JPS6291196A

JPS6291196A - Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の製法

Info

Publication number: JPS6291196A
Application number: JP10743486A
Authority: JP
Inventors: Koji Miyanohara; 厚司宮之原; Chikahide Nozaki; 周英野崎; Fukusaburo Hamada; 福三郎濱田; Akio Toe; 東江　昭夫; Shinya Otomo; 信也大友; Kenichi Matsubara; 謙一松原
Original assignee: Science & Tech Agency; Agency of Industrial Science and Technology
Current assignee: Science & Tech Agency; National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 1986-05-10
Filing date: 1986-05-10
Publication date: 1987-04-25
Also published as: JPH0352960B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、Ｂ型肝炎ウィルスの遺伝子を組込んだ組換え
プラスミ゛トにより形質転換を行なった酵母を用いたＢ
型肝炎ウィルス表面抗原の製法に関する。さろに詳しく
は、大腸菌および酵母の両方で増殖しうる、いわゆるシ
ャトルベクターを用い、そのベクターに担われた抑制性
酸性ホスファターゼ形質発現調節領域（以下、酸性ホス
ファターゼプロモーターまたは酸性ホスファターゼ遺伝
子という）の下流に、Ｂ型肝炎ウィルス（以下、ＨＢＶ
と略す）の表面抗原（以下、ＨＢｓ抗原またはＨＢｓＡ
ｇという。単にＳ抗原と略すこともある）の遺伝子を組
込んだ組換えプラスミドを得、これを酵母に与えて形質
転換を起こさせて形質転換酵母とし、この酵母を酸性ホ
スファターゼプロモーターが抑制されない条件下に培養
させて産生される免疫学的に活性なＨＢｓ抗原（ＨＢｓ
Ａｇ）を得る方法である。

Ｂ型ウィルス肝炎は、ＨＢＶ陽性者の血液の輸血その他
の原因によって感染する疾患であって、完全な治療薬が
なく、一度罹患するとその完全治癒が困難であり、その
予防には、ＨＢｓＡｇからなるワクチンが最も有効であ
ると考えられている。

しかしながら、ＨＢＶはヒトやチンパンジーにのみ感染
し、培養細胞への感染の試みは成功していない。このよ
うなＨＢＶの特殊性により、そのようなＨＢｓＡｇは主
として人血清に求めざるを得ない。そのため、ＨＢｓＡ
ｇワクチンの量産に問題がある。

最近、ＨＢｓＡｇをヒト血清によらず、組換えＤＮＡを
用いて大腸菌に作らせろことが提案されているが（例え
ば特開昭５５−１０４８８７号）、大腸菌による場合に
は、生じたＳ抗原が大腸菌内で壊れ易いとかそのＳ抗原
によって大腸菌の増殖が困難であるなどの欠点を何する
ためＨＢｓＡｇの産生量か低く、所望のＨＢｓＡｇの大
量生産には、かならずしも適当でない。

また、ごく最近において、酵母によるＨ　Ｂ　Ｓ抗原粒
子の産生に成功したことが報告されている［Ｎａｔｕｒ
ｅ、　２９８巻、３４７〜３５０頁（２２Ｊｕｌｙ１９
８２　）を参照］。この文献によれば、インターフェロ
ンの酵母による産生に使用されているアルコールデヒド
ロゲナーゼ（ＡＤＨＩ）のプロモーターをトリ用し、大
腸菌−酵母シャトルベクターの該Ａ　Ｄ　Ｉ−（＋プロ
モーターの下流にＩ−Ｉ　Ｂ　ｓ蛋白をコードする遺伝
子を接続す方法が採用されているが、この方法では産生
されるＨＢｓ蛋白の量が低く、所望のＨＢ　Ｓ抗原の量
産にはかならずしも充分てないものと認められる。

このような事情のらとに、本発明者らは酵母によるＨＢ
ｓＡｇの量産について検討を重ねた結果、酵母の遺伝子
と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子を担った特定のプラスミドベクターに、
該ホスファターゼプロモーターの制御下にＨＢ　Ｓ抗原
遺伝子を組込んだ新しい組換えＤＮＡを調製し、それに
よって酵母を形質転換さｔト、かかる形質転換酵母を用
いてヒト由来のＨＢｓＡｇと同じ免疫学的活性を存する
ＨＢｓＡｇを量産させることに成功し、本発明を完成す
るに至った。

すなわち、本発明は、ＨＢｓ抗原遺伝子を湘込んだ新規
な組換えプラスミドによって形質転換させた酵母を用い
てＨＢｓＡｇを生産する方法を提供するものである。

本発明で用いる組換えプラスミドは、大腸菌および酵母
の両方の遺伝子を備え、それらのいずれで乙増殖しうる
シャトルベクターを用い、そのベクターに担われた酸性
ホスファターゼプロモーターの下流において、酸性ホス
ファターゼ構造遺伝子の一部または全部もしくはさらに
その上流の一定部位までを除去したのちにＨＢｓ抗原遺
伝子を組込んで得られる。このようにして得られるＨＢ
ｓ遺伝子発現プラスミドを常法により酵母に作用させて
形質転換を起こさせることにより形質転換酵母が得、こ
の形質転換酵母を、好ましくは酸性ホスファターゼプロ
モーターが抑制されない条件下に培養することにより所
望のＨＢｓＡｇが量産される。

以下に、本発明による、特定の形質転換酵母菌を用いた
ＨＢｓＡｇの生産についてさらに詳細に説明する。

（１）　　ｒ−ｒ　Ｂ　Ｖ遺伝子本発明で用いられるシャトルベクターに組込むためのＨ
ＢＶ遺伝子は、大腸菌によりクローニングされたＨ　Ｂ
　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａで、ことに日本および他の東南アジア
などで多く見られるＨＢＶサブタイプａｄｒのものであ
り、制限酵素ＸｈｏｌおよびＢａｍＨＩ認識部位を各々
１個有する。この）ＩＢＶＤＮＡは通常制限酵素Ｘｈｏ
ｌまたはＢａｍＨＩで処理してＨＢＶ遺伝子を含んだフ
ラグメントとして組込みに供される。このフラグメント
は、例えば制限酵素Ｘ　ｈｏ　Ｉで処理して得られるＸ
ｈｏＩ認識部位を末端とするものは、第１図に示すよう
な構造を有し、ＨＢｓ遺伝子とＨＢｃ遺伝子とを対応さ
せた構造である。

第１図に示すように、Ｘｈｏｌで切断された５′末端よ
り２８番目のヌクレオチドからＨＢｓ遺伝子が開始し、
アミノ酸２２６個に相当する遺伝子があり、さらにその
下流にＨＢｃ遺伝子が同じ向きに存在する。また、この
フラグメントをさらにＢａｍＨＩで処理すると、ＨＢＶ
ＤＮＡ（３，２Ｋｂ）はＨＢｓ遺伝子を含むフラグメン
ト（約１．３Ｋｂ）とＨＢｃ遺伝子を含むフラグメント
（約１．９Ｋｂ）の２つに分かれる。このＨＢｓ遺伝子
の塩基配列は本発明者らにより決定され、第２図に示す
ような配列を有する（欧米型のサブタイプａｄｗなどに
ついてはすでに構造が知られている：下記文献を参照）
。なお、これらＨＢｓ　、ＨＢｃ両遺伝子とも介在配列
はもたない。第２図に示すものは、Ｓ抗原決定領域のヌ
クレオチド配列（最上段）とそれによりコードされるア
ミノ酸配列（第２段）を示し、ヌクレオチド配列の上に
付けた数字はＳ抗原のＮ端からのアミノ酸の個数を示す
。なお、その下段Ａ、Ｂ、ＣＷｌはそれぞれａｄ／ｙｗ
タイプ（Ｐａｓｅｋらの解析：　Ｎａｔｕｒｅ、２８２
，５７５〜５７９．１９７９）、ａｄｗタイプの（Ｖ　
ａｌｅｎｚｕｃｌａらの解析：Ｎａｔｕｒｅ、　　２８
０，８１５〜８１９．１９７９）およびａｙｗタイプ（
Ｃｈａｒｎａｙらの解析：　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、Ｕ、Ｓ、Ａ、、７６　、　２
２２２〜２２２６．１９７９）のデータである。

このＨＢＶＤＮＡはつぎのようにして調製される。

まず、ＨＢ　ｓ抗原保有のヒト血液中に含まれるウィル
ス粒子［ディン（Ｄａｎｅ）粒子］を常法により分離す
る。但し、このＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａは３．２００ｂｐ
を有する環状２本鎖構造をとっているが、ＤＮＡ全体の
１５〜５０％の領域は１本鎖であり遺伝子クローニング
用に２本鎖とするために、サトラーおよびロビンソンの
方法（Ｆ、５ａｔｔｌｅｒ　＆　Ｗ。

Ｓ　、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ、　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖ
ｉｒｏｌｏｇｙ、　３２　、２２６〜２３３（＋　９７
９）、“Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒａｌＤ　ＮＡ
　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ｈａｖｅ　ｃｏｈｅｓｉｖｅ　
ｅｎｄｓ”を参照）により１本鎖部分をＨＢＶに含まれ
るエントゲナスＤＮＡポリメラーゼを利用して２本鎖に
修復したのちＤＮＡを抽出し、これを大腸菌によりクロ
ーニングして増殖したのち、通常は適当な制限酵素で処
理して所定のフラグメントとして、後述のプラスミド構
築に供する。

なお、本発明において用いられるＨＢＶＤＮＡは前述し
たとおり日本などで多く見られるＨＢＶサブタイプａｄ
ｒがとくに好ましいが、欧米において多く見られるＨＢ
Ｖサブタイプａｄｗなども同様に用いられうる。

（２）　シャトルベクタ一本発明で用いられるシャトルベクターは、酵母の遺伝子
と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母の抑制性酸性ホスフ
ァターゼ遺伝子を担ったプラスミドベクターである。

この酵母の遺伝子としては、一般に、プラスミドが酵母
中で染色体と独立して増殖するのに必要なＤＮＡ配列、
例えば酵母の自律増殖に必要なＤＮＡ配列（ａｒｓ　１
　）と２μｍＤＮＡの複製に必要なＤＮＡ配列（２μｏ
ｒｉ）があり、所望により、さらに形質転換酵母の選択
マーカーとなる遺伝子が含まれる。この選択マーカーと
しては、ロイシン産生遺伝子、ヒスチジン産生遺伝子、
トリプトファン産生遺伝子、ウラシル産生遺伝子、アデ
ニン産生遺伝子などが含まれ、これらの１種または２種
以上が用いられる。

大腸菌側の遺伝子としては大腸菌体内においてプラスミ
ドが増殖するために必要なＤＮＡ配列、例えばＣｏ１Ｅ
　Ｉ　　系のプラスミドの複製起点のＤＮ′Ａ配列を有
し、好ましくはさらに形質転換大腸菌の選択マーカーと
なる遺伝子を含む。この選択マーカーの遺伝子としては
アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テ
トラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性
遺伝子などが挙げられ、これらの遺伝子の１種または２
種以上が用いられる。このような大腸菌ＤＮＡとしてア
ンピシリン耐性遺伝子とテトラサイクリン耐性遺伝子を
有するｐＢＲ３２２が一般に汎用されている。

本発明で用いるシャトルベクターは酵母の抑制性酸性ホ
スファターゼプロモーターを担っていることが特徴であ
り、この酸性ホスファターゼプロモーターは通常ホスフ
ァターゼを構成する６０゜０００ダルトンのポリペプチ
ド（ｐ６０）のプロモーターである。

このようなシャトルベクターの代表的な例は、本発明者
らにより調製された、酵母側の遺伝子としａｒｓ　１．
２μｏｒｉおよびロイシン産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を有
する酵母ＤＮＡと大腸菌プラスミドｐＢｒ（３２２とを
組合せたシャトルベクターｐＡＴ７７であり、これはつ
ぎのようにして構築される。

酵母５２８８ＣＤＮＡバンクより得られた抑制酸性ホス
ファターゼを構成する６０，０００　　ダルトンのポリ
ペプチド（ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００ヌクレオ
チド対（８Ｋｂ）の制限酵素Ｅｃ。

Ｒ１断片（ＰＮＡＳ、７７巻、６５４１〜６５４５頁、
！９８０およびＰＮＡＳ、７９巻、２１５７〜２１６１
頁、１９８２を参照）を公知の大腸菌プラスミドｐＢＲ
３２２（Ｓｕｔｃｌｉｆｒｅ、　　Ｊ、Ｇ、。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐｏｓ
ｉｕｍ、　４３巻、７７〜９０頁、１９７９を参照）の
ＥｃｏＲＩ部位に挿入して得られるプラスミドを出発材
料とする。

なおこの８　Ｋ　ｂ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片は制限酵素５ａｉ
ｌの認識部位を約２　、８　Ｋｂと約５．２Ｋｂに分け
る位置に１個所有し、２．８Ｋｂ側力卸ＢＲ３２２のア
ンピリジン耐性遺伝子側になるように挿入されていこの
プラスミドを制限酵素５ａｌｌで切断し、さらにＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼにより再アニールさ仕てｐＢ１１３２２の
Ｓｃｉ１部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の５．
２Ｋｂ側を失なったプラスミドを得、これをｐＡＴ２５
と称する。このｐＡＴ２５は３２２のアンピリジン耐性
遺伝子を含むＥｃ。

Ｒ１部位から５ａ１１部位までの約３．７Ｋｂの断片と
酵母の酸性ホスファターゼ遺伝子のＥｃｏＲ１部位から
５ａｌＩ部位までの約２．８Ｋｂの断片がそれぞれ対応
する末端同士で結合したプラスミドである。

つぎに、上記ｐＡＴ２５のＥｃｏＲ１部位に、酵母の自
律増殖に必要なＤＮＡ配列（ａｒｓ　Ｉ　）および酵母
のＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４ＫｂのＥｃｏＲＩ断片（
Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ１、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ
、Ｓ、Ａ、。

Ｌ旦、１０３５〜１０３９頁！９７９を参照）を挿入す
る。得られたプラスミドをｐＡＴ２６と称する。なおこ
のａｒｓｌ−Ｔｒｐｌを含む断片は、そのＴｒｐｌ遺伝
子内に制限酵素ＨｉｎｄＩＩＴの認識部位を１個所有す
る。

上記ｐＡＴ２６のＨｉｎｄｕ部位に酵母のロイシン産生
遺伝子（Ｌｅｕ２）と２μｍ　ＤＮＡの複製に必要なＤ
ＮＡ配列（２μｏｒｉ）を含むＨｉｎｄＩ［［断片（Ｔ
ｏｈｅ。

Ａ、　Ｇｕｅｒｒｙ、　Ｐ、、　Ｗｉｃｈｅｎｅｒ、　
Ｒ，Ｂ、　；Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏ１、　　１４１．４１３〜４１６．　
　Ｌ　９８０参照）を挿入する。このようにして得られ
るプラスミドがシャトルベクターｐＡＴ７７である。

このｐＡＴ７７およびのちに説明するようにそれから誘
導されるＩ）ＡＭ８２の構造は第３図に示、　すとおり
である。すなわち、このｐＡＴ７７は、大腸菌の遺伝子
としてｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ
）を含むＥｃｏＲＩ部位から５ａｌｌ部位までを有し、
一方酵母の遺伝子として、ｐＢＲ３２２と結合したＥｃ
ｏＲ１部位よりａｒｓ１、２μｏｒｉ　、　Ｌ　ｅｕ　
２　の遺伝子の順に位置し、さらにそのつぎに酸性ホス
ファターゼ遺伝子の上流から５ａｌｌ部位までを有する
。そしてそのＥｃｏＲＩおよび５ａｌｌ部位でこれら大
腸菌遺伝子と酵母遺伝子が結合した構造となっている。

このｐＡＴ７７は大腸菌内においてはｐＢＲ３２２によ
り増殖し、また酵母内においてはａｒｓ　１および２μ
ｏｒｉにより増殖可能となる。さらにこのプラスミドに
よる形質転換体の選択マーカーとして大腸菌側にアンピ
シリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）を、酵母菌側にはロイシン
産生遺伝子（Ｌｅｕ２）を有しており、シャトルベクタ
ーとしての条件を充分に満たしている。

なお、このシャトルベクターを用いるのは、後記組換え
プラスミドを大腸菌を用いて調製するためであり、該組
換えプラスミドで酵母を形質転換する段階に至っては、
大腸菌の遺伝子は除去されても問題はない。

このシャトルベクター１）ＡＴ７７の酸性ホスファター
ゼプロモーター付近の遺伝子地図は第４図に示すとおり
であり、ここに示されるＥｓｔＥＵ−ＳａｌＴ領域の塩
基配列は本発明者らにより決定されており、第５図に示
すような配列である。第４図および第５図に示されるＡ
ＴＧコドン（メチオニン）が酸性ホスファターゼの開始
コドンである。

つまり、このベクターの抑制性酸性ホスファターゼ遺伝
子断片（約２．８Ｋｂ）には、構造遺伝子の約２．７Ｋ
ｂ上流から構造遺伝子８２ヌクレオチド対（８２ｂｐ）
までが含まれる。

このようなシャトルベクターｐＡＴ７７を公知の制限酵
素５ａｌｔで処理して開裂させ、ついでこれをエキソヌ
クレアーゼＢＡＬ３１で処理することにより第４図およ
び第５図に示す酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部ま
たは全部と、所望によりさらにその上流の種々の部分ま
で除去する。この除去は酸性ホスファターゼプロモータ
ー領域と思われるＴ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　（Ｈｏ
ｇｎｅｓｓ　ｂｏｘ）、すなわち−ｔｏｏｂｐの前まで
の適当な部位まで行なわれ、エキソヌクレアーゼ処理条
件により適宜調節されるが、通常＋１〜−１００　ｂｐ
１好ましくは＋１〜−５０ｂｐまでである。この際、除
去が上流まで行きすぎると酸性ホスファターゼプロモー
ターの制御が困難となり、形質転換酵母菌の培養の際、
所望のＨＢｓＡｇの収量が低下する。一方、除去が不充
分で酸性ホスファターゼ構造遺伝子が一部残存すると産
生されるＨＢｓ抗原がホスファクーゼペブチドと合いの
子となるため好ましくない。

上記のようにして酸性ホスファターゼ構造遺伝子の一部
または全部もしくはさらにその上流部分を除去したのち
、この部位に合成または天然のリンカ−１例えば５ａｌ
Ｉリンカ−またはＸｈｏｒリンカ−を組込み再び環状プ
ラスミドに戻すことにより、酸性ホスファターゼプロモ
ーターの制御下に外来性遺伝子を純粋な形で発現させ得
るシャトルベクターが得られる。このシャトルベクター
は、通常の制限酵素５ａｉｌまたはＸｈｏｌで処理する
ことにより容易にその組込み部位を開裂させることがで
きるため、所望の遺伝子を組込むのに好適である。

（３）ＨＢｓ遺伝子発現プラスミドの構築本発明におけ
る組換えプラスミド、すなわちＨＢｓ遺伝子を組込んだ
プラスミドの調整は、まず前記シャトルベクターを使用
したリンカ−に対応する制限酵素、例えば５ａｌｌまた
はＸｈｏｌにて処理して開裂させ、これに上記ＨＢ　Ｖ
　Ｄ　Ｎ　Ａを作用させて連結させる。これを大腸菌に
て増幅し、各種制限酵素分析によって正しい配位に組込
まれたもののみを選択し、目的とする組換えプラスミド
を得る。

（４）酵母の形質転換形質転換されるべき酵母としては、プラスミドに担われ
た形質転換酵母の選択マーカー遺伝子によって相補され
る変異を持った変異株、例えばロイシン要求性変異株で
あるサッカロミセス・セレビシェ（Ｓ　ａｃｃｈａｒｏ
ｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　Ａ　Ｈ２２ａｌ
ｅｕ　２　ｈｉｓ　４　　Ｃａｎ１（Ｃ１ｒ　　）を用
いる。上記組換えプラスミドを大腸菌にて増殖させたの
ち、該酵母変異株に常法により作用させ、例えばスフェ
ロプラスト化したのちカルシウム処理した菌体とプラス
ミドＤＮＡを混合して形質転換を起させる。

このように処理された酵母をベクター上に担われている
宿主酵母の変異を相補する遺伝子、たとえばロイシン産
生遺伝子の発現を指標として形質転換酵母を選択し、分
離する。

なお、酵母としてはロイシン要求性変異株のほかに、ヒ
スチジン要求性変異株、トリプトファン要求性変異株、
ウラシル要求性変異株、アデニン要求性変異味などが挙
げられろ。

（５）形質転換酵母の培養およびＨＢｓＡｇの生産上記
の方法で樽られた形質転換酵母をリン酸を含む培地にて
通常の培養条件下に前培養し、対数増殖期にある菌体を
リン酸を含まない培地に移しかえて酸性ホスファターゼ
プロモーターが抑制されない条件下に培養する。培養後
、常法により集菌し、溶菌処理し、所望のＨＢｓＡｇを
多量に含む溶菌液を得る。

なお、用いる酵母の種類により、例えばＰｈｏ８０変異
株を用いた場合には、酸性ホスファターゼプロモーター
を抑制しない条件をとくに採用する必要はなく、該形質
転換酵母を直接培養して所望のＨＢｓＡｇを多量に産生
させることができる。

上記方法で得られるＨＢｓＡｇは免疫学的にヒト血清か
ら得られるものと全く同一であり、ヒト血清によるもの
と同様にして）（ＢＶ用ワクチンとして有用である。

つぎに実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例（１）ＨＢＶＤＮＡの調製（ｉ）ウィルスＤＮＡの調製ＨＢＳＡｇ陽性かつＨＢｅＡｇ陽性の供血＃（血清型ａ
ｄｒ）からのヒト血漿１０人分のプール７００ｒｒｔＱ
を５．ＯＱＯｒｐｍで２０分間遠心分離し、不溶物を除
去する。これを４℃にて１８．００Ｏｒｐｍで８時間遠
心分離し、得られた沈査を緩衝液（ＩＯｍＭトリスＨＣ
Ｉ、Ｏ，ＩＭＮａＣＩ、ＩｍＭ　ＥＤＴＡ；ｐ８７．５
）ＩＱａ＋（２に再溶解させ、３０％の蔗糖を含有する
遠沈管の頂部に重層させる。これを４℃にて３９．ＯＯ
Ｏｒｐｍで４時間遠心分離し、得られた沈査を上記と同
じ緩衝液に再溶解させる。

ついで、のちの操作を容易にするために、Ｉ−（ＢＶの
もつＤＮＡポリメラーゼによる反応を、６７ｍＭトリス
−ＨＣＩ（＋）Ｈ７，５）、８０ｍＭＮＨ４Ｃ１、２５
　ｍＭＭｇＣＩ！、０．５％（ｗ／ｖ％、以下同じ）タ
ージトールＮＰ−４０，０，１％２−メルカプトエタノ
ール、３３０μＭのｄｃＴＰ（デオキシシチジントリホ
スフェート）、ｄＧＴＰ（デオキングアノンントリポス
フェート）、ｄＡＴＰ（デオキソアデノシントリホスフ
ェート）、０．５μＭα−［”Ｐ］　ｄＴＴＰ（デオキ
シチミジントリホスフェート）の混合液５００μρ中で
３７℃にて３０分間行なう。これにさらにｄＴＴＰを最
終濃度３３０μＭになるように加え、３７°Ｃで３時間
反応させ、これに同容量の１００ｍＭ　ＥＤＴＡ溶液を
加える。

このＤＮＡポリメラーゼ反応により、ＤＮＡ中の一本鎖
部分が修復され、［”Ｐ］ラベル化された材料を得、こ
れを蔗糖の３０％、２０％および１０％水溶液を段階的
に重層した遠心管の項部に重層し、４℃にて３９．ＯＯ
Ｏｒｐｍで４．５時間遠心分離する。

ついでＤＮＡに強く結合している蛋白質を消化するため
に、上記で得られた沈査をＩｎ９７ｍ（７ブロナーゼＥ
および０．２％ラウリル硫酸ナトリウムの混合液２００
μａ中で３７℃にて２時間処理したのち、ＤＮＡをフェ
ノール２００μぐで２回抽出し、ついでエーテルで振っ
てフェノール溶媒を除去するとＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａ溶
液を得る。このＤＮＡは２．５　ｘ　ｌ　Ｏ６ｃｐｍ／
μゾの比放射活性を示し、制限酵素消化に充分使用し得
る。

（ｉｉ）ＨＢＶＤＮＡのクローン化前記の方法で調製された環状二本鎖のＨＢＶＤＮＡを、
下記のようにしてまずλファーノンヤロノ１６ＡＤＮＡ
をベクターとしてクローン化し、さらに公知のプラスミ
ドｐＡ　ＣＹ　ＣＩ　７７　［Ｃｈａｎｇ。

Ａ、　Ｃ，Ｙ、　、　Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、、Ｊ、
　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

、１３４．１＋４１〜ｌ　ｌ　５６（１９７８）ｉをベ
クターとして再クローン化を行なう。

（Ａ）λファージシャロン１６Ａ宿主−ベクター系によ
るクローン化：ＨＢＶＤＮＡ６０ｎ１Ｆをｌ０ｍＭトリス−ＨＣＩ（ｐ
Ｈ７，４）、７ｍＭＭｇＣＬ、Ｉ　００ｍＭＮａＣ１、
７ｍＭ２−メルカプトエタノールの混液２０μｅ中にて
制限エンドヌクレアーゼＸｈｏｌにより３７℃にて２時
間処理したのち、フェノール２０μＱにて抽出し、つい
でエーテル抽出後、その水層に２倍容蛮の冷エタノール
を加えてＤＮＡを沈澱させる。

この混液を一７０℃て１時間保持したのち１０゜０００
　ｒｐｍにて５分間遠心分離して沈澱するＤＮＡを回収
する。分離した沈査をｌ０ｍＭトリス−Ｉｔ　ＣＩ（ｐ
ｌ（７、４）’および１ｍＭＥＤＴＡの、混液５μＱに
溶解させる。ついで、このＨＢＶＤＮＡと等モルｍの前
記と同様にして制限酵素Ｘｈｏｌにより開裂されたえフ
ァージシャロン１６ＡＤＮＡ（Ｘ　ｈｏ　ｌ認識部位を
１個所有する）とをＴ４ＤＮＡリガーゼ（５０ｍＭｈリ
スーＨＣＩ（叶１７．４）、ＩＯｍＭＭｇＣＩ２．１０
ｍＭジチオスレイトール、１００ｕｑ／ｙｒＱ牛血ｔｎ
アルブミン、０．５ｍＭＡＴＰおよび０．５μｇ酵素調
製物との混液）１０μａを用いて４°Ｃで１８時間反応
させ、その反応混合液を前記と同様にしてフェノール抽
出、エーテル処理およびエタノール沈澱に付し、得られ
た沈査を１０ｍＭトリスートｒｃｌ（ｐＨ７，４）およ
び１　ｍＭ　Ｅ　ＤＴＡ混液１０μａ中に溶解させる。

上５己のようにしてアニーＪしさせたＤＮＡより、ｉｎ
　　ｖｉｔｒｏパンケージング操作（Ｍｅｔｈｏｄｓ　
　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　６８巻、２９９〜３０
９を参照）によりλファージを形成させ、さらに大腸菌
ＤＰ５０ＳｕｐＦを指示菌としてし一寒天平板（２３ｃ
ｍｘ２３　ｃｍ）上に〜１０４個のプラークを形成させ
る。

これらプラークのうちからＨＢＶＤＮＡを維持している
ファージにより形成されたプラークを選び出すために、
前記で調製した３２ｐ−ラベルされたＨ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　
Ｎ　Ａをプローブとしてプラークハイブリダイゼーショ
ンを行ない（Ｓｃｉｅｎｃｅ、　　！　９６巻、１８０
頁、１９７７を参照）、目的とするファージを複数分離
する。

（Ｂ）プラスミドｐＡｃＹｃＩ７７をベクターとした再
クローン化；上記（Ａ）で得られたＨ　Ｂ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａを保持す
るファージについて「生化学実験講座、核酸の化学ＩＪ
５．１〜６５頁に記載される方法に従い、大腸菌ＤＰ５
０−９ｕｐＦを感染間としてファージＤＮＡを調製する
。得られたＤＮＡを前記の制限酵素Ｘ　ｈｏ　Ｉの反応
条件下で２時間消化したのち、この反応液を０．７５％
アガロースゲル電気泳動にかけ、分離した３、２Ｋｂの
ＨＢＶＤＮＡをＤＥＡＥ紙（東洋濾紙製）に吸着さＵ゛
てベクターＤＮＡと分離し、ついで１ＭＮａｃｌ溶液に
て溶出し、両端がＸ　ｈｏ　１末端となったＨ　Ｂ　Ｖ
　Ｄ　Ｎ　Ａを得ろ。

つぎにプラスミドｐＡＣＹＣｌ　７７［Ｃｈａｎｇ、Ａ
。

Ｃ，Ｙ、　、　Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、　Ｎ、　、Ｊ、　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏ１、　。

１３４．１１４１〜１１５６（１９７８）２（このもの
はＸｈｏｌ切断部位を１個所有し、それはカナマイシン
耐性遺伝子の中に存在する）を同様にＸｈ。

Ｉにて消化し、その生成物をフェノール抽出、エーテル
処理およびエタノール沈澱により精製する。

ついでＸｈｏ［開裂されたｐＡｃＹｃ１７７とＸｈ。

Ｉ末端−ＨＢＶＤＮ’Ａとを分子比ｌ：５で混合し、前
記Ｔ４ＤＮＡリガーゼの反応条件下に１８時間アニール
さＵ−る。

大腸菌Ｘｌ７７６の培養液を高木康敬編著「遺伝子操作
実験法」第１６１項に記載の方法で調製された菌液０　
、　ｌ　、ｑＱに、上記アニールされたＤ　Ｎ　Ａ調製
物１０７ｉを加えてよく混合させ、０°Ｃて２５分間放
置したのち、アンピシリン（２０μ９／靜）、α−ヒオ
チン（１μｙ／ｍの、ジアミノピメリン酸（１００ｕｇ
／ｌ＋り、チシン（２０μ９／ｍ＆）ヲ含’ｔＷｔ　ル
し一寒天プレート上に塗沫して３７°Ｃて一夜培養する
。出現したコロニーについて、カナマイノン（２０μ９
ＡＩｒ（１）を含む寒天プレートとアンピシリン（２０
μ９／ｍｃ）を含寒天プレートにそれぞれ対応させて塗
沫し、アンピシリンを含むプレートでのみ増殖したコロ
ニーを選択する。ｐＡｃＹｃ１７７はアンピシリン耐性
遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を有するが、カナマイ
シン耐性遺伝子中にあるＸｈｏＩ部位にｒ（Ｂ　Ｖ　Ｄ
　Ｎ　Ａか挿入されろことによりカナマイシン耐性が消
失される。すなイつち選択されたコロニーはｐＡＣＹＣ
Ｉ　７７−ＨＢＶ　Ｄ　Ｎ　Ａの組換えＤ　Ｎ　Ａを保
持している。得られたコロニー数個について、「代謝」
第１７巻、第４１リパーゼ」第８１〜８９頁（１９８０
）に記載される方法に従いプラスミドを調製する。得ら
れたプラスミドをｐＨＢＶと称す。このｐＨＢＶを制限
酵素ＸｈｏＩで処理すると３．２Ｋｂの全ＨＢＶＤＮＡ
フラグメントが得られ、またＸｈｏｌとＢａｍＨＩで処
理するとＨＢｓＡｇ遺伝子を含む約１．３Ｋｂのフラグ
メントか（”Ｊられる（第１図を参照）。

（２）シャトルヘクターｐＡＭ８１．８２．８３および
８４の調製酵母５２８８　Ｃ’Ｄ　ＮＡバンクより得られｆこ抑制
性酸性ホスファターゼを構成する６　０，０００ダルト
ンのポリペプチド（Ｐ６０）の遺伝子を含む約８０００
ヌクレオチド対（８Ｋｂ）の制限酵素Ｅｃ。

Ｒ＋断片を大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２のＥｃ。

Ｒ１部位に挿入して得られるプラスミドを出発材料とし
、これを制限酵素５ａｉｌで切断し、さらにＴ４ＤＮＡ
リガーゼにより再アニールさせてｐＢＲ３２２の５ａｌ
Ｉ部位から酸性ホスファターゼ遺伝子断片の５．２Ｋｂ
側を失ったプラスミドｐＡＴ２５（これはｐＢＲ３２２
のアンピシリン耐性遺伝子を含むＥｃｏＲ１部位から５
ａｌＩ部位までの約３゜７Ｋｂの断片と酵母菌の酸性ホ
スファターゼ遺伝子のＥｃｏＲｒ部位から５ａｌＩ部位
までの約２８Ｋｂの断片がそれぞれ対応する末端同士で
結合したプラスミドである）を得る。

つぎに、このｐＡＴ２５のＥｃｏＲ１部位に、プラスミ
ドＹＲＰ７をＥｃｏＲｒを処理することによって得られ
ろａｒｓ　ｌおよびＴｒｐｌ遺伝子を含む１．４Ｋｂの
ＥｃｏＲＩ断片を挿入してプラスミドｐＡＴ２６を得る
（このａｒｓｌ−Ｔｒｐｌを含む断片は、そのＴｒｐｌ
遺伝子内に制限酵素Ｈｉｎｄ［Ｉの一認識部位を１個有
する）。

上記ＭＴ２６のＨｉｎｄｌ１１部位に、プラスミドｐｓ
ＬＥＩをＨｉｎｄＩＩＩて処理して得られる酵母のＬｅ
ｕ２および２μｏｒｉを含むｌ−１ｉｎｄＩＩＩ断片を
挿入してノヤトルヘクターｐＡＴ７７を得る。

上記の方法で得られたｐＡＴ７７（Ｉμｇ）を５ａｌＩ
で開裂したのち、２０ｍＭ）リスートＩ　ＣＩ（１）８
８　。

２）、Ｉ　２　ｍＭ　ＣａＣ１２，１２ｍＭＭｇｃ　１
２．０．２ＭＮａＣ１，ＩｍＭＥＤＴＡ溶液５０ｕＱ中
て０．ＩＵのエキソヌクレアーゼＢＡＬ３１を３０秒〜
１分間作用させろ。ついてフェノール抽出、エタノール
沈澱を行なったのち、Ｘ　ｈｏ　Ｉリンカ−１ｐｍｏｌ
とＴ　＝Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａリガー七の反応条件下で１２時
間結合を行なう。この反応溶液で大腸菌Ｘｌ７７６を形
質転換し、得られたアンピノリン耐性の形質転換体より
プラスミドＤ　Ｎ　Ａを調製し、各Ｄ　Ｎ　Ａについて
マキサム−ギルバートの方法（Ｍａｘａｍ、　Ａ、＆Ｇ
１１ｂｅｒｔ、　’ｖＶ、　；　Ｐｒｏ、　Ｎ、　Ａ、
　Ｓ、　、７４，５６０〜５６４を参照）に従い、塩基
配列を調へ、ＢΔＬ３１処理により除去された酸性ホス
ファターゼ遺伝子領域を決定する。これらの中からホス
ファターゼ構造遺伝子領域が完全に除去されたプラスミ
ドｐＡＭ８１．ｐＡＭ８２、ｐＡＭ８３およびｐＡＭ８
・１を得る。

ホスファターゼ構造遺伝子の産物Ｐ６０の最初のアミノ
酸であるメチオニンをコードするコドンＡ　’１’　Ｇ
のＡを＋１として、ｐＡＭ８１は＋２まで、ｐＡＭ８２
は−３３まで、ｐＡＭ８３は−５０まで、ｐＡＭ８４は
−５１まで、それぞれ除去されたものである。なお、こ
のｐＡＭ８２をザッカロミセス・セレビシエＡ　Ｉ−（
２２に組込んだ乙のは微工研菌寄第６６６８号：微工研
条寄第３１３号として寄託している。

（３）ＨＢｓＡｇ遺伝子発現プラスミドの調製（ｉ）Ｉ
（Ｕｓ遺伝子全体が組込まれたプラスミトの調製プラスミドｐＨＢＶをＸｈｏＩで処理して得られろＨＢ
　Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａと、Ｘｈｏｌで開裂されたシャトルベ
クターｐＡＭ８１．ｐＡＭ８２、ｐＡＭ８３およびｐＡ
Ｍ８４のそれぞれを分子比５．１でＴ４ＤＮＡリガーゼ
によりアニールさせたのち、この反応溶液で大腸菌Ｘ１
７７６を形質転換する。得られたアンピノリン耐性の形
質転換体よりプラスミドＤＮＡを調製し、これらについ
て制限酵素Ｘ　ｈｏ　Ｉ、ＸｂａＩ、　ＨｉｎｄｌＩＩ
て分析することにより、ベクターへのＨＢＶＤ、’ＪＡ
の組込みおよびその方向を確認する。

選び出されたプラスミドはベクターのホスファターゼプ
ロモーターの下流にＨＢ　Ｖ　Ｄ　Ｎ　ＡがＩ（Ｆ３Ｓ
遺伝子、ＨＢｃ遺伝子の順に並ぶ向きに挿入されｆコら
のであり、これらがＨＢｓＡｇ遺伝子発現プラスミドで
あって、シャトルベクターｐＡＭ８１゜ｐＡＭ８２、ｐ
ＡＩｖｆ８３およびｐＡＭ８４にＨＢ　ＶＤＮＡを組込
んだものをそれぞれｐＡＨ２０１゜１）Ａ）ｒ２０３、
ｐＡＨ２０５およびｐＡＨ２０７と弥する。

（ｉｉ）ＩＩ１３ｓＡｇ逍伝子フラグメントか組込まれ
ｆコブラスミドの調製プラスミドｐＩＩＢＶをＢａｍＨｌて処理して切断し、
そのＨＢＳＡｇ遺伝子フラグメント３μ９に′１１し、
２００μＭのαＡＴＰ、　　αＣＴＰ、　　αＴ　ＴＪ
）および（ＺＧＴＰを含む６７ｍＭトリス−ＨＣｌ　（
ｐ　Ｈ８６）、６　、７　ｍＭＭｇＣ＋２．１０ｍＭ２
−メルカプトエタノール、６．７ＵＭＥＤＴＡ、ｌ　６
．７ｍＭ、へｍｓｏ、溶液＋００μＣ中で、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ０．２Ｕを３０分間作用させ、１３ａｍＨ
Ｉ切断末端を埋める。ついでフェノール抽出、エタノー
ル沈澱を行なったのち、これとＸｈｏｌリンカ−とを１
：ｌＯの分子比でＴ４ＤＮＡリガーゼによる結合反応を
行なう。フェノール抽出、エタノール沈澱ののち、これ
をさらにＸｈｏｌて処理すると両端がＸ　ＦＩｏ　［切
断末端となった約１．３に！＋のＨＢｓＡｇ遺伝子フラ
グメントが得られる。このフラグメントとＸ　ｈｏ　Ｉ
で開裂されたシャトルベクターｐＡ　Ｍ　８２とを分子
比５；ｌにてＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼによりアニー
ルさせたのち、前記（１）と同様にして大腸菌ｘ１７７
６を形質転換してプラスミドＤＮＡを調製する。得られ
たプラスミドは、ベクターｐＡＭ８２のホスファターゼ
プロモーターの下流にＨＢｓＡｇ遺伝子が正しい向きに
挿入された乙のであり、これをｐＡｓＩｏｌと称する。

（４）形質転換酵母の調製酵母としてサツカロミセス・セレピ゛ン工ＡＨ２２［ａ
　　１ｅｕ２　　ｈｉｓ４　　ｃａｎｔ　　（Ｃｉｒ”
）］（微工研菌寄第６６６７号・微工研条寄第３１２号
）を用い、これをＹＰＤ培地（２％ポリペプトン、１％
イーストエキス、２％グルコース）１００ｚ個に接種し
、３０℃で一晩培養したのち、遠心して集菌する。滅菌
水２０＋ρにて閉封を洗浄し、ついで１２Ｍソルビトー
ルおよび１００μ９／靜チモリア〜−ゼロ０，０００（
生化学工業製）の溶液５顧に懸蜀さＵ・、３０°Ｃて約
３０分間保ち、スフェロプラスト化する。ついて、スフ
ェロプラストを１．２Ｍソルビトール溶液で３回洗浄し
たのち、２Ｍソルビトール、１０ｍＭＣａＣ＋２および
１０ｍＭトリス−）［Ｃ１（ｐＨ７，５）の溶液０　、
６　ｚ（！ｉ、：懸ＥＪすｕ−１その６０μσずつを小
試験管に分注する。これにｒＦｉ記（３）で調製した組
換えプラスミドＩ）ＡＩ−１２０３溶ｔＬ３０μＱを加
え、充分混合し、さらにＯ，ＩＭＣａＣ１２（３ｕ　（
り加えて最終層ＩＪｊＩ　０ｍＭＣａＣｌ２とし、室温
に５〜ＩＯ分間放置する。ついてこれに、２０％ポリエ
チレングリコール１１０００、ｔｏｎＭ　Ｃａ　ＣＩ　
２およびＩＯ＋ｎＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＩ−１７，５）
溶液Ｌ＋Ｃずつを加えて混合し、室温に約２０分間放置
する。この混合液０　、２　ｍＱずつを４５°Ｃに保温
された再生培地（２２％ソルヒトール、２％クルコース
、０７％イーストニトロゲンヘースアミノ酸、２％ＹＰ
Ｄ、２０μ９／ｍＱヒスチジン、３％寒天）１０ｍ１２
に加え、軽く混合させ、予め阜備された１　、　２　Ｍ
ソルビトール含有最小培地（０゜７％イーストニトロゲ
ンベースアミノ酸、２％グルコース、２０μ９／７１Ｑ
ヒスチノン、２％寒天）プレートに重筋し、固化させた
のち、３０°Ｃて培養してロイノン非要求性酵母のコロ
ニーを得る。このコロニーを２０μ７／肩＆ヒスチノン
を含むハルクポルダーミニマルメディウム（Ｔｏｈｅ、
　Ａ、ｔ３（ａｌ；　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｏ１、、１上３
，７２７〜７３８（１９７３）を参照］にて培養して形
質転換酵母サッカロミセス・セレビシェｐＡＨ２０３を
得る。

上記の方法において、組換えプラスミドｐＡＨ２０３の
代イつりにｐＡｓｌｏ１、ｐＡＨ２０１およびｐＡＨ２
０５を用い、それぞれ下記の形質転換酵母を得る。

サッカロミセス・セレビシェｐＡＳＩＯＩ。

サッカロミセス・セレビシェｐＡＨ２０１゜サッカロミ
セス・セレビシェｐＡＨ２０５゜（５）形質転換酵母に
よるＨＢｓＡｇの製法前記（４）で得られた形質転換酵
母の各コロニーをさらに２０μｇ／ｍρヒスチジンを含
むバルクホルダーミニマルメディウムの寒天プレート上
に塗布し、３０℃にて培養してコロニーを形成させる（
ロイシン非要求性となった形質転換体の再確認のため）
。ついでこのコロニーから菌体を分離し、２０μ９／７
１（ｌヒスチジンを含むバルクホルダーミニマルメディ
ウムＩＯｍＱに接種し、３０℃にて培養を行なう。約２
４時間後、対数増殖期におる菌体を遠心して集菌し、こ
れをリン酸を含まない最小培地（バルクホルダーミニマ
ルメディウムに含まれるＫＨ２ＰＯ，をＫＣＩて置換し
、さらに２０μｇ／ｍρヒスチジンを加えたしの）１０
ｚ（ｊに菌数的４×１０°ｃｅｌｌｓ／ｘＱになるよう
に検温し、３０６Ｃにて約２４時間培養を続けたのち、
４，０００回転、１０分間の遠心により菌体を集める。

この菌体を１，２Ｍソルビトール、５０ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７，２）、１４ｍＭ２−メルカプトエタノール
、１００μ９／ｍρザイモリエース６０，０００の溶液
３ｍ（２に＠濁させ、３０℃にて３０分間ゆるやかに振
盪してスフェロプラスト化し、遠心分離によりこれを集
める。このスフェロプラストを０．１％トリトンＸ−１
００，５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７’、　２　）　Ｉ
　ｚ（ｌに充分懸濁し、数回激しく攪拌し、７０００回
転にて１０分間遠心して得られる上清液を酵母溶菌液と
してとる。

この溶菌液２０μＱをＨＢｓ抗原ＲｒＡキット（アボッ
ト社製）によりＨＢｓ抗原活性を測定した。その結果を
第１表に示す。

第１表＊）このベクターはＨＢ　ＶまたはＨＢｓ遺伝子を含ん
でいない陰性対照である。

（なお、ＲＩＡ測定キットの陰性コントロールは３１０
０ｐｍ、陽性コントロールは７．５００ｃｐｍであった
）また、前記のようにして得られた酵母溶菌液（Ｓセレビ
シェＡＨ２２／ｐＡＨ２０３由来）について、前記ＨＢ
　ｓ抗原検出用キット（アボット社製）を用いた平行線
検定法（厚生省薬務局監修、生物学的製剤基準解説、４
３５頁、１９７３）に従い、抗原量および抗原の反応性
を推定した。なお、対照抗原としては、ヒト由来の精製
ＦＩＢｓ抗原を用いた。この結果を第６図に示す。第６
図に示されろように、抗原【１１は２μｇ／ｘσと比較
的高濃度であった。しかも、直線の平行性により本発明
に基づいて産生されたＩ−ｒ　Ｂ　ｓ抗原はヒト由来の
精製抗原の持つ反応性とほぼ同じ性質を持つことが理解
できろ。

さらに、上記溶菌液を１０匹のモルモット（体重３００
〜３８０いに０．４肩ρずつ１週問おきに３回皮下に接
種すると、すべてのモルモットに抗ＨＢ　ｓ抗体が出現
することが、抗［（Ｂｓ抗体検出用キット（アボット社
製「オーサブ」）により認められた。

以上により、本発明で得られる宿主・ベクター系および
ＨＢ　ｓ抗原の製法か、Ｂ型肝炎起因物質（ディン粒子
）に対する免疫原物質を効率よく与えるきわめて有用な
手段および方法であることがわかる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で用いられるＨＢＶ遺伝子を含むＨＢ　
Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントの構造、第２図は１１Ｂｓ
遺伝子のアミノ酸配列、第３図はンヤトルヘクタ−ｐＡ
Ｔ７７およびｐＡＭ８２の構造、第４図は該シャトルベ
クターの酸性ホスファターゼプロモーター付近の遺伝子
地図、第５図はそのＢ　５ｔＥＵ−９ａｉｌ領域の塩基
配列を示す。第６図は本発明で得られる酵母溶菌液につ
いての平行線検定法による抗原量および抗原の反応性を
示すグラフである。特許出願人　科学技術庁長官官房会計課長代　理　人　
弁理士　前出　葆　ほか１名手続補正書　動式）特許庁長、宮殿　　　昭和　６１年１１月ＩＯ日Ｉ　事
件の表示昭和　６１年特許願第　　１０７４３４　　号３　補正
をする者事件との関係　特許出願人住所　東京都千代田区霞が開−丁目２番１号名称科学技
術庁長官官房会計課長代表者三井嗣部４代理人

Claims

【特許請求の範囲】

（１）酵母の遺伝子と大腸菌の遺伝子とを含みかつ酵母
の抑制性酸性ホスファターゼ形質発現調節領域を担った
プラスミドベクターに、該ホスファターゼプロモーター
の制御下にＢ型肝炎ウィルス遺伝子を組込んでなる組換
えプラスミドを用いて酵母を形質転換させ、この形質転
換酵母を培養することを特徴とするＢ型肝炎ウィルス表
面抗原の製法。
（２）該プラスミドベクターにおける抑制性酸性ホスフ
ァターゼ形質発現調節領域がホスファターゼを構成する
６０，０００ダルトンのポリペプチド（Ｐ６０）の遺伝
子であり、その構造遺伝子の一部または全部もしくはさ
らにその上流の種々の部位までが除去されている前記第
（１）項記載の製法。
（３）酵母の遺伝子がａｒｓ１および２μｏｒｉである
前記第（１）項記載の製法。
（４）酵母の遺伝子としてａｒｓ１、２μｏｒｉならび
に形質転換酵母の選択マーカーとなる遺伝子を有する前
記第（１）項記載の製法。
（５）該選択マーカーとなる遺伝子がロイシン産生遺伝
子、ヒスチジン産生遺伝子、トリプトファン産生遺伝子
、ウラシル産生遺伝子およびアデニン産生遺伝子から選
ばれる１種または２種以上である前記第（４）項記載の
製法。
（６）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
ために必要なＤＮＡ配列である前記第（１）項記載の製
法。
（７）大腸菌側の遺伝子が大腸菌体内において増殖する
ために必要なＤＮＡ配列ならびに形質転換大腸菌の選択
マーカーとなる遺伝子である前記第（１）項記載の製法
。
（８）該選択マーカーとなる遺伝子が、アンピシリン耐
性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン
耐性遺伝子およびクロラムフェニコール耐性遺伝子から
選ばれる１種または２種以上である前記第（７）項記載
の製法。
（９）該組込みＢ型肝炎ウィルス遺伝子がアミノ酸２２
６個に相当するＨＢｓ遺伝子全体を含むフラグメントで
ある前記第（１）項記載の製法。
（１０）該ＨＢｓ遺伝子全体を含むフラグメントが、制
限酵素Ｘｈｏ I で開裂されたＨＢＶＤＮＡ全体である
前記第（９）項記載の製法。
（１１）該ＨＢｓ遺伝子全体を含むフラグメントが、制
限酵素Ｘｈｏ I およびＢａｍＨ I の処理によって得ら
れるフラグメントである前記第（９）項記載の製法。
（１２）該形質転換させる酵母がロイシン要求性変異株
、ヒスチジン要求性変異株、トリプトファン要求性変異
株、ウラシル要求性変異株およびアデニン要求性変異株
から選ばれる１種である前記第（１）項記載の製法。
（１３）該酵母がロイシン要求性変異株のサッカロミセ
ス・セレビシェＡＨ２２ａ　１ｅｕ２　ｈｉｓ４　Ｃａ
ｎ１（Ｃｉｒ＾＋）である前記第（１２）項記載の製法
。
（１４）該形質転換酵母の培養を、酸性ホスファターゼ
プロモーターが抑制されない条件下に行なう前記第（１
）項記載の製法。