JPH11215997A - β−１，４−ガラクトシル−マルトースの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 構造異性体であるβ−１，６−ガラクトシル
−マルトースを生成することなく、又、高価で処理能力
の低いゲル濾過精製法を用いることなく、工業的規模で
簡便に行うことができるβ−１，４−ガラクトシル−マ
ルトースの製造方法を提供することにある。 【解決手段】 構造異性体であるβ−１，６体は生成す
ることなく、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを
選択的に生成するサーモモノスポラ（Ｔｈｅｒｍｏｍｏ
ｎｏｓｐｏｒａ）属放線菌が生産する糖化型α−アミラ
ーゼを使用すること、ラクトース並びにガラクトシル−
ラクトース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトー
ス、及びガラクトシル−ガラクトシル−マルトテトラオ
ースからなる群から選ばれる少なくとも１種のガラクト
シル−オリゴ糖を優先的に加水分解する酵素を使用し
て、ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖を低分
子化することを特徴とするβ−１，４−ガラクトシル−
マルトースの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、β-1,4-ガラクトシル
−マルトースの製造方法に関する。詳しくは、工業規模
で容易に効率よく、かつ、安価にβ-1,4-ガラクトシル
−マルトースを製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】医療現場で各種検査が行われるようにな
り、膵臓や尿中に含まれるα−アミラーゼ活性も測定さ
れるようになった。α−アミラーゼ活性の測定は重要な
検査事項であり、疾病診断の一助になっている。近年、
α−アミラーゼの活性測定用基質として、共役酵素を使
用しない高感度の基質が開発されている。そのような基
質の一つとして、マルトースの還元性末端にフェニル
基、ナフチル基又はそれらの誘導体をアグリコンとして
結合させたマルトース誘導体であって、その非還元性末
端の４位がガラクトースで修飾された構造を持つ化合物
が知られている（特開平６−３１５３９９号）。この化
合物の化学構造式を以下（化１）に示す。

【０００３】

【化１】 式中、Ｘ¹及びＸ²の少なくとも一方はガラクトシル残基
であり、他方は水素原子であり、Ｒはフェニル基、ナフ
チル基等の修飾基を示す。上記化合物は、β−１，４−
ガラクトシル−マルトースの還元末端に、Ｒで示される
フェニル基、又はナフチル基等の修飾基を付加したもの
であり、この基質は、例えば、β−１，４−ガラクトシ
ル−マルトースを原料として製造することができる。

【０００４】また、このβ−１，４−ガラクトシル−マ
ルトースは、ガラクトシルマルトビオノラクトンの原料
としても用いられる。ガラクトシルマルトビオノラクト
ンは、α−アミラーゼの阻害剤として有効であることが
知られている（特開平８−２９１１９２号）。このよう
にβ−１，４−ガラクトシル−マルトースは、医療現場
において欠く事のできないα−アミラーゼ基質やα−ア
ミラーゼ阻害剤の原料となる化合物であるが、その製造
方法は実用的に十分確立されているとはいえない。

【０００５】β−１，４−ガラクトシル−マルトースの
一般的な製造方法は、２つある。第一の方法は、マルト
ース及びガラクトースにβ−ガラクトシダーゼを作用さ
せて、ガラクトシル−マルトースを得る方法である。こ
の方法は、１段階で目的物を生成することができる方法
である。第二の方法は、ガラクトースとマルトオリゴ糖
にβ−ガラクトシダーゼを作用させ、ガラクトシル−マ
ルトオリゴ糖を得、得られたガラクトシル−マルトオリ
ゴ糖にタカアミラーゼを作用させ、ガラクトシル−マル
トースを生成する方法（特開平８−１７３１８０号）で
ある。

【０００６】第一の方法は、ガラクトシダーゼ糖転移反
応を利用して、マルトースの非還元末端の４位を１分子
のガラクトースで修飾する方法であるが、重大な欠点が
ある。この製造方法では、例えば、供与体基質である乳
糖存在下、β−ガラクトシダーゼの糖転移反応を行った
場合、マルトースへのガラクトシル基転移生成物と乳糖
への転移生成物が、同時に生成する。これらの生成物
は、ゲル濾過などによる分画において、溶出時間が非常
に似通っているため、分画が困難であった。従って、β
−１，４−ガラクトシル−マルトースを生成しても、そ
の後精製することが実質的に不可能であった。

【０００７】一方、第二の方法にも、２つの問題があっ
た。この方法は、詳しくは、マルトトリオース以上の重
合度を持つ直鎖マルトオリゴ糖（マルトトリオース、マ
ルトテトラオース、マルトペンタオース等）とガラクト
シル残基を含む糖の混合物に、β-ガラクトシダーゼを
作用させ糖転移反応を行い、マルトオリゴ糖の非還元末
端の４位をガラクトースで修飾したガラクトシル−マル
トオリゴ糖を調製し、得られたガラクトシル−マルトオ
リゴ糖にタカアミラーゼを作用させてガラクトシル−マ
ルトオリゴ糖３糖類のみを遊離させて、ガラクトシル−
マルトースを得るというものである。

【０００８】第一の問題は、生成物にβ−１，６−ガラ
クトシルマルトースが混在し、分離が困難であることで
ある。即ち、マルトオリゴ糖の非還元末端の４位をガラ
クトースで修飾して得られた生成物には、目的とするβ
−１，４−ガラクトシル-マルトオリゴ糖は約１０％
（Ｗ／Ｗ）程度しか生成しない。更に、上記反応におい
て、ガラクトースが非還元末端にあるグルコシル基の６
位に結合した構造異性体も生成する。このような生成物
（混合物）にタカアミラーゼを作用させると、タカアミ
ラーゼはガラクトースが６位に結合した異性体にも作用
するためβ-1,４-ガラクトシルマルトースに加えてβ-
1,6-ガラクトシルマルトースも生成してしまう。β−
１，４体とβ−１，６体とは分子量に差がなく、両者の
分画は極めて困難である。

【０００９】第二の問題は、上記糖転移反応の生成物に
は、更に主として原料由来の乳糖、転移反応生成物であ
るガラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシ
ル-ラクトース、及び／又はガラクトシル-ガラクトシル
-マルトオリゴ糖等も含まれていることである。これら
の糖は、β−１，４−ガラクトシル−マトースと分子量
等が近似しているため、これらの糖から目的物を分離
し、精製することも容易ではなかった。

【００１０】第一の問題の解決法として、ガラクトシル
−マルトオリゴ糖から、ガラクトースが６位に結合した
異性体は遊離することなく、β−１，４−ガラクトシル
−マルトースのみ遊離する酵素の使用が考えられる。サ
ーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産す
る糖化型α−アミラーゼは、β-1,6-ガラクトシル−マ
ルトオリゴ糖には作用せず、β-1,4-ガラクトシル−マ
ルトースのみを遊離させることが知られている（糖質関
連酵素シンポジウム vol.30, p213-221, 1996）。従っ
て、本発明者らは、この酵素を上記タカアミラーゼの代
わりに用いることにより、異性体であるβ−１，６−ガ
ラクトシル−マルトースの生成を阻止することができる
と考えた。

【００１１】一方、第二の問題の解決法として考えられ
る方法として、ゲル濾過精製法を挙げることができる。
この精製法は一般的にマルトオリゴ糖あるいはその誘導
体の高純度品を得る場合に用いられる方法である。しか
し、このゲル濾過精製法は、分離能力は高いが処理能力
が低く、ゲル自体の価格が高い等の欠点がある。更に、
β−１，４−ガラクトシル-マルトースの誘導体がα-ア
ミラーゼ基質として用いられる際には、９８％以上とい
う高純度を要求される。そのため、β-1,4-ガラクトシ
ル-マルトースの高純度品を得るためには、このゲル濾
過精製が二回以上必要であった。従って、工業的規模で
β-1,4-ガラクトシルマルトースあるいはその誘導体の
高純度品を製造する場合、生産量が制限され、高価にな
らざるを得なかった。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】そこで本発明の目的
は、α−アミラーゼ活性測定の基質の原料及びα−アミ
ラーゼ阻害剤の原料として有用な、高純度のβ−１，４
−ガラクトシル−マルトースの製造方法であって、構造
異性体であるβ−１，６−ガラクトシル−マルトースを
生成することなく、また、高価で処理能力の低いゲル濾
過精製法を用いることなく、工業的規模で簡便に行うこ
とができる製造方法を提供することにある。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本発明は、ラクトース並
びにガラクトシル−ラクトース、ガラクトシル−ガラク
トシル−ラクトース、及びガラクトシル−ガラクトシル
−マルトテトラオースからなる群から選ばれる少なくと
も１種のガラクトシル−オリゴ糖が共存するβ−１，４
−ガラクトシル−マルトオリゴ糖（以下、原料混合物と
いう）に、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選
択的に生成する酵素を作用させて、β−１，４−ガラク
トシル−マルトースを製造する方法であって、

【００１４】ラクトースを優先的に加水分解する酵素と
上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくとも１種を優先的
に加水分解する酵素とを、上記原料混合物又はβ−１，
４−ガラクトシル−マルトースを含む生成物に作用させ
て、ラクトース及び上記マルトオリゴ糖を低分子化する
工程を含むことを特徴とする方法に関する。

【００１５】

【発明の実施の形態】従来の方法においては、β−１，
４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖からβ−１，４−ガ
ラクトシル−マルトースを生成する際、構造異性体であ
るβ−１，６−ガラクトシル−マルトースも同時に生成
することがあった。本発明では、「β−１，４−ガラク
トシル−マルトースを選択的に生成する酵素」をもちい
ることにより、異性体の生成を排除することに成功し
た。「β−１，４−ガラクトシル−マルトースを選択的
に生成する酵素」としては、例えば、サーモモノスポラ
（Thermomonospora）属放線菌が生産する糖化型α−ア
ミラーゼＴＦ９０（日本食品化工（株）製）を使用する
ことができる。この糖化型α−アミラーゼは、ガラクト
シル−マルトオリゴ糖から、ガラクト−スが６位に結合
した異性体は遊離することなく、β−１，４−ガラクト
シル−マルトースのみ遊離することが知られている。従
って、同じ分子量を持つため分離が不可能である異性体
を生成することがない。これは、後のβ−１，４−ガラ
クトシル−マルトース精製工程においてその工程を簡便
にするという利点がある。「β−１，４−ガラクトシル
−マルトースを選択的に生成する酵素」が、例えば、サ
ーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が生産す
る糖化型α−アミラーゼＴＦ９０の場合、基質であるガ
ラクトシル−オリゴ糖１ｇに対して、３０〜２００Ｕを
使用することが好ましい。反応は、４５〜６５℃で、ｐ
Ｈ４．５〜８．５の範囲で行うことが好ましい。

【００１６】なお本発明において「β−１，４−ガラク
トシル−マルトースを選択的に生成する酵素」は、上記
糖化型α−アミラーゼに限定されるものではなく、異性
体を生成することなく、ガラクトシル−マルトオリゴ糖
から目的物質であるβ−１，４−ガラクトシル−マルト
ースを選択的に生成することができる酵素であればいず
れも使用可能である。

【００１７】原料混合物中のラクトース及び上記ガラク
トシルーオリゴ糖は、目的物のβ−１，４−ガラクトシ
ル−マルトースと分子量が近似している。そのため、高
純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトース得るため
に、これらの化合物をβ−１，４−ガラクトシル−マル
トースから分離することが困難であった。本発明では、
これらの化合物を、酵素を用いて加水分解することによ
り低分子化することに着目した。その結果、β−ガラク
トシル−マルトオリゴ糖及びβ−１，４−ガラクトシル
−マルトースを分解せず、ラクトース及び上記ガラクト
シル−オリゴ糖を優先的に加水分解する酵素群を見出し
た。これらの酵素を用いることにより、ラクトース及び
上記ガラクトシル−オリゴ糖を低分子化することができ
るようになった。低分子化されたこれらの化合物は、β
−１，４−ガラクトシル−マルトースとその分子量が明
らかに異なるため、簡易に分離することができる。

【００１８】低分子化の具体的な方法としては、「ラク
トース優先的に加水分解する酵素」及び「上記ガラクト
シル−オリゴ糖を優先的に加水分解する酵素」を、上記
「原料混合物」又はβ−１，４−ガラクトシル−マルト
ースを含む生成物に作用させることにより行うことがで
きる。酵素としては、目的物であるβ−１，４−ガラク
トシル−マルトースを加水分解せずにラクトース及び上
記ガラクトシル−オリゴ糖を低分子化するものを使用す
ることができる。

【００１９】「ラクトースを優先的に加水分解する酵
素」としては、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシ
ダーゼからなる群から選ばれる少なくとも１種の酵素等
を用いることができる。

【００２０】原料混合物に含まれるラクトースを加水分
解するには、ガラクトシル-マルトオリゴ糖あるいは目
的物であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースには
作用せずに乳糖を加水分解するβ−ガラクトシダーゼを
使用することができる。そのようなβ−ガラクトシダー
ゼとしては、例えば、β−１，４−ガラクトシル−マル
トース難分解性のβ−ガラクトシダーゼを挙げることが
できる。具体的には、β−ガラクトシダーゼとしては、
例えば、クリベロマイセス・フラギルス（Kluyvermyces
fragilis）起源の酵素製剤「ラクトザイム」（ノボノ
ルディスクバイオインダストリー（株）製）、クリベロ
マイセス・ラクティス（Kluyvermyces lactis）起源の
酵素製剤「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精（株））等を
挙げることができる。これらの酵素は市販品として容易
に入手可能である。β−ガラクトシダーゼは、基質であ
るラクトース１ｇに対して、５〜５０Ｕの量の範囲で使
用することが好ましい。その反応は、温度３０〜５０℃
でｐＨ５〜８の範囲において行うことができる。

【００２１】原料混合物中のラクトースを加水分解する
ためには、乳糖分解能を有するβ−グルコシダーゼを使
用することができる。ラクトースを加水分解するために
使用することができるβ−グルコシダーゼとしては、例
えば，乳糖分解能力を有するアーモンドやサーマス(The
rmus)属由来のβ-グルコシダーゼ等を挙げることができ
る。β−グルコシダーゼは、基質であるラクトース１ｇ
に対して、５〜１００Ｕの範囲で使用することが好まし
い。また、その反応は、温度３０〜６０℃で、ｐＨ５〜
８の範囲で行うことができる。

【００２２】なお本発明において「ラクトースを優先的
に加水分解する酵素」はβ−ガラクトシダーゼ及びβ−
グルコシダーゼに限定されるものではなく、目的物質で
あるβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを実質的に
分解することなく、ラクトースを分解し得る酵素であれ
ばいずれも使用可能である。

【００２３】「上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくと
も１種を優先的に加水分解する酵素」としては、例え
ば、β−ガラクタナーゼ等を挙げることができる。

【００２４】β−ガラクタナーゼは、一般的には、ガラ
クトース重合体を加水分解する酵素である。本発明にお
いては、β-1,4-ガラクトシル-マルトースあるいはその
誘導体を分解せずにガラクトシル-ラクトース、ガラク
トシル-ガラクトシル-ラクトースまたは２個以上のガラ
クトース残基が非還元末端側に結合したマルトオリゴ糖
あるいはその誘導体を分解する種類のβ−ガラクタナー
ゼを使用する。そのようなβ−ガラクタナーゼとして、
例えば、β−１，４−ガラクタナーゼを挙げることがで
きる。具体的には、β−ガラクタナーゼとしては、例え
ば、Bacillus subtilis起源のもの（J.M.Labavitchら，
J. Biol.Chem.,251,5904-5910）、Penicillium citrinu
m起源のもの（澱粉科学，第３６巻, P131-140,1989
年）、Aspergillus pulverulent起源の酵素製剤「ペク
チナーゼＧアマノ」（天野製薬（株）製） Aspergillus
niger起源の酵素製剤「ペクチネックス」（ノボノルデ
ィスクバイオインダストリー（株）製）等を挙げること
ができる。これらの酵素は一般的に入手可能である。β
−ガラクタナーゼは、基質である上記ガラクトシル−オ
リゴ糖１ｇに対して、５〜５０Ｕの範囲で使用すること
が好ましい。またその反応は、温度３０〜６０℃で、ｐ
Ｈ３〜６の範囲で行うことができる。

【００２５】上記に例示したβ−ガラクタナーゼについ
ては、文献等においてガラクトースの重合体からなる高
分子やガラクトース残基からなるガラクトオリゴ糖を加
水分解できることは記載されている。しかし、ガラクト
シル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクト
ースまたはガラクトシル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖
を加水分解することができることは記載されていない。
β−ガラクタナーゼが、ガラクトシル-ラクトース、ガ
ラクトシル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシ
ル-ガラクトシル-マルトオリゴ糖を加水分解すること
は、本発明で初めて見いだされたものである。

【００２６】なお本発明において「上記ガラクトシル−
オリゴ糖の少なくとも１つを優先的に加水分解する酵
素」はβ−ガラクタナーゼに限定されるものではなく、
目的物質であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトース
を実質的に分解することなく、上記ガラクトシル−オリ
ゴ糖を分解し得る酵素であればいずれも使用可能であ
る。

【００２７】本発明において、必要に応じて、上記の方
法により「ラクトース及び上記ガラクトシル−オリゴ糖
の少なくとも１種を低分子化して得られたβ−１，４−
ガラクトシル−マルトースを含む生成物」からβ−１，
４−ガラクトシル−マルトースを分離することもでき
る。この分離工程により、高純度のβ−１，４−ガラク
トシル−マルトースを得ることができる。

【００２８】β−１，４−ガラクトシル−マルトースを
含む生成物は、異性体であるβ−１，６体を含まず、残
存原料及び副生成物が低分子化されているため、ゲル濾
過精製及び逆浸透膜等の工程により精製が可能である。
ゲル濾過精製では一般に分子量の大きさによる分離モー
ドが使用されている。単糖とオリゴ糖とでは分子量が相
違するためβ−１，４−ガラクトシル−マルトースと他
の低分子化された糖化合物を分離することが可能であ
る。従って、上記混合物はゲル濾過精製を用いて容易に
分離することができる。一方、逆浸透膜においても、オ
リゴ糖と単糖類は大量にかつ簡便に分離することができ
る。この方法を用いてもβ−１，４−ガラクトシル−マ
ルトースと他の低分子化された糖化合物を分離すること
が可能である。従って、ゲル濾過精製の前処理として逆
浸透膜を組み込めば、目的物質の含量が向上しゲル濾過
精製工程の生産性の大幅な向上が可能である。また、高
純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを得るた
めに高価なゲル濾過精製工程を２回繰り返す必要性も排
除することができる。

【００２９】上記β−１，４−ガラクトシル−マルトー
スの製造方法の「原料混合物」は、例えば、ガラクトシ
ル残基を有する糖及びマルトオリゴ糖に、β−ガラクト
シダーゼを作用させて得ることができる。β−ガラクト
シダーゼを用いて、マルトオリゴ糖の非還元末端にガラ
クトースを結合し、β−１，４−ガラクトシル−マルト
オリゴ糖を得ることができる。これは、β−ガラクトシ
ダーゼの糖転移反応によるものである。

【００３０】糖転移反応に用いることができるβ−ガラ
クトシダーゼとしては、ラクトース残基をβ−１，４−
ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖の非還元末端グルコ
ース残基に転移し得る酵素を挙げることができる。一般
的に、β−ガラクトシダーゼは各種β-ガラクトシドを
加水分解してガラクトースを遊離する酵素として知られ
ているが、本方法においては、ガラクトシル-マルトオ
リゴ糖あるいはその誘導体を生成させる転移活性の強い
β−ガラクトシダーゼを使用することができる。この酵
素は、ラクトース残基をβ−１，４−ガラクトシド結合
でマルトオリゴ糖の非還元末端グルコース残基に転移す
る。その結果、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリ
ゴ糖を得ることができる。

【００３１】β-ガラクトシダーゼとしては、具体的に
は、特開平３-２６４５９６に述べられているようにバ
チルス・サーキュランス（Bacillus circulans）起源の
酵素製剤「Biolacta」（大和化成（株)製）、アスペル
ギルス・オリゾエ（Aspergillusoryzoe）起源の酵素製
剤「Lactase Fアマノ」（天野製薬（株）製）、同じく
「Lactase Y-AO」（ヤクルト（株））、あるいは特開昭
６２-１３０６９５記載のクリプトコッカス（Cryptococ
cus）属起源のものを挙げることができる。更に、ガラ
クトース残基を主にβ-1,4-結合でマルトオリゴ糖ある
いはその誘導体の非還元末端グルコース残基に転移し得
るバチルス属あるいはクリプトコッカス属由来の酵素が
使用可能であるが、好ましくは温度安定性が高いバチル
ス属由来の酵素を使用することができる。

【００３２】ガラクトシル残基を有する糖としては、重
合度２以上のβ−１，４−ガラクトシルオリゴ糖又は乳
糖等を用いることができる。マルトオリゴ糖としては、
グルコースの重合度３〜７の直鎖マルトオリゴ糖、又は
これらの混合物を用いることができる。例えば、マルト
トリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオ
ース等を挙げることができる。

【００３３】

【発明の効果】本発明の製造法は、高純度のβ−１，４
−ガラクトシル-マルト−ス精製することを容易にす
る。詳しくは、β−１，４−ガラクトシル−マルトース
と近似する分子量を持つ、β−１，６体（異性体）を生
成することなく、残存原料及び副生成物を低分子化し
て、分子量による分離工程によりβ−１，４−ガラクト
シル−マルトースを精製することを容易にした。従っ
て、高価で処理能力の低いゲル濾過精製法を用いること
なく、工業的規模で簡便に高純度のβ−１，４−ガラク
トシル−マルトースを製造することができるようにな
り、精製工程の効率が極めて向上した。これは、実用上
多大な効果をもたらすものである。

【００３４】

【実施例】以下に本発明を実施例により更に説明する。
下記の実施例における糖組成は試料を高速液体クロマト
グラフィー（ＨＰＬＣ）により分析し、ピーク面積より
算出した。ＨＰＬＣは以下の条件で行った。カラム；Sh
odex RS-pak DC-613 ( 6 I.D.mm×150mm），溶離液；ア
セトニトリル／水＝70/30(v/v)，流速；0.9 ml/min，カ
ラム温度；室温，検出器；ＲＩモニターまたはＵＶ検出
器（310nm）。また酵素活性測定法は以下のようにして
行った。

【００３５】β-ガラクトシダーゼの活性測定法 0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニルβ-ガラクトシドと2
5mMリン酸緩衝液(pH6.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間
予備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添
加して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlに0.2M炭
酸ナトリウム2mlを添加し405nmの吸光度を測定した。遊
離したpNP量は検量係数設定用4-ニトロフェノール(和光
純薬工業（株）製)を用いて作成した検量線を求めた。
なお上記条件で1分間に1μmolのpNPを遊離する酵素量を
1単位（U）とした。

【００３６】β-グルコシダーゼの活性測定法 0.5mlの0.5%(w/v)p-ニトロフェニルβ-グルコシドと25m
Mリン酸緩衝液(pH6.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間予
備加温した。適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加
して35℃、10分間反応させた後、反応液1mlに0.2M炭酸
ナトリウム2mlを添加し405nmの吸光度を測定した。pNP
量は検量係数設定用4-ニトロフェノール(和光純薬工業
(株)製)を用いて検量線を求めた。なお上記条件で1分間
に1μmolのpNPを遊離する酵素量を1Uとした。

【００３７】β-ガラクタナーゼの活性測定法 0.5mlの1.0%大豆アラビノガラクタンと50mMの酢酸緩衝
液(pH4.5)0.45mlを混合し、35℃で5分間予備加温した。
適する濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して35℃、10
分間反応させた後、反応液1mlにDNS試薬1ml添加し、10
分間煮沸後、冷却し、蒸留水5mlを添加後、510nmの吸光
度を測定した。遊離した還元糖量はガラクトースを標準
として用いて作成した検量線から求めた。なお上記条件
で1分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1Uとし
た。

【００３８】サーモモノスポラ（Thermomonospora）属
放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼの活性測定法 0.35mlの100mMの酢酸緩衝液(pH6.0)に1.0%になるように
可溶性澱粉溶解しし、55℃で5分間予備加温した。適す
る濃度に希釈した酵素液0.05mlを添加して55℃、10分間
反応させた後、反応液1mlにDNS試薬を1ml添加し、10分
間煮沸後、冷却し、蒸留水5mlを添加後、510nmの吸光度
を測定した。遊離した還元糖量はグルコースを標準とし
て用いて作成した検量線から求めた。なお上記条件で1
分間に1μmolの還元糖を遊離する酵素量を1Uとした。

【００３９】実施例１各種酵素剤の選択 乳糖19.85g(58.0mmol)及びマルトテトラオース38.7g(5
8.0 mmol)を100mlの50mMリン酸緩衝液中(pH7.0)に分散
させ、β-ガラクトシダーゼ製剤「Biolacta」（5.4 U/m
g,大和化成（株）製, Bacillus circulans起源）を200
U添加し40℃で5時間反応させて、β-1,4-ガラクトシル
−マルトテトラオースを生成させた。次いで5%塩酸溶液
で反応液のpHを3.5に調整した後、5分間煮沸し、酵素を
失活させた。本反応液の糖組成を上記ＨＰＬＣにより分
析したところ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオー
スは10.5%、β-1,6-ガラクトシルマルトテトラオース1.
0%、ガラクトシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは
3.2%、ガラクトシル-ガラクトシル-ラクトースは7.0%、
ガラクトシル-ラクトースは2.1%、マルトテトラオース
は30.5%、ラクトースは24.8%、グルコースは11.5%、ガ
ラクトースは3.7%でその他オリゴ糖は6.7%であった。

【００４０】上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10ml
に、サーモモノスポラ（Thermomonospora）属放線菌が
生産する糖化型α−アミラーゼＴＦ９０（日本食品化工
(株)）50 Uと各種酵素剤をそれぞれ50 U添加し、24時
間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより分析した
結果を表１に示した。また次に表１の結果から本発明の
目的に合致したβ-ガラクトシダーゼ「ラクトザイム」
「ＧＯＤＯ−ＹＮＬ」「ＢＧＨ−１０１」（アーモンド
由来，東洋紡（株）製）およびβ-1,4-ガラクタナーゼ
「ペクチナーゼＧアマノ」「ペクチネックス」を選択
し、β-1,4-ガラクタナーゼ及びβ-ガラクトシダーゼ2
種類の酵素剤を順次作用させた場合の加水分解について
検討した。上記反応失活液を10倍に希釈した溶液10ml
に、まずβ-1,4-ガラクタナーゼ剤をそれぞれ50 U添加
し、24時間，40℃で反応させた後、酵素を煮沸失活させ
た。次いでβ-ガラクトシダーゼをそれぞれ50 U添加
し、24時間，40℃で反応させた糖組成をＨＰＬＣにより
分析した結果を表２に示した。

【００４１】

【表１】 ＋＋：70〜100%程度分解する ＋ ：10〜70%程度分解する ± ：〜10%程度分解する − ：分解しない

【００４２】

【表２】

【００４３】実施例２β-1,4-ガラクトシル-マルトースの調製 乳糖2.0kg(5.8mol)及びマルテトラオース3.9kg(5.8mol)
を10リットルの50mMリン酸緩衝液中（pH 7.0）に分散さ
せ、β-ガラクトシダーゼ製剤（Biolacta、5.4U/mg,大
和化成（株）製）を2 X 10⁴ U添加し40℃で5時間反応さ
せ、β-1,4-ガラクトシル-マルトテトラオースを生成さ
せた。次に5%塩酸溶液で反応液のpHを3.5にした後、5分
間煮沸し、上記酵素を失活させた。本反応液の糖組成を
上記ＨＰＬＣにより分析したところ、β-1,4-ガラクト
シル-マルトテトラオースは10.5%、β-1,6-ガラクトシ
ル-マルトテトラオースは1.0%、ガラクトシル-ガラクト
シル-マルトテトラオースは3.2%、ガラクトシル-ガラク
トシル-ラクトースは7.0%、ガラクトシル-ラクトースは
2.1%、マルトテトラオースは30.5%、ラクトースは24.8
%、グルコースは11.5%、ガラクトースは3.7%でその他オ
リゴ糖は6.7%であった。

【００４４】本反応失活液を10倍に希釈した溶液をpH
6.0に調整し、β-1,4-ガラクトシル-マルトースを生成
させるためにサーモモノスポラ（Thermomonospora）属
放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼを5 X 10⁴ U、
反応原料のマルトテトラオース及びアミラーゼの作用に
より生ずるマルトオリゴ糖を分解するために、Rhizopus
nives起源グルコアミラーゼ（生化学工業（株）製）を5
X 10⁵ Uおよびガラクトシル-ラクトース、ガラクトシ
ル-ガラクトシル-ラクトースまたはガラクトシル-ガラ
クトシル-マルトテトラオースを分解するためにAspergi
llus pulverulent起源の酵素製剤「ペクチナーゼＧア
マノ」（天野製薬（株）製）を2 X 10⁵ U添加し、37℃
で24時間反応させた。

【００４５】次に本反応失活液のpHを6.5に調整し、原
料の乳糖を分解させるために、クリベロマイセス・ラク
ティス（Kluyvermyces lactis）起源の酵素製剤「ＧＯ
ＤＯ−ＹＮＬ」（合同酒精（株））を1 X 10⁵ U添加
し、40℃で24時間反応させた。反応終了は5%塩酸溶液で
反応液のpHを3.5にした後、5分間煮沸し、上記酵素を失
活させた。本液の糖組成をＨＰＬＣにより分析したとこ
ろ、β-1,4-ガラクトシル-マルトースは12.2 %、ガラク
トシル-ガラクトシル-マルトトリオースは1.5%、グルコ
ースが62%、ガラクトースが22%で、ラクトースとガラク
トシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-ラク
トースを含めたその他のオリゴ糖は2.3%であった。

【００４６】上記酵素反応液を逆浸透膜モジュール（Ｄ
Ｋ４０４０ＣＤＡ，デサリネイション社製）を用いて圧
力20 kgf/cm²で10時間処理したところ、本液の糖組成
は、β-1,4-ガラクトシル-マルトースは57.4%、ガラク
トシル-ガラクトシル-マルトテトラオースは5.3%、グル
コースが8.8%、ガラクトースが5.5%で、ラクトースとガ
ラクトシル-ラクトース、ガラクトシル-ガラクトシル-
ラクトースを含めたその他のオリゴ糖は27.5%であっ
た。

【００４７】本操作により目的とするβ-1,4-ガラクト
シル-マルトースは最初の反応終了液の含量に比較して
５．５倍に向上した。本液250ml（40%,w/v，固形物とし
て100g）をToyopeal HW-40S（トーソー(株)製）を充填
したカラム（13cm,I.D×95cm）を用い、カラム温度；65
℃、流速；5ml/min、検出器：ＲＩモニターでゲル濾過
により精製し、純度98.5%のβ-ガラクトシル-マルトー
ス49.5g（固形物）を得た。

【００４８】実施例３β-1,4-ガラクトシル-マルトースの調製（その２） 実施例２で調製したβ-1,4-ガラクトシル-マルトースは
12.2 %の反応液を、さらに高純度にするために、この反
応液を原糖液として、樹脂分画法を行った。樹脂は、ア
ルカリ土類金属型強カチオン交換樹脂（ダウケミカル社
製造、商品名ダウエックス５０Ｗ×４、Ｍｇ⁺⁺型、架橋
度４％）を使用し、内径５．４ｃｍのジャケット付ステ
ンレス製カラムに水懸け濁液で充填し、その液が直列に
流れるようにカラム６本を連結して、樹脂槽全長が３０
ｍになるように充填した。カラム内温度を７５℃で維持
しつつ、原糖液を樹脂に対して、６．６ｖ／ｖ％加え、
これに７５℃の温水をＳＶ０．１３の流速で流して分画
した。得られた分画品を溶出順にサイドカラムにかけて
分画し、純度90%以上ののβ-ガラクトシル-マルトース
高含有画分を58.5g採取した。

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ラクトース並びにガラクトシル−ラクト
   ース、ガラクトシル−ガラクトシル−ラクトース、及び
   ガラクトシル−ガラクトシル−マルトテトラオースから
   なる群から選ばれる少なくとも１種のガラクトシル−オ
   リゴ糖が共存するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオ
   リゴ糖（以下、原料混合物という）に、β−１，４−ガ
   ラクトシル−マルトースを選択的に生成する酵素を作用
   させて、β−１，４−ガラクトシル−マルトースを製造
   する方法であって、 ラクトースを優先的に加水分解する酵素と上記ガラクト
   シル−オリゴ糖の少なくとも１種を優先的に加水分解す
   る酵素とを、上記原料混合物又はβ−１，４−ガラクト
   シル−マルトースを含む生成物に作用させて、ラクトー
   ス及び上記マルトオリゴ糖を低分子化する工程を含むこ
   とを特徴とする方法。
2. 【請求項２】 ラクトース及び上記ガラクトシル−オリ
   ゴ糖の少なくとも１種を低分子化して得られた生成物か
   らβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを分離して高
   純度のβ−１，４−ガラクトシル−マルトースを得る請
   求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 β−１，４−ガラクトシル−マルトース
   を選択的に生成する酵素が、サーモモノスポラ（Thermo
   monospora）属放線菌が生産する糖化型α−アミラーゼ
   である請求項１又は２に記載の製造方法。
4. 【請求項４】 ラクトースを優先的に加水分解する酵素
   が、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼから
   なる群から選ばれる少なくとも１種の酵素である請求項
   １〜３のいずれか１項に記載の製造方法。
5. 【請求項５】 β−ガラクトシダーゼが、β−ガラクト
   シル−マルトース難分解性酵素である請求項４に記載の
   製造方法。
6. 【請求項６】 β−グルコシダーゼが、乳糖分解能を有
   するβ−グルコシダーゼである請求項４又は５に記載の
   製造方法。
7. 【請求項７】 上記ガラクトシル−オリゴ糖の少なくと
   も１種を優先的に加水分解する酵素が、β−ガラクタナ
   ーゼである請求項１〜６のいずれか１項に記載の製造方
   法。
8. 【請求項８】 β−ガラクタナーゼが、β−１，４−ガ
   ラクタナーゼである請求項７に記載の製造方法。
9. 【請求項９】 原料混合物がガラクトシル残基を有する
   糖及びマルトオリゴ糖に、β−ガラクトシダーゼを作用
   させて得られるものである請求項１〜８のいずれか１項
   に記載の製造方法。
10. 【請求項１０】 β−ガラクトシダーゼがラクトース残
    基をβ−１，４−ガラクトシド結合でマルトオリゴ糖の
    非還元性末端グルコース残基に転移し得る酵素である請
    求項９に記載の製造方法。
11. 【請求項１１】 ガラクトシル残基を有する糖が重合度
    ２以上のβ−１，４−ガラクトシルオリゴ糖又は乳糖で
    ある請求項９又は１０に記載の製造方法。
12. 【請求項１２】 マルトオリゴ糖が、グルコースの重合
    度３〜７の直鎖マルトオリゴ糖、又はこれらの混合物で
    ある請求項９〜１１のいずれか１項に記載の製造方法。