CN114651005A - 生产和使用重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)及其组合物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的实施例总体涉及包括具有单独引入的突变的人AAT变体的重组α1‑抗胰蛋白酶(AAT)蛋白、含有这种重组AAT蛋白和载体的组合物、表达这种重组AAT蛋白的表达质粒或载体和宿主细胞、生产这种重组AAT蛋白的方法和用本文所述的重组AAT蛋白和/或重组AAT蛋白组合物治疗有需要的受试者的AAT缺乏症相关的疾病、障碍和病症或导致蛋白酶诱导的组织损伤的疾病、障碍和病症的方法。通过本文所述的方法生产的源自哺乳动物宿主细胞的重组AAT蛋白可以大量生产,而没有任何动物组分,即高度纯、高度糖基化,并且可以有利地用于血浆衍生AAT。
Description
序列列表
本申请包含序列列表,所述列表已经由EFS网络以ASCII格式提交,并通过引用整体并入本文。创建于2019年1月23日的所述ASCII副本名为SEQ LIST_178225.01000.txt,且大小为39千字节。
技术领域
本发明总体涉及重组人α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白及其变体、含有这种重组AAT蛋白的载体和宿主细胞以及制作和使用这种AAT产物治疗AAT缺乏症相关疾病、障碍和病症的方法。
背景技术
α1-抗胰蛋白酶或a1-抗胰蛋白酶(AAT、A1AT、A1A)是广泛的糖肽、急性期蛋白和丝氨酸蛋白酶的抑制剂,包括例如也具有抗炎功能的丝氨酸蛋白酶抑制剂(Serpin)超家族的抑制剂。在人中,AAT由SERPINA1(Serpin家族A成员1)基因编码。野生型成熟AAT糖蛋白具有394个氨基酸,并且在残基46(Asn 46)、83(Asn 83)和247(Asn 247)的天冬酰胺处被N-糖基化。AAT也被称为α-1蛋白酶抑制剂(α1PI),因为它能够抑制多种蛋白酶,而不仅仅是胰蛋白酶。它主要是中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制剂,但也抑制组织蛋白酶G、糜蛋白酶、纤溶酶原激活物、蛋白酶3等(Janciauskiene S.《生物化学与生物物理学报(Biochim BiophysActa)》,1535(3):221-235,2001)。
在体外和体内,AAT还被表征为抗炎和免疫调节蛋白(Janciauskiene S等人《呼吸医学(Resp.Med.)》105:1129-1139,2011)。大多数蛋白天生折叠成其最稳定的形式。然而,AAT的基本功能是由于其较高的构象灵活性,这有利于其与多种蛋白酶和其他物质的结合。AAT主要在肝脏中生产并释放到循环。这一蛋白的至少一种公认的最佳功能是保护肺免受炎性细胞的活化酶诸如例如中性粒细胞弹性蛋白酶(一种当机体白细胞对炎症或感染作出反应时释放的酶)引起的损伤。为了保护肺中的***免受丝氨酸蛋白酶降解,蛋白酶和抗蛋白酶之间的平衡是重要的,并且这一平衡由AAT的抗蛋白酶活性提供。在缺乏正确的定量和定性AAT量的情况下,中性粒细胞弹性蛋白酶可能会破坏或分解弹性蛋白(一种能够使组织在伸展或收缩后恢复到其原始形状的***中的重要蛋白)。
由于SERPINA1基因中的遗传缺陷,当身体不能制造足够的AAT蛋白来保护组织免受蛋白水解损伤时,会发生α1-抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症。已描述了许多AAT缺乏症变体,然而,临床上最显著的缺乏症是由Z变体(342位谷氨酸至赖氨酸突变;E342K)造成(Hag I等人《美国呼吸***细胞和分子生物学杂志(Am JRespir CellMol Biol.)》54(1):71-80,2016)。
人的严重AAT缺乏症被定义为AAT血浆水平低于11mmol/L(即,约0.5g/L)。AAT缺乏症可能是由蛋白稳定性、分泌和功能活性异常引起的。例如,Z型AAT变体的错折叠与AAT分子通过有序自缔合(或聚合)的细胞内累积相关联。由于肝脏是生产AAT的主要器官,因此异常AAT蛋白在肝脏中的滞留可能导致肝病(例如,新生儿胆汁淤积、肝硬化、肝癌等)。另一方面,在急性和慢性炎症情况期间,分泌较少的缺陷AAT蛋白及其细胞外聚合提供的AAT量不足以保护肺和其他器官。这一状况可导致肺病(例如,肺气肿、哮喘、支气管扩张、慢性阻塞性肺病(COPD)、慢性支气管炎等)以及其他障碍和病症,包括但不限于例如脂膜炎、韦格纳肉芽肿病和血管炎。
从人血浆中纯化的AAT蛋白制剂常用于人疗法(Lebing,W.“α-1蛋白酶抑制剂:疾病、蛋白和商业生产(Alpha-1 Proteinase Inhibitor:The Disease,the Protein andCommercial Production.)”在:Bertolini,J,Goss,N.,Curling,J.(编辑):Wiley andSons,Inc.(2013)pp.227-240;Lundblad,R.L.在:Lundblad血浆蛋白生物技术(LundbladBiotechnology of Plasma Proteins).Taylor and Francis Group 2013.pp.285-323)。在健康人血浆中,AAT以约1-2g/L的浓度存在。严重遗传性AAT缺乏症(AATD)患者通常采用衍生自人血浆的人AAT蛋白治疗。严重缺乏症被定义为具有已知的严重缺乏基因型/表型(例如,PI*ZZ、PI*Z null、PI*null null等)和/或如果可用的血清AAT水平小于0.5g/L。严重AAT缺乏症患者通常具有约0.1-0.25g/L的AAT浓度(Ferrarotti I等人《胸部(Thorax)》,67:669-674,2012;Stoller J等人《美国胸科学会年鉴(Ann Am Thorac Soc)》12(12):1796-1804,2015年12月)。最常见的严重遗传性AATD之一是SERPINA1基因中的PiZZ,由纯合子突变(残基342处甘氨酸至赖氨酸;Gly342Lys)引起。PiZZ突变导致AAT蛋白的细胞内聚集,从而阻止其分泌。在错折叠的Z-AAT蛋白的细胞内累积(即,功能获得或蛋白毒性)和导致组织损伤和最终发展为慢性疾病的Z-AAT蛋白分泌减少(即,功能丧失)之间存在机制性联系。
临床上,PiZZ携带者极易发生肺气肿和肝病。通常进行性肺气肿形式的肺病在人类生命尤其是吸烟者的第4或第5个十年期间发生。PiZZ突变可能导致成年后发生急性新生儿肝损伤和慢性进行性肝病。除此之外,PiZZ携带者表现出升高的炎性或免疫反应,使其易患脂膜炎或伴有多血管炎的肉芽肿病。PiZZ携带者还可能存在其他几种形式的疾病。
人AAT的血浆衍生纯化制剂作为生物产品,用于治疗AATD肺病患者,目的是减慢疾病的进展。除肺气肿外,被认为与AAT水平降低和/或功能活性降低相联系的一组病理性障碍包括HIV 1型感染、丙型肝炎感染、糖尿病、纤维肌痛、***性血管炎和坏死性脂膜炎。1型糖尿病、囊性纤维化和移植物抗宿主病的AAT替代或取代疗法正在临床试验中进行评估。
然而,纯化的、配制的血浆衍生AAT制剂存在一些与质量相关的缺陷,因为这些产品被其他蛋白污染,尽管数量很少。此外,血浆衍生AAT来源于汇集献血,因此代表在氨基酸序列和糖基化模式方面可能不完全相同的AAT分子。使用DNA测序技术已鉴定出不同于主要野生型人AAT的100多种分子AAT变体。因此,在SERPINA1基因中具有不同突变但无任何临床疾病表现的供体,很可能成为有助于将汇集血浆用作产生纯化的人血浆AAT产物的底物的人群的一部分。由于汇集血浆衍生AAT来自具有不同基因型(即,并非所有供体都具有MM基因型)的数百个供体,因此可能存在低百分比的突变,这些突变可能导致错折叠的蛋白或对接受来自重复增强疗法治疗的汇集血浆衍生AAT的患者具有免疫学影响。此外,从人血浆中分离AAT是非常复杂的长期过程,其可以改变天然循环的血浆AAT蛋白的结构,诸如通过氧化、诱导AAT聚合和/或产生其他化学形式(抑制性较低)。不同生产商从人血浆中获得的临床级AAT制剂的纯化方法、浓度和剂型不同,且价格昂贵。
已报道有在微生物中表达哺乳动物蛋白(包括人AAT)的多种方法。这些包括细菌(EP0137633)、酵母(美国专利第4,839,283和4,752,576号;EP0304971)、植物(美国专利第6,127,145号;Sudarshana MR等人《植物生物技术杂志(Plant Biotechnol J)》4(5):551-9,2006年9月)、昆虫(Chang CJ等人,《生物技术杂志(J Biotechnol.)》102(1):61-71,2003;Morifuji Y等人《分子生物技术(Mol Biotechnol.)》60(12):924-934,2018(https://doi.org/10.1007/s12033-018-0127-y)、哺乳动物细胞(美国专利第5,399,684和5,736,379号;Garver RI等人《美国科学院院刊(Proc Natl Acad Sci USA)》84:1050-1054,1987),包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(Paterson T等人《应用微生物学与生物技术(Appl Microbiol Biotechnol.)》40:691-698,1994;Lee KJ等人《糖缀合物杂志(Glycoconj.J.)》30,537-547,2013;Amann T等人《代谢工程学(Metab.Eng.)》,52:143-152,2019(epub 2018年12月1:https://doi.Org/10.1016/j.ymben.2018.11.014))和人神经元细胞系(Blanchard V等人《生物技术生物工程(Biotechnol.Bioeng.)》108:2118-28,2011)。作为另一种选择,可以在转基因动物的乳汁中生产人重组AAT(Archibald AL等人,《美国国家科学院院刊》87:5178-5182,1990年7月;美国专利第5,650,503号;Wright G等人《生物技术(Bio/Technology)》9:830-834,1991)。甚至转基因蚕最近也被用来制作人AAT(Morifuji Y等人《分子生物技术(Mol.Biotech.)》60(12):924-934,2018)。
基于微生物***、昆虫细胞或基于植物的技术的重组方法产生的材料在主要二级修饰方面与人血浆衍生AAT不同,因此具有不够复杂的人样糖基化,暴露不同的非人样糖基化,或完全缺乏它们。除了对功能性的影响外,这些特征还导致此类材料在注射到动物体内时的循环半衰期缩短,这使得它们不适合用于一般疗法。
为了饲喂足够大的畜群用于“工业挤奶”,在雌性的乳汁中生产所需蛋白的转基因动物(诸如绵羊或山羊)的产生是非常复杂且昂贵的长期工作。此外,这些方法具有缺点,因为可能存在已知和未知病原体污染产品的某些风险,因为动物不能在无病毒、无真菌和无细菌的环境中饲喂。AAT产品需要从数百只动物的乳汁中纯化,并且在专业农场繁殖和饲喂。尽管几家公司进行了重大投资,但这些尝试几十年前就已经终止了。
也曾尝试表达培养的动物细胞中的重组人AAT,但总体成功有限,且被认为不足以进一步开发。已利用了CHO细胞和人细胞系。在所有情况下,尽管为提高生产率做出了巨大努力,但获得的AAT材料的量都相当低。在其中一个最佳案例中,从未在工业中广泛使用的人细胞系中,获得了小于3g/L(Ross D等人《生物技术杂志(J.Biotech.)》162:262-273,2012)。此外,由于生产工艺期间使用胎牛血清(FBS),仍存在可接受质量的问题。FBS——培养基中的生长促进剂,即培养基添加剂,由于与牛朊病毒疾病相关联的潜在风险因素,目前通常被排除在大规模制造工艺之外。Amann T等人(《代谢工程学(Metab.Eng.)》52:143-152,2019(epub 2018年12月1:https://doi.Org/10.1016/j.ymben.2018.11.014))公开在糖工程CHO细胞系中制成的AAT的表达已经进行,然而,同样,在13天内在“优化的”补料分批工艺中获得的产率仅达到150mg/F(即,0.15g/F),这再次证明生产率不足以获得血浆衍生AAT的商业上可行的替代品。对于一个患者,要获得单次1周剂量的AAT,将需要多达20升的这种细胞培养过程。考虑到Lalonde等人采用的当前技术,仍长期需要生产高产率的AAT(或在本文可互换使用的重组AAT),其使用诱导型表达***在CHO细胞中仅产生1g/L的重组AAT(参见,例如Lalonde等人《生物技术杂志》307(2020)87-97,2019,其通过引用并入本文)。这个量对于商业可行性来说仍然太低,并且生产速率也太低。考虑到细胞培养物中的生产产率不反映配制和高度配制的蛋白的产率,可假定将实际向患者提供这些培养物产率的不到一半。
每年需要100至200克AAT的量来供应需要AAT替代疗法的单个患者。当使用任何先前描述的生产***时,在1-3g/L的细胞培养物产率下,用于未来市场的重组产品的必要制造操作规模将是非常大的,因此使得重组产品非常昂贵。
最重要的是,所提及的应用于合成重组人样AAT的基于细胞培养物的技术中,没有用于生产临床上朝着其最终用途发展的材料。因此,需要AAT进行治疗的患者继续依赖于供应不一致或萎缩的来源于汇集和分馏人血浆的产品。因此,在本领域中需要用于改进糖基化的、治疗有效的AAT的生产的方法和手段,并且优选地,从宿主生产***和相关联制造技术生产,所述宿主生产***和相关联制造技术在几十年中一贯地显示为治疗性蛋白的优异来源。
已知的治疗方法因AAT缺乏患者而异,但大多针对AAT缺乏症的症状和生理结果。这些治疗可包括肝脏/肺移植、肺气肿的AAT替代(或也称为增强)疗法,以及使用例如支气管扩张剂、皮质类固醇、补充氧、肺康复、抗生素和针对病毒性肝炎和流感毒株的疫苗治疗症状,以及减少或消除环境风险因素。最广泛用于肺气肿患者的AAT缺乏症的治疗是利用血浆衍生AAT可注射制剂的替代疗法。这些制剂向携带负责蛋白变体的突变基因的患者提供蛋白酶抑制活性,所述蛋白变体不提供蛋白酶抑制活性或提供很少的蛋白酶抑制活性。在某些人组织(例如肺)中,需要一定量的蛋白酶抑制来维持蛋白酶和蛋白酶抑制剂之间的平衡。蛋白酶抑制的缺乏或不足会导致组织降解过程,并因炎症而增强。此外,在这些炎性过程中,AAT的功能水平提供超出蛋白酶抑制的抗炎支持。
AAT相关肺病在临床上最相关的治疗目标是通过用功能性AAT蛋白增强蛋白酶抑制来减慢或消除肺损伤的进展。替代或增强疗法是针对AAT相关疾病的特异性疗法,并且通常使用来自健康供体血浆的AAT,以提高遗传性和/或获得性AAT缺乏症患者的血液和其他生物流体中循环的AAT蛋白水平。利用AAT的替代疗法通常通过静脉输注人血浆衍生和纯化的AAT进行。为了在这些AAT缺乏患者的血液中达到约1g/L至2g/L的功能性AAT水平,患者可接受静脉输注。内源性AAT在人中的循环半衰期已显示为约五天。已发现人血浆中的内源性AAT的浓度是约1-1.75g/L。
为了向AAT缺乏患者提供单周剂量的AAT,需要来自供体的超过半升至超过3升(例如,大于0.5L、1L、1.25L、1.5L、1.75L、2L、2.25L、2.5L、2.75L、3L、3.25L、3.5L、3.75L、4L)的人血浆。因此,目前可获得的血浆衍生AAT的供应是有限的,并且不能满足日益增长的使用和需求。尽管数十年来多次尝试通过重组DNA技术提供高质量AAT制剂的安全且商业上可行的来源,但对于制造临床上可接受质量和数量的用于增强或替代疗法的人重组AAT,没有一种熟知的途径是令人满意的或适合的。
利用AAT的增强疗法被认为不是恢复已经丧失的肺功能的对策或解决方案。然而,这一疗法可以降低肺恶化的频率,减轻严重性,并减少肺气肿的进展。在美国,存在经美国食品和药物管理局(FDA)批准的至少四种商购增强疗法产品。这些批准的α-1蛋白酶抑制剂产品包括(Grifols,S.A.)、Aralast NPTM(Takeda Pharmaceutical)、(CSL Behring LLC)和(Kamada Ltd.)。然而,这些是血浆衍生AAT产品,其不仅供应有限,而且还可能具有传播致病因子(Infectious agent),例如病毒、未知或新出现的病毒以及其他病原体的风险。因此,仍然需要具有相当长的循环半衰期和生物利用度的高产率、高质量的重组α1-抗胰蛋白酶产品作为AAT缺乏症的预防性或治疗性治疗,其可以安全地施用并且通过具有经济可行性的工艺足够大量地生产。
发明内容
如本文所述,本发明及其实施例的特征在于一种重组AAT蛋白(包括其变体)、组合物、表达载体、宿主细胞和用于制造AAT蛋白(包括其变体)或编码AAT蛋白(包括其变体)的高效方法,用于生产重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,以及用包含本文所述重组AAT(包括其变体)的组合物治疗有需要的受试者的AAT缺乏症相关疾病、障碍和病症的方法。一个方面提供重组AAT蛋白,包括其变体,其中重组AAT蛋白来自任何物种,包括但不限于人。术语“重组AAT”、“其变体”或“重组AAT变体”在本文中均可互换使用,其中提及的“人重组AAT蛋白”还包括任何可互换的术语,诸如例如人重组AAT蛋白的变体。
本发明的一个方面可以涉及一种表达载体和一种将含有编码人AAT蛋白的核苷酸或核酸序列的核酸片段并入表达载体的方法。另一方面提供动员或辅助载体,其包含含有编码转座酶的核酸序列的核酸片段,其中所述转座酶是“剪切-粘贴”转座酶,诸如但不限于:piggyBac、Tol-2、Sleeping Beauty、Leap-In和可用于辅助将编码人AAT蛋白的核苷酸序列转座到至少一个宿主细胞中的任何其他“剪切-粘贴”转座酶等。
一个方面可以涉及生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,包括:a)引入宿主细胞与包含含有编码人重组AAT蛋白(包括其变体)的核酸序列的核酸片段的表达载体以分离表达人重组AAT蛋白(包括其变体)的转化体,即重组细胞;b)在允许表达人重组AAT蛋白的条件下,将宿主细胞与包含核酸片段的转化体、重组细胞或表达载体一起培养,所述核酸片段包含编码重组AAT的核酸序列;以及c)从重组细胞中分离人重组AAT蛋白(包括其变体),从而生产人重组AAT蛋白(包括其变体)。另一方面可以涉及一种包含编码人重组AAT(包括其变体)的核酸序列的核酸片段,即CHO细胞密码子优化的序列。
另一方面可涉及生产重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,其中培养步骤包括:选择具有表达人AAT蛋白的核酸片段的宿主细胞,其中选定细胞是表达人重组AAT蛋白的克隆衍生细胞。选择步骤包括:a)在培养基中永久性地(组成型)生长或培养表达人重组AAT蛋白的克隆衍生重组细胞;b)用至少一种饲料饲喂表达人重组AAT蛋白的克隆衍生细胞;c)将培养基保持在足以维持或促进正常、健康细胞的细胞培养温度;d)改变或降低细胞培养温度;e)在降低的细胞培养温度下生长或培养克隆衍生细胞,直到细胞以约1g/L或更大的滴度表达重组AAT蛋白,例如人重组AAT蛋白。
另一方面可以涉及一种生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,包括:a)将编码人AAT蛋白的第一核酸序列和编码转座酶的至少一个附加核酸序列引入例如真核宿主细胞中;b)在允许表达编码人AAT蛋白的第一核酸序列(包括其变体)的条件下培养宿主细胞,其中编码例如转座酶(诸如但不限于例如piggyBac)的附加核酸序列也可以在细胞培养物中并表达以帮助并入编码即例如人AAT的目的基因,其中宿主细胞用编码人AAT的核酸序列转化;c)选择具有表达人AAT蛋白的核酸片段的宿主细胞,其中选定的细胞是表达人重组AAT蛋白的克隆衍生细胞;以及d)从宿主细胞或真核宿主细胞中分离重组AAT蛋白(包括其变体),从而生产人重组AAT蛋白,其中分离步骤可包括纯化人重组AAT蛋白。
一个方面可以涉及一种表达载体,包含:含有编码AAT蛋白的核苷酸序列的核酸片段,其中所述AAT蛋白可以是例如人AAT蛋白(包括其变体),其中所述核酸片段位于多重克隆位点;核酸片段上游的内含子;内含子上游的小鼠或人巨细胞病毒(CMV)启动子;CMV启动子上游的5'反向末端重复序列(5'ITR);核酸片段下游的聚腺苷尾信号序列;核酸片段下游的大肠杆菌复制起点序列;复制起点序列下游的可选择标记序列;可选择标记序列下游的3'反向末端重复序列(3'ITR),其中可选择标记序列可以不同于抗生素抗性序列,或者可以另选地包括抗生素抗性序列。
再一方面可涉及一种人重组AAT蛋白(包括其变体),包含与SEQ ID No:1具有约75%或更大的同一性、约80%或更大的同一性、约85%或更大的同一性、约90%或更大的同一性、约95%或更大的同一性、约96%或更大的同一性、约97%或更大的同一性、约98%或更大的同一性、约99%或更大的同一性或约100%同一性的多肽序列。
本发明的进一步的方面可以涉及一种人重组AAT蛋白(包括其变体),以及生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,其中分离的人重组蛋白具有约90%或更大、约95%或更大、约97%或更大、约98%或更大、约99.9%或更大的纯度,或大于通过血浆衍生AAT蛋白的生产、分离和/或纯化可以实现的任何纯度百分比。
本发明的一个方面提供一种组合物,包含通过本文所述的任何方法生产的人重组AAT蛋白,包括其变体。进一步的方面提供一种药物组合物,其包含本文所述或通过本文所述的方法生产的人重组AAT蛋白(包括其变体),其中所述组合物进一步包含药学上可接受的载体、稀释剂或介质。
在再一个方面,一种治疗患有α1-抗胰蛋白酶缺乏症的受试者的方法包括施用人重组AAT蛋白或包含本文公开的重组AAT蛋白及其变体和药学上可接受的载体、稀释剂或介质的组合物,其中如果受试者是人,则所述组合物包含人重组AAT蛋白(其变体),其中AAT缺乏症可通过施用人重组AAT蛋白在治疗后得到缓解或改善。又一方面提供一种治疗患有由多种基础疾病诱导的任何类型的蛋白酶诱导的组织损伤的受试者的方法,所述基础疾病包括可由不明来源的炎症引起的疾病,其中所述组织损伤可通过施用重组AAT蛋白在治疗后得到缓解或改善。
另一方面提供一种生产人重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的方法,包括:将宿主细胞与编码人AAT蛋白的第一核酸序列和编码转座酶的至少一种第二核酸序列一起培养,其中所述培养步骤在第一温度下在第一时间段和在第二温度下在第二时间段进行,并且任选在第三温度下在第三时间段进行。
附图说明
将结合附图详细描述本发明实施例的特征和优点。
图1示出了人“野生型”AAT的氨基酸序列,其前面是用粗体和下划线文本指示的前导肽序列,以及用斜体文本指示的带有限制性酶位点(SpeI和EcoR1)的相应核酸序列。图1A示出了没有前导肽序列(SEQ ID NO:1)的野生型人AAT氨基酸序列。图1B示出了包含编码的人AAT蛋白序列SEQ ID NO:1的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。由人AAT氨基酸序列的粗体下划线文本指示的各种前导肽信号序列在图1C(SEQ ID NO:3)中,具有天然人AAT前导序列(SEQID NO:11),并且提出以下作为来自不同来源的前导序列的示例:图1D,包含编码的人AAT蛋白序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:4),具有SEQ ID NO:3的天然人AAT前导肽序列,图1E(SEQID NO:5),具有人IgG重链前导序列(SEQ ID NO:12),图1F,包含编码的人AAT蛋白序列的核苷酸序列(SEQ ID NO:6),具有人IgG重链前导肽序列SEQ ID NO:5,图1G(SEQ ID NO:7),具有黑猩猩AAT前导序列(SEQ ID NO:13),图1H,包含编码的人蛋白序列的核苷酸序列(SEQID NO:8),具有黑猩猩AAT前导序列SEQ ID NO:7。
图2(图2A、图2B、图2C、图2D)示出了质粒PXLG6-AAT的6504单链核酸序列(分布在4个单独的图中,但连续计算核苷酸序列;SEQ ID NO:9),包含编码CHO细胞密码子优化的AAT蛋白序列的序列,所述序列被大写并加下划线(位置1948……3214,并且将编码AAT蛋白序列的限制性酶片段***PXLG6质粒载体的限制性酶识别位点SpeI至EcoR1,其中斜体文本表示在5'端至3'端的方向上的限制性酶识别位点(分别是位置1948……1953;位置3209……3214)。
图3示出了用于表达目的DNA的5268碱基对pXLG6载体的质粒图谱,通常***EF-1-α内含子因子的下游(998……1941bp)。质粒图谱还包括ITR piggyBac末端重复序列(321……13bp/4050……4299bp)和哺乳动物对嘌呤霉素的抗性标记(Puro-r;3834……3235bp),以及细菌氨苄青霉素抗性标记(Amp-r;5251……4391bp)。
图4示出了在共转染中用作“动员”表达载体的pXLG5载体的质粒图谱(图4A),其中编码Piggy Bac转座酶(mPBase)的基因(图4B)指示转座酶基因的位置(905……2686bp),其由巨细胞病毒(CMV)启动子(209……863bp)驱动。这一载体还包含Zeocin抗性标记,包括它自己的启动子(Zeo;3870……4244bp)。图4B示出了由pXLG5载体(mPBase 905-2686)中的序列(SEQ ID NO:10)编码的PiggyBac氨基酸序列。
图5展示了克隆衍生细胞群体CHO-rAAT_cl 12的分批(实心圆)和补料分批(实心三角形)培养性能。分别示出在活细胞密度/mL{顶部)下的细胞生长动力学(VCD;106个细胞/mL)和10天或14天的细胞培养物存活率(%)(底部)。
图6示出了2个克隆细胞系(No.112(浅灰色)和No.423(深灰色))关于细胞生长(VCD;细胞/mL){顶部)和生产率动力学(AAT滴定度;mg/L){底部)的14天补料分批细胞培养过程。
图7示出了在第12和14天测量的在图9所述条件下使用不同培养基条件生产的AAT滴度(mg/L)平均值的比较(n=4)。
图8示出了在分批工艺(第6天)和补料分批工艺(第14天)中从五种不同的克隆AAT生产细胞系(CHO-AAT No.112、275、423、555、585)生产重组AAT的分析。CDM柱(方格)表示使用商购化学成分明确的培养基(CDM;HyCloneTMCDM4CHO;通用电气医疗)的6天培养,XLG柱(灰色)表示使用化学成分明确的培养基XLG_E21_07(ExcellGene S.A.)的6天分批培养,XLG补料分批(XLG FB)柱(黑色)表示使用化学成分明确的培养基XLG_E21_07(ExcellGeneS.A.)和化学成分明确的饲料(饲料A;ExcellGene S.A.)的14天补料分批工艺培养。
图9示出了应用高通量培养条件的实验示例,其目的是获得高产率补料分批工艺,使用细胞系CHO-rAAT_cll2生产重组人AAT,同时使用化学成分明确的培养基XLG_E21_07(ExcellGene S.A.)作为基本生产培养基。
图10示出了通过大小排除色谱法分析的从生产AAT的CHO细胞纯化的重组AAT的曲线。从约12分钟至约14分钟洗脱的主峰收集纯化的重组AAT蛋白。
图11示出了衍生自重组CHO细胞的重组AAT在体外高效地降低弹性蛋白酶活性,并有效地与其靶-弹性蛋白酶形成复合物。更具体地,图11A示出了随着时间的推移,弹性蛋白酶转化底物(N-琥珀酰基-Ala-Ala-Ala-对-硝基苯胺)以重复地产生分光光度可测量的吸光度(实心黑圈)。在重组或血浆衍生AAT存在的情况下,这一转化受到显著抑制(空心圈,重组AAT;黑色三角形,血浆衍生AAT)。图11B以柱状图的形式表示图11A的数据,表明在两种情况下AAT弹性蛋白酶活性的存在降低了约50%。图11C示出了重组AAT或Prolastin(GRIFOLS)对弹性蛋白酶的抑制活性,以A和B所示不同方式且独立于A/B实验进行。简言之,将50ng弹性蛋白酶与不同浓度的重组AAT或Prolastin在室温下在50mM Tris、1M NaCl、0.05%(w/v)Brij35、pH 7.5中一起孵育30分钟。添加用于人中性粒细胞和猪胰腺弹性蛋白酶测定的中性粒细胞弹性蛋白酶底物(MEOSUC Ala Ala Pro Val AMC,Bachem,Catalog#11270,100mM)后,在460nm(380nm激发)下以动力学模式在37℃下记录荧光发射10分钟。通过从空白中减去每个点的RFU值,测量每种AAT浓度的相对荧光单位(RFU)变化。结果使用Prism 5.0(加利福尼亚州圣地亚哥的GraphPad)绘制。图11D示出了SDS PAGE凝胶(7.5%聚丙烯酰胺)的图像,其中血浆衍生AAT和重组AAT分别单独运行或在与弹性蛋白酶一起孵育后运行,显示了两种分子之间的相互作用导致AAT与弹性蛋白酶的复合物具有较高分子量带。标记;泳道1:仅5pg血浆衍生AAT(pAAT)(Zemaira);泳道2:5μg pAAT与2.35μg弹性蛋白酶(pAAT+弹性蛋白酶);泳道3:5μg重组AAT(recAAT);泳道4:5μg recAAT与2.35μg弹性蛋白酶(recAAT+弹性蛋白酶);泳道5:仅2.35μg弹性蛋白酶。
图12示出了重组AAT(recAAT;ExcellGene;R&D***)和血浆衍生AAT(Prolastin)以及含有小鼠血浆的AAT在从低纳克/毫升到超过4pg/ml(即,4,000ng/ml)的AAT浓度范围内抑制强效蛋白酶胰蛋白酶。数据以三次实验的平均值表示,并且符号附近的水平线表示与平均值的变化。
图13示出了增加重组AAT(0mg/ml至1mg/ml)的量会减少内毒素(1pg/ml)(或脂多糖(LPS))-诱导的TNF-α(TNF-α)释放(pg/ml))。
图14A和图14B示出了与次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)看家基因相比,重组AAT(1mg/ml)在人粘附外周血单核细胞(PBMC)中分别抑制内毒素(1pg/ml)(LPS)诱导的TNF-α表达(顶部;图13A)和IL-6表达(底部;图13B)。每个条表示两个独立的重复序列。
图15示出了在人皮肤的体外模型(CellSystems)中,重组AAT以及血浆纯化AAT可高效地转运通过几层皮肤。皮肤模型用于AAT在皮肤渗透方面的体外毒理学和疗效测试,其中与图15A中没有AAT的对照相比,在图15B中示出了AAT的阳性染色(由箭头指示的较暗的染色区域)。图15C示出了通过蛋白质印迹进行的培养上清液分析证明了在同时用重组AAT(recAAT)和血浆AAT(pAAT)处理的皮肤中AAT呈时间依赖性阳性,但在没有AAT的对照(Co)中不呈时间依赖性阳性。图15D示出了与不存在任何AAT的对照(0mg AAT对照;黑色)相比,通过IL-18(pg/ml),促炎细胞因子和皮肤刺激标记的总水平鉴定的皮肤刺激在6小时受到两种recAAT(10mg;浅灰色)和pAAT(10mg;深灰色)抑制。
具体实施方式
本文公开了本发明的详细实施例。然而,应当理解,所公开的实施例仅仅是说明可以以各种形式实施的本发明。此外,结合本发明的各种实施例给出的每个示例都旨在是说明性的,而不是限制性的。例如,生产重组人α1-抗胰蛋白酶的方法也可应用于生产任何其他所需的重组蛋白。基于本文的教导和本领域已知的内容,本领域技术人员将理解如何制备编码所需蛋白的表达载体以引入适宜的宿主细胞或宿主细胞群体,在允许表达所需重组蛋白的条件下培养宿主细胞,并分离所需重组蛋白,以进一步用于应用,包括但不限于治疗、研究和诊断。
除非另有提供,否则本文使用的所有术语都旨在具有其在本领域中的普通含义。除非另有定义,否则所有浓度均以指定组分相对于局部用组合物总重量的重量百分比表示。
本文使用的“一个”或“一种”指一个或多个。如本文所使用的,当与词“包括”结合使用时,词语“一个”或“一种”可以表示一个或多于一个。本文使用的“另一个”表示至少一第二个或更多个。
如此处所使用的,数值的所有范围包括端点和在所公开的值之间所公开的所有可能的值。所有半整数数值的精确值也被认为是特别公开的,并且是对所公开范围的所有子集的限制。例如,0.1%至3%的范围具体公开0.1%、1%、1.5%、2.0%、2.5%和3%的百分比以及所有中间百分比。此外,0.1%至3%的范围包括原始范围的子集,包括例如0.5%至2.5%、1%至3%、0.1%至2.5%等。应理解,除非另有说明,否则单个组分的所有重量%之和将不超过100%。
应当理解,本文描述的本发明的方面和实施例包括“包括方面和实施例”、“由方面和实施例组成”和/或“基本上由方面和实施例组成”。
本文中对“约”值或参数的引用包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施例。例如,提及“约X”的描述包括对“X”的描述。数字范围包括定义所述范围的数字。
本公开提供了人α1-抗胰蛋白酶(AAT)的替代供应,包括通过哺乳动物宿主细胞的基因工程产生的具有单独引入的突变的人AAT的变体,诸如例如分子氨基酸变体,导致AAT蛋白的丰富且可再现的供应。本公开的实施例不一定是全面的,而是向本领域普通技术人员提供足够的洞察力以遵循从高产细胞(诸如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)产生或生产高水平蛋白表达的方法,以获得的重组AAT(rAAT或recAAT)(包括其变体),例如重组人AAT。在本发明的实施例中,患有AAT缺乏症的受试者可包括任何人或另选地任何动物,其中动物可被分类为哺乳动物,包括人、家畜和农场动物,以及动物园、运动或宠物动物,诸如狗、马、猫、牛等。优选地,哺乳动物是人。本发明的其他实施例涉及重组AAT蛋白(包括其变体),其用于与正在遭受和/或待治疗的那些AAT缺乏受试者相同的物种。
实施例表明,高质量AAT的可靠、大规模供应可由生物反应器中的重组哺乳动物细胞提供,所述生物反应器针对高产生产率进行了优化。本文所述的适于悬浮培养的重组CHO细胞系或修饰的CHO细胞为大规模制造提供了基础,因为本文开发的高产小规模至中等规模工艺可扩展至约1,000L和10,000L操作。因此,数百千克修饰的CHO细胞衍生重组人AAT(包括其变体)的生产可以实现。然而,在过去几十年的研究和开发中,大量且高质量和高纯度的这种重组人AAT的供应已经失败,原因也可能在于商业上无法平衡制造成本和市场经济。
本发明的实施例解决重组AAT产品的低产率和次等质量的问题,以及生产其的方法,所述实施例是例如以下这些:提供从快速生长的宿主细胞及其衍生物即适用于悬浮培养的经优化且因此经修饰的CHO细胞产生高产的克隆衍生细胞系的方法,以及使用非常丰富的无动物组分培养基和/或饲料增补剂的细胞系开发途径和工艺条件的用途。这些方法一起可以产生生产人AAT的细胞培养物,导致在补料分批工艺中在多克/升范围内的重组AAT的体积产率,例如,高达并包括约10g/L或更大。此外,但不限于所生产的重组AAT蛋白的特定特征,可以以这样的方式产生重组人AAT蛋白(包括其变体)的方式调节培养基和某些工艺条件,所述重组人蛋白具有高水平的末端唾液酸和改变这种CHO衍生AAT的糖基化模式和状态的其他二级修饰。糖基化可用于保护蛋白诸如AAT免于从循环血流中除去,这是增强重组AAT在受试者中的循环半衰期的一个因素,从而延长重组AAT在用重组AAT(包括其变体)治疗的AAT缺乏受试者中的半衰期,其中在一个实施例中受试者是人。
本公开的实施例涉及用于产生或生产重组AAT制剂(包括其变体)的材料和方法,所述重组AAT制剂可用于通过例如替代或增强疗法来治疗患有AAT缺乏症的受试者或患者,或公开了可用于许多其他疾病的材料和方法,其中AAT可能不能被正确处理或可能被完全阻止在AAT缺乏受试者中循环或以降低的半衰期循环。通过本文所述的材料和方法生产的AAT(包括其变体)可包括重组AAT,其被糖基化,具有高水平的唾液酸,例如末端唾液酸,允许AAT在已通过增强或替代疗法治疗的患有AAT缺乏症的患者或受试者中的循环半衰期增加。由于AAT的生物活性和对AAT产品的增加的需求,对于获得或生产大量用于人治疗用途的高质量重组AAT(包括其变体)具有长期期望和积极的兴趣。本文公开的方法允许生产在可进行大规模生产的生物反应器中培养的修饰的中国仓鼠卵巢细胞中制成的极高纯度的重组AAT(包括其变体),以及生产的重组AAT(包括其变体)在治疗AAT缺乏或缺失的人疾病或病症中的用途。
人α1-抗胰蛋白酶(AAT)序列
在一个实施例中,目的AAT序列与Long GL等人(《生物化学(Biochemistry)》23(21):4828-4837,1984)公开的序列相同。它表示M等位基因,即最常见和功能性人α1-抗胰蛋白酶。全长野生型AAT氨基酸序列包含与人M等位基因对应的394个氨基酸(图1A;SEQ IDNO:1)。然而,野生型人AAT序列的前导序列(即,分泌信号肽序列)可以用不同的前导序列替换,诸如但不限于人重链IgG1序列的前导序列、人血清白蛋白前导序列、黑猩猩AAT前导序列、小鼠Igκ轻链前导序列等。表1提供可并入AAT序列的替代前导序列。另一个前导序列是“天然的”AAT前导序列(SEQ ID NO:10),它也切割来自成熟AAT的前导肽序列。对于“天然”AAT前导序列以及其他前导序列,可以通过SignalP 4.1程序预测和比较信号肽切割的存在和位置(H.Nielsen.《方法分子生物学(Methods Mol.Biol.)》1611:59-73,2017.doi:10.1007/978-1-4939-7015-5_6)。一个实施例提供包含含有AAT氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO:4)的核酸片段,所述氨基酸序列包含天然AAT前导序列(SEQ ID NO:3),其中可以将包含这一核酸片段的表达载体引入宿主细胞中,以便使用本文所述的方法生产人重组AAT载体。
表1
前导序列或信号序列可以在从细胞分泌之前被切断。包括24个氨基酸的天然人AAT前导肽序列,AAT氨基酸序列可包含418个氨基酸。(参见图1B;SEQ ID NO:3)。另选地,AAT蛋白序列中可包括不同长度的其他前导肽序列。在一个实施例中,前导序列具有至少约10个残基、至少约15个残基、至少约19个残基或至少约24个残基。另一个实施例可以涉及来自与所需AAT相同物种的前导序列,例如人前导序列和人AAT。进一步的实施例可以涉及在分泌前被切割的前导序列。
应理解,为了使蛋白保持其正确的构象,糖基化是一个有用的因素。不存在聚糖或糖基化可能导致蛋白从循环中快速清除、半衰期缩短、稳定性降低和/或错折叠,这可能导致聚集或可能更容易聚集或降解,从而导致活性丧失,而这些因素中的任何一个都可能影响蛋白的稳定性。事实上,血浆衍生AAT不利地包含高度多样的聚糖特征,即,由于血浆衍生AAT是从汇集血液中收集的,聚糖特征可能是基于具有不相同序列的AAT多肽。血浆衍生AAT分子可以反映从中收集血浆的个体的遗传和生理因素(例如,衰老或疾病等)。然而,重组AAT的糖基化模式可以被工程化成更均匀的,因为对于重组宿主细胞生产的所有AAT的多肽序列主链没有个体可变性。
在一个实施例中,重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白(包括其变体)是约90%至约100%不含污染物的活性糖基化蛋白,所述污染物诸如但不限于诱导不良免疫反应的非人组分、动物组分或人组分。本文所述的重组AAT蛋白(包括其变体)可具有约90%至约100%、约95%至约99.9%或约98%至约99%的纯度;大于约95%、大于约98%、大于约99%或大于约99.9%的纯度;或约95%、约98%、约99%、约99.9%或约100%的纯度。
另一个实施例可以涉及本文所述的活性重组AAT蛋白(包括其变体),其包含等同于或大于血浆衍生AAT蛋白的蛋白酶抑制活性的蛋白酶抑制活性,其中蛋白酶是例如弹性蛋白酶。在一个实施例中,重组AAT(recAAT)蛋白(包括其变体)的弹性蛋白酶抑制活性可以与血浆衍生AAT蛋白的弹性蛋白酶抑制活性大致相同。另一个实施例可以涉及recAAT(包括其变体)的弹性蛋白酶抑制活性,其可以是血浆衍生AAT蛋白的弹性蛋白酶抑制活性的大于约0%至约20%、大于约5%至约25%、或大于约10%至约30%。
进一步的实施例可以涉及弹性蛋白酶和α1-抗胰蛋白酶之间的关系,其中本文所述的重组AAT抑制弹性蛋白酶活性。图10A示出了弹性蛋白酶底物暴露于这种酶的时间越长,在405nm处的吸光度会随之增加。在以相同量加入到反应中的血浆衍生和重组AAT的存在下,吸光度的增加速率减少约50%。这一数据以条形图表示(图10B),表明这两种AAT即重组AAT和血浆衍生AAT对弹性蛋白酶的抑制率相同。图10C表明,与泳道1(pAAT)和3(recAAT)中不含弹性蛋白酶的AAT相比,当反应混合物进行SDS-PAGE时,血浆衍生AAT(pAAT)和重组AAT(recAAT)均与反应混合物中的弹性蛋白酶形成复合物,在泳道2和4中用较高分子量条带表示。
进一步的实施例可以涉及胰蛋白酶和α1-抗胰蛋白酶之间的关系,其中本文所述的重组AAT或其变体以与人血浆衍生AAT、或含有AAT的粗制小鼠血浆、或来源于人神经元细胞系的另一种重组AAT(R&D***)相同或相似的方式抑制胰蛋白酶活性。图11示出了与胰蛋白酶(作为示例的另一强效蛋白酶)不同来源的AAT的抑制活性。使用荧光肽Mca-RPKVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2(SEQ ID NO:18)作为胰蛋白酶的底物(Mca:(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基;Nval:正缬氨酸;Dnp:2,4-二硝基苯基),应用不同浓度的上述AAT(0ng/ml至约4,000ng/ml)。小鼠血清含1.2mg/ml的AAT。
AAT缺乏症可能与炎症相关联。因此,在进一步的实施例中,本文所述的活性重组AAT蛋白或其变体可具有高且宽范围的抗炎活性,其中抗炎活性可高于血浆衍生AAT蛋白的抗炎活性。AAT可通过例如阻断TNF-α受体来预防或减轻TNF-α的负面效应,例如TNF-α诱导的细胞凋亡。图13示出了当外周血细胞与给定量的LPS和重组AAT一起孵育时,这些细胞中的TNF-α(图13A)和IL-6(图13B)的mRNA会降低,但在没有重组AAT的情况下不会降低。本发明的实施例可涉及可阻断TNF-α反应作用的氧化重组AAT,包括其变体。在一些实施例中,重组AAT蛋白(包括其变体)可以将炎性反应降低约10%至约100%、约15%至约90%、约20%至约80%、约13%、约18%、约80%、约81%、约82%、约83%、约84%、约85%、或大于约10%、大于约11%、大于约12%、大于约13%、大于约14%、大于约15%、大于约16%、大于约17%、大于约18%、大于约19%、大于约20%、大于约50%或大于约80%。
进一步的实施例可以提供人重组AAT蛋白,其包含具有SEQ ID NO:1突变的多肽序列,其中所述突变是以下突变中的至少一种:51位的苯丙氨酸至亮氨酸(F51L)、351位的甲硫氨酸至缬氨酸突变(M351V)、或358位的甲硫氨酸至缬氨酸突变(M358V)。还设想将替换氨基酸残基的其他突变,这些氨基酸残基通常将会被氧化或导致抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的能力降低。在一个实施例中,可以被氧化的任何SEQ ID NO:1的甲硫氨酸将改为具有从甲硫氨酸到例如缬氨酸的突变。另选地,甲硫氨酸可突变为异亮氨酸或缬氨酸和异亮氨酸的组合。在某些实施例中,所述至少一个突变可以选自以下的至少一个氨基酸残基:半胱氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和组氨酸,其中这些残基之一的突变可以防止在该特定位置的氧化。进一步的实施例可以提供产生热稳定性的至少一个突变。在某些实施例中,所述至少一个突变可选自以下的至少一个氨基酸残基:苯丙氨酸、天冬酰胺、苏氨酸、精氨酸和组氨酸残基,其中这些残基之一的突变可导致比没有突变时高的热稳定性。例如,苯丙氨酸可以突变为亮氨酸,天冬酰胺突变为丝氨酸,苏氨酸突变为异亮氨酸,或热稳定性高于起始氨基酸的任何其他氨基酸。
再一个实施例可以涉及重组AAT蛋白(包括其变体),诸如例如人重组AAT蛋白,其包含每摩尔AAT约3摩尔或更多的唾液酸、每摩尔AAT约4摩尔或更多的唾液酸、每摩尔AAT约5摩尔或更多的唾液酸、每摩尔AAT约6摩尔或更多的唾液酸、每摩尔AAT约7摩尔或更多的唾液酸、每摩尔AAT约8摩尔或更多的唾液酸、每摩尔AAT约10摩尔或更多的唾液酸或每摩尔AAT约12摩尔或更多的唾液酸。进一步的实施例可以涉及重组AAT蛋白(包括其变体),其包含每摩尔AAT约3摩尔的唾液酸至每摩尔AAT约12摩尔的唾液酸、每摩尔AAT约3摩尔的唾液酸至每摩尔AAT约10摩尔的唾液酸、每摩尔AAT约5摩尔的唾液酸至每摩尔AAT约8摩尔的唾液酸、每摩尔AAT约4摩尔的唾液酸至每摩尔AAT约6摩尔的唾液酸等。另一个实施例可以涉及重组AAT蛋白(包括其变体),其包含每摩尔AAT大于3.5摩尔的唾液酸或每摩尔AAT约5.5摩尔的唾液酸或更多。又一个实施例可涉及重组AAT蛋白(包括其变体),其包含每摩尔AAT与血浆衍生AAT的唾液酸至少约相同摩尔的唾液酸,或涉及重组AAT蛋白(包括其变体),其具有比血浆衍生AAT高或超过其的至少约10%至约80%的唾液酸含量。在进一步的实施例中,唾液酸含量超过血浆衍生AAT蛋白至少约10%、至少约15%、至少约20%、或小于约90%、小于约85%、小于约80%。应当理解,在重组AAT(包括其变体)上可获得的唾液酸分子稳定蛋白并且可以延长蛋白的半衰期,这对于在患有AAT缺乏症的受试者的循环中维持重组AAT蛋白的水平特别有用。
进一步的实施例可以涉及重组AAT制剂(包括其变体),其可以通过人组织的几层,例如皮肤或其他器官分离材料,例如但不限于肺泡、支气管、细支气管、胸膜等。图14示出了实验结果,其中将少量的AAT制剂施用于人造皮肤模型的“外部”表面上。孵育后,使用蛋白质印迹方法在这一人皮肤体外***的表层下方鉴定AAT,所述方法经由兔多克隆抗人AAT抗体检测AAT。不受理论的束缚,重组AAT(包括其变体)可以通过穿过皮肤的外层,穿过表皮、真皮-表皮连接处、真皮或皮肤的一些或全部层,递送至存在AAT缺乏或错折叠的AAT的位点。可以以足以将重组AAT递送至包括但不限于皮肤或其层、肺泡、支气管、细支气管、胸膜、毛细血管、血管、动脉等的位置的方式施用重组AAT。
只要重组AAT蛋白保持其抑制蛋白酶活性的活性,SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的任何序列可以被所用的部分氨基酸的取代、***或缺失中的至少一种修饰。例如,与SEQ ID NO:1的氨基酸序列相比,修饰的序列可以包括具有约70%或更大、约80%或更大、约90%或更大、约95%或更大、约98%或更大、或约99%或更大的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一个实施例中,AAT蛋白的核苷酸序列可以是任何所需物种(诸如例如人AAT蛋白)的核苷酸序列,或通过优化核苷酸序列以适合在宿主细胞中表达而获得的修饰的序列。另一个实施例可以提供编码AAT蛋白的核苷酸序列,所述AAT蛋白具有选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的序列中的至少一个氨基酸序列的序列,或者与选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:7的序列中的至少一个氨基酸序列相比,具有约70%或更大、约80%或更大、约90%或更大、约95%或更大、约98%或更大、或约99%或更大的氨基酸序列同一性。具体地,所述核苷酸序列可以是选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的序列中的任意一种,或者具有基本上相似的序列同源性的核苷酸序列。基本上相似的序列同源性意指通过序列比任何核苷酸序列与选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8的至少一个核苷酸序列相比的核苷酸序列同一性可以是约40%或更大、约50%或更大、约60%或更大、约70%或更大、约80%或更大、约90%或更大、约95%或更大、约98%或更大、或约99%或更大。
宿主细胞表达***
三十多年来,中国仓鼠卵巢(CHO)细胞被用于基于生物反应器中悬浮培养的细胞大规模制造药物相关蛋白。CHO细胞的表型潜能非常多样,这是因为它们起源于不断进化的永生化细胞,并已显示出对非常不同的生长和生产模式的适应性(Wurm F.M.,《过程(Processes)》,1:296-311,2013;Wurm F.M.《自然生物技术(Nat Biotechnol.)》22(11):1393-1398,2004;Wurm F.M.,和Wurm M.J.,《过程》5(2):20,2017)。在一个实施例中,可用于生产重组AAT的方法中的哺乳动物细胞包括用于在生物反应器中表达和放大的强效重组细胞系,来源于具有选定表型的非重组宿主细胞系用于制造,诸如例如修饰的CHO细胞(CHOExpressTM细胞;ExcellGene SA)。这一非重组宿主细胞系具有异常高的生长速率、在使用某些培养基制剂的分批和补料分批培养下的较高的最大细胞密度的表型特征,并且当用合适的载体转染时,重组子代以高保真度遗传这些表型。当使用转染时,适宜的表达载体(例如,驱动目的基因(GOI)表达的载体永久组成型表达载体)和适宜的选择和克隆衍生细胞群体,衍生细胞系具有高合成能力,和在补料分批培养下的高存活率,在此期间将形成重组产物。在另一个实施例中,哺乳动物重组细胞是快速生长的、高产率的(>5g/L,具有许多蛋白靶)、在高密度下健壮的(>2000万个细胞/mL,在补料分批工艺中高达5000万个细胞/mL)、具有非常高的转种比(sub cultivation ratio)(>1/30)、在1至2至1至100的转种比范围内,并且具有最高的合成能力和在延长的天数内,例如7天、11天、14天、17天、大于7天、大于11天、大于14天等内保持高存活率(>90%)的能力。进一步的实施例涉及哺乳动物重组细胞,其是具有这些特征的修饰的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括例如CHO-rAAT,或诸如但不限于克隆衍生细胞群体,例如CHO-rAAT_c112、CHO-rAAT_c423等。本文所述的重组CHO细胞可通过所述培养程序快速生长(低于20小时/细胞倍增),并且更具体地说,在无动物组分的培养基或化学成分明确的培养基中生长。这些重组CHO细胞是从非重组宿主细胞系CHOExpressTM细胞(在无动物组分的培养基中生长了30年)产生的,可追溯到从学术实验室获得的原始CHO细胞系(Puck TT等人《实验医学杂志(J Exp Med.)》,108(6):945-56,1958)。
在一个实施例中,培养基的组合物和制剂,即用于培养重组AAT(包括其变体)来源于其中的哺乳动物宿主细胞的生产培养基和饲料培养基通过它们的名称和每种组分的浓度来得知,使得可以改变培养基的某些组分的浓度或可以完全除去。此外,某些组分的添加可以在不对培养基的整体性能产生负面影响,但提高所需AAT的生产率和/或质量来进行。因此,这些修饰可能影响在补料分批工艺期间由这些细胞产生的AAT分子的二级修饰。
用于转染和选择重组细胞群体的表达载体***
另一个实施例可以提供包含核酸片段的核酸构建体,所述核酸片段包含编码所需AAT蛋白(包括其变体)的一个或多个核苷酸序列,其中所需AAT蛋白可以包括人AAT蛋白或其任何变体。所述构建体可以包含例如在盒中已***序列的表达载体。表达载体可以包括AAT蛋白(包括其变体)和人AAT蛋白的编码序列。例如,包含编码人AAT蛋白的核酸序列和可选择标记序列的表达载体可用于转化宿主细胞以生产人重组AAT蛋白,其中所述可选择标记序列包含嘌呤霉素抗性基因序列,所述核酸序列和可选择标记序列均位于相反的阅读框中并且位于5’反向末端重复序列(5’ITR)和3’反向末端重复序列(3’ITR)之间。进一步的实施例可以提供包含核酸片段的表达载体,所述核酸片段包含编码人AAT多肽序列的核苷酸序列,所述序列与下列至少一个序列具有约70%或更大的同一性、约75%或更大的同一性、约80%或更大的同一性、约85%或更大的同一性、约90%或更大的同一性、约95%或更大的同一性:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7。又一个实施例可提供含有编码人AAT多肽序列的核苷酸序列中的至少一个的核酸片段,其中所述核苷酸序列与下列至少一个序列具有约70%或更大的同一性、约75%或更大的同一性、约80%或更大的同一性、约85%或更大的同一性、约90%或更大的同一性、约95%或更大的同一性:SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。
在一个实施例中,表达载体可用于将编码所需蛋白的核酸序列,例如但不限于AAT蛋白或人AAT蛋白或其变体,转移到至少一个宿主细胞中(体外)。表达载体可以配备有编码可选择标记的核酸序列、限制性酶位点、适宜的控制元件,诸如启动子和终止序列等组分。表达载体还可以包含调控序列,包括但不限于非编码序列,诸如例如内含子和控制元件,即,启动子和终止子元件或5'和/或3'非翻译区,其可用于在宿主细胞中表达编码序列。合适的载体和启动子是本领域普通技术人员已知的,其中许多可以是商购的。
合适的启动子的非限制性示例可以包括组成型启动子和诱导型启动子,诸如例如CMV启动子、SV40早期启动子、HSV启动子、EF-1a启动子、肌动蛋白启动子等。简言之,出于表达目的,宿主细胞可以识别启动子序列,其中启动子序列是DNA序列。启动子可以与编码目的蛋白诸如例如AAT蛋白或人AAT蛋白或其变体的DNA序列可操作地连接。启动子可以以启动子可以驱动编码AAT蛋白的核酸序列的转录或翻译的方式在表达载体中相对于编码所需AAT蛋白的DNA序列的起始密码子定位。启动子序列可以包含介导AAT蛋白表达的转录和翻译控制序列。
适宜的选择性标记通常将取决于宿主细胞,并且不同宿主的适宜标记在本领域中是众所周知的。这种可选择标记可以赋予转化体利用通常不被宿主细胞代谢的代谢物的能力。可选择标记可赋予转化体在抗生素诸如例如嘌呤霉素存在的情况下生长的能力,其中可选择标记是嘌呤霉素抗性基因(Puro-r)。可使用本领域通常采用的方法将可选择标记编码序列克隆到合适的质粒中。合适质粒的示例包括pXLG5或pXLG6。分子生物学、重组DNA、免疫学等的常规技术在本领域技术范围内。在编码AAT蛋白或其他目的蛋白(包括其变体)的核酸序列已被克隆到构建体或表达载体中之后,构建体或表达载体可用于转化至少一种宿主细胞以表达AAT重组蛋白,诸如例如人AAT重组蛋白或其变体。根据本文所述的实施例,可以为了表达AAT蛋白而转化的宿主细胞可以选自多种宿主细胞。本文给出的表达载体组分和宿主细胞的各种示例并不意味着限制它们的范围,而是可以用于实践本文给出的方面和实施例。
另一实施例可提供一种表达载体,包含:含有编码人AAT蛋白的核苷酸序列的核酸片段,其中所述核酸片段位于多重克隆位点;所述核酸片段上游的内含子;内含子上游的巨细胞病毒(CMV)启动子;所述CMV启动子上游的5'反向末端重复序列(5'ITR);所述核酸片段下游的聚腺苷尾信号序列;所述核酸片段下游的复制起点序列;所述复制起点序列下游的可选择标记序列;以及所述可选择标记序列下游的3'反向末端重复序列(3'ITR)。在一个实施例中,可选择标记序列可以包括例如嘌呤霉素抗性基因的核酸序列,其中本领域技术人员将理解如何选择适宜的可选择标记序列并使用其相关的对应物,即,抗生素诸如嘌呤霉素,以便从细胞培养物中选择含有目的基因例如人AAT的克隆衍生细胞。此外,本领域技术人员还将理解将具有目的基因和可选择标记序列的核酸片段定位在相反的阅读框中和5’反向末端重复序列(ITR)和3'ITR之间。
表达载体的另一个实施例可以涉及含有编码人AAT蛋白的cDNA序列的核酸片段。非限制性可选择标记序列可以包括抗生素抗性序列、对更昔洛韦选择敏感的胸苷激酶、三氯生抗性序列、代谢选择序列,诸如例如包括二氢叶酸还原酶基因或谷氨酰胺合成酶基因的序列等,或其组合。在一个实施例中,可选择标记序列和/或抗生素抗性基因是嘌呤霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、博莱霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因、任何其他所需可选择标记的基因,诸如例如二氢叶酸还原酶或谷氨酰胺合成酶等,或其组合。另一个实施例可以涉及一种表达载体,其中核酸片段和可选择标记序列位于相反的阅读框中,并且在5'ITR和3'ITR之间。表达载体的进一步实施例提供编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:7(图1)中任一个或多个的人AAT多肽序列或任何其他人AAT蛋白序列的核苷酸序列,其中所述核苷酸序列可选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQID NO:8(图1)中的至少一个。在另一个实施例中,表达载体包含与SEQ ID NO:9(FIG.2)、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8中的至少一个具有约40%或更大同一性、约50%或更大同一性、约60%或更大同一性、约70%或更大同一性、约75%或更大同一性、约80%或更大同一性、约85%或更大同一性、约90%或更大同一性、约95%或更大同一性或约99%或更大同一性的核苷酸序列,或者核苷酸序列包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9中的至少一种。
在又进一步的实施例中,可使用共转染***高效地将目的基因例如AAT的核酸序列并入至少一个宿主细胞中,以生产重组AAT蛋白,包括其变体,所述共转染***包括表达目的基因(GOI)即AAT蛋白(包括其变体)的供体载体和表达转座酶基因的动员载体(mobilizing vector),其识别构成GOI序列的反向末端重复序列(ITR)。如本领域技术人员所理解的,可以利用共转染包含任何目的基因的供体载体的方法以及本文公开的其他方法来生产由相关联目的基因编码的重组蛋白。生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法的进一步的实施例可以涉及引入步骤,包括与含有编码人AAT蛋白的第一核酸序列的载体和含有编码转座酶的附加核酸序列的载体共转染宿主细胞。所述方法的附加实施例可以提供包含编码转座酶的核酸序列或辅助mRNA的辅助载体或表达载体,其与包含编码人AAT蛋白的核酸序列的载体或表达载体一起被引入宿主细胞或细胞系,其中包含目的基因(例如,AAT蛋白、人AAT蛋白等)的核酸序列整合入宿主细胞的基因组而不是来自动员载体或辅助载体的核酸序列(例如,在转染中使用mRNA转座酶,而不使用含有用于转座酶的DNA的任何质粒)。
简言之,转座子是遗传元件,通过“剪切-粘贴”机制允许载体和染色体之间的高效转座。由于由动员载体或辅助载体表达的转座酶识别含有目的基因的供体载体的转座子特异性ITR,因此转座酶可以在ITR处“切割”供体载体,然后将包含目的基因和可选择标记序列的供体载体序列“粘贴”到宿主细胞的染色体DNA中,例如粘贴到TTAA染色***点中。转座子例如piggyBac***的优势在于转座的序列大小基本上不受限制,它是非病毒的,并且是高效的。可用于本发明实施例的转座酶的非限制性示例包括:piggyBac、Tol-2、SleepingBeauty、Leap-In和任何其他“剪切-粘贴”转座酶等。包含转座酶的表达载体或辅助载体可包括pD2500载体,特别是用于Leap-In转座酶(ATUMSM;https://www.atum.bio/products/expression-vectors/mammalian#3;Newark,CA)或用于Tol-2或基于Sleeping Beauty的转染的载体(Balasubramanian S.Thesis No.6563(2015)“CHO细胞中转座子介导的细胞池和细胞系产生的研究(Study of Transposon-Mediated Cell Pool and Cell LineGeneration in CHO Cells)”,瑞士洛桑的瑞士联邦理工学院(EPFL))。
在又进一步的实施例中,引入细胞的表达载体及其随后的GOI表达可含有附加序列,诸如CHO细胞来源内源性逆转录病毒序列,其可促进此类表达载体整合到非重组CHOExpressTM宿主细胞系的活性染色质中。这类内源性逆转录病毒序列可能属于A型逆转录病毒序列家族(Anderson K等人《病毒学(Virology)》64,5,2021-2032,1990)、C型序列家族(Anderson K等人《生物标准化进展(Dev.Biol.Stand.)》75:123-132,1991)或真核生物基因组中优先聚集在基因组活性区域中的任何其他重复序列家族(Mager DL和StoyeJP.2014.《微生物谱(Microbiol.Spectr.)》3(1):MDNA3-0009-2014)。这些附加内源性逆转录病毒DNA序列可以表示全长(非功能性)逆转录病毒序列或其较短片段。这种途径可能介导细胞中的同源重组事件,导致GOI序列整合到含有内源性逆转录病毒DNA序列的基因组区域中(Wurm FM等人“追溯目标:使用有缺陷的逆转录病毒DNA片段来改进哺乳动物细胞中重组蛋白的生产(Retrotargeting:Use of defective retroviral DNA fragments toimprove recombinant protein production in mammalian cells)”《动物细胞技术:当今的产品,明天的展望(Animal Cell Technology:Productsfor Today,ProspectsforTomorrow)》,R.E.Spier等人编辑,Butterworth-Heinemann Ltd.,1994,pp.24-29)。
在再一个实施例中,可以通过将基于转座子的基因转移途径与用于整合到DNA接收细胞的基因组的活性染色质中的同源重组途径相结合,从重组细胞构建用于GOI目的的表达载体以用于高水平生产率。转染细胞和选择重组细胞群体的非限制性途径包括经由锌(Zn)指核酸酶(Bibikova M等人《科学(Science)》,300(5620):764,2003)、单链归巢核酸酶(Grizot S等人《核酸研究(Nucleic Acids Research)》37(16):5405-5419,2009)或CRISPR/Cas 9过程(Jinek M等人《科学》,337(6096):816-821,2012)将靶向基因转移到细胞中的那些。
本公开的另一个实施例涉及用于从转染的哺乳动物细胞获得高水平AAT表达的表达载体构建体。(图2、3和4)。质粒载体pXLG6-AAT包含编码本文所述完整人AAT蛋白序列的核酸序列,包括***pXLG6质粒载体的多克隆位点(MCS)的相应前导序列。在本发明的一个实施例中还包括动员载体或辅助载体,即包含转座酶的质粒pXLG 5,诸如但不限于PiggyBac转座酶(mPBase)或其他转座酶,但不限于Tol-2、Sleeping Beauty、Leap-In、任何其他“剪切-粘贴”转座酶及其优化形式。在哺乳动物宿主细胞,诸如例如修饰的CHO细胞(例如,CHOExpressTM细胞;ExcellGene S.A.)等中,pXLG 5与pXLG6-AAT共转染,其中所述修饰允许细胞生长到高细胞密度,例如但不限于超过2000万个细胞/mL,诸如但不限于超过1/20的高转种比,以及具有超过1g/L、超过3g/L、超过5g/L、超过6g/L或超过7g/L的表达水平的重组CHO细胞过程产率,以及其他优点。共转染入哺乳动物宿主细胞可以以各种量进行,其中转座酶表达载体通常具有相对于GOI(例如,本文描述的AAT表达载体)的低摩尔比,因为转座酶表达载体是动员载体或辅助载体,其有助于将GOI整合或并入宿主细胞的基因组,而转座酶核酸序列避免整合。转座酶载体与GOI载体的非限制性重量/重量比可以包括但不限于约1:1、约1:3、约1:9、约1:10、约0.75:9.25、约0.5:9.5、约0.25:9.75、约0.1:9.9、小于约1:10、小于约1:9、小于约1:3、小于约0.75:9.25、小于约0.5:9.5、小于约0.25:9.75、小于约0.1:9.9、大于约0.1:9.9、大于约0.25:9.75、大于约0.5:9.5、大于约0.75:9.25、大于约0.9:9.1、大于约1:9、大于约1:10、约1:10至约0.1:9.9、约0.75:9.25至约0.25:9.75、约0.5:9.5,以及允许将GOI成功并入宿主细胞基因组的任何中间比或附加比。由于转座酶载体不含ITR,因此转座酶将不会整合到宿主细胞基因组中,然而随着时间的推移将通过降解的细胞内过程从细胞中消除,因此,转座酶载体在这种共转染方案中仅在短时间内(瞬时地)具有活性,以帮助将GOI(例如,AAT表达盒)并入或整合至宿主细胞基因组。当转座酶编码mRNA用于与GOI编码表达载体DNA共转染时,同样的原理也适用。
在一个实施例中,目的基因(GOI)的pXLG 6表达载体盒可以含有来源于小鼠巨细胞病毒(mCMV)序列的强组成型启动子/增强子和其他有用元件,诸如剪接供体序列,以及用于组成型表达选择性标记的另一表达盒(例如,编码嘌呤霉素抗性(Puro-r):PAC-嘌呤霉素N-乙酰基转移酶的基因),其由单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子(HSV TK)驱动。GOI序列,诸如例如本公开的人AAT序列(见图1)可以被克隆到pXLG 6的多克隆位点(MCS)(见图3)。此外,在另一个实施例中,GOI序列可以包含指向除M等位基因之外的等位基因的人AAT序列。
这两个表达盒可以由5'ITR和3'ITR的反向末端重复序列构建。这两个ITR或其他ITR被转座酶蛋白识别,包括但不限于粉纹夜蛾(拟尺蠖)的PiggyBac转座子、Tol-2转座子(Kawakami K.《基因组生物学(Genome Biol.)》8(增刊1):S7,2007)或Sleeping Beauty转座子(Aronovich E等人《人分子遗传学(Human Molecular Genetics)》,20:R14-R20,2011)、Leap-In转座酶(ATUMSM;https://www.atum.bio/products/expression-vectors/mammalian#3;加利福尼亚州纽瓦克),或任何其他使用转座酶的DNA动员***。为了将转座酶蛋白引入宿主细胞,表达例如PiggyBac转座酶或Sleeping Beauty转座酶的第二载体可以与包含目的基因的质粒载体共转染。一个实施例涉及第二载体pXLG 5,其包含PiggyBac转座酶。(参见图4)。pXLG 5质粒载体包含编码PiggyBac转座酶(mPBase)的相应表达盒。在本公开的一个实施例中,GOI载体(例如,pXLG6-AAT载体)和转座酶载体(pXLG5-mPBase载体或辅助载体)的CHO细胞共转染中质粒DNA的比率为9:1(按重量计)。因此,90%的转染混合物含有GOI载体。辅助载体与GOI载体的较高和较低比率不被排除,并且可以包括这种比率,诸如但不限于约1%的辅助载体与约99%的GOI载体的重量百分比、5%的辅助载体与约95%的GOI载体的重量百分比、约15%的辅助载体与约85%的GOI载体的重量百分比、20%的辅助载体与80%的GOI载体的重量百分比等,使得存在成功的共转染,其导致生产活性的、成熟的重组AAT,包括其变体。
使用化学转染试剂(试剂盒;ExcellGene SA)转染,并遵循优化程序,可将数百个(如果不是数千个)质粒(本文为两种不同核酸载体的混合物)转移到宿主细胞的细胞核中。转座酶载体可以驱动转座酶基因的转录和转座酶的合成。然后,转座酶蛋白可以识别GOI载体中的ITR序列,并将其从质粒中切除。随后,切除的GOI盒可以整合到由转座酶介导的宿主细胞的基因组中(Matasci M等人《生物技术与生物工程(BiotechnolBioeng.)》108(9):2141-50,2011年4月25Epub)。另一个实施例涉及具有编码人AAT蛋白(包括其变体)的至少一个GOI盒的修饰的宿主CHO细胞。在进一步的实施例中,约5至30个拷贝、约5至15个拷贝或10至20个拷贝的GOI盒可整合到来源于这种转染的克隆重组CHO细胞系的基因组中。由于PiggyBac转座酶优先整合到活性染色质中,因此发现此类重组细胞系的表达水平是高的。
转染和选择
本发明的另一个实施例可以涉及转染和选择重组人AAT表达细胞。与包含AAT蛋白基因的供体质粒载体和包含转座酶基因(诸如但不限于PiggyBac转座酶基因)的动员质粒载体共转染的修饰的CHO细胞的抗生素抗性选择表明存活的细胞同时具有GOI和抗生素抗性基因,诸如例如整合并表达的嘌呤霉素抗性基因,或在质粒载体中并已转化宿主细胞的任何其他抗性提供DNA,而动员载体的转座酶基因未在宿主细胞中转化。转染和选择都可以发生在细胞培养基中悬浮培养下快速生长而无任何聚集并且在任何时候都不暴露于动物组分来源物质的细胞中。转染后约7天至约10天期间的选择压力可维持在非常严格的条件下。这些条件包括每天更换含有选择提供剂的培养基。一旦细胞再次快速生长并且细胞存活率已重新建立到高值,可使用典型的和常用的技术对培养物进行转种。这种异源细胞群体一旦在不存在任何抗生素选择性试剂的情况下进一步生长和扩增,就会被认为是重组的,并以非常高的水平表达人AAT蛋白,例如但不限于约1g/L至约10g/L、大于约2g/L、大于约5g/L、大于约6g/L、大于约8g/L、大于约9g/L、约2g/L、约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L、约10g/L或任何中间量。因此,本公开的实施例涉及表达高水平的活性、高度糖基化的人AAT的重组细胞及其克隆细胞系的重组细胞。
在一个实施例中,修饰的CHO细胞可以用包含野生型AAT基因的高效表达载体(例如,通过转座酶介导的基因整合或其他已知的方法)来转染。可以分离表达AAT的重组池,随后,可以通过单细胞克隆和扩增来选择克隆衍生细胞系。简言之,修饰的CHO细胞可以与供体GOI或人AAT表达载体和动员转座酶载体或辅助转座酶载体共转染,比率为更多的供体GOI表达载体对转座酶载体,或更少的转座酶载体对供体GOI表达载体。供体AAT载体与辅助转座酶载体的比率可包括但不限于9:1(w/w)、9.25:0.75(w/w)、9.5:0.5(w/w)、9.75:0.25(w/w)、9.9:0.1(w/w)和10:1(w/w)或中间比率。例如,pXLG-6AAT载体与pXLG-5转座酶载体的比率可能包括但不限于9:1(w/w)、9.25:0.75(w/w)、9.5:0.5(w/w)、9.75:0.25(w/w)和9.9:0.1(w/w)。转染的细胞可以维持在悬浮培养下,其中培养基可以补充有选择性试剂,例如50μg/ml的嘌呤霉素,并且每天用补充有嘌呤霉素的培养基更换约7天至约10天,或者直到已经恢复健康的细胞群体,其显示出大于或约50%、大于或约60%、大于或约70%、大于或约80%、大于或约90%、大于或约95%或约100%的细胞存活率。当细胞达到至少约90%的存活率时,由于选择已经发生,细胞可以进一步在不含嘌呤霉素的培养基中转种。约3天至约4天的典型转种安排可以继续。可测试转种细胞是否成功表达重组蛋白,并可使用有限稀释途径、单细胞打印机(Cytena AG,Freiburg Germany)或两种技术进行克隆。可扩增和研究多达约1,000个克隆衍生细胞群体,用于AAT的蛋白质生产。
一个实施例可以涉及生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,包括:a)引入宿主细胞与包含有包含编码人AAT蛋白的核酸序列的核酸片段的表达载体以分离表达人重组AAT蛋白(包括其变体)的转化体,即重组细胞;b)在允许表达人重组AAT蛋白的条件下,将宿主细胞与包含有包含编码重组AAT的核酸序列的核酸片段的转化体、重组细胞或表达载体一起培养;以及c)从重组细胞中分离人重组AAT蛋白(包括其变体),从而生产人重组AAT蛋白(包括其变体)。本文所述方法的另一实施例可以提供包含编码人AAT(包括其变体)的核酸序列的核酸片段,即CHO细胞密码子优化序列。
进一步的实施例可以提供本文所述方法的引入步骤,包括共转染人AAT表达载体或包含AAT变体的表达载体和编码转座酶的表达载体,其中转座酶表达载体是辅助将目的基因并入至少一个宿主细胞基因组的辅助载体或动员载体。共转染可导致将质粒切除的AAT表达盒递送到非重组宿主细胞的基因组中。另一个实施例可以涉及转座酶,例如,piggyBac转座酶和动员载体、辅助载体或编码例如piggyBac转座酶的表达载体,其中转座酶基因被引入宿主细胞或宿主细胞培养物中而不被引入宿主细胞的基因组中。编码转座酶的表达载体是用于并入目的基因的“辅助载体”,即在一个实施例中,将AAT表达盒并入宿主细胞基因组。另一个实施例可以是使用编码转座酶的体外合成的mRNA制剂,而不是使用转座酶的表达载体。
另一个实施例可以涉及作为真核细胞或真核细胞群体的宿主细胞或宿主细胞群体。进一步的实施例可以提供非重组宿主细胞群体,其是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。又一个实施例可以涉及CHO细胞系,其中所述CHO细胞是重组CHO细胞系。CHO细胞或CHO细胞系可以是经过修饰的CHO细胞系,以高密度生产快速生长的健壮细胞,从而生产高产率的表达蛋白。这些修饰的CHO细胞也可以很容易地从小规模生产扩大到大规模制造。
在进一步的实施例中,非重组和重组CHO细胞系可以被修饰以在基本上没有一些或任何动物组分(即,包括人组分或非人动物组分)或基本上没有一些或任何诱导免疫反应的人组分或非人动物组分的培养基中快速生长。另一个实施例提供本文公开的方法,所述方法涉及重组CHO细胞的培养步骤,所述步骤基本上在没有一些或任何动物(即,人或非人)组分的情况下进行。培养步骤在培养基中进行,其中培养基含有少于约5%(体积/体积)、少于约4%(体积/体积)、少于约3%(体积/体积)、少于约2%(体积/体积)、少于约1%(体积/体积)的任何污染物,或不含或基本上不含污染物,其中污染物可包括动物来源组分,诸如例如人和/或非人来源组分,或可触发免疫反应的任何动物来源组分。培养基可以含有有利于表达从宿主细胞分离的重组蛋白,诸如例如人AAT蛋白的量的帮助转化的宿主细胞生长和扩增的任何添加剂,包括但不限于饲料、氨基酸和胰岛素(例如,人重组动物来源的游离胰岛素)。
在再一个实施例中,本文所述的方法可涉及生产或产生约1g/L或更大、约2g/L或更大、约3g/L或更大、约4g/L或更大、约5g/L或更大、约6g/L或更大、约7g/L或更大、约8g/L或更大、或约10g/L或更大、或约15g/L或更大的人重组AAT蛋白、约1g/L至约10g/L的人重组AAT蛋白、约2g/L至约6g/L的人重组AAT蛋白或约3g/L至约15g/L的人重组AAT蛋白(包括其变体)的培养步骤。另一个实施例可以涉及生产约4g/L至约10g/L的人重组AAT蛋白(包括其变体)的培养步骤。
进一步的实施例提供生产重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,其中培养步骤包括:选择具有表达人AAT蛋白的核酸片段的宿主细胞,其中选定细胞是表达人重组AAT蛋白的克隆衍生细胞。选择步骤包括:a)在培养基中生长或培养表达人重组AAT蛋白的克隆衍生重组细胞;b)用至少一种饲料饲喂表达人重组AAT蛋白的克隆衍生细胞;c)将培养基维持在足以维持或促进正常、健康细胞的细胞培养温度;d)改变或降低细胞培养温度;e)在降低的细胞培养温度下生长或培养克隆衍生细胞,直到细胞以约1g/L或更大、约2g/L或更大、约3g/L或更大、约4g/L或更大、约5g/L或更大、约6g/L或更大、约8g/L或更大、或约10g/L或更大、或约15g/L或更大的滴度表达重组AAT蛋白,例如人重组AAT蛋白,或者达到如此程度,即,使得克隆衍生细胞生长到足以以约1g/L或更大的期望滴度表达人重组AAT蛋白(包括其变体)。另一个实施例可以涉及以约或大于约2g/L、约或大于约3g/L、约或大于约4g/L、或约或大于约6g/L的滴度表达人重组AAT蛋白的细胞,并且在另一个实施例中,直到或在细胞培养的第3天、第5天、第7天、第10天、第14天或第17天达到这些滴度。进一步的实施例可以涉及在细胞培养的第17天以约6g/L或更大的滴度表达人重组AAT蛋白(包括其变体)的宿主细胞。在再进一步的实施例中,在生产阶段期间,即以细胞和培养基的收获结束的细胞在生物反应器中的培养期间,细胞培养温度在约35℃至约38℃或例如约37℃的范围内,或在培养的第一天或第0天至第3天或第0天至第5天,或从细胞培养的第0天开始,或在整个说明书中可互换使用,其中第0天是培养用于生产的第一天,或足以达到目的基因(包括例如人重组AAT蛋白)编码的所需蛋白水平的另一适宜的天或天范围。一个实施例可以涉及改变、修饰或降低的细胞培养温度,所述细胞培养温度直到、在或从细胞培养的第3天或第5天开始或另一适宜的天或天范围内在约25℃至约34℃或例如约31℃至约33℃、约31℃或约33℃的范围内,所述另一适宜的天或天范围足以实现目的基因(包括例如人重组AAT蛋白)编码的所需蛋白水平。进一步的实施例可以涉及降低的细胞培养温度,所述细胞培养温度直到、在或从细胞培养的第3天开始或直到、在或从第5天开始或另一适宜的天或天范围内在约31℃至约33℃范围内,所述另一适宜的天或天范围足以实现目的基因(包括例如人重组AAT蛋白)编码的所需蛋白水平。
在另一个实施例中,本文所述方法的饲喂步骤提供至少一种饲料,所述饲料选自以下中的至少一种:中性饲料、碱性饲料或足以维持或促进正常健康细胞的另一种饲料,以实现目的基因包括例如人重组AAT蛋白的所需蛋白水平。再进一步的实施例提供中性饲料,其具有在总细胞培养物体积的约1%至约10%、约1%至约8%、约1%至约6%、约1%至约5%范围内的浓度。另一个实施例可以提供包含碱性饲料的至少一种饲料。在进一步的实施例中,碱性饲料可以具有在总细胞培养物体积的约0.1%至约1%、0.1%至约0.8%、约0.1%至约0.6%、约0.1%至约0.5%范围内的浓度。一个实施例提供包含中性饲料和碱性饲料的至少一种饲料。进一步的实施例提供一种饲料,其以总细胞培养物体积中中性饲料体积的约十五分之一(1/15)、十分之一(1/10)、约八分之一(1/8)、约六分之一(1/6)、约五分之一(1/5)的量包含中性饲料和碱性饲料。在一个实施例中,饲喂步骤每天或每隔一天进行,或维持或促进正常、健康细胞以实现目的基因包括例如人重组AAT蛋白的所需蛋白水平的任何其他饲喂安排。在另一个实施例中,使用中性饲料和/或碱性饲料的受控流速连续进行饲喂。
另一个实施例可以涉及生产重组AAT蛋白的方法,其中生产阶段期间的培养步骤包括约200mOsm/kg至约600mOsm/kg、约250mOsm/kg至约400mOsm/kg、约260mOsm/kg至约320mOsm/kg、约450mOsm/kg至约600mOsm/kg、约500mOsm/kg或更大、约550mOsm/kg或更大的细胞培养物的渗透压或维持或促进正常、健康细胞,以实现目的基因包括例如人重组AAT蛋白的所需蛋白水平的任何适宜渗透压。在一个实施例中,直到或在第5天或更晚或足以达到目的基因包括例如人重组AAT蛋白编码的所需蛋白水平的任何其他适宜的天或天范围,细胞培养物的渗透压可以是约550mOsm/kg或更大。
进一步的实施例提供一种生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,包括:a)将编码人AAT蛋白的第一核酸序列和编码转座酶的至少一个附加核酸序列引入例如真核的宿主细胞或宿主细胞群体中;b)在允许表达编码人AAT蛋白的第一核酸序列(包括其变体)的条件下培养宿主细胞或宿主细胞群体,其中编码例如转座酶(例如但不限于例如piggyBac)的附加核酸序列也可以在细胞培养物中并表达以帮助并入编码,即例如人AAT的目的基因,其中宿主细胞用编码人AAT的核酸序列转化;c)选择具有表达人AAT蛋白的核酸片段的宿主细胞,其中选定细胞是表达人重组AAT蛋白的克隆衍生细胞;以及d)从宿主细胞或真核宿主细胞中分离重组AAT蛋白,包括其变体,从而生产人重组AAT蛋白,其中分离步骤可包括纯化人重组AAT蛋白。
另一个实施例可以提供用编码人AAT蛋白的核酸序列转化的真核宿主细胞或真核细胞群体。在另一个实施例中,引入步骤包括共转染宿主细胞与包含编码AAT蛋白(包括其变体)的第一核酸序列的载体和包含编码转座酶(例如但不限于piggyBac、Tol-2、SleepingBeauty、Leap-In和任何其他“剪切-粘贴”转座酶等)的附加核酸序列的载体。分离步骤的再进一步的实施例可以提供纯化所需重组AAT蛋白的步骤。纯化步骤可以通过以下任何一种或多种技术中的至少一种进行,但不限于:亲和色谱法,包括例如基于抗体或配体的亲和色谱法、尺寸排除色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、磁珠分离、选择性沉淀、基于分子量的膜过滤或排除、缓冲液交换、病毒过滤、基于pH的病毒灭活等。
本发明的进一步的实施例可以涉及生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,其中所述方法包括在基本上不含动物来源组分(即人或非人动物组分)或诱导免疫反应的蛋白例如人免疫球蛋白、人血清白蛋白、非人动物蛋白、非人动物免疫球蛋白、非人血清白蛋白或可被认为是污染物的任何其他已知血浆蛋白的培养基中进行的培养步骤。在进一步的实施例中,生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,其中所述方法包括在培养基中进行的培养步骤,所述培养基含有小于约5%(体积/体积)的动物来源组分、小于约4%(体积/体积)的动物来源组分、小于约3%(体积/体积)的动物来源组分、小于约2%(体积/体积)的动物来源组分、小于约1%(体积/体积)的动物来源组分。再一个实施例涉及生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,其中所述方法包括在培养基中进行的培养步骤,其中所述培养基可以包含或可以不包含人重组动物来源的游离胰岛素。进一步的实施例可提供生产纯度为约95%或更大或约98%或更大的人重组AAT蛋白的方法,其中人重组AAT蛋白的纯度可基本上或大体上不含天然伴随人重组AAT蛋白、用于生产人重组AAT蛋白或为生产人重组AAT蛋白的降解产物的组分。污染物组分可以是与所需人重组AAT蛋白不同的那些材料,或者是将会干扰所述蛋白的研究、诊断或治疗用途的那些天然发生或存在的材料,并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。人重组AAT蛋白的纯度可以通过任何本领域认可的分析方法(例如,聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC、银染色凝胶等)来确定。通常,人重组AAT蛋白的纯度意味着所述蛋白的纯度已经提高,使得其以比在其天然环境中和/或最初生产和/或合成时更纯的形式存在。通常,分离的人重组AAT蛋白的纯度可以是约60%、约70%、约80%、约90%、约95%、或大于约90%、约92%、约94%、约95%、约96%、约98%或约100%。
细胞系和过程优化
在一个实施例中,可在高通量条件下培养包含所需重组AAT(包括其变体)的克隆衍生细胞系。例如,本文所述的克隆衍生细胞系,包括例如细胞系30、112和423,在使用高通量培养***的许多条件下培养,同时在轨道摇动的50ml OrbShake管(例如,生物反应器管,生物反应器50,瑞士特拉萨丁根;或类似的产品)中施加小规模(10ml)培养物。这些管提供有通风帽,且通常在CCh受控、加湿的孵育箱摇床(Kuhner Shaker,瑞士Birsfelden)内以180rpm和50mm的位移半径摇晃。在一个实施例中,包括克隆衍生细胞的克隆衍生细胞系可以在高通量条件下培养,其中研究了在使用多种培养基组合物、饲料组合物、添加的时间、饲料添加的体积、温度转变和其他工艺条件下的细胞存活率和生长。在另一个实施例中,克隆衍生细胞可以在高通量条件下培养并在更大规模上加工,其中应当理解,用于将此工艺从小规模扩大到大规模的条件是直接的或基本上直接的。可在图8中找到用于生产所需重组AAT(包括其变体)的各种程序的示例,其比较不同饲喂策略即饲料体积、饲料类型、饲喂时间等的使用和补料分批工艺中的温度转变。本例中所示的饲料(7A和7B;HyCloneTM Cell Boost 7a、HyCloneTM Cell Boost7b,产品目录编号SH31026.01(RRG168030,SH31027.01)均为商购的,并且以总有效细胞培养物体积的百分比表示,并每天(ED)或每隔一天(EOD)提供。每种指定的培养条件都已执行了三次,并且误差条在各列之上用细线表示。本发明的一个实施例可以涉及由克隆衍生细胞在例如图8、条件1和3中鉴定的那些等工艺条件下生产的重组AAT(包括其变体)的滴度,使得AAT滴度直到第17天达到大于约6g/L。例如,在工艺条件1和3下,克隆衍生细胞系112在第17天升高至大于6g/L。
再一个实施例可以涉及使用生物反应器的大规模细胞培养和优化。在一个实施例中,使用化学成分明确的饲料,诸如包含无机盐、氨基酸和维生素的饲料(例如,XLG饲料A(饲料A4CHO);ExcellGene S.A.等)和包含有机物和其他有益组分的饲料(例如,XLG饲料B(饲料B4 CHO);ExcellGene S.A.等)的使用可在生产阶段期间的不同时间添加到生物反应器。这些饲料可以以相同或不同的体积即生产生物反应器的工作体积的分数添加。本领域普通技术人员将理解如何改变工艺条件和量以大量生产明确质量的重组AAT。
进一步的实施例提供一种生产重组AAT的方法,包括:培养或生长表达重组AAT的克隆衍生细胞;用至少一种饲料饲喂表达重组AAT的克隆衍生细胞,其中所述饲喂连续地或不连续地进行,其中可以使用受控的流速进行饲喂;维持细胞培养温度;将维持的细胞培养温度转变至转变的细胞培养温度;在降低的细胞培养温度下生长所述细胞,直到所述细胞以大于约1g/L、大于约2g/L、大于约3g/L、大于约4g/L、大于约5g/L、大于约6g/L、大于约7g/L、大于约8g/L、大于约9g/L或大于约10g/L;或至少约1.5g/L、至少约2.5g/L、至少约3.5g/L、至少约4.5g/L、至少约5.5g/L、至少约6.5g/L、至少约7.5g/L、至少约8.5g/L、至少约9.5g/L或至少约10.5g/L;或在约1g/L至约10g/L范围内、约2g/L至约10g/L范围内、约3g/L至约10g/L范围内、约4g/L至约10g/L范围内、约5g/L至约10g/L范围内、约6g/L至约10g/L范围内、约7g/L至约10g/L范围内、约8g/L至约10g/L范围内或约9g/L至约10g/L范围内的滴度表达重组AAT。在进一步的实施例中,每天饲喂克隆衍生细胞。再一个实施例可以涉及每隔一天饲喂克隆衍生细胞。进一步的实施例可涉及每3天饲喂克隆衍生细胞,或有利于细胞整体健康并由此增加重组AAT的最终收获产物滴度的任何其他饲喂安排。
一个实施例可以涉及使表达重组AAT的克隆衍生细胞生长足够的天数以达到大于约1g/L、大于约2g/L、大于约3g/L、大于约4g/L、大于约5g/L、大于约6g/L、大于约7g/L、大于约8g/L、大于约9g/L或大于约10g/L;或至少约1.5g/L、至少约2.5g/L、至少约3.5g/L、至少约4.5g/L、至少约5.5g/L、至少约6.5g/L、至少约7.5g/L、至少约8.5g/L、至少约9.5g/L或至少约10.5g/L;或在约1g/L至约10g/L范围内、约2g/L至约10g/L范围内、约3g/L至约10g/L范围内、约4g/L至约10g/L范围内、约5g/L至约10g/L范围内、约6g/L至约10g/L范围内、约7g/L至约10g/L范围内、约8g/L至约10g/L或约9g/L至约10g/L范围内的重组AAT滴度。足以获得大于约1g/L的重组AAT滴度的天数可以在7天至21天的范围内,或者天数可以是至少7天、至少11天、至少14天、至少17天或至少21天。
在进一步的实施例中,生产阶段期间的细胞培养温度可以维持在约35℃至约38℃的温度下,包括但不限于约35℃、约36℃、约37℃、约38℃或小于约39℃。另一个实施例可以涉及在约24℃至约34℃范围内的转变的细胞培养温度,或任何温度或之间的温度,包括但不限于约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃或约34℃。另一个实施例可涉及在第一个2天或第一个3天或其第3天的部分时间内维持在约37℃的细胞培养温度。进一步的实施例可涉及约33℃、约32℃、约31℃、约30℃、约29℃、约28℃、约27℃、约26℃、约25℃或约24℃至约25℃的降低的细胞培养温度,其中所述降低的细胞培养温度发生在第3天或其第3天的一部分。然而,进一步的实施例可以涉及在第5天或其第5天的一部分出现的约31℃的降低的细胞培养温度。在另一个实施例中,降低的细胞培养温度包多于一个的降低的细胞培养温度,其中约33℃、约32℃、约31℃、约30℃、约29℃、约28℃、约27℃、约26℃、约25℃或约24℃至约25℃的第一降低的细胞培养温度出现在第3天或其第3天的一部分,第二降低的细胞培养温度出现在第5天或其第5天的部分,在第一次温度转变后比先前使用的温度低约2℃至约3℃。除了本文提到的那些天之外,还设想出现温度转变的替代天,只要表达重组AAT的克隆衍生细胞是健康的,即不会死或死去。
在另一个实施例中,包括本文所述并入rAAT的宿主细胞的生产阶段期间的细胞培养物可以保持具有在约200mOsm/kg至约600mOsm/kg、约250mOsm/kg至约400mOsm/kg、约260mOsm/kg至约320mOsm/kg、约450mOsm/kg至约600mOsm/kg范围内、约500mOsm/kg或更大、约550mOsm/kg或更大的渗透压或维持或促进正常、健康细胞的任何适宜渗透压,以实现目的基因包括例如人重组AAT蛋白的所需蛋白水平。随着渗透压在细胞培养过程期间增加,并且补料分批培养物中的营养物也增加渗透压,因此还设想到培养物中渗透压随时间的变化。另一个实施例可以涉及直到或在第5天或以后,或允许正常、健康细胞达到目的基因包括例如本文所述的人重组AAT蛋白的所需蛋白水平的任何适宜的天,将细胞培养物的渗透压增加至约550mOsm/kg或更大。
再进一步的实施例可涉及不含动物组分或化学成分明确的、优化的高产率蛋白质生产的饲料,包括但不限于在补料分批工艺中,不含生长因子、动物组织衍生肽、动物组织衍生水解产物、酚红或2-巯基乙醇。在再一个实施例中,饲料可以包含中性或接近中性的pH,即中性饲料,其中在一些实施例中,中性饲料可以含有氨基酸、维生素、盐和葡萄糖。在进一步的实施例中,饲料可以是化学成分明确的,或可以含有非动物来源组分,诸如来自植物种子、来自某些谷物(小麦)、来自某些豆类或豌豆(大豆)等的水解产物。在进一步的实施例中,饲料可以包含碱性pH,即碱性饲料,其中碱性饲料在一些实施例中可以含有氨基酸的浓溶液。另一个实施例可以涉及用饲料的组合饲喂表达重组AAT的克隆衍生细胞,其中饲料的组合可以包括同时、基本上同时、顺序或基本上顺序饲喂的中性饲料和碱性饲料。此外,用包括但不限于饲料、营养物、氨基酸等的添加剂饲喂细胞培养物可以连续或不连续地进行,其中可以使用受控的流速和包括每天或每隔一天饲喂至少一种饲料的安排,或维持或促进正常、健康细胞以实现目的基因包括例如人重组AAT蛋白的期望蛋白水平的任何其他饲喂安排进行饲喂。
进一步的实施例可涉及饲料的组合,其中中性饲料具有在总细胞培养物体积的约1%至约8%范围内,或介于其间或之中的任何百分比,包括但不限于约1.8%、约3.6%或约7.1%的浓度;并且其中所述碱性饲料具有在总细胞培养物体积的约0.1%至约0.8%范围内,或其间或其中的任何百分比,包括但不限于约0.18%、约0.36%或约0.71%的浓度。另一个实施例可涉及饲料浓度,其中碱性饲料的量是中性饲料量的约十分之一(1/10)。例如,中性饲料的百分比在约1.8%至约7.1%的范围内,且碱性饲料的百分比在约0.18%至约0.71%的范围内,即中性饲料百分比的十分之一,其中饲料百分比是相对于总细胞培养物体积,所述总细胞培养物体积可包括以下至少一种:细胞、培养基、饲料和用于培养细胞以维持或生产正常、健康细胞用于实现目的基因包括例如人重组AAT蛋白的所需蛋白水平的任何其他营养物或添加剂。
在一个实施例中,生产重组AAT的方法可以涉及:生长表达重组AAT的克隆衍生细胞;每隔一天给表达重组AAT的克隆衍生细胞饲喂包含以下的饲料:中性饲料,诸如例如7A饲料(HyCloneTM Cell Boost 7a)和碱性饲料,诸如例如7B饲料(HyCloneTM Cell Boost7b);从第0天到第3天包括第3天的一部分即从大于0小时(第0天)至72小时、78小时或84小时或在所提供的小时之间的任何时间(第3天)保持37℃的培养温度,在第3天将培养温度转变至33℃,当先前提供的第一温度设定的时间结束时,从细胞中纯化重组AAT;以及收集纯化的重组AAT。在一个实施例中,中性饲料的浓度为细胞培养物总体积的约7.1%,碱性饲料的浓度为细胞培养物总体积的约0.71%。本发明的一个实施例可以涉及饲喂包含中性饲料和碱性饲料的组合的饲料,其中每隔一天将所述饲料饲喂给表达重组AAT的克隆衍生细胞,其中从第0天至第3天或其第3天的一部分将细胞培养温度保持在约37℃,并且其中从第3天或其第3天的一部分开始降低的细胞培养温度是约33℃。在另一个实施例中,本文描述的进一步饲喂安排是用于生长表达重组AAT的克隆衍生细胞的培养基,其中所述培养基提供附加营养物、氨基酸、金属等,其增强细胞培养条件,并且可以包括例如化学成分明确的培养基,例如XLG_E21_07(ExcellGene SA)。本发明的进一步的实施例可以包括XLG_E21_07培养基,通过改变几种组分的浓度,诸如增加葡萄糖、锌、天冬酰胺、谷氨酸和磷酸盐的浓度,简单地,例如,通过以小体积加入较高浓度的贮备溶液进行调节。这五种示例性组分的浓度可以根据表2中发现的以下范围进行修改:
表2
组分 | 浓度从 | 浓度至 |
葡萄糖 | 约2g/L | 约30g/L |
锌 | 约0.1mg/L | 约10mg/L |
天冬酰胺 | 约500mg/L | 约7000mg/L |
谷氨酸 | 约100mg/L | 约3000mg/L |
磷酸盐 | 约100mg/L | 约3000mg/L |
进一步的实施例可以涉及生产重组AAT的方法,包括:培养或生长表达重组AAT的克隆衍生细胞;每天给表达重组AAT的克隆衍生细胞饲喂至少一种饲料,所述饲料包括但不限于:中性饲料,诸如例如HyCloneTM Cell Boost 7A饲料和碱性饲料,诸如例如HyCloneTMCell Boost 7B饲料,其中碱性饲料以中性饲料的约1/10的量存在,并且饲料的量(体积/体积)基于总细胞培养物体积;从第0天到第3天保持37℃的培养温度,借此将来自“N-1”生物反应器(预培养或种子生物反应器)的新鲜细胞接种到生产容器定义为第0天开始,然后在第3天将培养温度转变到33℃(即,在生产培养物开始后72小时);纯化所述细胞表达的重组AAT;以及收集纯化的重组AAT。在一个实施例中,中性饲料的浓度为细胞培养物总体积的约3.6%,碱性饲料的浓度为细胞培养物总体积的约0.36%。本发明的一个实施例可以涉及饲喂包含中性饲料和碱性饲料的组合的饲料,其中每天将所述饲料饲喂给表达重组AAT的克隆衍生细胞,其中从第0天至第3天或其第3天的一部分将细胞培养温度保持在约37℃,并且其中从第3天或其第3天的一部分开始降低的细胞培养温度是约33℃。可用于本文所述方法和工艺的单独或组合饲料包括但不限于饲料表,表3中呈现的那些:
表3
表3
饲料 | 制造商 | 目录编号 |
CHO Xtreme饲料<sup>TM</sup> | Sartorius | BE02-056Q |
PowerFeed Advance | Sartorius | |
Ex-Cell Advanced CHO饲料1(具有葡萄糖) | Sigma(西格玛) | 24367-1L |
Ex-Cell CHOZN平台饲料 | 西格玛 | 24331C-10L |
EX-Cell<sup>TM</sup>水解产物 | 西格玛 | 24700C-100G |
Cell Boost TM 1(R05.2) | GE | SH30584.02 |
Cell Boost TM 2(R15.4) | GE | SH30596.01 |
Cell BoostTM 3(JM 3.5) | GE | SH30825.01 |
Cell Boost TM 4(PS307) | GE | SH30857.01 |
Cell Boost TM 5(CN-F) | GE | SH30865.01 |
Cell Boost TM 6(CN-T) | GE | SH30866.01 |
饲料A4CHO(CDM) | ExcellGene SA | |
饲料B4CHO(CDM) | ExcellGene SA | |
饲料3CHO(CDM) | ExcellGene SA |
在另一个实施例中,本文所述的进一步的饲喂安排是用于生长表达重组AAT的克隆衍生细胞的培养基,其中所述培养基可以不含源自动物的任何组分,诸如但不限于胎牛血清(FBS),例如化学成分明确的培养基,诸如培养基XLG_E21_07(ExcellGene SA)。可用于本文所述的生产重组AAT的方法和工艺中的单独或组合的培养基的非限制性示例还包括其中指定化学衍生的(CD)和无动物组分的(ACF)培养基表即表4中给出的那些:
表4
表4
表4
表4
另一个实施例可涉及使用各种培养基和/或饲料组合物及其任何合适的组合,以及培养基和饲料组合物与任何其他工艺条件的组合,所述其他工艺条件包括但不限于某些限定的pH值、氧水平和/或提供氧的鼓泡(提供气体)方案(氧和/或空气,同时提供或不提供氮和/或CO2)、温度和渗透压,所述渗透压可导致细胞培养物中重组AAT的体积生产率增加至大于或等于约6g/L、大于或等于约8g/L、或大于或等于约10g/L的滴度。
简言之,生产阶段期间培养条件的pH值可以在约pH 6.25至约pH 7.5;约pH 6.5至约pH 7.3;约pH 6.7至约pH 7.3;约pH 6.7至约pH 7.1;约pH 6.8至约pH 7的范围内;大于或等于约pH 6.5;大于或等于约pH 6.7;大于或等于约pH 6.8;小于或等于约pH 7.5;小于或等于约pH 7.3;小于或等于约pH 7.1;或小于或等于约pH 7。培养条件的氧水平和/或鼓泡方案可以在相对于空气饱和度的约20%氧至相对于空气饱和度约60%的氧;相对于空气饱和度约25%的氧至相对于空气饱和度约55%的氧;相对于空气饱和度约20%的氧至相对于空气饱和度约60%的氧的范围内;相对于空气饱和度大于或等于约20%的氧;相对于空气饱和度大于或等于约25%的氧;相对于空气饱和度大于或等于约30%的氧;相对于空气饱和度大于或等于约35%的氧;相对于空气饱和度大于或等于约40%的氧;相对于空气饱和度大于或等于约45%的氧;相对于空气饱和度大于或等于约50%的氧;相对于空气饱和度大于或等于约55%的氧;相对于空气饱和度小于或等于约60%的氧;相对于空气饱和度小于或等于约55%的氧;相对于空气饱和度小于或等于约50%的氧;相对于空气饱和度小于或等于约45%的氧;相对于空气饱和度小于或等于约40%的氧;相对于空气饱和度小于或等于约35%的氧;相对于空气饱和度小于或等于约30%的氧;或相对于空气饱和度小于或等于约25%的氧。培养条件的温度也可以在约26℃至约38℃;约28℃至约38℃;约29℃至约37℃;约31℃至约37℃;约34℃至约37℃;约31℃至约33℃的范围内;大于或等于约26℃;大于或等于约28℃;大于或等于约31℃;大于或等于约33℃;大于或等于约34℃;大于或等于约37℃;小于或等于约38℃;小于或等于约37℃;小于或等于约36℃;小于或等于约34℃;小于或等于约33℃;或小于或等于约31℃。
在一个实施例中,重组AAT的细胞培养物收获滴度可具有以下滴度:至少约1g/L、至少约3g/L、至少约4g/L、至少约6g/L、至少约8g/L和至少约10g/L;约3g/L、约4g/L、约5g/L、约6g/L、约7g/L、约8g/L、约9g/L和约10g/L;大于或等于1g/L、大于或等于约2g/L、大于或等于约2.5g/L、大于或等于约3.5g/L、大于或等于约4.5g/L、大于或等于约5.5g/L、大于或等于约6.5g/L、大于或等于约7.5g/L、大于或等于约8.5g/L、大于或等于约9.5g/L和大于或等于约10.5g/L。
又一个实施例可涉及生产重组AAT的方法,其中重组AAT可具有大量末端唾液酸,使得在接受重组AAT剂量的受试者中可增加重组AAT的循环半衰期。
在一个实施例中,生产人重组AAT蛋白的方法包括将宿主细胞与编码人AAT蛋白的第一核酸序列和编码转座酶的至少一种第二核酸序列一起培养,其中所述培养步骤在第一温度下在第一时间段和在第二温度下在第二时间段进行,并且任选地在第三温度下在第三时间段进行。所述方法的另一个实施例可以提供低于第一温度的第二温度(例如,降低至少:约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约8℃、约10℃等)。所述方法的进一步的实施例可以提供低于第二温度或第一温度的第三温度(例如,降低至少:约1℃、约2℃、约3℃、约4℃、约5℃、约6℃、约8℃、约10℃等)。所述方法的另一个实施例提供高于室温的第一温度、第二温度和/或第三温度(例如,约15℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃等)。在再一个实施例中,第一培养时间段可以是至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约10天、约15天、约1-2天、约1-3天、约1-4天、约1-5天、约1-7天、约1-10天、约1-15天、约1-16天、约1-17天、约1-18天、约1-20天等。进一步的实施例提供第二培养时间段,其中第二时间段可以是至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约10天、约15天、约1-2天、约1-3天、约1-4天、约1-5天、约1-7天、约1-10天、约1-15天、约1-16天、约1-17天、约1-18天、约1-20天等。再一个实施例可以涉及第三培养时间段,其中第三时间段可以是至少约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约10天、约15天、约1-2天、约1-3天、约1-4天、约1-5天、约1-7天、约1-10天、约1-15天、约1-16天、约1-17天、约1-18天、约1-20天等。进一步的实施例可以涉及第一时间段,包括约1-20天、约1-18天、约1-17天、约1-16天、约1-15天、约1-10天、约1-6天、约1-5天、约1-4天、约1-3天或约1-2天;第二时间段包括约1-20天、约1-18天、约1-17天、约1-16天、约1-15天、约1-10天、约1-6天、约1-5天、约1-4天、约1-3天或约1-2天;并且任选地,第三时间段包括约1-20天、约1-18天、约1-17天、约1-16天、约1-15天、约1-10天、约1-6天、约1-5天、约1-4天、约1-3天或约1-2天。
再进一步的实施例可以提供一种生产人重组AAT蛋白的方法,所述方法包括将宿主细胞与编码人AAT蛋白的第一核酸序列一起培养,并在产生宿主细胞的第一阶段使用编码转座酶的至少一种第二核酸序列,其中培养步骤在第一温度下在第一时间段和在第二温度下在第二时间段进行,其中每隔一天或每天施用第一饲料和第二饲料,第一时间段包括在约31℃至约37℃、约33℃至约37℃范围内的第一温度下约1-10天、约1-6天、约1-5天、约1-4天、约1-3天、约1-2天,且第二时间段包括在约31℃至约37℃、约33℃至约37℃的第二温度下约1-20天、约1-18天、约1-17天、约1-15天、约1-10天、约1-8天、约1-7天、约1-6天、约1-5天、约1-4天、约1-3天、约1-2天,并且如果所述方法包括在第三温度下在第三时间段,则第三时间段包括在约31℃至约37℃、约33℃至约37℃范围内的第三温度下约1-20天、约1-18天、约1-17天、约1-15天、约1-10天、约1-8天、约1-7天、约1-6天、约1-5天、约1-4天、约1-3天、约1-2天。
因此,血浆衍生AAT的供应不足的问题的一个解决方案涉及从表达重组AAT的重组哺乳动物细胞生产非常高产量的实施例。在本发明的实施例中,在考虑克隆衍生细胞群体的不同生理代谢的同时,使用用于生长和生产率的工艺条件,并且鉴定了支持用于基于生物反应器制造蛋白质的有利细胞表型的培养基和饲料组合物。
AAT产品表征和活性
通过2步色谱程序从收获的细胞培养物流体中纯化重组AAT,然后通过大小排除色谱进行分析。图9中的主峰显示纯化的重组AAT材料级分在约12分钟至约14分钟洗脱。执行分析HPLC以获得如通过早期生产运行之一生产的重组AAT的糖基化模式(图9)。此外,对从不同工艺条件获得的材料执行分析IEF,以观察这些工艺条件将如何影响AAT糖基化的总体结构表示(数据未显示)。由CHO细胞生产的血浆衍生AAT和重组AAT之间的比较涉及氧化甲硫氨酸。野生型AAT包含8种可能是氧化的目标的甲硫氨酸。特别是甲硫氨酸358和甲硫氨酸351已被报道易被氧化,并且当被氧化时,甲硫氨酸似乎对AAT有深远的影响,降低其抑制弹性蛋白酶的能力并且负责促炎反应(Li Z等人《美国生理学杂志肺细胞和分子生理学(Am JPhysiol Lung CellMol Physiol.)》297(2):L388-400,2009)。因此,AAT中一些甲硫氨酸残基的氧化可能导致抑制中性粒细胞弹性蛋白酶的能力下降,从而导致具有AAT缺乏症的疾病或病症的发病机制。因此,在本发明的一个实施例中,使用生物反应器中生产阶段期间使甲硫氨酸的氧化最小化的条件,因此活性的糖基化重组AAT蛋白或变体重组AAT蛋白可以具有少于8个甲硫氨酸氧化靶、少于6个甲硫氨酸氧化靶、少于4个甲硫氨酸氧化靶、少于3个甲硫氨酸氧化靶,或具有少于7个可氧化甲硫氨酸、少于5个可氧化甲硫氨酸、少于3个可氧化甲硫氨酸或少于1个可氧化甲硫氨酸的变体重组AAT蛋白。本发明的另一个实施例可以涉及活性重组AAT,其具有比血浆衍生AAT更少的氧化甲硫氨酸,或者其中血浆衍生AAT中氧化甲硫氨酸的水平大于在本文所述的修饰的CHO细胞中生产的重组AAT中的氧化甲硫氨酸的水平。本发明的这种实施例可以是在避免使用纯氧气的情况下向培养物中的细胞供应氧气,但在细胞培养物生产阶段期间仅使用纯化的空气。
另一个实施例可以涉及人重组AAT蛋白(包括其变体),其可以具有优于人野生型AAT蛋白的益处。一个实施例可提供人重组AAT蛋白,其包含与SEQ ID NO:1具有约80%、约85%、约90%或约95%序列同一性的多肽序列。本实施例的重组AAT蛋白可以包含在野生型AAT序列(SEQ ID NO:1)的51、351或358位具有至少一个突变的序列。进一步的实施例可提供人重组AAT蛋白,其包含具有SEQ ID NO:1突变的多肽序列,其中所述突变包含以下突变中的至少一种:51位的苯丙氨酸至亮氨酸(F51L)、351位的甲硫氨酸至缬氨酸突变(M351V)、或358位的甲硫氨酸至缬氨酸突变(M358V)。例如,包括其变体的人重组AAT蛋白可以在野生型AAT的51位(F51L)具有从苯丙氨酸到亮氨酸的单个突变,其中变体重组AAT具有比野生型AAT改进的热稳定性。(Kwon KS等人《生物化学杂志(JBC)》269(13):9627-9631,1994;Kim J等人《生物化学杂志》,270(15):8597-8601,1995)。附加重组AAT蛋白及其变体可包括AAT的单或双突变形式,诸如但不限于351和358位的甲硫氨酸至缬氨酸突变(M351V;M358V)。(Taggart C等人《生物化学杂志》,275(35):27258-65,2000)。进一步的实施例可以包括具有单突变、双突变或多突变的重组AAT蛋白或其变体,包括但不限于包含F51L、M351V和M358V的三突变。(Zhu W等人,《FEBS开放生物学(FEBS Open Bio.)》8(10):1711-1721,2018;eCollection 2018年10月)。又一个实施例可提供人重组AAT蛋白(包括其变体),其包含具有SEQ ID NO:1突变的多肽序列,其中在所述突变中是51位(F51L)的苯丙氨酸至亮氨酸突变、351位的甲硫氨酸至缬氨酸突变(M351V)、或358位的甲硫氨酸至缬氨酸突变(M358V),或其任何组合。阻止一些甲硫氨酸残基氧化的突变可降低蛋白酶抑制活性,包括例如弹性蛋白酶等。因此,具有降低蛋白酶抑制活性的氨基酸突变的变体重组AAT蛋白可用于本发明的实施例中。此外,具有增强热稳定性的任何氨基酸突变的变体重组AAT蛋白可用于本发明的实施例中,包括位于AAT疏水核心的任一者。用于生产具有热稳定性以及相对于血浆衍生AAT蛋白改进的热稳定性的人重组AAT蛋白或其变体的方法可以是有用类型的重组AAT蛋白。
另一个实施例可以涉及人重组AAT蛋白,包括用与其生产方法相同的方法生产的其变体,其中重组AAT蛋白(包括其变体)具有带有抗氧化抗性的突变。这些突变可选自半胱氨酸、甲硫氨酸或可被氧化的任何其他氨基酸,或多个氨基酸突变。抗氧化突变的非限制性示例包括基于野生型AAT蛋白序列的甲硫氨酸351、甲硫氨酸358或两者。生产人重组AAT蛋白或其变体的方法可以产生重组AAT蛋白或其变体,其与血浆衍生AAT蛋白相比具有增加的热稳定性,其中突变是从51位的苯丙氨酸到亮氨酸。本发明的进一步的实施例可涉及生产具有改进的热稳定性和抗氧化能力的人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,其中对野生型AAT蛋白的氧化敏感的甲硫氨酸被突变、修饰或改变。
又一个实施例可以涉及生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法,其中它们具有增加的活性,在体内或患者中的循环半衰期大于血浆衍生AAT蛋白,促进AAT蛋白在任何施用途径中的施用,或其组合。在附加实施例中,生产人重组AAT蛋白(包括其变体)的方法可以在基本上不含任何动物来源组分即没有任何动物组分或任何污染的人或非人动物蛋白(包括可能诱导免疫反应的那些)的细胞培养基中生长。在一个实施例中,生产人重组AAT蛋白包括在培养基中进行的培养步骤,并且所述培养基含有少于约5%(体积/体积)、少于约4%(体积/体积)、少于约3%(体积/体积)、少于约2%(体积/体积)、或少于约1%(体积/体积)的动物来源组分(人或非人),或所述培养基本上不含动物来源组分。进一步的实施例提供一种生产人重组AAT蛋白的方法,所述方法包括在培养基中进行的培养步骤,其中培养基可以包含或可以不包含人重组胰岛素。
再一个实施例可涉及人重组AAT蛋白(包括其变体),其包含与SEQ ID NO:1具有约至少约95%序列同一性、与SEQ ID NO:1具有约或至少约97%序列同一性、与SEQ ID NO:1具有约或至少约98%序列同一性、与SEQ ID NO:1具有约或至少约99%序列同一性的多肽序列。这些重组人AAT蛋白可以通过生产人重组AAT蛋白的任何方法生产。
在本发明的进一步的实施例中,由本文所述方法转染和生长的修饰的CHO细胞衍生的重组AAT可减少炎症。另一个实施例可以涉及具有比血浆衍生AAT抗炎活性更大的抗炎活性的活性重组AAT,其中例如,当外周血单核细胞(PBMC)暴露于脂多糖(LPS)时,活性重组AAT蛋白抑制白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子(TNF)的表达或释放。进一步的实施例可以涉及保护免受TNF-α或内毒素诱导的疾病或死亡的活性重组AAT。在又一个实施例中,活性重组AAT可发挥抗炎和免疫调节活性,还发挥抗凋亡活性。例如,从本文所述的修饰的CHO细胞衍生的重组AAT可抑制对乙酰氨基酚或醋氨酚诱导的肝细胞凋亡,这通常可见于哺乳动物中的急性肝衰竭中。进一步的实施例可以涉及具有比血浆衍生AAT蛋白的抗凋亡活性更大的抗凋亡活性的活性重组AAT蛋白,其中例如,活性重组AAT抑制由对乙酰氨基酚诱导的肝损伤。
另一个实施例可以涉及生产具有人样糖基化并且具有比血浆衍生AAT产品更高的纯度和质量的重组AAT制剂。进一步的实施例包括在哺乳动物宿主细胞中制成的重组AAT制剂的生产,所述哺乳动物宿主细胞生长至非常高的密度并且生产非常高水平的重组AAT,因此允许这些AAT制剂的商业上可行的制造。在又一个实施例中,重组AAT制剂的生产如本文所述在高产CHO宿主细胞中进行,并且没有任何动物来源的衍生组分,因此确保了比人血浆衍生AAT更高的安全性特征。
重组AAT组合物及其治疗
本文所述的实施例提供将组合物施用于患有AAT缺乏症的受试者,所述组合物是生物相容性形式,其也可以是适于体内施用的治疗组合物。生物相容性形式包括活性重组AAT,其可以被施用,其中任何毒性作用被活性重组AAT蛋白的治疗作用超过。当施用治疗有效量的治疗组合物时,可以使用在剂量下和在一段时间内有效的量以实现所需结果,所述治疗组合物包含重组AAT蛋白,诸如例如本文定义的人重组AAT蛋白。对于治疗活性量的活性物质,设想并考虑例如可能接受或被施用包含重组AAT的治疗组合物的受试者或个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及AAT在个体中引发所需反应的能力等因素。也可出于剂量目的考虑这些因素,并可相应调整治疗方案,从而提供最佳治疗反应。
一个实施例可以涉及在适宜的药学上可接受的载体、稀释剂或介质(包括但不限于水、盐水、水性缓冲液等)中包含本文所述活性重组AAT(包括其变体)的组合物,包括药物组合物,所述组合物对于施用是充分无菌的(例如,静脉内、皮下等)。在一些实施例中,基于透明质酸酶的配方可以是活性重组AAT(例如,赫赛汀)的可用载体。患有α1-抗胰蛋白酶缺乏症的受试者可通过向所述受试者施用有效量的重组AAT蛋白(包括其变体)和在一个实施例中人重组AAT蛋白来治疗,其中所述量有效改善或减少所述受试者中的α1-抗胰蛋白酶缺乏症,从而治疗所述受试者并将所述受试者的α1-抗胰蛋白酶血浆水平升高至使所述受试者不再患有AAT缺乏症的水平。进一步的实施例提供一种治疗患有AAT缺乏症的受试者的方法,所述方法通过以有效改善、改进或减轻受试者的AAT缺乏症的量施用人重组AAT蛋白(包括其变体)或包含人重组AAT蛋白(包括其变体)的组合物,从而治疗受试者。另一个实施例可涉及一种治疗患有导致蛋白酶诱导的组织损伤的疾病的受试者的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的人重组AAT蛋白或包含所述人重组AAT蛋白的组合物以改善所述受试者中蛋白酶诱导的组织损伤,从而治疗所述受试者。
剂量配方、剂量量和施用此类剂量配方的途径可根据待治疗病症的性质和严重性、受试者的年龄和体重等而变化。经由静脉内输注施用约60mg/kg体重的剂量(例如,每周一次)可能是在受试者(例如,AAT缺乏患者或需要AAT的受试者)中使用重组AAT的所需增强协议。另选地,可根据水平增加或减少剂量,以为患有AAT缺乏症的受试者提供最佳益处。在另一个实施例中,每两周以120mg/kg给药、每三周以180mg/kg给药或每月以250mg/kg给药也可对有需要的受试者施用。包含有效量的重组AAT或其变体的本发明组合物可以通过医生认为适宜的任何合适的途径对人或非人动物施用。应当理解,根据本发明对患者施用和用于根据本发明的治疗或预防所需的根据本发明的重组AAT或其变体的量将随施用途径、需要治疗或预防的病症的性质和严重性、患者的年龄、体重和病症而变化,并且最终将由主治医生决定。然而,一般而言,有用的量使得通过将所述药物组合物施用于待治疗的患者,改善至不受AAT缺乏症影响的人的水平。例如,包含本文所述的重组AAT或其变体的药物组合物和药学上可接受的载体、稀释剂或介质可以通过任何适宜的途径以足以将AAT缺乏受试者的AAT血浆水平增加至健康受试者的那些AAT血浆水平的量即约1g/L至约2g/L或更高施用于患有AAT缺乏症的受试者或患者。由于本文所述实施例的重组AAT或变体AAT可能具有更长的半衰期,因此每周静脉内施用可能不是必需的。然而,可能会对受试者或个体进行监测,并可能会改变剂量或剂量组,以便为受试者提供最佳结果。输注速率也可能不同。然而,0.08ml/kg/千克每分钟已经是公认的速率,当施用包含重组AAT(包括其变体)的组合物时,所述速率可能是有用的。
另一个实施例可以涉及包括药物组合物和药学上可接受的载体、稀释剂或介质的组合物,其中所述组合物可以包含本文所述的重组AAT(包括变体),其中所述组合物可以外用(即局部)和内用(即,通过注射、输注、吸入)用于引起AAT缺乏症、炎症、蛋白酶诱导的组织损伤等的疾病或病症,并且可以通过例如肠胃外施用(包括但不限于静脉内、心内、冠状动脉内、肌内、皮下、通过吸入、支气管/气管滴注、经皮肤、皮内、经皮、粘膜内、经粘膜、***内、局部、鼻内、直肠等)以及它们的组合对有需要的受试者施用。施用也可以通过包括但不限于腹膜内、胸膜内、鞘内、动脉内、胃肠外等及其组合的途径在组织和空腔中进行。粘膜内施用可经由粘膜进行,诸如但不限于唇、口、鼻道、中耳、咽鼓管、消化道内衬、泌尿生殖道(包括尿道和***)内衬、呼吸道内衬和眼(包括结膜),其可包括局部施用以及例如玻璃体内注射。根据施用途径,活性重组AAT(包括其变体)可包衣于材料中,以保护化合物免于被酶、酸和其他可使重组AAT失活的自然条件降解。在一个实施例中,活性重组AAT(包括人重组AAT、其变体)或包含其重组AAT的组合物可以静脉内施用。在另一个实施例中,活性重组AAT(包括人重组AAT、其变体)或包含其重组AAT的组合物可以鼻内施用,或通过直接吸入肺中施用。在再进一步的实施例中,活性重组AAT(包括人重组AAT、其变体)或包含其重组AAT的组合物可以局部施用。
在本发明的一个实施例中,活性重组AAT蛋白(包括其变体)可以制备成用于局部施用的组合物。来源于本文所述修饰的CHO细胞的包含重组AAT(包括其变体)的组合物的非限制性示例包括溶液、喷雾剂、洗剂、凝胶、乳膏、香油、糊剂或软膏。
在本发明的另一个实施例中,具有AAT缺乏症的受试者可以用本文所述的重组AAT蛋白(包括其变体)进行治疗。另一个实施例可以涉及治疗受炎症、免疫反应或凋亡影响的疾病或病症,其中重组AAT蛋白(包括其变体)抑制炎症、免疫反应和凋亡。
如本文所证明的,从培养于生物反应器中的高水平生产哺乳动物细胞获得的要用重组AAT制剂(包括其变体)治疗的疾病选自由给定受试者的AAT活性降低的任何发生所诱导的疾病群组,并且如它们由患有例如功能性AAT缺乏症、肝硬化、囊性纤维化、炎性皮肤病、糖尿病诱导的伤口愈合缺乏、蛋白酶诱导的组织损伤等的患者所呈现。
本文所述的重组AAT(包括其变体)也可用于治疗患有蛋白酶诱导的组织损伤的受试者。有多种潜在疾病可能表现为蛋白酶诱导的组织损伤。这些疾病的非限制性示例包括可能由任何恶性疾病引起的那些,包括但不限于癌症(例如,上皮来源和/或间充质来源的恶性肿瘤、肉瘤、恶性胸膜间皮瘤)、神经变性障碍以及炎性和心血管疾病。这些疾病也可能包括由不确定或不明原因的炎症引起的那些。
进一步的实施例可涉及治疗患有AAT缺乏症或蛋白酶诱导的组织损伤的受试者,其通过选自以下任一种的施用途径在组织和空腔中施用人重组AAT蛋白(包括其变体),或包含人重组AAT蛋白(包括其变体)和药学上可接受的载体、稀释剂或介质的组合物:皮下、肌内、腹膜内、胸膜内、鞘内、皮内、经皮、静脉内、动脉内、胃肠外、粘膜内、局部、吸入等及其组合。
α1抗胰蛋白酶治疗可提供抗炎作用和丝氨酸蛋白酶抑制以外的附加应用。在一些实施例中,这些可以包括通过诸如但不限于半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-3等半胱天冬酶抑制的免疫调节和抗凋亡。即使α-1抗胰蛋白酶失去其抗蛋白酶作用,这些作用也可能存在或保留。参见例如Wanner A.(2016)α-1抗胰蛋白酶作为与α-1抗胰蛋白酶缺乏症不相关联的病症的治疗剂。在:Wanner A.,Sandhaus R.(编辑)“α-1抗胰蛋白酶(Alpha-1Antitrypsin)”《呼吸医学(Respiratory Medicine)》胡玛纳出版社,Cham;Siebers K等人“α-1抗胰蛋白酶抑制ATP介导的白细胞介素-1β经由CD36和烟碱乙酰胆碱受体的释放(Alpha-1 Antitrypsin Inhibits ATP-Mediated Release of Interleukin-1βvia CD36and Nicotinic Acetylcholine Receptors)”《免疫学前沿(Front Immunol.)》4月25,9:877,2018,两者均以引用方式全文并入本文中。
进一步的实施例可以涉及治疗患有胰腺细胞破坏的受试者,所述胰腺细胞破坏是由于例如自身免疫性疾病,诸如在患有糖尿病疾病(例如I型糖尿病、青年成熟型糖尿病(MODY))的儿童和青少年以及成人中。在这些患者中,在注射人重组AAT之后,循环AAT水平的升高可防止β细胞的破坏并逆转高血糖症的影响。
重组AAT的另一个应用可能是器官移植和保存,因此其可能使用比普通经典方法更安全和危险性更低的技术。免疫抑制剂联合治疗患者(包括随后出现免疫缺陷并累积大部分增强毒性的患者)以解决移植物功能障碍。移植物抗宿主病通常是与干细胞移植相关联的并发症。器官摘取期间使用的灌注液可用重组AAT处理,例如,在中用于肺移植。在器官保存或存储期间也可能使用重组AAT,因此,活体和死亡供体池可能会增加,这可能是器官移植的重要限制因素。因素可以包括更长的存储时间、更好的器官保护等,使得对移植患者产生较少的伤害,包括但不限于移植期间对器官本身、患者的损害(例如,脑损伤)和更少的长期移植物衰竭或排斥的发作。
在其他实施例中,重组AAT可能与具有大量缺血-再灌注损伤组分的严重且重要的非器官移植疾病(诸如心肌梗死、中风等)中的组织保护相关。(参见例如Abouzaki NA等人“用血浆衍生α-1抗胰蛋白酶抑制心肌缺血再灌注后的炎性损伤:VCU-α1RT研究的事后分析(Inhibiting the Inflammatory Injury After Myocardial Ischemia ReperfusionWith Plasma-Derived Alpha-1 Antitrypsin:A Post Hoc Analysis of the VCU-alRTStudy)”《心血管药理杂志(J Cardiovasc Pharmacol.)》2018年6月;71(6):375-379;MauroAG等人“血浆衍生α-1抗胰蛋白酶在急性心肌梗死中的心脏保护作用的临床前转化研究(Preclinical Translational Study of the Cardioprotective Effects of Plasma-Derived Alpha-1Anti-trypsin in Acute Myocardial Infarction)”《心血管药理杂志》2017年5月;69(5):273-278;Toldo S等人“重组人α-1抗胰蛋白酶-Fc融合蛋白独立于弹性蛋白酶抑制,减轻缺血再灌注后小鼠心肌炎性损伤(Recombinant Human Alpha-1AntitrypsinFc Fusion Protein Reduces Mouse Myocardial Inflammatory InjuryAfter Ischemia-Reperfusion Independent of Elastase Inhibition)”《心血管药理杂志》2016年7月;68(1):27-32;Toldo S等人“α-1抗胰蛋白酶抑制半胱天冬酶-1并且保护急性心肌缺血再灌注损伤(Alpha-1antitrypsin inhibits caspase-1and protects fromacute myocardial ischemia-reperfusion injury)”《分子与细胞心脏病学杂志(JMolCell Cardiol.)》2011年8月;51(2):244-51;Mollnes TE等人“急性心肌梗死患者中的急性期反应物和补体激活(Acute phase reactants and complement activation inpatients with acute myocardial infarction)”《补充药物和疗法(Complement.)》1988;5(1):33-9,所有杂志都通过引用整体并入用于重组AAT疗法的使用教导。)
重组AAT的进一步的用途是用于溶血性贫血、脓毒症和其他相关疾病,以防止或减少游离血红素释放的损害作用,特别是在红细胞溶血期间。此外,重组AAT可能在移植物抗宿主病中发挥重要作用。(参见例如Janciauskiene、Sabina和Tobias Welte.“未来方向:利用AAT的诊断途径和疗法(Future directions:diagnostic approaches and therapywith AAT)”《α-1-抗胰蛋白酶缺乏症(Alpha-1-Antitrypsin Deficiency)》85(2019):159;Geiger S等人“在致死性GvHD小鼠模型中表达α-1抗胰蛋白酶的间充质基质细胞带来长期存活益处(Alpha-1 Antitrypsin-Expressing Mesenchymal Stromal Cells Confer aLong-Term Survival Benefit in a Mouse Model of Lethal GvHD)”《分子疗法(MolTher.)》2019年8月7日;27(8):1436-1451;Thangavelu G、Blazar BR.“实现耐受诱导以预防急性移植物抗宿主病(Achievement of Tolerance Induction to Prevent AcuteGraft-vs.-Host Disease)”《免疫学前沿(Lront Immunol.)》2019年5月6日;10:309;Baranovski BM等人“α-1抗胰蛋白酶替代用于α-1抗胰蛋白酶缺乏患者中的肺外疾病(Alpha-1 Antitrypsin Substitution for Extrapulmonary Conditions in Alpha-1Antitrypsin Deficient Patients)”《慢性阻塞性肺病(Obstr Pulm Dis.)》2018年9月19;5(4):267-276;Magenau JM等人“α1-抗胰蛋白酶输注治疗类固醇耐药的急性移植物抗宿主病(Alpha-1 Antitrypsin Substitution for Extrapulmonary Conditions inAlpha-1Antitrypsin Deficient Patients)”《血液学(Blood)》2018年3月22;131(12):1372-1379;Jerkins JH等人“α-1-抗胰蛋白酶治疗类固醇难治性急性胃肠道移植物抗宿主病(Alpha-1-antitrypsin for the treatment of steroid-refractory acutegastrointestinal graft-versus-host disease)”《美国血液学杂志(Am J Hematol.)》2017年10月;92(10):E610-E611;Lee S等人“在小鼠骨髓细胞中α1-抗胰蛋白酶选择性地抑制IL-32诱导的炎性细胞因子(IL-32-induced Inflammatory Cytokines AreSelectively Suppressed byα1-antitrypsin in Mouse Bone Marrow Cells)”《免疫网络(Immune Netw.)》2017年4月;17(2):116-120;Gerner RR等人“用α-1-抗胰蛋白酶治疗类固醇难治性急性肠移植物抗宿主病:2例报告(Treatment Withα-1-Antitrypsin forSteroid-Refractory Acute Intestinal Graft-Versus-Host Disease:A Report of2Cases)”《移植(Transplantation)》2016年12月;100(12):el58-el59;Marcondes AM等人“类固醇难治性急性GVHD对α1-抗胰蛋白酶的反应(Response of SteroidRefractoryAcute GVHD to a l-Antitrypsin)”《血液和骨髓移植生物学(Biol Blood MarrowTransplant.)》2016年9月;22(9):1596-1601;Kekre N,Antin JH.“用于移植物抗宿主病的新兴药物(Emerging drugs for graft-versus-host disease)”《新兴药物专家意见(Expert Opin Emerg Drugs)》2016年6月;21(2):209-18;Lior Y等人“α1-抗胰蛋白酶的治疗组合物和用途:专利综述(Therapeutic compositions and uses ofalphalantitrypsin:a patent review)”(2012-2015)《治疗术专利专家评论(Expert OpinTher Pat)》2016年5月;26(5):581-9,所有杂志都通过引用并入本文用于其关于AAT疗法的使用的教导。)
疾病负担的中心作用可能由病毒性疾病(例如,在动物中,来源于动物,具有传播给人类的潜力)造成。A型流感病毒(且值得注意的是,就发病率、死亡率和成本而言,流感感染已成为世界上最重要的传染病)、具有其特定流行或大流行危险和挑战的冠状病毒以及1型人类免疫缺陷病毒(HIV-1)使用宿主丝氨酸蛋白酶进行细胞进入和随后感染。α-1抗胰蛋白酶水平可能在疾病传播和演变中发挥作用(包括病毒传播减少、炎症调节和减轻以及细胞死亡预防),并且因此也可能潜在地用于增强疗法。(参见例如Wanner A“α-1抗胰蛋白酶作为用于与α-1抗胰蛋白酶缺乏症无关的病症的治疗剂(Alpha-1antitrypsin as atherapeutic agent for conditions not associated with alpha-1antitrtrypsindeficiency)”。在:Wanner A,Sandhaus R.S.(编辑):《α抗胰蛋白酶在健康和疾病中的作用(Alpha-an antrypsin.Role in health and disease)》,胡玛纳出版社2016;斯普林格国际出版公司,Cham,Heidelberg,New York,Dordrecht,London,pp.141-55,通过引用整体并入本文。)
此外,AAT可用于治疗囊性纤维化和慢性阻塞性肺病。就使α-1抗胰蛋白酶水平不升高至正常水平,而是超过正常水平而言,α-1抗胰蛋白酶充足可具有治疗潜力。由于α-1抗胰蛋白酶是中性粒细胞弹性蛋白酶的强效抑制剂,其最终目的是在囊性纤维化中失去进行性肺重塑和破坏的能力。此外,由于嗜中性粒细胞依赖性和嗜中性粒细胞非依赖性炎症以及细胞凋亡导致的细胞死亡是中心,α-1抗胰蛋白酶可用于组织保护方法。(参见例如McElvaney NG.“α-1抗胰蛋白酶在囊性纤维化和与α-1抗胰蛋白酶缺乏症相关联的肺病中的疗法(Alpha-1Antitrypsin Therapy in Cystic Fibrosis and the Lung DiseaseAssociated with Alpha-1 Antitrypsin Deficiency)”《美国胸科学会年鉴(Ann AmThorac Soc.)》2016年4月;13增刊2:SI91-6;Janciauskiene S,Welte T.《未来方向:利用AAT的诊断途径和疗法》。在:Strand P,Prantyl ML,Bals R编辑α1-抗胰蛋白酶缺乏症(ERS专著)Sheffield,欧洲呼吸学会2019:pp.158-78;Wanner A.“α-1抗胰蛋白酶作为用于与α-1抗胰蛋白酶缺乏症无关的病症的治疗剂”。在:Wanner A,Sandhaus R.S.(编辑):《α-1抗胰蛋白酶在健康和疾病中的作用》,胡玛纳出版社2016;斯普林格国际出版公司,Cham,Heidelberg,New York,Dordrecht,London,pp.141-55,所有这些文献均通过引用并入本文。)
本发明的再一个实施例可以涉及将活性重组AAT(包括其变体)施用于患有慢性阻塞性肺病(COPD)或相关疾病或病症的个体,所述疾病或病症包括但不限于肝病、呼吸***疾病等,其中存在由循环AAT缺失或缺乏引起的AAT缺乏症或由于其未被适当分泌而在肝中积累AAT。可以用重组AAT(包括其变体)治疗的疾病、病症或障碍的非限制性示例包括:肺气肿、肝硬化、肝衰竭、COPD、气胸、哮喘、伴有多血管炎的肉芽肿病、胰腺炎、支气管扩张、自身免疫性肝炎和任何恶性疾病,包括但不限于一些癌症(例如,上皮来源和/或间充质来源的恶性肿瘤、肉瘤、恶性胸膜间皮瘤)和例如肺、肝和膀胱的那些癌症。
一个实施例可涉及使用活性糖基化重组AAT蛋白(包括其变体)的增强或替代疗法,其通过将所述蛋白静脉内输注到患有AAT缺乏症的受试者中进行。施用可以遵循常规方法,除了代替输注血浆衍生AAT蛋白,本发明的实施例可以涉及使用通过本文所述方法生产的修饰的CHO细胞来源的活性重组AAT蛋白(包括其变体)来施用。
进一步的实施例可以涉及重组AAT蛋白CHO衍生重组AAT高效地通过皮肤或粘膜施用以进入例如肺、呼吸***、循环***等。在一个实施例中,重组AAT可被吸入并用作例如由AAT缺乏症诱导的肺气肿的局部治疗。重组AAT可以比血浆衍生AAT更高效和改进的方式穿越皮肤层。
本发明的实施例还解决所述问题,所述实施例提供治疗疾病的方法,其中在培养的哺乳动物细胞中制成的重组AAT以用于改善或改进AAT缺乏受试者或受与AAT相关联的疾病、障碍或病症影响且有需要的那些受试者中的AAT水平的量和质量生产。
免疫疗法在不同的癌症类型中发挥了重要作用,并广泛改变了一些恶性疾病的预后,包括但不限于癌症(例如,上皮来源和/或间充质来源的恶性肿瘤、肉瘤、恶性胸膜间皮瘤)。在这种治疗下的临床障碍是由于自身免疫的有效遏制导致的自身免疫疾病的发生。在一些实施例中,AAT可用于自身免疫性疾病治疗。
实例
以下实例说明本说明书的特定方面。这些实例不应被解释为限制性的,因为这些实例仅仅提供对实施例及其各个方面的特定理解和实践。
实例1:α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白序列
AAT基因最常见的等位基因(即,M等位基因)以合成的CHO密码子优化DNA的形式被克隆到高效表达载体中。由目的基因(GOI)编码的目的期望蛋白(图1A,无前导序列;图1B-1D(具有前导序列)由pXLG-6-AAT表达载体表达。参见图2A-2C和图3。具有394个氨基酸的野生型AAT基因的序列在灵长类动物中是高度保守的,与人的M等位基因相比在黑猩猩中只有一个氨基酸差异。尽管如此,在人群体中,仍存在多于50个等位基因变体,其中许多导致或成为疾病的原因。M等位基因序列可见于Long GL,等人(《生物化学(Biochemistry)》23(21):4828-4837,1984)中,但也可商购自人基因组测序平台(见附录)。AAT蛋白表现出三个N-连接的糖基化位点。
所用的α1-抗胰蛋白酶(AAT)序列与Long GL等人(《生物化学》23(21):4828-4837,1984)发表的序列相同;然而,原始序列的前导序列(即,分泌信号肽序列)由人重链IgG1序列的前导序列取代。根据信号肽切割程序,从预期的前三个氨基末端氨基酸谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)和脯氨酸(P)开始,在CHO细胞中将会制成相同的成熟多肽。SERPINA1基因编码基于M等位基因表示的基因序列的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白,M等位基因被认为是最常见的功能性人AAT。分泌的全长野生型AAT氨基酸序列有394个氨基酸,发表于Long GL等人1984中。
包括人重链IgG1前导序列(以粗体和下划线)在内的序列在图1C中作为重组人α-1抗胰蛋白酶蛋白(M)的氨基酸序列提供。
实例2:α1-抗胰蛋白酶的宿主细胞表达***
本文所述的修饰的CHO细胞(即,快速生长、高蛋白产出、高密度稳健性、悬浮培养下的可扩展性等)被开发用于生物反应器,即,通过修饰和选择最初在学术实验室中产生的特定中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系进行大规模制造(Puck TT等人,《实验医学杂志(J.Exptl.Med.)》108(6):845-956,1958),学术实验室随后在数十年间提供给包括大学团体在内的众多研究人员。已知CHO细胞会快速改变其遗传构成,并以非常类似于人或动物中的癌细胞的方式适应各种培养条件。本发明的细胞来源于非重组细胞宿主,在无动物组分培养基中的悬浮培养下进行广泛优化以实现快速、稳健生长。这些表型特征在转染后被遗传给表达AAT的重组细胞,并且除了其他特征之外,允许这些细胞生长至大于2000万个细胞/mL的密度和导致小于20小时/细胞倍增的倍增速率的生长速率,产生超过约5g/L的ATT或超过约6g/L或超过7g/L或超过8g/L的AAT,证明了在大规模制造中的稳健性和生产率,同时在无动物组分的培养基中生长。使用本文所述的基于转座子的高效基因转移技术成功建立了表达重组人AAT的克隆CHO细胞系。CHO细胞的复杂历史及其不确定的遗传构成描述在出版物(Wurm,F.M.《过程》1(3):296-311,2013)中。文献中还报告了CHO细胞中AAT表达水平仅为100μg/L/天(Paterson T等人,《应用微生物学与生物技术(AppliedMicrobiol.Biotechnol.)》40:691-698,1994)和最近约1g/L的最终产率(Lalone M-E等人,《生物技术杂志(J.Biotechn.)》307(2020)87-97,2019),但在人视网膜组织PerC6细胞系中,AAT以略高于2.5g/L的最终产率的量表达(Ross D等人,《生物技术杂志》162(2-3):262-273,2012)。
实例3:用于转染的表达载体***
使用双载体共转染途径,以用所需目的AAT蛋白转染CHO细胞。所需AAT蛋白由目的基因(GOI)-载体、pXLG-6-AAT表达载体(ExcellGene S.A.;图2A、图2B、图2C、图2D)编码。图3示出在多克隆位点(MCS)内将AAT基因克隆到其中的pXLG-6载体图。在双载体共转染途径中使用了编码PiggyBac转座酶(mPBase)的第二质粒载体pXLG-5(ExcellGene S.A.)(SEQID NO:10)(图4A、图4B)。
AAT基因最常见的人等位基因(即,M等位基因)以无内含子DNA的形式克隆到高效表达载体中,例如pXLG6表达载体中。具有394个氨基酸的野生型AAT基因的序列在灵长类动物中是高度保守的,与人的M等位基因相比在黑猩猩中只有一个氨基酸差异。尽管如此,在人群体中,仍存在多于50个等位基因变体,其中许多导致或成为疾病的原因。M等位基因序列可见于Long GL等人,《生物化学》1984,23,4828-4837中,但也可商购自人类基因组序列平台。野生型人AAT蛋白表现出三个N-连接的糖基化位点。本文描述的本发明实施例的重组AAT可以具有附加糖基化位点。
实例4:转染和选择表达重组AAT的CHO细胞
在不含动物组分的培养基中,具有快速生长所需表型的非重组宿主细胞用于产生主细胞库(MCB),其被证实为中国仓鼠卵巢细胞。所述基于转座子的高效基因转移技术通过共转染宿主细胞与包含AAT基因序列的供体载体和表达核酸的第二转座酶而发生,其在由转座酶基因编码的转座酶的帮助下介导AAT基因***宿主细胞的基因组中。将在ProCHO5培养基(Lonza)(由上述主细胞库建立)中悬浮培养的种子训练培养物中衍生的细胞通过离心分离旋转减慢,并严格按照商购转染试剂盒(ExcellGene SA)中提供的说明书进行转染,提供5μg表达载体混合物(包含上述两种载体)用于10ml的细胞培养物体积。随后,将转染的细胞悬浮培养,同时在CCE受控和加湿的振荡培养箱中以180转/分钟且在37℃下摇动。每天对细胞培养物进行离心分离,并且将容器中形成为团块的沉降细胞置于转染试剂盒提供的新鲜预温热培养基(含50μg/ml嘌呤霉素)中,以供选择。转染后约4天,培养物的存活率和细胞数量下降,但随后细胞群体开始恢复,并且存活率和细胞数量均开始增加。在选择性条件下培养10天后,重新建立了健康生长细胞的高存活率群体。未对建立的培养物进行进一步的嘌呤霉素选择。这种快速生长的重组细胞群体显示出以高水平表达人重组AAT。这一细胞群体被认为是重组AAT细胞的“池”,表示AAT基因进入CHO细胞基因组的多种和不同遗传整合事件的混合物。
使用扩增的重组细胞群体,即重组CHO-AAT池来产生研究细胞库(RCB-P-rAAT;10个小瓶)。解冻一小瓶这一群体,使用Lonza ProCHO 5培养基扩增,并使用限制性稀释途径克隆和再克隆单细胞。这一途径以确保了新兴细胞群体的克***源,概率大于98%。使用研究细胞库“RCB-P 03-rAAT”进行单细胞的两次限制性稀释途径,并递送72个高产克隆衍生细胞群体,其中五(5)个在长期培养物中进行了进一步研究。这些长期培养物来自附加研究细胞库,使用克隆衍生细胞群体(分别指示为RCB-0和RCB-1和相应的克隆名称)产生。这5个细胞系(来自库RCB-1)的亚克隆细胞的生产率保持稳定,并且四(4)个表现最佳的克隆衍生细胞群体被命名为“克隆112、423、555和585”,并再次冷冻为RCB-2,且注明相应的克隆名称。
当在分批和补料分批条件下用非优化工艺研究时,这些细胞系中的两个,XLG-AAT#112和XLG-AAT#423来源于又一个研究细胞库RCB-3(图5和图6)。在这些非优化的细胞培养物生产条件下,这两个克隆衍生细胞群体在14天过程后分别显示出4g/L和5g/L的表达水平,其显著高于可从人血浆获得的产率(即,约1-1.5g/L)。
另一个克隆细胞系XLG-AAT#30是根据在与前述类似条件下进行的转染而开发的。生产条件包括在保持在50ml OrbShakeTM管中的10ml培养物中使用多种培养基和饲料,但未进行任何深度优化。如图7可以看出,在某些研究条件下,在14天内获得了6-8g/L的产物滴度。按照图9中使用的安排,在第12和14天的时间点,比较了四种不同的培养基条件(n=4)。黑色柱(最左侧)是指ExcellGene培养基(XLG_E21_7CDM)与以下联用:饲料7A/7B(HyCloneTMCell Boost 7a增补剂(SH31026.01);HyCloneTM Cell Boost 7b增补剂(sh 31027.01);通用电气医疗生命科技);HyClone CDM4CHO和饲料7A/7B(通用电气医疗生命科技),来自西格玛奥德里奇的AdvancedTM CHO补料分批培养基,且BalanCD是来自Irvine的培养基。
实例5:在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生的α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白
将密度为100万个细胞/ml的10ml非重组CHOExpressTM细胞(ExcellGene SA)培养物与基于转座子的高效基因转移***共转染,所述***包含有包括用于重组AAT的表达盒的质粒载体pXLG6-AAT和包括用于转座酶介导的基因整合的piggyBac转座酶的质粒载体pXLG5。非重组CHOExpressTM细胞可用作高性能生产宿主***以例如使用具有高效混合***的生物反应器大规模制造。用编码目的人AAT的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)转化宿主细胞,其中包含目的核苷酸序列的载体是pXLG6-AAT载体(SEQ ID NO:9),且将转化体(即克隆衍生细胞群体)分离,表达重组AAT蛋白(例如,SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的变体)。通过单细胞克隆和扩增,选择克隆衍生细胞系。在众多其他细胞系中,储存并研究了五种稳定的重组克隆CHO细胞系(XLG AAT#112、XLG AAT#275、XLG AAT#423、XLG AAT#555、XLG AAT#585)用于进一步分析。
在简单的补料分批(FB或F.B.)工艺中,使用化学成分明确的培养基(例如,XLG_E21_7;ExcellGene S.A.)和单次添加饲料A(ExcellGene S.A.)研究了每一个建立的细胞系的细胞生长,并且在这些条件下证明了可接受的细胞生长并保持了高达14天的高细胞存活率水平(数据未显示)。某些细胞系(包括但不限于XLG 112补料分批)的最高细胞密度在或约在第9天达到生长峰值,达到约18-19x106个细胞/ml活细胞密度(VCD)(图6)。到第14天,XLG 112补料分批的细胞密度降至约10x106个细胞/ml。
在五个克隆CHO细胞系即AAT克隆No.112、275、423、555和585)的每一个中在不同培养条件下的AAT生产(图8)证明了:与在第6天的单独的商购化学成分明确的培养基(CDM)(例如,PowerCHOTM 2无血清CDM;Lonza;#BE12-771Q)或XLG培养基(灰色柱,例如,没有XLG饲料的XLG_E21_7CDM;ExcellGene S.A.)的ExcelGene S.A.)相比,培养基(XLG_E21_7CDM,ExcellGene S.A.)与XLG饲料(XLG FB;黑色柱)一起使用在第14天最大。在悬浮培养物中使用涉及0.5x106个细胞/ml的种子密度、14天的生产运行时间、温度转变和在具有某些饲料(ExcellGene S.A.)的补料分批条件下的工艺,比较所有细胞系。第14天在XLG培养基和饲料工艺(FB)中培养的XLG AAT#112CHO细胞系的滴度具有约4.5g/L的AAT滴度。然而,在不含XLG饲料(即,分批工艺)的商购CDM和XLG培养基中在第6天的相同细胞系具有分别为约0.750g/L和1.1g/L的AAT滴度(p<0.05)。通过SDS-PAGE分析来自不同CHO培养物的重组AAT在不同补料分批工艺下的蛋白表达。反复发现XLG AAT#l 12克隆CHO细胞系培养物在各种条件下高度表达AAT。
对在12种不同补料分批工艺中培养的XLG AAT#112克隆CHO细胞系培养物的进一步研究表明,两种特定的补料分批工艺(即,条件1和3)至第17天递送的滴度超过约6g/LAAT(图9)。在条件1和3下的补料分批工艺需要:CDM(XLG_E21_7;ExcellGene S.A.)中的种子密度为0.5x106个细胞/ml,并且在37℃下生长第0-3天、在33℃下生长第3-17天并每隔一天(EOD)或每天(ED)补充饲料7a和7b(HyCloneTM Cell Boost;通用电气医疗生命科技),分别用于条件1和3,如所示。
图9的表格插图是指化学成分明确的培养基饲料7a和7b,以及在补料分批工艺期间执行的温度转变。7a和7b培养基饲料是商购(HyCloneTM Cell Boost 7a增补剂(SH31026.01);HyCloneTM Cell Boost 7b增补剂(SH31027.01);通用电气医疗生命科技),并以占总培养物体积的百分比表示的一定体积提供给生产工艺(EOD:每两天,ED:每天)。给出了生产培养物在第0天(d00)至第3天(d03);第3天至第5天(d05)或第17天(d17);以及第5天至第17天期间的温度,如图所示。从左到右的柱指示天数,即分别为7、11、14和17,此时采集培养物中产物浓度的样本并分析AAT滴度。
在用细胞系XLG AAT#112设计用于优化唾液酸(SA)含量的实验中,在第7天观察到约5.5摩尔唾液酸/摩尔AAT的高唾液酸(SA)含量。相比之下,发现商购血浆衍生AAT(Grifols)具有每摩尔AAT 3.5摩尔的唾液酸。因此,发现XLG AAT#112CHO细胞系能够生产唾液酸含量大于血浆衍生AAT约55%的重组AAT,并且在某些条件下可能大于约80%。细胞在培养基(例如,ExcellGene SA)中生长,并在1x106个细胞/ml的种子密度下开始生产。从生产开始到第3天,温度一直保持在37℃,然后转变到33℃,直至生产结束。HyCloneTM Cell Boost 7a和7b饲料分别以7.1%和0.71%的体积使用,并从第3天开始按照工艺条件#1每隔一天饲喂。同时7a和7b饲料分别以3.6%和0.36%的体积使用,并从第3天开始按照工艺条件#3每天饲喂。
实例6:来自CHO细胞的重组AAT在体外降低弹性蛋白酶活性
为了量化弹性蛋白酶的抑制能力,将重组AAT(recAAT)或血浆衍生AAT(血浆AAT)与胰腺弹性蛋白酶(E7885;西格玛奥德里奇)一起预孵育。然后,用分光光度法确定剩余弹性蛋白酶活性。更详细地说,使用测定缓冲液(0.1M Tris缓冲液,pH 8)将AAT稀释至0.08mg/ml,并将5μl稀释的AAT与5μl弹性蛋白酶(0.26μM)混合,总体积为275μl。在37℃下孵育5分钟后,添加N-琥珀酰基-Ala-Ala-对硝基苯胺底物(S4760,西格玛奥德里奇),并使用M200酶标仪(Tecan)测量405nm处的吸光度3分钟。将仅含有底物和缓冲液的样本用于空白还原,而另一份含有弹性蛋白酶、底物和缓冲液的样本用于确定100%活性或0%抑制。全部样本均分析两次。(图11A)。图11B显示与不含AAT的对照相比,重组AAT和血浆衍生AAT的弹性蛋白酶活性的百分比降低。通过对含有弹性蛋白酶和AAT反应混合物的样本运行用考马斯亮蓝R350染色的7.5%SDS-PAGE,证明了AAT与弹性蛋白酶形成复合物。
实例7:重组AAT在体外降低其他蛋白酶诸如胰蛋白酶的活性。
胰蛋白酶是应用广泛且功能强大的蛋白酶。将使用本文公开的方法描述和获得的来自不同来源的不同浓度的AAT(包括重组AAT及其变体)与荧光肽(Mca-R-P-K-P-V-E-Nval-W-R-K(Dnp)-NH2;SEQ ID NO:17)作为底物一起添加到含胰蛋白酶的缓冲液(0.25μg/ml)中。在5ng/ml的浓度下,通过本文提供的方法描述和获得的重组AAT(ExcellGene)以与血浆衍生AAT(Prolastin)、另一种重组AAT(R&D***)、或从含有约1.2g/L小鼠AAT的样本稀释的小鼠血浆类似的方式显著降低胰蛋白酶活性(图11)。实验进行三次。一些符号附近的水平线表示与平均值的偏差。
实例8:重组AAT减少内毒素-(或脂多糖-)诱导的TNF-α释放
用脂多糖(LPS,1μg/ml)处理贴壁人外周血单核细胞(PBMC)4小时。然后,通过洗涤三(3)次除去LPS,随后加入各种量的重组AAT(0mg/ml至1mg/ml)10小时。使用人TNF-αELISA通过TNF-α特异性免疫测定法分析上清液,所述ELISA被设计成测量细胞培养上清液、血清和血浆中的人TNF-α(R&D***;美国明尼苏达州明尼阿波利斯)。结果示于图12中。两次运行样本显示,在0.5mg/ml至1mg/ml重组AAT时,TNF-α释放量减少1μg/ml脂多糖。
在图13中,外周血单核细胞(PBMC)单独,与脂多糖(LPS)(1pg/ml),或与LPS和重组AAT(1mg/ml)一起孵育10小时。分离mRNA(TNF-a(图13A)和IL-6(图13B)),并进行基因表达分析。使用Micro Kit(QIAGEN)制备总RNA。对于cDNA合成,使用大容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems,赛默飞世尔科技)转录1μg总RNA。在StepOnePlusTM实时PCR***(Applied Biosystems)上,使用基因表达测定(Applied Biosystems,LifeTechnologies)确定选定基因的mRNA水平,与看家基因次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)进行比较。
实例9:AAT处理的皮肤体外分析
将AAT(10mg recAAT)施用于人皮肤模型(CellSystems)的“外层”,并如本文所述孵育数小时(18小时)。随后,通过使用特异性抗体鉴定AAT的蛋白质印迹途径在皮肤层下鉴定AAT。用兔多克隆抗人AAT抗体(1:5000;DAKO;Denmark)染色的未处理皮肤显示对AAT无染色(图13A);而用recAAT(10mg)处理18小时后染色的皮肤表现出AAT染色呈阳性(灰色较暗区域和箭头,图14B)。通过蛋白质印迹法对用重组AAT和血浆AAT处理的培养上清液进行的上清液分析显示AAT表达在3小时、18小时和48小时内增加。(图14C)。图14D显示在皮肤上清液中IL-18,促炎细胞因子和皮肤刺激标记总水平的ELISA(美国R&D***)分析结果。10mg recAAT(浅灰色)和10mg血浆AAT(深灰色;pAAT;)未诱导皮肤刺激。事实上,在6小时,与没有AAT(黑色)的对照相比,recAAT和pAAT均显示出对IL-18释放的抑制作用。
特定实施例
下面描述了非限制性的特定实施例,其中的每一个都被认为在本公开之内。
特定实施例1)一种生产人重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的方法,包括:
a)将包含编码所述人AAT蛋白的核酸片段的表达载体引入宿主细胞;
b)在允许表达所述人重组AAT蛋白的条件下培养所述宿主细胞;以及
c)从所培养的宿主细胞中分离所述人重组AAT蛋白,从而生产所述人重组AAT蛋白。
特定实施例2)根据特定实施例1所述的方法,其中所述核酸片段包括编码人AATCHO细胞密码子优化序列的核酸序列(并且由优化的组成型启动子驱动)。
特定实施例3)根据特定实施例1或特定实施例2所述的方法,其中所述引入步骤包括共转染所述人重组AAT表达载体和编码转座酶的表达载体。
特定实施例4)根据特定实施例3所述的方法,其中所述转座酶是piggyBac转座酶。
特定实施例5)根据特定实施例1至4中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是真核细胞。
特定实施例6)根据特定实施例1至5中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
特定实施例7)根据特定实施例6所述的方法,其中所述CHO细胞系是修饰的CHO细胞系。
特定实施例8)根据特定实施例1至7中任一项所述的方法,其中所述培养步骤在培养基中进行,并且所述培养基包含少于约5%(体积/体积)的动物来源组分。
特定实施例9)根据特定实施例1至8中任一项所述的方法,其中所述培养步骤在培养基中进行,并且所述培养基包含少于约2%(体积/体积)的动物来源组分。
特定实施例10)根据特定实施例1至9中任一项所述的方法,其中所述培养步骤在培养基中进行,并且所述培养基由化学成分明确的组合物组成并且不包含人重组胰岛素或任何其他蛋白。
特定实施例11)根据特定实施例1至10中任一项所述的方法,其中所生产的人重组AAT蛋白的量是约1g/L至约10g/L的人重组AAT蛋白。
特定实施例12)根据特定实施例1至11中任一项所述的方法,其中所生产的人重组AAT蛋白的量是约2g/L至约6g/L的人重组AAT蛋白。
特定实施例13)根据特定实施例1至12中任一项所述的方法,其中所述培养步骤包括:
选择具有表达所述人重组AAT蛋白的所述核酸片段的所述宿主细胞,其中所选定的细胞是表达人重组AAT的克隆衍生细胞。
特定实施例14)根据特定实施例13所述的方法,其中所述选择步骤包括:
a)在培养基中培养表达人重组AAT的所述克隆衍生细胞;
b)用至少一种饲料饲喂表达人重组AAT的所述克隆衍生细胞;
c)将所述培养基保持在细胞培养温度下;
d)降低所述细胞培养温度;以及
e)在降低的所述细胞培养温度下培养所述克隆衍生细胞,其中所述克隆衍生细胞以约1g/L或更大的滴度表达所述人重组AAT蛋白。
特定实施例15)根据特定实施例13至14中任一项所述的方法,其中所述克隆衍生细胞以大于约4g/L的滴度表达人重组AAT蛋白。
特定实施例16)根据特定实施例13至15中任一项所述的方法,其中所述克隆衍生细胞以大于约6g/L的滴度表达人重组AAT蛋白。
特定实施例17)根据特定实施例14至16中任一项所述的方法,其中所述细胞培养温度在约35℃至约38℃的范围内。
特定实施例18)根据特定实施例14至17中任一项所述的方法,其中所述细胞培养温度在第0天至第3天或第0天至第5天保持不变。
特定实施例19)根据特定实施例14至18中任一项的方法,其中所降低的细胞培养温度在约25℃至约34℃的范围内。
特定实施例20)根据特定实施例14至19中任一项的方法,其中所述细胞培养基在从第3天至第17天、第3天至第5天、第5天至第17天或其组合的降低的细胞培养温度下。
特定实施例21)根据特定实施例14至20中任一项所述的方法,其中所述至少一种饲料包括中性饲料。
特定实施例22)根据特定实施例19的方法,其中所述中性饲料的体积在总细胞培养物体积的约1%至约8%的范围内。
特定实施例23)根据特定实施例14至22中任一项的方法,其中所述至少一种进料包括碱性饲料。
特定实施例24)根据特定实施例23的方法,其中所述碱性饲料的体积在总细胞培养物体积的约0.1%至约0.8%的范围内。
特定实施例25)根据特定实施例14至24中任一项的方法,其中所述至少一种饲料包括中性饲料和碱性饲料。
特定实施例26)根据特定实施例25所述的方法,其中所述碱性饲料的量是中性饲料量的十分之一(1/10)。
特定实施例27)根据特定实施例14至26中任一项所述的方法,其中所述饲喂步骤每天进行。
特定实施例28)根据特定实施例14至26中任一项所述的方法,其中所述饲喂步骤每隔一天进行。
特定实施例29)根据特定实施例1至28中任一项所述的方法,其中所述培养步骤包括约550mOsm/kg或更高的所述细胞培养物的渗透压。
特定实施例30)根据特定实施例1至29中任一项所述的方法,其中在第5天或之后所述培养步骤包括约550mOsm/kg或更高的所述细胞培养物的渗透压。
特定实施例31)一种生产人重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的方法,包括:
a)将编码人AAT蛋白的第一核酸序列和编码转座酶的至少一个附加核酸序列引入真核宿主细胞;
b)在允许表达编码人AAT蛋白的所述第一核酸序列的条件下培养所述真核宿主细胞;
c)选择具有表达人AAT蛋白的所述核酸片段的所述真核宿主细胞,其中所选定的细胞是表达人重组AAT蛋白的克隆衍生细胞;以及
d)从所述克隆衍生细胞中分离所述人重组AAT蛋白,从而生产所述人重组AAT蛋白。
特定实施例32)根据特定实施例31所述的方法,其中所述真核宿主细胞用编码人重组AAT蛋白的所述核酸序列转化。
特定实施例33)根据特定实施例31或特定实施例32所述的方法,其中所述分离步骤包括纯化所述人重组AAT蛋白。
特定实施例34)根据特定实施例33所述的方法,其中所述纯化步骤是通过以下至少一种:尺寸排除色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、磁珠分离、选择性沉淀、基于分子量的膜过滤或排除、缓冲液交换、病毒过滤、基于pH的病毒灭活等。
特定实施例35)根据特定实施例1至34中任一项所述的方法,其中所述分离的人重组蛋白具有约95%或更大的纯度。
特定实施例36)根据特定实施例1至35中任一项所述的方法,其中所述分离的人重组蛋白具有约98%或更大的纯度。
特定实施例37)一种表达载体,包括:含有编码人重组AAT蛋白的核苷酸序列的核酸片段,其中所述核酸片段位于多重克隆位点;所述核酸片段上游的内含子;内含子上游的巨细胞病毒(CMV)启动子;所述CMV启动子上游的5'反向末端重复序列(5'ITR);所述核酸片段下游的聚腺苷尾信号序列;所述核酸片段下游的复制起点序列;所述复制起点序列下游的可选择标记序列;以及所述可选择标记序列下游的3'反向末端重复序列(3'ITR)。
特定实施例38)根据特定实施例37所述的表达载体,其中所述可选择标记序列是嘌呤霉素抗性基因。
特定实施例39)根据特定实施例37至38中任一项所述的表达载体,其中所述核酸片段和所述可选择标记序列位于相反的阅读框中并且在5’ITR和3’ITR之间。
特定实施例40)根据特定实施例37至39中任一项所述的表达载体,其中所述核苷酸序列编码以下至少一个的人重组AAT多肽序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
特定实施例41)根据特定实施方式37至40中任一项所述的表达载体,其中编码人重组AAT多肽序列的所述核苷酸序列包括以下至少一个的序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:8。
特定实施例42)根据特定实施例37至41中任一项所述的表达载体,其中所述表达载体包含SEQ ID NO:9。
特定实施例43)一种人重组AAT蛋白,包含与SEQ ID NO:1具有约99%同一性的多肽序列。
特定实施方式44)根据特定实施例43所述的人重组AAT蛋白,包含具有SEQ ID NO:1突变的多肽序列,其中所述突变是:51位(F51L)的苯丙氨酸至亮氨酸突变、351位(M351V)的甲硫氨酸至缬氨酸突变、358位(M358V)的甲硫氨酸至缬氨酸突变或其任何组合。
特定实施例45)根据特定实施例43至44中任一项所述的人重组AAT蛋白,包含在每摩尔AAT约3摩尔唾液酸至每摩尔AAT约12摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
特定实施例46)根据特定实施例45所述的重组AAT蛋白,其中所述唾液酸在每摩尔AAT约4摩尔唾液酸至每摩尔AAT约6摩尔唾液酸的范围内。
特定实施例47)根据特定实施例45至46中任一项所述的重组AAT蛋白,其中所述唾液酸含量超过血浆衍生AAT蛋白的唾液酸含量至少10%。
特定实施例48)一种组合物,包含通过根据特定实施例1至36中任一项所述的方法生产的人重组AAT蛋白和药学上可接受的载体。
特定实施例49)一种组合物,包含根据实施例43至47中任一项所述的人重组AAT蛋白和药学上可接受的载体。
特定实施例50)一种治疗患有α1-抗胰蛋白酶缺乏症的受试者的方法,包括向所述受试者施用有效量的根据实施例43至47中任一项所述的人重组AAT蛋白以改善所述受试者的所述α1-抗胰蛋白酶缺乏症,从而治疗所述受试者。
特定实施例51)一种治疗患有导致蛋白酶诱导的组织损伤的疾病的受试者的方法,包括向所述受试者施用有效量的根据特定实施例43至47中任一项所述的人重组AAT蛋白以改善所述受试者的所述蛋白酶诱导的组织损伤,从而治疗所述受试者。
特定实施例52)根据特定实施例50至51中任一项所述的方法,其中所述人重组AAT蛋白是包含人重组AAT蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
特定实施例53)根据特定实施例50至52中任一项所述的方法,其中所述施用通过选自由以下组成的群组的至少一种途径进行:静脉内、胃肠外、粘膜内、局部、透皮和吸入。
特定实施例54)一种生产人重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的方法,包括:将宿主细胞与编码人AAT蛋白的第一核酸序列和编码转座酶的至少一种第二核酸序列一起培养,其中所述培养步骤在第一温度下在第一时间段和在第二温度下在第二时间段进行,且任选在第三温度下在第三时间段进行。
特定实施例55)根据特定实施例54所述的方法,其中所述第二温度低于所述第一温度。
特定实施例56)根据特定实施例55所述的方法,其中所述第三温度低于所述第二温度。
特定实施例57)根据特定实施例56所述的方法,其中所述第一温度在31℃至约37℃的范围内。
特定实施例58)根据特定实施例57所述的方法,其中所述第二温度在约31℃至约37℃的范围内。
特定实施例59)根据特定实施例58所述的方法,其中所述第三温度在约31℃至约37℃的范围内。
特定实施例60)根据特定实施例59所述的方法,其中所述第一时间段在约1至20天的范围内。
特定实施例61)根据特定实施例60所述的方法,其中所述第二时间段在约1至20天的范围内。
特定实施例62)根据特定实施例61所述的方法,其中所述第三时间段在约1至20天的范围内。
特定实施例63)根据特定实施例62所述的方法,其中所述培养步骤进一步包括添加第一饲料和第二饲料。
特定实施例64)根据特定实施例63所述的方法,其中所述添加步骤每隔一天进行。
特定实施例65)根据特定实施例64所述的方法,其中所述添加步骤每天进行。
特定实施例66)根据特定实施例65所述的方法,其中用于生产的所述培养仅在避免纯氧的情况下用空气充氧。
特定实施例67)一种治疗患有免疫因子过度生产的受试者的方法,包括向所述受试者施用有效量的根据特定实施例43至47中任一项所述的人重组AAT蛋白以减少免疫因子的过度生产,从而治疗所述受试者。
特定实施例68)根据特定实施例67所述的方法,其中所述免疫因子选自TNF、IL-2等或其任何组合。
由于在不脱离本发明的范围和精神的情况下,可以对上述主题进行各种改变,因此上述描述中包含的或所附权利要求中定义的所有主题都应被解释为对本发明的描述和说明。根据上述教导,本发明的许多修改和变化是可能的。因此,本说明书旨在包括落入所附权利要求的范围内的所有这种替换、修改和变化。
序列表
<110> 艾克赛尔吉恩公司
M·J·武尔姆
F·M·武尔姆
S·扬恰乌斯凯因
J·哈马彻
U·斯坦伯格
<120> 生产和使用重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)及其组合物的方法
<130> 178225.10000
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 394
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
<210> 2
<211> 1210
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> 限制酶识别序列(Restriction Enzyme Recognition Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1205)..(1210)
<223> 限制酶识别序列(Restriction Enzyme Recognition Sequence)
<400> 2
actagtcacc gaagatcctc aaggtgacgc cgcccaaaag accgatacct cgcatcatga 60
ccaagaccac ccgaccttta acaagatcac tccaaacctg gccgagttcg cattctccct 120
ctacagacag ctggctcacc agtcaaactc aaccaacatc ttcttctccc ctgtgagcat 180
cgccactgcg ttcgccatgc tttcactggg caccaaagcc gatacgcacg acgagatcct 240
ggaggggctc aactttaacc ttaccgaaat cccggaagcg caaatccacg aaggattcca 300
agaacttctg cgcaccctca atcagccaga ctcgcagttg cagctgacta ccggcaacgg 360
actgtttctc tcggaagggc tgaaactcgt ggacaaattc ctcgaggacg tgaagaagct 420
gtaccattcg gaggcgttta ccgtcaattt cggagatacc gaagaagcta aaaagcaaat 480
caatgactac gtggagaagg gaacccaggg aaagatcgtg gacctcgtca aggaattgga 540
ccgggacacc gtgttcgccc tggtgaatta catcttcttt aaaggaaagt gggaaagacc 600
attcgaggtg aaggatactg aggaagaaga tttccacgtc gatcaggtga ctaccgtgaa 660
ggtccccatg atgaagcgcc tgggcatgtt caacatccag cactgtaaga agctgtcctc 720
gtgggtcctg ctcatgaagt acctgggaaa tgcaactgct attttcttcc tcccggatga 780
gggcaaactg cagcaccttg agaacgagct gactcatgat atcattacga agtttctgga 840
aaatgaggac aggcggagcg ccagcctcca tctcccaaag ctgtccatca cggggacgta 900
tgacctgaag tcagtccttg gacagctggg catcactaag gtgtttagca acggtgctga 960
cttgtccgga gtgactgaag aggcaccgct gaaactgtct aaggcggtcc acaaggccgt 1020
gctcaccatc gacgaaaagg gaactgaggc cgctggagca atgttcttgg aggcgatccc 1080
gatgtcgatc cctcccgaag tgaagttcaa taagccgttc gtgtttctga tgattgagca 1140
aaacactaaa agccctctgt tcatgggtaa agtggtgaac ccgactcaga agtagtgatg 1200
ataagaattc 1210
<210> 3
<211> 418
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(24)
<223> 自然人AAT前导序列(Natural human AAT leader sequence)
<400> 3
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
35 40 45
Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln
50 55 60
Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser
65 70 75 80
Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr
85 90 95
His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro
100 105 110
Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn
115 120 125
Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu
130 135 140
Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys
145 150 155 160
Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
165 170 175
Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys
180 185 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
195 200 205
Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val
210 215 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
225 230 235 240
Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys
245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu
275 280 285
Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp
290 295 300
Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
355 360 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
370 375 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385 390 395 400
Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr
405 410 415
Gln Lys
<210> 4
<211> 1282
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> 限制酶识别位点(Restriction Enzyme Recognition Site)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1277)..(1282)
<223> 限制酶识别位点(Restriction Enzyme Recognition Site)
<400> 4
actagtcacc atgccgagca gcgtgagctg gggcattctg ctgctggcgg gcctgtgctg 60
cctggtgccg gtgagcctgg cggaagatcc tcaaggtgac gccgcccaaa agaccgatac 120
ctcgcatcat gaccaagacc acccgacctt taacaagatc actccaaacc tggccgagtt 180
cgcattctcc ctctacagac agctggctca ccagtcaaac tcaaccaaca tcttcttctc 240
ccctgtgagc atcgccactg cgttcgccat gctttcactg ggcaccaaag ccgatacgca 300
cgacgagatc ctggaggggc tcaactttaa ccttaccgaa atcccggaag cgcaaatcca 360
cgaaggattc caagaacttc tgcgcaccct caatcagcca gactcgcagt tgcagctgac 420
taccggcaac ggactgtttc tctcggaagg gctgaaactc gtggacaaat tcctcgagga 480
cgtgaagaag ctgtaccatt cggaggcgtt taccgtcaat ttcggagata ccgaagaagc 540
taaaaagcaa atcaatgact acgtggagaa gggaacccag ggaaagatcg tggacctcgt 600
caaggaattg gaccgggaca ccgtgttcgc cctggtgaat tacatcttct ttaaaggaaa 660
gtgggaaaga ccattcgagg tgaaggatac tgaggaagaa gatttccacg tcgatcaggt 720
gactaccgtg aaggtcccca tgatgaagcg cctgggcatg ttcaacatcc agcactgtaa 780
gaagctgtcc tcgtgggtcc tgctcatgaa gtacctggga aatgcaactg ctattttctt 840
cctcccggat gagggcaaac tgcagcacct tgagaacgag ctgactcatg atatcattac 900
gaagtttctg gaaaatgagg acaggcggag cgccagcctc catctcccaa agctgtccat 960
cacggggacg tatgacctga agtcagtcct tggacagctg ggcatcacta aggtgtttag 1020
caacggtgct gacttgtccg gagtgactga agaggcaccg ctgaaactgt ctaaggcggt 1080
ccacaaggcc gtgctcacca tcgacgaaaa gggaactgag gccgctggag caatgttctt 1140
ggaggcgatc ccgatgtcga tccctcccga agtgaagttc aataagccgt tcgtgtttct 1200
gatgattgag caaaacacta aaagccctct gttcatgggt aaagtggtga acccgactca 1260
gaagtagtga tgataagaat tc 1282
<210> 5
<211> 413
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<223> 人IgG重链前导序列(Human IgG heavy chain leader sequence)
<400> 5
Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr
20 25 30
Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn
35 40 45
Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser
50 55 60
Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe
65 70 75 80
Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu
85 90 95
Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His
100 105 110
Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln
115 120 125
Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys
130 135 140
Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu
145 150 155 160
Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile
165 170 175
Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val
180 185 190
Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe
195 200 205
Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu
210 215 220
Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met
225 230 235 240
Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser
245 250 255
Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe
260 265 270
Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His
275 280 285
Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser
290 295 300
Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser
305 310 315 320
Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp
325 330 335
Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val
340 345 350
His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly
355 360 365
Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys
370 375 380
Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu Gln Asn Thr Lys Ser
385 390 395 400
Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
405 410
<210> 6
<211> 1267
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> 限制酶识别序列(Restriction Enzyme Recognition Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1262)..(1267)
<223> 限制酶识别序列(Restriction Enzyme Recognition Sequence)
<400> 6
actagtcacc atggaatttt ggctgtcctg ggttttcctc gttgcaatct tgaaaggcgt 60
ccagtgcgaa gatcctcaag gtgacgccgc ccaaaagacc gatacctcgc atcatgacca 120
agaccacccg acctttaaca agatcactcc aaacctggcc gagttcgcat tctccctcta 180
cagacagctg gctcaccagt caaactcaac caacatcttc ttctcccctg tgagcatcgc 240
cactgcgttc gccatgcttt cactgggcac caaagccgat acgcacgacg agatcctgga 300
ggggctcaac tttaacctta ccgaaatccc ggaagcgcaa atccacgaag gattccaaga 360
acttctgcgc accctcaatc agccagactc gcagttgcag ctgactaccg gcaacggact 420
gtttctctcg gaagggctga aactcgtgga caaattcctc gaggacgtga agaagctgta 480
ccattcggag gcgtttaccg tcaatttcgg agataccgaa gaagctaaaa agcaaatcaa 540
tgactacgtg gagaagggaa cccagggaaa gatcgtggac ctcgtcaagg aattggaccg 600
ggacaccgtg ttcgccctgg tgaattacat cttctttaaa ggaaagtggg aaagaccatt 660
cgaggtgaag gatactgagg aagaagattt ccacgtcgat caggtgacta ccgtgaaggt 720
ccccatgatg aagcgcctgg gcatgttcaa catccagcac tgtaagaagc tgtcctcgtg 780
ggtcctgctc atgaagtacc tgggaaatgc aactgctatt ttcttcctcc cggatgaggg 840
caaactgcag caccttgaga acgagctgac tcatgatatc attacgaagt ttctggaaaa 900
tgaggacagg cggagcgcca gcctccatct cccaaagctg tccatcacgg ggacgtatga 960
cctgaagtca gtccttggac agctgggcat cactaaggtg tttagcaacg gtgctgactt 1020
gtccggagtg actgaagagg caccgctgaa actgtctaag gcggtccaca aggccgtgct 1080
caccatcgac gaaaagggaa ctgaggccgc tggagcaatg ttcttggagg cgatcccgat 1140
gtcgatccct cccgaagtga agttcaataa gccgttcgtg tttctgatga ttgagcaaaa 1200
cactaaaagc cctctgttca tgggtaaagt ggtgaacccg actcagaagt agtgatgata 1260
agaattc 1267
<210> 7
<211> 418
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(24)
<223> 黑猩猩AAT前导序列(Chimpanzee AAT leader sequence)
<400> 7
Met Leu Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala
20 25 30
Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn
35 40 45
Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln
50 55 60
Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser
65 70 75 80
Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr
85 90 95
His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro
100 105 110
Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn
115 120 125
Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu
130 135 140
Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys
145 150 155 160
Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu
165 170 175
Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys
180 185 190
Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu
195 200 205
Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val
210 215 220
Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val
225 230 235 240
Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys
245 250 255
Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala
260 265 270
Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu
275 280 285
Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp
290 295 300
Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr
305 310 315 320
Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe
325 330 335
Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys
340 345 350
Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly
355 360 365
Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile
370 375 380
Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Glu
385 390 395 400
Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr
405 410 415
Gln Lys
<210> 8
<211> 1282
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> 限制酶识别序列(Restriction Enzyme Recognition Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1277)..(1282)
<223> 限制酶识别序列(Restriction Enzyme Recognition Sequence)
<400> 8
actagtcacc atgctgagca gcgtgagctg gggcattctg ctgctggcgg gcctgtgctg 60
cctggtgccg gtgagcctgg cggaagatcc tcaaggtgac gccgcccaaa agaccgatac 120
ctcgcatcat gaccaagacc acccgacctt taacaagatc actccaaacc tggccgagtt 180
cgcattctcc ctctacagac agctggctca ccagtcaaac tcaaccaaca tcttcttctc 240
ccctgtgagc atcgccactg cgttcgccat gctttcactg ggcaccaaag ccgatacgca 300
cgacgagatc ctggaggggc tcaactttaa ccttaccgaa atcccggaag cgcaaatcca 360
cgaaggattc caagaacttc tgcgcaccct caatcagcca gactcgcagt tgcagctgac 420
taccggcaac ggactgtttc tctcggaagg gctgaaactc gtggacaaat tcctcgagga 480
cgtgaagaag ctgtaccatt cggaggcgtt taccgtcaat ttcggagata ccgaagaagc 540
taaaaagcaa atcaatgact acgtggagaa gggaacccag ggaaagatcg tggacctcgt 600
caaggaattg gaccgggaca ccgtgttcgc cctggtgaat tacatcttct ttaaaggaaa 660
gtgggaaaga ccattcgagg tgaaggatac tgaggaagaa gatttccacg tcgatcaggt 720
gactaccgtg aaggtcccca tgatgaagcg cctgggcatg ttcaacatcc agcactgtaa 780
gaagctgtcc tcgtgggtcc tgctcatgaa gtacctggga aatgcaactg ctattttctt 840
cctcccggat gagggcaaac tgcagcacct tgagaacgag ctgactcatg atatcattac 900
gaagtttctg gaaaatgagg acaggcggag cgccagcctc catctcccaa agctgtccat 960
cacggggacg tatgacctga agtcagtcct tggacagctg ggcatcacta aggtgtttag 1020
caacggtgct gacttgtccg gagtgactga agaggcaccg ctgaaactgt ctaaggcggt 1080
ccacaaggcc gtgctcacca tcgacgaaaa gggaactgag gccgctggag caatgttctt 1140
ggaggcgatc ccgatgtcga tccctcccga agtgaagttc aataagccgt tcgtgtttct 1200
gatgattgag caaaacacta aaagccctct gttcatgggt aaagtggtga acccgactca 1260
gaagtagtga tgataagaat tc 1282
<210> 9
<211> 6504
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (1948)..(1953)
<223> 限制酶识别序列(Restriction Enzyme Recognition Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (2015)..(3196)
<223> CHO细胞密码子优化的AAT蛋白序列(CHO-cell codon-optimized AAT proteinsequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (3209)..(3214)
<223> 限制酶识别序列(Restriction Enzyme Recognition Sequence)
<400> 9
ggcgcgcctt aaccctagaa agatagtctg cgtaaaattg acgcatgcat tcttgaaata 60
ttgctctctc tttctaaata gcgcgaatcc gtcgctgtgc atttaggaca tctcagtcgc 120
cgcttggagc tcccgtgagg cgtgcttgtc aatgcggtaa gtgtcactga ttttgaacta 180
taacgaccgc gtgagtcaaa atgacgcatg attatctttt acgtgacttt taagatttaa 240
ctcatacgat aattatattg ttatttcatg ttctacttac gtgataactt attatatata 300
tattttcttg ttatagatat catcgataac aggaaagttc cattggagcc aagtacattg 360
agtcaatagg gactttccaa tgggttttgc ccagtacata aggtcaatgg gaggtaagcc 420
aatgggtttt tcccattact ggcacgtata ctgagtcatt agggactttc caatgggttt 480
tgcccagtac ataaggtcaa taggggtgaa tcaacaggaa agttccattg gagccaagta 540
cactgagtca atagggactt tccattgggt tttgcccagt acaaaaggtc aatagggggt 600
gagtcaatgg gtttttccca ttattggcac gtacataagg tcaatagggg tgagtcattg 660
ggtttttcca gccaatttaa ttaaaacgcc atgtactttc ccaccattga cgtcaatggg 720
ctattgaaac taatgcaacg tgacctttaa acggtacttt cccatagctg attaatggga 780
aagtaccgtt ctcgagccaa tacacgtcaa tgggaagtga aagggcagcc aaaacgtaac 840
accgccccgg ttttcccctg gaaattccat attggcacgc attctattgg ctgagctgcg 900
ttctacgtgg gtataagagg cgcgaccagc gtcggtaccg tcgcagtctt cggtctgacc 960
accgtagaac gcagagctcc tcgctgcagg caagcttggt aagtgccgtg tgtggttccc 1020
gcgggcctgg cctctttacg ggttatggcc cttgcgtgcc ttgaattact tccacgcccc 1080
tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg 1140
aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc 1200
tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag 1260
tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt 1320
cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc 1380
gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca 1440
ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg 1500
ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga 1560
gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc 1620
tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc 1680
gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg 1740
agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc 1800
cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg 1860
gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa 1920
agtttttttc ttccatttca gggatccact agtcaccatg gaattttggc tgtcctgggt 1980
tttcctcgtt gcaatcttga aaggcgtcca gtgcgaagat cctcaaggtg acgccgccca 2040
aaagaccgat acctcgcatc atgaccaaga ccacccgacc tttaacaaga tcactccaaa 2100
cctggccgag ttcgcattct ccctctacag acagctggct caccagtcaa actcaaccaa 2160
catcttcttc tcccctgtga gcatcgccac tgcgttcgcc atgctttcac tgggcaccaa 2220
agccgatacg cacgacgaga tcctggaggg gctcaacttt aaccttaccg aaatcccgga 2280
agcgcaaatc cacgaaggat tccaagaact tctgcgcacc ctcaatcagc cagactcgca 2340
gttgcagctg actaccggca acggactgtt tctctcggaa gggctgaaac tcgtggacaa 2400
attcctcgag gacgtgaaga agctgtacca ttcggaggcg tttaccgtca atttcggaga 2460
taccgaagaa gctaaaaagc aaatcaatga ctacgtggag aagggaaccc agggaaagat 2520
cgtggacctc gtcaaggaat tggaccggga caccgtgttc gccctggtga attacatctt 2580
ctttaaagga aagtgggaaa gaccattcga ggtgaaggat actgaggaag aagatttcca 2640
cgtcgatcag gtgactaccg tgaaggtccc catgatgaag cgcctgggca tgttcaacat 2700
ccagcactgt aagaagctgt cctcgtgggt cctgctcatg aagtacctgg gaaatgcaac 2760
tgctattttc ttcctcccgg atgagggcaa actgcagcac cttgagaacg agctgactca 2820
tgatatcatt acgaagtttc tggaaaatga ggacaggcgg agcgccagcc tccatctccc 2880
aaagctgtcc atcacgggga cgtatgacct gaagtcagtc cttggacagc tgggcatcac 2940
taaggtgttt agcaacggtg ctgacttgtc cggagtgact gaagaggcac cgctgaaact 3000
gtctaaggcg gtccacaagg ccgtgctcac catcgacgaa aagggaactg aggccgctgg 3060
agcaatgttc ttggaggcga tcccgatgtc gatccctccc gaagtgaagt tcaataagcc 3120
gttcgtgttt ctgatgattg agcaaaacac taaaagccct ctgttcatgg gtaaagtggt 3180
gaacccgact cagaagtagt gatgataaga attctgcaga tatccatcac actggcggcc 3240
gctcgagcat gcatctagag ggccctattc tatagtgtca cctaaatgct agagctcgct 3300
gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc 3360
cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg 3420
catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca 3480
agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatggctt 3540
ctgaggcgga aagaaccagt ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca 3600
ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg 3660
ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt 3720
cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc 3780
ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct 3840
tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc 3900
gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta 3960
tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca 4020
gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag 4080
tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag 4140
ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt 4200
agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa 4260
gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg 4320
attttggtca taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca 4380
caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca 4440
tcaatgtatc ttatcatgtc tggatccgct tcaggcaccg ggcttgcggg tcatgcacca 4500
ggtgcgcggt ccttcgggca cctcgacgtc ggcggtgacg gtgaagccga gccgctcgta 4560
gaaggggagg ttgcggggcg cggaggtctc caggaaggcg ggcaccccgg cgcgctcggc 4620
cgcctccact ccggggagca cgacggcgct gcccagaccc ttgccctggt ggtcgggcga 4680
gacgccgacg gtggccagga accacgcggg ctccttgggc cggtgcggcg ccaggaggcc 4740
ttccatctgt tgctgcgcgg ccagcctgga accgctcaac tcggccatgc gcgggccgat 4800
ctcggcgaac accgcccccg cttcgacgct ctccggcgtg gtccagaccg ccaccgcggc 4860
gccgtcgtcc gcgacccaca ccttgccgat gtcgagcccg acgcgcgtga ggaagagttc 4920
ttgcagctcg gtgacccgct cgatgtggcg gtccgggtcg acggtgtggc gcgtggcggg 4980
gtagtcggcg aacgcggcgg cgagggtgcg tacggcccgg gggacgtcgt cgcgggtggc 5040
gaggcgcacc gtgggcttgt actcggtcat ggtggcctgc agagtcgctc tgtgttcgag 5100
gccacacgcg tcaccttaat atgcgaagtg gacctgggac cgcgccgccc cgactgcatc 5160
tgcgtgtttt cgccaatgac aagacgctgg gcggggtttg tgtcatcata gaactaaaga 5220
catgcaaata tatttcttcc ggggacaccg ccagcaaacg cgagcaacgg gccacgggga 5280
tgaagcagct ggctagctaa aagttttgtt actttataga agaaattttg agtttttgtt 5340
tttttttaat aaataaataa acataaataa attgtttgtt gaatttatta ttagtatgta 5400
agtgtaaata taataaaact taatatctat tcaaattaat aaataaacct cgatatacag 5460
accgataaaa cacatgcgtc aattttacgc atgattatct ttaacgtacg tcacaatatg 5520
attatctttc tagggttaat tcgaacagct ggttctttcc gcctcaggac tcttcctttt 5580
tcaataaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 5640
tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 5700
ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 5760
taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 5820
gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 5880
gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 5940
ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 6000
aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 6060
gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 6120
cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 6180
actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 6240
caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 6300
gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 6360
ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 6420
caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 6480
tactcatact cttccttttt caat 6504
<210> 10
<211> 594
<212> PRT
<213> Trichoplusia ni
<400> 10
Met Gly Ser Ser Leu Asp Asp Glu His Ile Leu Ser Ala Leu Leu Gln
1 5 10 15
Ser Asp Asp Glu Leu Val Gly Glu Asp Ser Asp Ser Glu Ile Ser Asp
20 25 30
His Val Ser Glu Asp Asp Val Gln Ser Asp Thr Glu Glu Ala Phe Ile
35 40 45
Asp Glu Val His Glu Val Gln Pro Thr Ser Ser Gly Ser Glu Ile Leu
50 55 60
Asp Glu Gln Asn Val Ile Glu Gln Pro Gly Ser Ser Leu Ala Ser Asn
65 70 75 80
Arg Ile Leu Thr Leu Pro Gln Arg Thr Ile Arg Gly Lys Asn Lys His
85 90 95
Cys Trp Ser Thr Ser Lys Ser Thr Arg Arg Ser Arg Val Ser Ala Leu
100 105 110
Asn Ile Val Arg Ser Gln Arg Gly Pro Thr Arg Met Cys Arg Asn Ile
115 120 125
Tyr Asp Pro Leu Leu Cys Phe Lys Leu Phe Phe Thr Asp Glu Ile Ile
130 135 140
Ser Glu Ile Val Lys Trp Thr Asn Ala Glu Ile Ser Leu Lys Arg Arg
145 150 155 160
Glu Ser Met Thr Gly Ala Thr Phe Arg Asp Thr Asn Glu Asp Glu Ile
165 170 175
Tyr Ala Phe Phe Gly Ile Leu Val Met Thr Ala Val Arg Lys Asp Asn
180 185 190
His Met Ser Thr Asp Asp Leu Phe Asp Arg Ser Leu Ser Met Val Tyr
195 200 205
Val Ser Val Met Ser Arg Asp Arg Phe Asp Phe Leu Ile Arg Cys Leu
210 215 220
Arg Met Asp Asp Lys Ser Ile Arg Pro Thr Leu Arg Glu Asn Asp Val
225 230 235 240
Phe Thr Pro Val Arg Lys Ile Trp Asp Leu Phe Ile His Gln Cys Ile
245 250 255
Gln Asn Tyr Thr Pro Gly Ala His Leu Thr Ile Asp Glu Gln Leu Leu
260 265 270
Gly Phe Arg Gly Arg Cys Pro Phe Arg Met Tyr Ile Pro Asn Lys Pro
275 280 285
Ser Lys Tyr Gly Ile Lys Ile Leu Met Met Cys Asp Ser Gly Thr Lys
290 295 300
Tyr Met Ile Asn Gly Met Pro Tyr Leu Gly Arg Gly Thr Gln Thr Asn
305 310 315 320
Gly Val Pro Leu Gly Glu Tyr Tyr Val Lys Glu Leu Ser Lys Pro Val
325 330 335
His Gly Ser Cys Arg Asn Ile Thr Cys Asp Asn Trp Phe Thr Ser Ile
340 345 350
Pro Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gln Glu Pro Tyr Lys Leu Thr Ile Val
355 360 365
Gly Thr Val Arg Ser Asn Lys Arg Glu Ile Pro Glu Val Leu Lys Asn
370 375 380
Ser Arg Ser Arg Pro Val Gly Thr Ser Met Phe Cys Phe Asp Gly Pro
385 390 395 400
Leu Thr Leu Val Ser Tyr Lys Pro Lys Pro Ala Lys Met Val Tyr Leu
405 410 415
Leu Ser Ser Cys Asp Glu Asp Ala Ser Ile Asn Glu Ser Thr Gly Lys
420 425 430
Pro Gln Met Val Met Tyr Tyr Asn Gln Thr Lys Gly Gly Val Asp Thr
435 440 445
Leu Asp Gln Met Cys Ser Val Met Thr Cys Ser Arg Lys Thr Asn Arg
450 455 460
Trp Pro Met Ala Leu Leu Tyr Gly Met Ile Asn Ile Ala Cys Ile Asn
465 470 475 480
Ser Phe Ile Ile Tyr Ser His Asn Val Ser Ser Lys Gly Glu Lys Val
485 490 495
Gln Ser Arg Lys Lys Phe Met Arg Asn Leu Tyr Met Ser Leu Thr Ser
500 505 510
Ser Phe Met Arg Lys Arg Leu Glu Ala Pro Thr Leu Lys Arg Tyr Leu
515 520 525
Arg Asp Asn Ile Ser Asn Ile Leu Pro Asn Glu Val Pro Gly Thr Ser
530 535 540
Asp Asp Ser Thr Glu Glu Pro Val Met Lys Lys Arg Thr Tyr Cys Thr
545 550 555 560
Tyr Cys Pro Ser Lys Ile Arg Arg Lys Ala Asn Ala Ser Cys Lys Lys
565 570 575
Cys Lys Lys Val Ile Cys Arg Glu His Asn Ile Asp Met Cys Gln Ser
580 585 590
Cys Phe
<210> 11
<211> 24
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(24)
<223> 智人&长臂猿属天然AAT前导序列(H. sapiens & Hylobates sp. natural AATleader sequence)
<400> 11
Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala
20
<210> 12
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<223> 智人IgG重链前导序列(H. sapiens IgG Heavy chain leader sequence)
<400> 12
Met Glu Phe Trp Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 13
<211> 24
<212> PRT
<213> Pan troglodytes
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(24)
<223> 潘穴居人(黑猩猩)AAT前导序列(Pan troglodytes (Chimpanzee) AAT leadersequence)
<400> 13
Met Leu Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys
1 5 10 15
Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala
20
<210> 14
<211> 18
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(18)
<223> 智人血清白蛋白前导序列(H. sapiens serum albumin leader sequence)
<400> 14
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser
<210> 15
<211> 19
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(19)
<223> 智人天青杀素前导序列(H. sapiens Azurocidin leader sequence)
<400> 15
Met Thr Arg Leu Thr Val Leu Ala Leu Leu Ala Gly Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
Ser Arg Ala
<210> 16
<211> 22
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(22)
<223> 智人Ig κ轻链前导序列(H. sapiens Ig kappa Light chain leadersequence)
<400> 16
Met Glu Thr Pro Ala Gln Leu Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Leu Pro
1 5 10 15
Val Ser Asp Thr Thr Gly
20
<210> 17
<211> 20
<212> PRT
<213> Mus musculus
<220>
<221> SIGNAL
<222> (1)..(20)
<223> 小鼠和仓鼠Ig κ轻链(Mouse and Hamster Ig kappa Light chain)
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly
20
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Synthetic
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> 在残基位置1之前附接的(7-甲氧基香豆素-4-基)乙酰基(Mca)((7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl (Mca) attached before residue position 1)
<220>
<221> MOD_RES
<222> (6)..(6)
<223> Xaa = 正缬氨酸(Nva)(Norvaline (Nva))
<220>
<221> UNSURE
<222> (9)..(9)
<223> 在残基位置9之后附接的2,4-二硝基苯基(Dnp)(2,4-Dinitrophenyl (Dnp)attached after residue position 9)
<220>
<221> UNSURE
<222> (6)..(6)
<223> The 'Xaa' at location 6 stands for Gln, Arg, Pro, or Leu.
<400> 18
Arg Pro Lys Val Glu Xaa Trp Arg Lys
1 5
Claims (68)
1.一种生产人重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的方法,包括:
a)将包含编码所述人AAT蛋白的核酸片段的表达载体引入宿主细胞;
b)在允许表达所述人重组AAT蛋白的条件下培养所述宿主细胞;以及
c)从所培养的宿主细胞中分离所述人重组AAT蛋白,从而生产所述人重组AAT蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述核酸片段包括编码人AAT CHO细胞密码子优化序列的核酸序列(并且由优化的组成型启动子驱动)。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法,其中所述引入步骤包括共转染所述人重组AAT表达载体和编码转座酶的表达载体。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述转座酶是piggyBac转座酶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是真核细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述CHO细胞系是修饰的CHO细胞系。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述培养步骤在培养基中进行,并且所述培养基含有少于约5%(体积/体积)的动物来源组分。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述培养步骤在培养基中进行,并且所述培养基含有少于约2%(体积/体积)的动物来源组分。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述培养步骤在培养基中进行,并且所述培养基由化学成分明确的组合物组成并且不含人重组胰岛素或任何其他蛋白。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所生产的人重组AAT蛋白的量是约1g/L至约10g/L的人重组AAT蛋白。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所生产的人重组AAT蛋白的量是约2g/L至约6g/L的人重组AAT蛋白。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述培养步骤包括:
选择具有表达所述人重组AAT蛋白的所述核酸片段的所述宿主细胞,其中所选定的细胞是表达人重组AAT的克隆衍生细胞。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述选择步骤包括:
a)在培养基中培养表达人重组AAT的所述克隆衍生细胞;
b)用至少一种饲料饲喂表达人重组AAT的所述克隆衍生细胞;
c)将所述培养基保持在细胞培养温度下;
d)降低所述细胞培养温度;以及
e)在降低的所述细胞培养温度下培养所述克隆衍生细胞,其中所述克隆衍生细胞以约1g/L或更大的滴度表达所述人重组AAT蛋白。
15.根据权利要求13至14中任一项所述的方法,其中所述克隆衍生细胞以大于约4g/L的滴度表达人重组AAT蛋白。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法,其中所述克隆衍生细胞以大于约6g/L的滴度表达人重组AAT蛋白。
17.根据权利要求14至16中任一项所述的方法,其中所述细胞培养温度在约35℃至约38℃的范围内。
18.根据权利要求14至17中任一项所述的方法,其中所述细胞培养温度在第0天至第3天或第0天至第5天保持不变。
19.根据权利要求14至18中任一项所述的方法,其中所述降低的细胞培养温度在约25℃至约34℃的范围内。
20.根据权利要求14至19中任一项所述的方法,其中所述细胞培养基从第3天至第17天、第3天至第5天、第5天至第17天或其组合在降低的细胞培养温度下。
21.根据权利要求14至20中任一项所述的方法,其中所述至少一种饲料包括中性饲料。
22.根据权利要求19所述的方法,其中所述中性饲料的体积在总细胞培养物体积的约1%至约8%的范围内。
23.根据权利要求14至22中任一项所述的方法,其中所述至少一种饲料包括碱性饲料。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述碱性饲料的体积在总细胞培养物体积的约0.1%至约0.8%的范围内。
25.根据权利要求14至24中任一项所述的方法,其中所述至少一种饲料包括中性饲料和碱性饲料。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述碱性饲料的量是中性饲料量的十分之一(1/10)。
27.根据权利要求14至26中任一项所述的方法,其中所述饲喂步骤每天进行。
28.根据权利要求14至26中任一项所述的方法,其中所述饲喂步骤每隔一天进行。
29.根据权利要求1至28中任一项所述的方法,其中所述培养步骤包括约550mOsm/kg或更大的细胞培养物的渗透压。
30.根据权利要求1至29中任一项所述的方法,其中在第5天或之后所述培养步骤包括约550mOsm/kg或更大的细胞培养物的渗透压。
31.一种生产人重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的方法,包括:
a)将编码人AAT蛋白的第一核酸序列和编码转座酶的至少一个附加核酸序列引入真核宿主细胞;
b)在允许表达编码人AAT蛋白的所述第一核酸序列的条件下培养所述真核宿主细胞;
c)选择具有表达人AAT蛋白的所述核酸片段的所述真核宿主细胞,其中所选定的细胞是表达人重组AAT蛋白的克隆衍生细胞;以及
d)从所述克隆衍生细胞中分离所述人重组AAT蛋白,从而生产所述人重组AAT蛋白。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述真核宿主细胞用编码人重组AAT蛋白的所述核酸序列转化。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法,其中所述分离步骤包括纯化所述人重组AAT蛋白。
34.根据权利要求33所述的方法,其中所述纯化步骤是通过以下至少一种:尺寸排除色谱法、亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、反相色谱法、凝胶过滤、磁珠分离、选择性沉淀、基于分子量的膜过滤或排除、缓冲液交换、病毒过滤、基于pH的病毒灭活等。
35.根据权利要求1至34中任一项所述的方法,其中所分离的人重组蛋白具有约95%或更大的纯度。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的方法,其中所分离的人重组蛋白具有约98%或更大的纯度。
37.一种表达载体,包括:含有编码人重组AAT蛋白的核苷酸序列的核酸片段,其中所述核酸片段位于多重克隆位点;所述核酸片段上游的内含子;内含子上游的巨细胞病毒(CMV)启动子;所述CMV启动子上游的5'反向末端重复序列(5'ITR);所述核酸片段下游的聚腺苷尾信号序列;所述核酸片段下游的复制起点序列;所述复制起点序列下游的可选择标记序列;以及所述可选择标记序列下游的3'反向末端重复序列(3'ITR)。
38.根据权利要求37所述的表达载体,其中所述可选择标记序列是嘌呤霉素抗性基因。
39.根据权利要求37至38中任一项所述的表达载体,其中所述核酸片段和所述可选择标记序列位于相反的阅读框中并且在所述5’ITR和所述3’ITR之间。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的表达载体,其中所述核苷酸序列编码以下至少一个的人重组AAT多肽序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。
41.根据权利要求37至40中任一项所述的表达载体,其中编码人重组AAT多肽序列的所述核苷酸序列包括以下至少一个的序列:SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQID NO:8。
42.根据权利要求37至41中任一项所述的表达载体,其中所述表达载体包含SEQ IDNO:9。
43.一种人重组AAT蛋白,包含与SEQ ID NO:1具有约99%同一性的多肽序列。
44.根据权利要求43所述的人重组AAT蛋白,包含具有SEQ ID NO:1突变的多肽序列,其中所述突变是:51位(F51L)的苯丙氨酸至亮氨酸突变、351位(M351V)的甲硫氨酸至缬氨酸突变、358位(M358V)的甲硫氨酸至缬氨酸突变或其任何组合。
45.根据权利要求43至44中任一项所述的人重组AAT蛋白,包含在每摩尔AAT约3摩尔唾液酸至每摩尔AAT约12摩尔唾液酸范围内的唾液酸含量。
46.根据权利要求45所述的重组AAT蛋白,其中所述唾液酸在每摩尔AAT约4摩尔唾液酸至每摩尔AAT约6摩尔唾液酸的范围内。
47.根据权利要求45至46中任一项所述的重组AAT蛋白,其中所述唾液酸含量超过血浆衍生AAT蛋白的唾液酸含量至少10%。
48.一种组合物,包含通过根据权利要求1至36中任一项所述的方法生产的人重组AAT蛋白和药学上可接受的载体。
49.一种组合物,包含根据权利要求43至47中任一项所述的人重组AAT蛋白和药学上可接受的载体。
50.一种治疗患有α1-抗胰蛋白酶缺乏症的受试者的方法,包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求43至47中任一项所述的人重组AAT蛋白以改善所述受试者的所述α1-抗胰蛋白酶缺乏症,从而治疗所述受试者。
51.一种治疗患有导致蛋白酶诱导的组织损伤的疾病的受试者的方法,包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求43至47中任一项所述的人重组AAT蛋白以改善所述受试者的所述蛋白酶诱导的组织损伤,从而治疗所述受试者。
52.根据权利要求50至51中任一项所述的方法,其中所述人重组AAT蛋白是包含人重组AAT蛋白和药学上可接受的载体的药物组合物。
53.根据权利要求50至52中任一项所述的方法,其中所述施用通过选自由以下组成的群组的至少一种途径进行:静脉内、胃肠外、粘膜内、局部、透皮和吸入。
54.一种生产人重组α1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白的方法,包括:将宿主细胞与编码人AAT蛋白的第一核酸序列和编码转座酶的至少一种第二核酸序列一起培养,其中所述培养步骤在第一温度下在第一时间段和在第二温度下在第二时间段进行,并且任选在第三温度下在第三时间段进行。
55.根据权利要求54所述的方法,其中所述第二温度低于所述第一温度。
56.根据权利要求55所述的方法,其中所述第三温度低于所述第二温度。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述第一温度在约31℃至约37℃的范围内。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述第二温度在约31℃至约37℃的范围内。
59.根据权利要求58所述的方法,其中所述第三温度在约31℃至约37℃的范围内。
60.根据权利要求59所述的方法,其中所述第一时间段在约1至20天的范围内。
61.根据权利要求60所述的方法,其中所述第二时间段在约1至20天的范围内。
62.根据权利要求61所述的方法,其中所述第三时间段在约1至20天的范围内。
63.根据权利要求62所述的方法,其中所述培养步骤进一步包括添加第一饲料和第二饲料。
64.根据权利要求63所述的方法,其中所述添加步骤每隔一天进行。
65.根据权利要求64所述的方法,其中所述添加步骤每天进行。
66.根据权利要求65所述的方法,其中用于生产的所述培养仅在避免纯氧的情况下用空气充氧。
67.一种治疗患有免疫因子过度生产的受试者的方法,包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求43至47中任一项所述的人重组AAT蛋白以减少免疫因子的过度生产,从而治疗所述受试者。
68.根据权利要求67所述的方法,其中所述免疫因子选自TNF、IL-2等或其任何组合。
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