JPS60500648A - 新規の表現ベクタ−及びそれらのヒトのα↓１抗トリプシンの活性のあるプロテイン調整への応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規の表現ベクター及びそれらのヒトのα１抗トこの発明はとくに新規のクロ／ ベクター及び表現ベクター、これらのベクターによって形質転換した細菌及びそ れらのヒトのα、抗トリブ／ン活性のあるプロディンの調製のだめの応用に関す る。

α、抗トリブ／ンはヒトの血清中のα１グロブリンの９０％を代表する血清グリ コプロティンである。正常な血清中には１３０乃至１５０〜７ｄｌの濃度で存在 している。

分子量が４７−５２０００ダルトンの単純なポリペプチド鎖であり、その１０乃 至１５重量係が炭水化物の側鎖である。ヒトのα１抗トリプシンにはいくつかの 変形が公知であり、これらの多形の大部分はそれぞれ単一のアミノ酸置換に由来 すると思われる。抗α、−１・ｌＪプ／ンは主に肝臓において合成される。

α１抗トリプシンの機能（ｒｉ抗プロテアーゼのものである。これが多数の変形 のプロテアーゼと結合してそれらを、とくにトリゾ７）、トロンビン、キモトリ プシン及びプラスミンを不活性とする。

しかしその本質的な機能は、中性好性エラスターゼを阻害することであり、後者 は組織プロティ／の大部分とくに結合組織の構成部分を分解させる性能の幅広い スペクトルのあるプロテアーゼである。

循環する血清プロティンであるけれども、α１抗トリプ／ンは脈管外エラスター ゼ阻害剤として極めて重要である。このことは本質的にはその大きさが小さく、 より粗大な血清抗エラスターゼ・α２−マクログロブリンと違って組織の大部分 を貫いて拡散し得ることによる。

こうしてα１抗トリプシンのほぼ４４係が脈管外にあり、α１抗トリプ／ンによ って保護される最重要な器官は肺である。

α１抗トリプ／ンの不足は、プロテアーゼ／抗プロテアーゼの不均衡を惹起こす ことがあり、前記の理由から臨床上張も重要な結果は肺のレベルに現われる。

これらの器官中においては実際に、過剰のエラスターゼ活性が高頻度で気腫など の肺を損なう病気へ導く。

最もよく知られだα１抗トリプ／ン不足のケースは、若干の変形のα１抗トリプ シン表現型が、血清α１抗ｌ・リプンンの著しい不足と結ひついている遺伝的障 害によるものである。最もよく研究された変形、Ｚ型はアミノ酸置換（す／ンが プロティンの末端炭素から５３の位置のグルタミン酸に代る）である。この変化 がα１抗トリプシン分子のグリコ／ル化の重要性に影響を及ぼし、このことが分 子分泌欠如、肝細胞内の蓄積及び対照のものの１０乃至１５係を示す血清中α１ 抗トリプシン含有量へ導く。この欠陥は４０乃至５０歳の人びとの気腫の進行と 、寸だそれより頻度は低いが肝臓障害と関連している。対立遺伝子Ｚは米国なら びに欧州のコーカサス系住民の間で］／３０００乃至１／４０００の頻度である 。これは米国における同型接合体ＺＺ　５００００にほぼ相当する。その米国に おいて８００人のうちのほぼ１人が正常なものの３５チにしかすぎない血清中α １抗トリプンン含有量と結びついた表現型ＳＺを呈する。この含有量は多分プロ テアーゼ／抗プロテアーゼ不均衡による肺のレベルでの破壊進行に相当する開側 であり、米国の罹患者の数は２５００００のオーダである。欧州における頻度は ほぼ同じオーダである（文献１乃至３）。

官能的なα、抗トリプシンの含有量を下げる因子はすべて、プロテアーゼ／抗ブ ロテアーゼ不均衡へ導き、それによって肺の傷害への傾向があることは明かであ る。今ではこの種の障害が紙巻煙草で喫煙する人びとに現われ、紙巻煙草の煙が 非遺伝性の気腫の原因と見なされる大きな因子の一つであることは確証されてい る。同時に、紙巻煙草の煙の成分がエラスターゼ阻害の部位に近くにおいてメチ オニン残渣を酸化させて官能的にα１抗トリプシンを阻害できること（文献４） 及びα、抗トリプンンの官能活性が喫煙者の肺内では少なくとも２倍低減される こと（文献５）も立証された。

喫煙者は血清のα１抗トリプシンの低下を示さず、この不足は肺内に局限されて おり、それは紙巻煙草の煙の直接作用によることに留意するのは興味がある。

紙巻煙草の煙が肺内の中性好性エラスターゼの含有量を高くし、こうして肺の一 蛋白質加水分解負担を増大させ肺はα、抗ドリブン／の不活性化を考慮に入れて 、より少なく保護されるようになることもあり得るのは極めて確からしい。

他のさまざ捷な病理状態が血清のα１抗トリプノン含有量低下と結びついている 可能性があり、最も重要なものはとくに新生児及−び成人における急性呼吸器系 障害症候群、リューマチ２、関節炎、ステロイド依存の喘息及び多分嚢胞性繊維 症（文献Ｉ）である。

臨床の面に現われ得るプロテアーゼ／抗プロテアｉゼ不均衡（文献６）はすべて 置換治療によって処理できるに違いないことは明かである。

この技法の初期の取組み方は遺伝性欠如のある人びとの正常な血清から調製した ヒトのα、抗トリブ／ンの静脈注入を行なうことにあった（同型接合体２２　） 。

これら初期の研究の結果は、血清のα１抗トリプ／ン含有量は７０■／ｄｉを超 える値すなわち肺の抗エラスターゼ保護を保証するのに十分なレベルに維持でき ることを示しだ。α１抗トリプノン欠如はすべてこうして治療的に取組みできる ことは明かである。

この種の型の治療のためには大量の極めて純粋なヒトのα、ＡＴを用意する必要 がある。しかし血清からのα、ＡＴの抽出は天然媒体から抽出したプロティンの 精製の問題に遭遇し、また基質としての血清の使用に関する問題、主として汚染 の問題にも遭遇する。

これらさ捷ざまな問題は以下に示すとおり細菌醗酵によって得られる材料を用い て解決することができる。

実際に酵素・抗原及びホルモンなどポリペプチドを、これらのポリペプチドにと ってコードとなる遺伝子がクローン化しであるプラスミドなど表現ベクターを合 体する細菌の培養から精製することは公知である。

この明細書の枠内において用いる若干の用語要素を明確にするため遺伝子の表現 を支配する主要な要素を簡潔に思い起こすのがよい。

クローン化された遺伝子が表現され得る、すなわち該遺伝子によってコード化さ れる所望の生成物が細菌によって合成されるためには、用いられるベクターが遺 伝子の表現に関連した若干の特性を呈するのが好都合である。

クローン化した遺伝子の表現には二つの大段階があるニ −１ずベクターのＤＮＡによるコード化された情報のメソセンジャＲＮＡ（ｍＲ ＮＡ）への転写−次にこのｍＲＮＡのリポソームのレベルにあるポリペプチドへ の形質導入 転写の段階は、情報のゝ読取り”を保証する酵素ＲＮＡポリメラーゼの転写を開 始する１プロモーター′と呼ばれるベクターのＤＮＡの部分への固定によって始 まる。

この固定はさまざまな型の制御を受ける。とくに−ＲＮＡポリメラーゼ（でよる 転写は゛リプレッサー″と呼ばれるプロティンの固定によって抑制さね得、その リプレッサーはプロモーター（負の対照）の近くにある・オペレーター″と呼ば れる配列−ヒに固定される。

ＲＮＡポリメラーゼが転写を開始てきるのはリプレッサーが不活性化されている ときのみである。

リプレッサーの不活性化又は誘導は、リプレッサーに作用する物質によるなり、 他の手段、熱などによるなりして行なわれる。

一旦ＤＮＡがＲＩＪＡポリメラーゼを介してｍＲＮＡに転写を行なうと、ｍＲＮ Ａはりボノームのレベルでポリペプチド鎖へ形質導入される。

この形質導入が行なわれ得るためにはｍ　ＲＮ　Ａにリポソームの固定域及び形 質導入開始の部位がわかっていることを要する。ベクターのＤＮＡは以下に気形 質導入開始域′と呼ばれる対応の配列がなくてはならない。

先にあげた要素が、クローン化した遺伝子の表現のために必要であると表現のベ クターは寸だ別の重要な特性も保有する。実際に若干の細菌細胞いわゆる３宿主 細胞′において写しをとらせ複製し、それによってクローン化した遺伝子の゛コ ピー“の数を増すことができる。このことが遺伝子の表現される多くの場合にお いてプロティンの増加産生へ導く。

最後に表現のベクターは、とくにそれがプラスミドであるとき、一般にさまざま な抗生物質に対する耐性にとってコートとなる遺伝子があシ、この型の耐性は形 質変換細菌の株の選択を可能にする゛標識“とじて用いられる。

表現ベクターのその他の有用な要素は以下の記述中において説明する。

この発明はグラム陰性の細菌とくに大腸菌の株中のプロティン及び／又はペプチ ドの改良された産生を可能にする新規のクローン化の及び表現のベクターに関す る。

とぐにグラム陰性細菌中の特定の遺伝子のクローン化及び表現ベクターであって 一細菌プラスミド複製の原型 一ハクテリオファージλのプロモータ’ＰＬ、ＰＲ又はＰ′Ｒ −翻訳開始のためのコート化域 一独特の制限部位（複数）を包含しているクローン化域 を包含していることを特徴とするものに関する。

先に示したとおり、プラスミド複製原型の存在は対応の細菌細胞内のベクター複 製を可能にするため重要である。とくに大腸菌の場合優先的にプラスミド、ＢＲ ３２２の複製原型が用いられる。実際にプラスミドｐＢＲ３２２は多数のコピー を与え、こうして所望のプロティンを産生ずるプラスミドの量を増大させる利点 がある。

もち、ろん他の複製原型とくに何らかの耐性因子にとってコートとなるプラスミ ドのもの又はコリジノ産生性エピノーム（すなわち細菌にコリシンを合成する能 力を付与する）のものを使用することは可能である。

しかし複製が僕めて厳しく制御されることのない、捷たクローン化域外において 望ましくない制限の部位を示さないプラスミドを選ぶのがよろしい。

パクリテリオファー／λのプロモーターのうち記号λＰＬの左の主要プロモータ ーが優先的に用いられることになる。九はλの早熟な転写に責任のある強力なプ ロモーターである。以前の発表はすてにＰｏ、の制御下でクローン化した遺伝子 の高水準における表現を当てにした（文献８及び９）。

でた他のバクテリ万ファージλのプロモーター、トくに右のプロモーターＰＰ又 は第２の右のプロモーター　ｐ′Ｆを用いることも可能である。

極めてさまざまな翻訳開始配列の使用が可能であるけれどもバタテリオファー／ ２のプロティンｃＩＩＯもの以下スｃ工工ｒｂＳと称するものを用いるのが望ま しい。

上に説明したとおりの理由がら域λｃＩＩｒｂｓの使用がとくに有利であるにし ても、それにも拘わらず他の翻訳開始配列をとくに有用な制限部位によって限定 されている遺伝子λＥのもの、また Ｒ１，７Ｃ０ＡＴ　（ＥＣＴＣＡＡＣＣＧＧＧＧＴＴＴＧＡＡＧＣＡＴＧＧＣＴ ＴＣＴＡＡＯＴＴＴＬ　Ｉ　ＴＧＧＧＣＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＡＧＧＡＣＴＡＡ ＧＡＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＡＧＣＧＣＡＴＣＣＧＣＩＩ　ＡＴＴ ＧＴＴＡＴＣＴＡＡＧＧＡＡＡＴＡＣＴＴＡＣ：ＡＴＡＴＧＧＴＴ　ＧＧＴＣ， ＣＡＡＡＣＡＡＡＣＧＣＡＡＣ（、ＡＧＯＭＰ　Ａ　ＡＴＡＣＡＧＴＡＡＣＴＣ ＡＣＡＧＧＧＧＣＴＣＧＡＴＴＧＡＴＴＡＴＧＴＡＣＡＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＴ ＧＣＡＣＡＴＬＡＭ−Ｄ　ＴＧＡＡＣＡＣＡＣＣＡＧＴＣＴＡＡＧＧＧＡＴＧＴ ＴＴＡＴＧＡＣＧＡＧＣＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＴＴＡＣＣ；ＧＡＴＴのものも用 いることかできる。

若干の場合には合成開始の配列とくに が用いられる。

この開始の配列は、／ヤインータ゛ルガルノ（Ｓ／Ｄ　）の配列ＡＧＣＡＡ及び Ｉ４の読みとりを停止する翻訳終了コドンＴＡＡを包含しており、後者の有用性 については後述する。

翻訳開始のだめのコート化域λｃＩＩｒｂｓは次の理由からとくに有用である。

ピ）プロティ／ｃＩＩがプロモーターＰ、の制御の下に大量に合成されることが 示された。

２°）問題の域は制限部位によって限られておりこれらが該域の容易な分離を可 能にする。

３°）制限酵素Ｎ　ｄ　ｅ　Ｉが翻訳開始コドンを沙いかくす。

これらの条件において開始コドンＡ、ＴＧの再構成を伴なうその部位への異物遺 伝子の挿入は、非融合プロディンすなわち初めのメチオニンを除いて調製すべき プロティンに無関係のアミノ酸を含んでいないものの表現を可能にする。

これに反してλｃＩＩｒｂｓの下流の独特の制限部位の一つにおける異物遺伝子 のクローン化は、後述のとおり融合したプロティンの表現へ導く。

必要に応じて融合した、又は融合してないプロティンを作り得ることは有利であ る。

融合したプロティンは一般に問題のプロティンのほかにベクターの遺伝子表現か ら、又はベクターのさ１ざまな要素の若干の結合要素から由来する部分を含んで いる。

従ってこれは問題のプロティン部分を遊離させるだめ後で表現されたプロティン の分割を必要とする。しかし若干の場合には融合したプロティンを***させるこ とが可能である。

これに反して融合してないプロティンの場合には分分割を準備する必要はないが 、プロティンは一般に***されず、従って細菌加水・分解生成物から分離しなく てはならない。

最後に若干の場合には融合してないプロティンは細胞内において安定でないが、 融合したプロティンは安定である。

従ってそ才ｔそれの場合シて利点と不都合とを検討するのかよく、二つの型のプ ロティンの表現を可能にし得る多価ベクターを準備するのが重要である。

独特の制限部位を包含しているクローン化域は融合した（又は融合してない）プ ロティン産生のため異物遺伝子の挿入を可能にする。これら独特の制限部位を包 含しているクローン化域はプロモーターＰ１．の捷たｃＩＩの翻訳開始域の下流 に位置している。

この域に優先的に現われる独特の挿入部位のうち、通常用いられる制限酵素に対 応するＥｃｏＲｌ、５ａｌＩ、ＡｃｃＩ。

ＢａｍＨｌ、’ＨｉｎｄＩＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ及びＰｓｔＩをあげることができ る。翻訳開始コドン４０−５０塩基対下流に位置しているこの種の部位における 特殊なプロティンにとってコードとなる遺伝子の挿入は、ｃＩＩから導かれる細 菌アミノ酸のｒ４末端に融合した異物プロティンの合成へ導く。

問題のベクターはそのほか、望ましくはたとえばλの遺伝子Ｎ、記号λＮ、によ ってコード化される抗転写終結官能を包含する。遺伝子Ｎの転写生成物の存在に おいては、Ｐ、、からの転写は停止信号（複数）の大部分より前に行なわれる。

このことはクローン化された異物遺伝子がこの種の停止信号を呈するとき生じる ことのある転写の過早停止によってもたらされる諸問題を遠ざける。そのほかプ ロモーターが九でもＰＩｌでもなく、たとえばＰ′Ｒであるときは抗転写終結官 能は異なっていることがある。

Ｐ−はバクテリオファージλの後期遺伝子の転写に責任がある。後期遺伝子の表 現はプロティンＮ（文献１１）と類似の抗転写終結因子として作用することが示 された遺伝子Ｑ（文献１０）の生成物により正に制御される。

Ｑけこうして末端の後期遺伝子の域の転写を可能１（シてＰ；へ伝えられたλ構 成成分のＲＮＡ　６３について終結に作用する。Ｑの表現はそれ自体ＰＲによっ て制御され、Ｐｎ　’ｄ　ＰＩト同様にリプレッサーｃＩによって調節されろ。

この相互作用の断続は表現のプラスミド上に再構築され得、ＰＬについてと同様 に使用できる。

大量の異物プロティンの連続産生の場合における宿主ベクター系の毒性及び不安 定性の問題を避けるためにはプロモーターに誘導可能、とくに熱的に誘導可能の 表現系を全部又は一部付加してプロモーターの活性制御を設ける必要がある。

望捷しくに異物プロティン合成の熱による制御が転写のレベルにおいて、宿主細 菌たとえば２８℃においてＰ１４の活性を抑制するが４２°Ｃにおいて不活性と なるｃ１８５７中のコート化された感熱性リプレッサーによって行なわれる。こ のリプレッサーはプロモーターＰＬに隣接しているオペレーター咀に作用する。

先行のケース（ておいては熱的誘導可能の表現系の一部が宿主細菌に不可欠のも のであるけれども、この系がベクター自体に属するように準備することは可能で ある。

問題のベクター（、′ｉ捷だ抗生物質たとえばｐＢＲ３２２の場合アンビンリン に耐性の遺伝子も包含することができるが、他の遺伝子であってテトラサイクリ ン（Ｔｅｔｒ）又ハクロラムフユニコール（Ｃｍｒ）に耐性のものも使用できる 。

この種の標識の合体はクローン化実験中にこの発明によりプラスミドの形質転換 担体を含んでいる細菌の選択のために必要である。

耐性の遺伝子の合体は醗酵の際に選択の圧を加えてプラスミドの安定外を増大さ せることを可能にし、そのほか形質転換体の分離を容易にする。

クロー／化のためにはプラスミド中の異物ＤＮＡ挿入を検出するのを可能にする 系を負わせるのが有利である。

例としてクローン化域に大腸菌（ｌａｃｚ’）のβ　ガラクトシダーゼの末端ｌ くフラグメントを、λｃ　Ｔ、　Ｉから導かれた翻訳開始域と融合させて設ける ことが可能であり、これがαフラグメントの翻訳をｃＩＩの配列の制御下に置く 。

α−フラグメントは宿主中のコート化された末端Ｃωフラグメントの表現によっ て相補され、これが細胞内のβ−ガラクトノダーゼ活性へ導く。このβ−カラク ト／ダーゼ活性が青色コロニーから発色団基質の存在において５−ブロム−４− クロル−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクト／ダーゼを生じる。

２８℃においてはプロモーター九は不活性であり、α−フラグメントは合成され ずコロニーは白色の寸まである。温度が４２°Ｃにもたらされるとプロモーター 九が活性化されα　フラグメン１が合成され、コロニーが青色に変る。

この検出系中に位置しているクローン化部位内への異物ＤＮＡの挿入はβ−ガラ クト／ダーゼの合成を妨げ、従って２８℃においてモ４２°Ｃにおいても白色コ ロニーへ導く。

また１ａｃｚ’遺伝子を他の　検出を可能にする遺伝子によって置換することも 可能である。

この発明はまた特殊なプロティンについて、とくに融合した又は融合してない状 態において調製されたヒトのα１抗トリプシンにとってコートとなる遺伝子なら びに対応のプラスミドのクローン化及び表現を可能にする方法にも関する。

こうしてこの発明は、特定のプロティンについてコート化する遺伝子の融合した 形の該プロティンの調製を可能にするクローン化及び表現の方法であって、前述 したような、その内に翻訳開始コドンが再構成されるベクターの翻訳開始コドン を被う制限部位において遺伝子がクローン化されることを特徴とするものに関す る。

この発明はそのほか特定のプロティンにとってコートとなる遺伝子の融合した形 の該遺伝子の調製を可能にするクローン化の方法であって前述したような翻訳開 始配列の下流にあるベクターのクローン化域において遺伝子がクローン化される ことを特徴とするものに関する。

この発明はまだ、これらの方法を用いて得られるベクターならびに上記のさまざ まなベクターによって形質転換された細菌とくにグラム陰性の細菌またとくにこ の発明は最後（・で、こうして形質転換した株の醗酵によって調製された生成物 に関する。

最後にこの発明はベクター、とくにヒトのα、抗トリプシンについてコード化す る配列の全部又は一部を含んでいるプラスミド、またとくに−ヒ述のようなベク ターに関する。α１抗トリブ／）についてコート化する配列を含んでいるプラス ミドのうちｐＴｃ　９２２プラスミドをあげるのがよく、その調製は実施例に記 載しである。

しかしｐＴＣ９２２を用いて調製したヒトのα１抗トリプンンの活性を有するプ ロティンはα１抗トリプンン・プロティンのＮ−末端に融合したアミノ酸の配列 を包含している。この種の生成物の注入は若干の場合において被術者の免疫反応 を惹起こすことがある。

この不都合を避けるためには細菌内において、ヒトのα１抗トリプ／ンの融合し てない天然の遺伝子を表現し得るのが有利である。

そのようにするため、この発明のベクターにおいては望ましくはヒトのα１抗ト リプ／ンにとってコードとなる遺伝子の翻訳開始コドンに隣接し２て下記の構造 −ＣＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＴＣＧＣＣＡＴＧ　−−ＧＴＡＴＡＣＣＴＣＣＴＡ（ 、ＣＧＧＴＣＣ−−を翻訳開始コドンが遺伝子の翻訳のだめ同位相にあるように 設ける。

融合してないα１抗トリプ／ンの調製を可能ｔＬ′ｃするィ／の調製・＼プラス ミドを導（ｐＴＣＱ２２プラスミドの修飾によって作ることができる。

第１１図に図示しであるとおり、ｐＴＧ９２２　ｉ融合しであるα１抗トリブ／ ）の遺伝子のｃＩＩ配列のｌく末端にとってコートとなるヌクレオチドは独特の 制限部位Ｎｃｊｅｌ及びＢａｍＨＩによって連結しである。

これらで、つの部位の間に位置しているＤ　Ｎ　ＡをＮ　ｄ　ｅ　１及びシュ肘 を備えているプラスミドの分割によって排除し１、次にプラスミドの延長に戻し て、翻訳開始コドンがα、抗Ｉ・リブノンにとってコートとなる配列の初めに直 接に同位相に融合しであるようにする。

こ０）延長へＪ）戻しは ａ）慰丑及び墜坦部位の融合 ｂ）開始コドンの再構成、及び Ｃ）グルタミン酸：ことってコートとなるコドンをｐＴＧ９２２Ｃ’ｒ’）構成 （・−あ・いて欠けている成熟プロティンのトＩ末端（、・こ付加すること を可能にする合成Ｌｙ）アダプター・オリコヌクレオチド今用いて丙られる。

他のブラスミｔ−けとくに、ｐＴｃｑ２９内に翻訳開始の配列 ＴＣＧＡＴＡＡＣＡＣＡ　ＧＧＡＡＣＡＧＡＴＣＴ　ＡＴＧを用いて使用された 。

こう（２てｐＴＧ９５６ブラスミトが得られる。

このブラスミｌ−はα−ＡＴの増加した合成を丙ることを可能（でするが、収量 は比較的小さいま芥である。プロティンの大量の合成へ導くことのできるリポソ ームの二つの固定部位はそれらが、α−ＡＴの遺伝子に連結しであるとき翻訳開 始を可能にしない事実はα−ＡＴの遺伝子自体の若干の特徴がその表現を制限す ることを示すよう（Ｃ見える。

これかα−ＡＴの遺伝二ｆ−の初めを下記のように修飾しプて理由である。

もとの配列　プロティン　ｍｅｔ　ｇｌｕ　ａ、ｓｐ　ｐｒｏ　ｇｌｕ　ｇｌｙ 　ａｓｐ　ａｌａＤＮＡ　ＡＴＣＣＡＧ　ＣＡＴ　ＣＣＣＧＡＧ　Ｃ，Ｃ，Ａ　 Ｃ，ＡＴ　ＧＣＴ変更後の配列　プロティン　ｍｅｔ　ｇｌｕ　ａｓｐ　ｐｒｏ 　ｇｌｕ　ｇｌｙ　ａｓｐ　ａｌａこうしてｐＴＣ；９５６から、遥かに大量の α−ＡＴを生じるｐＴＧ９３３プラスミドが作られる。

この発明はまた形質転換した細菌及びこれらの細菌の醗酵（ｌζよってず与られ 石、す、下に２・いて゛細菌起源のヒトのα１抗ドリブン／〃と呼称する生成物 にも関する。

融合した又は融合してない状態において調製されたヒトのα１抗トリプ／ンにつ いて、ならびに対応のプラスミドについてである。

こうしてこの発明は特定のプロティンにとってコートとなる遺伝子の、融合した 形の該プロティンの調製を可能にする、クローン化及び表現の方法てあって前述 したような、その内に翻訳開始コドンが再構成さね。

るベクターの翻訳開始コト／を被う制限部位において遺伝子がクローン化される ことを特徴とするものに関する。

この発明はそのほか特定のプロティンにとってコードとなる遺伝子の、融合した 形の該遺伝子の調製を可能にする、クローン化の方法であって前述したような翻 訳開始配列の下流にあるベクターのクローン化域において遺伝子がクローン化さ れることを特徴とするものに関する。

この発明はまだ、これらの方法を用いて得られるベクターならびに上記のさ寸ざ まなベクターによって形質転換された細菌、とくにグラム陰性の細菌まだとくに 大腸菌にも関する。

この発明は最後にこうして形質転換した株の醗酵によって調製された生成物：て も関するっ最後にこの発明は、ベクターとく、・でヒトのα、抗トリプンノにつ いてコート化する配列の全部又は一部を含んでいるプラスミド、またとくに上述 のようなベクターならひに形質転換した細菌及びこれらの細菌の醗酵によって当 ・られる、以下において゛細菌起源のヒトα１抗トリブ／′ン″と呼称する生成 物に関する。

この生成物はヒトの血清のα１抗トリブ／ンとは異なる構造を呈することがある が、それにも拘わらず血清のα、抗トリフ／ンｉｃ比へて同じ生体内活性を、と く（／ζ同じ抗エラスターゼ活性又は同価の活性を呈することを理解すべきであ るっ 細菌起源のヒトのα１抗トリフ／ンとは寸だ、醗酵によって得られるが引続いて 化学的又は生物学的に修飾した細菌起源の生成物も示すものと解する。

この発明は最後にα１抗トリプ７ンの不足（ｌこよって惹起こされるヒトの病気 の処置及び７７′又は予防のだめの医薬としての細菌起源のヒトのα１抗トリフ ／ノの使用に関する。この発明によるα１抗トリプシンによって処置又は予防で きる病気のうち、遺伝性障害による先天性α１抗トリプ／ノ不足てあってとくに 気腫によって表現されるものをあげねばならない。また急性呼吸器系障害の若干 の症候群とくに新生児及び成人におけるもの、ならびにリューマチ様関節炎、ス テロイド依存の喘息及び嚢胞性繊維症も処置可能である。こ　′の医薬にてだ紙 煙茸の喫煙者にお・ける若干のα１抗トリブ／ン不尽を治療するのひて使用する こともてきる。

細菌起源のヒトのα１抗トリプシノは何れの経路によっても投与できるが非経口 の経路が、思うに、最も満足なものである。しかじ紙煙革の煙による欠陥の場合 は吸入による肺へ直接の導入もまた棲めて効果的である。

α、抗トリプンンの日日の使用薬量は処置の性質、予防的か治療的か、ならびに 処置すべき欠陥の程度によって左右される。これらの用薬量は血清中の、又はを 維持するため適応させることができる。

対応の医薬組成物もまた投与経路に適応させてあり制御された解放に、とくに循 環系内に有効成分を徐々に解放する移植組織片の形で向けておくことができる。

この発明は、もちろん他の面、とく疋実施例に記載する若干のプラスミドならび にそれらの変異体及び誘導体また一般的に形質転換した細菌の醗酵法ならびにこ れらの醗酵の生成物を包含する。

この発明のその他の特徴及び利点は下記の実施例及び添付図面の読みとりからよ りよく理解される。図面第１図はｐＴ０９０７プラスミドの調製を可能にする岐 器を、 第２図はＭＩ３ｔｇ９］０ファージの調製を可能にする岐器を、 第３図はＭ１３ｔｇ９１０ファージの構造を、第４図はｐＴＧ９０８プラスミド の調製を可能にする岐器を、 第５図はヒトの肝臓の全ＲＮＡの翻訳生成物に相当する免疫沈澱物を、 第６図はα、抗抗トリプシンついてコート化するヒトのｃＤＮＡ全体のクローン の分離されだノ゛ンテを、第７図はα１抗トリブ／／のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのクロー ンの部分配列を公表された配列として、 第８図はｐＴＧ９２０プラスミドの調製を可能にする岐器を、 第９図（はα１抗トリプノ／のヒトの遺伝子を備えているプラスミドにより形質 転換した大腸菌によって合成されたプロティンのゲルの分析を、 第１０図は大腸菌から調製されたα１抗トリプノノの生物学的活性を、 第１１図はｐＴ（，９２９プラスミドの調製を可能にする岐器を、 第１２図はｐＴＧ９５６ブラスミドの調製を可能にする岐器を、 第１３図は抗血清拭α、ＡＴで標識した培養の免疫沈澱物を、 第１４図は抗エラスターゼ試験を表わす説明図である。

この発明の枠内て用いられる細菌株は下記のものでｇａｌ　Δ８ｐｒｏＣ：　ｔ ｕｌｏ　ｌａｃΔｍ］５（λｃ工８５７ΔＢａｍΔＨＩ）・Ｊｍ１０３　、次の 特性を備えている大腸菌であるΔ（ｌａｃ−ｐｒＯ）Ｓｕｐ　ｔｈｉ　ｅｎｄＡ 　５ｂｃＢ１５　’５ｔｔＡ　ｒＫ　ｎＫ　／Ｆ’　ｔｒａＤ３６　ｐｒｏＡＢ 　１ａｃ１１ａｃＺΔｍ１５゜前述の株は利用可能であるから、用いられている か若干の重要な特性のある限り他の株も使用可能であるのはもちろんである。そ れらについては詳細な記述中において再度言及する。

ｂ）　Ｄ嬰ρ！−鼾 プラスミド又はＭ１３ファージのＤＮＡの微量調製は、ｌ５ｈ−Ｈｏ］、ｏｗｉ ｔｚ　（文献１２）の記述しているもののように行なわれるが、唯一つ使用前に ＤＮＡを２回目にエタノールを用いて沈澱させることが異なっている。

大量調製は前記の出版物に記載のもののように行なわれ、ＣｓＣ１／臭化エチジ ウム密度勾配法による補足的精製を行なう゛。

Ｃ）クローン化技法 制限酵素を用いてのＤＮＡの処理は、別段の指示がない限り製造者（Ｎｅｗ　Ｅ ｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ−ａｒｃｈ　Ｌａ ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）の示す 条件を適用して行なわれる。

必要のときは５′末端の燐酸塩を細菌アルカリホスファターゼなり仔牛の腸のホ スファターゼなりを３０分間３７℃において制限酵素緩衝溶液中Ｇでおいて用い て排除する。

フレノウ・ポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて の付着端修理は、ｐＨ７，８のトリスＨＣＩ　５０ｍＭｏｌ。

ＭｇＣ１２５ｍＭｏｌ　、β−メルカプトエタノールｌ　ＯｍＭｏｌ　、　６［ ＴＰｓＯ，４ｍＭｏ］の混合物中で酵素及びＤＮＡ　１０乃至２００　ｐ　ｇ／ ｍｅを用いて２５°Ｃにおいて１５分間行なわれる。

ヌクレアーゼＳ、　（Ｍｉｌｅｓ）はＮａＣ１Ｏ，３Ｍｏ１．Ｎａ０Ａｃ　０． ０：うＭｏｌ　、　ｐＨ４，８、ＺｎＣ１゜０．００３Ｍｏｌの媒体中２５℃に おいて３０分間ＤＮＡμｇに対して２ｕ用いられる。

Ｂａ１３］はＰａｎａｙｏｔａｔｏｓほか（文献１３）の方法に従って用いられ る。連結反応は１５”Ｃ（別段の温度指示のない限り）において４乃至２４時間 、ＤＮＡ　Ｔ４１Ｊガーゼ（Ｂｏｅｈｌｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　を　 ＮａＣ１ｌｏｏｍＭｏｌ　、ト　リ　ヌ、ＨＣＩ６６ｍＭｏ１．ｐＨ７，５，Ｍ ｇＣｌ２］ＯｍＭｏ１．スペルミノ７０．５ｍ１ＪＯ１゜ＥＤＴＡ　Ｏ，２ｍＭ ｏ１．ＤＴＴ　０．２ｍＭｏ１．、ＡＴＰ　ｌｍＭｏ１．ＢＳＡ　Ｏ］ｍｑ／ｍ ｅ及びＤＮＡ　５乃至５０μｇ　／ｍｔとともに用いて行なわれる。

付着端結合のだめにけリガーセ約３００ｕ／ｍ／を用いる。

プラント末端結合のためにはりガーゼ約１．ＯＯｕ／ｍｒを用いる。

さまざまな酵素反応の中でＤＮＡ試料をフェノール／クロロホルム混合物を用い て抽出し、エタノールで沈澱させる。必要なときは大腸菌又は酵母菌のｔＲＮＡ をエントレーナー（発動子・同調子）として用いる。分子アダプター（Ｃｏｌｌ ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅ−ａｒｃ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）は 事前雑種形成してあり、４℃において１５時間の間Ｔ４リガーゼ１００ｕ／ｍｌ ：を用いる前記緩衝液条件を適用してのＤＮＡプラント末端のために、１０乃至 ５０倍のモル過剰て使用されるホスホリル化してないアダプターを用いるときは 結合の直後に未反応のアダプターをスペルミノ・テトラヒドロクロリドを用いて 沈澱させる（　Ｈｏｏｐｅｓ　はか〜文献１４）。

ホスホリル化しだアタ゛ブタ−を用いるときは結合混合物は、捷ずフェノール／ クロロホルム混合物を用いて抽出し、次にエタノールで沈澱させた後に適宜な制 限酵素を用いて特異性切断を行ない、次にスペルミンテトラヒドロクロリドを用 いて沈澱させる。

適性の細菌細胞は調製し、次にプラスミドを用いて形質転換し、又はＤａｇｅｒ ｔ及びＥｈｒｌｉｃｈ　（文献１５）の記述している方法ニ従ってＭ１３のＤＮ Ａによりトランス次に記述される当発明に従うベクター合成の実施例は、勿論、 限定的なものではなく、異なる様式で実施することにより、尚発明の枠内に入る ベクターを得ることは可能である。

当発明（Ｃ従うベクターの製造には、先ず第一に、次のものを含むプラスミドの 製造が含まれるニー　ｐＢＲ３２２の複製起源、 −このブラスミ［のアノビンリン抵抗性遺伝子ａｍｐ、−プロモーターＰＬおよ び遺伝子λＮ、さらに、この合成の際には、唯一の制限サイトが、より遅い時期 に得られるようにするだめに、不都合な制限サイトを消失させるよう努力がなさ れなければならない。

］）　ｐＢＲ３２２内のＰｓｔサイトの除去使用される基礎プラスミドは、プラ スミドｐＢＲ３２２である。しかしながら、これは遺伝子ａｍｐ内に制限サイト ＰｓｔＩを有するという点で不都合でろる。なぜならば、同一の性質のサイトが 、のちにクローニング領域において、唯一の制限サイトとして用いられるからで ある。従って、プラスミドｐＢｆ１３２２の突然変異体であるプラスミドｐｕｃ ｓ−このプラスミドにおいては、アンビンリン抵抗性遺伝子は制限サイ）　Ｐｓ ｔＩを示さない（このサイトは、試験管内で突然変異によって除去された）−を 用いて、この制限サイトを消失させる方が好都合である。ｐＢＲ３２２は、特に ベテスダ・リサーチ・ラボラドリース社により商品化されている。ｐＵＣ８は、 文献１６の論文において記述されている。

これを行うために、ｐＢＲ３２２の１６６９ｂｐのＰｖｕＩ／ＰｖｕＩＩ断片が 、プラスミドｐｕｃｓのＰｖｕＩ／ＰｖｕＩＩ断片と交換される。この交換を実 現するだめに、プラスミドｐＢＲ３２２およびプラスミドｐＵＣ８は、順次Ｐｖ ｕＩ、ＰｖｕＩＩによって処理され、次にリガーゼの切断によって環状にされる 。

このようにして、最早制限サイ）　ＰｓｔＩを示さず。

最初はｐＢＲ３２２上に存在した制限サイ）　Ｎ６ｅＩ　（図２には示されてい ない）をも失ったプラスミドｐＴｃ９０２が、得られる。プラスミドｐＴＧ９０ ２は、さらに、１ａｃｉシーケンス（配列）−このうちにＰｖｕＩＩが存在する ー−−に対応する５０ｂｐの断片を有する。

２）プロモーターＰＬおよび遺伝子λＮの挿入ならひプロモーターＰＬおよび遺 伝子λＮは、ｐＴＧ９０２に挿入するためにグラスミドｐＫｃ３０から分離され る。採取された分節ｆｌｊ、オペレーターＯＬも含まれている。試験ノ部で記述 されるように、このオペレーター咀に、熱感受性レプレッサーＣｌ８５０が作用 を及ぼす。さらに、この方法は、その後のλｃＩＩｒｂｓの挿入を可能にするだ めに、遺伝子Ｎの下方に唯一のサイ）　ＢａｍＨＩを保存しながら、サイトＥＣ ０ＲＩおよびＨｉｎｄｌＩＩを除去しうる。

プラスＳ　トｐＫｃ３０　Ｋついては、文献１７に記述が行われている。

ｐＴＧ９０２は、その唯一の制限サイトＥｃｏＲＩにおいて切断され、はみ出た 先端５′は、ヌクレアーゼＳ１処理によって除去される。ＢａｍＨＩによる消化 後に、最大の断片がゲル上で純化される。

プロモーターＰＬおよび遺伝子、ｔ＋ｑを有する断片が、同様にしてｐＫｃ３０ から、そのプラスミドをＰｖｕ工、ヌクレアーゼ＄１、およびＢａｍＨＩにより 順次処理することによって、作られる。それらの断片は、ゲル上で純化されたの ち、リガーゼの作用を受ける。これはＥｃｏＲＩ　／ＰｖｕＩ融合およびＢａｍ 旧サイトの再構成に通じる。

リゲーンヨン（連結）混合物は、３７℃で宿主細胞ＴＧＥ９００の適格細胞の形 質転換に用いられる。この系統には、有害なプロファージλ、λＣｌ８５７ΔＢ ａｍΔＨＩ−−−これはＰＬからの転写の遮断に必要な熱感受性λレプレッサー 、ｃＩ８５７を供給するｍ＝が含まれる。

これは重要である。なぜならば、Ｎの抗末端機能を考慮した場合、Ｎ培地内のＰ Ｌの活性は致死的なものだからである。

制限酵素による分析後、それらのクローンは適正な構造のプラスミドを含有する 。次にそれらは、４２℃の下で生育性の欠如についてテストされる。

得られたプラスミドのうちの一つであるｐＴｃ９０６は、Ｐｖｕ　Ｉ　Ｉ分節に 含まれる制限サイトを削除するだめに、この分節を除去し、さらに末端の２制限 サイトをも、消失さもるように処理される。これを行うために、ｐＴＧ９０６は 順次、５ａＩＩ、ヌクレアーゼＳ、　、ＰｖｕＩＩ　、およびリガーゼによって 処理される。

このようにして、この段階の初めに想起された要素全体を含む−その上に、Ｐｓ ｔ　Ｅｃｏ　Ｈｉｎｃｌ　５ａｌ−Ａｖａ　Ｎｃ＋ｅ　ＰｖｕＩＩ−である〜プ ラスミドｐＴＧ９０７が得られる。このプラスミドの合成は、図１に表現されて 重要な合成の第２期は、λｃＩＩｒｂｓ領域を、ＡｖａＩ／ＴａｇＩ断片の形態 の下で、Ｍ］、３ｔｇ、］１０と名付けられたファージＭ］３内でクローニング された１ａｃｚ’遺伝子の冒頭（β−ガラクトンダー℃のα断片）Ｋ、挿入する ことトー−−すなわち１ａｃｚ′蛋白質産生−を可能にし、その結果として、Ｉ ＰＴＧおよびＸｇａｌの存在の下で、青色斑が得られる。これは、さらに、いわ ゆるノブオキジ法を用いることにより、構成の１色速なシーケンス（配列）をも 可能にする。

実験の部では、ファージＭ１３のさ１さまな誘導体について、言及がなされる。

すでにファージＭ］３ｔｇｌｌＯｆついて言及された。引き続き、下記の構造を 有する同一タイプの他のファージが、利用される。

これらのベクターの構成は、下記の表Ｉに示されている。この表には、出発点の ファージの標準、それを切断する制限酵素の性質、このようにして得られた断片 が受ける特殊な処理、このようにして明らかにされた部位に固定される挿入物の 性質が、記載されている。

ファー７Ｍ１３ｍｐ７は、特にベテスダ・リサーチ・ラボラドリース社によって 商品化されている。

Ｍ１３ｍｐ７０１は、Ｍ１３ｍｐ７から、右側のＰｓｔＩ　／　ＥｃｏＲＩ断片 （ＣＴＧ、ＧＡＧ　−、、、、ＧＡＡ、ＴＴＣ）を、ＣＴＣ；　、　ＣＡＧ　、 　ＣＡＡ　。

ＴＴＣの配列によって置換することにより、得られる。

この構成の原理は、次の図式のうちに表現されている。

ＡＴＧＡＣＣＡＴＴ、Ａ丁ＴＡＯＧＡＡＴＴＣＣにＣＧ　ＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡ ｌ：ＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴｒＧＭ；　１Ｙ：、ＧＣＣＴＡコＧＧＴＡＣＴＡＡＴ ＧＣ；ＴＴＡＡαχおＱｌ；ＴＡＣ，ＧＣＡＧ口Ｃ＝（ｘバ刀ＴＣＧＴＴＡＡＧ ＴＧＡＣα℃ＡＴＣＩＡＣＣＡＴＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＴＣＩＣＣＣＧＣＡＴＣ ＧＡ、ＴＣＣＧＴＣＧｋＣＣＴ３ＣＡＧＣＡＡＴＴＣＡＣπ但ＣＣＴＡＧＴＧＧ ＴＡＣＴＡＡＴＣＣＴｒＡＡＧＧＧＧＣＣＴＡＧ　ＣＴＡＧＧＣＡＧＣＴＧＧＭ ；ＧＴＣＧＴＴＡＡＧＴＧＡＣＣＧＧ↓ ＡＴＧＡ（ｆＡＴ、ＡＴＴＪｔＣＧＡＡＴＴＣＣＧｕＡＴＣＣＯＡＡＣｔｌ；Ｔ ｒＧＧ　ＣＣＡＡＧＣｆ仄１ＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴ ＣＡＧＴＧＧＣＣｉＴＡＧＴＧＧＴＡＣＴＡＡＴＧＣ；ＴＴＡＡＧＧＧＧＣＧＴ ＡＧＧＧＴＴＣＧＡＡＣＣＧＧＴＴＣＣＡＡＣＣＧＴＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧ ＧＴＣｉＧＴＴＡＡＣＴＧＡＣＧンＧ酵素（制限、ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａＤ ＮＡ　＋）プｊ−セ）利用のブロー・コー７Ｌは、供給者の注意書で指示されて いるプロトコールである。［リッカー］　ＨｉｎｄＩＩＩは、５’　ＣＣＡＡＧ ＣＴＴＧ（，３’の７−ケンスの合成第１ノコ゛ヌクレメーチド（米国、０２１ ５４マサチユー七ツノ州、ウオルサムのコラボラテイブ・リサーチＩｎｃ、製） である。

遺伝子ｃｒｏの中心からｃＩＩのため０）コート領域の中・し・にかけて伸びて いるλＨａｅＩＩＩ／Ｓａｕ：ｉ断片を含むプラスミドｐＯＧＩＩ　（文献１８ ）から、ＣＩＩｒｂｓ領域か分離される（　ｃｒｏおよびＣＩＩは、特に）ζク チ１ノオフアージλの溶解素形成の調整に関与する）。

ｐｏｌｌ］からｃＩＩｒｂｓ領域を含む］　８６ｂｐσ）　ＡｖａＩ　／　Ｔａ ｇＩ断片が採取され、その断片は、Ｋｌｅｎｏｗ　；＋’：　’）メラーゼによ って処理される。他方で、ファージＭＩ３ｔｇｌｌＯは、ＢａｍＨＩ　ｖＣより 処理され、次Ｋ　Ｋｌｅｎｏｗ　ｇ　ｌツメラーゼにより処理されたのち、仔牛 のホヌファクーセによる処理を受ける。得られた断片は、Ｔ４リカ゛−セの作用 を受ける。

ｃＩＩｒｂｓ領域を含むｐＯＧ］１断片およびファージＭ１３Ｊ１１０のシーケ ンスの検査により、Ｍ１３ｔｇｌｌＯのＢａｍＨ１部位への、ｃＩＩｒｂｓを含 む断片の挿入が一遺伝子１ａｃＺ・がｃＩＩ遺伝子のＡＵＧからの翻訳のための 位相にあることを考慮すれば一一移された細菌の発酵後の青色斑の獲得に通じ、 また一方で、親株であるＭＩ３ｔｇ１．ＩＯＫ文１青ω斑が採取され、次にミニ 標本の酵素制限分析（・でよってコロニーが選択される７次に、得られた構成が 正１−いことが、シーケンシングによって確認３７ｚる。

このようにして、Ｍ］３ｔｇ９１０　Ｋ由来するクローンが得られる。その全体 的構造は図２の下部に示されている。

詳細な構造は、図３に示されている。

ｃＩｌｂｓ断片の挿入は、上刃にＢａｍＨＩサイトおよびＡｖａＩサイトを再構 成し、下方（てＢａｍＨＩサイトを再構成することか確認される。

ｃＩＩのＡＵＧからの翻訳は、１ａｃＺ′Ｍ白質の末端１１Ｈ２の８アミ、）酸 への、ｃＩＩの末端１３アミノ酸の融合にこの合成の第三段階は、ファージｉＡ １３ｔｇ９１．０のｃＩ工ｒｂｓ／１ａｃＺ′断片を、事前に製造されたｐＴｃ ９０７ベクター・フラスミト上に移すことから成る。

これを行うためには、先ず最初にｃＩＩｒｂｓの一ヒ方のＥｃｏＲエサイト、Ｂ ａｍＨＩサイト、ＡｖａＩサイトを除去し、次（てＢｇｌＩエサイトを挿入する とよい。

これらの条件下で、ｃＩＩｒｂｓ　Ｉ′ｉＢｇｌ工Ｉ−ＢｇユニＪ断片の形態の 下で採取され、ｐＴＧ９０７のλＮ遺伝子およびプロモーターＰＬの上方のＢａ ｍＨＩサイトに、設置されうる。

ファージＭ］３ｔｇ９］、０は、ＥｃｏＲＩによって消化され、次にＢａ１３１ 　Ｋよって処理され、次にＫｌｅｎｏｗポリメラーゼによって処理される。得ら れた断片は、次シτ、非ホスボリル化ＢｇｌＩＩアゲブタ−の存在の下で、リカ ーセの作用を受ける。得られたりゲー／ヨ／混合物は、ＪＭ１０３の適格細胞の 形質転換のために用いられる。

次に、青色斑が選択される。これらのクロー７は、次に、それらがＢｇｌＩＩサ イトを含むことを確認し、またそれらが最早、上方にＥｃｏＲＩサイトまたはＢ ａｍＨＩサイトを示さないことを確認するために、分析される。

このよってして、図２（てその構造が示されているＭ１３ｔｇ９］２のようなり ローンが得られる。

Ｂａ１３１による処理は、ＥｃｏＲＩサイト、ＢａｍＨＩサイト、ＡｖａＩサイ トならびに１ａｃＡＴＧおよび５ｈｉｎｅ　／　Ｄａｌｇａｒｎ。

／−ケンスを除去し、ｌ　Ｏ］、　ｂ　ｐの削除を生じた。導入されたＢａｌ　 Ｉ　エサイトは、ｃＩＩのＡＴＧの約］　ｏｏｂｐ上方、ＰｌａｃのＩｔ）ｂｐ Ｔ方に位置することが認められる。

前述のように、Ｍ］３ｔｇ９１２の１ａｃＺ′およびｃＩＩｒｂｓを含ｊ１　Ｂ ｇｌＩＩ　−Ｂｇｌ工Ｉ断片を、最初に準備されたｐＴＧ９０７のＢａｍＨＩサ イトに移すことが、考慮された。しかしながら、この構成は不可能であった。な ぜならば、それは宿主株にとって致死的なものであることが、明らかＶＣされた からである。このような理由により、ｐＴｃ、９０７のＢａｍＨＩサイトとＳｐ ｈ　エサイトの間への、ｃＩＩｒｂｓおよび１ａｂｚを有するＢｇｌＩＩ／Ｈｇ ａＩ断片の挿入を可能にするＨｇａＩ／５ｐｈＩアダプターを用いる、別個の戦 術の開発が、必要となった。

ｐＴＧ９０７のＢａｍ／５ｐｈＩ断片、ＣＩＩ　ｂｓおよび１ａｃＺ’を有する Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断片、およびホスホリル化アダプターが、］：２：］のモル比て プレハイブリダイズされ、次にＴ、　ＩＪガーゼで処理される。アリコート（部 分標本）が、３０℃の下で、菌株６１５０の適格細胞の形質転換のために用いら 第１る。

関連する細胞は、ｐＡ２で標識されだｃＩＩｒｂｓ／１ａｃＺ’断片を用いて形 質転換体を選択すること疋より識別され、得られた構成は酵素制限研究によって 確認される。

表現系統のさまざまな要素が、望み通シに導力・れることを示す最初の指示を得 るために、得られたプラスミドｐＴＣ，９０８は、宿主株Ｎ６４３７−これは、 そのプラスミドによってコートされている断片αを補足するβ−ガラクトシダー セの断片ωおよびｃ１８５７を併有する一−−−内に移される。

得られた転換体は、Ｉ　ＰＴＧおよびＸｇａｌを含む箱の中で、２８℃において 白色であり、次に、４２゛Ｃでそれらを移した場合、約３０分後に青色になる。

実　施　例　２ 前例と同様にして、九以外の他のプロモーターを用いることが可能である。

Ｖ、Ｐ］、ｒＯｔｔａによって構成されたｐＢλＨ３は、遺伝子ｃＩ８５７、Ｐ ３、およびｐＢＲ３２２内にクローニングされた遺伝子ｃｒｏの一部を含む。

このクローンは、プロモーターｐＲ（ｐｒｏｍｏｔｅｕｒ　ｄｅｄｒｏｌｔｅ　 ）−−−−−−これは、そのプラスミドによってコートされたｃＩ８５７の管理 下（（あるー−−−−の下方の遺伝子ｃｒ。

内（ｌてＢａ１ＩＩサイトを有する。

遺伝子。、Ｐ２７、遺伝子６ｓＡｒｌＩ４、および遅発性遺伝子Ｓは、λＢｃｌ 　Ｉ断片（文献１９）内に含苔れる。この断片は、ｐＢλＨ３のＢｇｌＩＩザイ ト内サイ入され、このようにして、遺伝子ＱをプラスミドのＰＲの管理下に置く ことができる。そこで、Ｐ′Ｒプラス断続的管理系統全体は、ＥＣ０ＲＩ断片内 に含捷れ、この断片は、ｐＴＧ９０８内のＢｇｌＩＩ／Ａｙ訂工Ｉ断片内に位置 するＮおよびＰＬを置換するだめに用いられる。これはｐＴＧ９０８の類似の− しがし、その転写はＰｋＫよって管理される〜−−−構造に通じる。

次の実施例は、アンチトリプシンーα１のタメのコードを作る遺伝子のクローニ ングに関する。

これを行うために、ヒトのアンチトリプシンーα１をコードするｍ　ＲＮ　Ａの 完全な／−ケンスのためのコートヲ作ルクローンが、分離された。このノーケン スが、事前に準備されたー−そしてＥ、ｃｏｌｉ　（大腸菌）内で、天然ヒト・ アンチトリプシンーα１に対応する抗体との反応を示し、インビトロ（試験管内 ）でアンチトリプシン−α１の生物学的作用およびそのエステラーゼ抑制能力を 示すポリペプチドの、大量の合成を証明した細菌プラスミド表現ベクター内に、 挿入された。細菌から作り出されたこのアンチトリプシンα１は、アンチ）　ｌ ）プ／ノ欠乏を含む障害の治療のための代替療実　施　例　３ ヒトの肝臓は死亡後に得られ、液体窒素内で急速に冷凍される。ＲＮＡは、文献 ２０ＶＣ記述されているように塩酸グデニジン法を用いて、肝臓５Ｉから製造さ れる。ＲＮＡは、ボＩＪ　Ａ　ｍＲＮＡを豊富にするために、ポリＵ−セファロ ース分離管（ｐｈλｒｍａｃｉΔ社製）上て、クロマトグラフィー分離される。

総ＲＮＡおよびポ’）　Ａ＋ｍＲＮＡは、前述の文献２００条件ヲ用いて、ヌク レアーゼ（ＢＲＬ　）によって処理されたウサギの網赤血球の溶解質内で翻訳さ れる。翻訳後の変異を研究するために、イヌの膵臓の膜（文献２１）が、翻訳系 に加えられる。市販されている抗アンチドリブン／−α１抗血清（／ルテイノク ・イミュノロジー社製）を用いる免疫沈澱は、文献２２に記述されている。

図５は、ヒトの肝臓の総ＲＮＡの翻訳産物に対応する免疫沈澱物を、表現してい る。これらのＲＮＡは、イヌの膵臓のミクロノーム膜の存在の下で、あるいはそ の欠如の下で、３００μｊｉ／ｍｅのヌクレアーゼによって処理されたｅ７サギ の網赤血球の溶解質内て、翻訳された。メチオニン３３５が、放射性トレーサー として用いられた。

ＴＣＡ不溶性の約１．ｏ６ｃｐｍの放射能を含むアリコート（部分標本）が、１ ０（印刷不鮮明、％（９））ポリアクリルアミドＳＤＳゲル上で電気泳動に付さ れ、次に蛍光写真撮影および放射線撮影に付された。

ライン１は、放射性マーカー蛋白質を表現する。寸法（ｄ　１０”ダルトン単位 で示されている。

ライン２は、膜の存在の下での、アンチトリブ７）−α、抗血ａＶＣよる免疫沈 澱物を表現している。

ジイン３ば、ライン２と同一であるが、得られた生成物は膜の欠如の下で作られ たものである。

ライン４は、ライ／３と同様であるが、非免疫抗血清が用いられた。

抗アンチトリプ／ンーα１抗血清によるヒトの肝臓の総ＲＮＡの翻訳産物の免疫 沈澱は、翻訳がミクロノーム膜の欠如の下で行われる時に、４５０００ダルトン の分子量の特異性ポリペプチドが沈澱することを示している。翻訳へのミク「１ ノーム膜の付加は、幾分大きい（４，８０００ダルトン）免疫沈澱ポリペプチド を導き出す。

ミクロノーム膜の存在の下におけるアンチトリプシン−Ｃ１のｍ　ＲＮ　Ａの翻 訳産物の、この寸法増大は、恐らく、グリコリル化のような翻訳後変異に起因す るものと思われる。大型のペプチドの免疫沈澱ポリペプチドは、標識されていな い天然のヒト・アノチトリブ／／−α１の付加によって、競争状態に置かれ、翻 訳産物のアイデンティティを確認する。このようにして、生物学的活性を有する アンナトリブ／ノーα１のメンセンジャー　ＲＮＡけ、総ＲＮＡにおいても、ま たヒトの肝臓から作られたボＩＪ　Ａ　ｍＲＮＡにおいても、容易に検出されう る。

α−ＡＴｍＲＮＡの量は、肝臓においてば１−５（印刷不鮮明、％（？））の規 模である。

（ｄＴ）＋２−１８を使用する逆転写のためのマ）　ＩＪノクス（基質）として 、用いられる。相補的ＤＮＡは、ｐＨ８，３、Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　１００　ｍモ ル、ＫＯｌ　５０　ｍモル、Ｍｇ０１２８　ｍモル、β−ノルカプトエタノール ３０ｍモル、オリゴ（ｄＴ）、□−１８１μ２、ポリＡｍＲＮＡ５μＰ、ｄＡＴ Ｐ、ａＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、５００μモル、鳥の骨髄性白血病ウィルス のリバース・トランスクリブターゼ（フロリダ州、セント・ピータースバーグの ライフ・サイエンス社製）８０単位を含む反応培地］００ｚｌｌ内で、合成され る。

４２°Ｃで４５分間の培養後、反応は終了させられ、ＣＤＮＡコンプレックスは 】００°Ｃで３分間加熱したのち急速に水浴上に移すことによって、変性させら れる。

ＤＮＡの第二鎖の合成のために、プライマー鎖の反応性混合物は５倍に希釈され 、ｐＨ６，９、Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ１００ｍモル、ＫＣｌ、　］、ＯＯｍモル、 ｄＡＴＰ＋ｄｃＴＰＳａＴＴｐ、　２００μモル、６ＣＴＰ　Ｐ”’　２００μ モル、固有放射能０．５　Ｃｉ／ｍ　モル、Ｅ、　ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラー ゼのＫｌａｎｏｗ断片（ベーリンガー・マンハイム社製）１０単位の最終濃度と なるよう、調節される。

培養は、２５゛Ｃで２時間行われる。放射能（でよって測定される２本鎖ｃＤＮ Ａ　（ｄｓｃＤＮＡ　）の収量は、９７０ｎｇである。その反応混合物はｐＨ７ ，５のＴｒｉｓ　ＨＣ；ｌ　１０　ｍモル、ＥＤＴＡ　］　ｍモルで飽和された 、等体積のフェノール：クロロホルム（５０：５０）を用いて抽出され、ｃＡＤ Ｎはエタノールによって沈澱させられる。

ｃｌｓｃＤＮＡは、ｐＨ４８の酢酸ナトリウム３０ｍモル、ＮａＣｌ３００　ｍ モル、ＺｎＣ１□３ｍモルを含む１００μｍの反応体積内で、ＳＬヌクレアーゼ ５単位を用いた消化により、極度に純化される。

３７℃で１時間ののち、ＥＤＴＡおよびＳＤＳが、それぞれ最終濃度が１．０ｍ モルおよびＣｌ係になるでて添加される。次に、その反応混合物は、６５°Ｃで １０分間、加熱される。Ｓｌによって処理されたｄｓｃＤＮＡは、ｐＨ７，５の Ｔｒｉｓ　ＨＣＩ　１００ｍモル、ＮａＣｌ　１００ｍモル、ＥＤＴＡ５πモル の緩衝液内の５−２０　％の一次スクロース勾配上に適用され、次にベックマン ５Ｗ６０　Ｔｉローターを用いて、１５℃で１５分間、３００００ｒｐｍて遠ル ４・分離される。ｏ５ゴの分画が集められ、各々の分画内のｃＤＮＡＯ量が、各 々の分画の部分標本内のＴＣＡ−ｆ−腎性放射能を１ｌｌｊｉ定することにより 、測定された。各々の分画内のｄｓ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの寸法は、中性アガロース ・ゲル上での部分標本の分析および、それに続く放射線撮影によって、測定され る。

平均重量］　ｋｂ以上のｄｓｃＤＮＡを含む分画が集められ、Ｅ、　ｃｏｌｉの ｔＲＮＡ　５μｇが起動物質として加えられ、エタノール沈澱およびそれに続く 遠心分離によって、核酸が回収される。

ｄｓｃＤＮＡけ、少量のＳＳＣ（１５ｍモルのＮａＣ１，１５０モルのクエン酸 ナトリウム、ｐＨ７，０）　Ｋ溶解させられる。

］、ＯＯｎ　ｇのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが、ｐＨ６，８０カコジル酸ナトリウム１、４ ．０モル、塩化コバルト１ｍモル、ジチオエリトリトール０．１　ｍモル、ｄＣ ＴＰＨ３１００μモル、固有放射能６７ｃ１／ｍモル、末端デオキシヌクレオチ ド・トランスフェラーゼ５単位を含む３０μｍの反応培地内での、３７′Ｃで１ ５分間の培養ＶＣよるホモホリマーａＣ伸長により、３′末端１で伸ばされる。

ホモポリマーｄＧの小片（３′末端について約１３要素）が、この反応培地内で 、事前に酵素ＰｓｔＩ　Ｋよって消化さｈだプラスミドｐＢＲ３２２に付加され る。このようにしで得られたプラスミドｐＢＲ３２２は、次に、その反応混合物 から、フェノールによる抽出およびそれに続く予備的電気泳動、および１％アガ ロース・ゲル上での電気溶離によって純化される。

反応培地から直接的に得られたｄｓｃＤｔｉは、ｐＨ７，５のＴｒｉｓ　ＨＣＩ 　１．０ｍモル、ＮａＣ１１００ｍモル、ＥＤＴＡ　Ｉ　ｍモルを含む１５０μ ｍのベクター５００ｎｇ　Ｋついて、ｃＤＮＡ１５ｎｇの割合で、ｐＢＲ３２２ −ｄＧと混合され、６５°Ｃて１０分間加熱され、次に４２℃で２時間培養され る。その反応混合物は、次Ｋ　Ｅ、　ｃｏｌｉ　１１０６株の形質転換のために 用いられる（文献２３）。形質転換因子は、１５μｊｊ　／　ｍｌのテトラサイ クリンを含む寒天板上で選択されろ。そのうち約５０％がＩｋｂを越えるｃＤＮ Ａの挿入物を含むｄｓｃＤＮＡ３０　ｎｇから、合計１．５０００の再連結体が 得られる。全ての形質転換体が、板から採取され、１５ｒ／ｍｌのテトラサイク リンを含むＬＢ培地内で懸濁され、そのバンクは、５０係に至る一寸でのグリ十 ロール添加後、−２０°Ｃで貯蔵される。

１６の末端アミノ酸のコートを作り、３′に非コート性配列の６６ヌクレオチド ヲ含む不完全なヒ１−アンチトリプ／ノのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローンの、３０６ ｐｂの配列（文献２４）が、アンチドリブン−α１のＣＤＮＡ　のクローンのだ めのノ゛ノテとして用いられる、オリゴヌクレオチドの配列を決定するために、 コンピューターによって分析される。これは、３０６の塩基対を２１塩基（２１ ｍｅｒ）の可能な限りの全ての集合に分割し、次にそれらを別個に、それらが分 子内二本鎖構造（ヘアピン）を形成する可能性について分析することにより、行 われた。選択された２１ｍｅｒ、５′−ＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＡＡＧＣＣＣＴ ＧＴＧ　−３′（これは図６に示されている）Ｋは、２ｐｂよりも長いヘアピン は含まれていない。この配列の補足、すなわち５′−ＧＣＡｌ：ＧＣＣＴＴＧＧ ＡＧＡＧＣＴＴＣＡ　−３′は、以前に記述が行われたようＫ（文献２５）、ン リカゲル支持上で合成される。５′末端を標識したのち、オリゴヌクレオチドの 寸法がポリアクリルアミド・ゲル上の電気泳動によってテストされ、Ｍａｘａｍ およびＧ１１ｂｅｒｔの方法によって配列が決定される。

ｄ）ヒトの肝臓のｃＤＮＡバンクの分析約１５００のコロニーが、１５μ９７ａ ｔのテトラサイクリンを含むＬＢ寒天皿の上で、】晩生、生長させられる。

翌日、それらの細菌コロニーは、ワットマン５４０ペーパー上に移される（文献 ２６）。テトラサイクリンを含む最初の皿に残った細菌は、また数日間にわたっ て、３７゛Ｃの下で生長させられる。ノ・イブリテー／ヨンのだめの、細菌プラ スミドＤＮＡを製造するため（で、ｔＪ　ａ　Ｏ８０５モルを用いて５分間、フ ィルターが洗滌される。

それらのフィルターは、空気中で乾燥させられたのち、ｐＨ７，５のＴｒｉｓ　 ＨＣＩ　０．５モル、２　Ｘ　ＳＳＣの緩衝液内での連続的洗滌によって、中和 される。そこで、それらのフィルターはアルコールでゆすがれ、空気中で乾燥さ せられる。残存する細菌の破片は、ｐＨ７，５のＴｒｉｓ　ＨＣｌ５０ｍモル、 ＥＤＴＡ５ｍモル、０．５　％　ＳＤＳ内で、Ｋブロテイナーセ２５μｉ／ｍｌ による３７℃での、２時間の消化によって、除去される。

ハイブリデーンヨン・ゾンデは、５０　ｕｃｉのｐ３２　ｒ−ＡＴＰを用いて２ １ｍａｒの８０　ｎｇについて、キナーゼ・ポリヌクレオチド（ＰＬ・バイオケ ミカルス社製）を用いて５′末端を標識することによって、製造される。

ハイブリデーンヨンは、６　Ｘ　ＳＳＣ、Ｉ　Ｘ　Ｄｅｎｈａｒｃｌｔ液、ｐＨ ７５の燐酸ナトリウム１０ｍモル、５係のホルムアミドを含む溶液ＪＱｍｌ内で 、３７℃で１晩中、行われる。そこで、フィルターは、室温の下で６　Ｘ　ＳＳ Ｃ，０，１％ＳＤＳを用いて、数回洗滌される。それらのフィルターは乾燥させ られ、１晩中オートラジオグラフイー撮影される。

非常に強い正のシグナルは、ハイブリデーンヨンの基礎雑音以上に、明瞭に検出 されつる。

大規模な正のシグナルに対応する細菌コロニーは、テトラサイクリンを含む最初 の皿を用いて、オートラジオグラフの方向付けをすることにより、決定される。

プラスミドＤｒｑへけ、各々の細菌コロニーの小培養から製造され（文献２７） 、各々のプラスミドのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの挿入物は、ＰｓｔＩによる消化によって 決定される。ｐＴＧ６０３と呼ばれるプラスミドは、二つのＡｖａＩサイトおよ び唯一のＢａｍＨＩサイトを有する約１．６　ｋｂの挿入物を含んでいることが 、認められる。ＡｖａＩ　＋　ＰｓｔＩによる二重の消化によって作られた断片 の寸法（２５ｏ塩基対）は、完全な長さを有するアンチドリブン／のクローンに ついて予測された寸法と、一致する（文献２４．２８　）。このプラスミドが実 際にアンチトリプ／ンーα１のｃＤＮＡを含んでいることを確認するために、そ の挿入物ばＰｓｔＩ断片の形態の下で、ＰｓｔＩによる切断後にファー；；Ｍ］ ３ｍｐ８−ヒに移され、次に、連鎖停止剤としてジデオギンヌクレオチドを用い て配列される。得られた配列は、そのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａとアンチトリブ／ン−α１ のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの一致を確認する（図７）。得られた配列は、アンチトリプ／ ンーα１のだめのコートを作るヒ１−ＤＮＡについて知られている、対応する領 域と、比較される。図７の上部には、完全なアンチトリプンン−α１のｃＤＮＡ のクローンの部分的配列が示され、下部には、明らかにされたｐＴＧ６０３の部 分的配列が示されている。

ヒト・アノチトリブノン−α１のｃ　Ｄ　Ｎ　ＡのクローンｐＴ０６０３は、成 熟した蛋白質の最初のアミノ酸のためのコドンの直後に、唯一の制限サイトＢａ ｍＨＩを含んでいる。成熟した全ポリペプチドのためのコーティング能は、最初 のグルタミン酸を除いて、ｐＴ０９２０表現ベクター上にクローニングされたＢ ａｍＨＩ　／　ＰｓｔＩ断片内で、このようにして得られる。この構成において は、転写は左側のλプロモーターＰＬから行われ、翻訳はりボノーム固定ザイト を伴うλｃＩＩｒｂｓのＡＴＧにおいて開始される。さらに、遺伝子λｃＩＩの 最初の３９ｐｂは、指示されているように、遺伝子１　ａ　ｃ　Ｚ’の冒頭にお いて融合する。

唯一の制限サイトを含む連結領域は、ｃＩＩと１．　ａ　ｃ　７．′配列の接合 部に位置する。プラスミドｐＴＧ９２ｏは、実施例３において製造されたｐＴＧ ９０８の誘導体である。

このプラスミドにおいては、ｐＴＧ９０８て１ｄｃＩＩのＡＴＧの４０　ｂｐ十 方に位置する原断片ＢａｍＨＩ／Ｐｓｔは、図８に示されているように、Ｍ１３ ｔｇｌ１５のＢｇｌＩ工／　Ｐｓｔ断片によって置換されている。

このプロセスのおかけで、ア／チトリプンンーα、の遺伝子のＢａｍＨＩサイト と同一の翻訳和尚に位置するＢａｍＨＩサイトが、得られる。

図８は、プラスミドｐＴｃｑ　０８およびファージＭ１３ｔｇ１１５からのプラ スミドｐＴＧ９２０の製造を可能にするクローニング戦略および、クローニング すべ＠ｐＴ０６０３の断片の指示を表現している。実線の矢印は、蛋白質のだめ のコードを作る配列を表現し、ｐＴｃ６０３の場合には、アンチトリプンンーα １の成熟したポリペプチドのだめのコードを作る配列を表現している。線形が付 けられた領域は、最終的にはアンチトリプシンーα１と融合するｃＩＩのＮ末端 １３アミノ酸のだめのコートを作る領域を、表現している。

このようにして、ｐＴＧ９２０のＰｓｔＩザイトとＢａｍＨＩの間へのＢａｍＨ Ｉ　／　ＰｓｔＩ断片の挿入は、蛋白質ｃＩＩの１３アミノ酸（ＮＨ２末端から の）、アダプターの配列に由来する４アミノ酸、１４Ｈ２末端のグルタミン酸を 除くア／チトリプンンーα１の成熟したポリペプチドを含む融合ポリペプチドの 表現に通じる。

ＢａｍＨＩ　／　ＰｓｔＩおよびアルカリ性ホスファターゼによって処理された ｐＴＧ９２０は、ＢａｍＨＩおよびＰｓｔＩ　ｉＣよって消化されたｐＴ０６０ ３と連結する。アンチトリプ／ンーα、断片を有する形質転換体ＴＧＥ９００細 胞は、酵素制限研究後に分離される。これらのクローンのうちの一つであるｐＴ Ｇ９２２が、より完全な研究のために選択される。

既に言及されたように、当発明に従うベクターは、前掲の方法の異型の名目で、 非融合蛋白質の製造を可能にする。これを行うためには、ｐＴＧ９２０がＮｄｅ Ｉで消化され、さらにｐＴＧ６０３が前述のようにＢａｍＨＩで消化され、次に 、下記のように、オリゴマー・アダプターの仲介によって得られた断片の連結が 行われる。あるいけ、ベクターｐＴＧ９２２　（／ｌ：関して、同一の作業が行 われる： ５’−ＣＡＴＡＴＧ−−−−−−−−−−−−−−ＧＧＡＴＣＣ３′ＴＡＴＧＣ ，ＡＣ ＡＣＣＴＣＣＴＡＧ　９ｍｅｒ −−−−−−−ＧＡ　ＴＡＴＧＧＡＧ　ＧＡＴ−−−−−−−−−−−−−−Ｃ Ｔ　ＡＴＡＣＣＴＣＣＴＡ−−−−−−−この接合は、アンチトリプノノ−α１ のだめのコードを作る遺伝子の融合の対象となる出発点のＡＴＧコトノを、再構 成する。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＴＧＥ９００株の細胞は、ヒｌ−・アンチトリプ／ンーα１の 遺伝子を含むｐＴ０９２２表現プラスミド捷だは、挿入物を持たない単独のプラ スミ）ｐＴＧ９２０を含むことから、それらの蛋白質は、上記の温度で１時間に わたって、メチオニンＳ３５で標識される。抽出物は、文献７に記述されている ようにして製造され、部分標本が１０％ＳＤＳポリアクリルアミド上で分析され 、次にフルオログラフィーおよびオートラジオグラフィーによって分析される。

結果は図９ＡＫ示されているニ ライン１：放射性分子量マーカー、 ライｙ　２　：　ｐＴＧ９２２を伴う細胞抽出物、２８°Ｃにおける生長（誘導 なし）、 ライン３ニライン２と同様、たたし４２℃における生長（誘導）、 ライン４ニブラスミドｐＴＧ９２０を含む細胞の抽出物、ライン５ニライン４と 同様、たたし４２℃における生長、 観察された結果は、約４５０００ダルトンの分子量を有する太い帯の誘導を、証 明している（図９Ａ）。オートラジオグラムの密度計測定は、作り出されたアン チ（・リブノン−α１の量が、Ｅ、　ｃｏ］、ｉの総蛋白質の７５−１５係に相 当することを示している（アンチトリプシン−α１のメチオニン含量とＥ、　ｃ ｏｌｉの総蛋白質のメチオニン含量の間の、可能性として考えられる差について の調節は行われなかった）。

プラスミドｐＴｃ９２０およびｐＴＧ９２２を有するＥ、　ｃｏｌｉの細胞の標 識抽出物は、前述のようにして製造される。

部分標本は、図５について記述されているように抗アノチドリプシンーα１抗血 清を用いた免疫沈澱に付され、！　Ｑ　Ｚ　Ｓｚ　Ｓポリアクリルアミド・ゲル 上で分析され、次にフルオログラフィーによって分析される。結果（は図９Ｂ］ に示されているニ ライン１は、４２℃で標識され、抗アンチトリプシンーα、抗血清によって免疫 沈澱させられたＩ）ＴＧ９２２　（アンチトリプシンーα１の配列を示す）を含 むＥ、　ｃｏｌｉ・Ｔ（、Ｅ９００のエキスに対応する。１００μｍのエキス、 ライン２は、ライン１と同様である。ただし、２μｌライノ４はライン１と同様 であるが、許可されていない温度（２８℃）、１００μｍのエキス、ライン５け 、誘導温度４２℃で標識された族プラスミドｐＴＧ９２０を含む細胞のエキス、 １００／１１のエキス、さらに、図９８２には、Ｅ、　ｃｏｌｉによって合成さ れたアンチトリプシンーα、の免疫競争の結果が示されている。ｐＴＧ９２２を 含むＥ、　ｃｏｌｉの細胞エキスは、前述のようにして４２゛Ｃで標識される。

部分標本は、次の免疫沈澱のだめに用いられるニ ライン１：抗アンチトリプ／ンーα、抗血清を用いた免疫沈澱、 ライン２ニライン１と同様である。ただし、無標識の、天然のヒト・アンチトリ プシン−α１、】ｏμＩの存在の下で、 ライン３ニライン２と同様である。ただしアンチトリフ／ンーαトコンペティタ ー２０μ、９、ライン４、ライン３と同様である。ただしコンペテイター５０μ ｇ。

これらの試験は、その免疫沈澱産物の分子量が、膜の欠如の下でヒト肝臓ｍＲＮ Ａ由来細胞を持たない翻訳産物からの沈澱産物の分子量と、同一であることを証 ｐＴＧ９２２の粗エキスが製造され、部分標本が、その抗ブタ膵臓エラスターゼ 活性についてテストされる。

Ｅ、　ｃｏｌｌによって作ら→ｔたアンチトリプシン−α１の生物学的活性をテ ストするため（で、前述のようにして、大豆トリプシン抑制剤を除くプロテアー ゼ抑制剤の欠如の下で、培養の粗エキスが製造される。エステラーゼ試験は、修 正されたＶｅｒｂの方法（文献２９）に従って行われる。アンチトリプシン−α １試料の粗エキスは、エラスチンＨ３の添加および３７°Ｃでの培養に先立って 、環境温＋ｉの下で３０分間、ブタ膵臓エラスターゼ０２５１１ｈｉとともに前 培養される。次に、３００μｍの試料が遠心分離され、上澄の計算によって抑制 百分率が決定される。

試料は次の通りである： １）−−一　エラスターゼ ２）−エラスターゼ＋誘導されたｐＴＧ９２０エキス５０１１１　． ３−４）−−エラスターセキ誘導されたｐＴＧ９２０工キス２０μｍ＋ヒト・ア ンチトリプシン−α、（ングマ社製）５μｇ１ ５〜６−７）−エラスターゼ下誘導されたｐＴＧ９２２エキス５μ＋２０μｌ＋ ５０１ｔ１． ８）−一　エラスターゼ４−非誘導ｐＴＧ９２２エキス５０μｍ結果（図１０） は、エラスターゼの完全な抑制が、ｐＴＧ９２２により誘導されたエキスを用い た場合にのみ得られ、ｐＴＧ９２２またはｐＴＧ９２０の非誘導エキスによって は得られないことを、明らかにしている。これは、誘導さ、ｈたエキス内の、生 物学的活性を有するアンチトリプシンーα１の存在を示している。

標識された被誘導エキスのポリアクリルアミド・ゲルから、総細胞蛋白質の約１ ５係が、アンチトリプ／ノーα１によって構成されていると推定される。

１細胞当りの蛋白質がＩｐｇであることを認めるならば、これは、１細胞当りＯ ，ｉ　５　ｐ　ｇのアンチトリプシン−α、を与える。

超音波および遠心分離後、アンチトリプシンの約５０係が沈渣内に失われる。従 って、上澄内の細胞蛋白質合計と比較した場合の、アンチトリプシン−α１の百 分率は７５係である。

作り出されたアンチトリプシン−α１の量も、同様に抗エステラーゼ活性の測定 値から推定されうる。ブタ膵臓エステラーゼ０．２５μｇについて、１００％の 抑制が、血清から作られたヒト・アンチトリプシン］０μｇを用いて得られたこ とが、認められた（対照細菌エキスの存在の下で）。等値の抑制寸準が、アンチ トリプシン−α１を含む被誘導細菌エキス５０μｍを用いて観察される。すなわ ち： ５０μｌのエキスーアンチトリプ７ン−α、　１０／４．９＜−＞　１．５μｌ の培養　−アンチトリプシノーα１１０μＩ＜−＞　１．５　Ｘ　１０’細胞　 −アンチトリプシノ−α１１０μｙ＜＝＞１５０細胞　＝アンチトリブノノーα 、　１０／２９〈−〉１細胞　−０，０５ｐｇ　（すなわち総細胞蛋白質の６係 ） これは、音波処理および遠心分離後のゲルから推定された７５％という比率と、 非常に一致している。この割算は、細菌によって作り出されたアンチトリプンン ーα１が、血清から製造されたアンチトリプシン−α、の抗エラスターゼ活性率 に匹敵する抗エラスターゼ活性率を示すこと、および、アンチトリプンンーα１ が、培養１１当り約１５＃＋９の比率で作り出されることを示してヒト・アンチ トリプンンーα１は、３本の炭水化物側鎖を含む糖蛋白質である。これらの鎖は 、Ｎ−アセチル・ノイラミン酸、ガラクトース、マンノース、Ｎ　−アセチル・ グリコサミンを含むＮ−グルコノド・タイプの鎖であり、１個のアスパラギニル 基の仲介によって蛋白質と結合している。オリゴ糖類は、Ａ形態の下で（または 分岐の２点に）、あるいはＢ形態の下で（分岐の１点）、存在する。

蛋白質の生物学的活性のためには、恐らく、グリコジル化は不必要であると思わ れる。なぜならば、細菌から得られた産物は、活性を示すからである。

より良い安定性を保証するために、細菌によって得られた産物をグリコノル化す ることは、必要であると考えられる。これは、インビトニで可能である。なせな らば、膜の存在の下でアンナトリプ／ノーα１のｍＲＮＡから得られた、細胞を 含−１：ない翻訳産物は、グリコノル化を考慮に入れるならば、その寸法が増大 することが認められるからである。

実　施　例　４ 非融合α−アンチトリプシンの取得（図１１）出発点のプラスミドは、前述のプ ラスミドｐＴＣ９２２である。

プラスミドｐＴＧ９２２は、供給者によって指示された条件を用いて、制限酵素 ＮａｅＩ　にューイングラント・バイオラボラドリース社製）およびＢａｍＨＩ 　（ベテスダ・リサーチ・ラボラドリース社製）による完全な制限を受ける。

既知の方法により、次の構造を有する非ボスホリル化相補性アダプター・オリゴ ヌクレオチ［・カ、合成すれる： ５′−ｄＴＡＴｃＧＡＧ−３’および ５’　−ｄＧＡＴＧｃＴＣＣＡ−３’ これらのオリゴヌクレオチドハ、プレハイブリダイズされ、次に、既知の条件下 でＤＮＡ　ＩＪガーゼを用いて、５０：１のモル比で酵素制限を受けたプラスミ １−ｐＴＣ，９２２と、４°Ｃの下で連結される。この連結混合物は、ＴＧＥ９ ００株の適格細胞の形質転換のだめに用いられ、得られた形質転換株は、アンピ ンリンの存在の下で培地上に展開される。

Ｔ４ポリヌクレオチド・キナーゼ５’　−（］０ＣＴＧＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡ　 −３’で標識されたゾンデを用いた、ハイブリデーノヨンによす、ニトロセルロ ース・フィルター上で、コロニーが選択される。このゾンデは、選択しだい非融 合構成を完全に補足するが、親プラスミドｐＴＧ９２２のヌクレオチドのうちの ７個のみを、補足するにすぎない。これは、バイブリプ−ジョンを保証するには 不十分である。

このようにして、確実な６候補が得られる。

これらは、２８°Ｃおよび４２℃で培養され、製造されたエキスは、主特許証に 記述されたように、それらの抗エラスターゼ活性についてテストされる。

結果は、添付の表に記載されている。

ｐＴ０９２０　２８℃　５ ４２℃　４２ ｐＴ０９２２　２８℃　９３６ （表の注） ｐＴＧ９２０　ｉ、アンピンリン／／−α１のだめのコートを作る配列を持たな い唯一のベクターである。

ＴＧ９２２ ｐＴＧ９２９　ｆｌ）および（２）Ｉ″ｉ、当発明の方法によって製造された異 なるクローンである。

リブンンーα１の表現を保証することを証明している。

プラスミドｐＴＧ９２２と比較した場合のプラスミドｐＴｃ９２９　Ｋおけるヒ 、ト・アンチトリプシン−α１の表現水準の減少は、恐らく、ｃＩＩ配列の一部 の消失に起因するものと思われる。

質のＯ曝未満）を産生ずるにすぎない。表現水準を増大させるだめ（て、次のよ うに、合成ｒｂｓサイトによってｃＩ■ｒｂｓが置換される。

５ｈｉｎｅ／Ｄａ１ｇａｎｏ配列 この交換は、図］、２に示されているようにして、実施される。ｐＴＧ９２９の ＨｐａＩサイトおよびＢｇｌＩエサイトは、それぞれＣ１ａＩサイトおよびχｈ ｏＩサイトによって、合成挿入物を用Ｉｆ′−て置換される。

その場合、合成ｒｂｓ　（ｓｙｎｔｈ　ｒｂｓ）は、Ｎ遺伝子内（で作り出され た新しいＣ１ａＩサイトとＮｄｅＩサイトの間に、挿入される。この操作はｃＩ Ｉｒｂｓを除去し、その直後Ｋ　５ｙｎｔｈ　ｒｂｓが続く欠損Ｎ遺伝子を導き 出す。ｓｙｎ　ｔｈｒｂｓ内の翻訳末端コドノ（ＴＡＡ）は、Ｎの翻訳を遮断す る。得られたプラスミドｐＴＧ９５６は、インヒドロ抗エラスターセ試験（でよ って証明されたように、総細胞蛋白質の月俸の水準で、α、−ＡＴを産生する。

実　施　例　６ 明細書において指摘されたよう（／ｌ：、プラスミドｐＴｃ９５６ｆ／ｃおいて は、α−ＡＴの原配列が変異配列によって置換される： 原配列： 蛋白質＋　ｍｅｔ　ｇｌｕ　ａｓｐ　ｐｒｏ　ｇｌｕ　ｇａｙ　ａｓｐ　ａｌａ ＤＮＡ　：　ＡＴＣＧＡＧ　ＧＡ、Ｔ　ＣＣＣＣＡＧ　ＧＧＡ　ＧＡ、Ｔ　ＧＣ ；Ｔ変異配列。

蛋白質：　ｍｅｔ　ｇｌｕ　？Ｌｓｐ　ｐｒｏ　ｇｌｕ　ｇｌｙ　ａｓｐ　ａｌ ａＤＮＡ　：　ＡＴＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＣＯＴ　ＣＡＡ　ＧＧ−ＣＧＡＴ　Ｇ ＣＴ各々の変化（星標が付されている）１ｄ、コドンの３位において行われ、コ ートされたアミノ酸を変化させない。α−ＡＴの遺伝−７は、特定の塩基の変化 を決定する合成オリゴヌクレオチドを用いてサイト上で行われる変異誘発テクニ ンクを利用して、変化させられる（文献３０）。選択される配列の変化は、Ｅ、 　ｃｏｌｉＯ遺伝子の冒頭も・こ隣接する幾つかの位置における、一定の塩基に ついての選択を証明する統計的研究に、由来する（文献３１および文献３２）。

これらの変化は、同様に、可能性として考えられる二次的な−α−ＡＴの配列の うちＶこ出現しうる一構造に対応する領域をも、不安定化するであろう。

変異誘発のだめのオリゴヌクレオチドは、次の通りである： ５′−ＡＧＣＡＴＣＧＣＣＴＴＧＡＧＣ，ＡＴＣＴＴＣＣＡＴ　−３’この配列 は、原配列と比較した場合、四つの差異を含み、前記のα−ＡＴの遺伝子内の変 異に通じる−０得られたプラスミドｐＴＧ９８３は、前述の変化を除いてｐＴＧ ９５６と同一である。

仄の２系列の試験が実施されたニ ー抗α、ＡＴ抗血清を用いた・５３５ｓ）−メチオニン標識株の培養の免疫沈澱 。

一抗エラスターゼ（ヒト白血球に由来する）活性。

これらの試験の結果は、図２および図３に示されている。

図２には、次の５免疫沈澱試験が示されているニー／す／グー１：対照培養（キ ロダルトン単位の分−シリンダ−２：誘導されたｐＴＧ９２０　（挿入物を持た ないプラスミド・ベクター）の培養、−／リンター３：誘導されたｐＴｃ９２２ 　（融合α、ＡＴ）の培養、 一／リノダー４：非誘導ｐＴＧ９２２　（融合α、ＡＴ）の培養、 一ンリンク”−５：誘導されたｐＴｃ９８３　（非融合α、ＡＴ）の培養、 矢印は、融合α、　ＡＴ　（上方の帯）および非融合α１ＡＴ　（下方の帯）に 対応する沈澱領域を示す。シリンダー５の上に出現する下方の帯は、恐らく、α 、　ＡＴの配列内の翻訳開始の結果であると思われる。

この第一系列のテストにより、ｐＴＧ９８３を含む菌株（宿主株ＴＧＥ９００　 ）の培養に由来する標識蛋白質の抗α、　ＡＴ抗血清による免疫沈澱が証明され 、４２キロダルトンの分子量の蛋白質が得らｎる。これに、ｐＴ０９２２株の培 養（シリンダー３）から得られた４４キロダルトノの融合蛋白質と比較した場合 、非融合α１ｐＴの寸法々一致する（シリンダー５参照）。

図３（では、抗エラスターゼ活性試験の結果が、図式的に示されている。これら は、ヒト白血球エラスターゼ（５０ｎｇ）（エラスチン・プロダクツ社製）およ び、基質としてのメトキシ−サクシニル−ａｌａ、−ａｌａ　−ｐＴＣ−ｖａｌ −二ｌ−ロアニリト（カルバイオヶム社製）から、実現された。エラスターゼの 開裂はニトロアニリドを解放し、二）ａアニリドは４］、Ｏｎｍて回収される。

図３のグラフについては、さまざまな曲線の凡例は次の通りであるニ ー・−誘導されたｐＴＣ，９２２のエキス−〇−誘導されたｐＴＧ９８３のエキ スームー非誘導ｐＴＧ９８３のエキス −△−誘導された対照ｐＴｃ９２０のエキスインビボ（生体内）で実施されたこ れらの抗エラスターゼ・テストは、ｐＴＧ９８３がα、ＡＴの大規模な比率の表 現を可能にするこ七を示している。図３は、エラスターゼ（５０ｎｇ）の５０％ の抑制が、約４μＩのｐＴＧ９２２　エキスおよび約１４μＩのｐＴＧ９８３エ キスによって得られることを、示している。これは、それぞれ、産生される総細 胞蛋白質の約３％および約］％に相当する。エラスターゼ５０ｎｇ　ｉｊ、天然 ヒトα、ＡＴ（／グマ社製）の１１００−１２０ｎによって、５０％抑制される 。ｐＴＣ９２２を用いて実施されたそれらの試験の双方によって得られだα。

ＡＴの百分率の差は、失われたα、ＡＴＯ量の変動の結果であり、この損失は細 胞内沈澱に対応する。これらの細胞内沈澱のうち、ｐＴＣ９８３の培養によって 証明されたものは皆無であった。

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ｅｄｓ　５ｔａｎｂｕｒｙ　Ｗｙｎｇａａｒｄｅｎ、　Ｆｒｅｄｒｉｃｋｓｏｎ 、　Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ　ｅｔ　Ｂｒｏｗｎ。

Ｍｅ　Ｇｒａｗ　Ｈｉｌｌ− ２、Ｆａｇｅｒｈｏｌ　Ｍ、に、　ｅｔ　Ｃｏｘ　Ｄ、Ｗ、　（１９８１）、　 Ｔｈｅ　Ｐｉ　ＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍＧｅｎｅｔｉｃ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ａｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ４、　 Ｇａｄｅｋ　Ｊ、Ｅ、、　Ｆｅ１ｌｓ　Ｇ、Ａ、　ｅｔ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｒ， Ｇ、　（１９７９）、　Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｉｎｇ　１ｎｄｕｃｅｓ　 ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ　ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ　１ ｎｔｈｅ　ｌｏｗｅｒ　ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ　ｔｒａｃｔ　ｏｆ　ｈｕｍａ ｎｓ；　５ｃｉｅｎｃｅ　２０６゜１３１５−１３１６゜ ５−　Ｃａｒｐ　Ｈ，ｅｔ　Ｊａｎｏｆｆ　Ａ、　（１９７７）、　Ｐｏ５ｓｉ ｂｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ｏｆｅｍｐｈｙｓｅｍａ　ｉｎ　ｓｍｏｋｅｒ ｓ；　Ｃｉｇａｒｅｔｔｅ　ｓｍｏｋｅ　ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ　５ｕｐｐｒｅ −ｓｓｅｓ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ；　 Ａｍ、　Ｒｅｖ、　Ｒｅ５ｐ−Ｄｉｓ。

１１６、６５゜ ６、　Ｃｙａｄｅｋ　Ｊ、Ｅ、、　Ｋｌｅｉｎ　Ｈ，Ｇ、、　Ｈｏ１ｌａｎｄ　 Ｐ、Ｖ、　ｅｔ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｒ，Ｇ。

（１９８１）、　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　Ｔｈｅｒａｐｙ　ｏｆ　ａｌｐｈａ 　１−Ａｎｔｉ、ｔｒｙｐｓｉｎ　Ｄｅｆｉ−ｃｉｅｎｃｙ、　Ｒｅｖｅｒｓａ ｌ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ−Ａｎｔｉｐｒｏｔｅａｓｅ工ｍｂａｌａｎｃｅＷ ｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　Ａｌｕｃｏｌａｒ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｐｉ　 Ｚ　５ｕｂｊｅｃｔｓ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎ。

■ｎｖｅｓｔ、　６８．１１５８−１１６５゜７、　Ｇｒｏｏｐｍａｎ　Ｊ、Ｅ 、　ｅｔ　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ　Ｍ、Ｓ、　（１９Ｂ２）、　Ｋａｒｐｏｓｉ’ｓ 　Ｓａｒｃｏｍａ；ａｎ　ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａｌ　ｌｏｏｋｉｎｇ　ｇｌａｓ ｓ、　Ｎａｔｕｒｅ　２９９．１０３−１０４゜８、　Ｒｅｍａｎｔ　Ｅ、、　 ５ｔａｕｓｓｅｎｓ　Ｐ、　ｅｔ　Ｆｉｅｒｓ　Ｗ−、Ｇｅｎｅ　１５．８ｌ− ９３（１９８１） ９、　Ｙｏａｋｕｍ　Ｇ、Ｈ，、Ｙｏｕｎｇ　Ａ、Ｔ、、　Ｍａｔｔｅｓ　Ｗ、 Ｂ、　ｅｔ　Ｇｒｏｓｓｍａｎ　Ｌ、。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａ、ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７９．１７６６ −１７７０　（１９Ｂ２）。

１０、　Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ　１．　ｅｔ　Ｓｉｇｎｅｒ　Ｅ、、Ｊ、　Ｍｏ １．　Ｂｉｏｌ、　４７゜５４５−５５６　（１９７０）。

１１、Ｇｒａｙｈａｃｋ　Ｅ、Ｕ、ｅｔ　Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ｊ、Ｗ、、Ｃｅ１ｌ 、３０，６３７−６−８（１９８２）。

１２、工ｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　Ｄ、ｅｔ　Ｂｕｒｋｅ　Ｊ、Ｆ、、Ｎｕｃｌ 、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９゜２９８９−２９９８　（１９８１）。

１３、Ｐａｎａｙｏｔａｔｏｓ　Ｎ、ｅｔ　Ｔｒｏｎｇ　Ｋ、、Ｎｕｃｌ＋　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９゜５６７９−５６８８　（１９８１）。

Ｉｃ　Ｈｏｏｐｅｓ　Ｂ、Ｃ０ｅｔ　ＭｃＣｌｕｒｅ　Ｒ，Ｒ，、Ｎｕｃｌ、Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、９゜５４９３−５５０４　（１９８１）。

１５、　Ｄａｇｅｒｔ　Ｍ、　ｅｔ　Ｅｈｒｌｉｃｈ　Ｓ、Ｄ、、　Ｇｅｎｅ、 ２３−２８　（１９７９）。

１６、Ｖｉｅｉｒａ　Ｊ、ｅｔ　Ｍｅｓｓｊ、ｎｇ　Ｊ、、Ｇｅｎｅ　１９，２ ５９−２６８゜１７、Ｓｈｉｍａｔａ）ｃｅ　Ｈ，ｅｔ　Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ　 Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、２９２，１２８−１３２゜（１９８１）。

ＩＬ　Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍｅｒ　Ａ、Ｂ、、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ　Ｓ、ｅｔ　Ｇ ｏｔｔｅｓｍａｎ　Ｍ、。

Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、１５８，３２７−３４６　（１９Ｂ２）。

１９、Ｄａｎｉｅｌｓ　Ｄ、Ｌ、ｅｔ　Ｂｌａｔｔｎｅｒ　Ｆ、Ｒ，、Ｖｊ、ｒ ｏｌｏｇｙ、１１７．８１−９２゜（１９８２）。

２０、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ　Ｐ−、Ｂｅｒｇ　Ｒ，Ａ、、Ｒｅｎｎａｒｄ　Ｓ 、■、、Ｂｒａｄｌｅｙ　Ｋ、Ｈ，。

Ｔｒａｐｎｅｌ］、　Ｂ、Ｃ，ｅｔ　Ｃｒｙｓｔａｌ　Ｒ，Ｇ、（１９８１）、 　ＰｒｏｃｏｌｌａｇｅｎＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｒｏｃｏｌ、１Ｂ ｇｅｎ　ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ　ＲＮＡ　１ｅｖｅｌｓ　ａｎｄａｃｔｉｖｉｔｅ 　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｕｎｇ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ　ｄｕｒｉｎｇ　ｐｅ ｒｉｏｄｓｏｆ　ｒａｐｉｃｌｅ　ａｎｄ　５ｔａｔｉｏｎａｒｙ　ｇｒｏｗｔ ｈ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２５６゜３１３５−３１４０゜ ２１、Ｂｌｏｂｅｌ　Ｇ、ｅｔ　Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ　Ｂ、（１，９７５） 、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、６７゜８５２−８６２゜ ２２、Ｌａｔｈｅ　Ｒ，、Ｈｉｒｔｈ　Ｐ、、Ｄｅ　Ｗｉｌｄｅ　Ｍ、、Ｈａｒ ｔｆｏｒｄ　Ｎ、ｅｔＬｅｃｏｃｑ　Ｊ、Ｐ、（１９８０）、Ｎａｔｕｒｅ　２ ８４，４７３−４７４゜２３、Ｄａｇｅｒｔ　Ｍ、ｅｔ　Ｅｈｒｌｉｃｈ　Ｓ、 Ｄ、（１９７９）Ｇｅｎｅ　６，２３−２８゜２４、Ｋｕｒａｃｈｉ　Ｋ、、Ｃ ｈａｎｄｒａ　Ｔ、、Ｄｅｇｅｎ　Ｓ、Ｊ、Ｆ、、Ｗｈｉｔｅ　Ｔ、Ｔ、。

Ｍａｒｃｈｉ、ｏｒｏ　Ｔ、Ｌ、、　Ｗｏｏ　Ｓ、Ｌ、Ｃ−ｅｔ　Ｄａｖｉｅ　 Ｅ、Ｗ、（］、９８］−）。

Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ−Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７８．６８２６−６８３０゜ ２５、　Ｋｏｈｌｉ　Ｖ、、　Ｂａ１ｌａｎｄ　Ａ、　ｅｔ　Ｌｅｃｏｃｑ　Ｊ 、Ｐ、（１９８２）Ｂｒｅｖｅｔ　ｎ　８２１２１００゜ ２６、　Ｓｕｇｇｓ　Ｓ、Ｖ、、　Ｗａｌｌａｃｅ　Ｒ，Ｂ、、　Ｈｉｒｏｓｅ 　Ｔ、、　Ｋａｗａｓｈｉｍａ　Ｅ、Ｈ。

ｅｔ工ｔａＪｃｕｒａ　Ｋ、（１９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　。

７８．６６１３−６６１７゜ ２７、　Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　Ｈ，Ｃ０ｅｔ　Ｄｏｌｙ　Ｊ、（１９７９）　Ｎｕ ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７゜１５１３−１５２３゜ ２Ｂ、　Ｌｅｉｃｈｔ　Ｍ、　、　Ｌｏｎｇ、　Ｇ、Ｌ、　、　Ｃｈａｎｄｒａ 　Ｔ、　、　Ｋｕｒａｃｈｉ　Ｋ。

Ｋｉｄｄ　Ｖ、Ｊ、、Ｍａｃｅ　Ｍ、Ｊｒ、、Ｄａｖｉｅ　Ｅ、Ｗ、ｅｔ　Ｗｏ ｏ　Ｓ、Ｌ、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ　２９７，６５５−６５９゜２９、　Ｖ ｅｒｂ　Ｚ、　（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１９３．５８９−６０ ５゜３０、Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ、Ｊ　ａｎｄ　Ｓｍ１ｔｈ、Ｍ、（１９８３）　工 ｎ　Ｍｅｔｈｏｄｏ　ｏｆＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１００　ｐｐ　４６ ８−５００゜３１５ｃｈｅｒｅｒ、Ｇ、Ｆ、Ｅ、、Ｗａｌｋｉｎｓｈａｗ、Ｍ、 Ｄ、、Ａｒｎｏｔｔ、Ｓ　ａｎｄＭｏｔｔ５　Ｄ、Ｊ、　（１９８０）　Ｎｕｃ ｌ、Ａｃ１ｄｓ、Ｒｅｓ、　８．３８９５−３９０７．３２、Ｇｏｌｄ、Ｌ、、 Ｐｒｉｂｎｏｗ、Ｄ、、５ｃｈｎｅｉｄｅｒ、Ｔ、、Ｓｈｉｎｅｄｌｉｎｇ。

Ｓ、、Ｓｉｎｇｅｒ、Ｂ、Ｓ、ａｎｄ　Ｓｔｏｒｍｏ、Ｇ、（１９８１）Ａｎｎ 、Ｒｅｖ。

Ｒ／ＬＩＩＩ ｖｕ　ＩＩ ｓｉｇｎａｌ ＡＮＴＩＴＲＹＰ５１’Ｎ訃双１ ソ“〉テ゛：　ＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＧＴＣＣＡ６８− 抽出″ＰｊＪ”９ 特許庁長官殿 （特許庁審査官　殿） １、事件の表示 ２、発明の名称 ３、　補正をする者 事件との関係　出願人 氏名（名称）トランスノエンヌ・ノシェテ・アノニム４、代理人 住所　東京都港区南青山−丁目１番１号委任状 ７、補正の内容 別紙のとおり 竹表昭ＧＯ−５（１０６４８（２２） 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　細菌内の特定の遺伝子のクロー／化の、又は表現のベクターにおいて、少な くとも ａ）細菌プラスミド複製原型 ｂ）バクテリオファージλのプロモーターＰ、、、　Ｐ、又はＰ′Ｒ Ｃ）翻訳開始域 ｄ）独特の制限部位（複数）を包含しているりｏ　−ン化域 を包含していることを特徴とするベクター。 ２　細菌内の特定の遺伝子のクローン化の、又は表現のベクターにおいて、少な くとも ａ）細菌プラスミド複製原型 ｂ）バクテリオファージλのプロモーターＰＬ、ＰＲ又はＰ′Ｒ ｃ）−＋ｃＩＩｒｃｂｓとλＥｒｂｓとの間で選ばれた翻訳開始域、又はバクテ リオファージλのプロモーターの制御下におかれた合成配列 ｄ）独特の制限部位（複数）を包含しているクローン化域 を包含していることを特徴とするベクター。 ３　翻訳開始域がλｃＩＩｒｂＳであることを特徴とする請求の範囲第２項記載 のベクター。 ４　域が配列 の全部又は＝部によって構成しであることを特徴とする請求の範囲第３項記載の ベクター。 −５翻訳開始域が遺伝子λＥの翻訳開始域の全部又は一部によって構成しである ことを特徴とする請求の範囲第２項記載のベクター。 ６　翻訳開始域が下記のものであることを特徴とする請求の範囲第２項記載のベ クター。 ンヤインダルガルノ　配列 ７　翻訳開始域内に位置している独特の制限部位を包含していることを特徴とす る請求の範囲第２乃至６項の一つに記載のベクター。 ８　λｃＩＩｒｂｓの場合において独特の制限部位がＮｄｅＩ部位でるることを 特徴とする請不の範囲゛第７項記載のベクター。 ９　用いられるプロモーターがプロモーターＰＬであることを特徴とする請求の 範囲第１乃至８項の一つに記載のベクター。 １０　そのほかに抗転写終結官能を包含していることを特徴とする請求の範囲第 １乃至９項の一つに記載のベクター。 １１　抗転写終結官能は、プロモーターＰＬ又けＰ８のだめの遺伝子λＮ又はプ ロモーターＰ′Ｒのための遺伝子λＱであることを特徴とする請求の範囲第１０ 項記載のベクター。 １２．　ｐＢＲ３２２の複製原型を包含していることを特徴とする請求の範囲第 １乃至１１項の一つに記載のベクター。 １３、抗生物質に対する耐性にとってコードとなる遺伝子を包含していることを 特徴とする請求の範囲第１乃至１２項の一つに記載のベクター。 １４　アンビンリンに対して耐性のある遺伝子を包含していることを特徴とする 請求の範囲第１３項記載のアノピノリン耐性遺伝子を包含していることを特徴と する請求の範囲第１４項記載のベクター。 １６　クローン化域が指示遺伝子内に位置していることを特徴とする請求の範囲 第１乃至１５項の一つに記載のベクター。 １７　指示遺伝子は１ａｃＺ遺伝子の全部又は一部によって構成しであることを 特徴とする請求の範囲第１６項記載のベクター。 １８　プロモーターはりプレンサーによって制御されることを特徴とする請求の 範囲第１乃至１６項の一つに記載のベクター。 １９　酵素抑制配列は温度上昇によって誘導され得ることを特徴とする請求の範 囲第１８項記載のベクタ２０特定のプロティンについてコート化する遺伝÷を包 含していることを特徴とする請求の範囲第１乃至１９項の一つに記載のベクター 。 ２１、ｐＴＧ９２２ベクタープラスミドならびにその変２２　ヒトのα１抗トリ プンノにとってコードとなる遺伝子全部又は一部を包含していることを特徴とす る請求の範囲第２０及び２１項の一つに記載のベクター。 ２３　α１抗トリブ／ンにとってコードとなる遺伝子の翻訳開始コドンの近くに 下記の構造ＣＡＴＡＴＣ，ＧＡＧＧＡＴＣＣＣＣＡＧＧＣＴＡＴＡＣＴＴＣＣＴ ＡＧＣＧＧＴＣＣを翻訳開始コドンが遺伝子翻訳のだめ同位相（であるように包 含していることを特徴とする請求の範囲第２１項記載のベクター。 ２４、ｐＴＧ９０８及びｐＴＧ９２０ベクタープラスミドならびにそれらの変異 体及び誘導体。 ２５、ｐＴＧ９２９プラスミドであることを特徴とする請求の範囲第２３項記載 のベクター。 ２６　α、抗トリプシンにとってコードとなる遺伝子の翻訳開始コドンの近くに 下記の構造ＡＴＣＣＡＡ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＣＡＡ　ＧＧＣＧＡＴＧＣＴＴＡＣ ＣＴＴ　ＣＴＡ　ＧＧＡ　ＧＴＴ　ＣＣＧＣＴＡＣ；ＧＡを包含していることを 特徴とする請求の範囲第２２項２７、ｐＴｃ９８３プラスミドであることを特徴 とする請求の範囲第２６項記載のベクター。 ２８　特定のプロティンにとってコードとなる遺伝子の、融合してない該プロテ ィンの調製を可能にする　１クローン化の方法において、その遺伝子を制限部位 に　１オイて・請求の範囲第１乃至２１項の一つに記載のベクターの翻訳開始コ ドンを被ってクローン化し、翻訳開始コドンを再構成することを特徴とする方法 。 ２９　特定のプロティンにとってコードとなる遺伝子の、融合した該プロティン の調製を可能にする、クローン化の方法において、翻訳開始配列の下流にある請 求の範囲第１乃至２０項の一つに記載のベクターのクローン化域においてその遺 伝子をクローン化することを特徴とする方法。 ３０　請求の範囲第２８及び２９項の一つに記載の方法を用いて得られるベクタ ー。 ３１　少なくともヒトのα１抗トリブ／ンにとってコートとなる配列の全部又は 一部を包含していることを特徴とするα１−抗トリブ／ンのクローン化の及び表 現のベクター。 ３２　請求の範囲第１乃至２７及び３０及び３１項の一つに記載のベクターを用 いて形質転換した細菌。 ３３　大腸菌の株であることを特徴とする請求の範囲第３２項記載の細菌。 ３４　細菌起源のヒトのα、−抗トリブ／ンの製法ておいて、請求の範囲第３２ 及び３３項の一つに記載の杉゛質転換した細菌を培養基において培養し、該細菌 はヒトのα１抗トリブノンにとってコードとなるＤＮＡの配列の全部又は一部を 包含するベクターによって形質転換しであることを特徴とする方法。 ３５　細菌起源のヒトのα１抗トリプシン。 ３６　医薬としての細菌起源のヒトのα、抗トリブ／／　。 浄書（内容蚤こ変更なし）