JP3682931B2 - ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法 - Google Patents
ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3682931B2 JP3682931B2 JP00663195A JP663195A JP3682931B2 JP 3682931 B2 JP3682931 B2 JP 3682931B2 JP 00663195 A JP00663195 A JP 00663195A JP 663195 A JP663195 A JP 663195A JP 3682931 B2 JP3682931 B2 JP 3682931B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- galactosyl
- maltooligosaccharide
- derivative
- producing
- amylase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用なβ−１，４−Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−マルトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法に関する。更に詳しくは酵素の逆合成及び加水分解作用を利用した簡易で工業的に有用なβ−１，４−Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−マルトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの体液、例えば血液、尿等の含まれるα−アミラーゼの活性を測定し臨床診断に応用することが広く行われている。本発明者らはα−アミラーゼ活性の測定の際に、共役酵素（α−あるいはβ−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等）の作用を受けない安定な基質を得る目的で、ｐ−ニトロフェニルα−マルトオリゴシドの非還元末端グルコース残基に、ガラクトシル基がβ−結合した誘導体の製造方法、およびそれを用いるアミラーゼ活性測定法を既に提案している〔特開平３−２６４５９６号、特開平６−８６６８３号〕。
【０００３】
上記のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法（改良法）は、例えばマルトオリゴ糖とラクトースの混合物を緩衝溶液中に溶解し、β−ガラクトシダーゼを作用させて、ガラクトシル−マルトオリゴ糖を得て、このガラクトシルオリゴ糖と還元末端グルコース残基に発色団の結合したマルトオリゴ糖誘導体、例えばｐ−ニトロフェニルα−グルコシドとを緩衝溶液中に溶解し、オリゴ糖生成アミラーゼを作用させ、ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体を製造するものである。この方法は、従来の非還元末端のグルコースを化学修飾する方法（例えば、特開昭６０−５４３９５号、同６０−８７２９７号、同６０−２３７９９８号、同６１−６３２９９号、同６３−３０１８９２号、特開平１−１５７９９６号）に比較して簡易で効率の良い方法であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のオリゴ糖生成アミラーゼを用いる方法で、例えばｐ−ニトロフェニル４−Ο−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシドを得たい場合、この目的生成物が全ｐＮＰ誘導体（原料に用いたｐＮＰ−α−グルコシドも含む）中に約１０〜１５モル％程度生成する。しかしながら、上記目的生成物以外に重合度が近接している、ｐ−ニトロフェニル４−Ο−β−ガラクトシル−α−マルトトリオシド、ｐ−ニトロフェニル４−Ο−β−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド及びｐ−ニトロフェニル４−Ο−β−ガラクトシル−α−ヘキサオシドなどが多量に副生する。そのため、反応生成物から目的生成物を得るためには、分離精製が必要である。しかし、重合度が近いことから分画精製は非常に煩雑かつ困難であり、高純度の目的物を経済的に効率良く得ることは困難であった。
【０００５】
さらに、前記のオリゴ糖生成アミラーゼを用いる方法では、製法上の理由から、糖残基供与体基質のガラクトシルマルトオリゴ糖中には、主成分であるβ−１，４−ガラクトシルα−Ｄ−マルトオリゴ糖以外に異性体であるβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖（β−１，６体）が約１０重量％程度含まれる。そして、上記β−１，６体を含む原料を用いて、従来法で使用されているシュードモナス ステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のマルトテトラオース（Ｇ４）生成アミラーゼで糖転移反応を行うと、最終製品であるガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体に１０重量％程度のβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が副生してしまう。
【０００６】
α−アミラーゼ活性測定基質としての感度を比較した場合、β−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体はβ−１，４−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の約１／３と低い。そのため、β−１，６体を各種クロマトグラフィーによる分離除去することが必要であったが、工業的規模でβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体を除去することは非常に煩雑かつ困難であり、経済的にも大きな問題であった。
【０００７】
そこで本発明の目的は、目的とする重合度のマルトオリゴ糖誘導体の選択率が高く、かつ原料中にβ−１，６体が共存しても、β−１，６誘導体の副生も少ないか、実質的に生成しないβ−１，４−Ｄ−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖とΟ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体との混合物に、マイクロコッカス エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）２０７起源のマルトテトラオース生成アミラーゼを作用させることを特徴とする下記一般式（１）（式中、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは３、４、５又は６を示す）で表されるβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法。
【０００９】
【化２】
【００１０】
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の原料であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖は下記の一般式（２）（式中、ｍは３〜７の整数を示す）で表わされる。
【００１１】
【化３】
【００１２】
上記β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖は公知の方法により製造することができる。例えば、特開平３−２６４５９６号や特開平６−８６６８３号に記載されている、少なくとも１種のマルトオリゴ糖とβ−ガラクトシル残基を持つ糖との混合物にβ−ガラクトシダーゼを作用させることで得ることができる。上記β−ガラクトシル残基の受容体原料としてはマルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース）またはこれらの混合物が使用できる。工業的規模での製造を考慮した場合、混合物を使用することは、価格の面で非常に有利である。もう一つの出発原料であるβ−ガラクトシル残基の供与体は、例えばラクトース、ガラクトシル−ラクトースあるいはそれらの混合物を使用することが出来る。
【００１３】
β−ガラクトシダーゼは、β−ガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離する酵素と知られている。上記転移反応で主にβ−１，４−ガラクトシド結合を生成し得る酵素であればいずれの起源の市販β−ガラクトシダーゼを用いても良い。例えば、大和化成（株）製β−ガラクトシダーゼ（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来、商品名：Ｂｉｏｌａｃｔａ）を用いることができる。この糖転移反応において基質濃度は１０〜４０％とすることが適当である。β−ガラクトシダーゼを適量添加し、２０〜６０％℃の範囲で４〜２４時間反応させる。煮沸失活後、グルコアミラーゼを添加し、残存するマルトオリゴ糖を選択的に加水分解させる。反応終了後、ｐＨ調整または加熱により酵素反応を停止し、例えば逆浸透膜、限外濾過膜あるいはゲルカラムクロマトグラフィーにより分画を行なって、低分子画分を除去して本発明において原料として使用するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖（２）を得ることができる。
【００１４】
但し、上記生成物中にはβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖中にβ−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖が混在することがある。本発明の方法では、β−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖が混在するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を用いても、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖が選択的に糖転移反応を起こすことから、混在するβ−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を反応前に除去する必要はない。但し、β−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を含まないβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を反応原料として用いることも勿論できる。
尚、ガラクトシル−マルトオリゴ糖は上記のように酵素法によらず、例えば化学合成法によっても入手することは可能であり、本発明の方法では、このようなガラクトシル−マルトオリゴ糖も原料として使用できることは勿論である。
【００１５】
本発明の方法のもう一方の原料は「Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体」である。この「Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体」は、上記β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖残基の受容体として働く。
「Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体」は、例えば、下記一般式（３）で示される化合物（式中、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基であり、ｘは０、１又は２である）であることができる。
【００１６】
【化４】
【００１７】
Ｒで示される置換フェニル基の置換基としては、例えば、ニトロ基、クロル基等を挙げることができ、置換フェニル基としては、例えば、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基等を挙げることができる。一般式（３）で示される化合物の具体例としては、ｐ−ニトロフェニルα−グルコシド、ｐ−ニトロフェニルα−マルトシド、ｐ−ニトロフェニルα−マルトトリオシド等を例示できるが、工業的生産を考慮した場合、比較的安価なグルコシド及びマルトシドを用いることが望ましい。尚、Ｒで示される配糖体のアグリコン部の結合様式はα体、β体いずれでも良い。
【００１８】
本発明の方法によれば、目的とする生成物に応じて、原料であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖とΟ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体との組合せを選ぶことで、目的物を選択的に得ることができる。原料の組合せと主生成物の関係を以下の表１に示す。尚、表中、Ｇａｌ−Ｇｙ（ｙ：４〜８）は、原料であるガラクトシル−マルトオリゴ糖である。ｐＮＰ−Ｇｘ（ｘ：１〜３）のｐＮＰはｐ−ニトロフェニルであり、ＣＮＰ−Ｇｘ（ｘ：１〜３）のＣＮＰはクロロニトロフェニルであり、ｐＮＰ−Ｇｘ及びＣＮＰ−Ｇｘは、もう一方の原料であるＯ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体である。そして主生成物は、Ｇａｌ−Ｇｚ−ｐＮＰまたはＧａｌ−Ｇｚ−ＣＮＰ（ｚ：４〜７）で表される。
【００１９】
【表１】
【００２０】
また、本発明の方法で使用するマルトテトラオース生成アミラーゼ（Ｇ４生成アミラーゼ）を生産するマイクロコッカス エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）２０７菌は、微工研菌寄第９８７８号（ＦＥＲＭ Ｐ−９８７８）として寄託されている。
【００２１】
上記２０７菌由来のＧ４生成アミラーゼについては、特開平１−２１８５９８号あるいは木村らの文献等［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ．，５４巻，１０６６頁（１９８８年），Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，５３巻，２０１９頁（１９８９年），Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，５３巻，２９６３頁（１９８９年），Ｓｔａｒｃｈ，４２巻，４０３頁（１９９０年），Ａｐｐｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３４巻，５２頁（１９９０年），Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７０巻，１３４頁（１９９０年），ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７０巻，３５頁（１９９０年）］に詳細に説明されている。
【００２２】
２０７菌由来のＧ４生成アミラーゼの性質は以下のとおりである。
１）作用：アミロペクチン、アミロース、澱粉等、及びそれらの部分加水分解物のα−１，４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状構造をエンド型に加水分解し、主成分としてマルトテトラオースを生成する。そしてその生成物のアノマー型はαタイプである。
２）基質特異性：マルトペンタオース以上の重合度を有するα−１，４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状マルトオリゴ糖を加水分解する。（Ｃ3 −Ｃ7 を基質としたとき、遊離するグルコース量が、Ｃ1 の時を１００とすると、Ｃ2 ：３．１、Ｃ3 ：１４．２、Ｃ4 ：８４．３、Ｃ5 ：３２．５であった。）
３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは７．５〜８．０である。また３０℃、５時間の条件下において、ｐＨ５．５〜１１の範囲で安定である。
４）作用適温：約６０℃
５）失活条件：５０℃、１ｈの加熱で７５％失活。６０℃、１ｈでは９８％以上失活。
６）阻害、活性化及び安定化：エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）で阻害されるがカルシウム塩で回復する。カルシウム塩によって活性化及び安定化される。
７）分子量：約４２万（ゲル濾過法）、１８５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【００２３】
本発明では、上記２０７菌を培養して得られる培養上清濃縮物をＧ４生成アミラーゼを含有する粗酵素含有液としてそのまま、本発明の方法に用いることができる。さらに、上記粗酵素をエタノール、アセトン、イソプロパノール等による溶媒沈澱法、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クマトグラフィー等の通常の方法を用いて精製した後に、本発明の製造方法に用いることも出来る。
なお、本発明に用いるＧ４生成アミラーゼは以下の方法で酵素活性を測定することができる。
【００２４】
０．１Ｍリン酸緩衝液を含む１％可溶性澱粉溶液３００μｌを４０℃の恒温浴槽中で５分間予備加温した後、適当に希釈された酵素液１００μｌを添加し、同じく４０℃で１０分間反応させる。ＤＮＳ試薬１ｍｌを加え、反応を停止した後、１０分間煮沸し、流水中で冷却後、脱イオン水５ｍｌを加え、５１０ｎｍにおける吸光度を測定する。
ここで１単位の酵素活性は同条件下で１分間に１μｍｏｌ（マイクロモル）のグルコースを生成する酵素量とする。
【００２５】
本発明の糖移転反応において、ガラクトシル−マルトオリゴ糖（２）の基質濃度は、例えば、１０〜４０％の範囲とすることが適当である。また、Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体（３）の基質濃度は、例えば、５〜３０％とすることが適当である。
酵素を上記基質の混合物に添加し、例えば１０〜２４時間、例えば２０〜６０℃の範囲の温度で反応させることで、本発明のβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体（１）を生成させることができる。
【００２６】
本発明の上記反応は、水−親水性有機溶媒の混合溶媒中で行うことが目的生成物の収率を高めるという観点から好ましい。上記混合溶媒に用いる親水性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルホキサイド、エチレングリコール等を挙げることができる。また、混合溶媒には、親水性有機溶媒の２種以上を併用することもできる。混合溶媒における親水性有機溶媒の含有率は、例えば約２０〜８０％、好ましくは約３０〜７０％とすることが適当である。
【００２７】
上記酵素反応後、加熱あるいはｐＨを低下させることにより、酵素反応を停止し、例えばカラムクロマトグラフィーにより分画を行ない、ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体（１）を容易に単離することができる。尚、上記カラムクロマトグラフィーには、例えば、トヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）ＨＷ−４０Ｓゲルを充填したカラムを用いて分画する方法を挙げることができる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法は、体液α−アミラーゼの活性測定用基質として有用なβ−１，４−Ｄ−ガラクトシルα−１，４−Ｄ−マルトオリゴ糖（グルコース部分の重合度４〜７）誘導体の大量調整に適した方法として極めて有用である。
即ち、従来法においては糖移転反応に使用されてきた酵素の特性から重合度が近接した各種の糖転移物が生成し、これらを分別精製することは技術的にもまた経済的にも大きな問題点を残していた。しかし、本発明方法によれば従来方法に比し、主生成物の生成率が高いばかりでなく生成割合も非常に高いので、分別精製が容易となり、工程も簡略化し得るので、経済的にも大きな利点がある。
【００２９】
しかも、従来法ではα−アミラーゼ基質としての有用性に乏しいβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が約１０重量％程度生成していたのに対し、本発明方法では全く生成しないか、もしくは実質的に無視し得る程度にしか生成しない。そのため、β−１，６体の除去に要した煩雑な精製操作が不要となるので経済的に非常に有利となるばかりでなく、得られる製品の品質面においても大きな技術的なメリットが得られる。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
参考例
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌Ｎｏ．２０７株を先に述べた木村らの方法で培養して得た。即ち、バクトトリプトン２％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％、可溶性澱粉２％、Ｋ2 ＨＰＯ 4 ０．１％、ＭｇＳＯ 4・７Ｈ2 Ｏ ０．０２％、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、１ｐｐｍを含む１０リットルの液体培地（ｐＨ９）に予め同上培地で２４時間３０℃で回転振盪培養して得た１リットルのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌Ｎｏ．２０７株懸濁液を無菌的に接種し、３０℃、通気量１．５ｖ．ｖ．ｍ及び回転数３００ｒｐｍで４０時間通気攪拌培養した。ついで１２，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離をして菌体を除いて得た上清液をフィルトロン社製ＵＦ膜を用いて濃縮して２３５単位（Ｕ）／ｍｌの粗Ｇ４生成アミラーゼ濃縮液２５０ｍｌを得た。
【００３１】
該アミラーゼ濃縮液に７５％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一夜冷室（４℃）中に放置して生成した沈澱物を遠心分離（１２，０００ｇ、４℃、１０分間）して集め、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．３）に対して充分に透析した。ついで０．１Ｍ、ＮａＣｌを含む同上緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー製）カラムに通液して酵素を吸着させた後、同上緩衝液に含まれる０．１Ｍから０．５ＭのＮａＣｌの濃度匂配法で酵素を溶出させた。活性画分を集め、硫酸アンモニウムを加えて１５％飽和とした後、１５％飽和の硫酸アンモニウムを含む同上緩衝液で平均化したブチル・トヨパール６５０Ｓ（東ソー製）カラムに通液して酵素を吸着させた。ついで同上緩衝液に含まれる１５％飽和から０％飽和の硫酸アンモニウムの濃度匂配法で酵素を溶出させた結果、約１２％飽和の硫酸アンモニウム濃度に主要活性画分が、そして７％飽和に少量のアミラーゼ活性画分が得られたので主要活性画分を集め、アミコン社製ＵＦ膜（ＰＭ１０）を用いて濃縮し、１，５２８Ｕ／ｍｌの精製酵素１５ｍｌを得た。
【００３２】
ついで本精製酵素の分子量及び等電点をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法並びに焦点電気泳動法により測定した結果、約１８５，０００およびｐＨ４．８であった。また、酵素反応の最適のｐＨおよび温度についても検討した結果、それぞれ５５〜６０℃および７．５〜８．０であり、これらは木村らが報告した数値とほぼ同一であった。
【００３３】
実施例１
参考例で得られた精製酵素（Ｇ４生成アミラーゼ）８２Ｕを一連のβ−Ｄ−ガラクトシル−α−Ｄ−マルトオリゴ糖［日本食品化工（株）製］４００ｍｇとｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコシド（ｐＮＰ−α−Ｇ１）１００ｍｇを含む３０％（Ｖ／Ｖ）メタノール水溶液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌに添加し、３０℃で２時間反応させた。直ちに得られた反応液中に含まれる糖転移生成物の含有率をＳｈｏｄｅｘ ＲＳ−ｐａｋ ＤＣ−６１３［昭和電工（株）製］カラムを用いる高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法で測定した結果を表２に示す。
なお、本測定の移動相には７２／２８＝アセトニトリル／水（Ｖ／Ｖ，％）を用い、０．９ｍｌ／分の流速で、検出は３１０ｎｍで行なった。なお、表中の値は紫外部吸収を有する全糖誘導体中の割合を重量％で示す。
【００３４】
比較例１
比較のため、従来から用いられてきたシュウドモナス ステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ［日本食品化工（株）製、商品名オリゴアミラーゼ］を上記条件で作用させた後、実施例１と同様な方法で糖転移生成物の含有率を測定した結果を表３に示す。
【００３５】
【表２】
実施例１の結果
表中（ ）内は同一重合度の糖転移生成物中のβ−１，６−Ｄ−ガラクトシルα−Ｄ−マルトオリゴシド誘導体の割合を重量％で示している。
【００３６】
【表３】
比較例１の結果
表中（ ）内は同一重合度の糖転移生成物中のβ−１，６−Ｄ−ガラクトシルα−Ｄ−マルトオリゴシド誘導体の割合を重量％で示している。
【００３７】
その結果、表２及び表３から明らかなように、本発明方法によれば各種重合度のガラクトシルマルトオリゴ糖、特にマルトオリゴ糖の重合度４〜７のガラクトシルマルトオリゴ糖を糖残基の供与体とし、ｐＮＰ−α−Ｇ１を受容体とした場合、体液α−アミラーゼ活性測定用として有用なｐＮＰ−β−Ｄ−ガラクトシルα−Ｄ−マルトテトラオシド（Ｇａｌ−Ｇ４−ｐＮＰ）およびｐＮＰ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−Ｄ−マルトペンタオシド（Ｇａｌ−Ｇ５−ｐＮＰ）がより選択的に生成した。
さらに、特筆すべき事として、従来法ではα−アミラーゼの基質として有用ではないβ−１，６−Ｄ−ガラクトシルα−Ｄ−マルトオリゴ糖誘導体が約１０重量％程度生成し、その除去精製が非常に煩雑かつ困難であったが、本発明方法によれば実質的に無視し得る程度もしくは全く生成しない点で大きな優位性を有することが明らかである。
【００３８】
実施例２
乳糖１００ｇとマルトオリゴ糖混合物［日本食品化工（株）製、商品名フジオリゴＧ６７Ｓ］３００ｇ、β−ガラクトシダーゼ［大和化成（株）製、商品名ＢＩＯＬＡＣＴＡ、、１０，１００Ｕ／ｇ］１３０ｍｇを含む１リットルの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４０℃で５時間反応させた。ついで沸騰水浴中で５分間加熱して酵素を失活させた後、グルコアミラーゼ［生化学工業（株）製、３９．９Ｕ／ｍｇ］を２，０００Ｕ添加してｐＨ５．５で一晩反応させて未反応のマルトオリゴ糖をグルコースに加水分解してガラクトシルマルトオリゴ糖１２．６％を含む糖質を得た。
なお、糖組成の分析は実施例１と同様なＨＰＬＣ法にて測定した。また含有率は全糖質中の重量％で示した。該操作で得られた約４００ｇの反応糖質中のガラクトシルマルトオリゴ糖をトヨパールＨＷ−４０Ｓ［東ソー製］を用いるゲル濾過法で精製分取し、約４１．５ｇの凍結乾燥粉末を得た。本凍結乾燥粉末中の糖組成を上記方法にて分析した結果、Ｇａｌ−Ｇ４が１．８％、Ｇａｌ−Ｇ５が１６％、Ｇａｌ−Ｇ６が４５％、Ｇａｌ−Ｇ７が３０％であった。
【００３９】
ついで、得られた４ｇの凍結乾燥粉末及び１ｇのｐＮＰ−α−Ｇ１を、参考例で得た粗Ｇ４生成アミラーゼ８００Ｕおよび終濃度３０％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを含む１０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０℃で２時間加温して糖転移反応を行った。生成するガラクトシルマルトオリゴ糖のｐＮＰ誘導体を実施体１記載の方法で測定した。結果を表４に示す。
【００４０】
比較例２
参考例で得たＧ４生成アミラーゼに代えて、比較例１で用いたシュウドモナスステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ８００Ｕを用いた以外は、実施例２と同様な条件で反応させた。結果を表４に示す。
【００４１】
【表４】
（ ）内は同一重合度の糖転移反応生成物中に占めるβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の生成率を重量％で示している。
【００４２】
表４から明らかなように、糖残基の供与体基質にＧａｌ−Ｇ５，Ｇａｌ−Ｇ６及びＧａｌ−Ｇ７を主成分とするガラクトシルマルトオリゴ糖混合物を、そして受容体基質にｐＮＰ−α−Ｇ１を用いた場合でも本発明の主生成物はＧａｌ−Ｇ５−ｐＮＰであり、その生成率は従来法に比較し、非常に高かった。また、他の副生成物の生成が非常に少ないばかりでなく、α−アミラーゼ基質として不要なβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体も殆ど生成しなかった。一方、従来法では約１０重量％程度のβ−１，６−体が生成した。
【００４３】
実施例３
糖受容体基質であるｐＮＰ−α−Ｇ１に代えて２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシド（ＣＮＰ−β−Ｇ１）を用い、溶媒をｎ−プロパノールに代えた他は実施例２に記載した同一条件で反応を行ないガラクトシルマルトオリゴ糖ＣＮＰ誘導体を得た。結果を表５に示す。
比較例３
参考例で得たＧ４生成アミラーゼに代えて、比較例１で用いたシュウドモナスステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ８００Ｕを用いた以外は、実施例３と同様な条件で反応させた。結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
（ ）内は同一重合度の糖転移反応生成物中に占めるβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の生成率を重量％で示している。
【００４５】
表５から明らかなように、糖受容体基質をｐＮＰ−α−Ｇ１からＣＮＰ−β−Ｇ１に変更しても本発明の主生成物はＧａｌ−Ｇ５−ＣＮＰであり、生成比率も従来法に比較し、非常に高かった。また、同様にβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体は殆ど生成しなかった。一方、従来法ではやはりβ−１，６体が約１０重量％程度生成た。
【００４６】
実施例４
糖受容体基質であるｐＮＰ−α−Ｇ１に代えてｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−マルトシド（ｐＮＰ−α−Ｇ２）［日本食品化工（株）製］を用い、溶媒をｎ−プロパノールに代えた他は実施例２に記載した同一条件で反応を行ないガラクトシルマルトオリゴ糖ｐＮＰ誘導体を得た。結果を表６に示す。
【００４７】
比較例４
参考例で得たＧ４生成アミラーゼに代えて、比較例１で用いたシュウドモナスステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ８００Ｕを用いた以外は、実施例４と同様な条件で反応させた。結果を表６に示す。
【００４８】
【表６】
（ ）内は同一重合度の糖転移反応生成物中に占めるβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の生成率を重量％で示している。
【００４９】
表６から明らかなように、糖受容体基質をｐＮＰ−α−Ｇ１からｐＮＰ−α−Ｇ２に変更した時、本発明の主生成物はＧａｌ−Ｇ６−ｐＮＰであり、生成比率も従来法に比較し、非常に高かった。また、同様にβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体は殆ど生成しなかった。一方、従来法ではやはりβ−１，６体が約１０重量％程度生成した。
【００５０】
実施例５
糖受容体基質であるｐＮＰ−α−Ｇ１に代えて２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−マルトトリオシド（ＣＮＰ−β−Ｇ３）を用いた他は実施例２に記載した同一条件で反応を行ないガラクトシルマルトオリゴ糖ｐＮＰ誘導体を得た。結果を表７に示す。
【００５１】
比較例５
参考例で得たＧ４生成アミラーゼに代えて、比較例１で用いたシュウドモナスステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ８００Ｕを用いた以外は、実施例５と同様な条件で反応させた。結果を表７に示す。
【００５２】
【表７】
（ ）内は同重合度の糖転移反応生物中のβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の生成率を重量％で示している。
【００５３】
表７から明らかなように、糖受容体基質ｐＮＰ−α−Ｇ１からＣＮＰ−β−Ｇ３に変更した時、本発明の主生成物はＧａｌ−Ｇ７−ＣＮＰであり、生成比率も従来法に比較し、非常に高かった。また、同様にβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体は殆ど生成しなかった。一方、従来法ではやはりβ−１，６体が約１０重量％程度生成した。
【産業上の利用分野】
本発明は、α−アミラーゼ活性測定用基質として有用なβ−１，４−Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−マルトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法に関する。更に詳しくは酵素の逆合成及び加水分解作用を利用した簡易で工業的に有用なβ−１，４−Ｄ−ガラクトシル−α−１，４−Ｄ−マルトオリゴ糖誘導体の新規な製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ヒトの体液、例えば血液、尿等の含まれるα−アミラーゼの活性を測定し臨床診断に応用することが広く行われている。本発明者らはα−アミラーゼ活性の測定の際に、共役酵素（α−あるいはβ−グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等）の作用を受けない安定な基質を得る目的で、ｐ−ニトロフェニルα−マルトオリゴシドの非還元末端グルコース残基に、ガラクトシル基がβ−結合した誘導体の製造方法、およびそれを用いるアミラーゼ活性測定法を既に提案している〔特開平３−２６４５９６号、特開平６−８６６８３号〕。
【０００３】
上記のガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法（改良法）は、例えばマルトオリゴ糖とラクトースの混合物を緩衝溶液中に溶解し、β−ガラクトシダーゼを作用させて、ガラクトシル−マルトオリゴ糖を得て、このガラクトシルオリゴ糖と還元末端グルコース残基に発色団の結合したマルトオリゴ糖誘導体、例えばｐ−ニトロフェニルα−グルコシドとを緩衝溶液中に溶解し、オリゴ糖生成アミラーゼを作用させ、ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体を製造するものである。この方法は、従来の非還元末端のグルコースを化学修飾する方法（例えば、特開昭６０−５４３９５号、同６０−８７２９７号、同６０−２３７９９８号、同６１−６３２９９号、同６３−３０１８９２号、特開平１−１５７９９６号）に比較して簡易で効率の良い方法であった。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
前記のオリゴ糖生成アミラーゼを用いる方法で、例えばｐ−ニトロフェニル４−Ο−β−ガラクトシル−α−マルトペンタオシドを得たい場合、この目的生成物が全ｐＮＰ誘導体（原料に用いたｐＮＰ−α−グルコシドも含む）中に約１０〜１５モル％程度生成する。しかしながら、上記目的生成物以外に重合度が近接している、ｐ−ニトロフェニル４−Ο−β−ガラクトシル−α−マルトトリオシド、ｐ−ニトロフェニル４−Ο−β−ガラクトシル−α−マルトテトラオシド及びｐ−ニトロフェニル４−Ο−β−ガラクトシル−α−ヘキサオシドなどが多量に副生する。そのため、反応生成物から目的生成物を得るためには、分離精製が必要である。しかし、重合度が近いことから分画精製は非常に煩雑かつ困難であり、高純度の目的物を経済的に効率良く得ることは困難であった。
【０００５】
さらに、前記のオリゴ糖生成アミラーゼを用いる方法では、製法上の理由から、糖残基供与体基質のガラクトシルマルトオリゴ糖中には、主成分であるβ−１，４−ガラクトシルα−Ｄ−マルトオリゴ糖以外に異性体であるβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖（β−１，６体）が約１０重量％程度含まれる。そして、上記β−１，６体を含む原料を用いて、従来法で使用されているシュードモナス ステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のマルトテトラオース（Ｇ４）生成アミラーゼで糖転移反応を行うと、最終製品であるガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体に１０重量％程度のβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が副生してしまう。
【０００６】
α−アミラーゼ活性測定基質としての感度を比較した場合、β−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体はβ−１，４−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の約１／３と低い。そのため、β−１，６体を各種クロマトグラフィーによる分離除去することが必要であったが、工業的規模でβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体を除去することは非常に煩雑かつ困難であり、経済的にも大きな問題であった。
【０００７】
そこで本発明の目的は、目的とする重合度のマルトオリゴ糖誘導体の選択率が高く、かつ原料中にβ−１，６体が共存しても、β−１，６誘導体の副生も少ないか、実質的に生成しないβ−１，４−Ｄ−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖とΟ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体との混合物に、マイクロコッカス エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）２０７起源のマルトテトラオース生成アミラーゼを作用させることを特徴とする下記一般式（１）（式中、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基を示し、ｎは３、４、５又は６を示す）で表されるβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法。
【０００９】
【化２】
【００１０】
以下本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の原料であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖は下記の一般式（２）（式中、ｍは３〜７の整数を示す）で表わされる。
【００１１】
【化３】
【００１２】
上記β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖は公知の方法により製造することができる。例えば、特開平３−２６４５９６号や特開平６−８６６８３号に記載されている、少なくとも１種のマルトオリゴ糖とβ−ガラクトシル残基を持つ糖との混合物にβ−ガラクトシダーゼを作用させることで得ることができる。上記β−ガラクトシル残基の受容体原料としてはマルトオリゴ糖（マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、マルトヘプタオース）またはこれらの混合物が使用できる。工業的規模での製造を考慮した場合、混合物を使用することは、価格の面で非常に有利である。もう一つの出発原料であるβ−ガラクトシル残基の供与体は、例えばラクトース、ガラクトシル−ラクトースあるいはそれらの混合物を使用することが出来る。
【００１３】
β−ガラクトシダーゼは、β−ガラクトシドを加水分解してガラクトースを遊離する酵素と知られている。上記転移反応で主にβ−１，４−ガラクトシド結合を生成し得る酵素であればいずれの起源の市販β−ガラクトシダーゼを用いても良い。例えば、大和化成（株）製β−ガラクトシダーゼ（Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ由来、商品名：Ｂｉｏｌａｃｔａ）を用いることができる。この糖転移反応において基質濃度は１０〜４０％とすることが適当である。β−ガラクトシダーゼを適量添加し、２０〜６０％℃の範囲で４〜２４時間反応させる。煮沸失活後、グルコアミラーゼを添加し、残存するマルトオリゴ糖を選択的に加水分解させる。反応終了後、ｐＨ調整または加熱により酵素反応を停止し、例えば逆浸透膜、限外濾過膜あるいはゲルカラムクロマトグラフィーにより分画を行なって、低分子画分を除去して本発明において原料として使用するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖（２）を得ることができる。
【００１４】
但し、上記生成物中にはβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖中にβ−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖が混在することがある。本発明の方法では、β−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖が混在するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を用いても、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖が選択的に糖転移反応を起こすことから、混在するβ−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を反応前に除去する必要はない。但し、β−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を含まないβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を反応原料として用いることも勿論できる。
尚、ガラクトシル−マルトオリゴ糖は上記のように酵素法によらず、例えば化学合成法によっても入手することは可能であり、本発明の方法では、このようなガラクトシル−マルトオリゴ糖も原料として使用できることは勿論である。
【００１５】
本発明の方法のもう一方の原料は「Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体」である。この「Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体」は、上記β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖残基の受容体として働く。
「Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体」は、例えば、下記一般式（３）で示される化合物（式中、Ｒは置換あるいは無置換のフェニル基であり、ｘは０、１又は２である）であることができる。
【００１６】
【化４】
【００１７】
Ｒで示される置換フェニル基の置換基としては、例えば、ニトロ基、クロル基等を挙げることができ、置換フェニル基としては、例えば、２−クロロ−４−ニトロフェニル基、２，４−ジクロロフェニル基等を挙げることができる。一般式（３）で示される化合物の具体例としては、ｐ−ニトロフェニルα−グルコシド、ｐ−ニトロフェニルα−マルトシド、ｐ−ニトロフェニルα−マルトトリオシド等を例示できるが、工業的生産を考慮した場合、比較的安価なグルコシド及びマルトシドを用いることが望ましい。尚、Ｒで示される配糖体のアグリコン部の結合様式はα体、β体いずれでも良い。
【００１８】
本発明の方法によれば、目的とする生成物に応じて、原料であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖とΟ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体との組合せを選ぶことで、目的物を選択的に得ることができる。原料の組合せと主生成物の関係を以下の表１に示す。尚、表中、Ｇａｌ−Ｇｙ（ｙ：４〜８）は、原料であるガラクトシル−マルトオリゴ糖である。ｐＮＰ−Ｇｘ（ｘ：１〜３）のｐＮＰはｐ−ニトロフェニルであり、ＣＮＰ−Ｇｘ（ｘ：１〜３）のＣＮＰはクロロニトロフェニルであり、ｐＮＰ−Ｇｘ及びＣＮＰ−Ｇｘは、もう一方の原料であるＯ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体である。そして主生成物は、Ｇａｌ−Ｇｚ−ｐＮＰまたはＧａｌ−Ｇｚ−ＣＮＰ（ｚ：４〜７）で表される。
【００１９】
【表１】
【００２０】
また、本発明の方法で使用するマルトテトラオース生成アミラーゼ（Ｇ４生成アミラーゼ）を生産するマイクロコッカス エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）２０７菌は、微工研菌寄第９８７８号（ＦＥＲＭ Ｐ−９８７８）として寄託されている。
【００２１】
上記２０７菌由来のＧ４生成アミラーゼについては、特開平１−２１８５９８号あるいは木村らの文献等［Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ．，５４巻，１０６６頁（１９８８年），Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，５３巻，２０１９頁（１９８９年），Ａｇｒｉｃ，Ｂｉｏｌ，Ｃｈｅｍ．，５３巻，２９６３頁（１９８９年），Ｓｔａｒｃｈ，４２巻，４０３頁（１９９０年），Ａｐｐｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３４巻，５２頁（１９９０年），Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．，７０巻，１３４頁（１９９０年），ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，７０巻，３５頁（１９９０年）］に詳細に説明されている。
【００２２】
２０７菌由来のＧ４生成アミラーゼの性質は以下のとおりである。
１）作用：アミロペクチン、アミロース、澱粉等、及びそれらの部分加水分解物のα−１，４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状構造をエンド型に加水分解し、主成分としてマルトテトラオースを生成する。そしてその生成物のアノマー型はαタイプである。
２）基質特異性：マルトペンタオース以上の重合度を有するα−１，４−グルコピラノシド結合からなる直鎖状マルトオリゴ糖を加水分解する。（Ｃ3 −Ｃ7 を基質としたとき、遊離するグルコース量が、Ｃ1 の時を１００とすると、Ｃ2 ：３．１、Ｃ3 ：１４．２、Ｃ4 ：８４．３、Ｃ5 ：３２．５であった。）
３）至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲：至適ｐＨは７．５〜８．０である。また３０℃、５時間の条件下において、ｐＨ５．５〜１１の範囲で安定である。
４）作用適温：約６０℃
５）失活条件：５０℃、１ｈの加熱で７５％失活。６０℃、１ｈでは９８％以上失活。
６）阻害、活性化及び安定化：エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）で阻害されるがカルシウム塩で回復する。カルシウム塩によって活性化及び安定化される。
７）分子量：約４２万（ゲル濾過法）、１８５，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法）
【００２３】
本発明では、上記２０７菌を培養して得られる培養上清濃縮物をＧ４生成アミラーゼを含有する粗酵素含有液としてそのまま、本発明の方法に用いることができる。さらに、上記粗酵素をエタノール、アセトン、イソプロパノール等による溶媒沈澱法、硫安分画法、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クマトグラフィー等の通常の方法を用いて精製した後に、本発明の製造方法に用いることも出来る。
なお、本発明に用いるＧ４生成アミラーゼは以下の方法で酵素活性を測定することができる。
【００２４】
０．１Ｍリン酸緩衝液を含む１％可溶性澱粉溶液３００μｌを４０℃の恒温浴槽中で５分間予備加温した後、適当に希釈された酵素液１００μｌを添加し、同じく４０℃で１０分間反応させる。ＤＮＳ試薬１ｍｌを加え、反応を停止した後、１０分間煮沸し、流水中で冷却後、脱イオン水５ｍｌを加え、５１０ｎｍにおける吸光度を測定する。
ここで１単位の酵素活性は同条件下で１分間に１μｍｏｌ（マイクロモル）のグルコースを生成する酵素量とする。
【００２５】
本発明の糖移転反応において、ガラクトシル−マルトオリゴ糖（２）の基質濃度は、例えば、１０〜４０％の範囲とすることが適当である。また、Ｏ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体（３）の基質濃度は、例えば、５〜３０％とすることが適当である。
酵素を上記基質の混合物に添加し、例えば１０〜２４時間、例えば２０〜６０℃の範囲の温度で反応させることで、本発明のβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体（１）を生成させることができる。
【００２６】
本発明の上記反応は、水−親水性有機溶媒の混合溶媒中で行うことが目的生成物の収率を高めるという観点から好ましい。上記混合溶媒に用いる親水性有機溶媒としては、例えばメタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルホキサイド、エチレングリコール等を挙げることができる。また、混合溶媒には、親水性有機溶媒の２種以上を併用することもできる。混合溶媒における親水性有機溶媒の含有率は、例えば約２０〜８０％、好ましくは約３０〜７０％とすることが適当である。
【００２７】
上記酵素反応後、加熱あるいはｐＨを低下させることにより、酵素反応を停止し、例えばカラムクロマトグラフィーにより分画を行ない、ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体（１）を容易に単離することができる。尚、上記カラムクロマトグラフィーには、例えば、トヨパール（ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ）ＨＷ−４０Ｓゲルを充填したカラムを用いて分画する方法を挙げることができる。
【００２８】
【発明の効果】
本発明のβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法は、体液α−アミラーゼの活性測定用基質として有用なβ−１，４−Ｄ−ガラクトシルα−１，４−Ｄ−マルトオリゴ糖（グルコース部分の重合度４〜７）誘導体の大量調整に適した方法として極めて有用である。
即ち、従来法においては糖移転反応に使用されてきた酵素の特性から重合度が近接した各種の糖転移物が生成し、これらを分別精製することは技術的にもまた経済的にも大きな問題点を残していた。しかし、本発明方法によれば従来方法に比し、主生成物の生成率が高いばかりでなく生成割合も非常に高いので、分別精製が容易となり、工程も簡略化し得るので、経済的にも大きな利点がある。
【００２９】
しかも、従来法ではα−アミラーゼ基質としての有用性に乏しいβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体が約１０重量％程度生成していたのに対し、本発明方法では全く生成しないか、もしくは実質的に無視し得る程度にしか生成しない。そのため、β−１，６体の除去に要した煩雑な精製操作が不要となるので経済的に非常に有利となるばかりでなく、得られる製品の品質面においても大きな技術的なメリットが得られる。
【００３０】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。
参考例
Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌Ｎｏ．２０７株を先に述べた木村らの方法で培養して得た。即ち、バクトトリプトン２％（Ｗ／Ｖ）、酵母エキス１％、可溶性澱粉２％、Ｋ2 ＨＰＯ 4 ０．１％、ＭｇＳＯ 4・７Ｈ2 Ｏ ０．０２％、ＭｎＣｌ2 ・４Ｈ2 Ｏ、１ｐｐｍを含む１０リットルの液体培地（ｐＨ９）に予め同上培地で２４時間３０℃で回転振盪培養して得た１リットルのＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ属細菌Ｎｏ．２０７株懸濁液を無菌的に接種し、３０℃、通気量１．５ｖ．ｖ．ｍ及び回転数３００ｒｐｍで４０時間通気攪拌培養した。ついで１２，０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離をして菌体を除いて得た上清液をフィルトロン社製ＵＦ膜を用いて濃縮して２３５単位（Ｕ）／ｍｌの粗Ｇ４生成アミラーゼ濃縮液２５０ｍｌを得た。
【００３１】
該アミラーゼ濃縮液に７５％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、一夜冷室（４℃）中に放置して生成した沈澱物を遠心分離（１２，０００ｇ、４℃、１０分間）して集め、５ｍＭ塩化カルシウムを含む２０ｍＭトリス−酢酸緩衝液（ｐＨ７．３）に対して充分に透析した。ついで０．１Ｍ、ＮａＣｌを含む同上緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｓ（東ソー製）カラムに通液して酵素を吸着させた後、同上緩衝液に含まれる０．１Ｍから０．５ＭのＮａＣｌの濃度匂配法で酵素を溶出させた。活性画分を集め、硫酸アンモニウムを加えて１５％飽和とした後、１５％飽和の硫酸アンモニウムを含む同上緩衝液で平均化したブチル・トヨパール６５０Ｓ（東ソー製）カラムに通液して酵素を吸着させた。ついで同上緩衝液に含まれる１５％飽和から０％飽和の硫酸アンモニウムの濃度匂配法で酵素を溶出させた結果、約１２％飽和の硫酸アンモニウム濃度に主要活性画分が、そして７％飽和に少量のアミラーゼ活性画分が得られたので主要活性画分を集め、アミコン社製ＵＦ膜（ＰＭ１０）を用いて濃縮し、１，５２８Ｕ／ｍｌの精製酵素１５ｍｌを得た。
【００３２】
ついで本精製酵素の分子量及び等電点をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法並びに焦点電気泳動法により測定した結果、約１８５，０００およびｐＨ４．８であった。また、酵素反応の最適のｐＨおよび温度についても検討した結果、それぞれ５５〜６０℃および７．５〜８．０であり、これらは木村らが報告した数値とほぼ同一であった。
【００３３】
実施例１
参考例で得られた精製酵素（Ｇ４生成アミラーゼ）８２Ｕを一連のβ−Ｄ−ガラクトシル−α−Ｄ−マルトオリゴ糖［日本食品化工（株）製］４００ｍｇとｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコシド（ｐＮＰ−α−Ｇ１）１００ｍｇを含む３０％（Ｖ／Ｖ）メタノール水溶液（ｐＨ７．０）１．５ｍｌに添加し、３０℃で２時間反応させた。直ちに得られた反応液中に含まれる糖転移生成物の含有率をＳｈｏｄｅｘ ＲＳ−ｐａｋ ＤＣ−６１３［昭和電工（株）製］カラムを用いる高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）法で測定した結果を表２に示す。
なお、本測定の移動相には７２／２８＝アセトニトリル／水（Ｖ／Ｖ，％）を用い、０．９ｍｌ／分の流速で、検出は３１０ｎｍで行なった。なお、表中の値は紫外部吸収を有する全糖誘導体中の割合を重量％で示す。
【００３４】
比較例１
比較のため、従来から用いられてきたシュウドモナス ステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ［日本食品化工（株）製、商品名オリゴアミラーゼ］を上記条件で作用させた後、実施例１と同様な方法で糖転移生成物の含有率を測定した結果を表３に示す。
【００３５】
【表２】
実施例１の結果
表中（ ）内は同一重合度の糖転移生成物中のβ−１，６−Ｄ−ガラクトシルα−Ｄ−マルトオリゴシド誘導体の割合を重量％で示している。
【００３６】
【表３】
比較例１の結果
表中（ ）内は同一重合度の糖転移生成物中のβ−１，６−Ｄ−ガラクトシルα−Ｄ−マルトオリゴシド誘導体の割合を重量％で示している。
【００３７】
その結果、表２及び表３から明らかなように、本発明方法によれば各種重合度のガラクトシルマルトオリゴ糖、特にマルトオリゴ糖の重合度４〜７のガラクトシルマルトオリゴ糖を糖残基の供与体とし、ｐＮＰ−α−Ｇ１を受容体とした場合、体液α−アミラーゼ活性測定用として有用なｐＮＰ−β−Ｄ−ガラクトシルα−Ｄ−マルトテトラオシド（Ｇａｌ−Ｇ４−ｐＮＰ）およびｐＮＰ−β−Ｄ−ガラクトシル−α−Ｄ−マルトペンタオシド（Ｇａｌ−Ｇ５−ｐＮＰ）がより選択的に生成した。
さらに、特筆すべき事として、従来法ではα−アミラーゼの基質として有用ではないβ−１，６−Ｄ−ガラクトシルα−Ｄ−マルトオリゴ糖誘導体が約１０重量％程度生成し、その除去精製が非常に煩雑かつ困難であったが、本発明方法によれば実質的に無視し得る程度もしくは全く生成しない点で大きな優位性を有することが明らかである。
【００３８】
実施例２
乳糖１００ｇとマルトオリゴ糖混合物［日本食品化工（株）製、商品名フジオリゴＧ６７Ｓ］３００ｇ、β−ガラクトシダーゼ［大和化成（株）製、商品名ＢＩＯＬＡＣＴＡ、、１０，１００Ｕ／ｇ］１３０ｍｇを含む１リットルの５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を４０℃で５時間反応させた。ついで沸騰水浴中で５分間加熱して酵素を失活させた後、グルコアミラーゼ［生化学工業（株）製、３９．９Ｕ／ｍｇ］を２，０００Ｕ添加してｐＨ５．５で一晩反応させて未反応のマルトオリゴ糖をグルコースに加水分解してガラクトシルマルトオリゴ糖１２．６％を含む糖質を得た。
なお、糖組成の分析は実施例１と同様なＨＰＬＣ法にて測定した。また含有率は全糖質中の重量％で示した。該操作で得られた約４００ｇの反応糖質中のガラクトシルマルトオリゴ糖をトヨパールＨＷ−４０Ｓ［東ソー製］を用いるゲル濾過法で精製分取し、約４１．５ｇの凍結乾燥粉末を得た。本凍結乾燥粉末中の糖組成を上記方法にて分析した結果、Ｇａｌ−Ｇ４が１．８％、Ｇａｌ−Ｇ５が１６％、Ｇａｌ−Ｇ６が４５％、Ｇａｌ−Ｇ７が３０％であった。
【００３９】
ついで、得られた４ｇの凍結乾燥粉末及び１ｇのｐＮＰ−α−Ｇ１を、参考例で得た粗Ｇ４生成アミラーゼ８００Ｕおよび終濃度３０％（Ｖ／Ｖ）のメタノールを含む１０ｍｌの２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を３０℃で２時間加温して糖転移反応を行った。生成するガラクトシルマルトオリゴ糖のｐＮＰ誘導体を実施体１記載の方法で測定した。結果を表４に示す。
【００４０】
比較例２
参考例で得たＧ４生成アミラーゼに代えて、比較例１で用いたシュウドモナスステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ８００Ｕを用いた以外は、実施例２と同様な条件で反応させた。結果を表４に示す。
【００４１】
【表４】
（ ）内は同一重合度の糖転移反応生成物中に占めるβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の生成率を重量％で示している。
【００４２】
表４から明らかなように、糖残基の供与体基質にＧａｌ−Ｇ５，Ｇａｌ−Ｇ６及びＧａｌ−Ｇ７を主成分とするガラクトシルマルトオリゴ糖混合物を、そして受容体基質にｐＮＰ−α−Ｇ１を用いた場合でも本発明の主生成物はＧａｌ−Ｇ５−ｐＮＰであり、その生成率は従来法に比較し、非常に高かった。また、他の副生成物の生成が非常に少ないばかりでなく、α−アミラーゼ基質として不要なβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体も殆ど生成しなかった。一方、従来法では約１０重量％程度のβ−１，６−体が生成した。
【００４３】
実施例３
糖受容体基質であるｐＮＰ−α−Ｇ１に代えて２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−グルコシド（ＣＮＰ−β−Ｇ１）を用い、溶媒をｎ−プロパノールに代えた他は実施例２に記載した同一条件で反応を行ないガラクトシルマルトオリゴ糖ＣＮＰ誘導体を得た。結果を表５に示す。
比較例３
参考例で得たＧ４生成アミラーゼに代えて、比較例１で用いたシュウドモナスステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ８００Ｕを用いた以外は、実施例３と同様な条件で反応させた。結果を表５に示す。
【００４４】
【表５】
（ ）内は同一重合度の糖転移反応生成物中に占めるβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の生成率を重量％で示している。
【００４５】
表５から明らかなように、糖受容体基質をｐＮＰ−α−Ｇ１からＣＮＰ−β−Ｇ１に変更しても本発明の主生成物はＧａｌ−Ｇ５−ＣＮＰであり、生成比率も従来法に比較し、非常に高かった。また、同様にβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体は殆ど生成しなかった。一方、従来法ではやはりβ−１，６体が約１０重量％程度生成た。
【００４６】
実施例４
糖受容体基質であるｐＮＰ−α−Ｇ１に代えてｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−マルトシド（ｐＮＰ−α−Ｇ２）［日本食品化工（株）製］を用い、溶媒をｎ−プロパノールに代えた他は実施例２に記載した同一条件で反応を行ないガラクトシルマルトオリゴ糖ｐＮＰ誘導体を得た。結果を表６に示す。
【００４７】
比較例４
参考例で得たＧ４生成アミラーゼに代えて、比較例１で用いたシュウドモナスステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ８００Ｕを用いた以外は、実施例４と同様な条件で反応させた。結果を表６に示す。
【００４８】
【表６】
（ ）内は同一重合度の糖転移反応生成物中に占めるβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の生成率を重量％で示している。
【００４９】
表６から明らかなように、糖受容体基質をｐＮＰ−α−Ｇ１からｐＮＰ−α−Ｇ２に変更した時、本発明の主生成物はＧａｌ−Ｇ６−ｐＮＰであり、生成比率も従来法に比較し、非常に高かった。また、同様にβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体は殆ど生成しなかった。一方、従来法ではやはりβ−１，６体が約１０重量％程度生成した。
【００５０】
実施例５
糖受容体基質であるｐＮＰ−α−Ｇ１に代えて２−クロロ−４−ニトロフェニルβ−Ｄ−マルトトリオシド（ＣＮＰ−β−Ｇ３）を用いた他は実施例２に記載した同一条件で反応を行ないガラクトシルマルトオリゴ糖ｐＮＰ誘導体を得た。結果を表７に示す。
【００５１】
比較例５
参考例で得たＧ４生成アミラーゼに代えて、比較例１で用いたシュウドモナスステッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｔｕｔｚｅｒｉ）由来のＧ４生成アミラーゼ８００Ｕを用いた以外は、実施例５と同様な条件で反応させた。結果を表７に示す。
【００５２】
【表７】
（ ）内は同重合度の糖転移反応生物中のβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体の生成率を重量％で示している。
【００５３】
表７から明らかなように、糖受容体基質ｐＮＰ−α−Ｇ１からＣＮＰ−β−Ｇ３に変更した時、本発明の主生成物はＧａｌ−Ｇ７−ＣＮＰであり、生成比率も従来法に比較し、非常に高かった。また、同様にβ−１，６−ガラクトシルマルトオリゴ糖誘導体は殆ど生成しなかった。一方、従来法ではやはりβ−１，６体が約１０重量％程度生成した。
Claims (6)
- β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖と下記一般式（３）で示されるΟ−グルコシルまたはマルトオリゴシル誘導体との混合物に、マイクロコッカス エスピー（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）２０７起源のマルトテトラオース生成アミラーゼを作用させることを特徴とする下記一般式（１）で表されるβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法。
- マルトテトラオース生成アミラーゼの作用を水−親水性有機溶媒混合溶媒中で行う請求項１記載の製造方法。
- グルコース残基数が４〜８であるβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖の１種又は２種以上の混合物を原料として用いる請求項１又は２記載の製造方法。
- β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖が、少なくとも１種のマルトオリゴ糖及びβ−ガラクトシル残基を持つ糖との混合物にβ−ガラクトシダーゼを作用させて得られるものである請求項３記載の製造方法。
- マルトオリゴシル誘導体が、マルトシル誘導体もしくはマルトトリオシル誘導体である特許請求項１〜４のいずれか１項に記載の製造方法。
- β−１，６−ガラクトシル−マルトオリゴ糖が共存するβ−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖を原料として用い、β−１，４−ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体を選択的に製造する、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00663195A JP3682931B2 (ja) | 1995-01-19 | 1995-01-19 | ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP00663195A JP3682931B2 (ja) | 1995-01-19 | 1995-01-19 | ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08196289A JPH08196289A (ja) | 1996-08-06 |
| JP3682931B2 true JP3682931B2 (ja) | 2005-08-17 |
Family
ID=11643717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP00663195A Expired - Lifetime JP3682931B2 (ja) | 1995-01-19 | 1995-01-19 | ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3682931B2 (ja) |
-
1995
- 1995-01-19 JP JP00663195A patent/JP3682931B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH08196289A (ja) | 1996-08-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0327099B1 (en) | Cyclomaltodextrin glucanotransferase, process for its preparation and novel microorganism useful for the process | |
| Nishimoto et al. | Purification and characterization of glucosyltransferase and glucanotransferase involved in the production of cyclic tetrasaccharide in Bacillus globisporus C11 | |
| JPS63196596A (ja) | 末端にイノシト−ル残基を結合したグルコオリゴ糖およびその製造方法 | |
| EP0608636B1 (en) | Cycloisomaltooligosaccharides, an enzyme and process for producing said oligosaccharides, and a process for producing said enzyme | |
| JPH0491795A (ja) | フラクトース含有オリゴ糖の製造法 | |
| KR101013195B1 (ko) | ２－０－α－Ｄ－글루코피라노실－Ｌ―아스코르빈산의제조방법 | |
| JP2012095606A (ja) | デキストラングルカナーゼ | |
| JP3682931B2 (ja) | ガラクトシル−マルトオリゴ糖誘導体の製造方法 | |
| JP2886249B2 (ja) | ガラクトシル―マルトオリゴ糖誘導体、その製造法およびα―アミラーゼ活性測定方法 | |
| JP4012595B2 (ja) | オリゴ糖組成物の製造方法 | |
| JPH04279596A (ja) | 新規オリゴ糖およびその製造法 | |
| Shibuya et al. | Transglycosylation of glycosyl residues to cyclic tetrasaccharide by Bacillus stearothermophilus cyclomaltodextrin glucanotransferase using cyclomaltodextrin as the glycosyl donor | |
| JP2888506B2 (ja) | 非還元末端アジド化マルトオリゴ糖及びその製造方法 | |
| JP4161181B2 (ja) | コージオリゴ糖およびニゲロオリゴ糖を含む糖質の新規な製造方法およびそれに用いる菌体、酵素とその製造方法 | |
| JP3905141B2 (ja) | オリゴ糖の製造方法 | |
| JP3117328B2 (ja) | 新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素、その製造法及び環状イソマルトオリゴ糖の製造法 | |
| JPH04200386A (ja) | β―フラクトフラノシダーゼ及びその製造方法 | |
| JP3995774B2 (ja) | 新規α−フコシダーゼ | |
| JP4109343B2 (ja) | β−１，４−ガラクトシル−マルトースの製造方法 | |
| JPS61274680A (ja) | サイクロデキストリングリコシルトランスフエラ−ゼの製造法 | |
| JP3119523B2 (ja) | 新規なイソアミラーゼ、その製造法及びそれを用いた糖類の製造法 | |
| JP3637088B2 (ja) | ヘテロオリゴ糖３糖類の製造方法 | |
| CN114410610A (zh) | 一种环麦芽糊精酶及其制备方法与应用 | |
| JPS591276B2 (ja) | ノジリマイシン・グルコ−スオリゴマ−およびその製造法 | |
| JP3826426B2 (ja) | ２−クロロ−４−ニトロフェニル ４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−α−マルトシドの製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050119 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050314 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20050518 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20050523 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090603 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090603 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090603 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100603 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100603 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110603 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110603 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120603 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120603 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120603 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130603 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130603 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |