JPH0543352B2 - - Google Patents
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-
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
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- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
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- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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Description
本発明は、新規なDNAに関する。さらに詳し
くは、本発明は、遺伝子操作の手法により創製し
たadr型Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原構造遺伝
子、または表面抗原前駆体をコードする遺伝子を
含有するDNAに関するものである。 ヒトＢ型肝炎は、DNAウイルスの１種である
Ｂ肝炎ウイルス（HepatitiS Ｂ virus；以下、
HBVと略称することもある）の感染によつて発
症する。HBVは、デン粒子としてその性状が知
られており、このウイルス粒子の表面にはHBV
表面抗原（以下、HBsAgと略称する）、粒子内部
に一部分単鎖部分をもつ二重鎖環状DNA、HBV
コア抗原（以下、HBcAgと略称する）が存在
し、また二重鎖DNAの単鎖部分を修復する酵素
として内在性DNA合成酵素の活性が検出されて
いる。HBVDNAは分子量2.1×106ダントンで約
3200の塩基対を有する。HBsAgの抗原性は共通
抗原のａを中心にadr、adw、ayr、aywの４種類
が知られており、このうちayw型HBVはDNA塩
基配列がすべに決定されており、そのHBsAg構
造遺伝子およびHBcAg構造遺伝子のゲノム上の
位置も決定されている。 現在、我国に存在するHBVの種類はadw型と
adr型である。adw型のHBVについては、すでに
本発明者の一部ＳがそのDNA塩基配列、HBsAg
構造遺伝子およびHBcAg構造遺伝子のゲノム上
の位置を決定するとともに、さらには大腸菌内で
のHBsAg構造遺伝子の発現にも成功している。
しかしadr型のHBVについては、HBsAg構造遺
伝子のゲノム上の位置およびDNA塩基配列等は
部分的に解明されているにすぎない。 HBsAgおよびその前駆体（PreHBsAg）は
HBVの感染防御のためのワクチンとして使用可
能であり、出来るならば各型のHBVのHBsAgを
ワクチンとして使用することが望まれる。この目
的のためにはHBV粒子の混在しないadw型、adr
型等各種のHBsAg、PreHBsAgを得ることが望
まれる。 また、HBcAgは、HBV感染の早期診断のため
の診断用試薬として使用できる。すなわちHBV
に感染すると抗HBs抗体が血中に現われる前に、
抗HBc抗体が出現するので、これを検出するこ
とによりHBV感染の有無を早期に判定できる。
このHBcAgを得るには一度デン粒子を集め、こ
の中HBcAgを分離しなければならない。しか
し、デン粒子中に含まれるHBcAgは微量である
ため、これを大量に得る方法の確立が望まれてい
た。 本発明者らはかかる技術的背景の下に鋭意研究
した結果、adr型HBV DNAを単離し、adr型
HBsAg構造遺伝子（以下、adr型HBsAg遺伝子
と略称する）、adr型preHBsAgをコードる遺伝
子（以下、adr型preHBsAg遺伝子と略称する）、
adr型HBcAg構造遺伝子（以下、adr型HBcAg
遺伝子と略称する）を含む組み換えDNAの創製
に成功した。さらにこのadr型HBV DNAの全塩
基配列を決定するとともに、上記した各遺伝子の
DNA塩基配列ならびにゲノム上の位置を決定し
た。これにより、組み換えDNAを有する形質転
換体を培養してHBV粒子の混在しないHBsAg、
preHBsAgならびにHBcAgを大量に生産する途
を開いた。 すなわち、本発明は、adr型HBsAg遺伝子ま
たはadr型preHBsAg遺伝子を含有するDNAとり
わけ組み換えDNAを提供するものである。 本発明のDNAとしては、第１図に示される塩
基配列またはその断片を有するものが好ましい。
第１図はHBV DNAの二重鎖全塩基配列を
EcoRIサイトから順番に示したものである。この
第１図においては、塩基配列順序155〜835として
示される塩基配列がHBsAg遺伝子の塩基配列で
あり、塩基配列順序2854〜3188〜１〜835（あるい
は2821〜3188〜１〜835）がpreHBsAg遺伝子の
塩基配列であり、塩基配列順序1874〜2425が
HBcAg遺伝子の塩基配列である。 他の観点における本発明DNAの好ましい態様
は、HBsAg遺伝子が第２図に示されるポリペプ
チドまたはそれと等価の免疫学的もしくは生物学
的活性を有するポリペプチドをコードするもので
あり、またHBcAg遺伝子が第３図に示されるポ
リペプチドまたはそれと等価の免疫学的もしくは
生物学的活性を有するポピペプチドをコードする
ものである。本発明のDNAは、これらのポリペ
プチドをコードしうるかぎり、HBsAg遺伝子と
して上記配列順序155〜835で示される塩基配列の
断片を有するものであつてもよく、またHBcAg
遺伝子として配列順序1874〜2425で示される塩基
配列の断片を有するものであつてもよい。 本発明のDNAはプロモーターの下流に連結さ
れていることが好ましい。かかるプロモーターと
しては、たとえばトリプトフアン（Trp）プロモ
ーター、ラクトース（Lac）プロモーター、蛋白
質鎖伸長因子Tu（tufB）プロモーターなどが挙げ
られ、とりわけtrpプロモーターが好適である。 本願明細書および図面で用いる記号の意義は第
１表に示すとおりである。
くは、本発明は、遺伝子操作の手法により創製し
たadr型Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原構造遺伝
子、または表面抗原前駆体をコードする遺伝子を
含有するDNAに関するものである。 ヒトＢ型肝炎は、DNAウイルスの１種である
Ｂ肝炎ウイルス（HepatitiS Ｂ virus；以下、
HBVと略称することもある）の感染によつて発
症する。HBVは、デン粒子としてその性状が知
られており、このウイルス粒子の表面にはHBV
表面抗原（以下、HBsAgと略称する）、粒子内部
に一部分単鎖部分をもつ二重鎖環状DNA、HBV
コア抗原（以下、HBcAgと略称する）が存在
し、また二重鎖DNAの単鎖部分を修復する酵素
として内在性DNA合成酵素の活性が検出されて
いる。HBVDNAは分子量2.1×106ダントンで約
3200の塩基対を有する。HBsAgの抗原性は共通
抗原のａを中心にadr、adw、ayr、aywの４種類
が知られており、このうちayw型HBVはDNA塩
基配列がすべに決定されており、そのHBsAg構
造遺伝子およびHBcAg構造遺伝子のゲノム上の
位置も決定されている。 現在、我国に存在するHBVの種類はadw型と
adr型である。adw型のHBVについては、すでに
本発明者の一部ＳがそのDNA塩基配列、HBsAg
構造遺伝子およびHBcAg構造遺伝子のゲノム上
の位置を決定するとともに、さらには大腸菌内で
のHBsAg構造遺伝子の発現にも成功している。
しかしadr型のHBVについては、HBsAg構造遺
伝子のゲノム上の位置およびDNA塩基配列等は
部分的に解明されているにすぎない。 HBsAgおよびその前駆体（PreHBsAg）は
HBVの感染防御のためのワクチンとして使用可
能であり、出来るならば各型のHBVのHBsAgを
ワクチンとして使用することが望まれる。この目
的のためにはHBV粒子の混在しないadw型、adr
型等各種のHBsAg、PreHBsAgを得ることが望
まれる。 また、HBcAgは、HBV感染の早期診断のため
の診断用試薬として使用できる。すなわちHBV
に感染すると抗HBs抗体が血中に現われる前に、
抗HBc抗体が出現するので、これを検出するこ
とによりHBV感染の有無を早期に判定できる。
このHBcAgを得るには一度デン粒子を集め、こ
の中HBcAgを分離しなければならない。しか
し、デン粒子中に含まれるHBcAgは微量である
ため、これを大量に得る方法の確立が望まれてい
た。 本発明者らはかかる技術的背景の下に鋭意研究
した結果、adr型HBV DNAを単離し、adr型
HBsAg構造遺伝子（以下、adr型HBsAg遺伝子
と略称する）、adr型preHBsAgをコードる遺伝
子（以下、adr型preHBsAg遺伝子と略称する）、
adr型HBcAg構造遺伝子（以下、adr型HBcAg
遺伝子と略称する）を含む組み換えDNAの創製
に成功した。さらにこのadr型HBV DNAの全塩
基配列を決定するとともに、上記した各遺伝子の
DNA塩基配列ならびにゲノム上の位置を決定し
た。これにより、組み換えDNAを有する形質転
換体を培養してHBV粒子の混在しないHBsAg、
preHBsAgならびにHBcAgを大量に生産する途
を開いた。 すなわち、本発明は、adr型HBsAg遺伝子ま
たはadr型preHBsAg遺伝子を含有するDNAとり
わけ組み換えDNAを提供するものである。 本発明のDNAとしては、第１図に示される塩
基配列またはその断片を有するものが好ましい。
第１図はHBV DNAの二重鎖全塩基配列を
EcoRIサイトから順番に示したものである。この
第１図においては、塩基配列順序155〜835として
示される塩基配列がHBsAg遺伝子の塩基配列で
あり、塩基配列順序2854〜3188〜１〜835（あるい
は2821〜3188〜１〜835）がpreHBsAg遺伝子の
塩基配列であり、塩基配列順序1874〜2425が
HBcAg遺伝子の塩基配列である。 他の観点における本発明DNAの好ましい態様
は、HBsAg遺伝子が第２図に示されるポリペプ
チドまたはそれと等価の免疫学的もしくは生物学
的活性を有するポリペプチドをコードするもので
あり、またHBcAg遺伝子が第３図に示されるポ
リペプチドまたはそれと等価の免疫学的もしくは
生物学的活性を有するポピペプチドをコードする
ものである。本発明のDNAは、これらのポリペ
プチドをコードしうるかぎり、HBsAg遺伝子と
して上記配列順序155〜835で示される塩基配列の
断片を有するものであつてもよく、またHBcAg
遺伝子として配列順序1874〜2425で示される塩基
配列の断片を有するものであつてもよい。 本発明のDNAはプロモーターの下流に連結さ
れていることが好ましい。かかるプロモーターと
しては、たとえばトリプトフアン（Trp）プロモ
ーター、ラクトース（Lac）プロモーター、蛋白
質鎖伸長因子Tu（tufB）プロモーターなどが挙げ
られ、とりわけtrpプロモーターが好適である。 本願明細書および図面で用いる記号の意義は第
１表に示すとおりである。
【表】
【表】
本発明のadr型HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝
子または（および）HBcAg遺伝子を含むDNA
は、たとえばadr型HBV DNAをクローニングす
ることによつて得ることができる。たとえば、第
４図に示すように、その一部に単鎖部分をもつ
adr型HBVのデン粒子DNAをDNAポリメラーゼ
反応により完全な二重鎖DNAとした後、制限酵
素BamHIにより切断する。一方、プラスミドと
してのpBR322DNAも同じ酵素BamHIで切断し、
両者をBamHI部位で結合させたもので大腸菌
（Eschericha cali）x1776株を形質転換させるこ
とによりadr型HBV DNAをもつ組み換えDNA
分子（pBR322−BamHI／HBr330）を分離する
ことができる。 次に、たとえばHBsAg遺伝子を含む組み換え
DNAを得るには、上記pBR322−BamHI／
HBr330を、第５図に示すように制限酵素TaqI消
化により断片化し、得られるDNA断片のうち
adr型HBsAg遺伝子を含有する約0.8キロ塩基対
（以下kbp）のDNAを分離し、これをpBR322の
ClaI部位に結合させたプラスミド（pBR322−
ClaI／HBr540）を得る。これで大腸菌x1776株
を形質転換させる。このようにして形質転換させ
たx1776／pBR322−ClaI／HBr540を培養するこ
とにより上記プラスミドを多量に得ることができ
る。当該プラスミドはadr型HBsAg遺伝子を含
むものであり、これからさらに分子量の小さな組
み換えDNAを得ることもできる。 同様にして制限酵素BamHIおよびEcoRIによ
つてHBcAg遺伝子を含む約1.8kbpのDNAを分離
し、pBR322に結合させた組み換えDNAを得る
ことができる。さらにpreHBsAg遺伝子について
も同様な操作が可能である。 以下に、本発明実施例に基づいてさらに具体的
に説明するが、当該実施例はなんら本発明を制限
するものではない。 実施例 １ adr型HBV DNAの調製 adr型HBV感染ヒト血清（東京都立駒込病院、
清水氏より入手）30mlを採取し、これをスピンコ
SW27 ローター（Beckman、U.S.A.）を使つ
て遠心（24000rpm、16時間、４℃）し、adr型
HBVを沈殿させた後、20ｍ Ｍ Tris−HCl（PH
7.6）30mlに懸濁した。次の同条件（SW27ロータ
ー、24000rpm、16時間、４℃）で遠心してHBV
を洗い、血清成分を除去しHBVを濃縮した。こ
の沈殿を２mlの20ｍ Ｍ Tirs−HCl（PH7.6）に
懸濁し、DNA合成反応に使用するまで−20℃で
貯蔵した。 上記した沈殿0.8mlを使用し、Kaplanらの方法
（文献２）に従い3H−dTTPを含む反応液〔160
ｍ Ｍ Tris−HCl（PH7.5）、40ｍ Ｍ MgCl2、
120ｍ Ｍ NH4Cl、0.3％２−メルカプトエタノ
ール、0.5％ノニデツトｐ−40、1.0ｍ Ｍ
dATP、dATP、dCTP、dGTP〕中で37℃で16
時間インキユベートしてHBV DNAの単鎖部分
を二重鎖にした（文献３）。その際、酸不溶性画
分への3H−dTTPの取り込みを指標にしてDNA
合成反応を確認した。得られた反応液を超遠心機
（ベツクマンL5−50；ローターSW55を使用）で
遠心（35000rpm、６時間、４℃）して、DNA合
成反応後のHBVを沈殿、採取し、１mlのDNA抽
出用緩衝液（0.02M Tris−HCl（PH7.6）、0.02M
EDTA、１％SDS、プロテイナーゼＫ（１mg／
ml））に懸濁し、37℃で16時間インキユベートし
た。次に0.01M Tris−HCl（PH7.6）、0.1M NaCl
および0.001M EDTAで飽和した１mlのフエノー
ルで２回除タンパク（文献４）を行い、水層部分
をとりこれに0.2M NaCl、2.5倍量の99％エタノ
ールを加えて、−20℃でHBV DNAを沈殿させ
た。 上記操作により、単鎖部分が修復された完全な
二重鎖adr型HBV DNAを得た。 実施例 ２ adr型HBV DNAのクローニング 上記実施例１によつて得た二重鎖adr型HBV
DNAを、DNA鎖の特定の部位を認識し単鎖の付
着端を生じてDNAを切断する制限酵素BamHIに
より、10ｍ Ｍ Tris−HCl（PH8.0）、７ｍ Ｍ
MgCl2、100ｍ Ｍ NaClおよび２ｍ Ｍ ２
−メルカプトエタノール、10.0μｇ／mlウシ血清
アルブミン存在下37℃で消化して、adr型HBV
DNABamHI断片を得た。一方、クローニングベ
クターには大腸菌のプラスミドpBR322（文献５）
を使用した。このプラスミドは環状DNAで、そ
の上にはテトラサイクリン耐性およびアンピシリ
ン耐性に関する二つの薬剤耐性遺伝子が存在す
る。また、このプラスミドDNAはBamHIにより
１ケ所切断されるが、BamHI切断箇所に他の
DNAを組み込んでもアンピシリン耐性は保存さ
れる。そこでpBR322DNAをBamHI消化して直
鎖状DNAとした後、5′末端のリン酸基をアルカ
リ性ホスフアターゼ処理により除去した（文献
６）。このようにして得たadr型HBA DNAおよ
びプラスミドDNAは各々両端にBamHI消化によ
り生じた単鎖の付着端を有する。これらのadr型
HBV DNA BamHI断片とpBR322BamHI断片
とを混合し、66ｍ Ｍ Tris−HCl（PH7.6）、6.6
ｍ Ｍ MgCl2、10ｍ Ｍ ジチオスライトール
および0.4ｍ Ｍ ATP存在下、14℃でT4DNA
リガーゼを使用させてDNAを結合させた。得ら
れた反応液中にはpBR322由来の直鎖状DNAと
adr型HBV DNAが各々の両端にもつBamHI付
着端の塩基の相補性により結合して生じた環状
DNAが得られる。この場合、pBR322DNAは
5′末端のリン酸が除去されているため
BR322DNA自信がT4DNAリガーゼにより結合
し、安定な環状DNAとなることはない。そこで、
70ｍ Ｍ MnCl2、30ｍ Ｍ CaCl2、40ｍ Ｍ
酢酸ナトリウムからなる溶液（PH5.6）により０
℃で20分間インキユベート（文献７）し、同じ溶
液100μに懸濁した大腸菌（Eschericha coli）
x1776株（ATCCNo.31244；文献８）〔細菌数約５
×108〕に上記で得た反応液5μを添加し、０℃
で60分間インキユベートした。次に、この大腸菌
を20μｇ／mlのアンピリシン、50μｇ／mlのチミ
ジンおよび20μｇ／mlのジアミノピメリン酸を含
むLB寒天培地（１当りバクトトリプトン10ｇ、
バクトイースト抽出物５ｇ、NaCl10ｇ、グルコ
ース0.8ｇを含む）上にまき、37℃で２日間培養
した。生じたアンピシリン耐性コロニー中、外来
性のDNAを組み込んだpBR322プラスミドをも
つ大腸菌は“つまようじ”法（文献９）により選
び出した。すなわち、つまようじに付着させてと
つたコロニーを100μの可溶化溶液（１％SDS、
10％グリセロール、0.02M EDTA、0.04％キシ
レンシアノール）に懸濁し、70℃、10分間熱処理
した後、１％アガロース電気泳動を行い、
pBR322より大きいプラスミドをもつコロニーを
選択、採取した。これによりadr型HBV DNAの
クローニングが完成した。 実施例 ３ クローニングされたadr型HBV DNAの性質 上記のようにしてクローニングされたadr型
HBV DNAの大きさをしらべるため、実施例２
で採取した組み換えDNAを有する大腸菌を20μ
ｇ／mlのアンピシリン、50μｇ／mlのチミジンお
よび20μｇ／mlのジアミノピメリン酸を含むLB培
地で増殖させ、対数増殖期に170μｇ／mlになる
ようにクロラムフエニルコールを加えて、数時間
培養をつづけ、プラスミドDNAの増幅をはかつ
た。次に、リゾチーム、EDTA、SDSを用いて
細菌をこわし、プラスミドDNAを分離し、塩化
セシウム密度勾配遠心法により精製した（文献
10）。得られたプラスミドDNAをBamHI消化す
ると、全て3.2kbpのDNAと4.3kbpのDNAとに分
かれた。4.3kbp DNAはベクターであるpBR322
のDNAであり、adr型HBV DNAとしては
3.2kbpのDNAがクローニングされたことになる。
このadr型HBV3.2kbp DNAを制限酵素EcoRIで
消化すると約1.8kbp DNAおよび1.4kbp DNAに
切断されることが判明した。上記のようにして得
たHBV3.2kbp DNAとpBR322DNAとの組み換
えDNAをもつ大腸菌x1776株を大腸菌x1776／
pBR322−BamHI／HBr330と名づけた。さら
に、上記の手法によつてpBR322−BamHI／
HBr330からTaqI処理によりHBV0.8kbp DNA
を、BamHIとEcoRI処理によりHBV1.8kbp
DNAをそれぞれ採取した。これらを実施例２に
記した方法と同じ方法により0.8kbp DNAの場合
はpBR322 DNAのClaI部位に組み込んで該DNA
断片をクローニングした。また、1.8kbp DNA断
片の場合はDNAポリメラーゼＩでEcoRIおよび
BamHI切断箇所の単鎖部分を二重鎖にし、これ
にBamHIリンカーを結合させた後、BamHI処理
し（文献11）pBR322のBamHI部位に組み込ん
で1.8kbp DNAをクローニングした。この場合
pBR322はClaIまたはBamHIによつて１ケ所切断
されるが、先に述べたBamHI切断部位と同じく、
この切断部位に他のDNA断片を挿入してもアン
ピシリン耐性は保存される。しかもBamHIある
いはClaIによる切断箇所はそれぞれテトラサイク
リン耐性遺伝子上およびテトラサイクリン耐性遺
伝子近傍に存在するので、pBR322 BamHI部位
あるいはClaI部位に他のDNAを組み込むと、こ
のプラスミドをもつ大腸菌の多くはアンピシリン
耐性、テトラサイクリン感受性の性質を示し、他
のDNAを組み込まないpBR322をもつ大腸菌
（アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性）と
容易に区別出来る。そこで大腸菌x1776を上記の
ようにして形質転換させて生じたコロニーの中か
らテトラサイクリン感受性のコロニーを選択し、
ついで“つまようじ”法（文献９）により外来性
のDNA（HBV DNA断片）を組み込んだpBR322
プラスミドをもつ大腸菌を選び出した（第５図参
照）。ここに得られたHBV0.8kbp DNAを組み込
んだpBR322をもつ大腸菌x1776株を大腸菌
x1776／pBR322−ClaI／HBr540、HBV1.8kbp
DNAを組み込んだpBR322をもつ大腸菌x1776株
を大腸菌x1776／pBR322−BamHI／HBr550と
それぞれ名付けた。 さらに、前記した大腸菌x1776／pBR322−
BamHI／HBr330から分離した組み換え
DNApBR322−BamHI／HBr330をBamHIで消
化してHBV DNAを切り出した。このDNAを制
限酵素TaqIで部分分解して１つのpreHBsAg遺
伝子（2854〜3188〜１〜835）を含むDNAを分離
した後、pBR322のClaIサイトに組み込み大腸菌
x1776を形質転換させた。得られた約1.3kbpの
preHBsAg DNAを含むpBR322を持つ大腸菌
x1776株を大腸菌x1776／pBR322−ClaI／
HBr560と名づけた。 実施例 ４ adr型HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝子、
HBcAg遺伝子の同定 実施例２および実施例３でクローニングされた
adr型HBV DNA上に存在すると考えられるadr
型HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝子、HBcAg遺
伝子の位置を確認するため、このDNAの全部の
塩基配列を決定した。まず大腸菌x1776／
pBR322−BamHI／HBr330株を実施例３に記し
た方法によりふやし、クロラムフエニコールを用
いてプラスミドDNAを増幅して、組み換えDNA
pBR322−BamHI／HBr330を抽出、精製した。
このDNAをBamHIで消化し、10％アガロースゲ
ル電気泳動法によりpBR322のDNAとHBV
DNAを分離して、3.2kbpのHBV DNAをアガロ
ースゲルより溶出した。 次にこの3.2kbpのDNAの塩基配列をベセスダ
リサーチラボラトリーズ（米国）のM13−チエイ
ン・ターミネイテイング・シーケンシング・シス
テムを用いて決定した（文献12、13、14）。その
概略は次の通りである。まず3.2kbp DNAを種々
の制限酵素で切断しフアージM13mp7RF DNA
（文献14）の制限酵素切断部位に組み込みクロー
ニングした後、大腸菌K12株由来のJM103株（文
献13）に感染させフアージ粒子して成熟させる。。
このフアージよりHBV DNA断片（二重鎖）の
一方のDNA鎖を組み込んだ単鎖のフアージDNA
を抽出、精製し、これを鋳型に、組み込まれた
DNA断片に隣接する塩基配列と相補的な塩基配
列をもつごつ短い単鎖DNAをプライマーに、そ
してdATP、dTTP、dGTPおよびdCTP（１〜４
種の基質を32Pでラベルしておく）を基質として
DNA合成を行う。この時適当な濃度のDNA合成
阻害剤である４種のddATP、ddTTP、ddGTP
あるいはddCTPを各々加えて反応させると、こ
れらがDNAにとり込まれた時点でDNA合成が停
止する。そこでDNA鎖を単鎖に分け、８％アク
リルアミドゲル電気泳動およびラジオオートグラ
フイーにより分析すると、合成されたDNAの長
さによりその3′末端の塩基が決定される。このよ
うにして決定されたHBV DNAの全塩基配列は
第１図に示すとおりであつた。この第１図では
HBV DNAの二重鎖塩基配列をEcoRIサイトか
ら順番に示している。この塩基配列順序の155番
目にadr型HBsAg遺伝子の翻訳開始コドンATG
のＡが、また1874番目にHBcAg遺伝子の翻訳開
始コドンATGのＡが、2854または2821番目に
preHBsAg遺伝子の翻訳開始コドンATGのＡ（文
献15参照）がそれぞれ見い出されている。すなわ
ち、HBV DNA塩基の塩基配列順序155〜835が
adr型HBsAg遺伝子、1874〜2425がadr型
HBcAg遺伝子、2854〜3188〜１〜835あるいは
2821〜3188〜１〜835がadr型preHBsAg遺伝子
である。この事実は、これらの遺伝子から翻訳さ
れるポピペプチドの分子量がそれぞれ約25000、
約19000と約43000であることを示している。 このようにしてHBV adr型のDNAの全塩基配
列が決定され、HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝
子、HBcAg遺伝子の位置が定められた。この
adr型HBV DNAの全塩基配列は従来報告されて
いるayw型および本発明者らの一部らが決定した
adw型の塩基配列と異なり、また塩基数も異なつ
ている。このadr型HBsAg遺伝子は当然ながら
ayw型およびadw型のHBVのHBsAg遺伝子とそ
の塩基配列が異なり、また第１図から明らかなよ
うに遺伝子内に介在配列をもたない。また
preHBsAg遺伝子、HBcAg遺伝子についても同
様である。このことは動物細胞内および微生物内
のいづれにおいても、そのまま転写され、メツセ
ンジヤーRNAとして形質発現しうることを意味
する。従つて、この遺伝子をそのままか、あるい
は適当なペクターに組み込み、これを例えばカル
シウム−燐酸法を用いて動物細胞たとえばヒト肝
臓細胞内へ導入することにより、その細胞内で
adr型HBsAgやHBcAgを合成することができ
る。 またこのadr型HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝
子、HBcAg遺伝子を適当なプロモーターと結合
し、プラスミドDNAに組み込んで大腸菌などの
微生物に導入した後、当該微生物を培養すること
により、HBVの感染性がないadr型HBsAg、
preHBsAgを安価に大量生産することができ、こ
のようにして得られるadr型HBsAgは従来の方
法で得られたadw型、awy型、adr型、HBsAgと
同様にＢ型肝炎ワクチンとして使用できる。 一般に構造遺伝子のみを採取するのは、種々の
制限酵素を用いても困難な場合が多い。しかし本
発明により得られたadr型HBsAg遺伝子は翻訳
開始コドンATGの前で制限酵素TaqIにより切断
されるので、プロモーターとの結合がきわめて容
易であるという特性を有するものである。 なお、adr型HBsAg遺伝子を微生物内で発現
させた場合、合成されるポリペプチドのアミノ酸
配列は、第２図に示されたアミノ酸配列からアミ
ノ末端あるいは（および）カルボキシル末端の若
干のアミノ酸が除去されたものであつてもよい。
また微生物内で合成されるHBsAgには、ヒト細
胞内で起りうるポリペプチドの翻訳後の修飾が見
られない場合もありうる。いずれの場合も、生成
されたポピペプチドがHBsAgと類似する抗原性
を有するかぎり、Ｂ型肝炎のワクチンとして使用
することができる。 またHBcAgをHBsAg陽性の血液中にあるデン
粒子から分離するには量的に困難である。本発明
によれば、遺伝子操作を利用して、HBcAgを大
量に製造することができる。 HBcAgの抗原性については、HBsAgの抗原性
の亜型（sud type）と関連してるかどうか確定
していないが、HBVの他の亜型の全塩基配列が
決定され、比較された時、その共通性もより明確
になると推定される。いづれにしても少なくとも
同一亜型のHBVに感染した場合には、抗HBs抗
体よりも抗HBc抗体の方が先に血中に出現する
（文献15）ので、抗HBc抗体をラジオイムノアツ
セイ法で検出することにより早期にHBVの感染
の有無を高感度で診断できる。 文 献 １ Intervirology ３：378−381（1974）． ２ J.Virol、12：995−1005（1973）． ３ Intervirology 10：254−264（1978）．４ J.
Virol23：368−376（1977）． ５ Gene ２：95−113（1977）． ６ Science 17：1313−1319（1979）． ７ J.Mol.Biol 96：495−509（1975）． ８ U.S.P. ４、190、495 ９ Science 195：393−394（1977）． 10 J.Bact.121：354−362（1975）． 11 Methods in Enzy mology 68：473−482
（1979）． 12 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463−5467
（1977）． 13 Nucleic Acids Res ８：1731−1743
（1980）． 14 Ｍ 13 cloning／“dideoxy”sequencing
manual published by BRL INC.、Maryland
Ｕ・Ｓ・A. 15 Science 213：406〜411（1981）． 16 Am.J.Med.Sci.270：179〜187（1975）．
子または（および）HBcAg遺伝子を含むDNA
は、たとえばadr型HBV DNAをクローニングす
ることによつて得ることができる。たとえば、第
４図に示すように、その一部に単鎖部分をもつ
adr型HBVのデン粒子DNAをDNAポリメラーゼ
反応により完全な二重鎖DNAとした後、制限酵
素BamHIにより切断する。一方、プラスミドと
してのpBR322DNAも同じ酵素BamHIで切断し、
両者をBamHI部位で結合させたもので大腸菌
（Eschericha cali）x1776株を形質転換させるこ
とによりadr型HBV DNAをもつ組み換えDNA
分子（pBR322−BamHI／HBr330）を分離する
ことができる。 次に、たとえばHBsAg遺伝子を含む組み換え
DNAを得るには、上記pBR322−BamHI／
HBr330を、第５図に示すように制限酵素TaqI消
化により断片化し、得られるDNA断片のうち
adr型HBsAg遺伝子を含有する約0.8キロ塩基対
（以下kbp）のDNAを分離し、これをpBR322の
ClaI部位に結合させたプラスミド（pBR322−
ClaI／HBr540）を得る。これで大腸菌x1776株
を形質転換させる。このようにして形質転換させ
たx1776／pBR322−ClaI／HBr540を培養するこ
とにより上記プラスミドを多量に得ることができ
る。当該プラスミドはadr型HBsAg遺伝子を含
むものであり、これからさらに分子量の小さな組
み換えDNAを得ることもできる。 同様にして制限酵素BamHIおよびEcoRIによ
つてHBcAg遺伝子を含む約1.8kbpのDNAを分離
し、pBR322に結合させた組み換えDNAを得る
ことができる。さらにpreHBsAg遺伝子について
も同様な操作が可能である。 以下に、本発明実施例に基づいてさらに具体的
に説明するが、当該実施例はなんら本発明を制限
するものではない。 実施例 １ adr型HBV DNAの調製 adr型HBV感染ヒト血清（東京都立駒込病院、
清水氏より入手）30mlを採取し、これをスピンコ
SW27 ローター（Beckman、U.S.A.）を使つ
て遠心（24000rpm、16時間、４℃）し、adr型
HBVを沈殿させた後、20ｍ Ｍ Tris−HCl（PH
7.6）30mlに懸濁した。次の同条件（SW27ロータ
ー、24000rpm、16時間、４℃）で遠心してHBV
を洗い、血清成分を除去しHBVを濃縮した。こ
の沈殿を２mlの20ｍ Ｍ Tirs−HCl（PH7.6）に
懸濁し、DNA合成反応に使用するまで−20℃で
貯蔵した。 上記した沈殿0.8mlを使用し、Kaplanらの方法
（文献２）に従い3H−dTTPを含む反応液〔160
ｍ Ｍ Tris−HCl（PH7.5）、40ｍ Ｍ MgCl2、
120ｍ Ｍ NH4Cl、0.3％２−メルカプトエタノ
ール、0.5％ノニデツトｐ−40、1.0ｍ Ｍ
dATP、dATP、dCTP、dGTP〕中で37℃で16
時間インキユベートしてHBV DNAの単鎖部分
を二重鎖にした（文献３）。その際、酸不溶性画
分への3H−dTTPの取り込みを指標にしてDNA
合成反応を確認した。得られた反応液を超遠心機
（ベツクマンL5−50；ローターSW55を使用）で
遠心（35000rpm、６時間、４℃）して、DNA合
成反応後のHBVを沈殿、採取し、１mlのDNA抽
出用緩衝液（0.02M Tris−HCl（PH7.6）、0.02M
EDTA、１％SDS、プロテイナーゼＫ（１mg／
ml））に懸濁し、37℃で16時間インキユベートし
た。次に0.01M Tris−HCl（PH7.6）、0.1M NaCl
および0.001M EDTAで飽和した１mlのフエノー
ルで２回除タンパク（文献４）を行い、水層部分
をとりこれに0.2M NaCl、2.5倍量の99％エタノ
ールを加えて、−20℃でHBV DNAを沈殿させ
た。 上記操作により、単鎖部分が修復された完全な
二重鎖adr型HBV DNAを得た。 実施例 ２ adr型HBV DNAのクローニング 上記実施例１によつて得た二重鎖adr型HBV
DNAを、DNA鎖の特定の部位を認識し単鎖の付
着端を生じてDNAを切断する制限酵素BamHIに
より、10ｍ Ｍ Tris−HCl（PH8.0）、７ｍ Ｍ
MgCl2、100ｍ Ｍ NaClおよび２ｍ Ｍ ２
−メルカプトエタノール、10.0μｇ／mlウシ血清
アルブミン存在下37℃で消化して、adr型HBV
DNABamHI断片を得た。一方、クローニングベ
クターには大腸菌のプラスミドpBR322（文献５）
を使用した。このプラスミドは環状DNAで、そ
の上にはテトラサイクリン耐性およびアンピシリ
ン耐性に関する二つの薬剤耐性遺伝子が存在す
る。また、このプラスミドDNAはBamHIにより
１ケ所切断されるが、BamHI切断箇所に他の
DNAを組み込んでもアンピシリン耐性は保存さ
れる。そこでpBR322DNAをBamHI消化して直
鎖状DNAとした後、5′末端のリン酸基をアルカ
リ性ホスフアターゼ処理により除去した（文献
６）。このようにして得たadr型HBA DNAおよ
びプラスミドDNAは各々両端にBamHI消化によ
り生じた単鎖の付着端を有する。これらのadr型
HBV DNA BamHI断片とpBR322BamHI断片
とを混合し、66ｍ Ｍ Tris−HCl（PH7.6）、6.6
ｍ Ｍ MgCl2、10ｍ Ｍ ジチオスライトール
および0.4ｍ Ｍ ATP存在下、14℃でT4DNA
リガーゼを使用させてDNAを結合させた。得ら
れた反応液中にはpBR322由来の直鎖状DNAと
adr型HBV DNAが各々の両端にもつBamHI付
着端の塩基の相補性により結合して生じた環状
DNAが得られる。この場合、pBR322DNAは
5′末端のリン酸が除去されているため
BR322DNA自信がT4DNAリガーゼにより結合
し、安定な環状DNAとなることはない。そこで、
70ｍ Ｍ MnCl2、30ｍ Ｍ CaCl2、40ｍ Ｍ
酢酸ナトリウムからなる溶液（PH5.6）により０
℃で20分間インキユベート（文献７）し、同じ溶
液100μに懸濁した大腸菌（Eschericha coli）
x1776株（ATCCNo.31244；文献８）〔細菌数約５
×108〕に上記で得た反応液5μを添加し、０℃
で60分間インキユベートした。次に、この大腸菌
を20μｇ／mlのアンピリシン、50μｇ／mlのチミ
ジンおよび20μｇ／mlのジアミノピメリン酸を含
むLB寒天培地（１当りバクトトリプトン10ｇ、
バクトイースト抽出物５ｇ、NaCl10ｇ、グルコ
ース0.8ｇを含む）上にまき、37℃で２日間培養
した。生じたアンピシリン耐性コロニー中、外来
性のDNAを組み込んだpBR322プラスミドをも
つ大腸菌は“つまようじ”法（文献９）により選
び出した。すなわち、つまようじに付着させてと
つたコロニーを100μの可溶化溶液（１％SDS、
10％グリセロール、0.02M EDTA、0.04％キシ
レンシアノール）に懸濁し、70℃、10分間熱処理
した後、１％アガロース電気泳動を行い、
pBR322より大きいプラスミドをもつコロニーを
選択、採取した。これによりadr型HBV DNAの
クローニングが完成した。 実施例 ３ クローニングされたadr型HBV DNAの性質 上記のようにしてクローニングされたadr型
HBV DNAの大きさをしらべるため、実施例２
で採取した組み換えDNAを有する大腸菌を20μ
ｇ／mlのアンピシリン、50μｇ／mlのチミジンお
よび20μｇ／mlのジアミノピメリン酸を含むLB培
地で増殖させ、対数増殖期に170μｇ／mlになる
ようにクロラムフエニルコールを加えて、数時間
培養をつづけ、プラスミドDNAの増幅をはかつ
た。次に、リゾチーム、EDTA、SDSを用いて
細菌をこわし、プラスミドDNAを分離し、塩化
セシウム密度勾配遠心法により精製した（文献
10）。得られたプラスミドDNAをBamHI消化す
ると、全て3.2kbpのDNAと4.3kbpのDNAとに分
かれた。4.3kbp DNAはベクターであるpBR322
のDNAであり、adr型HBV DNAとしては
3.2kbpのDNAがクローニングされたことになる。
このadr型HBV3.2kbp DNAを制限酵素EcoRIで
消化すると約1.8kbp DNAおよび1.4kbp DNAに
切断されることが判明した。上記のようにして得
たHBV3.2kbp DNAとpBR322DNAとの組み換
えDNAをもつ大腸菌x1776株を大腸菌x1776／
pBR322−BamHI／HBr330と名づけた。さら
に、上記の手法によつてpBR322−BamHI／
HBr330からTaqI処理によりHBV0.8kbp DNA
を、BamHIとEcoRI処理によりHBV1.8kbp
DNAをそれぞれ採取した。これらを実施例２に
記した方法と同じ方法により0.8kbp DNAの場合
はpBR322 DNAのClaI部位に組み込んで該DNA
断片をクローニングした。また、1.8kbp DNA断
片の場合はDNAポリメラーゼＩでEcoRIおよび
BamHI切断箇所の単鎖部分を二重鎖にし、これ
にBamHIリンカーを結合させた後、BamHI処理
し（文献11）pBR322のBamHI部位に組み込ん
で1.8kbp DNAをクローニングした。この場合
pBR322はClaIまたはBamHIによつて１ケ所切断
されるが、先に述べたBamHI切断部位と同じく、
この切断部位に他のDNA断片を挿入してもアン
ピシリン耐性は保存される。しかもBamHIある
いはClaIによる切断箇所はそれぞれテトラサイク
リン耐性遺伝子上およびテトラサイクリン耐性遺
伝子近傍に存在するので、pBR322 BamHI部位
あるいはClaI部位に他のDNAを組み込むと、こ
のプラスミドをもつ大腸菌の多くはアンピシリン
耐性、テトラサイクリン感受性の性質を示し、他
のDNAを組み込まないpBR322をもつ大腸菌
（アンピシリン耐性、テトラサイクリン耐性）と
容易に区別出来る。そこで大腸菌x1776を上記の
ようにして形質転換させて生じたコロニーの中か
らテトラサイクリン感受性のコロニーを選択し、
ついで“つまようじ”法（文献９）により外来性
のDNA（HBV DNA断片）を組み込んだpBR322
プラスミドをもつ大腸菌を選び出した（第５図参
照）。ここに得られたHBV0.8kbp DNAを組み込
んだpBR322をもつ大腸菌x1776株を大腸菌
x1776／pBR322−ClaI／HBr540、HBV1.8kbp
DNAを組み込んだpBR322をもつ大腸菌x1776株
を大腸菌x1776／pBR322−BamHI／HBr550と
それぞれ名付けた。 さらに、前記した大腸菌x1776／pBR322−
BamHI／HBr330から分離した組み換え
DNApBR322−BamHI／HBr330をBamHIで消
化してHBV DNAを切り出した。このDNAを制
限酵素TaqIで部分分解して１つのpreHBsAg遺
伝子（2854〜3188〜１〜835）を含むDNAを分離
した後、pBR322のClaIサイトに組み込み大腸菌
x1776を形質転換させた。得られた約1.3kbpの
preHBsAg DNAを含むpBR322を持つ大腸菌
x1776株を大腸菌x1776／pBR322−ClaI／
HBr560と名づけた。 実施例 ４ adr型HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝子、
HBcAg遺伝子の同定 実施例２および実施例３でクローニングされた
adr型HBV DNA上に存在すると考えられるadr
型HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝子、HBcAg遺
伝子の位置を確認するため、このDNAの全部の
塩基配列を決定した。まず大腸菌x1776／
pBR322−BamHI／HBr330株を実施例３に記し
た方法によりふやし、クロラムフエニコールを用
いてプラスミドDNAを増幅して、組み換えDNA
pBR322−BamHI／HBr330を抽出、精製した。
このDNAをBamHIで消化し、10％アガロースゲ
ル電気泳動法によりpBR322のDNAとHBV
DNAを分離して、3.2kbpのHBV DNAをアガロ
ースゲルより溶出した。 次にこの3.2kbpのDNAの塩基配列をベセスダ
リサーチラボラトリーズ（米国）のM13−チエイ
ン・ターミネイテイング・シーケンシング・シス
テムを用いて決定した（文献12、13、14）。その
概略は次の通りである。まず3.2kbp DNAを種々
の制限酵素で切断しフアージM13mp7RF DNA
（文献14）の制限酵素切断部位に組み込みクロー
ニングした後、大腸菌K12株由来のJM103株（文
献13）に感染させフアージ粒子して成熟させる。。
このフアージよりHBV DNA断片（二重鎖）の
一方のDNA鎖を組み込んだ単鎖のフアージDNA
を抽出、精製し、これを鋳型に、組み込まれた
DNA断片に隣接する塩基配列と相補的な塩基配
列をもつごつ短い単鎖DNAをプライマーに、そ
してdATP、dTTP、dGTPおよびdCTP（１〜４
種の基質を32Pでラベルしておく）を基質として
DNA合成を行う。この時適当な濃度のDNA合成
阻害剤である４種のddATP、ddTTP、ddGTP
あるいはddCTPを各々加えて反応させると、こ
れらがDNAにとり込まれた時点でDNA合成が停
止する。そこでDNA鎖を単鎖に分け、８％アク
リルアミドゲル電気泳動およびラジオオートグラ
フイーにより分析すると、合成されたDNAの長
さによりその3′末端の塩基が決定される。このよ
うにして決定されたHBV DNAの全塩基配列は
第１図に示すとおりであつた。この第１図では
HBV DNAの二重鎖塩基配列をEcoRIサイトか
ら順番に示している。この塩基配列順序の155番
目にadr型HBsAg遺伝子の翻訳開始コドンATG
のＡが、また1874番目にHBcAg遺伝子の翻訳開
始コドンATGのＡが、2854または2821番目に
preHBsAg遺伝子の翻訳開始コドンATGのＡ（文
献15参照）がそれぞれ見い出されている。すなわ
ち、HBV DNA塩基の塩基配列順序155〜835が
adr型HBsAg遺伝子、1874〜2425がadr型
HBcAg遺伝子、2854〜3188〜１〜835あるいは
2821〜3188〜１〜835がadr型preHBsAg遺伝子
である。この事実は、これらの遺伝子から翻訳さ
れるポピペプチドの分子量がそれぞれ約25000、
約19000と約43000であることを示している。 このようにしてHBV adr型のDNAの全塩基配
列が決定され、HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝
子、HBcAg遺伝子の位置が定められた。この
adr型HBV DNAの全塩基配列は従来報告されて
いるayw型および本発明者らの一部らが決定した
adw型の塩基配列と異なり、また塩基数も異なつ
ている。このadr型HBsAg遺伝子は当然ながら
ayw型およびadw型のHBVのHBsAg遺伝子とそ
の塩基配列が異なり、また第１図から明らかなよ
うに遺伝子内に介在配列をもたない。また
preHBsAg遺伝子、HBcAg遺伝子についても同
様である。このことは動物細胞内および微生物内
のいづれにおいても、そのまま転写され、メツセ
ンジヤーRNAとして形質発現しうることを意味
する。従つて、この遺伝子をそのままか、あるい
は適当なペクターに組み込み、これを例えばカル
シウム−燐酸法を用いて動物細胞たとえばヒト肝
臓細胞内へ導入することにより、その細胞内で
adr型HBsAgやHBcAgを合成することができ
る。 またこのadr型HBsAg遺伝子、preHBsAg遺伝
子、HBcAg遺伝子を適当なプロモーターと結合
し、プラスミドDNAに組み込んで大腸菌などの
微生物に導入した後、当該微生物を培養すること
により、HBVの感染性がないadr型HBsAg、
preHBsAgを安価に大量生産することができ、こ
のようにして得られるadr型HBsAgは従来の方
法で得られたadw型、awy型、adr型、HBsAgと
同様にＢ型肝炎ワクチンとして使用できる。 一般に構造遺伝子のみを採取するのは、種々の
制限酵素を用いても困難な場合が多い。しかし本
発明により得られたadr型HBsAg遺伝子は翻訳
開始コドンATGの前で制限酵素TaqIにより切断
されるので、プロモーターとの結合がきわめて容
易であるという特性を有するものである。 なお、adr型HBsAg遺伝子を微生物内で発現
させた場合、合成されるポリペプチドのアミノ酸
配列は、第２図に示されたアミノ酸配列からアミ
ノ末端あるいは（および）カルボキシル末端の若
干のアミノ酸が除去されたものであつてもよい。
また微生物内で合成されるHBsAgには、ヒト細
胞内で起りうるポリペプチドの翻訳後の修飾が見
られない場合もありうる。いずれの場合も、生成
されたポピペプチドがHBsAgと類似する抗原性
を有するかぎり、Ｂ型肝炎のワクチンとして使用
することができる。 またHBcAgをHBsAg陽性の血液中にあるデン
粒子から分離するには量的に困難である。本発明
によれば、遺伝子操作を利用して、HBcAgを大
量に製造することができる。 HBcAgの抗原性については、HBsAgの抗原性
の亜型（sud type）と関連してるかどうか確定
していないが、HBVの他の亜型の全塩基配列が
決定され、比較された時、その共通性もより明確
になると推定される。いづれにしても少なくとも
同一亜型のHBVに感染した場合には、抗HBs抗
体よりも抗HBc抗体の方が先に血中に出現する
（文献15）ので、抗HBc抗体をラジオイムノアツ
セイ法で検出することにより早期にHBVの感染
の有無を高感度で診断できる。 文 献 １ Intervirology ３：378−381（1974）． ２ J.Virol、12：995−1005（1973）． ３ Intervirology 10：254−264（1978）．４ J.
Virol23：368−376（1977）． ５ Gene ２：95−113（1977）． ６ Science 17：1313−1319（1979）． ７ J.Mol.Biol 96：495−509（1975）． ８ U.S.P. ４、190、495 ９ Science 195：393−394（1977）． 10 J.Bact.121：354−362（1975）． 11 Methods in Enzy mology 68：473−482
（1979）． 12 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74：5463−5467
（1977）． 13 Nucleic Acids Res ８：1731−1743
（1980）． 14 Ｍ 13 cloning／“dideoxy”sequencing
manual published by BRL INC.、Maryland
Ｕ・Ｓ・A. 15 Science 213：406〜411（1981）． 16 Am.J.Med.Sci.270：179〜187（1975）．
第１図は本発明の実施例によつて得られたadr
型HBV DNAの全塩基配列を示し、第２図は本
発明のadr型HBsAg遺伝子がコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列の一例を示し、第３図は本
発明のadr型HBcAg遺伝子がコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列の一例を示す。第４〜５図
は本発明の実施例の概略図である。
型HBV DNAの全塩基配列を示し、第２図は本
発明のadr型HBsAg遺伝子がコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列の一例を示し、第３図は本
発明のadr型HBcAg遺伝子がコードするポリペ
プチドのアミノ酸配列の一例を示す。第４〜５図
は本発明の実施例の概略図である。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 式 ATGGAGAACACAACATCAGGATTCCTAG
ＧＡＣＣＣＣＴＧＣＴＣＧＴＧＴＴＡＣＡＧＧＣＧＧＧ
ＧＴＴ
ＴＴＴＣＴＴＧＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡＣＡ
ＡＴＡ
ＣＣＡＣＡＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＴＣＧＴＧＧＴＧＧＡ
ＣＴＴ
ＣＴＣＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧＧＧＡＧＣＡＣＣ
ＣＡＣ
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ＣＡＴＴＴＡＡ で示されるadr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原構造
遺伝子または式 ATGGGGACGAATCTTTCTGTTCCCAATC
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ＧＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡ で示されるadr型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原前駆
体をコードする遺伝子を含有するDNA。 ２ 式 ATGGACATTGACCCGTATAAAGAATTT
ＧＧＡＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＡＧＴＴＡＣＴＣＴＣＴＴ
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ＴＣＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴＣＡＡＴＧＴＴＡＧ で示されるadr型Ｂ型肝炎ウイルスコア抗原構造
遺伝子を含有する特許請求の範囲第１項記載の
DNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18343282A JPS5974985A (ja) | 1982-10-19 | 1982-10-19 | 新規ｄｎａ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP18343282A JPS5974985A (ja) | 1982-10-19 | 1982-10-19 | 新規ｄｎａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5974985A JPS5974985A (ja) | 1984-04-27 |
| JPH0543352B2 true JPH0543352B2 (ja) | 1993-07-01 |
Family
ID=16135670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP18343282A Granted JPS5974985A (ja) | 1982-10-19 | 1982-10-19 | 新規ｄｎａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS5974985A (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| JPH089637B2 (ja) * | 1986-06-18 | 1996-01-31 | 財団法人阪大微生物病研究会 | Ｂ型肝炎ウイルス抗原とその製造法 |
| EP0299242A3 (en) * | 1987-06-22 | 1989-01-25 | Medico Labs Ag | Heterologous viral peptide particle immunogens |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JPS5931799A (ja) * | 1982-08-16 | 1984-02-20 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
| JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
-
1982
- 1982-10-19 JP JP18343282A patent/JPS5974985A/ja active Granted
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5931799A (ja) * | 1982-08-16 | 1984-02-20 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えプラスミド |
| JPS5936698A (ja) * | 1982-08-20 | 1984-02-28 | Science & Tech Agency | Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を組込んだ組換えｄｎａおよび形質転換動物細胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS5974985A (ja) | 1984-04-27 |
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