JPS59210889A - ヒトα１−アンチトリプシンを産生する細菌クロ−ンの調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明の分野ばつぎのようである。

本発明は、ヒトα１−アンチトリプシンを生産する細菌
クローンの製造に関する。さらに、本発明は、ヒトのα
１−アンチトリプシンをコーげする本質的に純粋なｃＤ
ＮＡ　（以降”　ＤＮＡ　−Ａ　Ｔ　”と記す）および
ＤＮＡ　−Ａ　Ｔ　′ｆｒ−含有するバイブリド分子て
関する。

本発明の背景はつぎのようである。

血しようの主要成分のひとつであるα１−アンチトリプ
シンは肝臓で合成され血しよう中に分泌される。血しよ
う中での半減期は６日である。この酵素は本質的に蛋白
分解酵素の阻害剤として作用する。α１−アンチトリフ
０シンの主要な標的は、肺組織の弾性の消失に関与する
蛋白質であるエラスターゼである。さらに、α１−アン
チトリプシンはプラスミンおよびトロンビンに親和性馨
萼し、そのゆえに、フィブリン分解の過程に関与する。

かなりしばしばみられるこの酵素の遺伝的欠損には、早
期の退行性の肺の不調、そしである揚台には肝１閑の不
調が伴なう。

α１−アンチトリフ０シンが遺伝的に欠損すると、汚染
性物質でおこる炎症の過程に起因する蓄積性の肺障害に
かかりやす（する。つまり、炎症中に生体中に放出され
る催白質分解酵素は、欠損個体中に存在する、有限骨の
α１−アンチ）　ＩＪゾシンを飽和する。α１−アンチ
トリフ０シンがそれ自体、ある種の汚染物質により直接
的に不活化されてしまうことがありうるので、このこと
はそれだけ重大な間（値となる。

遺伝的または他の理由により血しよう中のα１−アンチ
トリプシンの量があるレベル以下になると、肺の弾性の
消失のような重篤な肺の障害７来たす。肺の弾性の消失
は、気腫に特徴的な非可逆的１２争害を与える。

肺の障害の病理の理解により、新しい治療的処置たとえ
ばα１−アンチトリプシンの代替といった処理の基礎が
提供される。そのような処置では、）６体的に、気腫の
患者に静脈投与されうるα１−アンチトリフ０シンを大
量にうろこと、または、エラスターゼに対する親和性の
増加した、そして汚染物質による直接的不活化を受けに
くくなったα１−アンチ）　ＩＪゾシン類縁体の合成が
必要となる。

本発明はつぎのように要約しうる。

本発明の目的は、治療上の応用に用いるに適当なヒトα
１−アンチトリフ０シンの大計を提供することである。

本発明のさらに別の目的は、ヒトのα１−アンチトリプ
シンを産生ずるイＩＨ菌性クローンの製造方法を提供す
ることである。

本発明のさらに別の目的は、ヒトのα１−アンチトリプ
シンをコードする本質的に純粋なｃＤＮＡを提供するこ
とである。

つぎに本発明？詳ｉ＋＋１に説明してゆく。

上記のように、本発明のひとつの具体例は、ヒトのα１
−アンチトリフ０シンを生産する細菌性クローンの製造
方法ケ提供するのであって、つぎの段階を包含する。

（ａ）　　ヒト１圧１．・、多より全ｍＲＮＡを抽出し
そしてｉ前照する： （ｂ）　　ヒトα１−アンチトリフ０シンケコードする
ｍＲＮＡのサイズに相当するサイズを有するｍＲＮＡに
ｉ″Ａしてイ農子宿する； （Ｃ）１蒙階ｆｂｌのｌ）急縮されたｍＲＮＡより、イ
ン　ビトロ−で、ＣＤＮＡを合成する； （ａ）　　ＤＮＡ　−Ａ　ＴＯサイズに相当するサイズ
を有するＣＤＮＡに関して濃縮する； （θ）段階（ｄ）の濃縮ｃＤＮＡに付着末端を付加する
；（ｆ）　　段階ｆｅ）で生成した濃縮ｃ　ＤＮＡと、
相補的付着末端を含有するベクターとをイン　ビトロ−
で混合してバイブリド分子とする； （ｇ）！Ｇ階（ｆ）のハイシリＰ分子でＥ、　ｃｏｌｉ
　’ｌ（形質転換する； （ｈ）　　ヒ）　ＤＮＡの挿入されたフラグメントを含
有する細菌クローンを選択し；そして （１）　ヒトα１−アンチトリプシンに関してスクリー
ニングし段階（ｈ）で生じたクローンよりＤＮＡ　−Ａ
Ｔ“を含有する細菌クローンを分離する。

別の具体例として、本発明は、ヒトα１−アンチトリフ
０シンをコードする本質的に純粋なｃＤＮＡおよびそれ
を含有するバイブリド分子に関する。

ヒト肝臓の全＋ｎＲＮＡは、細胞構造の完全な破壊およ
び抽出物中のりボヌクレアーゼ活性のすみゃかなそして
完全な破壊に本質的に基づく種々の方法で抽出しつる。

これらの方法はよく知られており、Ｍａｎｉａｔｉｅ　
、　　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ　、　　Ｅ、　Ｆ、　　
およびＳａｍｂ　ｒ　ＯＯｋ　、　　Ｊ　、　’Ａ　０
１　ｅ　Ｃｕ　１　ａ　ｒ　　巴王伍堅＋　　ＣＯｌ　
ａＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏ
ｎ　（１９８２）に記載されている。

たとえＨ，Ｉ　Ｘ洗浄剤たとえばｒ、＋ｐ４０ｓ　そし
てリボヌクレアーゼ阻害剤たとえばバナジル−リボヌク
レオシドを組合わせ、さらには強力なチャオトローノ（
ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ　）剤さえも甲いて、全ｍＲＮＡ
の抽出に用い５る。

Ｃｏｘ　　、　　　Ｒ，Ａ、　　　Ｍｅ　　しｈｏｄｓ
　　　　ｉｎ　　　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　　　ｉ　
　２　Ｂ　　：１２０（１９６８）に記ｉ’１ｉｉ４’
のグアニジンクロライ「の使用にもとつく方法は、本発
明に用いて有利である。この方法で、未分解の活ｉ生ｍ
ＲＮＡが得られる。

ヒト肝臓から抽出さ、１１．た全ｍＲＮＡは、それの６
′末端にポＩＪ（Ａ）配列が存在することケ利用して精
製しつる。有利な方法と［−て）ま、Ａｖｉｓ　、　Ｈ
ｌおよびＬｅｄｅｒ　、　Ｐ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａａ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　６９：１４０８（１
９７２）に記ｉ；すの方法に従いオリゴ−ｄ　（Ｔ）セ
ルロースカラムを用いｍＲＮＡ抽出物についてアフイニ
テイクロマトグラフイーを行なう。

ヒトα１−アンチトリジシン乞コー１するｍＲＮＡのサ
イズに相当するサイズのｍＲＮＡについての濃縮は、分
画技術たとえばアがロースデル上の電気泳動およびスク
ロースグラジェントでの遠心により実施するッＲｏｕｇ
ｅｏｎ　、　　？、、　　Ｃｈａｍｂｒａｕａ　、　　
Ｂ、。

Ｆｏｏｔｅ、　Ｓ、、　Ｐａｎｔｈｉｅｒ、　Ｊ、Ｊ、
、　Ｎａｇｅｏｔｔｅ、　Ｒｏおよび０ｏｒｖｏｌ、　
　Ｐ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　Ｕ
ＳＡ。

７８：６３６７（１９８１）に記載のようなスクロース
グラジェント上の分画が、本発明では有利であるっ 上記のように得られたｍＲＮＡ　ｆ含有する（ポリ）Ｗ
ｉｌｌｉａｍｑｏｎ　、　Ｒ，、編Ａｃａａｍｉｃ　　
Ｐｒｅｓ６．　Ｎ、Ｙ。

（１９８１）に記載のように実施する。たとえば、酵素
として逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼおよびＳ１ヌク
レアーゼを順次に用いて、遊離末端を含有するｃＤＮＡ
ＤＮＡ中る。しかし、同じ結果をうろのに、逆転写酵素
およびＳ１ヌクレアーゼを酢独で用いつる。Ｓ１ヌクレ
アーゼ処理の不完全さを克服するのにＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｋｌｅ　ｎ、ｏ　Ｗフラグメント）処理乞用いつる
。本発明を実施するのに６つの酵素のすべて？用いるの
が有利である。

ＤＮＡ　−ＡＴのサイでに」目当１−るサイズのｃＤＮ
Ａに関してのｌか縮は、上記したような分画技術ケ用い
て実施しつる。本発明を実１布１−るのに、スクロース
グラジェント上の分画が有利である。

Ｍａｎｉａｔｉｓ、　　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　　
Ｅ、Ｆ’、およびＳａｍｂｒｏｏｋ。

、工、１（９丁ｅｃｕｌａｒ　　　４　　、　　　Ｃｏ
１ｄ　　　Ｓｐｒｉｎｇ　　ＨａｒｂｏｒＰｕｂ’１ｉ
ｃａｔｉｏｎ　（１９３２）　ｌｙ　％Ｑ哉さね、てい
るようにｃＤＮＡ　５プラスミドベクターに結合さすの
にｒ′十押の方法が用いられた。もつともふつうの方法
では、ＤＮＡＶＣ相補的なホモ哨合体付着末端をイ」加
さすかまたはベクターのＤＮＡの特定の制限サイトに相
当する合成アダプターｙ　ＤＮＡ　Ｉだ付加させろ。本
発明では、ｉ目’ｌ’、ｉｉ的なホモ重合体付着末端ケ
ＤＮＡに付加さすのが有利である。この技術は、Ｖｉ’
ｌ’ｌａ　−ＫＯｍａｒ’Ｏｆｆ、　Ｌ、、　Ｅｆｓｔ
ｒａｄｉａｔｉｓ、　Ａ、　、　ＢｒＯＯｍｅ、　Ｓ、
。

Ｌｏｍｅａｉｃｏ、　　Ｐ、、　　Ｔｉｚａｒｄ、　Ｒ
１，Ｎａｋｅｒ、　　Ｓ、Ｐ、、　Ｃｈｉｃｋ。

され、酵素として末端ヂオキシヌクレオチジルトランス
フエラーゼを用いている。

ｃＤＮＡおよびプラスミドベクターを含有する／＼イブ
リド分子の不エ　ビ）ｏ−での構築は、Ｍａｎｉａｔｉ
ｅ。

Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｈ、　Ｅ、Ｆ、およびＳａｍ’ｂｒ
　ｏｏｋ　、　Ｊ　、　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ。

Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ｃ！ｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（１９８２）記載の
方法による。この方法では、適当な温度とイオン強度の
条件でｃＤＮＡとプラスミドベクターを混合する。

イン　ビトロ−での構築に用いるベクターは、種千重の
プラスミドより１嚢択しつる、たとえば、２つの可能の
挿入サイトつまりＰＳｔＩ挿入サイトおよびＢａｍＨＩ
挿入サイトを含有するｐＢＲろ２２がある。

（Ｂｏｌｉｖａｔ、　’ｔ＋’、、　Ｒｏｃｌｒｉｇｕ
ｅｚ、　Ｒ，Ｌ、　、　Ｇｒｅｅｎｅ。

Ｐ、　Ｊ、、　Ｂｅｔｌａｃｈ、　Ｍ、　Ｏ，、Ｈｅｙ
ｎｅｃｋｅｒ、　Ｈ，Ｌ、　、　Ｂｏｙｅｒ。

Ｈ，Ｗ、　０ｒｏｓａ、　、Ｔ、Ｈ，およびＦａｌｋＯ
ｖ＋、　ｓ、、　Ｇｅｎｅ　’ｌ　：９５（１９７７）
をみよ）。ｐＢＲ３２２の誘導物も用いうろ。本発明の
実施には、上記の方法に従い、直線状とし、適当な相補
性のホモ重合体性の接着末端を備えたｐ’ＢＲろ２２７
用いるのが有利である。他のプラスミドたとえばｐＫ２
７９、ｐＫ２８０およびｐＫ　２８７も本発明で用いう
ろ。

外来性のＤＮＡでｉ′＋１１菌を形質転換するに用いろ
方法の大部分では、独閑′？塩イヒカルシウムで処理し
、種々の午田菌医につり・て形質転換の効率ケ最高の状
態とする。本発明の枠組みのなかで、いくつかの型のｉ
ｔｎ菌がバイブリド分子のホストとして作用し５ろ。発
育状態が特に有用なＥ、　ｃｏｌｉ　　４４Ｍ２９４を
用いるのが有利である。

さらに、Ｍａｎｄｓｌ、　Ｍ、およびＨｉｇａ、　Ａ、
　ＪｏＭｏｌ。

Ｂｉｏｌ、５３：　１５Ａ（１９７０）に記載の挿々の
転換方法も本発明で用いつる。

ベクター中に存在する抗生物質抵抗性マーカーのゆえに
、バイブリド分子でインビトロ−で形゛１珪転換された
細菌ケ分邸［媚ることは簡単である。たとえば、ベクタ
ーがＴｅｔＲ遺伝子を世うならば、そのようなベクター
を有する細菌はすべてテトラサイクリン抵抗性となる。

さらに、ベクター中へのｃＤＮＡの挿入が抗生物質に抵
抗性の遺伝子を不活イヒする効果７有するならば、その
抗生物質に対するそれらの感受性により、ハイプリＰ分
子を担う細菌をスクリーニングし同定しうる。ｐＢＲ３
２２のＴｅｒ　　・時性（ま、本発明で用いられる有利
な選択マーカーである。さらに、アンピシリンに対する
抵抗性の消失は、ベクター中にｃＤＩＪＡの挿入された
ものの有利なスクリーニング手段となる。これら２つの
ファクターを組合わせて、バイブリド分子？担う細菌の
同定が可能となる。

ＤＮＡ　−Ａ　Ｔ　ｇ担うクローンは、天然または合成
のプローブ７用いる方法に従うかまたはクローンのＤＮ
ＡとヒトｍＲＮＡとのあいだの７人イブリダイゼーショ
ンまたは免疫学的手法によっても、スクリーニングし選
択しうる。これらの種々のアプローチｌ（”（：　Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｖｏ′１．
１．　Ｗｉ’ｌ’ｌｉａｍｅＯｎ。

Ｒ−（ｈ　＋　ＡＣａｅＬｅｍｉＣＰｒｅＢＳ、　Ｎ、
Ｙ、　（ｌ　９３１）に詳しい。

本発明の枠内において、α１−アンチ）　ＩＪゾシンの
ボリペフ０チドフラグメントＧｌｙ　−Ａｌａ　−Ｍｅ
ｔ　−Ｐｈ、ｅ　−ＬｅｕケコーＰする合成オリゴヂオ
キシリボヌクレオチドプロープおよび（または）ヒトα
１−抗トリフ０シンをコードするｍＲＮＡのクローンの
ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを用いるのが有利で
ある。クローンにより産生されるｍＲ１幀の」ンビトロ
ー翻訳およびそれにより生産される蛋白質の免疫学的同
定もまた、Ｇ１−アンチトリプシンを生産するクローン
のスフ１１−ニングに用い５る。

ヒトα１−抗トリゾシンン発現するクローンの同定の基
準は、一方においては、ＤＮＡ　−Ａ　Ｔが適切な配向
でそして正しい読１み取りフェースで挿入されているこ
とであり、他方において、これらのバイブリド分子を担
う細菌における合成生成物の免疫学的特徴つげである。

本発明のバイブリド分子＋Ｎ　＞Ｆについての方法は、
ＭＯｌｅＣｌｌｌａｌ−０コ刀ｎｉｎｇ、　　　　Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ、　　　Ｔ、、　　　Ｆｒ１ｔｓｃｈ。

Ｅ、Ｆ、およびＳａｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ　、　、　Ｃｏ
１ｎ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｕｂｌｉｃａｔｉ
○ｎ（１９８２）に詳しい。もし必要ならば、ｐＢＲ’
ｓ２２であれ他のいずれのベクターであれ、ＤＩＪＡ−
ＡＴの読み取りが正しいフェースとなるように、用いる
ベクターを変型１〜５る。それを実施するには、特に、
ｃＤＮＡを挿入しようとする遺伝子を欠失するベクター
を生成させ、このようにして、転写開始点とＤＮＡ　−
Ａ　Ｔの最初の塩基のあいだに１．２または３個の塩基
を埋め合わせ桔　ろ種のフェースの読み取りを提供する
型、のベクターは、Ｔａ’１ｍａａｇｅ、　Ｌ、　５ｔ
ｏｈｌ、　Ｓ、およびＧ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、、　Ｐｒ
０ｃ、Ｎａｔｌ、　ＡＱａｄ、　Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、
。

７７：ろろ６９（１９８０）に記載されて（べろ。

これらのベクターのうちのひとつだけにでもＤＮＡ　−
Ａ　Ｔが挿入されれば、適当な宿主細菌により適当な翻
訳が行なわれ、ＤＮＡ−ＡＴに相当する蛋白質を含有す
る、雑種蛋白質を生ずる。

本発明の範囲内において、ｐＢＲろ２２およびｐＫ　２
７９、ｐＫ　２８０およびｐＫ　２８７し家、ｉ商切な
読み取り枠中にＤＮＡ　−Ａ　Ｔを挿入し、マド１）゛
ンクスに固定化された抗体を用（・ることを基礎とする
免疫学的検出に用いるのに有利である。

ｐＢＲろ２２へのＤＮＡ−Ａ、　Ｔのクローニングに関
するつぎの非限定的実姉例は、本発明の理解をより完全
とするであろう。

１　ヒト肝）】絨盆ｒｎＲＮＡの抽出および梢製健康な
個体からＪ同高したヒト肝臓１０ｇン、ＣＯＸ　、　　
、Ｒ，Ａ、、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙ　１２　Ｂ　：１２０（１９６８）記載の方法ン
用い、り゛アニジンクロライドで処理した、ついで＃　
’ｔＨ％まオＩＪコゞ−ａ（ｒ）セルロースのカラムに
通し、それより全Ｈ＋ＲＮＡ−ン得た。１０．９のヒト
肝臓より２００μｇのＴ１１．ＲＮＡか得られた。

鍔られたｍＲＮＡ分画は、ウサギ網赤血球よりの７慝細
り蛋白合成系（Ｎ６ｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｂ、ｃ］、
ｅａｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）中でインビトロで
ポリにプチドに翻訳した。合成蛋白質は変性化末件で１
５％４＜リアクリルアミドゲル上で分画した。インビト
ロで合成された生成物中にＧ１−アンナト１ノフ０シン
の存在ずゐことは、それｙ、ａｌ−抗ト１ノフ０シンに
□・異的抗体（Ｎｏｒｄｉｃ　）で免投沈呻させそして
免疫沈降物ン奄気泳動で分析することで証明した。

これらの来躾は、翻訳生成物（１ＶＮ−４８，口００り
ゞルトン）中にＧ１−アンチｌ−ＩＪプシンの存在する
こと、それで全ｍＲＮＡ分画中に相当するメンセンジャ
ーの仔在ずろこと７制明した。

２　α１−アンチトリプシンンコードす６　ｍＲＮＡχ
求めての全ｍＲＮＡの調製物の濃縮 サイズで約５０．００ロタ゛ルトンの蛋白貝ンコードす
るｍＲＮＡに関して濃縮づ−ろことにより、α１−アン
チトリプシンンコード１−ろｍＲＮＡ乞銀縮しそして分
離すること７つきの段階に実施した。この目的では、全
ｍＲＮＡ　（７）　６０　／１ｇ　乞、１０から６０％
スクロースグラジェント上でサイズに応じて分画した。

Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｓ　Ｗ　４１０−ター中で遠心したあ
と・４００μＴ宛の６０分画ン得、翻訳生成物について
上記したような、免役分析およびｆｌｕｆｆ気泳動分析
ンアわせて行ない、ａｌ−アンチトリプシンの合Ｊ戎に
ついてインビトロで試験した。これらの実験で、α１−
アンチトリプシンンコードするｍＲＮＡの量の大きいｍ
ＲＮＡ分画ケ同定しえた。この分画は約１４から１５８
のｍＲＮＡに相当し、６μｇの祠料ン含有した。

ろ、鋲ＲＭ　ｍＲＮＡ分画に対応するｃ　ＤＮＡのイン
ビトロ合成 α１−アンチトリプシンに関して濃縮したｍＲＮＡより
出発して、それに相当するＤＮＡ　Ｙ合成した。

この段階は、一連の酵素的段階ン必要とした。第１に、
ｍＲＮＡに対し相補的のＤＮＡ鎖ン鎖酸合成のに逆転与
酵糸を用いた。ついで同じ酵素またはＤＮＡポリメラー
ゼを用いて、第１の頚に相補的の第２のＤＮＡ鎖を合成
した。最後に、第６の酵素、Ｓ１ヌクレアーゼの作用で
、二本鎖であるか、ふつう遊離木端と称されろ一本鎖末
端乞含まぬＤＮＡと分子としえた。上記のように得られ
た、α１−アンチトＩＪフ０シンについて濃縮されたｍ
ＲＮＡの６μｇケ用いて５２０　ｎｇのｃＤＮＡ　’ｌ
得た。・４、　　ＤＮＡ−ＡＴに相当するサイズの分子
に関しての、ｃＤＮＡ調製物の濃縮 ｃ　ＤＮＡ分子の集まりは均質でないので、１．１キロ
ベースより大きいサイズの分子ケ含有する分画のみン１
呆留し、それゆえに、α１−アンチトリフ０シンコード
ずろ遺伝情報のすべてでないにしても大部分χ官有する
クローメンうろのに役立つように、スクロースグラジェ
ント上の分画に処した。つまり、α１−アンチトリプシ
ンの６９４アミン１液ヲコードするｍＲＮＡ　、っまり
α１−アンチトリプシ７　ｍＲＮＡ　ｏ）理帥サイズは
、６９４コドン、つマリ１１８２月基または約１．１キ
ロベースでああ。この目「ソで、上ｉ己のように缶られ
たｃＤＮＡの５２０ｎｇ　Ｙ　１０−３０≠スクロース
グラジエント上におきＢｅｃｋｍａｎ　Ｓ　Ｗ　４　ｉ
ローター甲で遠心した。

１・１キロベースより大きい７１）または寺しいサイズ
の分子に相当する分画ン東めた。１００　ｎｇのｃＤＮ
Ａケ含自していた。

５、　　ＤＮＡ　−ＡＴ　Ｋ　関してｉ’ＴｈＪ　ｉＲ
−＋した（ＤＮＡ　ＩＭ　Ｉｕ物への付着末端の付加 適当なベクター中ＩＣｃＤＮＡンづ申入するためには、
でれに付着木端ケ付加１−ろことか弔１に必要でありた
。この目的で＋ｆ　Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ　、
　Ｌ、　。

ＥｆＳｔｒａｄｉａｔｉｓ、　Ａ、、　Ｂｒｏｏｍｅ、
　８．、　Ｌｏｍｅｄｉｃｏ、　Ｐ、。

’Ｉ’１ｚａｒａ＋　Ｒ，、Ｎａｋｅｒ、　Ｓ、Ｐ、、
　Ｃｈｉｃｋ、　Ｗ、Ｌ、およびＧｊ、１ｂｅｒ；、　
Ｗ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　ＴＪ、Ｓ、Ａ。

部欠付加する技術〉用いた。この方法では、上記のよう
に得られた濃縮ｃＤＮＡの１１００ｎ’Ｙターミナルト
ランスフエラーゼで処理し、長さで約１５温基のオリゴ
−ｄ　（Ｃ）尾部を６′末端に加えた。

このＷ　ｌ’ｔ”ｉではＴｅｔ”およびＡｍｐＲｙ、＝
担うＩ）ＢＲ３２２乞用いた。ｐＢＲ３２２は、Ａｍｐ
Ａ遺伝子中転子限酔系ＰｓｔＩに対してのひとつだけの
制限サイト７市１−ろ。ＰｓｔＩによろヌクレアーゼ消
化でプラスミドはｉ亘線状となり、ただひとつだけの仲
人サイトヶ与えろ。ついで、上記した方法により、クロ
ーン化ベクターの５′木端にオリゴ−ｄ　（Ｇ、）尾部
ン酔紮的に加え、クローン化さるべ＠　ＤＮＡの仲人を
実施しうろようにすれば十分である。記載した例では、
ｐＢｐ６２２は長さで３ｏ塩基のオリゴ−ｄ（Ｃｉ、）
尾都乞担った。

約１０モル比に対応する量の、７０　ｎｇの得られた保
ｋｏ　ＣＤＮＡと２００　ｎｇの得られたｐＢＲ３２２
ン、６５゛Ｃで５分、５７℃で１．５時間インビトロで
混合した。混合物は４℃にゆっくりと冷却した。

これらの条件で、相補的付着末端の対によりＤＮＡ分子
は丹結合しぞして＋１）核化した。

７、　Ｅ、　Ｃｏ１１の形買弘挾 上目己のバイブリド分子７用いてＥ、　Ｃｏ１１　ＭＭ
　２９４を形賀転侠した。ここで、Ｍａｎｉａｔｉｓ、
　Ｔ、、　Ｆｒ１ｔｓｃｈＥ、Ｆ、およびＳａｍｂｒｏ
ｏｋ＋　Ｊ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
Ｃｏｌ＋ｊ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｕｂｌｉ
ｃａｔｊ−ｏｎ　（１９８２）記載の方法で、よそ省Ｄ
ＮＡの＋１′：任に町えうあように、１問限−変型系ケ
改変した。

細菌内で、宿主の酵素により不光全の句焉木端は修俵さ
れ、その結末、Ｐｓｔ工制限ザイトは再生された。

ベクターのＴｅｒＲ属性のゆえに、それで形質私侠され
た１Ｎ（ＩＩ　ｌｉは、テトラザイクリン含有培地上の
単純な発育で選択した。それで、得られるＴｅｒＲ株の
うちで、アンピシリンの６任で死滅しなかった事大によ
り、バイブリド分子を富有する体ン同定した。−′Ｃの
理由は、ベクターのＡｍｐＡ遺伝子中転子ｃＤＮＡｙ７
仲人で、この遺伝子が不活化されたからである。

上記の操作馨りわせで５０００クローンケうろことかで
きろ。その大力はＣ１−アンチトリプシンンコードする
ＤＮＡ乞含有した。

９、　　ＤＮＡ−ＡＴ含有細菌クローンの分離α１−ア
ンチトリプシンクローンは、一方においては、Ｃ１−ア
ンチトリプシン遺伝子のフラグメントにズ１応する合成
プローブを用いて、そして他方において、クローンのＤ
ＮＡンα１−アンチトリプシンｍＲＮＡと・Ｘイプリタ
゛イセ゛−ジョンさせ、あとからより評しく記すように
、）゛・イブリｌ゛イセ′−ションされたｍＲＮＡ　Ｙ
インビトロ−翻訳し免疫学的に４ｔｌ）性づけろことに
より探された。

ヒト０１−アンチトリプシンンコードするＤＮＡフラグ
メントのヌクレオチド配列は知られているーこの悄”Ｔ
’ｆｔにもとづ＠　、Ｈｓｉｕｎｇ、　Ｈ，Ｍ、　、　
Ｂｒｏｓｓｅａｕ＋Ｒ，＋　ＭＩＣｈｒ＋１ＣＷＩＣＺ
、　Ｊ　、およびＮａｒ　ａｎｇ　ｌ　Ｓ　−１’−１
ＮｕＣ１ｅｌＣＡｃｌｄＲｅｓｅａｖｃｈ　６　：　１
３７１　（１９７９）の方法に従い、ヒトα１−アンチ
トリプシンに典型的なベプチドフラクメントＧｌｙ−Ａ
ｌａ−Ｍｅｔ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ　（蛋白買中の６４９か
ら６５６アミンｄ）ンコードす６１２　＋２Ａ基のオリ
ゴデオキシヌクレオチドに化学はりに性成した。酔系反
応によりこのプローブの５′木端Ｙ　”′Ｐでラベルし
、ラベル芒れたフ０ローブχ用いて、得られたクローン
ンスクリーニングした。　ｊ−＋１ｚｆ＝的には、谷ク
ローンのＤＮＡ　ｉ、ＣＦｒｕｕｓｔｅｊｎ。

Ｍ、′Ｊ６よひＨｏｇｎｅｓｓ、　Ｄ、、　Ｐｒｏｃ、
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ｏｓ＊　７２　：　３９６１（１９７５）の手法ン用い
、ニトロセルロースシート上に一足した。ついで、この
ＤＮＡン０２Ｊ〕でラベルした合成プローブと・・イブ
リグイセ゛−ジョンさぜた。適当なイオンおよび温度％
１７Ｆ　（０，９Ｍ　ＮａＣ１および２８　’Ｏ）でこ
の放射油性プローブは、肋・糸的に、相同ｌ配列つまり
ヒトα１−アンチトリプシンに典型的なヌクレオチド配
列欠認繊ずろ。これらの１易性クローンはオートラジオ
グラフィーでＯＪ祝化した。この方法で分伯−したｂｏ
ｏのうち、ＤＮＡ　−ＡＴの１−べてまたはｆＡｉ＋分
ヶ担う２５個のクローンケ同ボした。

ａｌ−アンチトリプシンン含有するクローンは牙たつさ
のようにスクリーニングした。上記４によりダル−ピン
グきれたクローンのプラスミドＤｉ執ン制限酵素（Ｈｉ
ｎｄ　ｍ　　）により直線化し、ついでニトロセルロー
スディスクに固定した。ついで、ＲＩＣＣ１ａｒｄ　１
−　Ｒ−Ｐ　、　＋　Ｍｌ　１ｌｅｒ　Ｉ　Ｊ　−Ｓ　
、およびＨａ−ｏｅｒｔ、　Ｂ、Ｅ、、　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６：４
ソ２７（１９７９）の方法に従い、ディスク上に向ボさ
れたＤＬ４Ａに対応ずろｍＲＮＡの符異的・・イブリダ
イセ゛−ジョン火可能とす熱条件でヒト肝臓より抽出さ
れた全ｍＲＮＡとディスク７接触させた。

・・イプリダイゼーションされたｍＲＮＡは、採取し、
ウサギ小胞体系中でインビトロで翻訳されえた。

翻訳生成物はそのままかまたはＣ１−アンチ）　ＩＪプ
シンに特異的な抗体で免疫沈降させてから分析しえた。

この方法でＣ１−アンチトリプシンに対ずろコード配列
ン含有する１群のクローンが同定された。それぞれの分
離されたクローンについて回じ型の保作ン行ない、Ｃ１
−アンチトリプシンの遺伝子情報ン含有するクローンが
明確に同定さオ′した。これらの′犬ｌ′ｌ天で、分令
丁さ才した３２クローンのうちから、、　　ＤＮＡ　−
ＡＴ　ｆ　ｄ’［１つ４１固のクローンか同定芒れｆニ
。

上記の２つのスクリーニング法で分離されたクローン中
に仲人されたＤＮＡフラグメントはＫｅｌｌ。

Ｒ，０，、Ｃｏｚ７．ａｒｅｌｌｉ、　Ｎ、、　Ｄｅｕ
ｔｓｃｈｅｒ、　Ｍ、Ｐ、、Ｌｅｂｍａｎ。

Ｉ　、Ｒ，およびＫａｒｎｂｅｒｇ、　Ａ、　Ｍｅｔｂ
ｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍｏＪｏ３ｙ７３　：４４２（
１９７０）Ｔｈ己４戊の゛′ニソクトランスレーンヨン
０法により　３２ｐでラベルした。ついで、ニトロセル
ロース上１１（、固定されたクローンＤＮＡの・・イブ
リタ゛イセゝ−ジョンに）０ロープ（ｌこ用いた。

通油なイオン％ｉ　ｆ４”　（Ｑ、９　Ｍ　１ｉａｃ１
　）で６５０で・・イブリグイーヒ゛−ジョン芒せた。

これらの条件で、放射性フ０ロープ（・ま、分析された
５００クローンのうちＤＮＡ　−ＡＴ配列含自クローン
９５１固し明らかにした。こオｔらのクローンのいくら
かにおいて、クローン化ＢれたＤＮｌｌ、−ＡＴフラグ
メントのサイガン６川足した。七才りには、各クローン
の７０ラスミドＤＮＡン分離し、そしＹＰｓｔＩで消化
し、アガロ−スケゞル上でＤＮＡフラグメントン分夕ｊ
した。非グリコシレート化α１−アンチトリプシンの分
子量は±４８．［Ｊ　００ダルｌ・ン（または±４００
アミノ酸）なので、コード配列の全部かクローン化され
たとてれ（工御人物か±１２００塩基対に近いクローン
か見出だされると予期されろ。

用米は、分析した檀々のクローンのうち、いくつかは、
０１−アンチトリプシンの全遺伝子情報に矛盾しないサ
イズの挿入物’Ｙ−Ｊ’Ｓうこと乞示した。

約１６７０ｉ盃基対のＤＮＡ　−ＡＴフラグメントケ担
う、以１４ｐＴｊＬＢ　１５２３と称する・・イブリド
分子か、下記ずろように、得られそして特性づけられた
。

（ｄ）　　ｐＴｊＬＢ　１５２３中にクローン化された
ＤＮＡ−Ａ、Ｔの特性うけ ｐＵＬＢ　１５２３のＤＮＡ−ＡＴは制限地図の作製に
より特性うけられた。この目的で、Ｐｓｔ■消化でプラ
スミドより分離された挿入ＤＮＡは、１個または１個よ
り多くの制限酵系により消化された。倚られたフラグメ
ントの配列で制限地図ン作製した。

この地図はついて一方において、ヒトのα１−アンチト
リプシンのＤＮＡについて９ｇＬｌられているものと、
他方において、ヒトα１−アンチトリフシン７コード−
Ｊ−ｈ　ＤＮＡの５′フラグメントおよび６′フラグメ
ントとして知られていル４）のと比較し１こ。いくつか
の＋ｔｉｌｌ眠アイトオアイトまたいくつかの時延の！
ｔｉｌｌ限ザイトのあいたの距離、’Ｉ’ａｇＩ−Ａｃ
ａＩおよびＡｖａＩ　−Ｈｊｐ、ｆＩ等か、ヒトα１−
アンチトリフ０シン７コードず７′）ＤＮＡの６′フラ
クシヨン中に存在１−ろザイｌ−Ｙ　Ａ］ｉ！　＋処に
期待された〕市つにｐＴＪＬＢ　’ｌ　５２３中にも見
出だされた。

このデータは、クローン化ＤＮＡのフラグメント配向、
鎖停止コドン、蛋白質の開始位置（ＧＡ○）、フ０レカ
ーサーの開始位置（ＡＴＯ）の位ｆΔづけ、とのＤＮＡ
でコードさ才ｔろ蛋白質の長さの推定ンｂ］能とした。

特に、ＢａｍＨＩザイト（位置１０５）が挿入物中に存
在ずろか、これは、このＤＮＡか少なくとも６６０個の
α１−アンチトリフ０シンアミノ酸、つまりほとんど蛋
白質全１杢ゲコードずろこと７フａ味′１−ろ。第１図
は、ｐｌＪＬＢ　１５７３に挿入されたＤＮＡ　−ＡＴ
の制限地図７示す、 ｐＵＬＢ　１５２３にクロー７化されたＤＮＡ　−ＡＴ
かヒトα１−アンチ）　ｌ）プシンのすべてンコードす
ることケ確かめろために、クローン化されたＤＮＡの５
′穎域のヌクレオチド配列ン決定した。この実験は、５
′Ｐで容易にラベルされつろＤＮＡフラグメントの生成
ン可能とずろＢａｍＨＩ　ｊｉｉｌｌ限サイト（位ｆＦ
ｆ　１０５　）　＆　Ｌｔｉ’いうろことにもとづいて
いる。

ラベルされたフラグメントはついで１連の化学反応に処
して、裡々の大きさのラベルされたオリゴヌクレオチド
とし、それらンポリアクリルアミドゲル上で分析してヌ
クレオチド配列を決定した。

方法は、Ｍａｚａｍ、　Ａ、Ｍ、およびＧ１１ｂｅｒｔ
　Ｗ、　、　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｏｓＡ７４　：　
５６０　（１９７０）に１■する。第２図に示すように
、ｐｏｂＢ１５２乙にクローン化されたＤＮＡは開始コ
ドンＡＴ（］　７ｒ含有し、このコドンより下流への塩
基の配列はα１−アンチ１゛リプシンのシグナルペプチ
ドの既知のアミノ酸す１列に対応している。それでＴ）
ＴＪＬＢ　１５２３はヒトａ１−アンチトリプシンのす
べてをコード′１−ろと結論しうろ。

ｐＬ］ＩＪＢ１５２３により担われろＤＮＡ　−ＡＴフ
ラグメントヒトα１〜アンチトリプシンのすべてアコー
ドするのみなら３−１３−１Ａ遺１パ子のプロモーター
に関して正しい転写配置にそして正しい読み取りフェー
スｊ４ｃｉ申人されている。これらの納戸んは、第１図
のｐ［ＪＬＢ　１５２５の：ｆｆ’Ｊ　ｉ、！！４卸り
図および第２１ｇ］にボされろ仲人物中の開始域の１１
犠基のｒ配列の両方から結論されろ。そｉｔでクローン
化ＤＮＡ−ＡＴの発現’ｌ、Ｍｌ＼４２９４中でのヒト
α１−アンチｌ−１）プシンの抗原性ヂターミナンｌ”
Ｙ担う蛋白質の合成により知ろことかで＠７−）。正し
い配向にそして６個ノ読み１収９フエースのそれぞれひ
とつづつでα１−アンチトリプシン娶コードするＤＮＡ
　ｉ相う１連６個の・・イブリド分子ン梅築した。ヒト
蛋白質の合成は、正しいｗ゛巳み取りフェースに挿入物
χ有するバイブリド分子ン４４１］閑にのみ生起ずろた
ろうと期待ぶれた。これらろ個の・・イブリド分子のＩ
Ｎ染Ｉ工、つさの段１漸ケ用いてイー丁なわれた。

バイブリド分子ｐＴ）ＬＢ　１５２３　（７）　ＤＮＡ
　ノＰｓｔＩ制眠サイトによりＤＮＡ−ＡＴＹ分離する
。

このＤＮＡ　−ＡＴを、ＰｓｔＩで直線状としたｐＫ　
２７９ｐｘ　２８０およびｐｘ　２８７の６個のベクタ
ーのＤＮＡと混合する。

ＤＮＡフラグメントを、４°Ｃで１６時間ＤＮＡリガー
ゼでリグ↑−トずろ。

Ｅ、　Ｃ○ＮＭｉｎ　２９４を形質転換し、それらより
堅む細菌？選択する。

得られた細菌のうちから、正しい配向にＤＮＡ　−ＡＴ
欠担うもの乞同定するには、・・イブリド分子の制限地
図ケ作製した。このようにして、ｐＫ２７９−６、ｐＫ
　２８０−２４およびｐＫ　２８７−５２と称す７）６
個の・・イブリド分子が得られた。これらのそれぞれは
、歳切な配向にそして６個の用油な抗み取リフエースの
うちのひとつのフェース乞翁スるセ（態としてＤＮＡ　
−ＡＴン担っている。

・・イブリド分子ｐＴｊＬＢ　１５２３、ｐＫ　２７９
−３、ｐＫ　２　’ｔ３０−２４　ｕよびｐＫ　２８７
−３１Ｙ担うＥ。

Ｃｏ１１　ＭＭ　２９４中のヒトα１−アンチトリプシ
ンの合ｒ＊を証明するために、全細菌抽出９勿中の蛋白
ｆｆｉの恢出ンｕｆ　ｊ止と１″ろ免役試、顎ゲイ］な
った。この試１１′！天のノ早３．ｌＪｉは第６区１に
説明ず４が、ここで用いられているｌｉ３号はっさのよ
うである。

ｏＡＭ　：マウスイムノグロブリンに丑異的のパーオキ
シダーゼ゛でジベルδれた山手イムノグロブ　リ　ン ＭａｈＡＴｒｙｐ　：　　ヒトα１−アンチトリプシン
に％Ｘ的のマウス１元１杢 ｈＡＴｒｙｐ　：細ｍ抽出・物中に、住在ずろ、Ｘ’Ｔ
照としてのヒトａ１−アンチトリプシンまたはヒドロ１
〜アンチトリプシン ０ＡｈＡＪ″ｒｙｐ　　固体州体上ＩＣ固足されたヒト
α１−アンチトリプシン知特異的な羊抗体 発色性基質（０）はｏＡＭに結合させたパーオキシダー
ゼと反圧、しオレンジに有色する。これケ４９５ナノメ
ーターで１ｔｌｉ　＞ｔ’ｔろ。

アムン博々のバイブリド分子ケ担う細 菌よりの抽出物に逆用ずろと、予期されたように、ｐＢ
Ｒ３２２ｗ囮うλ・Ｊ照１未はα１−アンチトリフ０シ
ンゲ合ｊ或せｆ　　ｐｌＪＬＢ　１５２３ではこの蛋白
質の、醪任が４火出ａれた。

Ｇらに、６個の・・イブリド分子のそれぞれを含有する
休のうちで、正しい試み取りフェースに挿入されたＤＮ
Ａ　−ＡＴアンチるバイブリド分子ン担うもののみか、
凡戦的大量にα１−アンチトリプシンケせ成した。

以上、現在のところ有利と考えられる具体例で本発明ン
説明して米たが、本発明ケ逸脱しないで、口」舵な神々
の変化および改変が専門家には明らかであろう。それで
、本発明の梢神および範囲内に属ずろよつなそのような
変化および改変も、本発明の対象となるものとする。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐｔｌＬＢ１５２３に挿入されたＤＮＡ−Ａ
Ｔの制限地図７示す。 第２図はヒトα１−アンチトリプシンについての一８１
５分旧ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。 第６図は細菌抽出物中にヒトα１−アンチトリフ０シン
ン恢出す７）免疫試験を示す。 第１頁の続き （Ｍ−明　者　アルフレッド・ジャイム・モライス・ク
ラバドー ベルギー国ローデーセントージ エネセ・アベニュ・デ・シイグ ネス２１ ０発　明　者　パスカル・へりオン ベルギー国サムプレビル・リュ ・ドウ・ファリソル６５ 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５９　　年特許願第　　３０１３６　　　号３、補
正をする者 事件との関係　特１、′１出願人 住　　所 ４、代理人 ５、補正命令の日イ」 昭和５９年　５月２９　日 ６、補正により増加ずろ発明の数 ７、補正の対象

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１，）　　（ａ）　　ヒト肝畷より全ｍＲＮＡを抽出
   しそして精製し； （ｂ）　　ヒトα１−アンチトリプシンをコードするｍ
   ＲＮＡのサイズに相当するサイズを有するｍＲＮＡを４
   権し； （Ｃ）　　段階（ｂ）の濃縮ｒｎＲＮＡよりｃＤＮＡを
   インビトロで合成し； （ａ）　　ＤＮＡ　−Ａ　Ｔのサイズに相当１−るサイ
   ズを有するｃＤＮＡを製器し； （ｅ）　　段階（ｄ）の９　Ｎ　ｃＤＮＡに付着末端ヲ
   付加し；（ｆ）　　段階ｔｅ＞でイ（）た濃野、宿ｃＤ
   ＮＡと相補的付着床ＨＭを含有するベクターとをインビ
   トロで混合してバイブリド分子ケ採取し； （ｇ）　　段階（ｆ）のハイデリド分子でＦ、　ｃｏｌ
   ｉ　ｑ形質転換し； （ｈ’ｌ　　ヒ）　ＤＮＡの挿入されたフラグメントを
   含有する細菌クローンを選択し、；そして （１）　　ヒトα１−アンチトリプシンに関してスクリ
   ーニングすることにより、一段階（ｈ）の生成りローン
   よりＤＮＡ　−Ａ　Ｔ含有細菌クローンを単離すること
   からなるヒトα１−アンチトリフ０シンを産生する細菌
   性クローンの調製方法。 （２）段階（ａ）での抽出をグアニジンクロライド処理
   により行なう、上記（１）項記載のヒトα１−アンチト
   リプシン産生細菌性クローンの調製方法。 （３）段階（ａ）での精製を、第１）ゴーｄ　（Ｔ）セ
   ルロースカラム上のアフイニテイクロマトグラフイーで
   行なう、上記（１）項記載のヒトα１−アンチトリプシ
   ン産生細菌性クローンの調製方法。 （４）　　段階ｆｂ）での濃縮を、スクロースグラジェ
   ント上の遠心により行なう、上記（１）項記載のヒトα
   １−アンチトリプシンを産生ずる細菌性クローンの調製
   方法。 （５）段階（ｂ＋での濃縮を、アがロースデル上の電気
   泳動により行なう、上記（１）項記載のヒトα１−アフ
   チトリフ０シンを産生ずる細菌性クローンの調製方法。 （６）　　Ｗ、　ｃｏｌｉが菌株Ｍ　Ｍ　２９４である
   、ヒトα１−アンチトリゾシンを産生ずる細菌性クロー
   ンの調製方法。 （７）　　段階（ｎでのベクターＹ、ｐＢＲ３２２、ｐ
   Ｋ２７９、ｐＫ　２８０およびｐＫ　２８７より成立つ
   群より選択する、上記（１）項記載のヒトα１−アンチ
   ）　ＩＪゾシンを産生ずる細菌性クローンの柵製方法。 （８）段階（ｊ）でのＤＮＡ　−Ａ　Ｔに間して濃縮さ
   れたｃＤＮＡを、該ベクターのＡｍｐＡ遺伝子のＰｅｔ
   エサイト中Ｖ中入挿入、上記（１）項記載のヒトα１−
   アンチ）　ＩＪプシンを産生する細菌性クローンの調製
   方法。 ＋９）　　ＭＤ　菌性ＤＮＡ　？、α１−アンチトリプ
   シンのアミノ酸Ｇｌｙ　−１，ａ　−Ｍｅｔ　−Ｐｈｅ
   　−Ｌｅｕに特徴的の合成オリイヂオキシリボヌクレオ
   チドゾローブとハイブリダイゼーシヨンさすことにより
   段階（１）でのスクリーニングを行なう、上記（１）項
   記載のヒトα１−アンチトリプシンｆｉｇ生する細菌性
   クローンの調製方法。 （■０）細菌性ＤＮＡをヒトα１−アンチトリプシンｍ
   ＲＮＡとハイブリダイゼーションさすことにより段階（
   ｉ）でのスクリーニングを行なう、上記（１）項記載の
   ヒトα１−アンチトリプシンを産生ずる細菌性クローン
   の調製方法。 旧）　ベクターおよびα１−アンチトリプシンをコード
   するｃＤＮＡ　Ｙ含有するバイブリド分子。。 （＋２）　　ｐＢＲ３２２、ｐＫ　２７９、ｐＫ　２８
   ０およびｐＫ　２８７より成立つ群より該ベクターを選
   択する、上記（１］）項記載のバイブリド分子。 （１３）該バイブＩＪ　ｙ分子がＴ）ＵＬＢ　１５２ろ
   でおる上記（ｌｌｊ項記載のバイブリド分子。 （１４）　　ヒトα１−アンチトリプシンをコードする
   本質的に純粋なｃＤＮＡ　。