KR960007194B1

KR960007194B1 - 재조합 숙주로부터 제조한 아프로티닌 동족체, 그의 발현 벡타 및 재조합 숙주 및 그의 제약상 용도

Info

Publication number: KR960007194B1
Application number: KR1019870007966A
Authority: KR
Inventors: 아우엘스발트 에른스트-아우구스트; 쉬뢰더 베르너; 쉬나벨 에우겐; 브룬스 볼프강; 라인하르트 겔트; 코릭 마이클
Original assignee: 바이엘 악티엔게젤샤프트; 클라우스 데너·귄터 슈마커
Priority date: 1986-03-26
Filing date: 1987-07-22
Publication date: 1996-05-29
Also published as: ATE123301T1; FI94876C; ZA872181B; AU600475B2; FI94876B; EP0238993B1; CA1338309C; JP2537507B2; EP0238993A3; GB2188322A; CN1018793B; CN87102412A; EP0238993A2; FI871288A0; FI871288A; KR950000302B1; DE3751324D1; AU6990187A; KR870009025A; US4894436A

Abstract

내용 없음.

Description

재조합 숙주로부터 제조한 아프로티닌 동족체, 그의 발현 벡타 및 재조합 숙주 및 그의 제약상 용도

제1도는 항상 아프로티닌 완전 유전자의 디자인을 나타냄.

제2a도는 4개 블록(알파, 베타, 감마, 델타)으로 되는 합성 유전자의 구성에 사용되는 올리고뉴틀레오티드의 DNA 서열을 나타냄.

제2b도는 15위치에서 아미노산 변경의 암호가 되는 단편의 DNA 서열을 나타냄.

제3도는 합성 Glu-52-아프로티닌 유전자의 DNA 서열(Eco RI-BamHI, pRK 63.1.1의 부분 서열)을 나타냄.

제4도는 플라스미드 pRK 63.1.1의 구성를 나타냄.

제5도는 플라스미드 pRK 54.1.1의 구성을 나타냄.

제6도는 플라스미드 pRK 48.1.1의 구성을 나타냄.

제7도는 융발될 수 있는 β-갈락토시다제 Glu-52-아프로티닌 융합 단백질과 함께 대장균 단백질의 7.5% SDS-폴리아크릴아미드 겔 결과를 나타냄.

제8도는 환원 조건 하에서 8% SDS-겔에 의해 조사한 HS 2074로부터 β-칼락토시다제 융합 단백질의 단리를 나타냄.

제9도는 β-갈락토시다제로부터 이온교환 크로마토그리피에 의한 Lys¹⁵Glu⁵²-아프로티닌의 분리를 나타냄.

제10도는 분별시킨 Lys¹⁵Glu⁵²-아프로티닌-β-갈락토시다제 융합 단백질의 브롬화 시아노겐 펩티드의 웨스턴 블롯 결과를 나타냄.

제11도는 아프로티닌과 Glu⁵²-아프로티닌의 트립신 억제 작용에 대한 투여-반응 곡선을 나타냄.

제12도는 램리 방법에 의한 Val¹⁵Glu⁵²아프로티닌-β-갈락토시다제 융합 단백질의 8% SDS-폴리아크릴아미드 겔 결과를 나타냄.

제13도는 β-갈락토시다제로부터 이온 교환 크로마토그래피에 으한 Val¹⁵Glu⁵²-아프로티닌의 분리를 나타냄.

본 발명은 아프로티닌 동족체 및 DNA 재조합 기술에 의한 그의 제조 방법에 관한 것이다.

본 명세서에 기재되어 있는 방법에 의하여 화학적으로 합성한 DNA 분자는 신규 폴리펩티드 또는 아미노산서열에 실질적으로 일치하는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA서열 및 아프로티닌 또는 아프로티닌 동족체의 조성물 및 아프로티닌 또는 아프로티닌 동족체의 생물학적 작용을 특징으로 한다.

아프로티닌은 58개의 아미노산으로 구성되어, 트립신, 키모트립신, 플라스민 및 칼리크레인을 억제하는 작용을 갖는 것으로 잘 알려진 펩티드이다. 이것은 소의 기관으로부터 R 채취한 염기성 프로테이나제 억제제로서, Trasylo1

이라 불리우는 예를 들면 과섬유소용해 출혈 및 외상에 의한 출혈 쇼크와 같은 직종 질병 치료용 약품으로서 유용하다.[에이취. 프리쯔(H, Fritz) 및 지·분데러(G. Wunderer)의 Drug. Res. 33권 제 479-494페이지, 1983년 참조].

최근, 15 위치에 리신 대신에 다른 아미노산을 갖는 아프로티닌 동족체가 아프로티닌에 비해서 개선된 효과 및 효력을 갖는 유용한 프로테아제 억제제임이 발견되었다[독일연방공화국 특허 공개제 33 39 693호 및 에이취, 알, 웬젤(H.R. Wenzel) 등의 Chemistry of Peptides and Proteins, 제3권 1985년 참조]. 이 아프로티닌 동족체는 췌장 및 백혈구로부터 생성되는 에라스타제 및 카텝신 G에 대하여 강력한 억제 효과를 갖는다.

이와 같은 아프로티닌 동족체는 췌장 에라스타제의 과도 분비(췌장염), 혈청 에라스타제의 과도 분비(동맥경화증)백혈구 에라스타제의 과도 분비에 관련된 질병, 연4결 조직의 손상에 따른 급성 및 만성 염증, 혈관벽의 손상, 과사병 및 폐조직 퇴화의 치료에 사용될 수 있다. 면역학적 처리로 인한 반응성 염증, 예를 들면, 류머티스성 관절염에서 리소좀 효소, 특히 백혈구 에라스타제에 의해 수행되는 역활 또는 마찬가지로 중요하다.

아프로티닌 및 아프로티닌 동족체는 소의 기관으로부터, 소의 트립신 억제제의 반합성 전환에 의해 얻을 수 있지만[최세, 엠.(Tschesche, M), 벤젤 엠.(Wenzel, M.), 쉬목, 알.(Schmuck, R.), 쉬나벨, 이.(Schnabel, E.)의 1985년 5월 15일자 독일연방공화국 특허 공개 제 33 39 693호 참조], 수율이 비교적 적다.

재조합 DNA에 관한 출원 및 이에 관련된 기술은 양질의 아프로티닌 동족체를 필요한 만큼의 많은 양으로 제공하는 효과적인 방법일 것이라고 여겨져왔다. 그리하여, 숙주 유기체로부터 재조합 DNA 기술의 산물로서 생물학적으로 유효한 아프로티닌 동족체를 제조하는 것이 목표가 되었다.

미생물에서 이종 DNA의 발현 방법은 공지되어 있다.

공지된 아미노산 서열의 폴리펩티드를 코팅하는 DNA는 게놈의 DNA 서열 도는 mRNA에 상보적인 cDNA서열을 사용하거나, 유전코드에 따른 코돈을 선택하여 합성유전자를 제조함으로써 제조할 수 있다.

소의 췌장 트립신 억제제로부터 채취한 소의 게놈 클론의 DNA 서열 중 일부를 에스. 앤더슨(S. Anderson)과 아이, 비, 킹스톤(I. B. Kingston)의 Proc, Natl, Acad, Sci. (미합중국), 제80호, 제6838~6848페이지(1983년)에 기재되어 방법에 의해 클론화하여 BPTI의 게놈 클로을 특징화하였다.

BPTI와 소의 비장 억제제 2를 코딩하는 소의 게놈 큰 분절이 최근 아이. 비. 킹스톤과 에스, 앤더슨에 의해 서열이 밝혀져 발표되었다.(Biochm. J. 제233호, 제443~450 페이지, 1986년 참조).

본 발명의 목적은 아프로티닌 동족체, 이를 암호화하는 헥산, 이 헥산을 혼입시키는 벡타, 이 벡타로 형질전환된 세포 및 아프로티닌 동족체의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적을 위해서는 합성 유전자를 광범위하게 적용될 수 있는, 적합한 디자인으로 제조하기 위한 코돈을 선택하는 것이 가장 유리하다.

특히, 제한 효소의 특정 인식 부위에 의해 종결된 DNA 블록 또는 카셋트를 포함하는 합성 완전 유전자 (symthetic master gene)를 만드는 경우이다. 이와 같은 유전자의 디자인으로, 상기 DNA 블록 내에서 모든DNA 서열이 용이하게 변형 또는 변이될 수 있다.

아프로티닌 동족체는 DNA 재조합 기술에 의해 제조하였다.

본 발명자들은 아프로티닌 동족체, 예를 들면 Val-15-, Ile-15-, Phe-15- 및 Ala-15, Arg-15, Ser-15, Gly-15, Trp-15와 같은 아프로티닌 단독으로 또는 이들의 52위치가 Glu, Leu, Val, Arg 또는 Thr으로 치환된 아프로티닌 동족체는 52 위치에서 Met를 갖고 제조 방법과 함께 개시된 공지의 아프로티닌 및 그이 동족체와 대등하다는 것을 발견하였다. Met-52의 치환으로, 유전공학적으로 융합된 폴리펩티드가 융합된 폴리펩티드 중의 Met에서 브롬화시아노겐에 의해 절단되는 것인 아프로티닌 동족체의 제조가 가능하다.

이와 같은 동족체를 코딩하는 합성DNA, 동족체를 발현하기 위한 구조 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드 및 재조합 플라스미드에 의해 형질 젼환된 대장균을 또한 개시한다.

이하, 아프로티닌 및 아프로티닌 동족체를 코딩하는 DNA 단편의 구축 및 선택 방법을 서술한다.

이와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 결정하기 위해서는 공지된 단백질의 서열 및 아프로티닌 및 아프로티닌 동족체의 유전 코드를 사용하였다.

유전 코드의 축증(degeneracy)으로 인해 일정한 아미노산 서열에 대한 코돈의 선택이 상당히 자유롭게 된다.

이 단백질의 아미노산 서열을 지정하는 코돈 중에서 모든 가능한 염기 치환을 결정함으로써, 가능한 DNA 서열 내에 위치하는 모든 잠재적 제한 부위를 결정하였다.

완전 유전자에 대한 코돈 선택은 다음과 같은 사항을 고려하여 정하였다. 즉, 첫째로 단편간의 지나친 상보성을 피할 수 있도록 코돈과 단편을 선택하고, 단편 조립을 디자인하고, 둘째로, 전사의 조기 종결(premature termination)에 따른 문제를 극복하기 위하여 A-T 염기쌍의 풍부한 부분을 피하고, 세째로, 형질 전환체의 검증을 촉진하거나, 또는 아프로티닌을 용이하게 변이시키고, 구조와 그의 활성 간의 관계를 조사할 수 있도록 적합한 단편을 다른 단편으로 치환하는 것에 의한 염기 치환을 촉진하는데 필요한 제한 부위를 선택하며, 네째로, 대부분의 코돈을 미생물 게놈의 발현에 적합한 것을 선택하였다[에이취. 그로스진(H. Grosjean)과 더불유, 피에스(W. Fiers)의 Gene, 제18호, 제192~209페이지(1982년) 및 엠.고우이(M. Gouy)와 씨. 가우티어(C. Gautier)의 Nucleic Acids Research, 제10권, 제7055~7074페이지(1982년)참조.]

합성 아프로턴 유전자 및 그의 동족체에 대한 주요 디자인은 첨부 도면 제1도에 나타내었다.

제한 엔도뉴클레아제의 인식 부위에 의해 둘러싸인 4개의 블록(즉, a, β, γ, δ)으로 구성된 합성 완전 유전자의 디자인으로 비융합 및 융합 발현을 위한 DNA 서열의 용이한 변형 및 변경(코돈 사용법, 돌연변이, 단백질 공학, 유전자 증폭)도 또한 가능하다.

합성 유전자를 다음과 같이 제조하였다.

아프로티닌 및 아프로티닌 동족체의 합서 유전자들을 겹침 말단부를 갖는 15개의 정체 올리고뉴클 레도티드를 조립하여 완전 유전자를 구성하는 것을 통해서 제조하였다(제1도 참조). 이 구성은 2단계로 하였다. 첫째로 A부분에 대해서 DNA 단편 1,2,3,4 및 6을, B부분에 대히셔 DNA 단편 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 및 16을 혼성, 결찰 및 정제하여 유전자의 A부분 및 B 부분을 얻었다(제2도). 둘째로, 유전자의 A부분과 B부분을 결찰 및 정제시켰다. 이하, 상기 구성에 사용되는 물질 및 방법을 서술한다. 완전 유전자의 DNA 서열은 첨부 도면 제3도에 나타내었다. 이것은 개시 코돈 ATG, 2개의 종결 코돈 TAG 및 TAA, Eco Rl의 5'말단 제한 부위 및 Hind Ⅲ 및 Bam HI의 3' 말단 제한 부위와, Apa I, Stu I, Sac II(Sst II)의 내부 제한 부위를 포함한다. 이들 부위, 특히 내부 부위는 암호화 서열의 클론화, 또는 아미노산을 코딩하거나 또다른 코돈 용법을 갖는 DNA 단편의 교환에 의한 완전 유전자의 변이를 촉진시킨다. 유전자의 증폭은 적당한 연결자 서열을 첨가함으로써 쉽게 행할 수 있다. 이와 같은 구성을 사용하여, 모든 스펙트럼의 단백질 공학이 가능하다.

아프로티닌 동족체의 유전자를 구성하기 위해서는 적당한 DNA 서열을 갖는 제한 단편만을 교환하여야 한다. 이와 같이, 15위치 및 52 위치에서의 아미노산 변이를 코딩하는 단편의 서열을 첨부 도면 제2b도에 나타내었다.

재조합 플라스미드는 다음과 같이 구축하였다.

실험용 아프로티닌 클론화를 위해 선택된 플라스미스는 pUC8이었다[제이. 피라(J. Vieira)와 제이. 메싱(J.Messing)의 Gene, 제19호, 제259페이지(1982년)참조]. 이 클로닝 벡타는 pBR 322에서 유래된 암피실리나제유전자, 및 일련의 독특한 제한 효소 인식 부위를 갖는 lac Z 유전자의 일부에 결찰된 DNA 복제의 원점으로 구성된다. 이 벡타를 lac 대장균에 도입하는 경우에, 형질 전환체는 적당한 지시 플레이트(indicator plate)상에서 청색 콜로니를 생성시킨다. DNA 단편을 다수의 제한 부위 중 어느 하나, 예를 들면 Eco RI와 Bam HI 사이에 클론화시키면, lac 유전자가 비활성으로 되어 백색 집락으로 나타난다. 플라스미스 pUC8은 현재 피-엘 바이오케미칼스(P-L Biochemicals)에서 시판되고 있다.

발현 플라스미스는 다음과 같이 구성하였다.

아프로티닌 및 아프로티닌 동족체를 융합 단백질로서 발현하기 위해서는 유. 뤼터(U. Ruther)와 비. 뮐러-힐(B. Muller-Hill)의 EMBO Journal, 제2호, 제1791~1794페이지(1983년)에 기재되어 있는 실험과 유사한 실험으로 나타난 바와 같이, 플라스미드를 적당한 유전자가 β-갈락토시다제 유전자의 카르복시 말단과 융합되도록 구성하였다. 모체 플라스미드 pUR278은 lac Z 유전자의 3' 말단에 단일 클로닝 부위, 즉 Bam HI, Sal I, Pst I, XbaI 및 Hind III을 갖는다(독일연방공화국 특허 출원 제 3 309 501.9호 참조). 암호와 DNA 서열을 적당한 클로닝 부위 및 올바른 판독 프레임에 삽입하면 DNA에 의해 암호화된 펩티와 함께 활성 β-갈락토시다제가 결합된 융합 단백질이 생성된다.

아프로티닌 및 아프로티닌 동족체의 합성 유전자를 발현 벡타에 클로닝시키기 위해서는 발현 벡타 pUR278의 제한 부위 Bam HI 및 Hind III을 선택하였다. 그러므로, 유전자의 5'Eco RI 말단에 Bam HI 부위를 첨가하고, 3' 말단에 Hind III 부위를 첨가하여 아프로티닌 유전자를 변형시켜야만 했다(제6도 참조).

본 발명에서는, 다음과 같은 표준 물질 및 DNA 재조합 방법을 사용하였다.

본 명세서에 기재한 합성 유전자, 재조합 프라스미드 및 이와 같은 유전자를 갖는 발현 벡타는 하기한 물질 및 방법을 사용하여 제조 및 특징지울 수 있다.

[물질]

[효 소]

폴리뉴클레오티드-키나제(PNK), 5.5단위/㎕;Boehringer-Mannheim Nr. 633 542 DNA 폴리머라제;Klenow, Boehringer Mannheim Nr. 104 523 T4 DNA 리가제, 0.9 단위/㎕;Boehringer-Mannheim Nr. 481 220 제한 효소는 베쎄스다 랩스(Bethesda Research Labs), 보에링거 만하임(Boehringer Mannheim), 바이오랩스(BioLabs)로부터 구입하였다.

송아지 장의 알칼리성 포스파타제(CIP):보에링거 만하임 제품 리소자임;RNase A:보에링거 만하임 제품.

[시 약]

감마 32 P ATP;Amersham Nr. PB 10168, 알파P-dTTP;Amersham 167, ATP;Sigma Nr. A-6144, 비스 아크릴아미드;Serva 29195, 아크릴 아미드;Serva 및 Bio-Rad 161-0103, TEMED : Serva 35925, 과황산암모늄;Serva 13375, 우레아;BRL 초순도의 5505 UA, DE 52(미리 팽윤시킨 디에틸아미노에틸 셀룰로오스);Whatman, Cat, 4057-050, DTE:Serva 20697, 이소프로필-β-D-티오갈락토시드(IPTG);Sigma I 5502, 5-브로모-4-클로로-인돌릴-β-D-갈락토시드 (X gal);Boehringer 651745, N,N'-디메틸포름아미드;Merck 2 203 034, EGTA, 사카로오스;BRL 5503 UA, 디아미노피멜리산;Sigma D 1377, M 13-디데옥시뉴클레오티드 서열 결정 시스템;미합중국, 매사추세츠, 베버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Bioalbs) 제 408호, 2409호, 클로로포름, 이소아밀알코올, 티미딘;Serva 18600, 글로코오스 D (+);Merck 8337, 트리스;Merck 8382, 수산화칼륨;Merck 5033, 염화칼슘;Merck 2382, 염화루비늄;Sigma R 2252, 염화 망간;Sigma M 3634, DMSO;Sigma D 5879, EDTA 아세트산 칼륨, SDS.

[DNA]

플라스미드 pRK 8;Pharmacia P-L Bilochemicals 27-4916-χχ, Bam HI 연결자.

[배지 및 항생 물질]

박토-트립톤;Difco 0123-01, 박토-효모-추출물;Difco 0127-01, 박토-한천;0140-01, LB-배지(1ℓ용)박토-트립톤 10g, 박토-효모-추출물 5g, NaCl 10g, NaOH를 사용하여 pH 7.5로 조절, 카파 1776-배지;(1ℓ용)박토-트립톤 25g, 박토-효모-추출물7.5g, IM 트리스-HCI(pH 7.5)20㎖, 약950㎖를 고압솥중에서 처리한 후, 냉각시키고, 여기에 멸균 IM MgCl₂5㎖, 1% 디아미노피멜린산 10㎖, 0.4% 티미딘 10㎖,20% 글로코오스 25㎖를 첨가하였다. YT-배지;(1ℓ용) 박토-트립톤 8g, 박토-효모-추출물 5g, NaCl 5g, 한천 플레이트는 박토-한천 15g을 적당한 배지 1ℓ에 첨가하여 제조하였다. 지시 플레이트;1.5% 한천을 첨가하여 고압솥 중에서 처리한 YT-배지 1ℓ에 0.1MIPTG 2㎖, N,N'-디메틸포름아미드 중의 2% X-gal 2㎖와 100㎎/㎖ 암피실린 2㎖ 용액을 첨가하였음.

[항생물질]

클로람페니콜;Boehringer Mannheim 634 433, 암피실린 : Serva 13397, 테트라시클린 : Serva 35865.

[완충제 및 용액]

물 중의 20μM ATP, 물 중의 10mM ATP, 10X PNK-혼합물 : 0.5M 트리스-HCI(pH 7.6) ;0.1IM MgCI₂;50mM DTE;1mM EDTA, 10X 리가제-혼합물 ; 0.5M 트리스-HCI(pH 7.4) ;0.1IM MgCI₂;0.1M DTE;10mM ATP, 10X SP-50 ; 100mM 트리스 -HCI(pH 7.5) ;100mM MgCI₂;500mM NaCI;10mM DTT, 10X SP-100; 100mM 트리스-HCI(pH 7.5) :100mM MgCI₂;IM NaCI ;10mM DTT, 10X SP-0 : 100mM 트리스-HCI(pH 7.5) ;100mM MgCI₂;10mM DTT, IM TBE : IM 트리스:0.83 M 붕산;100mM EDTA;pH 8.3, 3X 포름아미드 염료 혼합물;70% 포롬아미드;20% 글리세롤;1mM EDTA; 0.33㎎/㎖ 브롬페놀 블루;0.66㎎/㎖ 크실렌시아놀FE;0.66㎎/㎖, 오렌지 G, 20X E-완충제 : 0.8M 트리스;0.4M 아세트산나트륨;40mm EDTA;pH 8.3, 10X CIP-완충제 : 0.5M 트리스-HCI(pH 9.0) ;10mM MgCI₂;1mM ZnCl₂10nM 스페르미딘, 형질전환 완충제 : 사카로오스 15g, 3.5M KOH 1㎖, IM CaCI₂1㎖, 5.0M RbCI 2㎖를 물을 첨가하여 50㎖로 만들고, 10% 아세트산을 첨가하여 pH 6.2로 조절한 후, 4.5M MnCl₂1㎖를 첨가하고, 10% 아세트산을 첨가하여 pH 5.8로 조절한 다음, 물로 100㎖까지 채운 후 멸균 여과시켜서 제조하였다.

TE 완충제 : 10mM 트리스-HCI(pH 8.0), 0.1mM EDTA, 10X NT-완충제, 리소자임 혼합물 : 50mM 글루코오스, 1mM EDTA, 10mM 트리스-HCI(pH 8.0), 페놀/세바그 : 80%페놀 1부피와 세바그(클로로포름 :이소아밀알 코올, 24 : 1) 1부피의 혼합물.

[표준방법]

DNA 재조합 작업을 한 표준 방법은 미합중국, 콜드 스프링 하버(Cold Spring Harbor)의 콜드 스프링 하버 연구소가 출간한 마니아티스(Maniatis)등의 Molecular Cloning(1982년)에 기재되어 있는 방법을 하기한 바와 같이, 몇개의 수정을 가하여 사용하였다.

[표준에탄올 침전법]

DNA 펠릿을 용해시키거나, 용액을 0.3M 아세트산나트륨 조절하고, 여기에 에탄올 2부피부를 첨가한 후, -70℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 원심분리시켰다. 이 펠릿을 80% 에탄올로 2회 세척한 후, 진공 하에서 건조시켰다.

[표준 페논 추출법]

용액을 페놀/세바그(1 : 1 부피비)와 완전히 혼합시키고, 원심 분리시킨 후, 페놀상을 완충제 또는 물 1/10부피를 사용해서 재추출시키고, 수용액상을 모았다.

[폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후 DNA 단편의 표준 단리법]

작은 DNA 단편(최대로 250개의 뉴클레오티드를 가짐)을 겔 전기영동에 의해 분리한 후, 자동 방사선 사진술(antoradiography) 또는 UV광선에 의해 띠를 가시화 하였다[미리 피복시킨 TLO 플레이트 Silgur-25, 매체리-니겔 앤드 코. (Macherey-Nagel & Co.)제품]. 띠를 분할하고, 실리콘화 유리 막대로 갈아서 빻은 후, 42℃에서 TE-완충액(pH 8.0) 약 400㎕로 18시간 동안 용출시켰다. 이 물질을 원심 분리시키고, 펠릿을 42℃에서 4시간 동안 재용출시킨 후, 원심분리 시켰다. 2개의 상징액을 합하여, 작은 DE-52 패스터 피렛 컬럼 상에서 IM TEABC완충액을 첨가하여 음이온-교환-크로마토그래피에 의해 정제시켰다. 이것을 동결 건조시킨 후, DNA를 용해 시키고, 물 중에서 2회 동결건조시켰다.

[표준 결찰법]

표준 결찰법(벡타 보다 작은편)에서는 벡타 : 단편을 1 : 5의 몰비로 사용하였다. 최종 DNA농도는 25㎍/㎕이었다. DNA를 소량의 TE 완충액 중에 용해시키고, 여기에 10X-리가제 혼합물, T4 DNA 리가제를 첨가한후 1X 리가제 혼합물농도(50mM 트리스-HCI(pH 7.4), 10mM MgCl₂, 10mM DTE, 1mM ATP : 표준 부피30㎕)로 조절하였다. 반응은 14℃에서 16시간 동안 행하였다.

[DNA 단편의 표준 5' 표지화법]

포스포릴기를 제거한 DNA(최종 농도 약 0.2μM)를 키나제 완충액 I (50mM 트리스-HCI(pH 7.6, 10mM MgCl₂5nMDTE, 0.1mM EDTA)중에 용해시켰다. 여기에 감마 32 P ATP(3000 Ci/mmol)를 비표지ATP와 함께 첨가하였다. ATP의 최종 농도는 항상1μM 보다 크게 하였다. 반응은 단위 정의에 대해 산정한 폴리뉴클레오티드 키나제의 500~1000배 과량과 DNA 농도를 사용하여 37℃에서 30분 동안 행하였다. 페놀 추출을 위하여 반응을 정지시켰다. DNA를 에탄올로 석출시킨 후, 세척 및 건조시켰다.

[표준 제한 엔도큐클레아제 절단법]

제한 엔도튜클레아제 절단은 주로 제작자의 매뉴얼에 따라 행하였다. 정제 염 유리 DNA를 완충액(사용한 효소에 대하여 각각 SP-0, SP-50 또는 SP-100)중에 용해시킨후, 효소 적당량을 첨가하여 절단시켰다. 최종적으로 물질을 페놀을 사용해서 추출시키고, 에탄올로 석출시켰다.

[아가로오스 겔 전기 영동 후 DNA 단편의 표준 단리법]

DNA단편을 아가로오스 겔 전기영동(티, 마니아티스 등의 Molecular Cloning, 1982년, 콜드 스프링 하버 연구소에서 출간)에 의해 분리시킨 후, 브롬화 에티듐으로 염색하고, 장파장 UV 광선 하에서 절단하였다. 조각들을 투석 백에 넣고, 0.5X E-완충액(완충액 : 겔 조각 부피비 1.5 : 1)으로 완충액으로 충분히 에워싸야 한다. 백을 기포를 제거하여 밀봉한 후, 0.5X E-완충액으로 충전시킨 전기영동 챔저에 넣었다. 전기영동을 200V에서 30분 동안 행한 후, 전류의 극성을 30초 동안 역전시켜서 투석 백의 벽면으로부터DNA를 분리시켰다. 완충액으로 에어싼 겔 조각을 조심스럽게 제거하여 DEAE 셀룰로오스 또는 DE 52 컬럼(상기 참조)상에서 추가로 정제시켰다.

[DNA 표준 포스포릴기 제거법]

완전히 절단하여 정제시킨 DNA를 물 중에 용해시킨 후, 1X CIP-완충액(표준 총 부피48㎕)농도를 조절하였다. 37℃에서 송아지 장의 포스파타제(CIP) 1㎕(20단위)를 첨가하여 반응을 개시시키고, 30분 후 다시 CIP 1㎕를 첨가하였다. 1시간 후 50mM EGTA 5㎕를 첨가하고, 65℃에서 10분 동안 인큐베이션 시킴으로써 반응을 정지시켰다. 블런트(blunt end) 말단부 또는 오목한 (recessed) 5' 말단을 갖는 DNA의 포스포릴기를 제거하기 위하여, 37℃에서 15분 동안 각각 반복하여 인큐베이션 시켰다. 이 DNA를 페놀/세바그를 사용하여 추출시키고, 에탄올로 석출시켰다.

[자동방사선 사진법]

필름 : AGFA-Gevaert, Curix RP I, 100 AFW, Kodak XAR 5, 165 1512; X-레이 현상액 : AGFA G153, Kodak LX24;X-레이 정착액 : AGFA G353, Kodak AL4.

[표준 형질전환법]

형질전환은 디. 하나한(D.Hanahan)의 방법(J. Mol. Biol., 제166호, 제557-508페지지, 1980년 참조)을 사용하여 행하였다.

단일 클로니로 접종시켜서 카파 1776배지 중에서 생장시킨 (37℃, 200upm의 진탕기)숙주 균주의 20㎖ 철야 배양물 1㎖를 미리 가온시킨(37℃)카파 1776 배지 100㎖ 를 접송시키는 데 사용하였다.

이 배양물을 동일한 조건하에서 배양시켰다. 세포 생장을 0.2 OD 500nm에서 정지시켰다. 이것은 4℃까지 냉각 시키고, 원심분리시킨 후, 세포 펠릿을 빙냉 형질전환 완충액 20㎖ 중에서 충분히 재현탁시키고, 0℃에서 5분 동안 인큐베이션 시켰다. 이 현탄액을 다시 원심불리(3000 rpm, 4℃, 15분)시키고, 빙냉 형질전환 완충액 4㎖중에 재현탁시켰다. 부분 표본 200㎕에 DMSO 7㎕를 첨가한 후, 세포를 빙수 중에서 15분 내지 60분 동안 더 인큐베이션시켰다. 이 컴피텐트세포(compent cell)의 부분 표본에 TE 20㎕중에 용해시킨 DNA를 첨가한 후, 혼합물을 빙수 중에서 20분, 42℃에서 3분 동안 인큐베이션 시켰다. 미리 가온시킨(37℃) 카파 1776 배지 1㎖를 상기 부분 표본으로 접종시키고, 37℃에서 1시간동안 배양시켰다. 형질전환체를 평판 배양하기 위하여, 세포를 회전 침전(3000 rpm, 15분, 4℃)시키고, YT 배지 중에 재현탁시킨 후, 지시 플레이트에 평판배양하였다. 형질전환체의 기대수에 따라 일정량의 현탁액을 평판배양에 사용하였다.

[표준 신속 분석 플라스미드 단리법]

이 처리는 버어보임(Birnboin)과 돌리(Doly)의 방법(1979년)(또한, 티. 마니아티스 등의, 1982년 참조)을 변형한 것이다. 분석하고자 하는 형질전환체 각각으로부터 철야 배양물 2㎖를 제조하였다.(목재 투스 픽(wooden tooth pick), 37℃, 16시간, 회전 바퀴). 철양 배양물 0.5㎖를 1200g의 속도로 1분 동안 원심분리시켰다(Eppendorf 원심분리기), 펠릿을 새로 제조한 리소자임 혼합물 ㎖당 리소자임 2㎎의용액 중에 다시 용해시킨 후, 20℃에서 5분 동안 인큐베이션 시켰다. 시료에 새로 제조한 1% SDS 함유하는 빙냉 0.2M NaOH를 첨가 한 후 5분 동안 얼음 상에서 인큐베이션 시켰다. 염색체 DNA와 단백질을 침전시키기 위하여 빙냉 아세트산칼륨(pH 4.8) 150㎕를 첨가하였다. 이것을 0℃에서 5분 동안 인큐베이션시키고, 12000g의 속도로 10분 동안 원심분리시킨 후, 상징액을 함유하는 플라스미드를 새로운 시험관에 옮겨서, 클로로포름/이소아밀알코올(24 : 1)을 사용해서 추출시켰다. 수용액상에 이소프로판올 500㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 -20℃에서 30분 동안 인큐베이션 시켰다. 이것을 원심분리(10분, 12000g)시킨 후, 침강물을 80% 에탄올로 세척하고, 진공 중에서 간단히 건조시켰다. 이 물질은 겔 전기영동에 의한 5 내지 6개의 상이한 제한 분석에 충분하다.

폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용한 올리고뉴클레오티드의 표준 정제법

올리고뉴클레오티드(약 20 OD 260nm)를 완충시킨 포름아미드(0.1 IM TBE)에 용해시킨 후, 7M 우레아, 20% 폴리 아크릴아미드 겔 상에서 전기영동적으로 분리하였다[맥삼(Maxam)과 길버트(Gilbert)의 Meth. Enzymol, 제 65권, 500~560페이지, 1980년 참조]. 겔을 형광처리한 박충판 상에 놓고, UV 광선을 사용하여 DNA를 가시화 하였다. 단리 및 정제는 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동 후 DNA의 표준 단리법(상기 참조)에 명시한 방법으로 행하였다. 이 처리의 질은 감마 32 P ATP를 사용한 분석적 5' 포스포릴화 및 폴리아클리아미드 겔 전기영동에 의해 일정하게 조사하였다.

β-갈락토시다제 Lys-15-Glu-52-아프로티닌 융합 단백질로부터 Glu-52-아프로티닌을 제조하는 방법

다수의 단백질을 세균 축적물 중에서 불용성 형태로 다량 합성하였다[디. 씨. 윌리암스(D. C. Williams), 알. 엠 반 프랭크(R. M Frank), 제이. 비. 버넷(J. B. Burnet), 더블유. 엘. 무쓰(W. L. Muth)의 Science, 제215호, 제687페이지(1982년)참조]. 이 불용성 단백질을 봉입체(inclusion body)라 부른다. 이것은 대개 변성제를 용해서만 용해될 수 있으므로, 다른 세포 단백질로부터 사용이하게 정제시킬 수 있다.

대장균 RRI 델타 M15(ATCC 제35102호)를 플라스미드 pRK 48. 1. 1을 사용하여 형질전환시켰는데, 이 플라스미드는 대장균 촉진 유전자, 작동 유전자 및 리보솜 결합 부위의 하류로 Glu-52-아프로티닌 β-갈락토시다제 유전자르 암호화한다.

15-Glu-52-아프로티닌 β-갈락토시다제 융합 단백질의 최대 축적도는 전체 세포 단백질의20% 이었다. 봉입체는 일반적으로 극(polar)또는 부극(sub-polar)영역에 위치해 있고, 대부분의 백분율을 차지하는 정상 길이(normal-length) 세포는 각 극부근에 하나의 봉입체를 갖는다.

대장균 RRI 델타 M15 철야 배양물을 원심분리시키고, 이어서 펠릿을 브래이킹(breaking) 완충액 중에 현탁시켰다. 이것을 초음파 처리한 후, 세포 용해물을 원심분리하여 봉입체를 회수하였다. 봉입체를 2M 염산 구아니디늄으로 세척하였다. 정제 단계는 유. 케이. 램리(U. K. Laemmle)의 방법(Nature 제277호, 제680~685페이지, 1970년 참조)에 따라 SDS- 폴리아클리아미드 겔 전기영동에 의해 조사하였다.

완전한 Lys-15-Glu-52-아프로티닌을 회수하기 위해서는, 봉입 체를 용해시키고, 브롬화시아노겐에 의해 분열시키고, 폴딩(folding) 되지 않은 Glu-52-아프로티닌을 폴딩시켜야 한다.

봉입체는 DTT 충분량을 함유하는 6M 염산 구아니디늄 중에 용해시킬 수 있었다. 비용해 부분을 분리한 후, 융합 단백질을 10mM 메르캅토에탄올을 함유하는 물에 대하여 투석하여 석출 시켰다. 축축한 융합 단백질을 70% 포름산 중에 용해시킨후, 그로쓰(E. Gross)의 방법[이. 그로쓰. 비. 윗콥(B. Witkop)의 Amer, Chem, Soc, 제 183호, 제 1510~1511페이지 1961년 참조]에 따라 브롬화시아노겐에 의해 분열시켰다.

β-갈락토시다제의 브롬화시아노겐 단편으로부터 Glu-52-아프로티닌을 이온교환 크로마토그래피에 의해 분리시킴과 동시에, 크라이톤(T. E. Creighton)의 방법(Proceedings of Genex-UCLA Symposium 1985년, 킹스톤, 발행 중)에 의해 다시 폴딩시켰다(제9도 참조). 활성 억제제는 웨스턴 블롯(Western blot)분석에 의해 검출할 수 있었다(제10도 참조). 활성 분획물을 증발 농축시키고, 이어서 0.1M NH₄HCO₃에 대하여 투석하였다. 이것을 동결 건조시킨 후, 억제제를 고 기공 RP-18 컬럼 상에서 완충액 A중의 0.1% TFA, 완충액 B중의 0.1% TFA 60% CH₃CN의 구배로 HPLC에 의해 정제 시켰다.

활성 분획물을 꺼내어, 억제제를 가스상 서열제를 사용하여 헤윅(R. M. Hewick)의 방법[알. 엠. 헤윅, 엠. 더블유, 헌카필러(M. W. Henkapiller), 엘. 이. 후드(L. E. Hood), 더블유, 다이, 드레어(W. I. Dreyer)의 J. Biol, Chem. 제256호, 제7990~7997페이지, 1981년 참조]에 따라 미세서열화에 의해 특징지웠다. N-달단으로부터 처음 20개 잔기는 예상 억제제와 동일하다(하기 표 2참조). 아미노산 분석 결과, 억제제는 목적하는 아미노산 조성을 가짐이 증명되었다(하기 표 1참조)

아프로티닌과 Glu-52-아프로티닌을 트립신 억제 작용에 의해 비교한 결과 동일한 투여-반응 곡선을 나타낸다(제11도 참조).

이들 실험은 모두 Glu-52-아프로티닌을 대장균에서 융합 단백지로서 제조하고, 재변성 조건 하에서 분열 및 분리시킨 후, 단리시킬 수 있음을 나타낸다.

[Val-15-Glu-52-아프로티닌 및 기타 아프로티닌 유도체의 제조법]

Val-15-Glu-52-아프로티닌 β-갈락토시다제 융합 단백질로부터 상기 Glu-52-아프로티닌에 대하여 기재한 방법과 유사한 방법으로 제조할 수 있다(제12도, 제13도 참조). 이것을 엘라스타제 억제 분석에 의해 억제 작용을 측정하였다.

억제제는 아미노산 분석 및 N-말단 서열화에 의해 특징지었다.(표 1 및 2 참조).

기타 아프로티닌 유도체는 모두 상기 Glu-52-아프로티닌 및 Val-15-Glu-52-아프로티닌에 대하여 기재한 방법과 유사한 방법으로 제조할 수 있었다.

아프로티닌, Glu-52-아프로티닌 및 Val-15-Glu-52-아프로티닌의 아미노산 분석

[표 1]

아미노산을 0-프탈알데히드를 사용하여, 후 컬럼 유도화 후 측정하였다. Cys Pro는 측넝되지 않았다.

[표 2]

Glu-52 및 Val-15-아프로티닌(N-말단)의 아미노산 서열화

아프로티닌/Glu-52-아프로티닌을 비교함

BrCN을 사용하여 분열시킨 후 얻은 Glu-52-아프로티닌을 그의 포르신 트립신에 대한 억제 작용을 진정제 아프로틴과 비교하였다. 기질 Pyrglu-Gly-Arg-pNA와 벤조일-Arg-pNa를 모두 트립신 측정에 사용하였다.

아프로티닌 원액 1㎍/㎖을 제조하고, Glu-52-아프로티닌 원액 0.6㎍/㎖를 제조하였다. 이 원액 중 0-100-200-300-400-500㎍를 벤졸-Arg-pNA과 함께 시험에 사용하였다. Pyrglu-Gly-Arg-pNA를 사용한 시험에서는 0-3-6-9-12-15

㎕를 사용하였다. 그 결과는 하기 표3에 요약하였다.

[표 3]

이들 결과로써, 아프로티닌과 Glu-52-아프로티닌은 두 트립신 억제분석에서 동일한 투여-반응 곡선을 나타냄을 알 수 있다. 이것은 Glu-52-아프로티닌이 실제로 100% 활성 분자를 함유한다는 사실 뿐만 아니라, 트립신-억제제 복합체의 평형 상수가 동일한 수치 순서를 나타냄을 증명한다.

[웨스턴 블롯팅법]

웨스턴 블롯팅은 에이취 토우빈(H. Towbin), 티. 스태헬린(T. Staehelin)과 아이. 골든(I. Gordon)의 Proc. Natl. Acad, Sci, (미합중국), 제76호, 제4350~4354페이지(1979년)에 기재되어 있는 방법으로 행하였다. 니트로셀룰로오스 블롯을 1차로 토끼의 폴리클론 항-아프로티닌 항체를 사용하여 시험하고, 2차 항체로서 비오티닐화 당나귀 항 토끼 항체를 사용하여 시험하였다. 면역 복합체의 검출은 공급체의 매뉴얼(AMERSHAM BUCHLER, braunschweig)에 기재되어 있는 방법으로, 기질로서 스트렙트아비딘-비오티닐화 양고추냉이 퍼옥시다제와 4-클로로-1-니프톨의복합체를 사용하여 행하였다.

[ELISA법]

고상 효소 연결 면역 흡수체 분석(ELISA)은 더블유, 뮐러-에스테롤(W. Muller-Estel), 에이, 외틀(A. Oettle), 이. 트루샤이트(E. Truscheit), 에이취. 프리쯔(H. Fritz)의 Fresenius Z. Anal. Chem. (1984년), 제317호, 제718~719페이지에 기재되어 있는 방법으로, 마이크로타이터 항체플레이트를 사용하여 경쟁 방식으로 행하였다.

[아미노산 서열 결정법]

단백질 약 0.5~2nmol을 TFA 30㎕중에 용해시켰다. 시료를 폴리브렌 3㎎으로 전처리한 유리 섬유 필터에 넣었다. 서열 분석은 알. 엠. 헤웍, 엠. 더블유. 헌카필러, 엘. 이. 후드, 더블유. 드레거의 I. Biol, Chem, 제256호, 제7990~7997페이지(1981년)에 기재되어 있는 방법에 따라, 어플라이드 바이오시스템사(APPLIED BIOSYSTEMS, 미합중국)에서 시판하고 있는 가스상 단백질 서열기에 의해 행하였다. 단계적으로 유리된 아미노산 페닐티오히단토인 유도체를 시아노-HPLC 컬럼[듀퐁(DU PONT)제품]와 케이. 베이로이터(K.Beyreuther), 비. 비슬러(B. Biesler), 제이. 보벤스(J. Bowens), 알. 딜드롭(R. Dildrop), 케이. 네우퍼(K. Neufer), 케이. 스튀버(K. Stuber), 에스. 자이스(S. Zais), 케이 네우퍼(K.Neufer), 케어.스튀브(K.Stuber),에이 자이스(S.Zais), 케이 네우퍼(K.Neufer), 케이.스튀버(K.Stuber), 에이 자이스(S.Zais), 알. 에링그(R. Ehring), 피. 자벨(P. Zabel)의 Modern Methods in Protein Chemistry(1983년), 제303~325페이지[베를링 소재의 발터 드 그루이터 엔드 코. (Walter de Gruyter & Co.)출간]에 기재되어 있는 분리 시스템을 사용하여 분석하였다. M 510 펌프, WISP 710B 자동주입기, LC-분광측광기 M 481과 SHIMADZU 적분기 C-R3A를 포함하는 WATERS HPLC 시스템을 사용하였다.

[산 가스분해 및 아미노산 분석법]

단백질 약 1nmol을 파이렉스관 내에 넣고, 여기에 0.05% 2-메르캅토에탄올을 함유하는 일정하게 비등하는 6M HCI 200㎕를 첨가하였다.[아이. 티. 폿쯔 제이 알.(I.T. Potts Jr.), Anal. Biochem, 제131호, 제1~15페이지. 1969년 참조]. 관을 진공하에서 밀봉하고, 110℃에서 22시간 동안 인큐베이션시켰다. 가수분해물을 재빨리 건조시키고, 0.2M 시트르산 나트륨 완충액(pH 2.2)150㎕중에 재용해시킨 후, 여과시켰다. 아미노산 분석은 형광 검출기와 SHIMADZU C-R2AX 적분기를 장치한 BIOTRONIK LC 5000 아미노산 분석기를 사용하여 행하였다. 아미노산은 본질적으로 제이. 알. 벤슨(J. R. Benson), 피. 이. 헤이(P. E. Hare)의 Proc. Natl. Acad. SCI, (미합중국) 제72호, 제619~622페이지(1975년)에 기재되어 있는 방법에 의하여 0-프탈디알데히드와 반응시킨 후, 정량하였다.

[표준 백혈구 엘리스타제 분석법]

[물질]

인체의 백혈구 엘라스타제는 미합중국, 미시시피주 63069, 퍼시픽, 피. 오. 박스 147 소재의 엘라스틴 프로덕츠 컴파니, 인크. (Elastin Products Company, Inc.)로부터 구입하였다.

메톡시숙시닐-L -알라닐-L -알라닐-L - 프롤릴-L -발린-P-니트로아닐리드[케이. 나까지마(K. Nakajima), 제이. 씨. 파우어스(J. C. Powers), 엠. 제이. 카스틸로(M. J. Castillo), 비. 엠. 애쉬(B. M. Ashe)와 엠. 짐메르만(M. Zimmermann)의 J. Biol, Chem. 제254호, 제4027페이지(1979년)참조]는 스위스 연방, 부벤도르프 씨 에이취-4416, 하우프트스트르, 144 소재의 파. 바켐, 파인케미칼린 에이쥐(Fa. Bachem, Feincemikalien AG)로부터 구입하였다.

[방법]

0.05% Tween 80을 함유하는 0.2M 트리스-완충액(pH 8.0) 및 염화칼슘 중의 0.05m 트리스-완충액과 억제제 용액의 혼합물 550㎖에 50% 에틸렌글리콜 100㎖중에 용해시킨 효소 1㎎의 용액 5㎕를 첨가하였다. 이 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션시켰다. 여기에 디메틸술폭시드 1㎖중에 용해시킨 메톡시숙시닐-L-알라닐-L -알라닐-L - 프롤릴-L -발린-P-니트로아닐리드 59㎎의 용액 6.5㎕와 시험 완충액의 혼합물 100㎕를 교반시키면서 첨가하였다. 405nm에서 광학 밀도의 증가를 기록하고, 억제율을 시료화 효소 대조물을 함유하는 억제제의 광학 밀도 증가 계수를 100으로 곱하여 측정하였다.

[트립신의 억제(분석법)]

트립신의 억제는 기질 벤조일-DL-아르기니-P-닌트로아닐리드(Merck 1670) 또는 피로글루타밀-글리실-아르기닌-P-니트로아닐 리드[이것은 현재 시판중인 피로글루타민-글리신(SENN 6886)과 아르기닌-P-니트로아닐리드 x HBr(SENN 9123)로부터 디시클로헥실 카르보디이미드 축합법에 의해 합성하였음]에 의해 측정하였다. 이 기질은 또한 KABI에서 S-2444의 상표로 우로키나제 기질로서 판매되고 있다.

전자는 시료 중 아프로티닌의 양에 대하여 선형 반응을 나타낸다는 잇점을 가지고 있으나, 감도가 낮다. 후자는 높은 감도를 가지나, 아프로티닌-트립신 복합체의 저 농도에서의 해리로 인하여, 투여-반응 곡선이 비선형이다.

트립신 및 트립신 억제제의 측정을 완충액은 0.01M R CaCl₂와 0.05% Tween 80

를 함유하는 0.2M 트리스(pH 8.0)이다.

측정은 400nm에서 광학 밀도(ODs)를 판독할 수 있는 임의의 분광측광기로 행할 수 있다. 완전 자동 측정을 위하여, 측광기에 마이크로 처리기를 장치하거나, 적합한 퍼스널 컴퓨터와 연결시켜야 한다.

모든 분석에서는 1회용 1㎝세미마이크로 플라스틱 쿠베트를 사용한다. OD는 실온에서 8사이클에 걸쳐서 1분 간격으로 판독한다. 분당 평균 OD증가치는 작용 단위로서 임의로 취한다.

억제 분석을 위하여 포르신 트립신(Merck 8350) 용액 (0.001N HCI/50% 글리세롤 중의)을 억제제 시료와 혼합한 후, 완충액으로 500㎕까지 조절하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션 시켰다. 여기에 기질 용액을 첨가하여 반응을 개시하였다. 보다 상세한 설명은 하기 표에 나타내었다. 억제 작용은 눈금이 정해진 곡선으로부터 얻거나 또는 이 목적을 위해서 특별히 개발된 컴퓨터 프로그램에 의해 자동적으로 계산한다.

형질전환에 적합한 미생물로서는 당업계에 각종 미생물이 다수 공지되어 있다. 즉, 배양 또는 발표 중에 생장시킬 수 있는 단세포 유기체가 있다. 형질 전화에 적합한 유기체로는 세균, 효모 및 균류가 있다.

본 작업을 위해 특정적으로 선택된 유기체는 대장균 RRI△M15로서, 이것은 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁 번호 제35102호로 기탁되었다. 또한 기타 적합한 대장균 균주를 사용할 수 있다.

본 발명에는 무독성이고, 불활성이며 제약상 적합한 부형제 이외에, 본 발명에 의한 화합물 중 1개 이상의 화합물을 함유하거나, 또는 본 발명에 의한 유효 화합물 중 1개 이상의 유효 화합물로 되는 제약 제제물 및 제제물의 제제 방법이 포함된다.

본 발명에는 또한 투여 단위 형태의 제약 제제물이 포함된다. 제약 제제물의 예로는 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약 및 앰플제 등이 있으며, 이 제약 제제물에 있어서, 유효 화합물의 함량은 단일 투여량의 분율 또는 배수에 해당한다. 투여 단위는 단일 투여량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유시키거나, 또는 단일 투여량의 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유시킬 수 있다. 단일 투여량에는 1회 투약에 제시되는 유효 화합물의 양을 함유시키는 것이 적합하고, 이 양은 통상적으로 1일 투여량의 전량, 1/2, 1/3 또는 1/4에 해당하는 함량이다.

무독성이고, 불활성이며, 제약상 적합한 부형제는 고상, 반고상 또는 액상 희석제, 충전재 및 기타 모든 종류의 제제 보조제를 의미한다.

적합한 제약 제제물로서는 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 과립제, 좌약, 용액제, 현탁액제 및 에멀젼제, 이고제, 연고제, 겔제, 크림제, 로숀제, 분말제 및 분무제를 들 수 있다.

정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 및 과립제에는 본 발명의 유효 화합물(들)을 다음과 같은 통상의 부형제에 함유시킬 수 있다. 즉, (a)충전재 및 중량제(예, 전분, 락토오스, 슈크로오스, 글루코오스, 만니톨 및 실리카)(b)결합제(예, 카르복시메틸 셀룰로오스, 알긴산염, 젤라틴 및 폴리비닐 피롤리돈)(c)보습제(예, 글리세롤)(d)붕해제 (예, 한천, 탄산칼슘 및 탄산나트륨) (e)용해지연제(예, 파라핀) (f)흡수 촉진제 (예, 4급 암모늄 화합물) (g)습윤제 (예, 세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트) (h)흡착제(예, 카올린 및 벤토나이트) (i)윤활제 (예, 활석, 스테아르산 칼슘, 스테아르산 마그네슘 및 고상 폴리에틸렌 글리콜), 또는 상기 (a) 내지 (i)에서 열거한 부형제들의 혼합물.

정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 및 과립제는 임의로 유백제를 함유시킨 통상의 코우팅제와 외피제로 제제할 수 있으며, 이 제제물들은 또한 선택적으로 중합성물질 및 왁스를 봉매(153b )조성물로서 사용하여 적당히 지연시킨 후 장관내 일정 부위에서 유효 화합물(들)만을 선택적으로 방출시키는 조성물로 제제할 수도 있다.

이 유효 화합물(들)은 임의로 상기한 부형제 중 1개 이상의 부형제와 함께 미세 캡슐형으로 제제할 수도 있다.

좌약에는 유효 화합물(들)이외에, 통상의 수용성 또는 수불용성 부형제, 예를들면, 폴리에틸렌 글리콜, 지방(예, 카카오 지방) 및 고급 에스테르 (예, C₁₈-지방산을 갖는 C₁₄-알코올), 또는 이 부형제들의 혼합물을 함유시킬 수 있다.

연고제, 이고제, 크림제, 및 겔제에는 유효 화합물(들) 이외에, 통상의 부형제, 예를들면 동물성 및 식물성지방, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸드(tragacanth), 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 활석 및 산화아연 또는 이 부형제들의 혼합물을 합유시킬 수 있다.

분말제 및 분무제에는 유효 화합물(들) 이외에, 통상의 부형제, 예를들면 락토오스, 활석, 실리카, 수산화알루미늄, 규산 칼슘 및 폴리아미드 분말, 또는 이 부형제들의혼합물을 함유시킬 수 있다. 분무제에는 통상의 포사제, 예를들면 클로로플루오로히드로카르본을 추가로 함유시킬 수 있다.

용액제 및 에멀젼제에는 유효 화합물(들) 이외에, 다음과 같은 통상의 부형제, 또는 부형제들의 혼합물을 함유시킬 수 있다. 즉 예를들면, 물, 에틸알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1, 3-부틸렌그리콜, 디메틸포름 아미드, 오일(특히 면실류, 낙화생유, 옥수수 배종유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 글리세롤포르말, 테트라 히드로푸르푸릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄 의지방산 에스테르 등의 용매, 용해제 및 유화제이다.

경구 투여용 용액제 및 에멀젼제는 혈액과 등장 상태인 멸균형으로 제조할 수 있다.

현탁액제에는 유효 화합물(들) 이외에 액상 희석제(예, 물, 에틸알코올 또는 프로필렌글리콜), 현탁제(예,에톡실화이소 스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소리비톨 에스테르 및 소르비탄 에스테르), 미세결정상 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드로시드, 벤토나이트, 한천 및 트라가칸드와 같은 통상의 부형제, 또는 이 부형제들의 혼합물을 함유시킬 수 있다.

상기한 제제형에는 또한 착색제, 방부배 및 냄새 및 풍미를 증진시키는 첨가제 (예, 박하유 및 유우칼리나무유) 및 감미료 (예, 사카린)를 함유시킬 수도 있다.

치료적으로 유효한 화합물은 상기 제약 제제물 중에, 혼합물 전체의 중량%로 약 0.1% 내지 99.5중량%(약0.5% 내지 95 중량%가 적합함)의 농도로 함우시키는 것이 적합하다.

상기 제약 제제물에는 또한 본 발명에 의한 화합물 이외에, 제약학적으로 유효한 화합물을 추가로 함유시킬 수 있다.

상기 제약 제제물들은 공지된 방법에 의한 통상이 방법, 예를들면, 유효 화합물(들)을 부형제(들)와 혼합시켜 제제할 수 있다.

유효 화합물 또는 제약 제제물은 국부, 경구, 비경구, 복강내 및(또는) 직장내, 적합하기로는 경구, 또는 정맥내 또는 근육내 주사와 같은 비경구로 투여할 수 있다.

일반적으로, 인체 의약품 및 수의 약품에 있어서, 본 발명에 의한 유효 화합물(들)은 24시간 마다 약 0.5~약500㎎/㎏(체중)이 적합함)의 총량으로, 경우에 따라서는 목적하는 결과를 얻기 위하여 수개의 단일 투여 형태로 투여하는 것이 유리한 것으로 증명되었다. 단일 투여량에는 유효 화합물(들)을 약 1~약 250㎎/㎏(체중), 특히 3~60㎎/㎏(체중)의 양으로 함유시키는 것이 적합하다. 그러나, 상기한 투여량은 달리할 필요가 있는데, 특히 치료될 환자의 체질 및 체중, 질병의 특성 및 심도, 약제의 특성 및 투약방법, 투여시간 및 간격 등에의해 조절할 필요가 있다.

그리하여, 경우에 따라서는 유효 화합물을 상기한 투여량 미만으로 사용할 수 있고, 또한 상기한 투여량 이상으로 사용할 수도 있다. 유효 화합물의 최적 투여량과 투여 방법은 당업계 전문가들이 숙련된 지식을 기초해서 용이하게 정할수 있다.

발현 플라스미드 pRK 49.2.1 및 pRK 48.1.1로 형질전환한 대장균을 독일연방공화국, 괴틴겐, 그리세바흐스트로, (우편번호 디-3400) 소재의 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen에 기탁 번호 DSM 제3678호 및 DSM 제3679호(1987년 3월 25자 특허출원 제2715호에 관련하여 1987년 5월6일자로 한국과학기술원에 기탁번호 KCTC 8248P 및 KCTC 8249P로 각각 기탁되었음)로 기탁하였다.

Arg-15-동족체, 예를 들면 하기 실시예 7에 의한 동족체는 급성소염질환, 예를 들면 류머티스성 관절염 유전성 맥관신경증서부종, 폐염, 췌장염 및 쇽의 치료에 매우 유용하다. Arg-15-동족체는 또한 인공막을 포함한 투석 처리 체외 순환에 있어서 보호제로서 유용하다.

[실시예 1]

Glu-52-및 Val 15-Glu-52-아프로티닌을 코딩하는 DNA 단편의 합성 및 정제

유전자를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 고상 합성법을 사용하여 제조하였다. 올리고머의 합성 경로는 하기한 바와 같고, 양성자를 활성시킨, 보호된 2'-데옥시리보뉴클레오티드 포스포르아미다이트를 이용하였다. 모든 서열 단계는 Applied Biosystems Model 380 DNA 합성기 상에서 보호시킨 뉴클레오티드, 용매, 화합물질 및 이 제조업체로부터 얻은 시약을 사용하여 자동 방식으로 행하였다. 역시 동일한 제조 업체로부터 구입한 고상 지지체는 조절된 기공의 유리로서, 여기에 이미 출발 물질 3'-뉴클레오티드가 부착되어 있었다. 자동 반응 사이클에 있어서, Manufacturers Operating Instructions 및 Users Bulletins에 따라 일정한 수정을 가하였다. 합성을 완료한 후, 올리고머를 DNA 합성기 내에서 제조업자의 참고서에 따라 고상 지지체로부터 탈블록킹 및 분열 시켰다.

블록킹기의제거를 올리고머를 함유하는 수용액을 밀봉한 바이알 중에서, 진한 수산화 암모늄을 첨가하여55℃에서 4 내지 24시간 동안 가열하여 완결시켰다. 생성된 용액을 증발시키고, 잔류물을 0.01M 중탄산트리에틸암모늄 완충액(pH 7.0, TEAB 완충액)중에 용해시켰다. 이 용액을 Sephadex-G 50

겔 여과 수지를 사용하여 크로마토그래피시켰다. 이 컬럼을 마련하여, 동일한 TEAB완충액으로 용출시켰다. 공극 부피로 용출시킨 물질을 꺼내어, 용액을 증발시켰다.

잔류물 중 일부(260nm에서 흡광 단위의 10 내지 40%)를 하중 완충액(조성 : 포름아미드 중의 0.1% 브로모페놀 블루, 0.1% 크실렌 시아놀, 10㎜ 디소듐 EDTA)중에 용해시킨 것을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동에 의해 추가로 정제시켰다. 겔 크기는 1.5㎜ 두께의 18×32㎝이었다. 이와 같은 방식으로 정제한 각 올리고모의 벽면 크기는 너비가 2 내지 5㎝이었고, 최대로 5개의 올리고머를 단일 겔을 사용하여 정제하였다. 겔 중 아크릴아미드의 농도는 목적 생성물의 사슬 길이에 따라 14 내지 20%로 변화시켰다. 보다 길 올리고머를 원하는 경우에는, 14% 아크릴아미드 겔이 적합하다. 반면에 보다 짧은 올리고머는 최대로 20% 아크릴아미드 겔 상에서 정제시켰다. 겔에는 또한 7M 우레아와 트리스-붕산염-EDTA 완충액(0.1M 트리스, 0.1M 붕산염, 2mM EDTA, pH 8.3)을 함유시켰다. 진행 완충액은 이와 동일한 트리스-붕산염-EDTA 혼합물이었다. 전기영동은 20 내지 60왓트의 일정한 전력에서 18 내지 6시간 동안 행하였다. 이와 같은 표준화 기술은 어플라이드바이오시스템로부터 입수한 각종 User Imformation Bulletins에서 구할 수 있다.

전기영동을 완결한 후, 겔을 플라스틱 랩으로 싸서, 올리고머를 자외선으로 투영하여 가시화하였다. 이 투영은 랩으로 싼 겔을 형광박층 크로마토그래피판에 놓고, 겔을 단파장의 자외선으로 조사하여 행한다. 목적 생성물은 이 투영 기술에 의해 가장 서서히 이동하는, 청색의 주요 DNA 단편으로 나타낸다. 겔로부터 목적띠가 방출되었다. DNA 올리고머를 겔 조작으로부터 EpiGene D-Gel

전기 영동 장치를 사용하여 디에틸아미노에틸(DEAE)셀룰로오스 분말 상에서 용출 시켰다. 셀룰로오스로부터 IM TEAB 완충액으로 용출시켜서 올리고머를 회수하였다.

올리고모를 함유하는 완충액을 증발 시킨 후, 잔류물을 0.01M TEAB완충액 중에 용해시키고 이어서 상기한 Sephadex-G50

컬럼에 통과시켜서 탈염시켰다. 공극 부피로 용출시킨 물질을 꺼내어, 동결 건조시킨 결과, 최종 생성물을 얻었다.

상기한 방법을 사용하여 정제된 올리고머를 각각 0.5 내지 5.0 A260단위 얻었다.

[실시예 2]

Glu-52-및 Val 15-Glu-52-아프로티닌의 합성 아프로티닌 완전 유전자 구성

이들 특이적 합성 아프로티닌 유전자 구성은 15개의 정제 올리고뉴클레오티드를 조립한 것이다.(제14도 참조), 제3도에 나타낸 DNA 서열은 개시 코돈 ATG, 2개의 종결 코돈 TAG 및 TAA, 말단 제한 부위 Eco RI Hind IIII 및 Bam HI와 내부 제한 부위를 포함한다. 이들 부위의 선택은 암호화 서열의 클론 및 그의 변형을 촉진한다.

이 합성 유전자를 얻기 위해 사용되는 구성에는 단편들 이외에, 상기 물질 및 방법에 상세히 기재한 바와같이, 폴리뉴클레오티드 키나제, T4 DNA 리가제 및 제한 효소의 사용을 필요로 한다.

15개의 정제된 올리고뉴클레오티드 단편을 최종 농도 10pmol/㎕로 50mM TEABC(중탄산트리에틸암모늄완충액, pH 7.5)중에 용해시켰다. 모든 단편들의 포스포릴화는 4개의 분리된 파트(단편 1,3; 단편 2, 4, 6; 단편5, 7, 9, 11, 13;단편 8, 10, 12, 14, 16)로 행하였다.

예비 목적으로 각 단편 80 pmol을 각각 단편 10 pmol당 1X PNK- 혼합물, 20μM ATP, 0.5 uCi 32P 감마 ATP, 단편, 피코몰 당 10 단위 PNK의 혼합물 중에 용해 시켜서, 전체 용적을 단편 1,3 에 대하여 300 ㎕, 단편, 2, 4, 6에 대하여 400㎕

, 단편 5, 7, 9, 11, 12 및 단편 8, 10, 12, 14, 16에 대하여 700㎕로 하였다. 각 파트의 반응은 37℃에서 30분 동안 행하였다. 모든 파트를 페놀화시키고, 에탈올로 침전시킨 후, 세척하고, 건조시켰다.

혼성화 목적으로 단편 1, 3 및 단편 2, 4, 6(블록 A)을 전체 부피 120㎕로 1X리가제-혼합물 중에 용해 및 혼합시키고, 70℃에서 5분동안 인큐베이션시킨 후, 5시간내에 실온에서 냉각 시켰다. 다른 단편(블록 B)은 동일한 방법으로 240㎕

중에 혼성화시켰다.

결착시키기 위하여 블록 A용액에 10mM ATP 12㎕, 100mM DTE 12㎕

, T4 DNA 리가제 20㎕를 첨가하고, 블록 B 용액에는 2배씩을 첨가하였다. 반응은 14℃에서 7시간 동안 행하였다. 그 후, 블록 A에 대하여 T4 DNA 리가제 10㎕, 블록 B에 대하여 20㎕를 첨가하여, 14℃에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 이 혼합물을 페놀화시키고, 에탄올로 침전시킨 후, 건조시켰다.

얻은 블록 A를 IX SP-100 90㎕와 Eco RI(10μ/㎕)10㎕중에 용해시키고, 블록 B를 IX-SP-50 90㎕와 Bam HI 10㎕중에 용해시킨 후, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 이것을 페놀을 사용하여 추출시키고, 에탄올로 침전시켜 반응을 정지시킨 후, 6% 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 행하고, 상기한 방법과 동일한 방법으로 DNA 블록을 회수하였다.

방사성 표지 블록 A 및 블록 B동량을 물에 용해시키고, IX 리가제 혼합물로 조절한 후, 최종적으로 합성 유전자에 결찰시키기 위하여 상기한 방법으로 혼성 혼합물 22㎕에 10mM ATP 3㎕, 100mM DTE 3㎕, T4 DNA 리가제 3㎕를 첨가하고, 14℃에서 7시간 동안 인큐베이션시켰다. 여기에 T4 DNA 리가제 1㎕를 첨가하고, 14℃

에서 45분 동안 행하였다. 결찰 생성물을 페놀 추출 및 에탄올 침전에 의해 정제시켰다. SP-50 중에서 표준 제한 효소 절단(Bam HI 1.5㎕, Eco RI 1.5㎕, 이중 절단)를 행하였다. 물질을 페놀을 사용해서 추출시킨 후, 에탄올로 침전시키기 전에 수용액을 3mM MgCl₂, 0.3M 아세트산 나트륨 농도로 조절하였다. 이어서, 6% 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동을 행한 후, 유전자를 상기한 방법과 동일한 방법으로 회수하였다.

[실시예 3]

제조합 플라스미드 pRK 63.1.1 및 pRK 54.1 1의 구성

실험용 아프로티닌 클론화를 위해서 선택된 플라스미드는 pUC 8이었다(제이. 피라이 제이. 메싱의 Gene, 제19호, 제259페이지(1982참조). 이 클로닝 벡타는 pBRK 322에서 유래된 암피실리나제 유전자, 및 일련의 독특한 제한 효소 인식 부위 배열을 함유하는 lac Z유전자의 일부에 결찰된 DNA 복제 기점으로 구성되어있다. 이 벡터를 lac 대장균에 도입시켰을때, 형질전환체는 적당한 지시 플레이트에 청색 클로니를 나타내었다. DNA 단편을 다중 제한 부위 중 어느 하나, 예를 들면 Eco RI와 Bam HI 사이에 클로닝시켰을때, lac 유전자가 불활성화되어 백색 콜로니를 나타내었다.

[벡터 제조]

합성 아프로티닌 완전 유전자를 pUC 8 내에 결찰시키기 위하여, 예비 벡터를 제조하였다. 정제한 pUC8 DNA(약 30pmol)를 표준 제한 엔도뉴클레아제 절단 조건 하에서 Eco RI와 Bam HI로 2회 절단시켜서 내부의 Eco RI와 Bam HI 소편을 절단하였다. 이 제조물을 송아지의 소장 포스파타제를 사용하여 상기한 방법으로 표스포릴기를 제거하고, 아가로오스 겔 전기영동에 의해 분리한 후 벡터 중의 큰 Eco RI와 Bam HI 단편을 표준 조건 하에서 정제시켰다. 이 처리는, Eco RI와 Bam HI 말단에서 백터 분자의 자체 결찰을 배제시키고, 형질 전환체의 배경을 철저하게 감소시키기 때문에, 백터를 사용한 추가 공정을 상당히 촉진시킨다.

[결찰]

pRK 63의 구성(제4도 참조)은 정제한 합성 아프로티닌 유전자 전부를 벡터(T4-DNA 리가제 1.8 단위, IX 리가제 혼합물, 총 부피 45㎕)1pmol을 사용해서 결찰시키고, 14℃에서 7시간 동안 인큐베이션시킨 후, 여기에 T4-DNA 리가제 1단위를 첨가하고, 14℃에서 45분 동안 다시 인큐베이션시켜서 행하였다.

[형질전환]

디. 하나한에 기재되어 있는 형질전환법(세부사항은 표준 형질전환법 참조)을 사용하여, 대장균 RRI 델타M15[에이. 칼니스(A. Kalnins)등의 EMBO Journal, 제2호, 제593페이지 참조, ATCC 35102]를 수용체 세포로서 사용하였다. 암피실린 200㎍/㎖를 함유하는 지시 플레이트 상에서, 결찰 물질 중50%를 사용하여 형질전환시킨 후, 15개의 "백색"형질전환체를 얻었다. 15의 형질전환체를 모두 변보임과 돌리(1979년, 상기 참조)의 신속 분석 플라스미스 단리법을 변형하여 스크리닝시켰다. 그후, 15개의 시료 펠릿을 RNase A 1㎍을 함유하는 IX SP-100 30㎕중에 다시 용해시켰다. 이것을 Eco RI와 Bam HI을 첨가하여 제한 절단시켰다.

겔 전기영동 후 15개의 형질전환체 중 4개가 Eco RI- Bam HI 단편 약200개의 염기쌍 길이를 갖는 플라스미드 DNA를 함유하는 것으로 발견되었다.

이 Eco RI- Bam HI 단편을 갖는 형질전환체를 모두 대규모로 생장시키고, 각각으로부터 플리스미드를 단리시킨 후, 추가로 분석하였다. 이들 중 두개를 맥삼과 길버트의 방법으로 서열한 결과, 모두 정확한 서열을 니타내었는데, 이것은 우수한 화학적 합성 및 구성을 증명한다.

플라스미드 pRK54.1.1(Val-15-Glu-52-아르로티닌)은 합성 유전자의 베타 블록(Apa-Stu I 단편)을 15위치에서 Lys 대신에 Val에 대한 코돈을 함유하는 베타 블록으로 간단히 교환함으로써 구성하였다.

합성 ss DNA 단편 BEA 4A 및 BEA 4B(제2B도 참조)약 100 피코몰을 물 20㎕중에 용해시키고, 95℃에서 5분 동안 가열 시킨 후 5시간에 걸쳐서 실온으로 서서히 냉각시켰다. 혼성화된 비포스포릴화 단편을 Apal-Stu l 단편이 누락된 pRK63.1.1로 부터 정제 DNA 1.5pmol과 함께 결찰시켰다. 이 결찰 혼합물 30㎕에 대하여 표준 결찰을 행하였다. 대장균 RRI△M15의 형질전환은 결찰 혼합물 50%를 사용하여 행하였다. 1500개의 형질전환체로부터 24개를 분석적 플라스미드 단리 및 제한 분석에 의해 시험하였다. 모두가 양성이었고, 이중 두개는 미합중국, 매사추세츠주, 베버리 소재의 바이오랩스의 M13 디데옥시뉴클레오티드 서열 시스템에 의해 서열화 하였다. 추가 실험을 위해서는 형질전환체 pRK 54.1.1을 사용하였다.

[실시예 4]

발현 플라스미드 pRK 48.1.1 및 pRK 49.2.1의 구성

아프로티닌을 융합 단백질로서 발현하기 위하여, 플라스미드를 유, 뤼터와 비. 뮐러-힐의 EMBO Journal, 제2호, 제1791~1794페이지(1983년) 및 독일연방공화국 특허 공개 제33 09 501.9호에 기재되어 있는 방법으로, 아프로티닌 유전자가 β-갈락토시다제 유전자의 카르복시 말단에 위치하도록 구성하였다.

합성 아프로티닌 유전자를 발현 벡타 pUR 278에 클로닝시키기 위해. 클로닝 부위 Bam HI 및 Hind III을 선택하였다. 이를 위해, 유전자 5' Eco RI 말단에 Bam HI 부위를 부가하고, 3'말단에 Hind III부위를 부가함으로써, 아프로티닌 유전자를 변형시킬 필요가 있다(제6도 참조).

bRK 63.1.1DNA 50pmol을 IX SP-100 120㎕중에서 Eco RI(15pmol hit/㎕)를 첨가해서 37℃에서 하룻밤 완전히 절단시켰다. 이 DNA 물질의 돌출된 5'Eco RI 말단을 DNA 폴리머라제 I(Klenow 단편), dATP 및 dTTP(마니아티스 등의 1982년 참조)와의 효소 반응에 의해 채웠다. 건조 알파 32 P ATP(250uCi) 600pmol을 용해시키고, DNA 160㎕(50pmol), ImM dATP 10㎕(10,000 피코몰), NT 완충액 20㎕와 혼합시켰다. 이어서 여기에 DNA 폴리머라제 I(Klenow 50μ)10㎕를 첨가하고, 실온에서 1차 인큐베이션시켰다. 30분 후, 여기에 1mM dTTP 10㎕(10,000pmol)를 폴리머라제(25μ) 5㎕와 함께 첨가하고, 실온에서 2차 인큐베이션시켰다. 이 물질을 페놀/세바그를 첨가해서 추출시키고, 방사성 표지된 분자량 분획물을 꺼내어, 에탄올로 침전시킨 후, 세척하고, TE 50㎕중에 용해시킨 다음, 20℃에서 저장하였다.

플러쉬(flush)말단을 갖는 이 물질 20㎕를 Bam HI 연결자를 사용할 결찰에 사용하였다. 그러므로 감마 32 P ATP로 표지한 5' Bam HI 연결자 400pmol(표준 5' 포스포릴화법)을 DNA 말단 40 피코몰에 결찰시켰다(표준 결찰 조건, T4 DNA 리가제 4.5㎕, 전체 부피 60㎕), 연결자 결찰의 양을 조절하기 위하여 분석적 겔전기영동을 행하였다. 여기에 Bam HI 연결자 100pmol, T4 DNA 리가제 1.8단위를 첨가하고, 20℃에서 1시간동안 인큐베이션시킨 후, 여기에 T4 DNA 리가제 1단위를 첨가하고 14℃에서 18시간 동안 인큐베이션시킨결과, 결찰이 완결되었다. 이 반응 혼합물을 페놀/세바그를 사용해서 추출시키고, 에탄올로 침전시킨 후, 세척하고, 건조 시킨 다음, TE 40㎕중에 용해시켰다.

Bam HI와 Hind III 말단을 갖는 합성 아프로티닌 유전자를 제조하기 위하여, 연결된 선형 플라스미드 10pmol을 먼저 Hind III을 첨가하여 절단하고 (10.5pmol hti/㎕, 5시간 37℃), 이어서 Bam HI를 첨가하여 절단하였다(40 피코물 hti/㎕, 20시간 37℃표준 조건), 이것을 6% 폴리 아크릴 아미드 겔 전기영동에 의해 분리한 후 단편을 단리시키고, 조심스럽게 정제하였다(표준 처리 참조).

[벡터 제조]

모체 벡타 pUR 278 약 5pmol을 먼저 Hind III(표준 조건)을 첨가하여 절단하고, 페놀/세바그 추출, 에탄올 침전에 의해 정제한 후, 재용해 하고, Bam HI(표준 조건)와 함께 절단시켰다. 이 물질을 표준 조건에 따라서 1% 아가로오스 겔상에 부하시키고, 전기영동시킨 후, 단리시키고, 정제켜서, 합성 아프로티닌 유전자의 결찰에서 경쟁하게 되는 18개의 염기쌍 길이의 Bam HI-Hin III 단편을 제거하였다.

[결찰 및 형질전환]

벡타 0.3pmol을 결찰시키기 위하여 단편 약 1.5pmol, T4 DNA 리가제 2단위를 사용하였다(표준 조건, 전체부피 30㎕, 14℃에서 4시간 동안 인큐베이션).

형질전환은 결찰 혼합물 중 1/3을 사용하여 숙주로서 대장균 RRI 델타 M15와 함께 행하였다(표준 조건), 임피실린 200㎕/㎖를 함유하는 지시 플레이트에 대하여 층 173개의 "청색"콜로니를 얻었다. 이로부터 12개의 형질전환체를 신속 분석 플라스미드 단리법(표준 조건)법에 의해 추가 분석하였다. 173개의 형질전환체 중 30개는 벡타의 재결찰에 의해 수령된 형질 전환체의 백분율에 대하여 산정한 배경 형질전환체이어야 한다. 이 결과는 12개 형질전환체의 플라스미드 제한 분석에 의해 확인되었다. 이 중 8개는 양성이었는데, 이것은 약200개의 염기쌍을 갖는 Bam HI-Hind III 제한 단편임을 보여준다. 양성 제조한 플리스미드를 또한 아프로티닌 유전자 내의 Sst II 및 독특한 제한 부위에 의해 선형화하였다. 맥삼과 길버트의 방법 (1980년)에 따른 염기 서열 분석 결과, 플라스미드 pRK 48.1.1은 목적 아프로티닌 DNA 단편을 삽입하고 있는 것으로 나타났다(제6도 참조). 추가 분석 및 표현 작업을 위하여 플라스미드 pRK 48.1.1을 사용하였다.

플라스미드 pRK 49.2.1의 구성은 pRK 54.1.1로부터 Val-15-Glu-52를 사용하여 위와 정확히 동일한 방법에 의하여 행하였다. 양성 재조합 플라스미드 49.2.1은 올바른 DNA 서열임을 보여주었고, 이 구성을 추가 분석 및 발현 작업에 사용하였다.

β-갈락토시다제-Glu-52-아프로티닌 및β-갈락토시다제-Val-15 Glu-52-아프로티닌의 발현 확인

이들 구성을 각각 발현하기 위하여 pRK

48.1.1(DSM에 기탁번호 제3679호로 기탁하였음) 및 pRK 49.2.1(DSM에 기탁번호 제3679호로 기탁하였음)을 각기 갖는 대장균을 0.1M IPTG 4㎕를 보충한 LB-암피실린배지 2㎖중에서 접종시켰다. 아프로티닌 유전자가 삽입되지 않은 pUR 278을 함유하는 클론 또는 배양 배지중에 접종시켜서 분석을 위한 음성 대조물로서 제공하였다. 이것은 39℃에서 진탕시키면서 12~16시간 동안 생장시킨 후, LB-암피실린 배지 100㎖를 접종시키기 위하여 시료 1㎖를 직접 사용하였다. 이것을 37℃에서 진탕시키면서 12~16시간 동안 생장시킨 후, Beckmann JA 10회전기 중에서 5000rpm으로 10분동안 원심분리 시켜서 세포를 수확하였다.

융합 단백질의 직접 검출은 램리의 방법[영국, Natrue, 제277호, 제680페이지, 1970년; 비. 디. 헤임스(B. D Hames)와 디. 릭우드(D. Rickwood)의 Gel electrophoresis of proteins, 옥스포드 소재의 아이알엘 프레스 리미티드(IRL Press Limited)출간, 1981년 참조]에 따라 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 행하였다.

레인 당 약 IX 10E9 세포를 원심분리시키고, SDS 시료 완충액의 1 : 5 희석액(0.3M 트리스 HCI pH 8.8, 50% 글리세롤, 5% SDS, 25% 메르캅토 에탄올)중에 재용해시켰다. 전기 영동 후 겔은 쿠마씨(Coomassie)블루로 오염시켰다. 제7도는 발현 가능한 β-갈락토시다제Glu-52-아프로티닌 융합 단백질을 갖는 대장균 단백질의 전형적인 유형을 나타낸다.

[용액]

브레이킹 완충액 : 50mM 트리스 100mM 염화나트륨, 10mM 염화마그네슘, 10mM 메르캅토에탄올, 2M 구아니디늄-HCI 용액 : 2M 구아니디늄-HCI, 50mM 트리스-HCI, pH 7.7 100mM 염화나트륨, 10mM 메르캅토에탄올, 6M 구아니디늄 HCI-용액 : 6M 구아니다늄-HCI, 50mM 트리스-HCI, 100mM 염화나트륨, 10mM 메르캅토에탄올.

[실시예 5]

Glu-52-아프로티닌의 제조

1. β-갈락토시다제 융합 단백질 Lys-15-Glu-52-아프로티닌의 단리 및 브롬화 시아노겐 분열 제조할 목적으로, 대장균 철야 배양 균주 RRI 델타 M15 6ℓ를800rpm으로 15분 동안 원심분리시켰다. 세포 펠릿 약15g을 브레이킹 완충액 30㎖중에 재현탁시키고, 6분 동안(빙냉) 초음파 처리하였다. 세포 융해물을 20000rpm으로 20분 동안 원심분리시켰다. 상징액을 버렸다. 펠릿 약 10g을 2M 염산 구아니디늄 용액 20㎖중에 재현탁시키고, 균질화하였다. 이것을 20000rpm에서 20분 동안 원심분리시킨 후, 상징액을 버렸다. 펠릿 약 8g을 N₂분위기하에 DTT 200㎎을 함유하는 6M 염산 구아니디늄 용액 20㎖중에 용해시킨 후, 50℃에서 1시간 동안 환원시켰다. 이 용액을 1000rpm으로 10분 동안 원심분리시킨 후, 10mM 메르캅토 에탄올을 함유하는 물에 대하여 24시간 동안 투석하였다. 침전된 융합 단백질을 20000rpm으로 20분 동안 원심분리하여 수거하였다. 축축한 융합 단백질을 진한 포름산 30㎖중에 용해시키고, 이어서 물로 70%까지 희석하였다. 융합 단백질을 브롬화 시아노겐 4g을 첨가하고, 암실 중에서 질소 분위기 하에 18시간 동안 인큐베이션시켜서 절단시켰다. 이것을 물 200㎖로 희석하여 반응을 정지시켰다. 물과 휘발성 부산물을 동결 건조에 의해 제거하였다. 브롬화 시아노겐 분열은 램리의 방법에 따라 SDS겔 전기영동에 의해 조사하였다. 수득량은 브롬화 시아노겐 단편 약 1.5g이었다. 일련의 실험에서 수득량은 0.8 내지 2.5g이었다.

[용액]

완충액 A(pH 8.2) 50 밀리몰 트리스-HCI, I 밀리몰 EDTA, pH 8.2로 조절, 완충액 B(pH 8.2), 완충액 A중의 8M 우레아 1 밀리몰 비스-(2- 히드록시에틸)-디술파이드, 1 밀리몰 2-메르캅토에탄올, 완충액 C(pH 8.2), 완충액 A중의 1 밀리몰 비스-(2- 히드록시에틸)-디술파이드, 1 밀리몰 2-메르캅토에탄올, 완충액 D(pH 8.2), 완충액 A중의 0.6몰 염화나트륨./

2. Glu-52-아프로티닌의 분리 및 재변성

동결 건조된 Lys-15-Glu-52-아프로티닌 β-갈락토시다제 시아노 브로마이드 단편 약 300㎎을 DTT 300㎎을 함유하는 완충액 B 200㎖ 중에 용해시켰다. 이 용액을 질소 분위기 하에 50℃에서 1시간 동안 환원시켰다. 이어서 용액을 CM-R-세파로오스 Fast Flow

약 15㎖로 충전시킨 CM-Sephadex 컬럼(25×100㎜)에 넣었다. 컬럼을 완충액 B로 평형화시켰다. 컬럼을 기준선이 안정될 때까지 완충액 B로 세척하엿다. 첫번째 선형구배 용출에서는 컬럼을 완충액 B 100㎖와 완충액 C 100㎖로 전개하였다. 두번째 선형 용출 구배를 적용하기전에 컬럼을 기준선이 안정될때까지 완충액 A로 세척하였다. 두번째 구배를 완충액 A 100㎖와 완충액 D 100㎖를 사용하여 형성하였다. 피크 분획물에 대하여 트립신 억제 작용, ELISA 및 웨스턴 블롯을 시험하였다(제10도 참조). 일련의 실험에서 상이한 시험에 의해 평가된 수득량 0.4~2㎎이었다.

3. 역상 HPLC에 의한 Glu-52-아프로티닌의 정제

유효한 분획물을 증발에 의해 농축시키고, 이어서, 0.1M NH₄HCO₃(pH 7.5)에 대하여 18시간 동안 투석하였다. 이것을 동결건조시킨 후, 억제제를 0.1% TFA중에 용해시키고, 완충액 A중의 0.1% TFA와 완충액 B중의 0.1% TFA 60%의 구배를 사용하여 고기공 RD-18 컬럼(BIORAD)상에서 역상 크로마토그래피에 의해 분획화시켰다. 억제제는 N-말단 서열화 및 아미노산 분석에 의해 특징지었다.

[실시예 6]

Val-15-Glu-52-아프로티닌의 발현 및 생성물의 특징화

플리스미드 pRK 49.2.1을 사용한 대장균 형질전환체의 발효 및 Val-15-Glu-52-아프로티닌의 정제는 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 행하되, 단 활성을 트립신 억제 시험 대신에 엘라스타제 억제 분석에 의해 시험하였다. Val-15-Glu-52-아프로티닌은 GLU -52-아프로티닌 보다 CM-Sephadex 컬럼으로부터 훨씬 빨리 용출되었다.

일련의 실험에서 상이한 시험에 의해 평가된 수득량은 0.1 내지 1㎎이었다. VAL-15-Glu-52-아프로티닌의 단리에 대하여도 동일한 HPLC 정제법을 적용하였다. 억제 작용은 백혈구 엘라스타제 억제를 분석하여 측정하였다. 억제제는 N-말단 서열화 및 아미노산 분석에 의해 특징지었다.

[실시예 7]

Arg-15-Glu-52-아프로티닌의 구성, 발현 및 특징화

Arg-15-Glu-52-아프로티닌 유전자를 구성하기 위하여, Val-15-Glu-52-아프로티닌 유전자의 베타블록(제1도 참조, Apa l-stu I DNA 단편)을 교환하고, 플라스미드 pRK 54.1 1중에서 클론화 시켰다. 이 단편을 아미노산의 15위치에서 코돈 CGT에 의해 아르기닌을 코딩하는 대응하는 단편으로 대체하였다. 생성된 재조합 벡타를 pNH 01.1.1 라 부르고, 이중 일부를 서열화 하여 다음 실험에 사용하였다.

Arg-15-Glu-52-아프로티닌 유전자 5' 말단에 Bam HI 부위를 부가한 후, 단리시킨 유전자를 Bam HI-Hind III로 절단된 발현 벡타 pUR278에 결찰시켰다.

이 DNA를 대장균 RRI 델타 M15의 형질전환에 사용하고, 신규 발현 플라스미드 pRK 112.1.1을 함유하는 형질전환체를 선택하였다.

이 형질전환체로부터 β-갈락토시다제 Arg-15-Glu-52-아프로티닌 융합 단백질을 단리시키고, Arg-15-Glu-52-아프로티닌을 상기한 바와 같이, 브롬화시아노겐 절단 후 정제하였다.

놀라웁게도, 운동역학적 연구의 결과로, 재조합 Arg-15-Glu-52-아프로티닌은 인체의 혈장 칼리크레인(ki=3.2×10^-10(M)) 및 양이온 및 음이온 인체 트립신 (ki=10^-11(M)이하)의 매우 강력한 억제제임을 알 수 있었다. ki값은 엠. 더블유. 엠피(M. W. Empie)와 엠. 라스코부스키 제이알.(M. Laskowski, Jr.)의 Biochem, 제21권, 제227페이지(1982년)에 기재되어 있는 방법으로 측정하였다.

Claims

아프로티닌 또는 하기의 아프로티닌 동족체를 코딩하는 유전자를 숙주세포에서 발현시켜 제조한 아프로티닌 및 메티오닌을 임의로 제외한 천연 아미노산에 의해 15위치가 치환된 아프로티닌 동족체.
제1항에 있어서, Arg-15-, Val-15, Ile-15-, Leu-15, Phe-15-, Gly-15-, Ser-15-, Tyr-15- 및 Ala-15-아프로티닌인 아프로티닌 동족체.
제1항에 있어서, 52 위치가 Glu, Leu, Val, Thr 또는 Ser에 의해 추가로 아프로티닌 동족체.
제3항에 있어서, Glu-52-아프로티닌인 및 아프로티닌 동족체.
제3항에 있어서, Val-15-Glu-52-아프로티닌인 아프로티닌 동족체.
제3항에 있어서, Ile-15-Glu-52-아프로티닌인 아프로티닌 동족체.
제3항에 있어서, Lel-15-Glu-52-아프로티닌인 아프로티닌 동족체.
아프로티닌 또는 메티오닌을 임의로 제외한 천연 아미노산에 의해 15위치가 치환된 아프로티닌 동족체를 코딩하는 완전 유전자의 구성에 적합하고, 하기 단편 및 그의 기능상 균등 서열 중에서 선택되는 DNA 단편.

단편 1 AATTCATGCTCCGGACTTCTGCCTCGAGC

단편 2 CAGAAGTCCGGACGCATG

단편 3 CGCCGTACACTGGGCCCTGCAAAGCT

단편 4 CCCAGTGTACGGCGGTCGAGG

단편 5 CGTATCATCCGTTACTTC

단편 6 ATGATACGAGCTTTGCAGGG

단편 7 TACAATGCAAAGGCAGGCTGTGTCAGACC

단편 8 CCTGCCTTTGCATTGTAGAAGTAACGG

단편 9 TTCGTATACGGCGGTTGCCGTGCTAAGCGT

단편 10 AACCGCCGATACGAAGGTCTGACACAGG

단편 11 AACAACTTCAAATCCGCGGAAGACTGCGAA

단편 12 ATTTGAAGTTGTTACGCTTAGCACGGC

단편 13 CGTACTTGCGGTGGTGCTTAGTAAAGCTTG

단편14 CACCGCAAGTACGTTCGCAGTCTTCCGCGG

단편16 GATCCAAGCTTTACTAAGCAC.
하기의 서열 및 그의 기능상 균등 서열에 의해 특징지워지는 DNA.
제9항에 있어서, 주로 Lys-15-코돈이 Val-15-, Ile-15-, Leu-15-, Phe-15-, Gly-15-, Ala-15-, Arg-15-, Ser-15-, Trp-15- 또는 Tyr-15-52-아프로티닌을 코딩하는 코돈에 의해 치환된 제11항의 DNA 서열을 필수적으로 가지는 DNA.
제9항 또는 제10항에 있어서, Glu-52-코돈이 Leu, Val, Thr 또는 Ser을 코딩하는 코돈에 의해 치환된 DNA.
플라스미드 pRK 63.1.1, pRK 54.1.1, pRK 49.2.1 및 pRK 48.1.1.
제1항 내지 제7항의 단백질 제조에 유용한 발현 플라스미드.
pRK 48.1.1 및 pRK 49.2.1로 이루어진 군 중에서 선택되는, 제5항 내지 제8항의 단백질 제조에 유용한 발현 플라스미드.
아프로티닌 또는 메티오닌을 임의로 제외한 천연 아미노산에 의해 15위치가 치환된 아프로티닌 동족체를 코딩하는 발현 운반자를 사용하여 형질전환시킨 숙주 세포.
아프로티닌 또는 메티오닌을 임의로 제외한 천연 아미노산에 의해 15위치가 치환된 아프로티닌 동족체를 코딩하는 발현 운반자를 사용하여 형질전환시킨 대장균.
제14항에 의한 발현 운반자를 사용하여 형질전환시킨 대장균.
제14항에 의한 발현 운반자를 사용하여 형질전환시킨 대장균 RR 1△M15(ATCC 번호 35102).