JPS5936699A - シヤトルベクタ− - Google Patents

シヤトルベクタ−

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JPS5936699A
JPS5936699A JP57145093A JP14509382A JPS5936699A JP S5936699 A JPS5936699 A JP S5936699A JP 57145093 A JP57145093 A JP 57145093A JP 14509382 A JP14509382 A JP 14509382A JP S5936699 A JPS5936699 A JP S5936699A
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yeast
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coli
dna
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Koji Miyanohara
厚司 宮之原
Akio Higashie
東江　昭夫
Kenichi Matsubara
謙一 松原
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Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
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Chemo Sero Therapeutic Research Institute Kaketsuken
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はシャトルベクター、さらに詳しくは酵母の遺伝
子と大腸菌の遺伝子とを含みがっ酵母の抑制性酸性ホス
ファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホスファター
ゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺伝子という
）を担ってなる酵母と大腸菌の両方で増殖しうるシャト
ルベクターに関する。
最近、遺伝子工学の研究が活発に行なわれており、各種
の絹換えＤＮＡ、さらにそれによる形質転換体の調製が
なされている。それら絹換えＤＮＡの調製に際しては、
特定の遺伝子を絹込むためのベクターが用いられるが、
そのようなベクターとしては、ある種の微生物、例えば
大腸菌でのみ増殖しうるベクターのほか、２種以」二の
微生物、例えば大腸菌と酵母、あるいは微生物（例えば
大腸菌）と動物細胞との双方で増殖しうるいわゆるシャ
トルベクターが用いられる。例えば、ごく最近において
、大腸菌と酵母の両方で増殖しうるシャトルベクターと
して、インターフェロンの酵母による産生に使用されて
いるアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨｌ）のプロモ
ーターを利用したものが報告されており、これにＢ型肝
炎つィルヌの表面抗原ｃ以下、ＨＢｓ抗原、ＨＢｓＡｇ
もしくは単にＳ抗原という）の蛋白をコードする遺伝子
を接続する方法が採用されている（　Ｎａｔｕｒｅ、　
２９８巻、３４７〜３５０頁（２２Ｊｕｌｙ、１９８２
）を参照）。しかしながら、この方法で用いられるシャ
トルベクターはＡＤＨｌプロモーターヲ担ったものであ
り、しかもそのＨＢｓ遺伝子を絹込んで得られる組換え
ＤＮＡを用いた形質転換体では産生されるｌ−ｌＢｓ蛋
白の昂が低い。
本発明者らは、各種の遺伝子を組込み、さらにそれを発
現させるための新しい大腸菌−酵母シャトルベクターを
得るべく種々研究を重ねた結果、大腸菌の遺伝子と酵母
の遺伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロ
モーターを担ったシャトルベクターが所望の特性を示し
、そのホスファターゼプロモーターの制御下に各種の遺
伝子を組込んで種々の組換えＤＮＡを調製し、さらにそ
の絹換えＤＮＡを酵母に作用させることによって種々の
形質転換酵母が得られることを見い出し、本発明を完成
するに至った。
すなわち、本発明は酵母の遺伝子と大腸菌の遺（３） 伝子を含みかつ酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモ
ーターを担ったシャトルベクターを提供するものである
。
本発明のシャトルベクターは、酵母と大腸菌の両方の遺
伝子に加えて酵母の抑制性酸性ホスファターゼプロモー
ターを有することを特徴とし、このプラヌミドベクター
は酵母と大腸菌との両方で増殖することができ、これを
用いて組換えＤＮＡ、さらに形質転換酵母を調製する場
合に、大腸菌を用いて絹換えプラスミドを調製し、これ
を酵母の形質転換に利用し、該形質転換酵母の増殖によ
って所望の遺伝子産物の量産を図ることができる。
なお、この場合、酵母の形質転換を行なう段階では大腸
菌の遺伝子は除去されてもかまわない。
本発明のシャトルベクターにおける酵母の遺伝子として
は、一般に、プラスミドが酵母中で染色体と独立して増
殖するのに必要なりＮＡ配列１例えば、酵母の自律増殖
に必要なりＮＡ配列（ａｒｓｌ）と２μｍ　Ｄ　Ｎ　Ａ
の複製に必要なりＮＡ配列（２μ０ｒｉ）があり、所望
により、さらに形質転換（４） 酵母の選択マーカーとなる遺伝子が含まれる。この選択
マーカーとしては、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産
生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺
阪子、アデニン産生遺伝子などが含まれ、これらの１種
または２種以上が用いられる。
大腸菌側の遺伝子としては大腸菌体内においてプラスミ
ドが増殖するために必要なりＮＡ配列、例えばＣｏ１Ｅ
ｌ：系のプラスミドの複製起点のＤＮＡ配列を有し、好
ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーとなる遺
伝子を含む。この選択マーカーの遺伝子としてはアンピ
シリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサ
イクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子
などが挙げられ、これらの遺伝子の１種または２種以上
が用いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてアンピシ
リン耐性遺伝子とテトラサイクリン産生遺伝子を有する
ｐＢＲ３２２が一般に汎用されている。
本発明で用いるシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホ
ヌファターゼプロモーターを担っていることが特徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペプチ
ド（Ｐ６０Ｉのプロモーターである。
このようなシャトルベクターの代表的な例は、酵母側の
遺伝子としてａｒｓ　ｌ、２μｏｒｉおよびロイシン耐
性遺伝子（Ｌｅｕ　２　）を有する酵母ＤＮＡと大腸菌
プラスミドＰＢＲ３２２とを糾合せたシャトルベクター
ｐＡＴ７７であり、これはつぎのようにして構築される
。
酵母５２８８ＣＤＮＡパンクより得られた抑制性酸性ホ
スファターゼを構成する６　０，０００　ｆルトンのポ
リペプチド（Ｐ２Ｏ）の遺伝子を含む約８０００ヌクレ
オチド対（８Ｋｂ）の制限酵素ＥＣ０ＲＩ断片（Ｐ　Ｎ
Ａ　Ｓ、７７巻、６５４１〜６５４５頁、１９８０およ
びＰＮＡＳ、７９巻、２１５７〜２１６１頁、１９８２
を参照）を公知の大腸菌プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２（
５ｕｔｃｌｉｆ［ｃ。
Ｊ、　Ｇ、　、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏ
ｒ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ。
４３巻、７７〜９０頁、１９７９を参照）のＥｃ。
ＲＩ　部位に挿入して得られるプラスミドを出発材料と
する。なおこの８ＫｂＤＮＡ断片は制限酵素５ａｌｌ：
（７）認識部位を約２．８Ｋｂと約５ＪＫｂに分ける位
置に１個所有し、２，３Ｋｂ側がＰＢＲ３２２のアンピ
リジン耐性遺伝子側になるように挿入されている。
このプラスミドを制限酵素Ｓａｌ　ｌ：で切断し、さら
にＴ４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３
２２の５ａｌｌ：部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断
片の５．２ｘｂ側を失なったプラスミドを得、これをｐ
　’ＡＴ　２５と称する。このＰ’ＡＴ２５はｐＢＲ３
２２のアンピシリン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲＩ部位か
らＳａｌ　ｌ：部位までの約８．７Ｋｂの断片と酵母の
酸性ホスファターゼ遺伝子のＥｃｏＲ：［部位からＳａ
ｌ　：［部位までの約２，３Ｋｂの断片がそれぞれ対応
する末端同士で結合したプラスミドである。
つぎに、上記ｐ　Ａ　Ｔ　２５のＥｃｏＲ■部位に、酵
母の自律増殖に必要なりＮＡ配列（ａｒｓ　１　）およ
（７） び酵母（７）Ｔｒｐｌ遺伝子を含む１．４ｘｂのＥｃｏ
Ｒ■断片（ＰＮＡＳ、７５巻、１０３５〜１０３９頁、
１９７９を参照）を挿入する。得られたプラスミドをＰ
ＡＴ２６と称する。なお、このａｒｓ　ｌ　−Ｔｒｐｌ
を含む断片は、そのＴｒｐｌ遺伝子遺伝側内酵素Ｈｉｎ
ｄ　ｌ［の認識部位を１個所有すゐ。
上記ｐ　Ａ　Ｔ　２６のＨｉｎｄ　ｌ［部位に酵母のロ
イシン産生遺伝子（Ｌｅｕ　２　）と２μｍＤＮＡの複
製に必要なりＮＡ配列（２μ０Ｔｉ）を含むＩ（ｉ　ｎ
　ｄ　Ｔｆｒ断片（Ｔｏｈｅ、ん、　Ｇｕｅｒｒｙ、　
Ｐ、　、　Ｗｉｃｈｅｎｅｒ、　Ｒ，’Ｂ、；Ｊ、　Ｂ
ａｃｈｔｅｒｉｏｌ、　１４Ｌ　　４１３〜４１６＋　
　１９８０を参照）を挿入する。このようにして得られ
るプラスミドがシャトルベクターｐＡＴ７７である。
このｐＡＴ７７およびのちに説明するようにそれｈ〉ら
誘導されるＰＡＭ８２の構造は第１図に示すとおりであ
って、太線部分は大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２由来の
遺伝子、残部は酵母菌の遺伝子である。すなわち、この
ｐＡＴ７７は、大腸菌の遺伝子としてｐＢＲ３２２のア
ンピシリン耐性（８） 遺伝子（Ａｐｒ）を含むＥｃｏＲｌ：部位からＳａｌ　
：［部位までを有し、一方酵母の遺伝子として、ｐＢＲ
３２２と結合したＥｃｏＲ工部位上部位ｒｓ　１．２μ
ｏｒｉ、　　Ｌｅｕ２遺伝子の順に位置し、さらにその
つぎに酸性ホスファターゼ遺伝子の上流からＳａｌ　ｌ
：部位までを有する。そしてそのＥｃｏＲ：［およびＳ
ａｌ：［部位でこれら大腸菌遺伝子と酵母遺伝子が結合
した構造となっている。このｐＡＴ７７は大腸菌内にお
いてはｐＢＲ３２２により増殖し、また酵母内において
はａｒｓｌおよび２μｏｒｉにより増殖可能となる。さ
らにこのプラスミドによる形質転換体の選択マーカーと
して大腸菌側にアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を、
酵母菌側にはロイシン産生遺伝子（Ｌｅｕ　２）を有し
ており、シャトルベクターとしての条件を充分に満たし
ている。
このシャトルベクターｐＡＴ７７の酸性ホスファターゼ
プロモーター付近の遺伝子地図は第２図に示すとおりで
あり、ここに示されるＢｓｔＥ■−８ａｌｌ：領域の塩
基配列は本発明者らにより決定されており、第３図に示
すような配列である。第２図および第３図示されるＡＴ
ＧコドンＣメチオニン）が酸性ホスファターゼの開始コ
ドンである。
つまり、このベクターの抑制性酸性ホスファターゼ遺伝
子断片Ｃ約２．８Ｋｂ）には、構造遺伝子の約２，７Ｋ
ｂ上流から構造遺伝子８２ヌクレオチド対（８２ｂＰ）
までが含まれる。
このようなシャトルベクターｐ　Ａ　Ｔ　７７を公知の
制限酵素５ａｌＩで処理して開裂させ、ついでこれをエ
キソヌクレアーゼＢＡＬ３１で処理することにより第２
図および第３図に示す酸性ホスファターゼ構造遺伝子の
一部または全部と所望によりさらにその上流の種々の部
分まで除去する。この除去は酸性ホスファターゼプロモ
ーター領域と思われるＴＡＴＡＴＡＡ　（Ｉ−１ｏｇｎ
ｅｓｓ　ｂｏｘ　）、すなわち−１００ｂｐの前までの
適当な部位まで行なわれ、エキソヌクレアーゼ処理条件
により適宜調節されるが、通常＋１〜−１ｏ　ｏ　ｂｐ
−好ましくは＋１〜−５０ｂｐまでである。この際、除
去が上流まで行きすぎると酸性ホスファターゼプロモー
ターの制御が困難となり、形質転換酵母菌の培ｒ　１　
１　） 養の際、所望の蛋白質などの収量が低下する。一方、除
去が不充分で酸性ホスファターゼ構造遺伝子が一部残存
すると産生される蛋白質などがホスファターゼペプチド
と合いの子となるため好ましくない。
上記のようにして酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部
または全部もしくはさらにその上流部分を除去したのち
、この部位に合成または天然のリンカ−１例えばＳａｌ
　ニリンカーまたはＸｈｏｌニリンカーを組込み再び環
状プラスミドに戻すことにより、酸性ホスファターゼプ
ロモーターの制御下に外来性遺伝子を純粋な形で発現さ
せ得るシャトルベクターが得られる。このシャトルベク
ターは、通常の制限酵素５ａｌｌ：またはＸｈｏ■で処
理することにより容易にその組込み部位を開裂させるこ
とができるため、所望の遺伝子を組込むのに好適である
。
上述のとおり、不発明のシャトルベクターはその酸性ホ
スファターゼプロモーターの下流に種々の遺伝子を組込
むことにより各種の絹換えプラスミドを調製することが
でき、それをさらに酵母に作用させて種々の形質転換酵
母が得られるため遺伝子工学の分野において広範囲の利
用が図れるものであって産業上利用価値がきわめて高い
。例えば、本発明のシャトルベクターにＨＢｓ遺伝子を
絹込んで得られる組換えプラスミドを酵母に作用させて
調製される形質転換酵母は、培養によって大量のＨＢｓ
抗原を産生ずることができ、しかもかかるＨＢｓ抗原は
免疫学的にヒト血清から得られるものと全く同一である
ため、Ｂ型肝炎つイルヌワクチンとして有用である。
つぎに実施例および参考例を挙げて本発明をさらに具体
的に説明する。
実施例 シャトルベクターｐＡＭ３１．８２．８３および８４の
調製 酵母５２８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制性酸性ホ
スファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリペ
プチド（Ｐ２Ｏ）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオチ
ド対（８Ｋｂ）の制限酵素（１２） ＥＣＯｋ■断片を大腸菌プラスミドｐ　Ｂ　Ｒ３２２の
ＥＣｏＲＩ部位に挿入して得られるプラスミドを出発材
料とし、これを制限酵素Ｓａｌ　工で切断し、さらにＴ
４ＤＮＡリガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３２２
の５ａｌＩ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の５
．２Ｋｂ側を失なったプラスミドｐＡＴ２５（これはｐ
ＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子を含むＥｃ、ｏＲ
：［部位からＳａｌ　１部位までの約３．７Ｋｂの断片
と酵母菌の酸性ホスファターゼ遺伝子のＥｃｏＲＩ部位
からＳａｌ　Ｉ部位までの約２．８Ｋｂの断片がそれぞ
れ対応する末端同士で結合したプラスミドである）を得
る。
つぎに、このｐ　Ａ　Ｔ　２５のＥｃｏＲ］：部位に、
プラスミドＹＲＰ７をＥｃｏＲ１処理することによって
得られるａｒｓ　ｌおよびＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４
ＫｂのＥｃｏＲ工断片を挿入してプラスミドｐ　Ａ　Ｔ
２Ｃを得る（このａｒｓ　１．−　Ｔｒｐ　１を含む断
片は、そのＴｒｐｌ遺伝子内に制限酵素Ｈｉ　ｎ　ｄ　
ｌ［の認識部位を１個有する）。
上記Ｐ　Ａ　Ｔ　２６　ノＨｉ　ｎｄＮ部位に、プラ７
ミドｐｓＬＥｌをＨｉ　ｎ　ｄ　ｌｌ［で処理して得ら
れる酵母のＬｅｕ２および２　ｔｔ　ｏｒｉを含むＨｉ
　ｎ　ｄ　’ｆＪＪ断片を挿入してシャトルベクターｐ
ＡＴ７７を得る。
上記の方法で得られたｐＡＴ７７（１μｇ）をＳａｌ　
ｌで開裂したのち、２０ｍＭ）すｙ、　−Ｔ−ＩＣＪ　
（ＰＨ８，２）、１２ｍＭ　ＣａＣ／２、］２２ｍＭＭ
ｇＣ１２０，２Ｍ　ＮａＣ１，１ｍＭＥＤＴＡ溶液５０
μｌ中で０．ＩＵのエキソヌクレアーゼＢＡＩ、３１を
３０秒〜１分間作用させる。ついでフェノール抽出、エ
タノール沈殿を行なったのち、Ｘｈ　ｏ　：［リンカ−
１ｐｍｏｌとＴ４ＤＮＡリガーゼの反応条件下で１２時
間結合を行なう。この反応溶液で大腸菌Ｘ１７７６を形
質転換し、得られたアンピシリン耐性の形質転換体より
プラスミドＤＮＡを調製し、各ＤＮＡについてマキサム
−ギルバートの方法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、　ｋ　Ｇ１１
ｂｅｒｔ、　Ｗ、　；　ｐｒｏ、　Ｎ。
Ａ、Ｓ、、７４，５６０〜５６４を参照）に従い、塩基
配列を調べ、ＢＡＬ３１処理により除去された酸性ホス
ファターゼ遺伝子領域を決定する。これら中からホスフ
ァターゼ構造遺伝子領域が完全（１５） ｐ　Ａ　Ｍ　３３およびｐ　Ａ　Ｍ　８４を得る。
ホスファターゼ構造遺伝子の産物Ｐ６０の最初のアミノ
酸であるメチオニンをコードするコドンＡＴＧのＡを＋
１として、］）ＡＭ８１は＋２まで、ＰＡＭ８２は−３
３まで、ｐＡＭ８３は−５０まで、ｐ　Ａ　Ｍ　８４は
−５１まで、それぞれ除去されたものである。
なお、こＯＪＰＡＭ８２をサツカロミセス・セレビシェ
ＡＨ２２に組込んだものは、サツカロミセス・セレビシ
ェＡＨ２２／ｐＡＭ８２　（微工研菌寄第６６６８号）
として寄託している。
つぎに、」二記の方法で得られたシャトルベクター　ｐ
　Ａ　Ｍ　８２　ヲ用イ、これにＨＢｖＤＮＡを組込む
場合を参考例として示す。
参考例 （］）ＨＢＶＤＮＡの調製 （１）ウイルヌＤＮＡの調製 ＨＢｓＡｇ陽性かつＨＢｅＡｇ陽性の供血者Ｃ血清型ａ
ｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７００ｒ　１８
　） −を５．ＱＱＱｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を
除去する。これを４℃にて１８，０００　ｒｐｍで８時
間遠心分離し、得られた沈査を緩衝液（１０ｍＭ）　Ｉ
Ｊ　７−ＨＣＩ　　、Ｑ、１Ｍ　ＮａＣ／、１　ｍＭ　
ＥＤＴＡ；ＰＨ７，５）１０露ｌに再溶解させ、３０％
の蔗糖を含有する遠沈管の頂部に重層させる。これを４
℃にて３９．００　Ｏｒｐｍで４時間遠心分離し、得ら
れた沈査を上記と同じ緩衝液に再溶解させる。
ついで、のちの操作を容易にするために、ＨＢＶのもつ
ＤＮＡポリメラーゼによる反応を、５７ｍＭトリｙ、−
ＨＣｌ　　ＣｐＨ７，５）、８０ｍＭ　　ＮＨａＣｌ。
２５　ｍ　Ｍ　ＭｇＣ１２，０，５％　（ｗ／ｖ％、以
下同じ）タージトールＮＰ−４Ｑ、０、ｌチ２−メルカ
プトエタノール、３３０μＭのｄｃＴＰ（デオキシシチ
ジントリホヌフエート）、　ｄＣ，ＴＰ　（デオキシグ
アノシントリホスフェ−））、ｄＡＴＰ　（デオキシア
デノシントリホスフェ−））、０．５μＭα−（Ｐ）ｄ
ＴＴＰ　（デオキシチアミントリホスフェート）の混合
液５００μ！中で３７℃にて３０分間行なう。これにさ
らにｄＴＴＰを最終濃度３３０μｉになるように加え、
３７℃で３時間反応させ、これに同容量の１００ｍＭＥ
ＤＴＡ溶液を加える。このＤＮＡポリメラーゼ反応によ
り、ＤＮＡ中の一本鎖部分が修複され、〔Ｐ〕ラベル化
された材料をえ、これを蔗糖の３０係、２゜チおよび１
０％水溶液を段階的に重層した遠心管の頂部に重層し、
４℃にて３９．００　Ｏｒｐｍで４．５時間遠心分離す
る。
ついでＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られた沈査を１　ｔｑ　／　ｍｌプロナー
ゼＥおよび０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２
００μｌ中で３７℃にて２時間処理したのち、ＤＮＡを
フェノール２００μｌで２回抽出し、ついでエーテルで
振ってフェノール溶媒を除去するとＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　
Ａ溶液を得る。このＤＮＡは２．５ＸＩ　Ｑ　　ｃｐｍ
／μｇの比放射活性を示し、制限酵素消化に充分使用し
得る。
（１０ＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａのクローン化前記の方法で
調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、下記のように
してまずλファージシャロｙ１５ＡＤＮＡをベクターと
してクローン化し、さらに公知のプラスミドｐＡｃＹｃ
１７７をベクターとして再クローン化を行なう。
（〜λファージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系による
クローン化： ＨＢＶＤＮＡ２Ｑｎｇを１０ｍＭ）すｙ、　−ＨＣＡ（
ｐＨ７，４）、７ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１０　ＱｍＭＮａ
Ｃ／、７ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液２０μｌ
中にて制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌ：により３７℃
にて２時間処理したのち、フェノール２００μノにて抽
出し、抽出液をエーテルで洗浄し、その水層に２倍容量
の冷エタノールを加えてＤＮＡを沈殿させる。この混液
を一７０℃で１時間保持したのち１０．００　Ｏｒｐｍ
にて５分間遠心分離して沈殿するＤＮＡを回収する。分
離した沈査を１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　　（ｐＨ７，４
）および１ｍ　Ｍ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａの混液５μｌに溶解
させる。ついで、このＨＢＶＤＮＡと等モル量の前記と
同様にして制限酵素Ｘｈｏ■により開裂されたλファー
ジシャロン］　５ＡＤＮＡ　（ＸｈｏＩ認識部位を１個
所有す（１９） る）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（５０ｍＭ）リス−１−Ｉ
Ｃ／　　（ｐＨ７，４）、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１．
　ＱｍＭジチオフレイトール、１００μＱ／ｍｌ牛血清
アルブミン、（１５ｍ　Ｍ　Ａ　Ｔ　Ｐおよび０．５μ
Ｊ酵素調製物との混液）１０μｌを用いて４℃で１８時
間反応させ、この反応混合液を前記と同様にしてフェノ
ール抽出、エーテル処理およびエタノール沈殿に伺し、
得られた沈査を１０ｍＭ）リス−ＨＣｌ　ＣＰｌ’１７
．４　）および１ｍＭＥＤＴＡ混液］　Ｏｐｉ　中に溶
解させる。
上記のようにしてアニールさせたＤＮＡより、ｉｎ　ｖ
ｉｔｒｏパッケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥ
ｎｚ　ｙｍｏｌ　ｏｇｙ、６８巻、２９９〜３０９を参
照）によりλファージを形成させ、さら４こ大腸菌ＤＰ
５０ＳｕｐＦを指示菌としてＬ−寒天平板（２３ｃｎｒ
×２３ｔ７１１）上に〜１０　　個のプラークを形成さ
せる。これらのプラークのうちからＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　
Ａを維持しているファージにより形成されたプラークを
選び出すために、前記で調製した８２Ｐ−ラベルされた
ＨＢＶＤＮＡをプローブとしてプラークハ（２０） イブリダイゼーションを行ない（５ｃｉｅｎｃｅ　、　
１９６巻、１８０頁、１９７７を参照）、目的とするフ
ァージを複数分離する。
（至）プラスミドｐＡｃＹｃ１７７をベクターとした再
クローン化： 上記（へ）で得られたＨ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａを保持す
るファージについて「生化学実験横座、核酸の化学■」
５４〜６５頁に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５Ｑ
−８ＵＰＦを感染菌としてファージＤＮＡを調製する。
得られたＤＮＡを前記の制限酵素ｘｈＯ■の反応条件下
で２時間消化したのち、この反応液を０．７５％アガロ
ーヌゲル電気泳動にかけ、分離した３、２Ｋｂ　（７）
ＨＢＶＤＮＡをＤＥＡＥ紙（東洋沖紙製）に吸着させて
ベクターＤＮＡと分離し、ついでＩ　Ｍ　ＮａＣ／　　
溶液にて溶出し、両端がＸｈｏ　ｌ：末端となったＨＢ
ＶＤＮＡを得る。
つぎにプラスミドｐ　ＡＣＹ　Ｃ１７７ＣＣｈａｎｇ。
ＡＣ，Ｙ、　、　Ｇｏｈｅｎ、　Ｓ、Ｎ、　、　Ｊ、　
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１３４゜１１４１〜１１５
６　（１９７８））にのものはＸｈｏｌ切断部位を１個
所有し、それはカナマイシン耐性遺伝子の中に存在する
）を同様にＸｈｏｌにて消化し、その生成物をフェノー
ル抽出、エーテル処理およびエタノール沈殿により精製
する。ついで、Ｘｈｏ工開裂されたｐ　Ａ　ＣＹ　Ｃ１
７７とＸｈ　ｏ　■末端−ＨＢＶＤＮＡとを分子比１：
５で混合し、前記Ｔ４ＤＮＡＩＪガーゼの反応条件下に
１８時間アニールさせる。
大腸菌ｘ１７７６の培養液を高木康敬編著「遺伝子操作
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０．
１　ｍｌに、上記アニールされたＤＮＡ調製物１０μｌ
を加えてよく混合させ、０℃で２５分間放置したのち、
アンピシリンＣ２０μＩ／ｓｌ’Ｊ、α−ビオチン【１
μＩＩ／ｗｌ）、　　ジアミノピメリン酸（１００１１
１７ｍ１）、　チシンＣ２０１１１／ｍｅ）を含有する
し一寒天プレート上に塗沫して３７℃で一夜培養する。
出現したコロニーについて、カナマイシン（２０μＩ／
ｍｌ）を含む寒天プレートとアンピシリン（２０μｆ　
／ｍｌ　）を含む寒天プレートにそれぞれ対応させて塗
沫し、アンピシリンを含むプレートでのみ増殖したコロ
ニーを選択する。ＰＡＣＹＣ１７７はアンピシリン耐性
遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を有するが、カナマイ
シン耐性遺伝子中にあるＸｈＯＩ部位にＨＢ　Ｖ　Ｄ　
Ｎ　Ａが挿入されることによりカナマイシン耐性が消失
される。
すなわち選択されたコロニーはｐＡｃＹｃ１７７−　Ｈ
Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａの絹換えＤＮＡを保持している。
（Ｆ）１６れたコロニー数個について、「代謝」第１７
巻、第４「リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０）に記
載される方法に従いプラスミドを調製する。
得られたプラスミドをｐ　ＨＢ　Ｖと称す。このｐ　Ｉ
−ＩＢＶを制限酵素ＸｈＯ■で処理すると３，２Ｋｂの
全ＨＢＶＤＮＡフラグメントが得られ、またＸｈｏ：［
とＢａｍＨＩで処理するとＨＢｓＡｇ遺伝子を含む約１
．３ｘｂのフラグメントが得られる。
（２）　ＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子発現プラヌミドの調製
（ｉ）ＨＢｓ遺伝子全体が組込まれたプラスミドの調製 プラスミドｐ　ＨＢ　ＶをＸｈｏｌで処理して得られる
Ｈ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａと−ＸｈｏＩで開裂されたシャ
トルベクターＰＡＭ８２を分子比５：１にてＴ４ＤＮＩ
Ｑ　　Ｑ　　） Ａリガーゼによりアニールさせたのち、この反応溶液で
大腸菌Ｘ１７７６を形質転換する。得られたアンピシリ
ン耐性の形質転換体よりプラスミドＴ）ＮＡを調製し、
これらについて制限酵素Ｘｈｏｌ：、Ｘｈｏｌ、Ｉ−Ｔ
　ｉ　ｎ　ｄ　ｌ［で分析することにより、ベクターへ
のＨＢＶＤＮＡの組込みおよびその方向を確認する。
選び出されたプラスミドはベクターのホスファターゼプ
ロモーターの下流にＨＢＶＤＮＡがＨＢＳ遺伝子、ＨＢ
　ｃ遺伝子の順に並ぶ向きに挿入されたものであり、こ
れらがＨＢｓＡｇ遺伝子発現プラスミドであって、この
ものをＰＡＨ２０３と称する。
（Ｉｆ）　ＨＢ　Ｓ　Ａ　ｇ遺伝子フラグメントが組込
まれたプラスミドの調製 プラスミドｐ　Ｉ−Ｉ　Ｂ　ＶをＢａｍＨ］：で処理し
て切断し、そのＨＢ　ｓ　Ａ　ｇ遺伝子フラグメント３
μｇに対し、２００μＭのαＡＴＰ、αＣＴＰ、αＴＴ
ＰおよびαＧＴＰを含む６７ｍＭ）すｙ、−ＭＣＩ（Ｐ
Ｈ８，６）、　６．７　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ！２．１０ｍ
Ｍ２−メルカプトエタノール、６．７μＭＥＤＴＡ、１
６．７ｍ　Ｍ　Ａ　ｍ　ＳＯ４溶液１００　ｔｌｌ中で
、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ０．２　Ｕを３０分間作用さ
せ、ＢａｍＨ：［切断末端を埋める。ついでフェノール
抽出、エタノール沈殿を行なったのち、これとＸｈｏｉ
リンカ−とを１：１０の分子比でＴ４ＤＮＡリガーゼに
よる結合反応を行なう。フェノール抽出、エタノール沈
殿ののち、これをさらにＸｈｏｌ：で処理すると両端が
ＸｈＯ工切断末端となった約１．３ｘｂのＨＢｓＡｇ遺
伝子フラグメントが得られる。このフラグメントとＸｈ
ｏｌで開裂されたシャトルベクター　ｐ　Ａ　Ｍ　ｇ　
２とを分子比５：１にてＴ４ＤＮＡリガーゼによりアニ
ールさせたのち、前記（１）と同様にして大腸菌Ｘ１７
７６を形質転換してプラスミドＤＮＡを調製する。得ら
れたプラスミドは、ベクターＰＡＭ８２のホスファター
ゼプロモーターの下流にＨＢｓＡｇ遺伝子が正しい向き
に挿入されたものであり、これをｐＡｓｌｏｌと称する
。
（３）形質転換酵母の調製 酵母としてサツ力ロミセヌ・セレビシェＡＨ２２（２４
） ［ａ　　１ｅｕＱ　　ｈｉｓ４　　ｃａｎｌ　（Ｃｉｒ
　　）〕Ｃ微工研菌寄第６６６７号）を用い、これをＹ
ＰＤ培地（２％ポリペプトン、１％イーストエキス、２
チグルコーヌ）１０（１＋／に接種し、３０℃で一晩培
養したのち、遠心して集菌する。滅菌水２０ｔｓｌにて
菌体を洗浄し、ついで１，２Ｍソルビトールおよび１０
０μｌ１ｍ１チモリアーゼ６０．００Ｏｒ生化学工業製
）の溶液５ｇ／に懸濁させ、３０℃で約３０分間保ち、
ヌフエロプラスト化する。ついで、スフェロプラストを
１．２Ｍソルビトール溶液で３回洗浄したのち、２Ｍソ
ルビトール、１９ｍＭＣａＣ１２および１０ｍＭ）す７
．−　ＨＯ２（ｐＨ７゜５）の溶液０．６　ｗｅに懸濁
させ、その６０μｌずっを小試験管に分注する。これに
前記（３）で調製した組換えプラスミドｐＡＨ２０３溶
液３０μｌを加え、充分混合し、さら４ＣＯ，Ｉ　ＭＣ
ａＣ／２　（３ｔｌｌ　）を加えて最終濃度Ｉ　Ｑ　ｍ
ＭＣａ（Ｊ２とし、室温に５〜１０分間放置する。つい
でこれに、２０％ポリエチレングリコール４０００、Ｉ
　Ｑ　ｍ　Ｍ　ＣａＣｌ２および１０ｍＭ）すｙ、−Ｈ
Ｃｌ　　（ｐＨ７，５）溶液１　ｍｌずつを加えて混合
し、室温に約２０分間放置する。この混合液０．２　ｍ
ｅずつを４５℃に保温された再生培地（２２チンルビト
ール、２係グルコース、０．７％イーストニトロゲンベ
ーヌアミノ酸、２係ＹＰＩ）、２ＱμＩ／Ｗｌｔヒヌチ
ジン、３％寒天）１０耐に加え、軽く混合させ、予め準
備された１゜２Ｍソルビトール含有最小培地（０，７％
イーストニトロゲンベースアミノ酸、２％グルコース、
２０μＩ／ｌｓｌヒスチジン、２％寒天）プレートに重
層し、固化させたのち、３０℃で培養してロイシン非要
求性酵母のコロニーを得る。このコロニーを２０μｆｌ
／ｍｌヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメデイ
ウＡ　（Ｔｏｈｅ、　Ａ、　ｅｔ　ａＪＨＪ、　Ｂａｃ
ｈｔｅｒｏｌ、。
１１３．７２７〜７３８　（１９７３）を参照〕にて培
養して形質転換酵母サツカロミセス・セレビシェｐＡＨ
２０３を得る。
上記の方法において、絹換えプラスミドｐ　Ａ　Ｈ２Ｏ
３の代りにｐＡｓ１０］を用いてサツカロミセス・セレ
ビシェｐ　Ａ　Ｓ　１０１　ヲｅル。
（４）形質転換酵母によるＨＢｓＡｇの製法ｒ９り） さらに２０μｆ／ｌｓｌヒスチジンを含むバルクホルダ
ーミニマルメデイウムの寒天プレート上に塗布し、３０
℃にて培養してコロニーを形成させる（ロイシン非要求
性となった形質転換体の再確認のため）。ついでこのコ
ロニーから菌体を分離し、２０μｇ／耐ヒヌチジンを含
むバルクホルダーミニマルメデイウム１（１＋ｌに接種
し、３０℃にて培養を行なう。約２４時間後、対数増殖
期にある菌体を遠心して集菌し、これをリン酸を含まな
い最小培地（バルクホルダーミニマルメデイウムに含ま
れるＫＨ２ＰＯ４をＫＣｌ　で置換し、さらに２０μｇ
／ゴヒスチジンを加えたもの）１（１＋／に菌数約４×
１０ｃｅｌｌｓ／１１になるように懸濁し、３０℃にて
約２４時間培養を続けたのち、４，０００回転、１０分
間の遠心により菌体を集める。この菌体を１．２Ｍソル
ビトール、５ＱｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）、１４
ｍＭ２−メルカプトエタノール、１００μｇ／屑ｌザイ
モリエース６０，０００の溶液３ｍｌに懸濁させ、３０
℃にて３０分間ゆるやかに振盪ｒ９Ｑ　） してスフェロプラスト化し、遠心分離によりこれを集め
る。このスフエロプラヌトを０．１チドリトンＸ−１０
０，５９ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）１ａｌに充分
懸濁し、数回激しく攪拌し、７０００回転にて１０分間
遠心して得られる上清液を酵母溶菌液としてとる。
この溶菌液２０μｌをＨＢｓ抗原ＲＩＡキット〔アボッ
ト社製）によりＨＢｓ抗原活性を測定した。
その結果を第１表に示す。
第１表 ■　このベクターはＨＢＶまたはＨＢｓ遺伝子を含んで
いない陰性対照である。
Ｃなお、ＲＩＡ測定キットの陰性コントロールは３１０
　Ｃｐｍ、陽性コントロールは７゜５００ＣＰｍであっ
た）
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明のシャトルベクターの具体例、ＰＡＴ７
７およびＰＡＭ８２の構造、第２図は該シャトルベクタ
ーの酸性ホスファターゼプロモーター付近の遺伝子地図
、第３図はそのＢｓｔＥｌｌ−３ａｌ　■領域の塩基配
列を示す。

Claims (8)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母
    の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域を担って
    いることを特徴とするシャトルベクター　〇
  2. （２）該抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域が
    ホスファターゼを構成する６０，０００ダルトンのポリ
    ペプチド（Ｐ２Ｏ）の形質発現調節領域であり、そのＰ
    ２Ｏの構造遺伝子の一部または全部もしくはさらにその
    上流の種々の部位までが除去されている前記第（１）項
    のシャトルベクター。
  3. （３）酵母の遺伝子がａｒｓ　１および２μｏｒｉであ
    る前記第（１）項のシャトルベクター。
  4. （４）酵母の遺伝子としてａｒｓ　１．２μｏｒｉなら
    びに形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子を有する
    前記第（１）項のシャトルベクター。
  5. （５）該選択マーカーとなる遺伝子がロイシン産生遺伝
    子、ヒヌチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子
    、ウラシル産生遺伝子およびアデニン産生遺伝子から選
    ばれる１種または２種以上である前記第（４）項のシャ
    トルベクター。
  6. （６）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
    ために必要なりＮＡ配列である前記第（１）項のシャト
    ルベクター。
  7. （７）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
    ために必要なりＮＡ配列ならびに形質転換大腸菌の選択
    マーカーとなる遺伝子である前記第（１）項のシャトル
    ベクター。
  8. （８）該選択マーカーとなる遺伝子が、アンピシリン耐
    性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン
    耐性ａ伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子から
    選ばれる１種または２゛種以上でアル前記第（７）項の
    シャトルベクター。
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