JPS5896251A - 抗原又は抗体の測定方法および測定用試薬 - Google Patents

抗原又は抗体の測定方法および測定用試薬

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JPS5896251A
JPS5896251A JP19437881A JP19437881A JPS5896251A JP S5896251 A JPS5896251 A JP S5896251A JP 19437881 A JP19437881 A JP 19437881A JP 19437881 A JP19437881 A JP 19437881A JP S5896251 A JPS5896251 A JP S5896251A
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JP
Japan
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antigens
antibodies
antigen
carrier particles
light
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JP19437881A
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English (en)
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Tatsuo Yamazaki
山崎 達男
Tadaaki Furuta
古田 忠昭
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Asahi Kasei Medical Co Ltd
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Asahi Medical Co Ltd
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Publication date
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    • GPHYSICS
    • G01MEASURING; TESTING
    • G01NINVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、極微粒径の不溶性担体に抗体又は抗原を担持
させた粒子に、抗原及び/又は抗体或いはこれらの混合
物を反応させて、この反応混合物に可視光または紫外光
を照射することにより、抗原又は抗体を定量的に測定す
る方法および測定するための試薬に関する。
従来、抗体又は抗原を担持させたラテックスをガラス板
上で抗原又は抗体と反応させ、その凝集状態を内服で観
察することによって抗原又は抗体を半定量的に観察する
方法が知られている。
また近年において、上記ラテックス凝集法を用いて凝集
反応を反応混合物の濁度の減少で測定することKより、
抗原又は抗体な定量的に測定する方法が提案されている
が、ラテックス#度を極めて稀薄にしなければならない
ため、抗原又は抗体の定量法として精度や貴現性が悪く
、実用上の大きな制約を免れなかった。さらにこの方法
を改良したものとして、不溶性担体粒子に抗体又は抗原
を担持させ、これに抗原又は抗体或いはその混合物を反
応させ、反ろ混合物KO16〜2.4ミクロンの光(以
下近赤外光と呼ぶ)を照射し、吸光度を測定する方法が
提案されている(特開昭53−24015 )。
上記特開昭会報記載の測定法では、吸光闇−j定のため
に近赤外光を用いなければならず、そのための特殊な装
置が必要である。このため通常の分光計や比濁計などを
使用して、上記特開昭公報の測定を行なうことはできな
い。
また、平均粒径が0.1ミクロン以上のラテックス粒子
に抗体又は抗原を感作させ、この感作ラテツクスと抗原
又は抗体を含む被検体とを混合させ、ラテックスの凝集
を比濁法によって測定する従来の槻定法においては、ラ
テックス懸濁液の可視光及び/又は紫外光領域での光透
過率が著しく悪いため、ラテックス濃度をごく低くしな
ければ測定で舎ず、又、凝集沈降がおこりゃすく、その
ため再現性や精度が悪く実用上の困難があった。
従って、抗体又は抗原を担持させた例えばラテックス粒
子の如き不溶性担体な、なるべく高濃度で被検体と反応
させ、反応の進行を特殊な波長域の光を使用せず、通常
の分光計又は比肩針を用いて可視光域の光で測定するこ
とが望まれていた。
本発明の目的は、上述の特殊な装置や特殊な波長の光源
を必要とせず、被検体中の抗体又は抗原を為糟IILV
−1再現性よく、かつ迅速に測定する方法を提供すると
とKある。
本発明は又、通常の分光計や比濁計などを用いて、従来
実用的には放射免役測定法(RIム)Kよってのみ可能
であったような極めて微量の抗体又は抗原を、それと同
等又はより曳い精度で迅速かつ安全、簡便に定量−」定
する方法を提供する。
本発明は更K、ホルモン、薬物などの不完全抗原をも測
定できる定量法を提供する。
本発明は更に、抗体及び/又は抗原の凝集反応のみなら
ず、その阻止反応を利用して抗体又は抗原を定量する方
法を提供する。
本発明者らは、従来法の欠点を改善した測定方法を見出
すべく鋭意検討を加えた結果、おどろくべきことに0.
1μより小さい極微粒径の不溶性担体に抗体又は抗原を
担持させた粒子の高濃度溶液と、抗原及び/又は抗体あ
るいはこれらの混合物を含む溶液とを反応させた反応液
は、通常の可視光−によって分析可能であるのみならず
、0.1声より大きい汎用の粒子を用いた系に比して、
高い再現性を有することを見出し1本発明を完成するに
至った。
極微粒径の粒子を用いる場合に、分析の再現性が^いこ
との原因は、反応が進行し1粒子が大きくなっても沈降
がおこりにくいために、再現性の向上がみられたことに
よると考えられる。
すなわち本発明は、平均粒径が0.1ミクロンより小さ
い不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持させ、この担持
された抗体又は抗原に、抗原又は抗体あるいはその混合
物を、液体媒体中にて反応せしめ、この反応液KO,2
〜0.52 ミクロンの波長の光を照射して、該反応液
の吸光度又は散乱光強度を測定することを特徴とする抗
原又は抗体のII定方法、および平均粒径が0.1ミク
ロンより小さい不溶性担体粒子に抗体又は抗原を担持さ
せた粒子からなる抗原又は抗体の測定用試薬を提供する
ものである。
本発IjIIkよれば、平均粒径が0.1ミクロンより
小さい極微粒径の不溶性担体粒子に支持された抗体又は
抗原と、被検体中の抗原又は抗体との反応液を0.2〜
0.52?クロンの光を照射することにより、高い担体
粒子amで、反応の進行を定量的に測定することが可能
である。これは該担体粒子を懸濁させた水溶液は上記範
囲の光をよく透過し、度に極めてよく対応するからであ
る。
本発明で用いる不溶性担体粒子としては、本発明の測定
を行う時に用いられる液体媒体に実質的に不溶性で、平
均粒径が0.1ミクロンより小さく、より好ましくは0
.1ミクロン未満から006ミクロンの微粒子、例えば
ポリスチレン、メチルメタクリレート−メタクリル酸や
スチレン−メタアクリル酸の共重合体などの有機高分子
のラテックス又はシリカ、アルミナなどの無機酸化物粒
子などが用いられる。なかでも、有機高分子物質の微粒
子は、抗体および/又は抗原を化学結合を介して。
強固かつ多量に担持させることができ、非常に好ましい
上記不溶性担体粒子を本発明の測定に用いる場合、なる
べく粒径が均一でかつ単分散の状態で使用することが望
ましい。
本発明において、不溶性担体粒子(例えばラテックス粒
子)K、@定しようとする被検体中の抗原及び/又は抗
体と反応し得る抗体又は抗原を担持させる場合、担体に
対して抗体又は抗原を物理的に数層させてもよいし、官
能基を持つ有機高分子担体にカップリング剤により化学
的に結合させてもよいが、安定性などからみて、化学的
に結合させることがより好ましい。
本発明においては、極微粒径の不溶性担体粒子を用いる
ことKより、該粒子の懸濁液の0.2〜0.52ミクロ
ンの波長の光に対する光透過性を極めて為くすることが
できたため、波長が0.2〜0.52ミクロン、好菫し
くは0.35〜0.52 iクロンの光重を用いて、腋
粒子の濃度を0.1重量囁以上の高濃度にして測定する
ことが可能となった。
しかしながら皺担体粒子の11度が余りに大きくなると
、抗原抗体反応以外の原因による凝集反応(非41IJ
lI的凝集反応)が無視できなくなり、測定感度の悪化
を招く。短い反応時間でかつ高感度、為精度で再現性よ
く定量するためには0.1〜2重重量−より奸才しくは
0.5〜2重量−1の懸濁液を用いるのがよい。
また、本発明においては、感作担体粒子と被検体を混合
した後、静置下において反応を進行させることも可能で
あるが、被検物の検出感度を向上させ、かつ短時間で再
現性のよい結果を得るためには、皺混合反応物を攪拌又
は振盪下に!i広させることがより好ましい。反応混合
物の攪拌又は振盪には、−例として慣用の磁気的乱流攪
袢器を用いることができる。
吸光度又は散乱光強度の一定は感作担体粒子と被検体と
の反応をセル外で実質的に一定条件下で一定時間反応さ
せた後、反応混合物をセル中に入れて一定してもよいが
、分光針又は比濁計の中にセルを置き、このセル中で実
質的に一定条件下で反応を進行させ、一定時間の反応後
に吸光度又は乱散光強度を測定するか、或いは実質的に
一定条件下で反応を進行させ、一定時間間隔で又は連続
的に吸光度又は散乱光強度を測定し、吸光度又は乱散光
強度の時間に対する変化率を求めることもできる・特に
吸光度又は散乱光強度の時間に対する変化率の一定によ
れば、より短時間に高感度かつ高精度の定量を行なうこ
とができる。
本発明に従って被検体(試料)に含まれる抗原又は抗体
を定量するためKは、一定の抗原又は抗体を一定量含有
する標準試料を用いて、これを種々の倍率で稀釈した種
々の稀釈標準試料を用意し、本発明に従ってこれを一定
量の一定抗体又は抗原を感作した不溶性担体粒子と一定
条件下で反応させ、この反応混合物の吸光度又は散乱光
強度を測定して、皺抗原又は抗体の量(濃度)と吸光度
又は散乱光強度との関係を示す標準曲線を作成しておく
0次に、この標準IIIIIの作成に用いたのと同一の
感作担体粒子を用いて、その作成の場合と実質的に同一
の条件下で未知試料と該感作担体とを反応させ、その吸
光Myaよ散乱光強度を前記標準曲線と比較、照合する
ことにより、該未知試料中の抗原又は抗体の量(磯度)
を定量することができる。
また別法として、前記標準画−を作成する場合に、吸光
度又は散乱光強度の時間に対する変化率と使用した標準
試料中の抗原又は担体の量(濃度)との関係を示す標準
曲線を作成しておけば、前記の方法と同様に未知試料中
の抗原又は抗体の量(濃度)を定量することができる。
実施例 攪拌羽根、冷却管、チッ素気流管をそなえた5tの40
フラスコに、21の水、5J9のメチルセルロースを添
加し、60℃にでメチルセルロースを溶解したのち、室
温にまで冷却する。
攪拌下に200#のアクリル酸、800gのメタクリル
酸メチル、200gのエチレングリコールジアクリレー
ト、4IIのn−ブチルメルカプタン、10011のメ
ータクリル酸をこの順序で加える。
反応液の上部空間部をチッ素にて置換したのち、チッ素
気流下で80℃に加熱する。5gのアゾビスイソブチロ
ニトリルを100ccのメタノールに溶解した溶液・を
、重合反応温度が95℃をこえないようにゆっくり適下
したのち、5時間重合を続ける。反応終了後、冷却し、
共重合物粒子を分−1水洗し、60℃で一晩乾燥する。
乾燥粉末2001を攪拌機をつけた2tのフラスコに入
れ、2501の水と50JIのジエチレングリコール七
ノエチルエーテルと51の濃アンモニア水(289b)
を加え、フラスコを70℃に加熱し、6時間はげしく攪
拌す゛る。冷却し濾過して、青みがかった透明の分散液
を得た。電子紬徽鏡にて、検討した結果、該分散液中の
粒子の粒径は0.02〜0.08ミクロンで、その平均
粒径は0.06?クロンであった。
このラテックス粒子にカルボジイミド法を用いて抗ヒト
エgGを結合し、未反応1’g Gと分離した後牛血渭
アルゾミン(0,1重量%)浴液に、懸濁して5重量囁
の抗ヒトエgG固定化ラテックス試薬を調製した。
かくして得られた抗ヒトエgG固定化うテックス賦秦0
.2117tl−橡準工gG溶液(0,1q/d )を
希釈して作製した種々の濃度の希釈標準IgG浴液0.
8i1i1にそれぞれ加え、磁気的乱流攪拌器によって
攪拌しなから室温で5分間反応させた。しかる後、分光
計にて波長0.4ミクロンの吸光度を測定して、IgG
fII液の一度を横軸にとり、@、長0.4?クロンの
吸光度を縦軸にさった櫨準III麹を作製した0上記の
方法と同様にして、被検液(正常人血を1000倍希釈
したものを用いた。)の吸光度を測定して、標準−線か
ら工gG@度を求めた。その結果な第1表に示す。
なお比較のため従来の放射免& 61J定法(RIム法
)Kよる結果も併せて示した。
第  1  表 特許出願人 旭メディカル株式会社

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 t 平均粒径か0.1ミクロンより小さい不溶性担体粒
    子に抗体又は抗原を担持させ、この担持された抗体又は
    抗原に、抗原又は抗体あるいはその混合物を液体媒体中
    にて反応せしめ、この反応液に0.2〜0.52 ミク
    ロンの波長域の光を照射して、該反応液の吸光度又は散
    乱光強度を測定することを特徴とする抗原又は抗体の測
    定方法 2、平均粒径が0.1ミクロンより小さい不溶性担体粒
    子に抗体又は抗原を担持させた粒子からなる抗原又は抗
    体の測定用試薬
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS58187860A (ja) * 1982-04-26 1983-11-02 Wako Pure Chem Ind Ltd 免疫学的凝集反応の光学的測定方法
JPS63138266A (ja) * 1986-11-28 1988-06-10 Shimadzu Corp 抗原−抗体反応の測定法
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JPH01233298A (ja) * 1988-03-11 1989-09-19 Boehringer Mannheim Gmbh 抗体、その製造法、hmlcを測定するための試薬、ならびにモノクローナル抗体

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