JPS6262291B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、抗原又は抗体の定量法に関する。さ
らに詳しくは、本発明は、抗原―抗体反応混合物
に光を照射して、その透過率又は散乱率の変化を
測定して抗原又は抗体を定量する方法に関する。 近年、医療分野においては、病気の診断のため
に、抗原及び抗体を高い信頼性をもつて簡易迅速
に定量することが、極めて重要な課題となつてい
る。本発明はかかる課題の解決を目的とするもの
である。 放射化免疫分析（ラジオイムノアツセイ）、酵
素免疫分析等の従来の免疫化学的測定法は、夾雑
物、細胞、不溶性沈澱等を除いた蛋白溶液につい
て行われる。すなわち、血液が被検液の場合に
は、血球を分離した血漿又は血清について、脳脊
髄液が被検液の場合には、夾雑物を除いた遠心上
清について、免疫化学的測定が行われる。このよ
うに、従来法に於て被検液中から測定に悪影響を
与える物質を予め除去するのは、測定精度を上げ
るためであるが、このような被検液の前処理は、
煩雑で長時間を要するとともに、多量の被検液を
要することになつて、小児科領域への免疫化学的
測定の適用を困難なものにしている。さらに、被
検液が血液の場合には、多量の血液をとり、これ
を遠心後、上清をピペツトでとり、凝血を捨てる
というような操作が必要となるので、このような
操作を行う者は、HB抗原により汚染される危険
にさらされることになる。また、上記した免疫化
学測定は、通常終末法で行われるために、測定に
長時間を要するという欠点を有する。 従つて、血液、脳脊髄液等の被検液中の微量抗
原又は抗体を安全かつ簡易迅速に測定する方法の
開発が望まれる。 本発明はこのような要望にこたえるものであつ
て、その要旨とするところは、微細粒径の不溶性
担体に抗体又は抗原を支持させ、これと抗原及
び／又は抗体或いはそれらの混合物とを反応させ
て、この反応混合物に光を照射することにより、
抗原又は抗体を定量する方法に於て、試料液（た
だし、尿を除く。）中の抗原又は抗体を該試料液
の実質的に全ての構成成分の存在下に抗原―抗体
反応に供することを特徴とする抗原又は抗体の定
量法である。 本発明の抗原又は抗体の定量体は、抗原―抗体
反応混合物に光を照射して、該反応混合物の吸光
度、吸光率又は散乱光の強度を測定することを基
礎にしている。即ち、本発明の抗原又は抗体の定
量法に於ては、平均粒径が1.6ミクロン以下の不
溶性担体粒子に抗体又は抗原を支持させ、この支
持された抗体及び／又は抗原に抗原又は抗体或い
はその混合物を液体媒体中で反応させ、この反応
混合物に波長が0.4〜2.4ミクロンの範囲から選ば
れる光（単色光及び多色光を含む。）を反応開始
以後１以上の時点において照射し、該反応混合物
の吸光度、吸光率又は散乱光の強度を測定するこ
とによつて達成される。 本発明方法においては、被検液中の特定の抗原
又は抗体或いはその混合物（反応生成物も含む）
の濃度変化と該反応混合物の吸光度、吸光率又は
散乱光の強度との間に一定の対応関係が成立する
ような領域の波長の光線、担体の平均粒径を選ぶ
ことが重要である。 本発明で用いる不溶性担体粒子としては、本発
明の測定を行う時に用いられる液体媒体に実質的
に不溶性で前記平均粒径を有する有機高分子物質
の微粒子、例えばポリスチレン、スチレン―ブタ
ジエン共重合体の如き乳化重合により得られる有
機高分子のラテツクス、個々に分散されたブドウ
球菌、連鎖球菌の如き球菌型の細菌や霊菌又はリ
ケツチアあるいは細胞膜片等、或いは例えばシリ
カ、シリカ―アルミナ、アルミナの如き無機酸化
物、その他鉱物粉末、金属等が用いられる。 本発明においては、かかる不溶性担体粒子（例
えばラテツクス粒子）に、定量しようとする被検
体中の抗原及び／又は抗体と反応し得る抗体又は
抗原を担体させる（感作する）。この場合、担体
に対して抗体又は抗原を物理的に吸着させてもよ
いし、及び／又は化学的に結合させてもよい。抗
体は蛋白質で構成されており、一方抗原は例えば
蛋白質、ポリプペチド、ステロイド、多糖類、脂
質、花粉、ダスト等種々のものから成る。不溶性
担体粒子に、かかる抗体又は抗原、殊に抗体を担
持させる方法は既に多くの方法が提案されてい
る。不溶性担体に例えば殊にハプテンの如き不完
全抗原を担持させる場合は、該担体を例えばカツ
プリング剤により化学的に変性して、該抗原を化
学的に結合させるのが有利である。 本発明においては、感作担体粒子と抗原及び／
又は抗体を含有する被検体とを非静置条件下で反
応させる。このために、これら両者を、撹拌又は
振盪下に反応させるのが有利である。 本発明における抗体―抗原反応は液体媒体中、
好ましくは水又は水と水混和性有機溶媒（たとえ
ば、メタノール、エタノール、アセトン等）との
混合物中で行われる。 本発明における抗原―抗体反応の実施態様とし
ては、特定の抗体又は抗原を支持させた抗体粒子
の懸濁液に、抗原又は抗体を含有する被検液を反
応させる方法並びに定量すべき抗体又は抗原を含
有する被検液に先ず抗原又は抗体を加えて反応さ
せ、次いでこの反応混合物に特定の抗原又は抗体
を支持させた不溶性担体粒子の懸濁液を加えて反
応させる方法があげられる。 本発明方法では、反応開始以後１以上の時点に
おいて特定の波長の光を照射し、抗原―抗体反応
の混合物の吸光度、吸光率又は散乱光の強度を測
定するが、具体的な方法として下記のものがあげ
られる。 (A) 一定の抗原及び／又は抗体を一定量含有する
標準試料を用いて、これを種々の倍率で稀釈し
た種々の稀釈標準試料を用意し、本発明に従つ
てこれを一定量の特定の抗体又は抗原を感作し
た不溶性担体粒子と一定条件下たとえば室温で
反応時間数分〜２時間で反応させ、この反応混
合物の吸光度、吸光率又は散乱光の強度を測定
して、特定の抗原及び／又は抗体と感作担体粒
子とについて、該抗原又は抗体の量（濃度）と
吸光度、吸光率又は散乱光の強度との関係を示
す標準曲線Ａを作成しておき、つぎに、この標
準曲線Ａの作成に用いたと同一の感作担体粒子
を用いて、その作成の場合と実質的に同一条件
下で未知試料と該感作担体とを反応させ、その
吸光度、吸光率又は散乱光の強度を測定し、こ
の吸光度、吸光率又は散乱光の強度を前記標準
曲線Ａと比較、照合することにより該未知試料
中の抗原及び／又は抗体の量（又は濃度）を定
量することができる。 (B) 一定の吸光度、吸光率又は散乱光の強度に達
するに要する反応時間（たとえば室温で数秒な
いし10分）と使用した標準試料中の抗原又は抗
体の量（濃度）との関係を示す標準曲線Ｂを作
成しておき、これと実質的に同一条件下で、前
記感作担体粒子と未知試料とを反応させて、前
記の一定の吸光度、吸光率又は散乱光の強度に
達するに要する反応時間を読みとることによ
り、該未知試料中の抗原及び／又は抗体の量
（又は濃度）を定量することもできる。 (C) 特定の抗原及び／又は抗体を一定量含有する
標準試料を用いて、これを種々の倍率で稀釈し
た種々の稀釈標準試料を用意し、本発明に従つ
てこれを一定量の特定の抗体又は抗原を感作し
た不溶性担体粒子と一定条件下で反応させ、反
応開始後ほぼ一定時間後（たとえば少くとも２
〜３秒以後、好ましくは約５秒以後）であつ
て、反応混合物の反応状態が安定し、該反応混
合物の吸光度、吸光率又は散乱光の強度が最初
にほぼ定常的に増加する２以上の時点において
吸光度、吸光率又は散乱光の強度を測定して、
特定の抗原及び／又は抗体と感作担体粒子とに
ついて、該抗原又は抗体の量（濃度）と単位時
間当りの吸光度、吸光率又は散乱光の強度の増
加率との関係を示す標準曲線Ｃを作成してお
き、つぎに、この標準曲線Ｃの作成に用いたと
同一の感作担体粒子を用いて、その作成の場合
と実質的に同一条件下で、未知試料と該感作担
体とを反応させ、かつ実質的に同一な方法によ
り単位時間当りの吸光度、吸光率又は散乱光の
強度の増加率を測定し、この増加率を前記標準
曲線Ｃと比較、照合することにより該未知試料
中の抗原及び／又は抗体の量（又は濃度）を定
量することができる。 なお、上記した方法による抗原―抗体反応の
測定法はたとえば、特開昭53―24015号公報、
特開昭54―108693、特開昭54―108694、特開昭
54―108695及び特開昭54―109494に詳細に示さ
れている。 本発明の抗原又は抗体の定量法に於ては、試料
液又はその稀釈物を該試料液の実質的に全ての構
成成分の存在下抗原―抗体反応に供する。従来、
放射化免疫分析法、酵素免疫分析法、螢光免疫分
析法、レーザー比ろう法、免疫拡散法、免疫電気
泳動法、血球凝集反応法、血球凝集阻止反応法、
スライド法等により抗原又は抗体を高い精度で定
量するには、測定に悪影響を与える物質を予め除
去しておくことが必要であつて、たとえば、血液
が試料液の場合には、血球を除去した血清、血漿
が被検体として使用されている。しかし、本願発
明に於て、上記した特定の抗原又は抗体の定量法
を採用すれば、血液、脳脊髄液等の試料液の実質
的に全ての構成成分の存在下であつても、該試料
液中の抗原又は抗体を高感度でかつ簡易迅速に定
量できる。 本発明で、試料液中の抗原又は抗体を該試料液
の実質的に全ての構成成分の存在下抗原―抗体反
応に供するとは、たとえば、血液の場合には、血
液から血球を実質的に分離することなく、全血液
を抗原―抗体反応に供することを意味する。 以下、本発明を、生体試料が血液である場合に
ついて説明する。 血液中の抗原又は抗体を、本発明の方法によつ
て定量する場合、目的とする抗原又は抗体に対応
する抗体又は抗原で感作した不溶性微粒子担体の
懸濁液、たとえば、ラテツクス試薬に、血液をそ
のまま、あるいは稀釈して加える。このときに加
える被検体の量は、測定しようとする抗原又は抗
体の血中濃度や使用するラテツクス試薬の測定可
能範囲に合わせて決めることは勿論であり、たと
えば試薬２容に被検液１容を加える場合、IgG、
IgA、IgM等の如き免疫グロブリンの測定に際し
ては、血液を200倍〜150000倍に稀釈して加え
る。またhcG（ヒト胎盤性性腺刺戟ホルモン）
や、フイブリノーゲン、α―フエトプロテイン
（AFP）などの測定に際しては、２倍〜5000倍に
稀釈して加える。このときの稀釈液としては、血
球の崩壊を防ぐために、血液と等張の稀釈液を用
いることが好ましく、たとえばBSA（牛血清ア
ルブミン）添加の生理食塩水やグリシン緩衝液
（等張）を用いる。又、上記被検体は、稀釈せず
に直接ラテツクス試薬に加えることもでき、この
ときは必要に応じて１μｌ〜10μｌの如き微小容
量の秤量器具を用いることが好ましい。いずれの
方法をとるにしても、反応時における共存赤血球
数は、使用するラテツクス試薬中のラテツクスの
粒子数以下（好ましくは1/50以下）であることが
好ましい。 以上の如くして、ラテツクス試薬と被検体を混
合したのち、撹拌下に濁度変化を記録して、上記
した方法により、抗原あるいは抗体の濃度を求め
るが、このときの方法としては、上記出願明細書
に詳細に記載した方法を用いることができる。 血液以外の試料、たとえばリンパ液、脳脊髄
液、腹水、関節液等の生体試料に加えて、組織培
養液、組織抽出液、菌体培養液、細胞培養液等の
試料液についても、血液に準じて行うことができ
るが、これらの試料の場合には、固体共存物の量
は、血液に比してはるかに少ないので、容易に測
定を行うことができる。 かくして、本発明の方法は、生体試料中の
IgG、IgM、IgA、IgEの如き免疫グロブリン、
hCG、TSH（甲状腺刺戟ホルモン）、フイブリノ
ーゲン、α―フエトプロテイン（AFP）、インシ
ユリン、エストリオール、テストステロン等のホ
ルモン、あるいはC1q、C3、C4等の如き補体成
分、CEA、CRP、その他血漿たんぱくの各成分
などの測定に有効に用いられる。 このようにして得られた測定値は、血球を含む
全容積に対する測定値であるので通常、ヘマトク
リツト値で補正して、血清又は血漿中の含有量に
換算する。即ち、ヘマクリツト値をHt％とする
とき、測定値Ａは、式 Ａ／（１００−Ｈｔ）×100 で補正して、血清又は血漿中の値にする。 本発明方法によれば、微量の試料液を用いて、
しかも簡易迅速に試料液中の抗原又は抗体を安全
かつ高い精度で定量できる。たとえば、試料液と
して10μｌの全血を使用すれば、免疫グロブリン
Ｇ（IgG）、免疫グロブリンＡ（IgA）及び免疫グ
ロブリンＭ（IgM）の血漿中の濃度を定量でき
る。従来の平板免疫拡散分析法及びレーザー比ろ
う法では、IgG、IgA及びIgMのそれぞれの定量
に５mlの血液、即ち、合計15mlの血液を要するか
ら、本発明方法では、これらの方法の僅か1/500
の血液を使用すればよいことになる。また、たと
えば、10μｌの血液を５mlに稀釈して、たとえ、
そのうちの0.5mlを使用しても、IgG、IgA又は
IgMの定量を十分に行えるから、10μｌの血液を
採取するだけで、少くとも10回の繰返し定量が可
能であつて、より高い信頼性をもつて、抗原又は
抗体を定量できることになる。 さらに、本発明方法では、血清分離等の生体試
料液の前処理を要しないから、極めて短時間で、
抗原又は抗体を定量できる。即ち、試料液が血液
の場合には、15分で血液中の抗原又は抗体を定量
できる。これに対し、平板免疫拡散分析法及びレ
ーザー比ろう法では、同様な定量にそれぞれ、48
〜72時間及び３時間を要するから、本発明方法で
は、それぞれ、1/200〜1/300及び1/12の時間で抗
原又は抗体を定量できることになる。このよう
に、本発明方法によれば、短時間で抗原又は抗体
を定量できるから、本発明方法を患者の診断に使
用する場合には、予診から診察までの間に結果が
得られ、患者に適切な処置を施すことができて、
急性疾患の場合にも時期を失することがない。 以上述べたことから明らかなように、本発明の
方法は医療分野での使用に特に適した実際的な方
法である。 本発明を以下の実施例により、さらに詳細に説
明するが、本発明は、その要旨を超えない限り、
以下の実施例に限定されるものではない。 実施例 １ (1) 抗hCG抗体感作ラテツクス（抗hCG―ラテツ
クス）試薬の調製 特開昭53―24015号公報に記載の方法に準
じ、抗ヒト胎盤性性腺刺激ホルモン抗体（抗
hCG）及びポリスチレンラテツクス平均粒径
0.220μｍ（ダウ．ケミカル社製）を用いて、
抗hCG感作ラテツクス（ラテツクス粒子濃度
0.17％）を調製した。 (2) 検量線の作成 上記(1)で調製した抗hCG―ラテツクス試薬
0.2mlと、下記表―Ａに示す濃度の標準hCG溶
液（0.2重量％牛血清アルブミンを含む生理食
塩水に溶かしたもの）0.1mlとを、小試験管に
入れて５秒間振盪して混合した後、直径2.4mm
の廻転翼を有する小型撹拌機を具えたアクリル
樹脂製のセル（光路長４mm）に入れ、直ちに
600rpmの速さで撹拌しつつ吸光度の時間的変
化の記録を行う。 反応開始後のなるべく早い時点における吸光
度変化の直線部分を用いて吸光度変化の速さを
求め（下記表―Ａに示す。）、標準hCG濃度との
関係をグラフ化したものを第１図に示す。この
第１図を用いて後述の未知試料の定量を行う。

【表】 (3) 回収実験 血球の存在下に、正常な測定が行われること
を下記実験によつて立証した。正常男子血液
（クエン酸添加全血）に、下記表―Ｂに示す濃
度になるようhCGを溶かして検体とする。これ
を、同じ表―Ｂに示す稀釈度に、0.2％BSA含
有生理食塩水で稀釈し、上記(2)項の標準曲線作
成の条件と全く同じ条件で、濃度変化の速さを
測定し、第１図に示した標準曲線を用いてhCG
濃度を算出した。結果を下記表―Ｂに示す。

【表】 実施例 ２ (1) 抗免疫グロブリン抗体感作ラテツクス試薬の
調整 実施例１と同様にして、抗ヒトIgG抗体、抗
ヒトIgA抗体、抗ヒトIgM抗体を用いて、それ
ぞれ抗IgG抗体感作ラテツクス試薬、抗IgA抗
体感作ラテツクス試薬、抗IgM抗体感作ラテツ
クス試薬を調製した。 (2) 標準曲線の作成 実施例１と同様にして、それぞれIgG、
IgA、IgMに対する標準曲線を作成した。 (3) 未知試料中のIgG、IgA、IgMの定量 被検者の耳朶を小型のメスまたは注射針にて
２mm程切り、周囲を軽く圧迫すると静脈血が滴
状にもり上つて生てくる。ドラモントまたはク
レイアダムスの10μｌ毛細管ピペツトの先を血
液に入れると毛細管現象により血液は管内に上
昇する。10μｌの目盛まで上つたら、先端を耳
より放し、水平に保持してガラス管の外側をガ
ーゼで拭く。試験管に、あらかじめ正確に10ml
のグリシン緩衝液（0.1％牛血清アルブミン
加、PH9.6、等張）を採取し、その中に10μｌ
の血液を吹き出す。吹き出したあと、毛細管ピ
ペツトの先端を緩衝液に入れると、毛細管現象
により緩衝液は、再び管内に上つてくる。これ
を吹き出し、この操作を15回以上繰返す。ここ
までの操作は、血液の凝固を避けるため迅速に
行い、かつ微量の血液を正確に残らず緩衝液に
移すためにこの操作を確実に行う（1001倍稀
釈）。この緩衝液を均等に撹拌してその１mlを
ホールピペツトにとり、別の４mlの緩衝液に加
える（5005倍稀釈）。耳からはさらにヘマトク
リツト毛細管に採血し、遠心してヘマトクリツ
トを求める（Ht％） 先に得られた5005倍稀釈液を用い、実施例１
と同様にして、標準曲線よりIgG濃度（ａ
mg／dl）を求める。血漿中のIgG濃度Ａ（mg／
dl）は Ａ＝ａ×5005×１００／１００−Ｈｔ によつて算出される。 同様にして、1001倍稀釈液を用いて、血漿中
のIgA濃度Ｂ（mg／dl）及びIgM濃度Ｃ（mg／
dl）を標準曲線より求めたIgA濃度（ｂ mg／
dl）及びIgM濃度（ｃ mg／dl）に基いて次式
により算出する。 Ｂ＝ｂ×1001×１００／１００−Ｈｔ Ｃ＝ｃ×1001×１００／１００−Ｈｔ

【表】 実施例 ３ 実施例２に準じて、全血の代りに血清を用い
IgG、IgA、IgMを定量し、実施例２で得られた
全血についての定量値と比較した。下記表―Ｄか
ら明らかなように、よく一致した結果が得られ
た。

【表】 実施例 ４ α_１―フエトプロテイン（AFP）回収実験 実施例１と同様にして、抗ヒトAFP抗体感作
ラテツクスを用い、AFP回収実験を実施した。
但し、実施例４においては、表―Ｅに示した濃度
のAFP標準溶液で全血を表―Ｅに示す稀釈倍率
にまで稀釈し、これを検体として使用した。 結果を表―Ｅに示す。

【表】 実施例 ５ ヒト脳髄液0.4mlを緩衝液1.6mlに加え５倍に希
釈し、その１mlを取つて倍倍希釈し、これをサン
プルとして、実施例２と同様にしてIgGを定量し
た。 結果を表−Ｆに示す。

【表】 参考例 実施例５と同一のヒト脳脊髄液をminicon―
B15（Amicon社製）により45倍に濃縮して、一
元放射免疫拡散法（SRID）によりIgGを定量し
た。 結果を表―Ｇに示す。

【表】 ヒト脳脊髄液中の免疫グロブリンＧ（IgG）の
濃度は正常で１〜３mg／dlといわれ、血清の1/10
００と低濃度であるため、従来は濃縮して測定され
ている。しかし、正確に50倍程度に濃縮すること
は困難であり、たとえば、完全に凍結乾燥して、
一定容量に溶かすことにより、正確な濃縮を試み
ると、少量の溶媒には完全に溶解しないで、不溶
性部分が残るので、好しくない。 しかし、上記した結果から明らかなように、本
発明の方法によれば濃縮の必要はなく、むしろ10
倍程度に希釈して測定するためIgGの定量が著し
く容易である。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で得られた標準hCG濃度と吸
光度の変化速度との関係を表わす図であり、横軸
は標準hCG溶液のhCG濃度（Iu／ml）を示し、縦
軸は吸光度の変化速度（absorbance／min.）を
示す。なお、横軸、縦軸は共にlog目盛であらわ
してある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 微細粒径の不溶性担体に抗体又は抗原を支持
   させ、これと抗原及び／又は抗体或いはそれらの
   混合物とを反応させて、この反応混合物に光を照
   射することにより、抗原又は抗体を定量する方法
   に於て、試料液（ただし、尿をのぞく。）中の抗
   原又は抗体を該試料液の実質的に全ての構成成分
   の存在下抗原―抗体反応に供することを特徴とす
   る抗原又は抗体の定量法。 ２ 特許請求の範囲第１項記載の抗原又は抗体の
   定量法に於て、試料液である血液から血球を実質
   的に分離することなく、全血液を抗原―抗体反応
   に供することを特徴とする方法。