなるプラスミ
ドのもの又はコリジノ産生性エピノーム(すなわち細菌にコリシンを合成する能
力を付与する)のものを使用することは可能である。
しかし複製が僕めて厳しく制御されることのない、捷たクローン化域外において
望ましくない制限の部位を示さないプラスミドを選ぶのがよろしい。
パクリテリオファー/λのプロモーターのうち記号λPLの左の主要プロモータ
ーが優先的に用いられることになる。九はλの早熟な転写に責任のある強力なプ
ロモーターである。以前の発表はすてにPo、の制御下でクローン化した遺伝子
の高水準における表現を当てにした(文献8及び9)。
でた他のバクテリ万ファージλのプロモーター、トくに右のプロモーターPP又
は第2の右のプロモーター p′Fを用いることも可能である。
極めてさまざまな翻訳開始配列の使用が可能であるけれどもバタテリオファー/
2のプロティンcIIOもの以下スc工工rbSと称するものを用いるのが望ま
しい。
上に説明したとおりの理由がら域λcIIrbsの使用がとくに有利であるにし
ても、それにも拘わらず他の翻訳開始配列をとくに有用な制限部位によって限定
されている遺伝子λEのもの、また
R1,7C0AT (ECTCAACCGGGGTTTGAAGCATGGCT
TCTAAOTTTL I TGGGCCTGGTAGTGGAGGACTAA
GAAATGGCTAAACTGACCAAGCGCATCCGCII ATT
GTTATCTAAGGAAATACTTAC:ATATGGTT GGTC,
CAAACAAACGCAAC(、AGOMP A ATACAGTAACTC
ACAGGGGCTCGATTGATTATGTACACTTCAGGCTAT
GCACATLAM−D TGAACACACCAGTCTAAGGGATGT
TTATGACGAGCAAAGAAACCTTTACC;GATTのものも用
いることかできる。
若干の場合には合成開始の配列とくに
が用いられる。
この開始の配列は、/ヤインータ゛ルガルノ(S/D )の配列AGCAA及び
I4の読みとりを停止する翻訳終了コドンTAAを包含しており、後者の有用性
については後述する。
翻訳開始のだめのコート化域λcIIrbsは次の理由からとくに有用である。
ピ)プロティ/cIIがプロモーターP、の制御の下に大量に合成されることが
示された。
2°)問題の域は制限部位によって限られておりこれらが該域の容易な分離を可
能にする。
3°)制限酵素N d e Iが翻訳開始コドンを沙いかくす。
これらの条件において開始コドンA、TGの再構成を伴なうその部位への異物遺
伝子の挿入は、非融合プロディンすなわち初めのメチオニンを除いて調製すべき
プロティンに無関係のアミノ酸を含んでいないものの表現を可能にする。
これに反してλcIIrbsの下流の独特の制限部位の一つにおける異物遺伝子
のクローン化は、後述のとおり融合したプロティンの表現へ導く。
必要に応じて融合した、又は融合してないプロティンを作り得ることは有利であ
る。
融合したプロティンは一般に問題のプロティンのほかにベクターの遺伝子表現か
ら、又はベクターのさ1ざまな要素の若干の結合要素から由来する部分を含んで
いる。
従ってこれは問題のプロティン部分を遊離させるだめ後で表現されたプロティン
の分割を必要とする。しかし若干の場合には融合したプロティンを***させるこ
とが可能である。
これに反して融合してないプロティンの場合には分分割を準備する必要はないが
、プロティンは一般に***されず、従って細菌加水・分解生成物から分離しなく
てはならない。
最後に若干の場合には融合してないプロティンは細胞内において安定でないが、
融合したプロティンは安定である。
従ってそ才tそれの場合シて利点と不都合とを検討するのかよく、二つの型のプ
ロティンの表現を可能にし得る多価ベクターを準備するのが重要である。
独特の制限部位を包含しているクローン化域は融合した(又は融合してない)プ
ロティン産生のため異物遺伝子の挿入を可能にする。これら独特の制限部位を包
含しているクローン化域はプロモーターP1.の捷たcIIの翻訳開始域の下流
に位置している。
この域に優先的に現われる独特の挿入部位のうち、通常用いられる制限酵素に対
応するEcoRl、5alI、AccI。
BamHl、’HindIII、HindII及びPstIをあげることができ
る。翻訳開始コドン40−50塩基対下流に位置しているこの種の部位における
特殊なプロティンにとってコードとなる遺伝子の挿入は、cIIから導かれる細
菌アミノ酸のr4末端に融合した異物プロティンの合成へ導く。
問題のベクターはそのほか、望ましくはたとえばλの遺伝子N、記号λN、によ
ってコード化される抗転写終結官能を包含する。遺伝子Nの転写生成物の存在に
おいては、P、、からの転写は停止信号(複数)の大部分より前に行なわれる。
このことはクローン化された異物遺伝子がこの種の停止信号を呈するとき生じる
ことのある転写の過早停止によってもたらされる諸問題を遠ざける。そのほかプ
ロモーターが九でもPIlでもなく、たとえばP′Rであるときは抗転写終結官
能は異なっていることがある。
P−はバクテリオファージλの後期遺伝子の転写に責任がある。後期遺伝子の表
現はプロティンN(文献11)と類似の抗転写終結因子として作用することが示
された遺伝子Q(文献10)の生成物により正に制御される。
Qけこうして末端の後期遺伝子の域の転写を可能1(シてP;へ伝えられたλ構
成成分のRNA 63について終結に作用する。Qの表現はそれ自体PRによっ
て制御され、Pn ’d PIト同様にリプレッサーcIによって調節されろ。
この相互作用の断続は表現のプラスミド上に再構築され得、PLについてと同様
に使用できる。
大量の異物プロティンの連続産生の場合における宿主ベクター系の毒性及び不安
定性の問題を避けるためにはプロモーターに誘導可能、とくに熱的に誘導可能の
表現系を全部又は一部付加してプロモーターの活性制御を設ける必要がある。
望捷しくに異物プロティン合成の熱による制御が転写のレベルにおいて、宿主細
菌たとえば28℃においてP14の活性を抑制するが42°Cにおいて不活性と
なるc1857中のコート化された感熱性リプレッサーによって行なわれる。こ
のリプレッサーはプロモーターPLに隣接しているオペレーター咀に作用する。
先行のケース(ておいては熱的誘導可能の表現系の一部が宿主細菌に不可欠のも
のであるけれども、この系がベクター自体に属するように準備することは可能で
ある。
問題のベクター(、′i捷だ抗生物質たとえばpBR322の場合アンビンリン
に耐性の遺伝子も包含することができるが、他の遺伝子であってテトラサイクリ
ン(Tetr)又ハクロラムフユニコール(Cmr)に耐性のものも使用できる
。
この種の標識の合体はクローン化実験中にこの発明によりプラスミドの形質転換
担体を含んでいる細菌の選択のために必要である。
耐性の遺伝子の合体は醗酵の際に選択の圧を加えてプラスミドの安定外を増大さ
せることを可能にし、そのほか形質転換体の分離を容易にする。
クロー/化のためにはプラスミド中の異物DNA挿入を検出するのを可能にする
系を負わせるのが有利である。
例としてクローン化域に大腸菌(lacz’)のβ ガラクトシダーゼの末端l
くフラグメントを、λc T、 Iから導かれた翻訳開始域と融合させて設ける
ことが可能であり、これがαフラグメントの翻訳をcIIの配列の制御下に置く
。
α−フラグメントは宿主中のコート化された末端Cωフラグメントの表現によっ
て相補され、これが細胞内のβ−ガラクトノダーゼ活性へ導く。このβ−カラク
ト/ダーゼ活性が青色コロニーから発色団基質の存在において5−ブロム−4−
クロル−3−インドリル−β−D−ガラクト/ダーゼを生じる。
28℃においてはプロモーター九は不活性であり、α−フラグメントは合成され
ずコロニーは白色の寸まである。温度が42°Cにもたらされるとプロモーター
九が活性化されα フラグメン1が合成され、コロニーが青色に変る。
この検出系中に位置しているクローン化部位内への異物DNAの挿入はβ−ガラ
クト/ダーゼの合成を妨げ、従って28℃においてモ42°Cにおいても白色コ
ロニーへ導く。
また1acz’遺伝子を他の 検出を可能にする遺伝子によって置換することも
可能である。
この発明はまた特殊なプロティンについて、とくに融合した又は融合してない状
態において調製されたヒトのα1抗トリプシンにとってコートとなる遺伝子なら
びに対応のプラスミドのクローン化及び表現を可能にする方法にも関する。
こうしてこの発明は、特定のプロティンについてコート化する遺伝子の融合した
形の該プロティンの調製を可能にするクローン化及び表現の方法であって、前述
したような、その内に翻訳開始コドンが再構成されるベクターの翻訳開始コドン
を被う制限部位において遺伝子がクローン化されることを特徴とするものに関す
る。
この発明はそのほか特定のプロティンにとってコートとなる遺伝子の融合した形
の該遺伝子の調製を可能にするクローン化の方法であって前述したような翻訳開
始配列の下流にあるベクターのクローン化域において遺伝子がクローン化される
ことを特徴とするものに関する。
この発明はまだ、これらの方法を用いて得られるベクターならびに上記のさまざ
まなベクターによって形質転換された細菌とくにグラム陰性の細菌またとくにこ
の発明は最後(・で、こうして形質転換した株の醗酵によって調製された生成物
に関する。
最後にこの発明はベクター、とくにヒトのα、抗トリプシンについてコード化す
る配列の全部又は一部を含んでいるプラスミド、またとくに−ヒ述のようなベク
ターに関する。α1抗トリブ/)についてコート化する配列を含んでいるプラス
ミドのうちpTc 922プラスミドをあげるのがよく、その調製は実施例に記
載しである。
しかしpTC922を用いて調製したヒトのα1抗トリプンンの活性を有するプ
ロティンはα1抗トリプンン・プロティンのN−末端に融合したアミノ酸の配列
を包含している。この種の生成物の注入は若干の場合において被術者の免疫反応
を惹起こすことがある。
この不都合を避けるためには細菌内において、ヒトのα1抗トリプ/ンの融合し
てない天然の遺伝子を表現し得るのが有利である。
そのようにするため、この発明のベクターにおいては望ましくはヒトのα1抗ト
リプ/ンにとってコードとなる遺伝子の翻訳開始コドンに隣接し2て下記の構造
−CATATGGAGGATCGCCATG −−GTATACCTCCTA(
、CGGTCC−−を翻訳開始コドンが遺伝子の翻訳のだめ同位相にあるように
設ける。
融合してないα1抗トリプ/ンの調製を可能tL′cするィ/の調製・\プラス
ミドを導(pTCQ22プラスミドの修飾によって作ることができる。
第11図に図示しであるとおり、pTG922 i融合しであるα1抗トリブ/
)の遺伝子のcII配列のlく末端にとってコートとなるヌクレオチドは独特の
制限部位Ncjel及びBamHIによって連結しである。
これらで、つの部位の間に位置しているD N AをN d e 1及びシュ肘
を備えているプラスミドの分割によって排除し1、次にプラスミドの延長に戻し
て、翻訳開始コドンがα、抗I・リブノンにとってコートとなる配列の初めに直
接に同位相に融合しであるようにする。
こ0)延長へJ)戻しは
a)慰丑及び墜坦部位の融合
b)開始コドンの再構成、及び
C)グルタミン酸:ことってコートとなるコドンをpTG922C’r’)構成
(・−あ・いて欠けている成熟プロティンのトI末端(、・こ付加すること
を可能にする合成Ly)アダプター・オリコヌクレオチド今用いて丙られる。
他のブラスミt−けとくに、pTcq29内に翻訳開始の配列
TCGATAACACA GGAACAGATCT ATGを用いて使用された
。
こう(2てpTG956ブラスミトが得られる。
このブラスミl−はα−ATの増加した合成を丙ることを可能(でするが、収量
は比較的小さいま芥である。プロティンの大量の合成へ導くことのできるリポソ
ームの二つの固定部位はそれらが、α−ATの遺伝子に連結しであるとき翻訳開
始を可能にしない事実はα−ATの遺伝子自体の若干の特徴がその表現を制限す
ることを示すよう(C見える。
これかα−ATの遺伝二f−の初めを下記のように修飾しプて理由である。
もとの配列 プロティン met glu a、sp pro glu gly
asp alaDNA ATCCAG CAT CCCGAG C,C,A
C,AT GCT変更後の配列 プロティン met glu asp pro
glu gly asp alaこうしてpTC;956から、遥かに大量の
α−ATを生じるpTG933プラスミドが作られる。
この発明はまた形質転換した細菌及びこれらの細菌の醗酵(lζよってず与られ
石、す、下に2・いて゛細菌起源のヒトのα1抗ドリブン/〃と呼称する生成物
にも関する。
融合した又は融合してない状態において調製されたヒトのα1抗トリプ/ンにつ
いて、ならびに対応のプラスミドについてである。
こうしてこの発明は特定のプロティンにとってコートとなる遺伝子の、融合した
形の該プロティンの調製を可能にする、クローン化及び表現の方法てあって前述
したような、その内に翻訳開始コドンが再構成さね。
るベクターの翻訳開始コト/を被う制限部位において遺伝子がクローン化される
ことを特徴とするものに関する。
この発明はそのほか特定のプロティンにとってコードとなる遺伝子の、融合した
形の該遺伝子の調製を可能にする、クローン化の方法であって前述したような翻
訳開始配列の下流にあるベクターのクローン化域において遺伝子がクローン化さ
れることを特徴とするものに関する。
この発明はまだ、これらの方法を用いて得られるベクターならびに上記のさ寸ざ
まなベクターによって形質転換された細菌、とくにグラム陰性の細菌まだとくに
大腸菌にも関する。
この発明は最後にこうして形質転換した株の醗酵によって調製された生成物:て
も関するっ最後にこの発明は、ベクターとく、・でヒトのα、抗トリプンノにつ
いてコート化する配列の全部又は一部を含んでいるプラスミド、またとくに上述
のようなベクターならひに形質転換した細菌及びこれらの細菌の醗酵によって当
・られる、以下において゛細菌起源のヒトα1抗トリブ/′ン″と呼称する生成
物に関する。
この生成物はヒトの血清のα1抗トリブ/ンとは異なる構造を呈することがある
が、それにも拘わらず血清のα、抗トリフ/ンic比へて同じ生体内活性を、と
く(/ζ同じ抗エラスターゼ活性又は同価の活性を呈することを理解すべきであ
るっ
細菌起源のヒトのα1抗トリフ/ンとは寸だ、醗酵によって得られるが引続いて
化学的又は生物学的に修飾した細菌起源の生成物も示すものと解する。
この発明は最後にα1抗トリプ7ンの不足(lこよって惹起こされるヒトの病気
の処置及び77′又は予防のだめの医薬としての細菌起源のヒトのα1抗トリフ
/ノの使用に関する。この発明によるα1抗トリプシンによって処置又は予防で
きる病気のうち、遺伝性障害による先天性α1抗トリプ/ノ不足てあってとくに
気腫によって表現されるものをあげねばならない。また急性呼吸器系障害の若干
の症候群とくに新生児及び成人におけるもの、ならびにリューマチ様関節炎、ス
テロイド依存の喘息及び嚢胞性繊維症も処置可能である。こ ′の医薬にてだ紙
煙茸の喫煙者にお・ける若干のα1抗トリブ/ン不尽を治療するのひて使用する
こともてきる。
細菌起源のヒトのα1抗トリプシノは何れの経路によっても投与できるが非経口
の経路が、思うに、最も満足なものである。しかじ紙煙革の煙による欠陥の場合
は吸入による肺へ直接の導入もまた棲めて効果的である。
α、抗トリプンンの日日の使用薬量は処置の性質、予防的か治療的か、ならびに
処置すべき欠陥の程度によって左右される。これらの用薬量は血清中の、又はを
維持するため適応させることができる。
対応の医薬組成物もまた投与経路に適応させてあり制御された解放に、とくに循
環系内に有効成分を徐々に解放する移植組織片の形で向けておくことができる。
この発明は、もちろん他の面、とく疋実施例に記載する若干のプラスミドならび
にそれらの変異体及び誘導体また一般的に形質転換した細菌の醗酵法ならびにこ
れらの醗酵の生成物を包含する。
この発明のその他の特徴及び利点は下記の実施例及び添付図面の読みとりからよ
りよく理解される。図面第1図はpT0907プラスミドの調製を可能にする岐
器を、
第2図はMI3tg9]0ファージの調製を可能にする岐器を、
第3図はM13tg910ファージの構造を、第4図はpTG908プラスミド
の調製を可能にする岐器を、
第5図はヒトの肝臓の全RNAの翻訳生成物に相当する免疫沈澱物を、
第6図はα、抗抗トリプシンついてコート化するヒトのcDNA全体のクローン
の分離されだノ゛ンテを、第7図はα1抗トリブ//のc D N Aのクロー
ンの部分配列を公表された配列として、
第8図はpTG920プラスミドの調製を可能にする岐器を、
第9図(はα1抗トリプノ/のヒトの遺伝子を備えているプラスミドにより形質
転換した大腸菌によって合成されたプロティンのゲルの分析を、
第10図は大腸菌から調製されたα1抗トリプノノの生物学的活性を、
第11図はpT(,929プラスミドの調製を可能にする岐器を、
第12図はpTG956ブラスミドの調製を可能にする岐器を、
第13図は抗血清拭α、ATで標識した培養の免疫沈澱物を、
第14図は抗エラスターゼ試験を表わす説明図である。
この発明の枠内て用いられる細菌株は下記のものでgal Δ8proC: t
ulo lacΔm]5(λc工857ΔBamΔHI)・Jm103 、次の
特性を備えている大腸菌であるΔ(lac−prO)Sup thi endA
5bcB15 ’5ttA rK nK /F’ traD36 proAB
1ac11acZΔm15゜前述の株は利用可能であるから、用いられている
か若干の重要な特性のある限り他の株も使用可能であるのはもちろんである。そ
れらについては詳細な記述中において再度言及する。
b) D嬰ρ!−鼾
プラスミド又はM13ファージのDNAの微量調製は、l5h−Ho]、owi
tz (文献12)の記述しているもののように行なわれるが、唯一つ使用前に
DNAを2回目にエタノールを用いて沈澱させることが異なっている。
大量調製は前記の出版物に記載のもののように行なわれ、CsC1/臭化エチジ
ウム密度勾配法による補足的精製を行なう゛。
C)クローン化技法
制限酵素を用いてのDNAの処理は、別段の指示がない限り製造者(New E
ngland Biolabs、Bethesda Re5e−arch La
boratories及びBoehringer Mannheim )の示す
条件を適用して行なわれる。
必要のときは5′末端の燐酸塩を細菌アルカリホスファターゼなり仔牛の腸のホ
スファターゼなりを30分間37℃において制限酵素緩衝溶液中Gでおいて用い
て排除する。
フレノウ・ポリメラーゼ(Boehringer Mannheim)を用いて
の付着端修理は、pH7,8のトリスHCI 50mMol。
MgC125mMol 、β−メルカプトエタノールl OmMol 、 6[
TPsO,4mMo]の混合物中で酵素及びDNA 10乃至200 p g/
meを用いて25°Cにおいて15分間行なわれる。
ヌクレアーゼS、 (Miles)はNaC1O,3Mo1.Na0Ac 0.
0:うMol 、 pH4,8、ZnC1゜0.003Molの媒体中25℃に
おいて30分間DNAμgに対して2u用いられる。
Ba13]はPanayotatosほか(文献13)の方法に従って用いられ
る。連結反応は15”C(別段の温度指示のない限り)において4乃至24時間
、DNA T41Jガーゼ(Boehlinger Mannheim) を
NaC1loomMol 、ト リ ヌ、HCI66mMo1.pH7,5,M
gCl2]OmMo1.スペルミノ70.5m1JO1゜EDTA O,2mM
o1.DTT 0.2mMo1.、ATP lmMo1.BSA O]mq/m
e及びDNA 5乃至50μg /mtとともに用いて行なわれる。
付着端結合のだめにけリガーセ約300u/m/を用いる。
プラント末端結合のためにはりガーゼ約1.OOu/mrを用いる。
さまざまな酵素反応の中でDNA試料をフェノール/クロロホルム混合物を用い
て抽出し、エタノールで沈澱させる。必要なときは大腸菌又は酵母菌のtRNA
をエントレーナー(発動子・同調子)として用いる。分子アダプター(Coll
aborative Re5earch、Bethesda Re5e−arc
h Laboratories、New England Biolabs)は
事前雑種形成してあり、4℃において15時間の間T4リガーゼ100u/ml
:を用いる前記緩衝液条件を適用してのDNAプラント末端のために、10乃至
50倍のモル過剰て使用されるホスホリル化してないアダプターを用いるときは
結合の直後に未反応のアダプターをスペルミノ・テトラヒドロクロリドを用いて
沈澱させる( Hoopes はか〜文献14)。
ホスホリル化しだアタ゛ブタ−を用いるときは結合混合物は、捷ずフェノール/
クロロホルム混合物を用いて抽出し、次にエタノールで沈澱させた後に適宜な制
限酵素を用いて特異性切断を行ない、次にスペルミンテトラヒドロクロリドを用
いて沈澱させる。
適性の細菌細胞は調製し、次にプラスミドを用いて形質転換し、又はDager
t及びEhrlich (文献15)の記述している方法ニ従ってM13のDN
Aによりトランス次に記述される当発明に従うベクター合成の実施例は、勿論、
限定的なものではなく、異なる様式で実施することにより、尚発明の枠内に入る
ベクターを得ることは可能である。
当発明(C従うベクターの製造には、先ず第一に、次のものを含むプラスミドの
製造が含まれるニー pBR322の複製起源、
−このブラスミ[のアノビンリン抵抗性遺伝子amp、−プロモーターPLおよ
び遺伝子λN、さらに、この合成の際には、唯一の制限サイトが、より遅い時期
に得られるようにするだめに、不都合な制限サイトを消失させるよう努力がなさ
れなければならない。
]) pBR322内のPstサイトの除去使用される基礎プラスミドは、プラ
スミドpBR322である。しかしながら、これは遺伝子amp内に制限サイト
PstIを有するという点で不都合でろる。なぜならば、同一の性質のサイトが
、のちにクローニング領域において、唯一の制限サイトとして用いられるからで
ある。従って、プラスミドpBf1322の突然変異体であるプラスミドpuc
s−このプラスミドにおいては、アンビンリン抵抗性遺伝子は制限サイ) Ps
tIを示さない(このサイトは、試験管内で突然変異によって除去された)−を
用いて、この制限サイトを消失させる方が好都合である。pBR322は、特に
ベテスダ・リサーチ・ラボラドリース社により商品化されている。pUC8は、
文献16の論文において記述されている。
これを行うために、pBR322の1669bpのPvuI/PvuII断片が
、プラスミドpucsのPvuI/PvuII断片と交換される。この交換を実
現するだめに、プラスミドpBR322およびプラスミドpUC8は、順次Pv
uI、PvuIIによって処理され、次にリガーゼの切断によって環状にされる
。
このようにして、最早制限サイ) PstIを示さず。
最初はpBR322上に存在した制限サイ) N6eI (図2には示されてい
ない)をも失ったプラスミドpTc902が、得られる。プラスミドpTG90
2は、さらに、1aciシーケンス(配列)−このうちにPvuIIが存在する
ー−−に対応する50bpの断片を有する。
2)プロモーターPLおよび遺伝子λNの挿入ならひプロモーターPLおよび遺
伝子λNは、pTG902に挿入するためにグラスミドpKc30から分離され
る。採取された分節flj、オペレーターOLも含まれている。試験ノ部で記述
されるように、このオペレーター咀に、熱感受性レプレッサーCl850が作用
を及ぼす。さらに、この方法は、その後のλcIIrbsの挿入を可能にするだ
めに、遺伝子Nの下方に唯一のサイ) BamHIを保存しながら、サイトEC
0RIおよびHindlIIを除去しうる。
プラスS トpKc30 Kついては、文献17に記述が行われている。
pTG902は、その唯一の制限サイトEcoRIにおいて切断され、はみ出た
先端5′は、ヌクレアーゼS1処理によって除去される。BamHIによる消化
後に、最大の断片がゲル上で純化される。
プロモーターPLおよび遺伝子、t+qを有する断片が、同様にしてpKc30
から、そのプラスミドをPvu工、ヌクレアーゼ$1、およびBamHIにより
順次処理することによって、作られる。それらの断片は、ゲル上で純化されたの
ち、リガーゼの作用を受ける。これはEcoRI /PvuI融合およびBam
旧サイトの再構成に通じる。
リゲーンヨン(連結)混合物は、37℃で宿主細胞TGE900の適格細胞の形
質転換に用いられる。この系統には、有害なプロファージλ、λCl857ΔB
amΔHI−−−これはPLからの転写の遮断に必要な熱感受性λレプレッサー
、cI857を供給するm=が含まれる。
これは重要である。なぜならば、Nの抗末端機能を考慮した場合、N培地内のP
Lの活性は致死的なものだからである。
制限酵素による分析後、それらのクローンは適正な構造のプラスミドを含有する
。次にそれらは、42℃の下で生育性の欠如についてテストされる。
得られたプラスミドのうちの一つであるpTc906は、Pvu I I分節に
含まれる制限サイトを削除するだめに、この分節を除去し、さらに末端の2制限
サイトをも、消失さもるように処理される。これを行うために、pTG906は
順次、5aII、ヌクレアーゼS、 、PvuII 、およびリガーゼによって
処理される。
このようにして、この段階の初めに想起された要素全体を含む−その上に、Ps
t Eco Hincl 5al−Ava Nc+e PvuII−である〜プ
ラスミドpTG907が得られる。このプラスミドの合成は、図1に表現されて
重要な合成の第2期は、λcIIrbs領域を、AvaI/TagI断片の形態
の下で、M]、3tg、]10と名付けられたファージM]3内でクローニング
された1acz’遺伝子の冒頭(β−ガラクトンダー℃のα断片)K、挿入する
ことトー−−すなわち1acz′蛋白質産生−を可能にし、その結果として、I
PTGおよびXgalの存在の下で、青色斑が得られる。これは、さらに、いわ
ゆるノブオキジ法を用いることにより、構成の1色速なシーケンス(配列)をも
可能にする。
実験の部では、ファージM13のさ1さまな誘導体について、言及がなされる。
すでにファージM]3tgllOfついて言及された。引き続き、下記の構造を
有する同一タイプの他のファージが、利用される。
これらのベクターの構成は、下記の表Iに示されている。この表には、出発点の
ファージの標準、それを切断する制限酵素の性質、このようにして得られた断片
が受ける特殊な処理、このようにして明らかにされた部位に固定される挿入物の
性質が、記載されている。
ファー7M13mp7は、特にベテスダ・リサーチ・ラボラドリース社によって
商品化されている。
M13mp701は、M13mp7から、右側のPstI / EcoRI断片
(CTG、GAG −、、、、GAA、TTC)を、CTC; 、 CAG 、
CAA 。
TTCの配列によって置換することにより、得られる。
この構成の原理は、次の図式のうちに表現されている。
ATGACCATT、A丁TAOGAATTCCにCG GATCCGTCGA
l:CTGCAGCAATrGM; 1Y:、GCCTAコGGTACTAAT
GC;TTAAαχおQl;TAC,GCAG口C=(xバ刀TCGTTAAG
TGACα℃ATCIACCATGATTACGAATTCICCCGCATC
GA、TCCGTCGkCCT3CAGCAATTCACπ但CCTAGTGG
TACTAATCCTrAAGGGGCCTAG CTAGGCAGCTGGM
;GTCGTTAAGTGACCGG↓
ATGA(fAT、ATTJtCGAATTCCGuATCCOAACtl;T
rGG CCAAGCf仄1GGATCCGTCGACCTGCAGCAATT
CAGTGGCCiTAGTGGTACTAATGC;TTAAGGGGCGT
AGGGTTCGAACCGGTTCCAACCGTAGGGAGCTGGAG
GTCiGTTAACTGACGンG酵素(制限、DNAポリメラーゼ、TaD
NA +)プj−セ)利用のブロー・コー7Lは、供給者の注意書で指示されて
いるプロトコールである。[リッカー] HindIIIは、5’ CCAAG
CTTG(,3’の7−ケンスの合成第1ノコ゛ヌクレメーチド(米国、021
54マサチユー七ツノ州、ウオルサムのコラボラテイブ・リサーチInc、製)
である。
遺伝子croの中心からcIIのため0)コート領域の中・し・にかけて伸びて
いるλHaeIII/Sau:i断片を含むプラスミドpOGII (文献18
)から、CIIrbs領域か分離される( croおよびCIIは、特に)ζク
チ1ノオフアージλの溶解素形成の調整に関与する)。
poll]からcIIrbs領域を含む] 86bpσ) AvaI / Ta
gI断片が採取され、その断片は、Klenow ;+’: ’)メラーゼによ
って処理される。他方で、ファージMI3tgllOは、BamHI vCより
処理され、次K Klenow g lツメラーゼにより処理されたのち、仔牛
のホヌファクーセによる処理を受ける。得られた断片は、T4リカ゛−セの作用
を受ける。
cIIrbs領域を含むpOG]1断片およびファージM13J110のシーケ
ンスの検査により、M13tgllOのBamH1部位への、cIIrbsを含
む断片の挿入が一遺伝子1acZ・がcII遺伝子のAUGからの翻訳のための
位相にあることを考慮すれば一一移された細菌の発酵後の青色斑の獲得に通じ、
また一方で、親株であるMI3tg1.IOK文1青ω斑が採取され、次にミニ
標本の酵素制限分析(・でよってコロニーが選択される7次に、得られた構成が
正1−いことが、シーケンシングによって確認37zる。
このようにして、M]3tg910 K由来するクローンが得られる。その全体
的構造は図2の下部に示されている。
詳細な構造は、図3に示されている。
cIlbs断片の挿入は、上刃にBamHIサイトおよびAvaIサイトを再構
成し、下方(てBamHIサイトを再構成することか確認される。
cIIのAUGからの翻訳は、1acZ′M白質の末端11H2の8アミ、)酸
への、cIIの末端13アミノ酸の融合にこの合成の第三段階は、ファージiA
13tg91.0のcI工rbs/1acZ′断片を、事前に製造されたpTc
907ベクター・フラスミト上に移すことから成る。
これを行うためには、先ず最初にcIIrbsの一ヒ方のEcoRエサイト、B
amHIサイト、AvaIサイトを除去し、次(てBglIエサイトを挿入する
とよい。
これらの条件下で、cIIrbs I′iBgl工I−BgユニJ断片の形態の
下で採取され、pTG907のλN遺伝子およびプロモーターPLの上方のBa
mHIサイトに、設置されうる。
ファージM]3tg9]、0は、EcoRIによって消化され、次にBa131
Kよって処理され、次にKlenowポリメラーゼによって処理される。得ら
れた断片は、次シτ、非ホスボリル化BglIIアゲブタ−の存在の下で、リカ
ーセの作用を受ける。得られたりゲー/ヨ/混合物は、JM103の適格細胞の
形質転換のために用いられる。
次に、青色斑が選択される。これらのクロー7は、次に、それらがBglIIサ
イトを含むことを確認し、またそれらが最早、上方にEcoRIサイトまたはB
amHIサイトを示さないことを確認するために、分析される。
このよってして、図2(てその構造が示されているM13tg9]2のようなり
ローンが得られる。
Ba131による処理は、EcoRIサイト、BamHIサイト、AvaIサイ
トならびに1acATGおよび5hine / Dalgarn。
/−ケンスを除去し、l O]、 b pの削除を生じた。導入されたBal
I エサイトは、cIIのATGの約] oobp上方、PlacのIt)bp
T方に位置することが認められる。
前述のように、M]3tg912の1acZ′およびcIIrbsを含j1 B
glII −Bgl工I断片を、最初に準備されたpTG907のBamHIサ
イトに移すことが、考慮された。しかしながら、この構成は不可能であった。な
ぜならば、それは宿主株にとって致死的なものであることが、明らかVCされた
からである。このような理由により、pTc、907のBamHIサイトとSp
h エサイトの間への、cIIrbsおよび1abzを有するBglII/Hg
aI断片の挿入を可能にするHgaI/5phIアダプターを用いる、別個の戦
術の開発が、必要となった。
pTG907のBam/5phI断片、CII bsおよび1acZ’を有する
Bgl I I断片、およびホスホリル化アダプターが、]:2:]のモル比て
プレハイブリダイズされ、次にT、 IJガーゼで処理される。アリコート(部
分標本)が、30℃の下で、菌株6150の適格細胞の形質転換のために用いら
第1る。
関連する細胞は、pA2で標識されだcIIrbs/1acZ’断片を用いて形
質転換体を選択すること疋より識別され、得られた構成は酵素制限研究によって
確認される。
表現系統のさまざまな要素が、望み通シに導力・れることを示す最初の指示を得
るために、得られたプラスミドpTC,908は、宿主株N6437−これは、
そのプラスミドによってコートされている断片αを補足するβ−ガラクトシダー
セの断片ωおよびc1857を併有する一−−−内に移される。
得られた転換体は、I PTGおよびXgalを含む箱の中で、28℃において
白色であり、次に、42゛Cでそれらを移した場合、約30分後に青色になる。
実 施 例 2
前例と同様にして、九以外の他のプロモーターを用いることが可能である。
V、P]、rOttaによって構成されたpBλH3は、遺伝子cI857、P
3、およびpBR322内にクローニングされた遺伝子croの一部を含む。
このクローンは、プロモーターpR(promoteur dedrolte
)−−−−−−これは、そのプラスミドによってコートされたcI857の管理
下((あるー−−−−の下方の遺伝子cr。
内(lてBa1IIサイトを有する。
遺伝子。、P27、遺伝子6sArlI4、および遅発性遺伝子Sは、λBcl
I断片(文献19)内に含苔れる。この断片は、pBλH3のBglIIザイ
ト内サイ入され、このようにして、遺伝子QをプラスミドのPRの管理下に置く
ことができる。そこで、P′Rプラス断続的管理系統全体は、EC0RI断片内
に含捷れ、この断片は、pTG908内のBglII/Ay訂工I断片内に位置
するNおよびPLを置換するだめに用いられる。これはpTG908の類似の−
しがし、その転写はPkKよって管理される〜−−−構造に通じる。
次の実施例は、アンチトリプシンーα1のタメのコードを作る遺伝子のクローニ
ングに関する。
これを行うために、ヒトのアンチトリプシンーα1をコードするm RN Aの
完全な/−ケンスのためのコートヲ作ルクローンが、分離された。このノーケン
スが、事前に準備されたー−そしてE、coli (大腸菌)内で、天然ヒト・
アンチトリプシンーα1に対応する抗体との反応を示し、インビトロ(試験管内
)でアンチトリプシン−α1の生物学的作用およびそのエステラーゼ抑制能力を
示すポリペプチドの、大量の合成を証明した細菌プラスミド表現ベクター内に、
挿入された。細菌から作り出されたこのアンチトリプシンα1は、アンチ) l
)プ/ノ欠乏を含む障害の治療のための代替療実 施 例 3
ヒトの肝臓は死亡後に得られ、液体窒素内で急速に冷凍される。RNAは、文献
20VC記述されているように塩酸グデニジン法を用いて、肝臓5Iから製造さ
れる。RNAは、ボIJ A mRNAを豊富にするために、ポリU−セファロ
ース分離管(phλrmaciΔ社製)上て、クロマトグラフィー分離される。
総RNAおよびポ’) A+mRNAは、前述の文献200条件ヲ用いて、ヌク
レアーゼ(BRL )によって処理されたウサギの網赤血球の溶解質内で翻訳さ
れる。翻訳後の変異を研究するために、イヌの膵臓の膜(文献21)が、翻訳系
に加えられる。市販されている抗アンチドリブン/−α1抗血清(/ルテイノク
・イミュノロジー社製)を用いる免疫沈澱は、文献22に記述されている。
図5は、ヒトの肝臓の総RNAの翻訳産物に対応する免疫沈澱物を、表現してい
る。これらのRNAは、イヌの膵臓のミクロノーム膜の存在の下で、あるいはそ
の欠如の下で、300μji/meのヌクレアーゼによって処理されたe7サギ
の網赤血球の溶解質内て、翻訳された。メチオニン335が、放射性トレーサー
として用いられた。
TCA不溶性の約1.o6cpmの放射能を含むアリコート(部分標本)が、1
0(印刷不鮮明、%(9))ポリアクリルアミドSDSゲル上で電気泳動に付さ
れ、次に蛍光写真撮影および放射線撮影に付された。
ライン1は、放射性マーカー蛋白質を表現する。寸法(d 10”ダルトン単位
で示されている。
ライン2は、膜の存在の下での、アンチトリブ7)−α、抗血aVCよる免疫沈
澱物を表現している。
ジイン3ば、ライン2と同一であるが、得られた生成物は膜の欠如の下で作られ
たものである。
ライン4は、ライ/3と同様であるが、非免疫抗血清が用いられた。
抗アンチトリプ/ンーα1抗血清によるヒトの肝臓の総RNAの翻訳産物の免疫
沈澱は、翻訳がミクロノーム膜の欠如の下で行われる時に、45000ダルトン
の分子量の特異性ポリペプチドが沈澱することを示している。翻訳へのミク「1
ノーム膜の付加は、幾分大きい(4,8000ダルトン)免疫沈澱ポリペプチド
を導き出す。
ミクロノーム膜の存在の下におけるアンチトリプシン−C1のm RN Aの翻
訳産物の、この寸法増大は、恐らく、グリコリル化のような翻訳後変異に起因す
るものと思われる。大型のペプチドの免疫沈澱ポリペプチドは、標識されていな
い天然のヒト・アノチトリブ//−α1の付加によって、競争状態に置かれ、翻
訳産物のアイデンティティを確認する。このようにして、生物学的活性を有する
アンナトリブ/ノーα1のメンセンジャー RNAけ、総RNAにおいても、ま
たヒトの肝臓から作られたボIJ A mRNAにおいても、容易に検出されう
る。
α−ATmRNAの量は、肝臓においてば1−5(印刷不鮮明、%(?))の規
模である。
(dT)+2−18を使用する逆転写のためのマ) IJノクス(基質)として
、用いられる。相補的DNAは、pH8,3、Tris HCI 100 mモ
ル、KOl 50 mモル、Mg0128 mモル、β−ノルカプトエタノール
30mモル、オリゴ(dT)、□−181μ2、ポリAmRNA5μP、dAT
P、aCTP、dGTP、dTTP、500μモル、鳥の骨髄性白血病ウィルス
のリバース・トランスクリブターゼ(フロリダ州、セント・ピータースバーグの
ライフ・サイエンス社製)80単位を含む反応培地]00zll内で、合成され
る。
42°Cで45分間の培養後、反応は終了させられ、CDNAコンプレックスは
】00°Cで3分間加熱したのち急速に水浴上に移すことによって、変性させら
れる。
DNAの第二鎖の合成のために、プライマー鎖の反応性混合物は5倍に希釈され
、pH6,9、Hepes−KOH100mモル、KCl、 ]、OOmモル、
dATP+dcTPSaTTp、 200μモル、6CTP P”’ 200μ
モル、固有放射能0.5 Ci/m モル、E、 coliのDNAポリメラー
ゼのKlanow断片(ベーリンガー・マンハイム社製)10単位の最終濃度と
なるよう、調節される。
培養は、25゛Cで2時間行われる。放射能(でよって測定される2本鎖cDN
A (dscDNA )の収量は、970ngである。その反応混合物はpH7
,5のTris HC;l 10 mモル、EDTA ] mモルで飽和された
、等体積のフェノール:クロロホルム(50:50)を用いて抽出され、cAD
Nはエタノールによって沈澱させられる。
clscDNAは、pH48の酢酸ナトリウム30mモル、NaCl300 m
モル、ZnC1□3mモルを含む100μmの反応体積内で、SLヌクレアーゼ
5単位を用いた消化により、極度に純化される。
37℃で1時間ののち、EDTAおよびSDSが、それぞれ最終濃度が1.0m
モルおよびCl係になるでて添加される。次に、その反応混合物は、65°Cで
10分間、加熱される。Slによって処理されたdscDNAは、pH7,5の
Tris HCI 100mモル、NaCl 100mモル、EDTA5πモル
の緩衝液内の5−20 %の一次スクロース勾配上に適用され、次にベックマン
5W60 Tiローターを用いて、15℃で15分間、30000rpmて遠ル
4・分離される。o5ゴの分画が集められ、各々の分画内のcDNAO量が、各
々の分画の部分標本内のTCA−f−腎性放射能を1llji定することにより
、測定された。各々の分画内のds c D N Aの寸法は、中性アガロース
・ゲル上での部分標本の分析および、それに続く放射線撮影によって、測定され
る。
平均重量] kb以上のdscDNAを含む分画が集められ、E、 coliの
tRNA 5μgが起動物質として加えられ、エタノール沈澱およびそれに続く
遠心分離によって、核酸が回収される。
dscDNAけ、少量のSSC(15mモルのNaC1,150モルのクエン酸
ナトリウム、pH7,0) K溶解させられる。
]、OOn gのc D N Aが、pH6,80カコジル酸ナトリウム1、4
.0モル、塩化コバルト1mモル、ジチオエリトリトール0.1 mモル、dC
TPH3100μモル、固有放射能67c1/mモル、末端デオキシヌクレオチ
ド・トランスフェラーゼ5単位を含む30μmの反応培地内での、37′Cで1
5分間の培養VCよるホモホリマーaC伸長により、3′末端1で伸ばされる。
ホモポリマーdGの小片(3′末端について約13要素)が、この反応培地内で
、事前に酵素PstI Kよって消化さhだプラスミドpBR322に付加され
る。このようにしで得られたプラスミドpBR322は、次に、その反応混合物
から、フェノールによる抽出およびそれに続く予備的電気泳動、および1%アガ
ロース・ゲル上での電気溶離によって純化される。
反応培地から直接的に得られたdscDtiは、pH7,5のTris HCI
1.0mモル、NaC1100mモル、EDTA I mモルを含む150μ
mのベクター500ng Kついて、cDNA15ngの割合で、pBR322
−dGと混合され、65°Cて10分間加熱され、次に42℃で2時間培養され
る。その反応混合物は、次K E、 coli 1106株の形質転換のために
用いられる(文献23)。形質転換因子は、15μjj / mlのテトラサイ
クリンを含む寒天板上で選択されろ。そのうち約50%がIkbを越えるcDN
Aの挿入物を含むdscDNA30 ngから、合計1.5000の再連結体が
得られる。全ての形質転換体が、板から採取され、15r/mlのテトラサイク
リンを含むLB培地内で懸濁され、そのバンクは、50係に至る一寸でのグリ十
ロール添加後、−20°Cで貯蔵される。
16の末端アミノ酸のコートを作り、3′に非コート性配列の66ヌクレオチド
ヲ含む不完全なヒ1−アンチトリプ/ノのc D N Aのクローンの、306
pbの配列(文献24)が、アンチドリブン−α1のCDNA のクローンのだ
めのノ゛ノテとして用いられる、オリゴヌクレオチドの配列を決定するために、
コンピューターによって分析される。これは、306の塩基対を21塩基(21
mer)の可能な限りの全ての集合に分割し、次にそれらを別個に、それらが分
子内二本鎖構造(ヘアピン)を形成する可能性について分析することにより、行
われた。選択された21mer、5′−TGAAGCTCTCCAAGCCCT
GTG −3′(これは図6に示されている)Kは、2pbよりも長いヘアピン
は含まれていない。この配列の補足、すなわち5′−GCAl:GCCTTGG
AGAGCTTCA −3′は、以前に記述が行われたようK(文献25)、ン
リカゲル支持上で合成される。5′末端を標識したのち、オリゴヌクレオチドの
寸法がポリアクリルアミド・ゲル上の電気泳動によってテストされ、Maxam
およびG11bertの方法によって配列が決定される。
d)ヒトの肝臓のcDNAバンクの分析約1500のコロニーが、15μ97a
tのテトラサイクリンを含むLB寒天皿の上で、】晩生、生長させられる。
翌日、それらの細菌コロニーは、ワットマン540ペーパー上に移される(文献
26)。テトラサイクリンを含む最初の皿に残った細菌は、また数日間にわたっ
て、37゛Cの下で生長させられる。ノ・イブリテー/ヨンのだめの、細菌プラ
スミドDNAを製造するため(で、tJ a O805モルを用いて5分間、フ
ィルターが洗滌される。
それらのフィルターは、空気中で乾燥させられたのち、pH7,5のTris
HCI 0.5モル、2 X SSCの緩衝液内での連続的洗滌によって、中和
される。そこで、それらのフィルターはアルコールでゆすがれ、空気中で乾燥さ
せられる。残存する細菌の破片は、pH7,5のTris HCl50mモル、
EDTA5mモル、0.5 % SDS内で、Kブロテイナーセ25μi/ml
による37℃での、2時間の消化によって、除去される。
ハイブリデーンヨン・ゾンデは、50 uciのp32 r−ATPを用いて2
1marの80 ngについて、キナーゼ・ポリヌクレオチド(PL・バイオケ
ミカルス社製)を用いて5′末端を標識することによって、製造される。
ハイブリデーンヨンは、6 X SSC、I X Denharclt液、pH
75の燐酸ナトリウム10mモル、5係のホルムアミドを含む溶液JQml内で
、37℃で1晩中、行われる。そこで、フィルターは、室温の下で6 X SS
C,0,1%SDSを用いて、数回洗滌される。それらのフィルターは乾燥させ
られ、1晩中オートラジオグラフイー撮影される。
非常に強い正のシグナルは、ハイブリデーンヨンの基礎雑音以上に、明瞭に検出
されつる。
大規模な正のシグナルに対応する細菌コロニーは、テトラサイクリンを含む最初
の皿を用いて、オートラジオグラフの方向付けをすることにより、決定される。
プラスミドDrqへけ、各々の細菌コロニーの小培養から製造され(文献27)
、各々のプラスミドのc D N Aの挿入物は、PstIによる消化によって
決定される。pTG603と呼ばれるプラスミドは、二つのAvaIサイトおよ
び唯一のBamHIサイトを有する約1.6 kbの挿入物を含んでいることが
、認められる。AvaI + PstIによる二重の消化によって作られた断片
の寸法(25o塩基対)は、完全な長さを有するアンチドリブン/のクローンに
ついて予測された寸法と、一致する(文献24.28 )。このプラスミドが実
際にアンチトリプ/ンーα1のcDNAを含んでいることを確認するために、そ
の挿入物ばPstI断片の形態の下で、PstIによる切断後にファー;;M]
3mp8−ヒに移され、次に、連鎖停止剤としてジデオギンヌクレオチドを用い
て配列される。得られた配列は、そのc D N Aとアンチトリブ/ン−α1
のc D N Aの一致を確認する(図7)。得られた配列は、アンチトリプ/
ンーα1のだめのコートを作るヒ1−DNAについて知られている、対応する領
域と、比較される。図7の上部には、完全なアンチトリプンン−α1のcDNA
のクローンの部分的配列が示され、下部には、明らかにされたpTG603の部
分的配列が示されている。
ヒト・アノチトリブノン−α1のc D N AのクローンpT0603は、成
熟した蛋白質の最初のアミノ酸のためのコドンの直後に、唯一の制限サイトBa
mHIを含んでいる。成熟した全ポリペプチドのためのコーティング能は、最初
のグルタミン酸を除いて、pT0920表現ベクター上にクローニングされたB
amHI / PstI断片内で、このようにして得られる。この構成において
は、転写は左側のλプロモーターPLから行われ、翻訳はりボノーム固定ザイト
を伴うλcIIrbsのATGにおいて開始される。さらに、遺伝子λcIIの
最初の39pbは、指示されているように、遺伝子1 a c Z’の冒頭にお
いて融合する。
唯一の制限サイトを含む連結領域は、cIIと1. a c 7.′配列の接合
部に位置する。プラスミドpTG92oは、実施例3において製造されたpTG
908の誘導体である。
このプラスミドにおいては、pTG908て1dcIIのATGの40 bp十
方に位置する原断片BamHI/Pstは、図8に示されているように、M13
tgl15のBglI工/ Pst断片によって置換されている。
このプロセスのおかけで、ア/チトリプンンーα、の遺伝子のBamHIサイト
と同一の翻訳和尚に位置するBamHIサイトが、得られる。
図8は、プラスミドpTcq 08およびファージM13tg115からのプラ
スミドpTG920の製造を可能にするクローニング戦略および、クローニング
すべ@pT0603の断片の指示を表現している。実線の矢印は、蛋白質のだめ
のコードを作る配列を表現し、pTc603の場合には、アンチトリプンンーα
1の成熟したポリペプチドのだめのコードを作る配列を表現している。線形が付
けられた領域は、最終的にはアンチトリプシンーα1と融合するcIIのN末端
13アミノ酸のだめのコートを作る領域を、表現している。
このようにして、pTG920のPstIザイトとBamHIの間へのBamH
I / PstI断片の挿入は、蛋白質cIIの13アミノ酸(NH2末端から
の)、アダプターの配列に由来する4アミノ酸、14H2末端のグルタミン酸を
除くア/チトリプンンーα1の成熟したポリペプチドを含む融合ポリペプチドの
表現に通じる。
BamHI / PstIおよびアルカリ性ホスファターゼによって処理された
pTG920は、BamHIおよびPstI iCよって消化されたpT060
3と連結する。アンチトリプ/ンーα、断片を有する形質転換体TGE900細
胞は、酵素制限研究後に分離される。これらのクローンのうちの一つであるpT
G922が、より完全な研究のために選択される。
既に言及されたように、当発明に従うベクターは、前掲の方法の異型の名目で、
非融合蛋白質の製造を可能にする。これを行うためには、pTG920がNde
Iで消化され、さらにpTG603が前述のようにBamHIで消化され、次に
、下記のように、オリゴマー・アダプターの仲介によって得られた断片の連結が
行われる。あるいけ、ベクターpTG922 (/l:関して、同一の作業が行
われる:
5’−CATATG−−−−−−−−−−−−−−GGATCC3′TATGC
,AC
ACCTCCTAG 9mer
−−−−−−−GA TATGGAG GAT−−−−−−−−−−−−−−C
T ATACCTCCTA−−−−−−−この接合は、アンチトリプノノ−α1
のだめのコードを作る遺伝子の融合の対象となる出発点のATGコトノを、再構
成する。
E、 coli TGE900株の細胞は、ヒl−・アンチトリプ/ンーα1の
遺伝子を含むpT0922表現プラスミド捷だは、挿入物を持たない単独のプラ
スミ)pTG920を含むことから、それらの蛋白質は、上記の温度で1時間に
わたって、メチオニンS35で標識される。抽出物は、文献7に記述されている
ようにして製造され、部分標本が10%SDSポリアクリルアミド上で分析され
、次にフルオログラフィーおよびオートラジオグラフィーによって分析される。
結果は図9AK示されているニ
ライン1:放射性分子量マーカー、
ライy 2 : pTG922を伴う細胞抽出物、28°Cにおける生長(誘導
なし)、
ライン3ニライン2と同様、たたし42℃における生長(誘導)、
ライン4ニブラスミドpTG920を含む細胞の抽出物、ライン5ニライン4と
同様、たたし42℃における生長、
観察された結果は、約45000ダルトンの分子量を有する太い帯の誘導を、証
明している(図9A)。オートラジオグラムの密度計測定は、作り出されたアン
チ(・リブノン−α1の量が、E、 co]、iの総蛋白質の75−15係に相
当することを示している(アンチトリプシン−α1のメチオニン含量とE、 c
oliの総蛋白質のメチオニン含量の間の、可能性として考えられる差について
の調節は行われなかった)。
プラスミドpTc920およびpTG922を有するE、 coliの細胞の標
識抽出物は、前述のようにして製造される。
部分標本は、図5について記述されているように抗アノチドリプシンーα1抗血
清を用いた免疫沈澱に付され、! Q Z Sz Sポリアクリルアミド・ゲル
上で分析され、次にフルオログラフィーによって分析される。結果(は図9B]
に示されているニ
ライン1は、42℃で標識され、抗アンチトリプシンーα、抗血清によって免疫
沈澱させられたI)TG922 (アンチトリプシンーα1の配列を示す)を含
むE、 coli・T(、E900のエキスに対応する。100μmのエキス、
ライン2は、ライン1と同様である。ただし、2μlライノ4はライン1と同様
であるが、許可されていない温度(28℃)、100μmのエキス、ライン5け
、誘導温度42℃で標識された族プラスミドpTG920を含む細胞のエキス、
100/11のエキス、さらに、図982には、E、 coliによって合成さ
れたアンチトリプシンーα、の免疫競争の結果が示されている。pTG922を
含むE、 coliの細胞エキスは、前述のようにして42゛Cで標識される。
部分標本は、次の免疫沈澱のだめに用いられるニ
ライン1:抗アンチトリプ/ンーα、抗血清を用いた免疫沈澱、
ライン2ニライン1と同様である。ただし、無標識の、天然のヒト・アンチトリ
プシン−α1、】oμIの存在の下で、
ライン3ニライン2と同様である。ただしアンチトリフ/ンーαトコンペティタ
ー20μ、9、ライン4、ライン3と同様である。ただしコンペテイター50μ
g。
これらの試験は、その免疫沈澱産物の分子量が、膜の欠如の下でヒト肝臓mRN
A由来細胞を持たない翻訳産物からの沈澱産物の分子量と、同一であることを証
pTG922の粗エキスが製造され、部分標本が、その抗ブタ膵臓エラスターゼ
活性についてテストされる。
E、 collによって作ら→tたアンチトリプシン−α1の生物学的活性をテ
ストするため(で、前述のようにして、大豆トリプシン抑制剤を除くプロテアー
ゼ抑制剤の欠如の下で、培養の粗エキスが製造される。エステラーゼ試験は、修
正されたVerbの方法(文献29)に従って行われる。アンチトリプシン−α
1試料の粗エキスは、エラスチンH3の添加および37°Cでの培養に先立って
、環境温+iの下で30分間、ブタ膵臓エラスターゼ02511hiとともに前
培養される。次に、300μmの試料が遠心分離され、上澄の計算によって抑制
百分率が決定される。
試料は次の通りである:
1)−−一 エラスターゼ
2)−エラスターゼ+誘導されたpTG920エキス50111 .
3−4)−−エラスターセキ誘導されたpTG920工キス20μm+ヒト・ア
ンチトリプシン−α、(ングマ社製)5μg1
5〜6−7)−エラスターゼ下誘導されたpTG922エキス5μ+20μl+
501t1.
8)−一 エラスターゼ4−非誘導pTG922エキス50μm結果(図10)
は、エラスターゼの完全な抑制が、pTG922により誘導されたエキスを用い
た場合にのみ得られ、pTG922またはpTG920の非誘導エキスによって
は得られないことを、明らかにしている。これは、誘導さ、hたエキス内の、生
物学的活性を有するアンチトリプシンーα1の存在を示している。
標識された被誘導エキスのポリアクリルアミド・ゲルから、総細胞蛋白質の約1
5係が、アンチトリプ/ノーα1によって構成されていると推定される。
1細胞当りの蛋白質がIpgであることを認めるならば、これは、1細胞当りO
,i 5 p gのアンチトリプシン−α、を与える。
超音波および遠心分離後、アンチトリプシンの約50係が沈渣内に失われる。従
って、上澄内の細胞蛋白質合計と比較した場合の、アンチトリプシン−α1の百
分率は75係である。
作り出されたアンチトリプシン−α1の量も、同様に抗エステラーゼ活性の測定
値から推定されうる。ブタ膵臓エステラーゼ0.25μgについて、100%の
抑制が、血清から作られたヒト・アンチトリプシン]0μgを用いて得られたこ
とが、認められた(対照細菌エキスの存在の下で)。等値の抑制寸準が、アンチ
トリプシン−α1を含む被誘導細菌エキス50μmを用いて観察される。すなわ
ち:
50μlのエキスーアンチトリプ7ン−α、 10/4.9<−> 1.5μl
の培養 −アンチトリプシノーα110μI<−> 1.5 X 10’細胞
−アンチトリプシノ−α110μy<=>150細胞 =アンチトリブノノーα
、 10/29〈−〉1細胞 −0,05pg (すなわち総細胞蛋白質の6係
)
これは、音波処理および遠心分離後のゲルから推定された75%という比率と、
非常に一致している。この割算は、細菌によって作り出されたアンチトリプンン
ーα1が、血清から製造されたアンチトリプシン−α、の抗エラスターゼ活性率
に匹敵する抗エラスターゼ活性率を示すこと、および、アンチトリプンンーα1
が、培養11当り約15#+9の比率で作り出されることを示してヒト・アンチ
トリプンンーα1は、3本の炭水化物側鎖を含む糖蛋白質である。これらの鎖は
、N−アセチル・ノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、N −アセチル・
グリコサミンを含むN−グルコノド・タイプの鎖であり、1個のアスパラギニル
基の仲介によって蛋白質と結合している。オリゴ糖類は、A形態の下で(または
分岐の2点に)、あるいはB形態の下で(分岐の1点)、存在する。
蛋白質の生物学的活性のためには、恐らく、グリコジル化は不必要であると思わ
れる。なぜならば、細菌から得られた産物は、活性を示すからである。
より良い安定性を保証するために、細菌によって得られた産物をグリコノル化す
ることは、必要であると考えられる。これは、インビトニで可能である。なせな
らば、膜の存在の下でアンナトリプ/ノーα1のmRNAから得られた、細胞を
含−1:ない翻訳産物は、グリコノル化を考慮に入れるならば、その寸法が増大
することが認められるからである。
実 施 例 4
非融合α−アンチトリプシンの取得(図11)出発点のプラスミドは、前述のプ
ラスミドpTC922である。
プラスミドpTG922は、供給者によって指示された条件を用いて、制限酵素
NaeI にューイングラント・バイオラボラドリース社製)およびBamHI
(ベテスダ・リサーチ・ラボラドリース社製)による完全な制限を受ける。
既知の方法により、次の構造を有する非ボスホリル化相補性アダプター・オリゴ
ヌクレオチ[・カ、合成すれる:
5′−dTATcGAG−3’および
5’ −dGATGcTCCA−3’
これらのオリゴヌクレオチドハ、プレハイブリダイズされ、次に、既知の条件下
でDNA IJガーゼを用いて、50:1のモル比で酵素制限を受けたプラスミ
1−pTC,922と、4°Cの下で連結される。この連結混合物は、TGE9
00株の適格細胞の形質転換のだめに用いられ、得られた形質転換株は、アンピ
ンリンの存在の下で培地上に展開される。
T4ポリヌクレオチド・キナーゼ5’ −(]0CTGGGATCCTCCA
−3’で標識されたゾンデを用いた、ハイブリデーノヨンによす、ニトロセルロ
ース・フィルター上で、コロニーが選択される。このゾンデは、選択しだい非融
合構成を完全に補足するが、親プラスミドpTG922のヌクレオチドのうちの
7個のみを、補足するにすぎない。これは、バイブリプ−ジョンを保証するには
不十分である。
このようにして、確実な6候補が得られる。
これらは、28°Cおよび42℃で培養され、製造されたエキスは、主特許証に
記述されたように、それらの抗エラスターゼ活性についてテストされる。
結果は、添付の表に記載されている。
pT0920 28℃ 5
42℃ 42
pT0922 28℃ 936
(表の注)
pTG920 i、アンピンリン//−α1のだめのコートを作る配列を持たな
い唯一のベクターである。
TG922
pTG929 fl)および(2)I″i、当発明の方法によって製造された異
なるクローンである。
リブンンーα1の表現を保証することを証明している。
プラスミドpTG922と比較した場合のプラスミドpTc929 Kおけるヒ
、ト・アンチトリプシン−α1の表現水準の減少は、恐らく、cII配列の一部
の消失に起因するものと思われる。
質のO曝未満)を産生ずるにすぎない。表現水準を増大させるだめ(て、次のよ
うに、合成rbsサイトによってcI■rbsが置換される。
5hine/Da1gano配列
この交換は、図]、2に示されているようにして、実施される。pTG929の
HpaIサイトおよびBglIエサイトは、それぞれC1aIサイトおよびχh
oIサイトによって、合成挿入物を用If′−て置換される。
その場合、合成rbs (synth rbs)は、N遺伝子内(で作り出され
た新しいC1aIサイトとNdeIサイトの間に、挿入される。この操作はcI
Irbsを除去し、その直後K 5ynth rbsが続く欠損N遺伝子を導き
出す。syn thrbs内の翻訳末端コドノ(TAA)は、Nの翻訳を遮断す
る。得られたプラスミドpTG956は、インヒドロ抗エラスターセ試験(でよ
って証明されたように、総細胞蛋白質の月俸の水準で、α、−ATを産生する。
実 施 例 6
明細書において指摘されたよう(/l:、プラスミドpTc956f/cおいて
は、α−ATの原配列が変異配列によって置換される:
原配列:
蛋白質+ met glu asp pro glu gay asp ala
DNA : ATCGAG GA、T CCCCAG GGA GA、T GC
;T変異配列。
蛋白質: met glu ?Lsp pro glu gly asp al
aDNA : ATG GAA GAT COT CAA GG−CGAT G
CT各々の変化(星標が付されている)1d、コドンの3位において行われ、コ
ートされたアミノ酸を変化させない。α−ATの遺伝−7は、特定の塩基の変化
を決定する合成オリゴヌクレオチドを用いてサイト上で行われる変異誘発テクニ
ンクを利用して、変化させられる(文献30)。選択される配列の変化は、E、
coliO遺伝子の冒頭も・こ隣接する幾つかの位置における、一定の塩基に
ついての選択を証明する統計的研究に、由来する(文献31および文献32)。
これらの変化は、同様に、可能性として考えられる二次的な−α−ATの配列の
うちVこ出現しうる一構造に対応する領域をも、不安定化するであろう。
変異誘発のだめのオリゴヌクレオチドは、次の通りである:
5′−AGCATCGCCTTGAGC,ATCTTCCAT −3’この配列
は、原配列と比較した場合、四つの差異を含み、前記のα−ATの遺伝子内の変
異に通じる−0得られたプラスミドpTG983は、前述の変化を除いてpTG
956と同一である。
仄の2系列の試験が実施されたニ
ー抗α、AT抗血清を用いた・535s)−メチオニン標識株の培養の免疫沈澱
。
一抗エラスターゼ(ヒト白血球に由来する)活性。
これらの試験の結果は、図2および図3に示されている。
図2には、次の5免疫沈澱試験が示されているニー/す/グー1:対照培養(キ
ロダルトン単位の分−シリンダ−2:誘導されたpTG920 (挿入物を持た
ないプラスミド・ベクター)の培養、−/リンター3:誘導されたpTc922
(融合α、AT)の培養、
一/リノダー4:非誘導pTG922 (融合α、AT)の培養、
一ンリンク”−5:誘導されたpTc983 (非融合α、AT)の培養、
矢印は、融合α、 AT (上方の帯)および非融合α1AT (下方の帯)に
対応する沈澱領域を示す。シリンダー5の上に出現する下方の帯は、恐らく、α
、 ATの配列内の翻訳開始の結果であると思われる。
この第一系列のテストにより、pTG983を含む菌株(宿主株TGE900
)の培養に由来する標識蛋白質の抗α、 AT抗血清による免疫沈澱が証明され
、42キロダルトンの分子量の蛋白質が得らnる。これに、pT0922株の培
養(シリンダー3)から得られた44キロダルトノの融合蛋白質と比較した場合
、非融合α1pTの寸法々一致する(シリンダー5参照)。
図3(では、抗エラスターゼ活性試験の結果が、図式的に示されている。これら
は、ヒト白血球エラスターゼ(50ng)(エラスチン・プロダクツ社製)およ
び、基質としてのメトキシ−サクシニル−ala、−ala −pTC−val
−二l−ロアニリト(カルバイオヶム社製)から、実現された。エラスターゼの
開裂はニトロアニリドを解放し、二)aアニリドは4]、Onmて回収される。
図3のグラフについては、さまざまな曲線の凡例は次の通りであるニ
ー・−誘導されたpTC,922のエキス−〇−誘導されたpTG983のエキ
スームー非誘導pTG983のエキス
−△−誘導された対照pTc920のエキスインビボ(生体内)で実施されたこ
れらの抗エラスターゼ・テストは、pTG983がα、ATの大規模な比率の表
現を可能にするこ七を示している。図3は、エラスターゼ(50ng)の50%
の抑制が、約4μIのpTG922 エキスおよび約14μIのpTG983エ
キスによって得られることを、示している。これは、それぞれ、産生される総細
胞蛋白質の約3%および約]%に相当する。エラスターゼ50ng ij、天然
ヒトα、AT(/グマ社製)の1100−120nによって、50%抑制される
。pTC922を用いて実施されたそれらの試験の双方によって得られだα。
ATの百分率の差は、失われたα、ATO量の変動の結果であり、この損失は細
胞内沈澱に対応する。これらの細胞内沈澱のうち、pTC983の培養によって
証明されたものは皆無であった。
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、Rev。
R/LIII
vu II
signal
ANTITRYP51’N訃双1
ソ“〉テ゛: CCTGGGGATCGTCCA68−
抽出″PjJ”9
特許庁長官殿
(特許庁審査官 殿)
1、事件の表示
2、発明の名称
3、 補正をする者
事件との関係 出願人
氏名(名称)トランスノエンヌ・ノシェテ・アノニム4、代理人
住所 東京都港区南青山−丁目1番1号委任状
7、補正の内容
別紙のとおり
竹表昭GO−5(10648(22)
国際調査報告
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1 細菌内の特定の遺伝子のクロー/化の、又は表現のベクターにおいて、少な くとも a)細菌プラスミド複製原型 b)バクテリオファージλのプロモーターP、、、 P、又はP′R C)翻訳開始域 d)独特の制限部位(複数)を包含しているりo −ン化域 を包含していることを特徴とするベクター。 2 細菌内の特定の遺伝子のクローン化の、又は表現のベクターにおいて、少な くとも a)細菌プラスミド複製原型 b)バクテリオファージλのプロモーターPL、PR又はP′R c)−+cIIrcbsとλErbsとの間で選ばれた翻訳開始域、又はバクテ リオファージλのプロモーターの制御下におかれた合成配列 d)独特の制限部位(複数)を包含しているクローン化域 を包含していることを特徴とするベクター。 3 翻訳開始域がλcIIrbSであることを特徴とする請求の範囲第2項記載 のベクター。 4 域が配列 の全部又は=部によって構成しであることを特徴とする請求の範囲第3項記載の ベクター。 −5翻訳開始域が遺伝子λEの翻訳開始域の全部又は一部によって構成しである ことを特徴とする請求の範囲第2項記載のベクター。 6 翻訳開始域が下記のものであることを特徴とする請求の範囲第2項記載のベ クター。 ンヤインダルガルノ 配列 7 翻訳開始域内に位置している独特の制限部位を包含していることを特徴とす る請求の範囲第2乃至6項の一つに記載のベクター。 8 λcIIrbsの場合において独特の制限部位がNdeI部位でるることを 特徴とする請不の範囲゛第7項記載のベクター。 9 用いられるプロモーターがプロモーターPLであることを特徴とする請求の 範囲第1乃至8項の一つに記載のベクター。 10 そのほかに抗転写終結官能を包含していることを特徴とする請求の範囲第 1乃至9項の一つに記載のベクター。 11 抗転写終結官能は、プロモーターPL又けP8のだめの遺伝子λN又はプ ロモーターP′Rのための遺伝子λQであることを特徴とする請求の範囲第10 項記載のベクター。 12. pBR322の複製原型を包含していることを特徴とする請求の範囲第 1乃至11項の一つに記載のベクター。 13、抗生物質に対する耐性にとってコードとなる遺伝子を包含していることを 特徴とする請求の範囲第1乃至12項の一つに記載のベクター。 14 アンビンリンに対して耐性のある遺伝子を包含していることを特徴とする 請求の範囲第13項記載のアノピノリン耐性遺伝子を包含していることを特徴と する請求の範囲第14項記載のベクター。 16 クローン化域が指示遺伝子内に位置していることを特徴とする請求の範囲 第1乃至15項の一つに記載のベクター。 17 指示遺伝子は1acZ遺伝子の全部又は一部によって構成しであることを 特徴とする請求の範囲第16項記載のベクター。 18 プロモーターはりプレンサーによって制御されることを特徴とする請求の 範囲第1乃至16項の一つに記載のベクター。 19 酵素抑制配列は温度上昇によって誘導され得ることを特徴とする請求の範 囲第18項記載のベクタ20特定のプロティンについてコート化する遺伝÷を包 含していることを特徴とする請求の範囲第1乃至19項の一つに記載のベクター 。 21、pTG922ベクタープラスミドならびにその変22 ヒトのα1抗トリ プンノにとってコードとなる遺伝子全部又は一部を包含していることを特徴とす る請求の範囲第20及び21項の一つに記載のベクター。 23 α1抗トリブ/ンにとってコードとなる遺伝子の翻訳開始コドンの近くに 下記の構造CATATC,GAGGATCCCCAGGCTATACTTCCT AGCGGTCCを翻訳開始コドンが遺伝子翻訳のだめ同位相(であるように包 含していることを特徴とする請求の範囲第21項記載のベクター。 24、pTG908及びpTG920ベクタープラスミドならびにそれらの変異 体及び誘導体。 25、pTG929プラスミドであることを特徴とする請求の範囲第23項記載 のベクター。 26 α、抗トリプシンにとってコードとなる遺伝子の翻訳開始コドンの近くに 下記の構造ATCCAA GAT CCT CAA GGCGATGCTTAC CTT CTA GGA GTT CCGCTAC;GAを包含していることを 特徴とする請求の範囲第22項27、pTc983プラスミドであることを特徴 とする請求の範囲第26項記載のベクター。 28 特定のプロティンにとってコードとなる遺伝子の、融合してない該プロテ ィンの調製を可能にする 1クローン化の方法において、その遺伝子を制限部位 に 1オイて・請求の範囲第1乃至21項の一つに記載のベクターの翻訳開始コ ドンを被ってクローン化し、翻訳開始コドンを再構成することを特徴とする方法 。 29 特定のプロティンにとってコードとなる遺伝子の、融合した該プロティン の調製を可能にする、クローン化の方法において、翻訳開始配列の下流にある請 求の範囲第1乃至20項の一つに記載のベクターのクローン化域においてその遺 伝子をクローン化することを特徴とする方法。 30 請求の範囲第28及び29項の一つに記載の方法を用いて得られるベクタ ー。 31 少なくともヒトのα1抗トリブ/ンにとってコートとなる配列の全部又は 一部を包含していることを特徴とするα1−抗トリブ/ンのクローン化の及び表 現のベクター。 32 請求の範囲第1乃至27及び30及び31項の一つに記載のベクターを用 いて形質転換した細菌。 33 大腸菌の株であることを特徴とする請求の範囲第32項記載の細菌。 34 細菌起源のヒトのα、−抗トリブ/ンの製法ておいて、請求の範囲第32 及び33項の一つに記載の杉゛質転換した細菌を培養基において培養し、該細菌 はヒトのα1抗トリブノンにとってコードとなるDNAの配列の全部又は一部を 包含するベクターによって形質転換しであることを特徴とする方法。 35 細菌起源のヒトのα1抗トリプシン。 36 医薬としての細菌起源のヒトのα、抗トリブ// 。 浄書(内容蚤こ変更なし)
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR8300909 | 1983-01-21 | ||
FR8300909A FR2539758B1 (fr) | 1983-01-21 | 1983-01-21 | Nouveaux vecteurs d'expression et leur application a la preparation d'une proteine ayant l'activite de l'antitrypsine-a1 humaine |
FR8311594 | 1983-07-12 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS60500648A true JPS60500648A (ja) | 1985-05-09 |
Family
ID=9285167
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP50058484A Pending JPS60500648A (ja) | 1983-01-21 | 1984-01-20 | 新規の表現ベクタ−及びそれらのヒトのα↓1抗トリプシンの活性のあるプロテイン調整への応用 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS60500648A (ja) |
FR (1) | FR2539758B1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60186290A (ja) * | 1983-08-10 | 1985-09-21 | チモ−ジエネテイツクス インコ−ポレ−テツド | アルフア−1−アンチトリプシンを細菌に表現させる方法 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
FR1431678A (fr) * | 1963-06-12 | 1966-03-18 | Behringwerke Ag | Procédé pour l'isolement de l'alpha1-antitrypsine |
US4338397A (en) * | 1980-04-11 | 1982-07-06 | President And Fellows Of Harvard College | Mature protein synthesis |
DK171301B1 (da) * | 1980-06-06 | 1996-08-26 | Biogen Inc | Plasmid-vektorer, fremgangsmåde til fremstilling deraf samt fremgangsmåde til fremstilling af polypeptid |
-
1983
- 1983-01-21 FR FR8300909A patent/FR2539758B1/fr not_active Expired
-
1984
- 1984-01-20 JP JP50058484A patent/JPS60500648A/ja active Pending
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS60186290A (ja) * | 1983-08-10 | 1985-09-21 | チモ−ジエネテイツクス インコ−ポレ−テツド | アルフア−1−アンチトリプシンを細菌に表現させる方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FR2539758B1 (fr) | 1985-11-15 |
FR2539758A1 (fr) | 1984-07-27 |
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