JPS58500590A

JPS58500590A - 枯草菌におけるクロ−ン化異種遺伝子生産物の制御された蓄積のための方法およびベクタ−

Info

Publication number: JPS58500590A
Application number: JP57501695A
Authority: JP
Inventors: チヤン・シン
Original assignee: シ−タス・コ−ポレ−ション
Priority date: 1981-04-20
Filing date: 1982-04-20
Publication date: 1983-04-21
Also published as: FI824238L; ES519234A0; AU8521382A; CA1204681A; AU551529B2; EP0063494A2; ES8403158A1; IL65558A0; ATE48639T1; EP0063494B1; DK563082A; DE3280060D1; FI824238A0; NO824102L; WO1982003633A1; ES511510A0; EP0063494A3; ES8308586A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】枯草菌におけるクローン化異種遺伝子生産物の制御された蓄積のだめの方法およびベクター発明の技術分野本発明は分子生物学、詳細にはいわゆる組換えＤＮＡの技術に関する。よシ詳細には、本発明は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）においてクローン化異種遺伝子生成物を単一の非結合蛋白質として生産する方法およびクローニングベクターに関する。

本発明は新規な遺伝子工学的処理を施されたプラスミドに関する。これらのプラスミドを包含する微生物はメリーランド州ロックビル２０８５０のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにブタペスト条約にもとづき寄託されている％（寄託臼１９８０年１２月２２日）。

これらの微生物はＡＴＣＣ／１６８１，７７６ないしｉ３１，７７８である。ＡＴＣＣ／１６８１７７６はプラスミドｐＯＧ１１９６を含む枯草菌ＢＤ２２４であシ：ＡＴＣＣ／１６８１７７７はプラスミドｐＯＧ２１６５を含む枯草菌ＢＤ２２４であシ；　ＡＴＣＣ／６８１，７７８はプラスミドｐＯＧ２１１０を含む大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）Ｃ８４１２である。これらのプラスミドを含む微生物は当該米国特許が発効されれば一般に自由分譲される。

背景技術周知の如く、特定の蛋白質中のアミノ酸の特定配列は該蛋白質のための遺伝子中に担持されるコードによって２決定される。蛋白質は翻訳の過程でメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を経由してＤＮＡから形成される。翻訳の間に、ｍ　ＲＮ　Ａ中の３つのヌクレオチドの群、いわゆるコドンが蛋白質鎖中の相当する部位に可能な２０種のアミノ酸のうちの１つを置くことを指示する。

組換ＬＤＮＡ技術の出現によって、あらかじめ決められたヌクレオチド配列（合成あるいは１つの菌株または種から単離）の導入によって遺伝子を慎重に変化させることができる。あらかじめ決められたヌクレオチド配列を選択して、該ヌクレオチド配列を導入した菌株または種に翻訳過程の一部として上記あらかじめ決められたヌクレオチド配列によってコード化されている蛋白質を生産させることができる。変性された菌株または種が正常な複製過程を経るとき、該菌株または種は導入された配列をも複製する。

組換えＤＮＡ技術は、適当なりＮＡ鎖（クローニングベクター）片を単離し、外来ＤＮＡを挿入すべき望ましい部位においてクローニングベクターのＤＮＡの２本鎖を切断することからなる。これを行うために、特定タイプの蛋白質、すなわち制限酵素が典型的に使用される。

制限酵素はＤＮＡを特定のヌクレオチド配列のところで切断するが、いくつかの制限酵素については、切断は必ずしも２本のからみ合ったＤＮＡ鎖の同一部位で生じないことがある。そのような場合、もし２つの異なるタイプのＤＮＡが同様の方法で切断されるとき、開裂末端は相補的でアシ、適当な条件下に並行している相補的末端とくつつくであろう。これら開裂末端は次いでリガーゼのような酵素によって酵素的に結合できる。これはいかなる源からの２つのＤＮＡ断片でも単一のＤＮＡ分子に組込むことを可能にする。

−たんＤＮＡベクターが単離され、異種ＤＮＡ片が挿入されると、組換えＤＮＡは次いで適当な宿主微生物に導入される。宿主微生物に挿入されたＤＮＡを複製させるためには、組換えＤＮＡが宿主の遺伝学的系の一部になるように宿主に挿入されることが必要である。そのような挿入は種々な方法で生じる。たとえば大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、　ｃｏｌｉ）においては、２つの有利なタイプのクローニングベクターが使用されてきた。主ＤＮＡ鎖すなわち染色体の外に大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）はしばしばプラスミドとして知られる１つ以上の独立して複製するＤＮＡの環状の輸を有する。又、ラムダ・バクテリオファージ（ｌａｍｂｄａ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｃ）　（ファージ）として知られる特定タイプのビールスは大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）を感染させその遺伝学的系の一部となシ得る。組換えＤＮＡ技術は種々のプラスミド又はファージをクローニングベクターとして使用してきた。この技術は細菌からのプラスミドまたはファージの単離、制限酵素による単離されたＤＮＡの切断、該プラスミドまたはファージ内へ異種ＤＮＡ片を挿入して正しい方向に向けること、プラスミドの環状形およびファージ構造の回復、およびこのようにしたプラスミドまたはファージの大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞への返還からなる。宿主内では、異種ＤＮＡは世代から世代へと複製するばかりでなく、もし異種ＤＮＡが正しい方向に向いていて適当な解読枠とプロモーターが存在すれげ上記異種ＤＮＡにコード化されている蛋白質も生産するであろう。

今日までほとんどの組換え研究は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）についてなされてきた。すべての細菌と同様、大腸菌ＣＥ。

ｃｏｌｉ）は真の核の代りに核膜で囲まれていない単一の”裸”の染色体を有する原核細胞である。一方、酵母は共通の祖先から分岐したのでヒトは酵母とは全く異なる。

ヒトと酵母との間の明確な相違のために、上記２つの生２物がト鹸聯キ億年以上の進化論的間隔によって分けられているという点は別に驚くべきことではない。もつと驚くべきことは、細菌種が同様の進化論的間隔によって分けられるという事実である。これは大腸菌（Ｅ、ｃｏｔｊ）とその遠い進化論的゛いとこ”である枯草菌（Ｂ、ｓｕｂ　ｔ　ｉ　Ｘ１ｓ）の場合には本当にあてはまるのである。これら２つの菌２は約！億午前に分岐する前は祖先が共通であった。

Ｈｏｒｉ　ａｎｄ　Ｏｓａｗａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ　７６　：８８１−３８５（１９７９）参照。

大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）中の遺伝子をクローニングする特定の一般的方法は他の微生物、たとえば酵母および枯草菌（ｆ）、ｓｗｂｔｉｌｉｓ）に適用できるが、大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）プラスミドは通常枯草菌内で複製できず、大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）の遺伝子は一般に枯草菌内で発現しない。これは２つの細菌間の大きな進化論的間隔から生じる遺伝学的制御機構の相違に帰因する。Ｈｏｒｉ　ａｎｄ　Ｏｓａｗａ　前出文献参照。

枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）にとって宿主微生物として好適である。というのは、枯草菌中でのプラスミド媒介形質転換の効率が大きく、枯草菌が病原性を有しないからである。枯草菌は又、工業上広く使用される発酵微生物でもあるので、その工業的規模での管理に慣れている。実験室で使用する大腸菌ＣＥ、ｃｏｌｉ）菌株はヒトや高等動物の腸に寄生している非病原微生物であるが、遺伝学的に変化すると病原性となる懸念がある。

一方枯草菌は土壌中に住み、植物や動物の病気に関連したことは決してない。このように、枯草菌の遺伝学豹変。

化がヒト、動物又は植物に病的状態をもたらすことはあまシあシそうにない。

発明の開示共に係属中の米国特許出願第２２１，８００号には、枯草菌（Ｂ、ｓｗｂｔｉｌｉｓ）による異種遺伝子生産物の生産の初めての成功につい−て記載されている。これは遺伝子工学分野における顕著な進歩を代表している。本発明は上記係属中の特許出願第２２１，８００号の基本的技術を改良したものに関し、該特許出願は所望の非結合、すなわち純粋な形の蛋白質のみが細菌によシ生産されるという枯６軍曹における非結合外来蛋白質の生産の初めての成功を開示している。蛋白質生産物の非結合すなわち純粋が形のものは異種遺伝子以外の源によってコード化された異質のアミノ酸を何ら有しない。純粋な異種蛋白質は宿主内に蓄積させられる。所望の純粋な異種蛋白質が宿主内に蓄積したとき、純粋な蛋白質が当分野に知られた方法で回収できる。

枯草菌（Ｂ、ｔｓｔ、ｂｔｉｌｉｓ）による異種蛋白質を生産する改善された方法を提供することが本発明の目的である。

本発明のもう１つの目的は、枯草菌による発現によってあらかじめ決められた蛋白質であって、枯草菌にとっては非固有のものであるものを生産させる改善された方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、蛋白質が宿主様にとって非固有すなわち異質であシ、異種遺伝子以外の源によシコード化された外来アミノ酸が異種蛋白質に結合していない単一の非結合ペプチドとして生産される枯草菌による蛋白質の生産方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は蛋白質が宿主内に蓄積される枯草菌内で発現によシ純粋な非結合異種蛋白質を生産する方法を提供することである。

本発明の他の目的は添付図面についての下記説明から当業者には明らかとなろう：第１図はヒト線維芽細胞インターフェロン遺伝子配列の図式でちシ；７１Ｓ表Ｂ胚８−５００５９０（４）第２図はバチルス・リケニホルミスＣＢ、　ｌ　ｉ　ｃｈｅｎｉｆｏ需１Ｓ）ｐｅｎＰ遺伝子の調節域からなるヌクレオチド配列の図式であシ；第８図はヒト線維芽細胞インターフェロン遺伝子を発現させるのに使用されるバチルス・リケニホルミスＣＢ。

１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ｐｅｎＰ遺伝子からの調節配列断片からなるヌクレオチド配列の図式である。

非常に一般的に言えば、本発明によれば、枯草菌ＣＢ。

ｓｕｂ　ｔ　ｉ　ｌ　？：　ｓ　）にとって非固有すなわち異質であるあらかじめ決められた単一の非結合蛋白質は枯草菌による発現によって生産される。プラスミドが導入されている枯草菌の菌株を生育させるだめの生育培地および条件が与えられる。プラスミドは上記菌株中で複製されることができるか細菌の染色体の中に統合されることができる。そのようなプラスミドは所望のあらかじめ決められた蛋白質のだめのコードを有する適当に方向付けられた異種遺伝子を担持している。該異種遺伝子はそれ自身の翻訳開始コドン配列を含んでいる。この翻訳開始コドンは異種遺伝子上に本来存在することができ、あるいは合成的にそこに置くことができる。異種遺伝子以外の源に由来の、オペレーター、プロモーターおよびリボゾーム結合位配列を有する適当な転写および翻訳調節シグナルもプラスミドに存在する。それ自身の翻訳開始コドン配列を有する異種遺伝子はプラスミド上、異種遺伝子の適当な翻訳に必要なスペーサーヌクレオチドを提供するに充分な距離のところにあるリボゾーム結合位配列の後に局在する。

プラスミド上、上記調節シグナルと上記異種遺伝子が局在する部位との間に翻訳開始コドン配列がちることはない。このように゛、異種遺伝子はプラスミド調節シｙナルのコントロール下にあるが、異種遺伝子上の翻訳開始コ遺伝子は単一の非結合にプチドとして発現される。異種遺伝子生産物は宿主微生物中に細胞内蛋白質として蓄積するであろう。異種遺伝子生産物は当分野に既知の手段によって宿主微生物内から回収できる。

発明を実施するだめの最良の形態下記例は本発明が使用される方法を説明している。それらは説明のためのみ包含され、本発明の範囲を伺ら限定するものではない。

例　１　枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内での単一の非結合細胞内蛋白質としてのヒト線維芽細胞インターフェロンの発現枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内でのヒト線維芽細胞インターフェロンの発現に使用するだめのヒト線維芽細胞インクーフエロン遺伝子を当分野に既知の方法によって単離した。Ｔａｎｉｇｒｔ、ｃｈｉ　ｅｔ　ａｌ、Ｐｒｏｃ、Ｊｐｎ、Ａｃａｄ、、Ｓｅｒ、Ｂ５５　：４６４−４６９（１９７９）参照。よシ詳細には、ヒト線維芽細胞インターフェロンｃＤＮＡクローン、すなわちイマーとして使用してｃＤＮＡの逆転写酵素による合成によって得られた。このｃ、ＤＮＡは大腸菌（Ｅ、Ｃ０１ｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩの作用によって二本鎖とされ、ＳＩヌクレアーゼによって切断された。ホモポリマー尾部を、ｄＣＴＰを基質として使用して末端トランスフェラーゼによって二本鎖ＣＤＮＡ　（ｄ８ＣＤＮＡ）の３′−末端に付加させた。同様のｄＧホモポリマー尾部を、ＰｓｔＩ位で線状化されているプラスミドｐＢＲ８２２の３′−末端に付加させた。このベクターとｔｌｓｃＤＮＡをノ飄イプリツルンスタインーホグネスＣＧｒｕｎｓｔｅｉｎ −Ｈｏｇｎｅｓｓ）＝ｚ　ｏニー雑種形成スクリーンによって同定し、さらに制限酵素分析により特徴付けだ。そのような分析によυ、４．ＥＥ他に約６００　ｈｐおよび２００　ｂｐの２つの挿入断片が２つの断片になることがわかった。

クローン４ＥＡをＨｉｎｆ　Ｉで切断すると、現在ｐＢＲ８２２に存在する上記３つの新しい断片を生成する挿入断片中に少なくとも８つのＨｉｎｆ１位がちることがわかった。

制限地図のデータによって全ヒトインターフェロン遺伝子の完全なヌクレオチド配列を得ることができる。ヒト線維芽細胞インターフェロン遺伝子の翻訳された完成した蛋白配列は第１図に示されている。

枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内での発現の前に、ヒト線維芽細胞インターフェロン遺伝子は大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）での発現のためにサブクローン化された。これを達成するために、ヒト線維芽細胞インターフェロン遺伝子コーディング配列を、合成オリゴヌクレオチドプライマー（ＴＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＣ）およびＤＮＡポリメラーゼＩを使用してＤＮＡ配列５′を、完成したインターフェロンのアミン末端メチオニンをコード化しているＡＴＧコドンに分解することによってサブクローン化した。次いで、修復されたＤＮＡを修復されたＨｉｎｄ　［１およびｈＨＩ位でｐＢＲ８２２にサブクローン化した。上記ヒトインターフェロン遺伝子中のＢＱＩＴＪ位（ＵＧＡ翻訳終止コドンのすぐ後）を使用してｐＢＲ８２２中のＢａｔｎＨＩ付着末端と結合させてηｃｏ■位を再生させた。ヒトインターフェロン遺伝子の修復５′−末端を修復されたＨｉｎｄ　［［位に揃い末端結合させた；もとのプライマーがその５′−末端にエクストラチミジンヌクレオチドを有しているのでＨｉｎｄ　ｍ位を再生させた。得られたクローンｐｌ−２５を制限分析およびＤＮＡ配列分析によって確立した。

バチルスにニシリナーゼ（β−ラクタマーゼ）プロモーターを使用して枯草菌（ｆｌ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内でヒト線維芽細胞インターフェロンヲ発現させた。

バチルスペニシリナーゼ（β−ラクタマーゼ）プロモーター断片はクローン化ペニシリナーゼ遺伝子から生成させた。Ｇｒａｙ　ａｎｄＣｈａｎｇ、Ｊ、ＢａｃｔｅｒｉｏｌＡ４５　：４２２−４２８　（１９８１）ＢＡＬ−３１エキソヌクレアーゼによシ切断してＡＴＧコドンを越してすぐのコーディング域を取シ除いた。このコーディング配列は第２図に示されている。次いでこのＤＮＡを５′末端に位置するＥｃｏＲＩ位でさらに切断し、ＤＮＡポリメラーゼによって修復して揃い末端断片を生成した。この断片をさらにアクリルアミドゲル上でによる切断によって上記プロモーター断片を切シ取ることができた。２６２　ｈｐ挿入物を担持するｐＤＨ５２６８と称する１つのプラスミドをさらに配列分析によシ特性付けた。そのような分析は、このプラスミドが第８図に示されるような完全なプロモーター配列を含んでいることを示した。

枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内でヒト線維芽細胞インターフェロン遺伝子を発現させるために、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）β２ミドｐＯＧ１１９６とインビトロ結合させることによシュ機能性レプリコンに転化した。次いで、制限されたＳｌヌクレアーゼによる分解および大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼによる修復によって、ヒト線維芽細胞インターフェロンコーディング配列に対して、２Ｂ２ｂｐ５′にクローン化した。得られた１つのクローンであるｐＤＨ１１５１はさらに制限酵素分析によって特性付けられた。そのような分析によれば、枯草菌由来の配列の外に、このプラスミドは大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）プラスミドｐＢＲ８２２、完成したヒト線維芽細胞インターフェロンのだめのヌクレオチド配列コーディングおよびｐｅｎＰプロモーターから得られた配列のみ担持することがわかった。

次いでプラスミドｐＤＨ１１５１を枯草菌（Ｂ、ｓｒｔ、ｂｔｉｌｉｓ）ＨＶ１宿主菌株ＢＧＳＣＩＳ５Ｂに形質転換した。ｐＤＨ１１５１を有する形質転換菌株からつくられた細胞抽出物によシ、得られた菌株が単一の非結合の完成したヒト線維芽細胞インターフェロンによって示されるのと同等の抗ウィルス活性を示す細胞内ヒト線維芽細胞インターフェロンを生産することがわかった。抗ウイルス検定の詳細についてはＳｔｅｗａｒｔ、Ｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ。

Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７９）　ｐ　ｌ　７ −１８参照。

したがって、本発明が異種クローン化遺伝子を枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内で単一の非結合蛋白質として発現させ３るための方法およびベクターを提供することが理解されよう。これらの非結合異種蛋白質は宿主またはプラスミドのいずれかに由来するＤＮＡによってコード化されている外来アミノ酸を何ら含まないであろう。これらの単一の非結合蛋白質生成物は宿主微生物中に蓄積するであろう。宿主微生物にこれらが蓄積後、これら異種遺伝子の生成物は当分野に既知の手段で回収できる。

本明細書に記載したものの他に、本発明の種々の変形は上記記述および添付図面から当業者には明らかとなろう。そのよう々変形は請求の範囲内にあるものと考える。

浄書（力臂゛こ二てなＬ〕手続補正書（方式）１、事件の表示て虐＝ｒ、１ゴオ７；ｒ＋７＝／ノグＪつテ〕矛ミ　ふ　よＬ、バククー３補正をする者事件との関係　出　願　人５、補正命令の日付　昭和１２年２月　１日（発送日）７補正の内容 Σ゛１・憶力ｊ１−ソ　（＼勺、　１））仔’３−　ｔｑ　リ５二Ｃ・・Ｆ　」１史Ｔ＝ＦＬ）１”−′ ［１＋　４：１− ＩＳＡ。

Claims

【特許請求の範囲】（１）　形質変換された宿主内に蓄積するあらかじめ決められた蛋白質を生産する方法であって、枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内で複製できるか枯草菌ＣＢ。５ｕｂｔｉｌｉｓ）の菌体染色体内にとシ込まれることができるプラスミドを含む枯草菌（Ｂ、ｓｗｂｔｉｌｉｓ）のだめの生育培地中に生育条件を提供し、該プラスミドは枯草菌ＣＢ。５ｕｂｔｉＬｉｓ）内で発現可能なあらかじめ決められた蛋白質のだめのコードを有する異種遺伝子を有し、該異種遺伝子は翻訳開始コドン配列を包含し、オペレーター、プロモーターおよびリボゾーム結合位配列を包含する操作可能な転写および翻訳調節シグナルのコントロール下にあシ、該操作可能な転写および翻訳調節シグナルは上記異種遺伝子以外の源に固有のものであシ、さらに上記異種遺伝子の前にいかなる翻訳開始コドン配列も存在せず、該あらかじめ決められた蛋白質を回収することからなる方法。（２）あらかじめ決められた蛋白質のだめの異種遺伝子が、オペレーター、プロモーターおよびリボゾーム結合位配列を包含するバチルス・リケニホルミス（ｆｌ、ｌｉｃんｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）β−ラクタマーゼ転写および翻訳調節シグナルにコントロールされている請求の範囲第１項の方法。（８）あらかじめ決められた蛋白質が真核生物の蛋白質である請求の範囲第１項の方法。（４）　あらかじめ決められた蛋白質が哺乳類の蛋白質であ５る請求の範囲第１項の方法。（５）オらかしめ決められた蛋白質がヒト線維芽細胞インターフェロンである請求の範囲第１項の方法。（６）枯草菌（Ｂ、８ｕｂｔｉｌｉｓ）内で複製できるか枯草菌ＣＢ。５ｕｂｔｉｌｉｓ）の菌体染色体内にとシ込まれることができるプラスミドであって、該プラスミドは枯草菌（１３，８ｕｂ−１ｉｌｉｓ）内で発現可能なあらかじめ決められた蛋白質のためのコードを有する異種遺伝子を有し、該異種遺伝子は翻訳開始コドン配列を包含し、オペレーター、プロモーターおよびリボゾーム結合位配列を包含する操作可能な転写および翻訳調節シグナルのコントロール下にあシ、該操作可能な転写および翻訳調節シグナルは上記異種遺伝子以外の源に固有でアシ、さらに該異種遺伝子の前にいかなる翻訳直始コドンも存在しないプラスミド。（７）上記あらかじめ決められた蛋白質のだめの上記異種遺伝子は、オペレーター、プロモーターおよびリボゾーム結合位配列を包含するバチルス・リケニホルミスＣＢ。１ｉｃｈｅｎｉｆｏｒｒｎｉｓ）β−ラクタマーゼ転写および翻訳調節シグナルのコントロール下にある請求の範囲第６項のプラスミド。（８）アらかじめ決められた蛋白質が真核生物の蛋白質である請求の範囲第６項記載のプラスミド。（９）あらかじめ決められた蛋白質が哺乳類の蛋白質である請求の範囲第６項記載のプラスミド。（ト）あらかじめ決められた蛋白質がヒト線維芽細胞イン１６ターフエロンである請求の範囲第６項のプラスミド。但）発現によってあらかじめ決められた蛋白質を生産することが可能な微生物をつくる方法であって：枯草菌（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）内で複製できるが枯草菌ＣＢ。５ｕｂｔｉｌｉｓ）の菌体染色体内にとシ込まれることができるプラスミドであって、該プラスミドは枯草菌ＣＢ。５ｕｂｔｉｌｉｓ）内で発現可能なあらかじめ決められた蛋白質のだめのコードを有する異種遺伝子を有し、該異種遺伝子は翻訳開始コドン配列を包含し、オペレーター、プロモーターおよびリボゾーム結合位配列を包含する操作可能な転写および翻訳調節シグナルのコントロール下にあシ、該操作可能な転写および翻訳調節シグナルは上記異種遺伝子以外の源に固有であシ、さらに該異種遺伝子の前にいかなる翻訳開始コドンも存在しないプラスミドを形成し；該プラスミドを枯草菌（Ｂ、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）に導入することからなる方法。（至）あらかじめ決められた蛋白質のだめの異種遺伝子がオにレータ−、プロモーターおよびリボゾーム結合位配列を包含するバチルス・リケニホルミス（Ｒｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ−ｍｉ　ｓ　）　β−ラクタマーゼ転写および翻訳調節シグナルのコントロール下にある請求の範囲第１１項の方法。（ト）蛋白質が真核生物の蛋白質である請求の範囲第１１項記載の方法。（９）蛋白質が哺乳類の蛋白質である請求の範囲第１１項記載の方法。１’Ｚ　ｑ１表表明８−５００５９ｆｌ（２）（ト）蛋白質がヒト線維芽細胞インターフェロンである請求の範囲第１１項記載の方法（ト）枯草菌（Ｒ５ｕｂｔｉｌｉｓ　）宿主微生物および枯草菌（Ｂ。５ｕｂｔｉｌｉｓ）内で複製できるか枯草菌（Ｚ？、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）の菌体染色体内にとシ込まれることができるプラスミドであって、該プラスミドは枯草菌（Ｚ？、　５ｕｂｔｉｌｉｓ）内で発現可能なあらかじめ決められた蛋白質のだめのコードを有する異種遺伝子を有し、該異種遺伝子は翻訳開始コドン配列を包含し、オペレーター、プロモーターおよびリポゾーム結合位配列を包含する操作可能な転写および翻訳調節シグナルのコントロール下にあシ、該操作可能な転写および翻訳調節シグナルは上記異種遺伝子以外の源に固有であシ、さらに該異種遺伝子の前にいかなる翻訳開始コドンも存在しないプラスミドからなる、発現によりあらかじめ決められた蛋白質を生産することができる微生物。 αつ　上記あらかじめ決められた蛋白質のだめの上記異種遺伝子がオペレーター、プロモーターおよびリポゾーム結合位配列を包含するバチルス・リケニホルミス（Ｂ。ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ　）β−ラクタマーゼ転写および翻訳調節シグナルのコントロール下にある請求の範囲第１６項の微生物。（ト）あらかじめ決められた蛋白質が真核生物の蛋白質である請求の範囲第１６項の微生物。（至）あらかじめ決められた蛋白質が哺乳類の蛋白質であ８る請求の範囲第１６項の微生物。（財）あらかじめ決められた蛋白質がヒト線維芽細胞インターフェロンである請求の範囲第１６項の微生物。 ■υ請求の範囲第１項ないし第５項の方法によシ生産された細胞内蛋白質。 ■２）請求の範囲第１１項ないし第１５項の方法によシ微生物によって生産された細胞内蛋白質。（財）請求の範囲第１６項ないし第２０項に開示された細菌の１種以上からクローン化された形質転換細菌培養物であって、該培養物の細菌はあらかじめ決められた蛋白質を発現することができる培養物。