JPS63115061A - 免疫測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は免疫凝集反応に基づく免疫測定法、特に、測定
感度の高い免疫測定法に関する。

（従来の技術） 体液中のａｍ成分などの測定方法として、目的とする被
測定物質に該被測定物質と抗原抗体反応しうる物質を作
用させ、生じる凝集の度合を測定する方法が採用されて
いる。それには２例えば。

上記被測定物質を含む検体と上記抗原抗体反応しうる物
質とを直接反応させる免疫比濁法や上記抗原抗体反応し
うる物質を不活性担体に担持させた試薬を検体に作用さ
せる方法がある。いずれの場合にも９通常、血清などの
検体を緩衝液などに溶解させた検体溶液と、上記抗原抗
体反応しうる物質あるいはこれを不活性担体に担持させ
た試薬（いずれも免疫診断試薬という）とを液相中で反
応させ、生じた凝集反応を測定機器で測定する。

測定方法としては１例えば、■反応系に光を入射させ、
該先の透過光強度を測定する方法；■反応系に光を入射
させ散乱光強度を測定する方法；■反応系に入射する光
の透過光および散乱光の強度を測定し、その比率を算出
する方法；０反応液中の粒子数および／または粒子径を
測定する方法がある。このような、抗原抗体反応による
凝集を測定する方法の例としては、特公昭５８−１１１
５７５号公報に■の透過光強度の測定による方法が開示
されている。この方法においては、測定感度を上げるた
めに使用する免疫診断試薬の担体の粒子径。

反応条件、測定に使用する光の波長などを特定している
。特開昭５９−１８７２６４号公報には、■の透過光強
度と散乱光（前方散乱光）強度とを測定する積分球式濁
度計による測定法が開示されている。

特開昭６０−１１１９６３号公報には、■の反応液中の
粒子数および／または粒子径を測定する方法が開示され
ている。この方法では２反応液中の粒子径別の粒子数を
計数し凝集の度合を測定している。

上記方法のいずれにおいても凝集の度合が強すぎると機
器での測定が困難であるため９反応は希釈された状態で
行われる。通常、（１）血清などの被測定物質を含む検
体を精製水、緩衝液、生理食塩水などで希釈しておき、
これに免疫診断試薬を加える方法；（２）免疫診断試薬
を上記緩衝液などで希釈しておき、これに被測定物質を
含む検体を加える方法；（３）被測定物質を含む検体お
よび免疫診断試薬をあらかじめ上記緩衝液などで希釈し
ておき。

これらを混合する方法；などが採用される。しかし、抗
原抗体反応の速度は２反応液中の抗原および抗体の濃度
に依存するため１反応速度は極めて遅く、かつ被測定物
質含量が低い場合にはその精度も充分ではない。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明は、上記従来の問題点を解決するものであり、そ
の目的とするところは、生体成分などを抗原抗体反応に
よる凝集を利用し、迅速にかつ精度よく測定する方法を
提供することにある。

（問題点を解決するための手段および作用）本発明の免
疫測定法は、被測定物質を含有する検体と、該被測定物
質と抗原抗体反応しうる物質でなる免疫診断試薬または
該抗原抗体反応しうる物質が不活性担体粒子に担持され
た免疫診断試薬とを液相中で混合し、該被測定物質と該
免疫診断試薬との反応により生じる凝集の度合を測定す
る免疫測定法であって、該被測定物質と高濃度の該免疫
診断試薬とを混合し、かつ該凝集反応の開始後に反応液
を該被測定物質および／または該免疫診断試薬が含有さ
れない希釈液で１．５倍以上に希釈した後、該凝集の度
合を測定し、そのことにより上記目的が達成される。

本発明方法により測定しうる被測定物質には。

抗原抗体反応を利用して測定が可能なあらゆる物質が包
含される。それには例えば、リューマチ因子（ＲＰ）　
、　Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）　、抗ストレプトリジン
−〇　（ＡＳＯ）、　　α−フヱトプロテイン（ＡＦＰ
）。

＋１ＣＧ、　ＣＥＡがある。

上記被測定物質（抗原または抗体）と抗原抗体反応しう
る抗体または抗原（免疫診断試薬）は。

一般的な免疫・精製等の公知の方法により得られる。例
えば、ヒトＡＦＰをヤギに免疫じて抗ヒトへＦ！’ヤギ
抗体が得られる。これらの物質は、不活性担体粒子に担
持されていてもよい。不活性担体粒子としでは、カオリ
ン、ベントナイトのような無機質粒子；ポリスチレン粒
子のような合成高分子製粒子などが用いられる。特にポ
リスチレンやスチレン系共重合体粒子を均一に懸濁させ
たラテックスが好適に用いられる。ラテックス粒子に上
記既知の抗体または抗原を担持させたラテックス試薬が
市販されており、これを利用することもできる。

本発明方法により検体中の被測定物質を測定するには、
まず、抗原抗体反応が行われる反応液中での被測定物質
および免疫診断試薬の濃度が高濃度となるように被測定
物質および免疫診断試薬の溶液（もしくは懸濁液）が混
合される。ここで「高濃度」とは、該被測定物質および
免疫診断試薬の反応により生じる反応液中の凝集物の濁
度が大きすぎ名ため、従来技術の項で記したような光学
的装置により測定され得ないような濃度であることをい
う。このような濃度は、被測定物質により異なるため１
例えば、目的とする被測定物質を既知濃度で含有する標
準品を用いてその設定を行う。

通常、検体もしくは検体溶液がラテックス試薬などの免
疫診断試薬を含む溶液（懸濁液）と混合されたときの希
釈倍率が２５倍以下であり、かつ免疫診断試薬を含む溶
液（懸濁Ｆｊ、）の希釈倍率が２倍以下となるような混
合割合とする。。例えば、市販のラテックス試薬を用い
るときには１通常の希釈を行わない程度の濃度が採用さ
れる。

被測定物質および免疫診断試薬の混合により抗原抗体反
応が生じ凝集物が形成される。この凝集による濁度は上
述のように測定装置の測定可能範囲を越えるため、測定
可能なスケールにまで希釈がなされる。通常２反応液は
１．５倍以上に希釈される。希釈液は被測定物質および
／または免疫診断試薬を含有せず、かつ被測定物質、免
疫診断試薬およびこれらの反応物と化学的に不活性であ
る液体２通常、水、生理食塩水、緩衝液などが用いられ
る。希釈は２次の条件（ａｌ〜（Ｃ）の少なくともひと
つを満足する時点においてなされる。

（ａ）凝集開始時から測定までの時間を１００％とした
ときの３５％以上１００％未満の時点。

（ｂｌ抗原〜抗体反応物（凝集物）の測定時における量
を１００％としたときに、３５％以上の量の凝集物が生
成した時点。

（Ｃ１凝集開始時から希釈時までの濁度、散乱強度。

凝集粒子数などの指標の平均時間変化率（これは。

単位時間あたりの凝集物の生成量を示す）が、凝集開始
時から測定時までの全過程におけるこれらの指標の平均
時間変化率よりも大きいか等しいような時点；または凝
集開始から希釈時までの上記指標の平均変化率が希釈時
から測定時までの上記指標の平均変化率よりも大きいか
等しいような時点。

希釈時が上記（ａｌ　（ｂ）または（Ｃ）の条件を外れ
ると。

反応液が最初から低濃度であったのと同様の状態となり
抗原抗体反応の速度が遅く、測定までに長時間を要する
。検体中の被測定物質量が微量である場合には測定精度
も低下する。

上記希釈後の凝集反応の測定は、既知の装置によりなさ
れうる。例えば従来技術の項で示した分光光度計、光の
散乱強度を測定する装置１粒子数および／または粒子径
を測定するための装置などが用いられる。免疫凝集反応
を測定するための専用装置としては１分光光度計を組み
込んだ生化学自動測定装置、免疫比濁法による凝集反応
を測定するための専用装置、ラテックスの凝集反応を測
定するための専用装置などがある。これらの装置として
は、　ＬＰＩＡ　（（１ｍダイアヤトロン）、ＬＡシス
テム（■アルファチック）　、　ＥＬ−１０００（協和
ラテックス■）２日立７０５形１日立７３６形などが挙
げられる。上記測定機器専用に調製された測定キット〔
例えば日立７０５形や日立７３６形用に調製されたラテ
ックス試薬のキット（Ｈカイノス、＠ヤトロン）〕も発
売されている。測定方法としては１通常のピペット操作
によりセル内で凝集反応を行わせる方法の他、フローイ
ンジェクションを利用する方法も好適に用いられる。

このように本発明方法では、被測定物質と免疫診断試薬
との抗原抗体反応の大部分が高濃度で行われるため、単
位時間に生成する抗原−抗体結合物の量が多くなる。こ
のことは２反応速度が速く。

測定下限が低く、かつ検量線の傾き力５大きくなること
を示す。このように２例えば、ラテックス試薬などの免
疫診断試薬自体の感度を改善することなく、短時間で高
精度の測定が行われる。

（実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

去施且上 次の検体、免疫診断試薬、希釈液および測定装置を用い
てＣＲＰの測定を行なった。

検体：　　ＣＲＰ濃度約５■／艷のＣＲＰ陽性ヒト血清
を５％の牛血清アルブミンを含むｐＨ７，４のリン酸食
塩緩衝液（リン酸濃度１０ｍＭ、　ＮａＣｌ４度０．１
５Ｍ）により、所定濃度（１，３，２，５，１０，５０
および１１００ｎ／ｄ）に希釈したものを検体とした。

原血清の正確なＣＲＰ濃度は、原血清を適当な希釈倍率
に上記５％牛血清アルブミンを含むリン酸緩衝液により
希釈した後、セラテスクムＣＲＰ−Ｈの処方に従って２
日立７０５形全自動生化学自動分析装置により測定して
求めた。

免疫診断試薬（ラテックス試薬）　　：　　ＣＲＰ測定
用ラテックス試薬として、市販のセラテスタムＣＲＰ−
Ｈ（日立化成工業■製）を用いた。

希釈液：セラテスタムＣＲＰ−１１にセントされている
希釈液を用いた。

測定装置：分光光度計Ｕ−３２００（■日立製作所）を
使用し、光路長ｌ　ｃｍのガラスセルを用いて波長６０
０ｎｍで測定した。

（ＣＲＰの測定） ガラスセルに検体をマイクロシリンジにより６μｌ採取
し、ラテックス試薬を１００μｌ加えて充分混合した。

ラテックス試薬添加４分５０秒後に希釈液を７００μｌ
添加混合した。さらに１０秒後（ラテックス試薬を加え
てから正確に５分後）に、測定装置により吸光度（濁度
）を測定した。測定は各濃度について３回行い、　　Ｃ
ＲＰ濃度０のときの濁度（０，０，値）を対照として、
各検体濃度に対応する０、Ｄ、値から差し引いた。各Ｃ
ＲＰ　ｔＭ度に対するＯ、Ｄ。

値（補正値）のグラフ（Ａ）を第１図に示す。本測定方
法においては、検体、希釈液、ラテックス試薬はあらか
じめ３７℃のインキュベーターにより加温しておき１反
応も３７℃のインキュベーター中で行なった。希釈液を
加えてから測定までの時間は。

１０秒以内となるようにした。

北双±１ 検体、免疫診断試薬、希釈液、測定装置１反応の温度条
件などは実施例１と同様である。ガラスセルに検体をマ
イクロシリンジにより６μｌ採取し、希釈液を７００μ
！加えて充分に混合した。混合後、ラテックス試薬を１
００μｌ加えて混合し。

正確に５分後の吸光度（濁度）を測定装置により測定し
た。測定は実施例１と同様の濃度について各３回行なっ
た。ＣＲＰ濃度０のときの濁度を対照として、各検体濃
度に対応する０、Ｄ、値から差し引いた。各Ｃ！？Ｐ　
濃度に対する０、Ｄ、値（補正値）のグラフ（Ｂ）を第
１図に示す。

第１図から、従来法（Ｂ）においては、　　ＣＲＰ？ｆ
ｉ度が約３ｎｇ／−のときには、抗原抗体反応による吸
光度の変化がほとんど認められないことがわかる。

これに対して本発明方法（Ａ）においては、　　ＣＲＰ
が低濃度であっても吸光度変化が観測され、かつその値
が大きく、測定感度が改善されていることが明らかであ
る。

犬上孤１ 次の検体、免疫診断試薬、希釈液および測定装置を用い
てＡＦＰの測定を行なった。

検体：約２００μｇ７ｍｌの、ＡＦＰを含むヒト血清を
５％の牛血清アルブミンを含むｐＨ７，４リン酸食塩緩
衝液（リン酸１０ｍＭ、　ＮａＣｌ　０．１５Ｍ　；以
下ＰＢＳとする）により所定濃度（１，、２，５，５，
１０，５０，１００および２００　ｎｇ／　ｍｌ）に希
釈したものを検体とした。正確なＡ　Ｆ　ＰｔＨ度はＡ
　Ｆ　Ｐ　？Ｍ度測定のための市販のラジオイムノアッ
セイキットにより測定した。

希釈液：１％の牛血清アルブミンを含むＰＢＳを用いた
。

免疫診断試薬（ラテックス試薬）−次の方法で調製した
抗ヒトＡＦＰヤギ抗体を感作させたラテックス試薬を用
いた。〔調製法〕　：ヒトＡＦＰをヤギに免疫して得た
抗血清を硫安分画により精製し。

抗ＡＦＰ　γ−グロブリン分画を得た。別に、直径０．
１２μｍのポリスチレンラテックスを準備し、これを固
形分が２％となるようにＰ［ｌＳで希釈した。上記抗Ａ
ＦＰ　γ−グロブリン分画を５００μｇ　／　ｍｌとな
るようにＰＢＳで希釈し、上記ラテックスと３７℃で混
合し、１時間をかけて穏やかに攪拌した。この混合液を
２７．０ＯＯＧで遠心分離し、未吸着の抗ＡＦＰｒ−グ
ロブリンを除去した。抗ＡＦＰ　γ−グロブリンの結合
したラテックスに１％生血清アルブミンを含むＰＢＳを
加えて、固形分０．５％のラテックス試薬を得た。

測定装置：分光光度計ｔｌ−３２００（■日立製作所）
を使用し、光路長ｌ　ｃｍのガラスセルを用いて波長６
００ｎｍで測定した。

（ＡＦＰの測定ン ガラスセルに検体をマイクロシリンジにより２０μｌ採
取し、ラテックス試薬を１００μｌ加えて充分混合した
。ラテックス試薬添加４分５０秒後に希釈液を７００μ
ｌ添加混合した。希釈液添加１０秒後（ラテックス試薬
を加えてから正確に５分後）に測定装置により吸光度（
濁度）を測定した。測定は各濃度について３回行い、　
　ＡＦＰ？ｆｉ度０のときの濁度（０，Ｄ、値）を対照
として、各検体濃度に対応する０、Ｄ、値から差し引い
た。各Ａ　Ｆ　Ｐ　ｔＭ度に対する０、Ｄ、値（補正値
）のグラフを第２図に示す。本測定方法においては、検
体、希釈液、ラテックス試薬はあらかじめ３７℃のイン
キュベーターにより加温しておき９反応も３７℃のイン
キュベーター中で行なった。希釈液を加えてから濁度の
測定までの時間は、１０秒以内となるようにした。

北較±１ 検体、免疫診断試薬、希釈液、測定装置２反応の温度条
件などは実施例２と同様である。ガラスセルに検体をマ
イクロシリンジにより２０ｔｔｌ採取し、希釈液を７０
０μｌ加えて充分に混合した。混合後、ラテックス試薬
を１００μｌ加えて混合し。

正確に５分後の吸光度（濁度）を測定装置により測定し
た。測定は実施例２と同様の濃度について各３回行い、
　　ＡＦｐ濃度Ｏのときの濁度を対照として、各検体濃
度に対応する０、０．値から差し引いた。

第２図から、従来法（Ｂ）においてば、＾ｐ　ｐ　ｆｆ
、度が約５ｎｇ／ｄのときには、吸光度の変化がほとん
ど認められないことがわかる。これに対して本発明方法
（Ａ）においては、　　ＡＦＰが低濃度であっても吸光
度変化が観測され、かつその値が大きく、測定感度が改
善されていることが明らかである。

（発明の効果） 本発明によれば、このように、抗原抗体反応を利用した
被測定物質の測定が、免疫診断試薬の感度などに特に改
良を加えることなく簡単な操作で高精度になされる。こ
のような方法は１通常のピペット操作による測定法のほ
か、特に各種自動分析装置に好適に利用され得る。

」、　ヌ　　の　　′　なＵ 第１図は９本発明方法および従来法でＣＲＰを測定した
ときの検体中のＣＲＰ　ＱＱ度と０．Ｄ、値との関係を
それぞれ示すグラフ；そして第２図は１本発明方法およ
び従来法でＡＦＰを測定したときの検体中のＡＦＰ濃度
とＯ，Ｄ、値との関係をそれぞれ示すグラフである。

以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、被測定物質を含有する検体と、該被測定物質と抗原
   抗体反応しうる物質でなる免疫診断試薬または該抗原抗
   体反応しうる物質が不活性担体粒子に担持された免疫診
   断試薬とを液相中で混合し、該被測定物質と該免疫診断
   試薬との反応により生じる凝集の度合を測定する免疫測
   定法であって、該被測定物質と高濃度の該免疫診断試薬
   とを混合し、かつ 該凝集反応の開始後に反応液を該被測定物質および／ま
   たは該免疫診断試薬が含有されない希釈液で１．５倍以
   上に希釈した後、該凝集の度合を測定する、 免疫測定法。 ２、前記被測定物質と前記免疫診断試薬との反応により
   生じる凝集の度合が、前記希釈を行わない場合には、該
   凝集の度合を測定しようとする機器の測定限界を越える
   スケールである特許請求の範囲第１項に記載の免疫測定
   法。 ３、前記検体を含む液体と前記免疫診断試薬を含む液体
   とを混合したときの該検体を含む液体の該混合後の希釈
   倍率が２５倍以下、そして該免疫診断試薬を含有する液
   体の該混合後の希釈倍率が２倍以下である特許請求の範
   囲第１項に記載の免疫測定法。 ４、前記凝集の度合が、前記希釈液で希釈後の反応系に
   入射させた光の透過光および／または散乱光の強度によ
   り測定される特許請求の範囲第１項に記載の免疫測定法
   。 ５、前記凝集の度合が、前記反応液中の粒子数の変化お
   よび／または粒子径の分布の変化により測定される特許
   請求の範囲第１項に記載の免疫測定法。 ６、前記微小担体粒子が合成高分子粒子または無機質粒
   子である特許請求の範囲第１項に記載の免疫測定法。