JPH10513356A

JPH10513356A - プロテアーゼの化学発光検出に用いるためのジオキセタン化合物、その使用方法およびそのためのキット

Info

Publication number: JPH10513356A
Application number: JP8524250A
Authority: JP
Inventors: ブロンスタイン，イレーナ; エドワーズ，ブルックス; マーチン，クリストファー; スパークス，アリソン; ヴォイタ，ジョン・シー
Original assignee: Tropix Inc
Current assignee: Tropix Inc
Priority date: 1995-02-09
Filing date: 1996-01-22
Publication date: 1998-12-22
Also published as: EP0808458A4; AU4612596A; US5591591A; US5843681A; AU701686B2; WO1996024849A1; EP0808458A1; US5871938A; CA2212669A1

Abstract

(57)【要約】対応するプロテアーゼの作用によって除去することができるタンパク質分解酵素特異性アミノ酸またはペプチドを有する１，２−ジオキセタン化合物を提供する。アミノ酸またはペプチドが除去されると、１，２−ジオキセタンは化学発光しながら分解し、光の発生が、検査される試料中のプロテアーゼの存在を検出するための高速かつ超高感度で簡便な手段を提供する。発生した光の量、換言するならば化学発光度を、存在するプロテアーゼの量と相関させることができる。免疫検定ならびにＤＮＡハイブリッド形成およびＤＮＡプローブ検定を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】プロテアーゼの化学発光検出に用いるためのジオキセタン化合物、その使用方法およびそのためのキット技術分野本発明は、化学発光化合物、プロテアーゼの検出のための検定におけるそれらの使用ならびに本化合物およびプロテアーゼ検出検定に使用される他の要素を含むキットに関する。具体的には、酵素的反応によって除去されると、ジオキセタンを分解させ、化学発光させるタンパク質分解酵素特異性アミノ酸またはペプチドを有するジオキセタン化合物を提供する。これらの化合物は、プロテアーゼを含有する疑いのある試料に添加されると、試料中のプロテアーゼの存在を検出するための高速かつ超高感度で簡便な手段を提供する。発生した光の量、換言するならば化学発光の程度を、存在するプロテアーゼの量に相関させることができる。背景技術の説明本明細書の１名以上の発明者を発明者とし、Tropix社を譲受人とする出願が、多様な生物学的物質の検出のために、新規な条件または精巧な装置を頼りにすることなく、速やかに実施することができる超高感度な検定でリポータとして使用することができる化学発光化合物として１，２−ジオキセタン類を明確に確立した。これらの中には、米国特許第４，９３１，２２３号、第４，９３１，５６９号、第４，９５２，７０７号、第４，９５６，４７７号、第４，９７８，６１４号、第５，０３２，３８１号、第５，１４５，７７２号、第５，２２０，００５号、第５，２２５，５８４号、第５，３２６，８８２号、第５，３３０，９００号および第５，３３６，５９６号がある。本出願と譲受人を同じくする特許が他にも発行されており、さらに他の出願が係属中である。この膨大な特許文献は共に、ジオキセタン環の炭素の１個に結合した通常は多環式の基、好ましくはスピロアダマンタンと、ジオキセタン環の残りの炭素に結合した、電子感応性基（この電子感応性基、通常はアリール基、より好ましくはフェニル基もしくはナフチル基の脱保護が、不安定であり、分解するアニオン、一般にはオキシアニオンを生じさせる）とによって安定化された１，２−ジオキセタン類を扱うものである。分解を通じて、Ｏ−Ｏ結合が断たれ、光子が発生する。この電子感応性基が結合しているものと同じ炭素原子は、アルコキシまたは他の電子活性基を有していてもよい。メトキシが好ましい基である。市販化されたこの種のジオキセタン類の最初のものは、３−（４−メトキシ− スピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′−トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）フェニルホスフェート、特にＡＭＰＰＤとして一般に知られる二ナトリウム塩であった。この化合物は、本出願の譲受人であるTropix社およびミシガン州デトロイトのLumigen 社によって市販化されている。Lumigen 社の中心的な発明者であるA．Paul Schaapには、関連技術に対していくつかの特許を与えられている。スピロアダマンタン環上での選択的な置換によって優れた性能を得ることができる。いずれかの橋頭炭素における電子活性種、たとえば塩素での置換が、反応速度および信号雑音（Ｓ／Ｎ）比を改善する。ＡＭＰＰＤの塩素置換対応物であるＣＳＰＤが、マサチューセッツ州Bedford のTropix社によって広く市販化されている。フェニルまたはナフチル基がまた電子活性置換基、たとえば塩素を有する類似構造の「第三世代」ジオキセタン化合物が、性能におけるさらなる改善を提供し、Tropix社によって市販化されている。リン酸基は、CDP およびCDP-Star の商品名で市販されている。これらのすべてのジオキセタン類に共通の特徴は、フェニル基またはナフチル基の保護基またはマスク基である。酵素と混合すると、その酵素によって保護基が除去されて、電子を多く含む酸素基がフェニルまたはナフチル置換基に付いて残るような、酵素特異性基質である基が用いられる。通常、この保護基はリン酸基であったが、ガラクトシドのような他の保護基もまた使用されてきた。代表的な保護基は、本明細書に引用例として含める上記の特許に記載されている。これらの保護基は、その保護基に対して特異性を示す酵素（これらの酵素は、生物学的流体中の対象の酵素または潜在的に対象の酵素のいずれかとして選択される）または試料の特定の標的部分に結合している非内在性の酵素（したがって、それらによってジオキセタンが誘発されて光を発することが、非内在性の酵素が結合している、試料中の分析対象物の証拠である）に対する基質であった。アルカリホスファターゼが誘発剤として有力な対象の酵素であった。ジオキセタン類に関する既存の文献は、タンパク質分解酵素、すなわちペプチダーゼによって誘発されうる、誘発性ジオキセタン（すなわち、「脱保護」されると、検出に利用することができる分解および化学発光を誘発することができるジオキセタン類）を記載してはいない。これらの酵素はタンパク質のライフサイクルに関与する。さらに、タンパク質分解酵素はまた、ホルモン、レセプタ、成長因子、受精、タンパク質のプロセシング、凝血に関与する調節プロテアーゼの活性化、フィブリン溶解および補体反応ならびに他の細胞機能にも関与する。このように、生物学的試料中の特定のタンパク質分解酵素の存在または非存在は、特定の疾病状態、病原性症状または器質性症候群を十分に示唆することができる。タンパク質分解酵素の仲間には、セリンプロテアーゼ（キモトリプシンおよびズブチリシン）、システインプロテアーゼ（パパイン）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペニシロペプシン）ならびにメタロプロテアーゼ（カルボキシペプチダーゼおよびサーモリシン）がある。診断用マーカを構成する有機成分として特に重要であることに加え、プロテアーゼ酵素はまた、酵素標識としても相当に重要であり、洗剤の製造および皮革の処理にも使用される。診断用プロテアーゼマーカの例には、カテプシンＢ（ガン）、カテプシンＧ（気腫、慢性関節リウマチ、炎症）、カテプシンＬ（ガン）、エラスターゼ（気腫、慢性関節リウマチ、炎症）、プラスミノーゲン活性化因子（血栓症、慢性炎症、ガン）およびウロキナーゼ（ガン）がある。洗剤におけるアルカリプロテアーゼの使用は増大するものと予想される。したがって、種々の生物学的および市販のプロセスにおけるタンパク質の安定性を監視するために、プロテアーゼ検出のための検定が必要である。既知のプロテアーゼ検定条件を以下の表にまとめる。タンパク質酵素の既知の用途および潜在的な用途のいくつかを以下の表にまとめる。また、Proteolytic Enzymes - A Practical Approach，IRL Press，pp． 233- 40（1989）を参照すること。既知のプロテアーゼ検定方法タンパク質分解酵素の検出の基本的方法は、適当な基質との酵素的反応およびこの反応の生成物の検出からなる。したがって、既知のプロテアーゼは、そのような酵素の基質である合成ペプチドを開裂させる。合成基質はアミノ酸およびペプチドである。特定の置換基がα−ＮＨ₂基またはα−ＣＯＯＨ基に加えられて、アミノまたはカルボキシルのいずれかを保護して、特定のプロテアーゼによって認識され、開裂されることができる基質を生成する。さらには、加えられた基が「合図」を出す性質を基質に加えて、基質−酵素の反応の生成物を、吸収分光測定または蛍光分光測定によって検出し、モニタすることができるようにしてもよい。市販されているタンパク質分解酵素の検定がいくつかある。Promega 社は、Pe pTag^TMプロテアーゼ検定を提供している。これは、小さな色素に結合したペプチドのタンパク質分解を検出する定性検定である。これらのペプチドの消化はそれらの分子量および電荷を変化させるため、これらのペプチドは、アガロースゲル電気泳動を使用して検出することができる。しかし、この検定はやっかいであり、感度が悪く、定量的ではない。また、Sigma 社、Calbiochem社およびMolecula r Probes社からも、タンパク質分解酵素のいくつかの蛍光発生基質が市販されている。したがって、当業者の目的は、定性的かつ定量的であることができる、マーカ、市販の指示薬または標識のいずれかとしての、タンパク質分解酵素を検出するための、高速で信頼でき、高感度の検定を提供することである。当業者のさらなる目的は、参考文献で考察されている、オキシアニオン基から分解を受けるものと類似した方法で、タンパク質分解酵素によって誘発されて分解し、化学発光することができるジオキセタン化合物を提供することである。発明の開示以下の一般式Ｉの１，２−ジオキセタン類を使用して、試料中のタンパク質分解酵素の存在を検出することができる。である。式中、Ｘ¹、Ｘ²およびＹは、独立して、水素または電子活性置換基であり、Ｒは、炭素原子１〜２０個の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキルまたは炭素原子３〜２０個のシクロアルキルもしくはポリシクロアルキルであり、Ｚはアミノ酸またはポリペプチドであり、Ｚは酵素特異性基質である。これらのジオキセタン類は、貯蔵条件の下で安定であり、また、酵素特異性基質Ｚを開裂させるタンパク質分解酵素を検出するための化学発光性リポータ分子として働く程に、水または水性調製物に十分に可溶性である。Ｚ基が除かれると、アリールアミンが分解し、ジオキセタン環のＯ−Ｏ結合を断ち、文献で扱われている、オキシアニオンの形成によって誘発される従来の１，２−ジオキセタン類の場合のように化学発光を生じさせる。可溶性を改善するため、特に生物学的検定を実施している場合、一般に水性である試料中のジオキセタンリポータ分子の可溶性を改善するため、Ｘ¹、Ｘ²またはＹのいずれか一つ以上を、可溶化剤、すなわち、水素結合を改善する薬剤であるように選択することができる。水溶性のためには、Ｒは、好ましくは炭素原子６個以下のものである。特定の工業的処理は、有機配合物および有機溶剤を要するかもしれない。これらの場合、Ｒは、より大きなものでもよく、Ｘ¹、Ｘ²およびＹは、選択される溶剤中の可溶性を改善するように選択される。上記式中のＺは、タンパク質分解酵素特異性基質であるように選択される。これにより、Ｚは、検定される試料中に存在しやすい他の酵素がＺ基を開裂させず、したがって、検出される化学発光が目的酵素そのものの存在に直接たどりつくよう、特定のタンパク質分解酵素、換言するならば一群の酵素によって開裂される基質であるように特に規定される。本発明は、いかなる特定のアミノ酸またはペプチド配列にも限定されず、特異性検定のために開発された市販のペプチド配列および基にも適用することができる。特定のタンパク質分解検定が１種のアミノ酸だけに特異的であることを記すべきである。この状況では、Ｚは、１種のアミノ酸に限定することができる。ひとたびペプチドまたはアミノ酸が除かれると、得られるジオキセタンアミンは、既存のジオキセタン文献のオキシアニオンの場合とまさに同様に、化学発光しながら分解する。化学発光の量を酵素の量に相関させることができる。図面の簡単な説明図１：１，２−ジオキセタンズブチリシン特異性基質のズブチリシン誘発によって得られた化学発光トレースである。図２：３７℃のズブチリシンの連続希釈溶液により、ズブチリシンに関する１，２−ジオキセタン基質を誘発することによって得られた化学発光信号を表すグラフである。図２Ａは光単位で提示されており、図２Ｂは、信号雑音（Ｓ／Ｎ）比の測定単位を提供している。図３：図３は、４５℃で１時間さらにインキュベートした、図２に表す実験に関する情報を提供する。発明を実施する最良の形態本明細書で特許請求するジオキセタン類は、文献のフェノキシ置換ジオキセタン類に用いられるものに類似した出発原料から出発する。したがって、本明細書で特許請求するジオキセタン類の化学構造は、ジオキセタン上に置換したフェニル基、または、ジオキセタン上に置換したナフチル基に結合された酸素基がアミノ基で置換されている事実を除き、従来技術のフェノキシジオキセタン類の化学構造に類似している。これらの化合物は次式で示される。である。式中、Ｘ¹、Ｘ²およびＹは、独立して、Ｈまたは電子活性（電子求引性または電子供与性）基である。その基が電子活性基であるならば、それはまた、選択された溶剤または媒体中のジオキセタンの可溶性を改善するように選択することもできる。もっとも一般的には、検定される試料は、水性媒体中で調製され、したがって、可溶化基（１個または複数）は、水素結合を促進する基であろう。Ｘ¹、Ｘ²およびＹが、水素として選択されるのか、電子活性基として選択されるのかに依存して、その実体は、可溶性だけでなく、分解反応の半減期（Ｔ¹/₂ ）、化学発光収率および信号雑音（Ｓ／Ｎ）比にも影響するかもしれない。適当な置換基およびジオキセタン化学発光に対するそれらの影響が、フェノキシ置換ジオキセタン類に関連して論じられ、米国特許第５，３３０，９００号明細書に開示され、特許請求されている。したがって、アダマンタン環上の橋頭炭素における各置換基は、水素だけでなく、ヒドロキシル基、ハロ置換基、ヒドロキシ低級アルキル基、ハロ低級アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基またはアミド基を個々に表すこともできる。同様に、Ｙ基は、水素または電子活性基であってもよい。可溶性を考慮せずに選択するのならば、Ｙ基の例は、Ｃｌ、ＯＭ、ＯＡｒ、ＮＭ₃ ⁺、ＮＨＣＯＭ、ＮＭＣＯＭ¹、ＮＨＣＯＡｒ、ＮＨＣＯＯＡｒ、ＮＨＣＯＯＭ、ＮＭＣＯＯＭ¹、ＣＭ₃、ＮＯ₂、ＣＯＯＭ、ＣＯＯＡｒ、ＮＨＳＯ₂ＯＭ、ＮＨＳＯ₂ Ａｒ、ＣＦ₃、Ａｒ、Ｍ、ＳｉＭ₃、ＳｉＡｒ₃、ＳｉＡｒＭ₂、ＳＯ₂、ＮＨＣＯＭ、ＳＯ₂ＮＨＣＯＡｒ、ＳＯ₂Ｍ、ＳＯ₂Ａｒ、ＳＭおよびＳＡｒを含む（ＭおよびＭ¹は、独立して、Ｃ_1-6アルキルであり、Ａｒはフェニルまたはナフチルである）。好ましい置換基は、塩素、メトキシ、アルキルまたはアミドである。フェニルアミン置換基ではなくフェノキシ置換基を有するこのタイプの化合物が、係属中の米国特許出願第０８／０５７，９０３号で開示され、特許請求されている。同特許出願を引用例として本明細書に含める。アリール環上のＹおよびＮＨ−Ｚ基の置換位置が、得られるジオキセタンの化学発光およびＴ¹/₂に影響を及ぼすかもしれない。ジオキセタンがフェニル置換基を有する場合、ＮＨ−Ｚにとって好ましい置換位置は、ジオキセタンへの結合位置に対してメタの位置であり、ナフチル基上で置換する場合、ＮＨ−Ｚ基は、ジオキセタン基への結合位置に隣接しない（disjoint）位置にあるべきである。水素ではない場合のＹの好ましい位置は、ジオキセタンへの結合位置に対してオルト以外の位置である。基Ｚは、対象の酵素を含む試料と混合されると、酵素が基Ｚを開裂し、ジオキセタンアミンを自発的に分解させて、光を発生させるよう、酵素開裂性基でなければならないことを除き、特に限定されない。基Ｚの候補として適するタンパク質分解酵素のための多数の基質が市販されており、他にも特定されているものがある。いくつかのプロテアーゼは、保護基、たとえばＮ−カルボベンゾキシ（Ｎ −ＣｂｚまたはＮ−Ｚ）、Ｎ−スクシニル（Ｎ−ｓｕｃ）、Ｎ−メトキシスクシニル（Ｎ−ＭｅＯｓｕｃ）、Ｎ−アシル（Ｎ−Ａｃ）またはＮ−ベンゾイル（Ｎ −Ｂｚ）を有するペプチドまたはアミノ酸だけしか認識しないが、Ｚは通常、アミノ酸またはペプチドである。Ｚは、アミノ酸、ペプチド、または、プロテアーゼがＺを開裂サイトとして認識するような、保護基で保護されたアミノ酸またはペプチドである。以下の基Ｚは、例を示すだけのものであり、本発明の範囲を限定しようとするものではない。タンパク質分解酵素の基質である市販のペプチドが数多くあり、それらを使用して適当な１，２−ジオキセタン類を付加して、そのような酵素の化学発光性基質を生成することができる。市販のプロテアーゼ基質の一覧を以下の表に示す。基質の特異性は、特異性ペプチド配列の酵素による認識によって決まる。タンパク質分解酵素の特異性開裂サイトを以下の表にまとめる。プロテアーゼジオキセタン基質の合成以下の例は、代表的なジオキセタンプロテアーゼ基質の合成であり、請求の範囲を限定するものではない。Ｎ−ＣｂｚおよびＮ−Ａｃは、それぞれＮ−カルボベンゾキシおよびＮ−アセチルの略語である。３−（メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル）−１−アニリニル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ−Ｃｂｚ（２）エノールエーテルアニリン１（２０６mg、０．７７mmol、SBIR Grant #1 R43 HG00196-01に記載のようにして合成）を、アルゴン下に、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）４mlおよび無水ピリジン（ｐｙ）４mlに溶解した。Ｎ−Ｃｂｚ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ（１．２ｇ、３．２mmol）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド＝ＨＣｌ（６０６mg、３．２mmol）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（５３mg、０．４mmol）をアルゴン下に室温で加えた。反応を１時間攪拌し、酢酸エチルと水とに分配し、有機層を希釈ブライン溶液および希釈炭酸水素ナトリウム溶液で順次に洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、蒸発させ、シリカゲルカラム上で精製すると（３０〜１００％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、エノールエーテルペプチド（２）３６７mg（７６％）が白色フォームとして得られた。３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン３，２′トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）−１−アニリニル−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−Ｎ−Ｃｂｚ（３）クロロホルム１０ml中エノールエーテルペプチド２（２１２．６mg、０．３４ mmol）および５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン（ＴＰＰ、ＣＨＣｌ₃中２重量％の溶液０．６ml）の溶液を、酸素気流を溶液に通しながら、１０℃で、２５０Ｗの高圧ナトリウム灯で照射した。灯と反応混合物との間に配置した５ミルのKaptonポリイミド膜（Du Pont）片によって不要なＵＶ光線をろ過した。８分間照射したところで、分析ＴＬＣおよびＨＰＬＣは、完全なジオキセタン形成を示した。減圧下に０℃で溶剤を除去し、ポンプ乾燥させた。残留した淡黄色のフォームをアセトニトリル（ＨＰＬＣ等級）１mlに溶解し、冷凍機の中で一夜貯蔵して、結晶を形成させた。アセトニトリルをピペットで除去して白色沈殿物を残し、その沈殿物をアセトニトリル１mlで洗浄したのち、高減圧で乾燥させると、白色の結晶質ジオキセタン（３）１５２mg（７７％）が得られた。３−（メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル）−１−アニリニル−Ｎ^a，Ｎ^G，Ｎ^G1−トリ−Ｃｂｚ−Ｌ−Ａｒｇ（４）エノールエーテルアニリン１（３１mg、０．１１５mmol）を、アルゴン下に、無水ジメチルホルムアミド０．５mlおよび無水ピリジン０．５mlに溶解した。Ｎ^a ，Ｎ^G，Ｎ^G1−トリカルボベンゾキシ−Ｌ−アルギニン（７７mg、０．１３３mm ol）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドＨＣｌ（２５mg、０．１３mmol）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの結晶をアルゴン下に室温で加えた。反応を１時間攪拌し、冷凍機の中で一夜貯蔵し、酢酸エチルと水とに分配し、有機層を希釈ブライン溶液および希釈炭酸水素ナトリウム溶液で順次に洗浄した。溶剤を蒸発させると、エノールエーテル４が白色結晶（８９．５mg、９４％）として残った。３−メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル） −１−アニリニル−Ｌ−Ａｒｇ（５）トリ−Ｎ−Ｃｂｚ−Ａｒｇエノールエーテル４を無水ＥｔＯＨ２．５mlに溶解し、５％Ｐｄ／Ｃ（１０６mg）および１，４−シクロヘキサジエン(２５０μl) を加え、圧力管中７０℃で２時間攪拌した。溶液をセライトの栓に通してろ過し、栓を水で十分にすすぎ、溶液を蒸発させて、脱保護されたアルギニンエノールエーテル５を得た。この中間体を使用して、以下に記すようにしてアルギニンエノールエーテル誘導体６〜８を合成した。３−メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル） −１−アニリニル−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｎ−Ｃｂｚ（６）アルギニンエノールエーテル５をアルゴン下に無水ジメチルホルムアミド：ピリジン（１：１）に溶解した。Ｎ−カルボベンゾキシアラニン（１．１当量）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド＝ＨＣｌ（１．２当量）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの結晶をアルゴン下に室温で加えた。カップリングが完了するまで反応を攪拌し、酢酸エチルと水とに分配し、有機層を希釈ブライン溶液および希釈炭酸水素ナトリウム溶液で順次に洗浄した。溶剤を蒸発させると、Ｎ−Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｒｇエノールエーテル６が得られた。あるいはまた、Ｎ−メチルモルホリンの存在下でアルキルクロロホルメート、たとえばイソブチルクロロホルメートを使用する混合無水物法（Smith およびBissell、１９８１年、米国特許第４，２９４，９２３号明細書）により、カップリングを実施することもできる。３−メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル） −１−アニリニル−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ−ＣＢｚ（７）化合物６に関して記載したようにして、Ｎ−カルボベンゾキシグリシン−グリシンを使用して、エノールエーテル５からＮ−Ｃｂｚ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇエノールエーテル７を合成した。３−メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル） −１−アニリニル−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｎ−Ｃｂｚ（８）化合物６に関して記載したようにして、Ｎ−カルボベンゾキシバリン−グリシンを使用して、エノールエーテル５からＮ−Ｃｂｚ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇエノールエーテル８を合成した。３−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）−１−アニリニル−Ｌ−Ａｒｇ（９）ＣＨＣｌ₃：アセトン（１：１）および５，１０，１５，２０−テトラフェニル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン（ＴＰＰ、ＣＨＣｌ₃中２重量％溶液１．５ml ）中アルギニンエノールエーテル５の溶液をドライアイス／アセトン浴中で−７８℃に冷却し、酸素気流を溶液に通しながら、２５０Ｗの高圧ナトリウムランプで照射した。灯と反応混合物との間に配置した５ミルのKaptonポリイミド膜（Du Pont）片によって不要なＵＶ光線をろ過した。光酸素化が完了したのち、溶液を室温に暖め、減圧下に溶剤を除去すると、アルギニンジオキセタン９が得られた。３−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）−１−アニリニル−Ｌ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｎ −Ｃｂｚ（１０）化合物９に関して記載したようにして、エノールエーテル６からＮ−Ｃｂｚ− Ａｌａ−Ａｒｇジオキセタン１０を合成した。３−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）−１−アニリニル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ−Ｃｂｚ（１１）化合物９に関して記載したようにして、エノールエーテル７からＮ−Ｃｂｚ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ジオキセタン１１を合成した。３−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）−１−アニリニル−Ｌ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｎ−Ｃｂｚ（１２）化合物９に関して記載したようにして、エノールエーテル８からＮ−Ｃｂｚ− Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ジオキセタン１２を合成した。３−メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イルリデンメチル）−１−アニリニル−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｎ−Ｃｂｚ（１３）エノールエーテルアニリン１（６８mg、０．２５mmol）を、アルゴン下に、無水ジメチルホルムアミド０．６mlおよび無水ピリジン０．６mlに溶解した。Ｎ− Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｌａ（９２mg、０．３１mmol）、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド＝ＨＣｌ（５９mg、０．３１mmol）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾールの結晶をアルゴン下に室温で加えた。反応を２時間攪拌し、酢酸エチルと水とに分配し、有機層を希釈ブライン溶液および希釈炭酸水素ナトリウム溶液で順次に洗浄した。有機層をＮａ₂ＳＯ₄上で乾燥させ、蒸発させ、シリカゲルカラム上で精製すると（２５〜７５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサン）、エノールエーテルペプチド（１３）１３４mg（９７％）が得られた。３−メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル） −１−アニリニル−Ａｌａ−Ａｌａ（１４）エノールエーテル１３（２８．７mg、０．０５mmol）を無水ＥｔＯＨ１mlに溶解した。パラジウム担持カーボン触媒（５％、３３mg）および１，４−シクロヘキサジエン（４０μｌ、０．５mmol）を加え、反応を攪拌しながら５５℃４０分間加熱した。溶液をセライトの栓に通してろ過して触媒を除去し、蒸発させると、１８mgの１４が明澄な油状物として得られた。さらに精製することなく、この粗油状物を後続のペプチドカップリングに使用した。３−メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル） −１−アニリニル−（Ａｌａ）₃−Ｎ−Ａｃ（１５）化合物１３に関して記載したようにして、(Ａｌａ)₂−エノールエーテル１４をＮ−アセチル−Ｌ−Ａｌａとカップリングすることにより、Ｎ−Ａｃ−(Ａｌａ)₃エノールエーテル１５を合成した。３−メトキシトリシクロ［３．３．１．１^3,7］デス−２−イリデンメチル） −１−アニリニル−（Ａｌａ）₄−Ｎ−Ｃｂｚ（１６）化合物１３に関して記載したようにして、(Ａｌａ)₂−エノールエーテル１４（１８mg、０．０４mmol）をＡｌａ−Ａｌａ−Ｎ−Ｃｂｚ（１４mg、０．４８mmol）とカップリングすることにより、Ｎ−Ｃｂｚ−(Ａｌａ)₄−エノールエーテル１６を合成した。３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）−１−アニリニル−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｎ−Ｃｂｚ（１７）ジオキセタン３に関して記載したようにして、エノールエーテル１３からＮ− Ｃｂｚ−Ａｌａ−Ａｌａ−ジオキセタン１７を合成した。３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）−１−アニリニル−(Ａｌａ)₃−Ｎ−Ａｃ（１８）ジオキセタン３に関して記載したようにして、エノールエーテル１５からＮ− Ａｃ−(Ａｌａ)₃−ジオキセタン１８を合成した。３−（４−メトキシスピロ［１，２−ジオキセタン−３，２′ トリシクロ［３．３．１．１^3,7］デカン］−４−イル）−１−アニリニル−（Ａｌａ）₄−Ｎ −Ｃｂｚ（１９）ジオキセタン３に関して記載したようにして、エノールエーテル１６からＮ− Ｃｂｚ−(Ａｌａ)₄−ジオキセタン１９を合成した。ズブチリシンの化学発光検定ズブチリシンは、６０℃の温度に耐えることができる熱安定性の酵素である。この酵素はまた、塩に耐性を示し、尿素／洗剤の変性に抵抗を示す。プロトコル実験１プロテアーゼ基質３（０．０５M トリス中０．１mM、pH８．５、１０％アセトニトリル）を、Turner TD-20e ルミノメータ中３０℃でインキュベートした。約４．５分間バックグラウンド発光を記録したのち、２０mg/ml プロテアーゼ（Su btilisin Carlsberg，Sigma P5380）１μを加え、発光を計測した。バックグラウンドを０〜１０のスケールで計測した。酵素を添加すると、スケールは０〜１００スケールに変化し、その後（約９分後）０〜１，０００に変化した。この実験の結果を図１に示す。実験２プロテアーゼ（Subtilisin Carlsberg，Sigma P5380）を順次に希釈し、１０％アセトニトリル、１mg/ml Sapphireまたは０．１％Pluronic F127を含有する０．０５M トリス（pH８．５）中０．１mMプロテアーゼ基質３に加えた。以下の濃度、すなわち１mlあたり２００、２０、２、０．２および０．０２μｇのプロテアーゼを２組同一に試験した(ウェルあたり１００μｌ)。そして、マイクロタイタウェルを３７℃で１時間インキュベートし、Dynatech ML2250 マイクロタイタプレートルミノメータ中で化学発光信号を計測した。そして、４５℃でさらに１時間プレートをインキュベートし、化学発光信号を再び計測した。この実験の結果を図２（３７℃）および図３（３７℃、次いで４５℃）に示す。上述の実験によって示されるように、酵素によるペプチド基Ｚの消化が自発的な分解および化学発光をもたらす。本発明に対して決して限定を加えるものではない一つの特定の用途は、好熱性酵素、たとえばサーモリシンを使用する、溶液中のＤＮＡ検出およびＤＮＡブロット検定を含む。ＤＮＡ物質の調製には、しばしば、変性およびＰＣＲ増幅をはじめとする高温処理を要する。このような高温処理の前に酵素標識をＤＮＡに被着させ、標識を前にもたせることが有利であろう。しかし、多くの酵素は、高温に暴することによって失活し、変性するため、したがって、複雑な増幅後のカップリング要件がしばしば使用される。特許請求する本発明の新規なジオキセタン類は、サーモリシンおよび他の好熱性酵素の優れた基質として働くため、本発明は、ＤＮＡ検出およびＤＮＡハイブリッド形成検定に特に用途を見いだす。特に、ＤＮＡプローブおよびＤＮＡ試料は、好熱性酵素を被着した状態で調製され、変性および増幅に付されたのち、溶液中で調製されるか膜に付着され、厳しいハイブリッド形成条件に付され、本発明のジオキセタン基質リポータ分子を活性化する酵素標識を保持することができる。当業者にとって周知である他の検定フォーマットを、特許請求する発明に関連して用いることができる。特定の酵素の存在に関する単一溶液相検定に加えて、共有結合を介して、特殊なまたは高親和性結合リガンド、たとえば抗体、抗原およびリガンド対、たとえばアビジンもしくはストレプタビジン−ビオチンの結合対に標識を付けることができる。したがって、ＤＮＡハイブリッド形成検定に加えて、ＤＮＡ溶液検定、酵素検定、免疫検定および特異性溶液検定をはじめとする他の従来の検定を特許請求の発明の範囲内で実施することができる。さらには、図２および図３に示すように、多様な増強剤を使用して化学発光性能を改善することができる。代表的な増強剤、たとえば米国特許第４，９７８，６１４号明細書に記載されたものは、通常、天然に産出する物質、たとえばアルブミン、または、ホスホニウム塩、スルホニウム塩およびアンモニウム塩をはじめとする高分子第四オニウム塩であることができる水溶性の高分子である。増強剤の例は、ポリ（ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド）（ＴＭＱ）、ポリ（ビニルベンジルトリブチルアンモニウムクロリド）（ＴＢＱ）およびポリ（ビニルベンジルジメチルベンジルアンモニウムクロリド）（ＢＤＭＱ）をはじめとして、米国特許第５，１４５，７７２号明細書および米国特許第５，１１２，９６０号明細書に開示されている。これらの特定のポリマーは、疎水性ジオキセタンアミンを封鎖して水を排除するように作用し、それが、ジオキセタン化学発光を減衰する、または「消す」傾向を示す。増強剤が疎水性領域を形成する能力をさらに改善する増強添加剤、特に界面活性剤、負の電荷を帯びた塩、アルコール類、ターペンタインおよび他の溶剤ならびに水溶性ポリマーを使用することにより、さらなる改善を得ることができる。この方法によって得ることができる典型的な増強効果は、引用例として本明細書に含める係属中の米国特許出願第０８／０３１，４７１号明細書に開示されている。ブロッティング検定または他の膜ベースの検定を実施する場合、本明細書に引用例として含める米国特許第５，３３６，５９６号明細書に開示されているものをはじめとするポリマーコーティングで被覆された膜を使用することにより、化学発光性能およびＳ／Ｎ比ならびに感度をさらに高めることができる。ポリマーコーティングに適した支持体には、ニトロセルロース、ナイロンおよびＰＶＤＦがある。上述したように、プロテアーゼ不安定性基を除去した後に残るジオキセタンアミンは、自発的に分解し、化学発光するという点において、従来技術のアリールオキシ置換ジオキセタン類のオキシアニオンに類似している。ジオキセタンアミンベースの検定は、ジオキセタンアミンを含む溶液または試料の穏やかな加熱によって改善することができる。本発明のジオキセタン類は、特に安定であり、したがって、穏やかな加熱が、熱的に誘発された分解によって生じる自発的発光において実質的な増大をもたらすことはないはずである。試料の他の要素、すなわち、分析目標物を含む、検査を受ける試料の要素が、どの範囲の高温を用いることができるかに関する限界を大まかに設定するであろう。本発明のジオキセタン類および検定は、高温で変性および／または活性の減少を一般に受けるプロテアーゼ（ただし、大部分の通常の温度に抵抗を示すものもある）を用い、しばしば、さらに感熱性であるかもしれない、生物学的試料の検査および分析対象物の検出において重要な用途を見いだす。生物学的物質の一般に認められる温度限界は華氏１００度である。したがって、検定が生物学的物質を用いる場合、華氏１００度を超える加熱は避けるべきである。一般に好ましい範囲は華氏４６〜６５度である。周囲温度と華氏４５度との間の温度での加熱は、反応速度においてより穏やかな増大を実現することができる。一般的説明および具体例の両方の点で本発明を開示した。当業者にとっては、本発明の機能を実施しなくとも、ペプチド基、用いるべき特定のタンパク質分解酵素、増強剤および増強添加剤ならびに具体的な検定フォーマットをはじめとする変形態様が思いつくであろう。以下に提示する請求の範囲の記載によって排除されるものを除き、このような変形態様もまた本発明の範囲に入る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ )，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者マーチン，クリストファーアメリカ合衆国、マサチューセッツ 02178、ベルモント、チェスター・ロード 74 (72)発明者スパークス，アリソンアメリカ合衆国、マサチューセッツ 01845、ノース・アンドーバー、ジョンソン・ストリート 325 (72)発明者ヴォイタ，ジョン・シーアメリカ合衆国、マサチューセッツ 01776、サッドベリー、メイナード・ファーム・ロード 99

Claims

【特許請求の範囲】１．式（式中、Ｘ¹、Ｘ²およびＹは、独立して、水素または電子活性置換基であり、Ｒは、炭素原子１〜２０個の直鎖状もしくは分岐鎖状のアルキルまたは炭素原子３〜２０個のシクロアルキルもしくはポリシクロアルキルであり、Ｚはアミノ酸またはポリペプチドであり、Ｚは酵素特異性基質である）で示される化合物。２．Ｘ¹、Ｘ²またはＹの少なくとも一つが、該化合物を水性調製物中でより可溶性にするための可溶化剤である、請求項１記載の化合物。３．Ｘ¹およびＸ²が、独立して、水素、ヒドロキシル、ハロ置換基、ヒドロキシ低級アルキル基、ハロ低級アルキル基、フェニル基、ハロフェニル基、アルコキシフェニル基、ヒドロキシアルコキシ基、シアノ基またはアミド基である、請求項１記載の化合物。４．Ｙが水素、クロロ、アルコキシ、アリールオキシ、トリアルキルアンモニウム、アルキルアミド、アリールアミド、アリールカルバモイル、アルキルカルバモイル、シアノ、ニトロ、エステル、アルキル−もしくはアリールスルホンアミド、トリフルオロメチル、アリール、アルキル、トリアルキル−、トリアリールもしくはアルキルアリールシリル、アルキル−もしくはアリールアミドスルホニル、アルキル−もしくはアリールスルホニルならびにアルキル−もしくはアリールチオエーテルである、請求項１記載の化合物。５．該可溶化基が、アンモニウム基、ホスホニウム基、スルホニウム基、カルボン酸基、スルホン酸基、トリフルオロメチルスルホニル基、メチル−スルホニル基、シアノ基およびヒドロキシル基からなる群より選択される、請求項２記載の化合物。６．Ｘ¹およびＸ²の少なくとも一つがクロロであり、Ｙがクロロまたはメチルである、請求項１記載の化合物。７．Ａがフェニルであり、該基ＮＨ−Ｚがジオキセタン環への結合位置に対してメタ位にある、請求項１記載の化合物。８．Ａがナフチルであり、該基ＮＨ−Ｚがジオキセタン環への結合位置に隣接しない（disjoint）置換位置にある、請求項１記載の化合物。９．試料中のプロテアーゼの存在および／または量を検出する方法において、請求項１記載の化合物を該試料に加える工程、該試料をインキュベートする工程、および発光に関して該試料を検査する工程を含み、そのようにして発生した光が該プロテアーゼの存在および／または量を示すことを特徴とする方法。１０．該プロテアーゼがＤＮＡに結合している、請求項９記載の方法。１１．該プロテアーゼが抗体に結合している、請求項９記載の方法。１２．該プロテアーゼが、抗体が特異性を示す相手の物質に結合している、請求項９記載の方法。１３．該プロテアーゼが、アビジンまたはストレプトアビジン−ビオチン結合対に結合している、請求項９記載の方法。１４．請求項１記載の化合物および膜を含む、化学発光の発生によってプロテアーゼを検出するためのキット。１５．請求項１記載の化合物と、該化合物からの基Ｚの除去によって放出される光の量を、増強剤の非存在下で基Ｚの除去によって発される光の量に比較して増大させる物質とを含む、試料のプロテアーゼの存在および／または量を測定する検定を実施するためのキット。１６．膜をさらに含む、請求項１４記載のキット。