NO309143B1 - Kjemiluminiserende dioksetanderivater, analysekit og fremgangsmåte for deteksjon - Google Patents

Kjemiluminiserende dioksetanderivater, analysekit og fremgangsmåte for deteksjon Download PDF

Info

Publication number
NO309143B1
NO309143B1 NO950065A NO950065A NO309143B1 NO 309143 B1 NO309143 B1 NO 309143B1 NO 950065 A NO950065 A NO 950065A NO 950065 A NO950065 A NO 950065A NO 309143 B1 NO309143 B1 NO 309143B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
dioxetane
enzyme
chlorine
analysis
kit
Prior art date
Application number
NO950065A
Other languages
English (en)
Other versions
NO950065L (no
NO950065D0 (no
Inventor
Irena Bronstein
Brooks Edwards
Alison Sparks
Original Assignee
Tropix Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US08/057,903 external-priority patent/US5538847A/en
Application filed by Tropix Inc filed Critical Tropix Inc
Publication of NO950065L publication Critical patent/NO950065L/no
Publication of NO950065D0 publication Critical patent/NO950065D0/no
Publication of NO309143B1 publication Critical patent/NO309143B1/no

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A43—FOOTWEAR
    • A43B—CHARACTERISTIC FEATURES OF FOOTWEAR; PARTS OF FOOTWEAR
    • A43B1/00—Footwear characterised by the material
    • A43B1/0027—Footwear characterised by the material made at least partially from a material having special colours
    • A43B1/0036—Footwear characterised by the material made at least partially from a material having special colours with fluorescent or phosphorescent parts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A43—FOOTWEAR
    • A43B—CHARACTERISTIC FEATURES OF FOOTWEAR; PARTS OF FOOTWEAR
    • A43B1/00—Footwear characterised by the material
    • A43B1/0072—Footwear characterised by the material made at least partially of transparent or translucent materials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A43—FOOTWEAR
    • A43B—CHARACTERISTIC FEATURES OF FOOTWEAR; PARTS OF FOOTWEAR
    • A43B3/00—Footwear characterised by the shape or the use
    • A43B3/0031—Footwear characterised by the shape or the use provided with a pocket, e.g. for keys or a card
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
    • C07C205/27—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups
    • C07C205/35—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton
    • C07C205/36—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring or to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of the same condensed ring system
    • C07C205/37—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by etherified hydroxy groups having nitro groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the carbon skeleton to carbon atoms of the same non-condensed six-membered aromatic ring or to carbon atoms of six-membered aromatic rings being part of the same condensed ring system the oxygen atom of at least one of the etherified hydroxy groups being further bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C205/00—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton
    • C07C205/44—Compounds containing nitro groups bound to a carbon skeleton the carbon skeleton being further substituted by —CHO groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C217/00—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C217/78—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C07C217/80—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings
    • C07C217/82—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings of the same non-condensed six-membered aromatic ring
    • C07C217/84—Compounds containing amino and etherified hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton having amino groups and etherified hydroxy groups bound to carbon atoms of non-condensed six-membered aromatic rings of the same non-condensed six-membered aromatic ring the oxygen atom of at least one of the etherified hydroxy groups being further bound to an acyclic carbon atom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C233/00—Carboxylic acid amides
    • C07C233/01—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms
    • C07C233/16—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms
    • C07C233/17—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom
    • C07C233/18—Carboxylic acid amides having carbon atoms of carboxamide groups bound to hydrogen atoms or to acyclic carbon atoms having the nitrogen atom of at least one of the carboxamide groups bound to a carbon atom of a hydrocarbon radical substituted by singly-bound oxygen atoms with the substituted hydrocarbon radical bound to the nitrogen atom of the carboxamide group by an acyclic carbon atom having the carbon atom of the carboxamide group bound to a hydrogen atom or to a carbon atom of an acyclic saturated carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/08—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms
    • C07C271/26—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C271/28—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to acyclic carbon atoms with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring to a carbon atom of a non-condensed six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C271/00—Derivatives of carbamic acids, i.e. compounds containing any of the groups, the nitrogen atom not being part of nitro or nitroso groups
    • C07C271/06—Esters of carbamic acids
    • C07C271/40—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings
    • C07C271/58—Esters of carbamic acids having oxygen atoms of carbamate groups bound to carbon atoms of six-membered aromatic rings with the nitrogen atom of at least one of the carbamate groups bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/03—Ethers having all ether-oxygen atoms bound to acyclic carbon atoms
    • C07C43/14—Unsaturated ethers
    • C07C43/178—Unsaturated ethers containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C43/1788—Unsaturated ethers containing hydroxy or O-metal groups containing six-membered aromatic rings and other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/18—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring
    • C07C43/196—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a ring other than a six-membered aromatic ring containing hydroxy or O-metal groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C43/215—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring having unsaturation outside the six-membered aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C43/225—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring containing halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/02—Ethers
    • C07C43/20—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring
    • C07C43/23—Ethers having an ether-oxygen atom bound to a carbon atom of a six-membered aromatic ring containing hydroxy or O-metal groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C43/00—Ethers; Compounds having groups, groups or groups
    • C07C43/30—Compounds having groups
    • C07C43/315—Compounds having groups containing oxygen atoms singly bound to carbon atoms not being acetal carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C45/00—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds
    • C07C45/61—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups
    • C07C45/67—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton
    • C07C45/673—Preparation of compounds having >C = O groups bound only to carbon or hydrogen atoms; Preparation of chelates of such compounds by reactions not involving the formation of >C = O groups by isomerisation; by change of size of the carbon skeleton by change of size of the carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C47/00—Compounds having —CHO groups
    • C07C47/52—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings
    • C07C47/56—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings containing hydroxy groups
    • C07C47/565—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings containing hydroxy groups all hydroxy groups bound to the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C47/00—Compounds having —CHO groups
    • C07C47/52—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings
    • C07C47/575—Compounds having —CHO groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/01—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing hydroxy or O-metal groups
    • C07C65/03—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing hydroxy or O-metal groups monocyclic and having all hydroxy or O-metal groups bound to the ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C65/00—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C65/21—Compounds having carboxyl groups bound to carbon atoms of six—membered aromatic rings and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups containing ether groups, groups, groups, or groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D321/00—Heterocyclic compounds containing rings having two oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D317/00 - C07D319/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/12—Esters of phosphoric acids with hydroxyaryl compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
    • C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
    • C07F9/40—Esters thereof
    • C07F9/4003—Esters thereof the acid moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/4056—Esters of arylalkanephosphonic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6551—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a four-membered ring
    • C07F9/65512—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a four-membered ring condensed with carbocyclic rings or carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/6564—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms
    • C07F9/6571—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having phosphorus atoms, with or without nitrogen, oxygen, sulfur, selenium or tellurium atoms, as ring hetero atoms having phosphorus and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6574—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/65742—Esters of oxyacids of phosphorus non-condensed with carbocyclic rings or heterocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07G—COMPOUNDS OF UNKNOWN CONSTITUTION
    • C07G3/00—Glycosides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/203—Monocyclic carbocyclic rings other than cyclohexane rings; Bicyclic carbocyclic ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/26—Acyclic or carbocyclic radicals, substituted by hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/42—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving phosphatase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2603/00—Systems containing at least three condensed rings
    • C07C2603/56—Ring systems containing bridged rings
    • C07C2603/58—Ring systems containing bridged rings containing three rings
    • C07C2603/70—Ring systems containing bridged rings containing three rings containing only six-membered rings
    • C07C2603/74—Adamantanes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2334/00—O-linked chromogens for determinations of hydrolase enzymes, e.g. glycosidases, phosphatases, esterases
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/975—Kit

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Luminescent Compositions (AREA)
  • Heterocyclic Compounds That Contain Two Or More Ring Oxygen Atoms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Electroluminescent Light Sources (AREA)

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører kjemiluminiserende 1,2-dioksetan derivater som kan bli enzymatisk aktivert for å nedbryte og gjennom nedbrytning frigjøre lys. Dioksetaner er spesielt kjennetegnet ved tilstedeværelse av en aromatisk (fenyl eller naftyl) ring bundet til dioksetanet, i det ringen bærer en meta-substituert eller atskilt enzymatisk spaltbar gruppe som ved spalting forlater fenoksyanionet eller naftyloksyanionet til dioksan, og i fjerde eller femte posisjon når det gjelder fenyl, for eksempel, en elektron-donerende eller elektrontiltrekkende gruppe. Ved å velge identiteten på substituenten i fjerde eller femte posisjon (Z delen) kan spesielle aspekter av kjemiluminescens egenskapene til dioksetan, inkludert halveringstiden, kvantumutbytte, S/N forholdet osv bli endret.
1,2-dioksetan enzym substrater er vel etablert som meget effektive kjemiluminiserende reporter molekyler for anvendelse i enzym immunoanalyser og nukleinsyre probeanalyser av mange forskjellige typer. Disse analysene utgjør et foretrukket alternativ i forhold til konvensjonelle analyser som er basert på radioisotoper, fluoroforer, kompliserte farveskift, sekundære reaksjoner og lignende. Dioksetaner utviklet for dette formålet innbefatter de som er beskrevet i US-PS 4.978.614 samt US-PS 5.112.960. US-PS 4.978.614 beskriver blant andre 3-(2'-spiroadamantan)4-metoksy-4-(3''-fosforyloksy)fenyl-l,2-dioksetan, som har fått omfattende oppmerksomhet over hele verden og som er kommersielt tilgjengelig under varemerket AMPPD. US-PS 5.112.960 beskriver forbindelser hvor den adamantylstabiliserende ringen er substituert med enten brohodeposisjonen, med forskjellige substituenter, inkludert hydroksy, halogen og lignende, som omdanner den ellers statiske eller passive adamantyl stabiliserings gruppen til en aktiv gruppe som er involvert i kinetikken ved dekomponering av dioksetanringen. Forbindelsene av denne typen har likeledes mottatt inter-nasjonal oppmerksomhet og har gitt et raskere og sterkere signal enn AMPPD i mange anvendelser. CSPD er et spiroada-
mantylfenylfosfatdioksetan som bærer en klorsubstituent på adamtyl gruppen og som AMPPD er tilgjengelig fra Tropix, Inc. of Bedford, Mass.
Forbindelsene av denne typen er spesielt blitt utviklet for forsterket sensitivitet i analyser for tilstedeværelse av analyter i konsentrasjoner som er så lave som IO"<12> M og lavere. I visse anvendelser blir forbindelsene av denne typen anvendt sammen med forsterkere for å detektere analyter i konsentrasjon på 10_<12>M eller lavere. Disse forsterknings-mldlene, som innbefatter naturlige og syntetiske vann-oppløselige makromolekyler, er beskrevet i detalj i US-PS 5.145.772. Foretrukne forsterkningsmidler innbefatter vann-oppløselige polymeriske kvarternære ammoniumsalter, så som poly(vinylbenzyltrimetylammoniumklorid) (TMQ), poly(vinyl-benzyltributylammoniumklorid) (TMQ) og poly(vinylbenzyldi-metylbenzylammoniumklorid) (BDMQ).
Disse forsterkningsmidlene forbedrer kjemiluminiscenssignalet til dioksetan reportermolekylene ved å tilveiebringe et hydrofobt miljø hvor dioksetan er utskilt. Vann er uungåelig i de fleste analysene, og på grunn av anvendelse av kropps-fluider, er vann en naturlig "slukker" av dioksetankjemilumi-nescensen. Forsterkningsmolekylene ekskluderer sannsynligvis vann fra mikromiljøet hvori dioksetanmolekylene, eller der hvor i det minste utstrålingsartene i eksitert tilstand er, som resulterer i forsterket kjemiluminescens. Andre effekter assosiert med enhancer-dioksetaninteraksjonen kan også bidra med kjemiluminescens forsterkningen.
Ytterligere fordeler kan sikres ved anvendelse av valgte membraner, inkludert nylonmembraner og behandlet nitrocellulose, som tilveiebringer en lignende hydrofob overflate for membran-baserte analyser, og andre membraner belagt med de beskrevne forsterknings-type ("enhancer-type") polymerene som er beskrevet.
Det er fortsatt et generelt mål innen industrien å forbredre ytelsen til disse stabiliserte, kjemiluminescensdioksetan-. reportermolekylene for å forbedre maskinens avlesningsevne, sensitivitet og ytelsesaspektene til immunoanalysene avhengig av kjemiluminescenssignalet som blir frigjort av dioksetanene.
Som bakgrunn og som beskrevet i alle de refererte patentene blir enzymatisk-aktiverte dioksetaner anvendt som reportermolekyler, som substratet for enzymer som spalter den enzym-labile gruppen bundet til en aromatisk substituent på dioksetanringen. Enzymet, for eksempel alkalisk fosfatase er dermed tilstede alene eller er kovalent koblet eller på annen måte kompleksbundet med enten et antigen eller antistoff, i konvensjonelle antigen/antistoff ligand bindingsanalyser, eller en nukleinsyreprobe i nukleinsyre-analyser. Det enzym-bærende antigenet eller antistoffet, eller nukleinsyreproben, blir deretter blandet sammen med analyten som antas å inneholde målantigenet, eller nuklein-syresekvensen, under betingelser som muliggjør kompleks-binding eller hybridisering mellom antigen/antistoff eller probe/nukleinsyresekvensen. Etter bortvasking eller ut-separering av det totale ikke-kompleksbundede eller ikke-hybridiserte materialet blir dioksetansubstratet tilsatt. Dersom den antatte analyten er tilstede vil enzymet spalte den enzym-labile gruppen på den aromatiske substituenten på dioksetan, for eksempel fenyl eller naftyl, som tilveiebringer fenoksy eller naftyloksyanion mellomproduktet. Dette anionet nedbrytes, ved elektronoverføring gjennom den aromatiske ringen, spaltning av dioksetanringen og tilveiebringer to karbonyl-baserte produkter. Spaltnings-/nedbrytningsheneldsen er den lys-frigjørende heneldsen.
For å automatisere kliniske analyser og for å tilveiebringe vesentlig gjennomkjøring er kontinuerlig reduksjon i halveringstid, eller ^i/z"til dioksetan, samt en reduksjon i tidsmengden nødvendig for å nå maksimal emissjon av lys fra reporter molekylet, er ønskelig. På samme tid for å detektere analyter i ekstreme lave konsentrasjoner, under for eksempel omtrent 10_<12>M er det ønskelig å forbedre intensiteten til signalet fra dioksetan reportermolekylet og samtidig ønskelig å unngå og øke bakgrunnsstøyen forårsaket av ikke-enzymatisk-indusert lysfrigjøring for å forbedre den totale sensi-tiviteten til analysen. Ytterligere forbedringer i kjemiluminescens dioksetan reportermolekyler er ønskelig.
Ovennevnte mål og andre blir oppfylt av en ny klasse dioksetaner som er spesielt kjennetegnet ved en substituent på den aromatiske ringen bundet til dioksetan, i tillegg til den metasubstituerte enzym-labile gruppen. Det nye dioksetan ifølge denne oppfinnelsen har formelen
kjennetegnet ved at Y<1> og Y<2> uavhengig er H eller et halogen, hvor R er C1-C12 alkyl,
hvor X er en enzym-labil gruppe valgt fra gruppen bestående av en fosfat,
hvor Z er et halogen eller metoksy og okkuperer 4- eller 5-posisjonen på fenylringen.
Ved å velge den bestemte identiteten og beliggenheten til Z, som en elektron-tiltrekkende eller en elektron-donerénde gruppe, kan spesifikke karaktertrekk ved kjemiluminescens atferden til dioksetan, inkludert tl/2-kjemiluminescens halveringstid, tid til maksimal emissjon, maksimal emissjons-bølgelengde og kjemiluminescens signal intensitet bli påvirket.
Foreliggende oppfinnelse vedrører et kit for å utføre en analyse ved anvendelse av et kjemiluminescens dioksetan reportermolekyl, kjennetegnet ved at det omfatter dioksetan som tidligere nevnt, og et enzym med evne for spalting, i vandig oppløsning, del X til nevnte dioksetan.
Foreliggende oppfinnelse vedrører også en fremgangsmåte for å detektere tilstedeværelsen av et enzym i en prøve, kjennetegnet ved å kontakte nevnte prøve med et dioksetan som tidligere nevnte, og detektere frigjøring av lys forårsaket derved, idet nevnte enzym spalter nevnte enzym-labile gruppe X og hvor deteksjonen av lys som blir frigjort indikerer tilstedeværelse av nevnte enzym i en prøve.
Videre vedrører oppfinnenlsen en fremgangsmåte for å detektere et første medlem av et spesifikt bindingspar som har første og andre medlemmer, kjennetegnet ved å optisk detektere kjemiluminescens produsert ved omsetning av et dioksetan som nevnt ovenfor, med et enzym som spalter nevnte enzym-labile gruppe X til nevnte dioksetan, hvor nevnte enzym er kompleksbundet med et andre medlem av nevnte spesifikke bindingspar.
Kort beskrivelse av tegningene;
Figur 1 og 2 sammenligner ytelsen til dinatrium 3(4-metoksy-spiro[l,2-dioksetan-3,2'-(5'-klor)tricyklo[3.3.1.I<3>•<7>]dekan]-4-yl)fenylfosfatdioksetan (CSPC) med en forbindelse ifølge denne oppfinnelsen dinatrium-2-klor-5-(4-metoksyspiro[l,2-dioksetan-2 , 3 * ( 5 ' -klor - ) tr i cyklo-[3 . 3.1.13 •7]-dekan]-4yl )-fenylfosfat hvor fenyldelen bærer en klorsubstituent i 4 posisjonen (CDP-Star). Figur 2 reflekterer tilstedeværelse av en kjmiluminescensforsterker, polyvinylbenzyltributyl-ammoniumklorid. Figur 3 er en sammenligning mellom CSPD og CDP-Star på en nylonmembrananalyse for biotinylert pBR322-35mer. Figurene 4 og 5 er reproduksjoner av Kodak XAR-5 film eksponeringer av western blot analyser utført på nylon og PVDF membraner som sammenligner CSPD og CDP-Star. Figurene 6, 7 og 8 er reproduksjoner av røntgenfilmkontrast CSPD og CDP-Star inkubasjoner i 10 minutter, 70 minutter og 19 timer, til en analyse utført på nylonmembraner for gjaergenet RPB1. Figur 9 er en reproduksjon av røntgenfilm eksponeringer som reflekterer kjemiluminescens deteksjon av DNA sekvens stige utført på nylonmembraner contrasting CSPD og CDP-Star. Figurene 10 og 11 er elektrofotografiske duplikasjoner av røntgenfilmbiIder av DNA sekvensering oppnådd ved anvendelse av dioksetaner i den krevde oppfinnelsen. Disse blir sammenlignet mot den kommersielle standarden, CSPD. Figurene 12-21 er elektrofotografiske duplikasjoner av dot blot analyseresultatene på membraner som vist ved anvendelse av dioksetaner ifølge den krevde oppfinnelsen, dioksetaner utenfor rammen av den krevde oppfinnelsen og de kommersielle standardene til CSPD og AMPPD. Membranen som disse analysene ble utført på er angitt i figurene.
Dioksetan ifølge denne oppfinnelsen er kritisk karakterisert av substituentene på den aromatiske ringen koblet til dioksetanene, i det ringen bestemmer elektronoverføringen i aryloksyanionet som fører til nedbrytning og kjemiluminescens. Fenyldioksetanet ifølge oppfinnelsen har dermed følgende og generelle struktur (I).
Adamantyl-stabiliserte dioksetaner ifølge den krevde oppfinnelsen bærer dermed to substituenter på fenylringen i tillegg til koblingspunktet til dioksetan, samt 0, 1 eller 2 ikke-hydrogen substituenter på adamantylringen. Disse substituentene karakteriserer kritisk de elektroniske karaktertrekkene til dioksetan, oksyanionet og dekompo-neringsatferden. Identitetene til hver substituent er angitt nedenfor.
R er Cl-C12-alkyl. R er fortrinnsvis C1-C4 alkyl. Identiteten til R kan bli optimalisert med hensyn på oppløselighet hvor uvanlige analyter eller buffere kan gi bestemte problemer. Ever Y<1> og Y<2> representerer individuelt og uavhengig hydrogen eller et halogen. Foretrukne identiteter til en av Y<1> og Y<2 >er klor, hvor den andre er hydrogen.
X er en enzym-spaltbar del. Ved riktig kontakt med et egnet enzym blir X spaltet fra molekylet og etterlater oksygenet koblet til fenylringen og dermed fenoksyanionet. X er fosfat. Det er viktig å bemerke at når substituert på fenylringen er OX meta med hensyn på koblingspunktet til dioksetanringen, dvs. okkuperer tre posisjonen.
Z kan enten okkupere fire eller fem posisjon. Z er en elektron-aktiv substituent, karakteren til de elektron-aktive artene (elektron-donerende eller elektron-tiltrekkende), som optimaliserer forskjellige aspekter av dioksetandelen. Som et eksempel kan en elektron-donerende gruppe, så som en metoksygruppe forsterke dioksetanfenoksyanion dekomponerings-prosessen ved å lette overførbarheten til de fri ektronene fra den aromatiske ring 0~ donorgruppen, til dioksetanringen. I kontrast til dette kan en elektron-tiltrekkende gruppe redusere eller ødelegge evnen til å overføre frie elektroner til dioksetan og dermed gjøre dekomponeringsreaksjonen og lysemissjonen langsommere til tross for at det dermed gir et lyssignal med høyere intensitet. Dette bør stå i kontrast til innvirkningen av den elektron-tiltrekkende (eng. "with-drawing") substituenten på adamantyl gruppen, så som klor, som vesentlig aksellererer lysemissjonen og sterkt reduserer "tl/2- Av overraskende betydning er det faktumet at substitu-sjonen i seks posisjonen er spesielt lite ønsket. Slike seks-substituerte fenyldioksetaner utviser ekstraordinær hurtig dekomponeringskinetikk og nesten ikke noe lysemissjon. Uten å være begrenset til denne teorien antas det at denne atferden er forårsaket av steriske betraktninger, dvs. orto substituenten "dreier" fenylringen slik at det destabiliserer dioksetanringen (destabilisering gjennom steriske krefter, ikke elektronoverføring) og en substituent i seks-posisjonen for eksempel metoksy, deltar ikke i elektronoverføringen. Som diskutert nedenfor gir eksperimenter som involverer 6-substituerte fenyldioksetaner vesentlig ikke noe signal.
Som angitt ovenfor kan Z være et halogen eller metoksy. Foretrukne elektron-aktive substituenter innbefatter klor, metyl eller -OCH3.
Dioksetan med type beskrevet ovenfor, uten innbefattelse av Z substituenten, som tidligere angitt, er beskrevet i patenter som hører hertil. Patenter vedrørende dioksetan av denne typen uten innbefatning av Y og Z substituentene er også blitt gitt til Wayne State University, så som 4.962.192. Substitusjon av Z substituenten på dioksetaner krevde utvikling av syntese av tri-substituerte fenylfosfonater som er beskrevet nedenfor, under tittelen nye tri-substituerte fenyl 1,2-dioksetanfosfater. Den samme generelle synteseveien kan bli anvendt for naftyldioksetaner innbefattet heri tatt i betraktning av substitusjonsmønstrene som er nød-vendige som beskrevet ovenfor. Syntese av disse forbindelsene ved hjelp av veien beskrevet nedenfor innbefatter frem-stilling av nye tri-substituerte benzener. Som beskrevet nedenfor innbefatter en eksempelvis forbindelse involvert i syntese av dioksetaner fra denne klassen 3-klor-5-metoksy-benzaldehyd. Disse tri-substituerte forbindelsene utgjøre viktige mellomprodukter i forskjellige syntetiske reak-sjonsveier, i det 1,3,5-substitusjonsmønsterert er et generelt foretrukket og meget anvendbart mønster. Disse mellomproduktene er aldri tidligere blitt fremstilt og er i synteseveien beskrevet nedenfor markert med en stjerne.
Blant andre forbindelser innenfor strukturen ifølge formel I har en forbindelse følgende struktur:
Navnet på denne forbindelsen er dinatirum 2-klor-5-(4-metoksy-spiro[1.2-dioksetan-3,2'-(5'klor-)tricyklo-[3.3.1.l<3-7>]dekan]-4-yl)-l-fenylfosfat.
Denne forbindelsen blir generelt referert til som CDP-Star. Den kan bli fremstilt som vist i følgende reaksjonsskjema.
4- klor- 3- metoksybenzaldehyddimetylacetal 3
En heterogen blanding av metanol (2 ml), CH2C12 (3 ml), 4-klor-3-metoksybenzaldehyd (2 g, 11.7 mmol); fremstilt vesentlig som beskrevet av R.M. Riggs et al., J. Med. Chem., 30 1887, 1987), trimetylorthoformat (1.7 ml, 15.5 mmol) og en stor krystall av p-toluensulfonsyre ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Ytterligere MeOH (1 ml) og en krystall av p-toluensulfonsyre ble tilsatt og oppløsningen ble varmet helt til den var homogen. Ved endt reaksjon ble oppløsningen omrørt i 5 min. med overskudd fast NaHC03 og rotoravdampet for å fjerne oppløsningsmidlene. Pastaen ble løst opp i 40 ml EtOAc, fordelt mot fortynnet NaHC03 oppløsning og avdampet for å tilveiebringe en lysebrun olje. Reaksjonen ble gjentatt med ytterligere 2 g 4-klor-3-metoksybenzaldehyd og begge produktoljene ble kombinert for å tilveiebringe 4.37 g (86$) dimetylacetal 3.
IR (neat, cm-<1>): 2930, 2810, 1582, 1580, 1483, 1460, 1402, 1348, 1268, 1100, 1059, 989, 861, 827, 790
<1->H NMR (CDC13, ppm): 3.30 (6H, s), 3.90 (3H, s), 5.33 (1H, s), 6.95 (1H, d), 7.03 (1H, s),7.32 81H, d).
Dietyl l- metoksy- l-( 4- klor- 3- metoksyfenyl) metanfosfonat 4
En oppløsning av dimetylacetal 3 (4.3 g, 20 mmol) sikt-tørket CH2C12 (20 ml) og trietylfosfit (4.1 ml, 24 mmol) ble omrørt under argon ved -78°C. Bortrifluoridetereat (2.95 ml, 24 mmol) ble dråpevis tilsatt ved -78°C, oppløsningen ble omrørt i 5 min. og lagret over natt ved -20° C. Neste dag ble reaksjonen varmet til romtemperatur og omrørt i 5 timer for å fullføre fosfonatdannelsen. Med omfattende omrøring ble reaksjonen stoppet med fast NaHCC>3 etterfulgt av 40 ml mettet NaHCOs oppløsning. Etter at gassutviklingen var opphørt ble 40 ml CH2Cl2 og 20 ml H20 tilsatt, den bifasiske blandingen ble fordelt og CH2C12 fasen ble isolert, tørket over Na2S04 og avdampet. Etter pumping i vakuum ble oljen renset på en silika gelplugg, eluerende med CH2C1<2> for å tilveiebringe fosfonat 4 som en lysegul olje (6.01 g., 99%).
IR (neat, cm-<1>): 2980, 2930, 1590, 1580, 1480, 1460, 1408, 1280, 1250, 1095, 1055, 1025, 967, 871, 809, 790, 754, 728
4- klor- 3- metoksy- l-( metoksy- 5- klor- tricyklor3. 3. 1. l-3-^-?-! dek- 2-ylidenmetyl)- benzen 5
Fosfonat 4 (3.2 g, 10 mmol) ble løst opp i 30 ml tørr THF under argon og avkjølt til -78°C. Dråpevis tilsetning av nBuLi (2.3M, 4.4 ml, 10.1 mmol) dannet et gul-orange fosfonatylid. Etter omrøring av ylidoppløsningen i 10 min. ble 5-klor-2-adamantanon (1.75 g, 9.5 mmol) løst opp i 8 ml THF tilsatt dråpevis til ylidet ved -78°C. Reaksjonen ble sakte varmet til romtemperatur over 45 min. og tilbake-strømmet i 2 timer. Ved avkjøling ble THF strippet i vakuum og produktet ble fordelt mellom EtOAc/heksaner (1:1) og fortynnet NaHCC^. Det organiske laget ble tørket over NaHCC^. Det organiske laget ble tørket over Na2S04, strippet for oppløsningsmiddel og renset på silikagel (2-4$ EtOAc/- heksaner) for å tilveiebringe 3.3 g (96$) enoleter 5 som en farveløs, viskøs gummi.
4- klor - 3- hydroksy- l-( metoksy- 5- klor- tricyklofS■ 3. 1. l^-=-?- ldek-2- ylidenmetyl)- benzen 6
Demetylering til enoleterfenol 6 forløp med oppvarming av enoleter 5 (3.3 g, 9.3 mmol) i 22 ml DMF ved 135°C ved 175°C i nærvær av natrium etanthiolat (14 mmol) i 1.5 time. Reaksjonen ble avkjølt og fordelt mellom 50 ml EtOAc, 100 ml IM NH4CI og 10 ml mettet NaHC03 oppløsning. Den organiske fasen ble isolert og grundig vasket med vann mens den vandige fasen ble vasket en gang med EtOAc. EtOAc lagene ble kombinert, vasket med saltvann, tørket over Na2S04 og strippet for oppløsningsmiddel i vakuum. Råoljen ble renset på en silika gelkolonne, eluerende med 50$ C^C^/heksaner, for å tilveiebringe 3.6 g fenol 6 som en råolje. Ytterligere rensning ved to krystalliseringer frå en avkjølt 15$ CH2Cl2/heksaner oppløsning ga fenol 6 som et fast stoff (2.18 g, bO%). IR (CHCI3, cm-<1>): 3530 (OH), 3300 (OH), 2920, 2845, 1568, 1478, 1308, 1190, 1166, 1090, 1079, 1042, 1020, 821
<X>H NMR (CDC13, ppm): 1.57-2.28 (11H, m), 2.75 (1H, br s), 3.27 /3H, s), 3,41 (1H, br s), 5.57 (1H, s), 6.79 (1E, dd, J=8 Ez, 2 Ez), 6.93 (1H, d, J=2 Hz), 7.28 (1E, d, J=8 Ez)
Natrium 2- cyanoetyl 2- klor- 5-( metoksy-( 5- klor) tricvklo-r3. 3. i. l3-=- Z-| dek_ 2_ vlldenmetvl )- i- fenylfosfat 7
Til en oppløsning av fenol 6 (0.75 g, 2.2 mmol), trietylamin (400 ul, 2.86 mmol) og vannfri TEF (8 ml) ble tilsatt til 2-klor-2-okso-l,3,2-dioksafosfolan (Fluka, 240 ul, 2.6 mmol) ved romtemperatur under argon. Reaksjonen ble omrørt i 3 timer og trietylammoniumhydroklorid presipiterte ut. Reaksjonsoppløsningen ble pipettert av presipitatet med en sprøyte med bomullstopp under sterk strømning av argon. Presipitatet ble skylt flere ganger med eter og den kombi-nerte oppløsningen og skyllingene ble avdampet i vakuum for å tilveiebringe et skum som ble beskyttet fra eksponering for fuktighet.
Skummet ble løst opp i vannfri DMF (4 ml) og omrørt med tørr NaCN (140 mg, 2.8 mmol) ved romtemperatur i 24 timer for å danne p<->cyanoetylfosfatdiester. Reaksjonsblandingen ble pumpet ved høyt vakuum ved 55 °C for å fjerne DMF og ga fosfatdiester 7 som en gummi. Rå fosfatdiester ble fotooksy-genert uten ytterligere rensning.
Syn- og anti- dinatrium 2- klor- 5-( 4- metoksyspirori. 2- dioksetan - 3. 2'-( 5>klor- ) tricyklor3 . 3. 1. l-3-^-7-! - dekanl - 4- vi )- l-fenylfosfat 1
Fosfatdiester 7 ble løst opp i 20 ml 10$ MeOE/CECl3 hvor det ble tilsatt 5 ,10 ,15 ,20-tetrafenyl-21E,23H-porfin (TPP, 0.8 ml av en 2 mg/ml CECI3 oppløsning). Reaksjonsblandingen ble mettet med oksygen og bestrålt med en 250W, natriumdamplampe med høyt trykk omhyllet av Kapton film ved 5°C mens oksygen ble sendt gjennom oppløsningen. Analytisk revers fase EPLC analyse viste fullstendig dioksetandannelse ved bestrålning i 20 min. Oppløsningsmidlene ble strippet i vakuum ved romtemperatur, resten ble pumpet til en gummi under høyt vakuum og lagret ved -20°C.
Rå cyanoetylfosfatdiesterdioksetan 8, løst opp i 11 ml MeOH, ble avspaltet med natriummetoksid (0,5 ml 25$ vekt NaOMe i MeOH) ved romtemperatur i 30 min. Ved fullført p-eliminering av cyanoetylgruppen ble 2 ml mettet NaHC03 oppløsning tilsatt og meOH ble roterende avdampet. HPLC kvalitetvann (15 ml) ble tilsatt og den brune oppløsningen ble sendt gjennom et 0.45u nylonfilter. Oppløsningsvolumet ble justert til 40 ml med HPLC kvalitetvann og renset ved preparativ HPLC ved anvendelse av en HC3CN/H2O gradient gjennom en polystyren kolonne (PLRP-S, Polymer laboratories). Fryse-tørkede fraksjoner ga 0.81 g (74$ fra fenol 6) av dioksetan 1. Analytisk revers fase HPLC på en polystyrenkolonne ved anvendelse av en gradient av acetonitril og 0.1$ NaHC03 og UV-deteksjon ved 270 nm viste en topp med en front som beveger seg som skulder og som representerer en blanding av syn og antiisomerer. En prøve av produktet, som en isomer-blanding, ble løst opp i en 0,1 M dietanolaminbuffer (1 mM MgCl2) ved pH 10. Etter å ha blitt behandlet med alkalisk fosfatase ble lys emittert som ventet og bekreftet dermed at produktet er et 1,2-dioksetan av tittelstrukturen.
EKSEMPLER
Dioksetan innenfor rammen av denne oppfinnelsen er blitt dannet og testet for essensielle egenskaper. Innbefattet som fremstilte og undersøkte dioksetaner er de hvor R er metyl, X er fosfat og Y<2> er klor, og Z er i 4 eller 5 posisjonen på en fenylring. I forsøkene nedenfor blir dioksetanene sammenlignet mot de kommersielle standardene CSPD og AMPPD.
K. jemiluminescensdeteks. ion av alkalisk fosfatase i oppløsning Alkalisk fosfatase (5.25 X IO-<17> mol) ble inkubert i 0.5 ml 0.1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2, pH 10, inneholdende 0.4 mM dioksetan ved romtemperatur. Kjemiluminescens (5 sekund integral) ble målt i et Berthold LB952T luminometer ved 5, 10, 20, 30, 44, 50 og 60 minutter. Figurene 1 og 2 sammenligner ytelsen til CSPD og CDP-Star. Figur 1 viser sammenligning av CSPD og CDP-Star plottet som relative lysenheter (RLU) vs tid. Gjennomsnittet av tre replikater er plottet.
Figur 2 viser resultatene oppnådd fra et annet sett av prøver inneholdende 1 mg/ml kjemiluminescens forsterkende polymer-polyvinylbenzyltributylammoniumklorid.
Chemiluminescensdeteks. ion av biotinylert pBR322- 35mer på nylonmembran
Biotinylert pBR322 35-mer (13.1 pg i 1 ul) ble applisert på et lite stykke positivt ladet nylonmembran (Tropilon-pluss). Membranen ble fullstendig tørket og DNA ble fiksert til membranen ved UV kryss-binding (129 mJ/cm<2>). Membranen ble fuktet med PBS og deretter inkubert i blokkeringsbuffer (0.2$ 1-Block, 0.5$ SDS i PBS) i 10 minutter, i streptavidin-alkalisk fosfatase konjugat (Avidex-AP, Tropix; fortynnet 1:5000 i blokkeringsbuffer) i 20 minutter og vasket en gang i 5 minutter med blokkeringsbuffer og tre ganger i 5 minutter med vaskebuffer (0.5$ SDS i PBS). Membranene ble deretter vasket to ganger i fem minutter med analysebuffer (0.1 M DEA, 1 mM MgClg, pH 10.0). Til slutt ble membranene trimmet og forseglet i en liten firkant av varme-forskjærbar plast med 40 ul 0.25 mM CSPD eller CDP-Star (fortynnet i analysebuffer). Det forseglede stykket av membranen ble øyeblikkelig festet til et rør (pre-inkubert ved 22° C) og plassert i et Turner Model 20e luminometer (Turner Designs, Inc. Mountain view, CA). Lysemissjonen ble registrert hvert 5. minutt i en periode på 24 timer ved 22° C. Figur 3 er et plot av kjemiluminescens intensiteten (RLU) vs tid for SCPD og CDP-Star.
K. iemiluminescens deteksjon av Western blottet human transferrin
Renset human transferrin (Boehringer/Mannheim cat#1317 415) ble fortynnet i serie med IX SDS-PAGE ampi iseringsbuffer
(0.06 M Tris-HCl, pH 6.8, 2.25$ glycerol, 0. 5% e-merkapto-etanol, 2% SDS, 0.05$ bromfenol blå). Fortynningene ble oppvarmet ved 95 "C i 5 minutter og 5 pl fortynnet prøve ble applisert pr. gelkolonne. Prøvene ble elektroforetisk separert ved SDS-PAGE på 10$ polyakrylamid minigeler ved anvendelse av en Hoefer SE250 minigel apparatur. Hvert blot inneholder 10, 3.3, 1.1, 0.37, 0.12 og 0.04 ng mengder transferrin. Etter elektroforese ble geler og membraner ekvilibrert med transf erbuf f er (5 mM MP0S pH 7.5, 2 mM natriumacetat, 20$ MeOH) i 15 minutter. Proteinet ble overført til PVDF (Tropifluor) og positivt ladet nylon (Tropilon-Plus) membran i 1 time ved 90V ved 4°C. Blottene ble inkubert i blottebuffer (BB-1 [0.2$ 1-Block, 0.1$ Tween-20 i PBS] ble anvendt for PVDF og BB-2[3# 1-Block, 0.1$ Tween-20 i PBS] ble anvendt for nylon) i 30 mnutter. Blottene ble deretter inkubert med kaninpolyklonalt antihumant transferrin (Boehringer/Mannheim eat # 615 015; fortynnet 1:5000 i hensiktsmessig blokkeringsbuffer) i 30 minutter, og deretter vasket to ganger i 5 minutter (PVDF med BB-1, og nylon med vaskebuffer [0.1$ Tween-20 i PBS]). Deretter ble blottene inkubert med geiteanti-kanin IgG alkalisk fosfatasekonjugat (tropix; fortynnet 1:10000 i hensiktsmessig blokkeringsbuffer) i 30 minutter og deretter vasket to ganger i 5 minutter som ovenfor. Blottene ble deretter vasket to ganger i 5 minutter i analysebuf f er (0.1 M DEA, 1 mM MgClg» pH 10.0). Til slutt ble blottene inkubert med 0.25 mM CSPD eller CDP-Star (fortynnet i analysebuffer) i 5 minutter. BLottene ble drenert for overskuddsubstratoppløsning, plassert i plastreporter lag og eksponert for Kodak XAR-5 film. Resultatene oppnådd på nylon og på PVDF membraner er vist i figurene 4-5.
K. jemi luminescens deteksjonen av et enkelt kopi gjærgen på nylonmembran
Totalt genomisk DNA fra gjær Saccharomyces cerevisiae ble spaltet med EcoRI og Bgl 11 restriksjonsendonukleaser. 5.0, 0.5 og 0.05 jjg mengder av hver DNA spaltning ble separert ved elektroforese i en horisontal 0. 8% agarose IX TBE gel. Etter elektroforese ble gelen nedsenket i 1.5 M naCl, 0.5 M BaOH for 45 minutter for å denaturere DNA og deretter inkubert i nøytraliseringsbuffer (IM Tris, 1.5 M NaCl, pH 7.4) i 45 minutter. DNA ble overført til positivt ladede nylonmembraner (Tropilon-Plus) ved overnatt kapillær overføring ved anvendelse av 20X SSC. Membranene ble lufttørket og DNA ble TJV-kryssbundet til membranene ved 120 mJ/cm<2>. Et 1 kb Bgl 11 fragment, spaltet fra gjærgenet RPB 1, ble renset på gel og biotinylert ved en tilfeldig timingsreaksjon som inn-korporerer biotin-14-dCTP. Membranene ble prehybridisert i 30 minutter ved 68°C i hybridiseringsoppløsning { 7% SDS, 0.25 M Na2P04, 1.0 mM EDTA) hybridisert over natt ved 68°C med 5 ml frisk hybridiseringsbuffer inneholdende 5 ng/ml denaturert probe og deretter fjernet fra hybridiseringsoppløsningen og vasket som følger: to ganger i 5 min, med 2X SCC, 1% SDS ved romtemperatur; to ganger i 15 minutter i 0.1XSSC, 1% SDS ved 68° C; og to ganger i 5 minutter i 1XSSC ved romtemperatur. Membranene ble deretter inkubert i 10 minutter i blokkerings-buf f er ( 0. 2% cassein, 0.5$ SDS, PBS) og 20 min. med 1:5000 fortynning AVIDx-AP i blokkeringsbuffer. De ble deretter vasket i blokkeringsbuffer i 5 min., 3 ganger i 10 min. i vaskebuffer ( 0. 5% SDS, PBS) og to ganger i 2 min. i analysebuf f er (0.1 M dietanolamin, 1.0 mM MgCl2, pH 10.0) etterfulgt av inkubasjon i 5 minutter i 0.25 mM dioksetan i analysebuf fer. Etter drenering av overskuddsubstratoppløsning ble membranene omhyllet av plast og eksponert for røntgenfilm. 60 minutter utsettelse tatt 10 minutter, 70 minutter og 19 timer etter substratinkubasjon er reflektert i følgende eksponeringer. Sammenligninger av CSDP og CDP-Star er vist i figurene 6, 7 og 8.
Kjemiluminescens deteksjon av DNA sekvensstiger
DNA sekvenseringsreaksjoner ble utført med Tropix SEO-Light sett ved anvendelse av biotinylert (-20) universal primer og enkelttrådet M13 mpl8 templat DNA. Reaksjonsproduktene ble separert på en b% polyakrylamid 8 M ureagel, overført til Tropilon-Plus nylonmembraner ved kapillær virkning og UV-kryssbinding til membranen (total bestrålning - 120 mJ/cm<2>). Kjemiluminescens deteksjon ble utført ved inkubering av membranen i 10 minutter i blokkeringsbuffer (0.2$ i-Block, 0.5$ SDS, PBS) i 20 minutter i konjugatoppløsning (1/5000 fortynning av Avidex-AP streptavidin alkaliskfosfatase konjugat i blokkeringsbuffer), deretter vasket 1X5 minutter med blokkeringsbuffer, 3X5 minutter med vaskebuffer (0.5$ SDS, PBS) og 2X2 minutter med analysebuf f er (0.1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2» pH 10). Hver membranstrimmel ble inkubert i 5 minutter med enten 0.25 mM CSPD eller CDP-Star i analysebuf fer. Alle trinnene ble utført ved romtemperatur i en stor varmeforseglet plastpose med moderat risting (140-170 rpm). Sammenligning av CSPD og CDP-Star ved tre tidspunkter er tilveiebragt. Tid etter inkubasjon med substrat og eks-poneringstid for Kodak XAR-5 røntgenfilm er vist på figur 9.
Ytterligere testing reflekterer verdier så som kvantumutbytte (utført av et uavhengig laboratorium ifølge prosedyren angitt nedenfor), ^ ±/ 2 °S emissjonsbølgelengde maksimum. Disse dioksetanene er identifisert med tall og i tabellene som følger etter tallene er identiteten til substituenten på adamantylringen, om noen etterfulgt av identiteten til Z substituenten, gitt. I de testede forbindelsene er X fosfat. Verdier for kvantumutbytte og T^/g blir oppnådd både for dioksetan alene i 0.1 molar DEA og i nærvær av et forsterkningsmiddel, Sapphire II.
Protokoll for kvantumutbyttebestemmelse
500 ul 3.2 x IO"<4> M oppløsning av et dioksetan i 0.IM DEA, pH 10.0 ble plassert i et 12 x 75 mm rør ved 20"C. Oppløsningen ble ekvilibrert til 20°C i et avkjølt vannbad i 10 minutter.
2 ul alkalisk fosfatase suspensjon ble tilsatt til røret inneholdende dioksetan og øyeblikkelig vortex behandlet i 1 sekund og plassert i et 20 °C vannbad. Røret ble deretter plassert i MGM Optocomp I luminometer og lyssignalet ble målt ved 1 sek. integrasjonstider. Etter at lyssignalet var målt ble røret plassert tilbake inn i 20° C vannbad og målingen ble gjentatt. Totale tellinger for dioksetan ble bestemt ut fra intensitetsdataene. Totale tellinger observert for en gitt konsentrasjon av dioksetan er produktet av Photon deteksjonseffektiviteten (PDE) til luminometeret, kvantumutbytte av dioksetan og antall molekyler som kan emittere lys (konsentrasjon til defosforylerte dioksetaner). PDE for MGM Optocomp I luminometer ble bestemt å være 2.56 x IO-<3> målt med en Biolink absolutt standard og anvendelse av kjent spektral respons av luminometerets PMT og det kjente emissjonsspekteret til dioksetanene. Kvantumutbyttet blir beregnet ved å dele totale tellinger målt ved PDE og konsentrasjonen av dioksetan.
Beregning av halveringsliv eller halveringstid mot likevekt lvsemissjon
Fra avlesningen til Turner luminometeret ble det maksimale signalet målt. Maksimalt signal minus Turner lys enhet avlesningene ved 30, 150, 300 eller 600 sekund intervaller ble beregnet og oppstilt grafisk mot tid i sekunder. Ut fra grafene ble en eksponentiell ligning beregnet for å bestemme halveringslivet.
Halveringslivene til dioksetaner ble også bestemt direkte ut fra Turner luminometer utprintninger.
Emiss. i on smak sima
Til 2 ml av en pH 10 oppløsning av 0.4 mM dioksetan, 0.1M dietanolamin, 1 mM MgCl2 ble det tilsatt 9.9 x 10_<11>M alkalisk fosfatase. Oppløsningen ble ekvilibrert 5 minutter i et Spex Fluorolog Fluorimeter og deretter scannet 5 ganger ved 0.5 sek/nm for kjemiluminescens emissjon. Kjemiluminescens emissjons bølgelengde maksimum ble registrert.
K. jemiluminescens DNA sekvensering
DNA sekvensering med kjemiluminescens deteksjon ble utført som beskrevet i Tropix SEQ-Light protokollen. Kort fortalt
ble DNA sekvenseringsreaksjonene initiert med biotinylerte primere ved anvendelse av M13 enkelttrådet fag DNA som et templat. Reaksjonene ble separert på 8 M urea deanturerende PAGE, overført horisontalt til Tropilon-Plus nylonmembran ved kapillær virkning og kryss-bundet til membranen ved eksponering for UV-lys ved anvendelse av en Spectronics SpectroLinker XL-1500 ved 200 mJ/cm<2>. Membranene ble inkubert med blokkeringsbuffer (0.2$ I-Block, 0. 5% natrium, dodecyl-sulfat/SDS i fosfatbuffret saltvann/PBS [20 mM natriumfosfat, pH 7.2, 150 mM NaCl]) i 10 minutter, inkubert med en 1/5000 fortynning av Avidex-AP streptavidin-alkalisk fosfatase i blokkeringsbuffer i 20 minutter, vasket i 5 minutter i blokkeringsbuffer, vasket 3X5 minutter med vaskebuffer ( 0. 5% SDS, PBS), vasket <2> X 5 minutter med analysebuffer (0.1 M dietanolamin, 1 mM MgCl2 pH 10) og deretter inkubert med dioksetanoppløsning (enten CSPD, 140-17 eller 128-87 fortynnet til 0.25 mM i analysebuf fer) i 5 minutter. Membranene ble drenert, forseglet i en plastfolder og eksponert for Kodak XAR-5 røntgenfilm. For dioksetan 128-87 var eksponeringstiden 70 minutter og for 140-17, 80 minutter, begge 65 minutter etter substrattilsetning. For sammenligning av dioksetan 128-87 mot CSPD var membraneksponeringstiden 5 minutter etter en 24 timer lang inkubasjon med substrat.
Figurene 10 og 11. Detaljer om denne protokolltypen er reflektert i Tropix SEQ-Light DNA sekvenseringssystemet, kommersielt tilgjengelig fra Tropix, Inc.
0.1M DEA, pH 10, 25 °C
Dioksetan konsentrasjon 3.7 x 10"<7>M til 6 x 10~<6>M
0.09M DEA + 0. 1% Sapphire II, pH 9.95, 25'C Dioksetan konsentrasjon 1.8 x 10~<7>M til 6.1 x 10'
For å demonstrere positivt interaksjonen av dioksetan, eller i det minste eksitert-tilstand emitterer, med forsterkningsmidler av en type som er kjent for anvendelse i sammenheng med dioksetaner, ble bølgelengden for emissjonsmaksimum detektert i fravær av forsterkningsmiddel, i nærvær av BDMQ og på en nylonmembran. Data er angitt i følgende tabell.
DOT BLOT ANALYSER
Som angitt ovenfor er dioksetanene ifølge denne oppfinnelsen egnede for anvendelse i Dot blot analyser. Dioksetaner syntetisert ifølge synteseveien beskrevet ovenfor ble anvendt i dot blot analysene. Ved bekreftelse på fravær av kjemiluminescens til dioksetaner som bærer en Z substituent i seks posisjonen er det å bemerke at forbindelse 140-62 ga et vedvarende fravær av signal eller, under optimale betingelser, et nesten ikke detekterbart signal. Dioksetan med metoksysubstituent ved seks posisjonen med en klor substituent på adamtylringen, 140-73, ga ikke noe signal i dot blot analysen, som igjen bekrefter mangel på kjemiluminescens aktivitet i seks-substituerte metafosfatfenyldioksetaner.
Figurene 12-21.
Nitrocellulose og nylonmembraner ble belagt i flekker med en biotinylert 35 base oligonukleotidprobe. Proben ble fortynnet i IX SSC for å tilveiebringe en begynnende fortynning på 210 pg. Suksessive 1:2 fortynninger av utgangsfortynningen ble flekkvis applisert på membranene, 12 flekker totalt. Membranene ble tørket, utsatt for optimal UV-kryssbinding (120 mH/cm<2>), blokkert i 30 minutter i blokkeringsbuffer (nitrocellulose: 0.2$ I-Block, 0. 1% Tween-20, IX PBS; nylon: 0. 2% I-Block, 0. 5% SDS, IX PBS), inkubert i 20 minutter i en 1/5000 fortynning av streptavidin-alkalisk fosfatasekonjugat fortynnet i blokkeringsbuffer og vasket som følger: 1x5 minutter i blokkeringsbuffer; 3x5 minutter i IX PBS, 0. 3% Tween-20 (nitrocellulose) eller 3x5 minutter i IX PBS, 0.5$ SDS (nylon); 2x5 minutter i substratbuffer (0.1M dietanolamin, O.lmM MgCl2, pH 10); 1x5 minutter i en 1/20 fortynning av nitro-blokk (Tropix, Inc. Bedford, MA) fortynnet i substratbuffer (bare nitrocellulose eksperiment); og 2 x 5 minutter i substratbuffer (bare i nitrocellulose-eksperimentet). Membranene ble inkubert med 0.25 mM dioksetan fortynnet i substratbuffer i 5 minutter. Flere membraner i både nitrocellulose og nyloneksperimentene ble inkubert med 0.25 mg/ml Calfax DB-45, Calfax 10L-45 eller Calsoft T-60 (Pilot Chemical Company, Los Angeles, CA), 1.0 mg/ml Tween-20, 1.0 mg/ml Nitro-Block og 0.25 mM dioksetan fortynnet i substratbuffer i 5 minutter. Disse membranene ble ikke utsatt for en 1/20 fortynning av Nitro-Block. Membranene ble deretter eksponert for røntgenfilm og utviklet.
Som det fremgår fra ovennevnte resultater endrer de elektron-fratrekkende gruppene tilsatt til den aromatiske ringen av dioksetan kinetikkene til lysemissjonene, men øker kjemiluminescens signalet. I kontrast til dette aksellerer de elektron-donerende gruppene T ^/g ved å. lette elektronover-føring fra oksygenet gjennom den aromatiske gruppen til dioksetan. Ved riktig seleksjon av naturen og evnen til den elektron-donerende eller elektron-tiltrekkende Z substituenten, og samtidig seleksjon av hensiktsmessig substituent for adamantylringen kan dioksaner med spesifikke karaktertrekk, inkludert optimalisert signalintensitet, optimalisert hastighet, spesifikk emissjonsbølgelengde og lignende bli oppnådd.
Disse deoksytanene kan bli anvendt for analyser av alle typer hvor et enzym som kan spalte dioksetan er til stede alene eller som kan bli koblet til et element av komplekset som analyten, om til stede, vil danne. Konvensjonelle analyse-formater er kjente for fagfolk innenfor dette området og er beskrevet i patentene angitt ovenfor. Eksempelvise be-skrivelser av egnede analyser fremkommer i US-PS 5.112.960 og disse er innkorporert heri som referanse. Analyseformatet, per se, unntatt den forsterkede ytelsen deri til dioksetanene ifølge denne oppfinnelsen, utgjør ikke et aspekt ifølge oppf innelsen.
Dioksetanene ifølge denne oppfinnelsen, samt mellomprodukter derav, er blitt beskrevet med referanse til både generisk beskrivelse og spesifikk utførelse. I tillegg er dioksetan-yteevnen blitt beskrevet generelt og eksemplifisert.

Claims (27)

1. Dioksetan med formel (I): karakterisert ved at Y<1> og Y<2> uavhengig er H eller et halogen, hvor R er C1-C12 alkyl, hvor X er en enzym-labil gruppe valgt fra gruppen bestående av en fosfat, hvor Z er et halogen eller metoksy og okkuperer 4- eller 5-posisjonen på fenylringen.
2. Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at Z blir valgt fra gruppen bestående av metyl eller metoksy.
3. Dioksetan ifølge krav 2, karakterisert ved at Z er klor eller metoksy ved 5-posisjonen.
4. Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at Z er klor.
5 . Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at Y<2> er hydrogen og Y<1> er klor.
6. Dioksetan ifølge krav 2, karakterisert ved at Z er klor og er i 4-posisjonen.
7. Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at Z er klor, Y<2> er hydrogen og Y<1> er klor.
8. Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at Z er metoksy i fem posisjonen, Y<2> er hydrogen og Y<1> er klor.
9. Dioksetan ifølge krav 5, krav 7 eller krav 8, karakterisert ved at X er en fosfatdel.
10. Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at R er Cl-4 alkyl.
11. Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at Y<2> er hydrogen, Y<1> er klor, Z er -OCH3 i 5-posisjonen, R er metyl og X er fosfat.
12. Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at Y<2> er hydrogen, Y<1> er klor, Z er klor i 5-posisjonen, R er metyl og X er fosfat.
13. Dioksetan ifølge krav 1, karakterisert ved at Y<2> er hydrogen, Y^ er klor, Z er klor i 4-posisjonen, R er metyl og X er fosfat.
14 . Kit for å utføre en analyse ved anvendelse av et kjemiluminescens dioksetan reportermolekyl, karakteri sert ved at det omfatter dioksetan ifølge krav 1 og et enzym med evne for spalting, i vandig oppløsning, del X til nevnte dioksetan.
15. Kit ifølge krav 14, karakterisert ved at det videre omfatter en forsterkningsforbindelse for å øke kjemiluminescens signalet oppnådd fra nevnte dioksetan ved spaltning av nevnte X del i den vandige oppløsningen.
16. Kit ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte analyse er en immunoanalyse, av nevnte enzym er kompleksbundet med et middel som kan bli bundet til en analyt, i det analysen blir utført for å detektere tilstedeværelse eller konsentrasjon derav.
17. Kit ifølge krav 14, karakterisert ved at nevtne analyse er en DNA probe analyse og nevnte kit videre omfatter en membran hvorpå nevnte analyse kan bli utført.
18. Kit ifølge krav 14, karakterisert ved at det videre omfatter en forsterkningsforbindelse for å øke kjemiluminescenssignalet oppnådd fra nevnte dioksetan ved spaltning av nevnte X del i vandig oppløsning.
19. Kit ifølge krav 17, karakterisert ved at nevnte enzym er kompleksbundet med et middel som igjen kan bli kompleksbundet med en analytt tilstede i en prøve, idet tilstedeværelsen eller konsentrasjonen av nevnte analytt er slik at analysen kan bli utført.
20. Kit ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte analyse er en DNA-sekvensanalyse-assay, og nevnte kit videre omfatter en membran hvorpå nevnte sekvensanalyse-assay kan bli utført.
21. Kit ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte kit videre omfatter en forsterkningsforbindelse for å øke kjemiluminescenssignalet oppnådd fra nevnte dioksetan ved spaltning av nevnte X del i vandig oppløsning.
22. Kit ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte enzym er kompleksbundet med et middel som muliggjør kobling av enzymet til DNA som skal bli sekvensert i nevnte analyse.
23. Fremgangsmåte for å detektere tilstedeværelse av et enzym i en prøve, karakterisert ved å kontakte nevnte prøve med et dioksetan ifølge krav 1 eller 14, og detektere frigjøring av lys forårsaket derved, idet nevnte enzym spalter nevnte enzym-labile gruppe X og hvor deteksjonen av lys som blir frigjort indikerer tilstedeværelse av nevnte enzym i en prøve.
24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte X-gruppe er fosfat og nevnte enzym er alkalisk fosfatase.
25 . Fremgangsmåte for å detektere et første medlem av et spesifikt bindingspar som har første og andre medlemmer, karakterisert ved å optisk detektere kjemiluminescens produsert ved omsetning av et dioksetan ifølge krav 1 eller 14 med et enzym som spalter nevnte enzym-labile gruppe X til nevnte dioksetan, hvor nevnte enzym er kompleksbundet med et andre medlem av nevnte spesifikke bindingspar.
26. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter en immunoanalyse.
27. Fremgangsmåte ifølge krav 25, karakterisert ved at nevnte fremgangsmåte omfatter en nukleinsyre-probeanalyse.
NO950065A 1993-05-07 1995-01-06 Kjemiluminiserende dioksetanderivater, analysekit og fremgangsmåte for deteksjon NO309143B1 (no)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/057,903 US5538847A (en) 1989-07-17 1993-05-07 Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US08/231,673 US5582980A (en) 1989-07-17 1994-04-25 Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
PCT/US1994/004555 WO1994026726A1 (en) 1993-05-07 1994-05-06 Improved chemiluminescent 1,2-dioxetanes

Publications (3)

Publication Number Publication Date
NO950065L NO950065L (no) 1995-01-06
NO950065D0 NO950065D0 (no) 1995-01-06
NO309143B1 true NO309143B1 (no) 2000-12-18

Family

ID=26737008

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO950065A NO309143B1 (no) 1993-05-07 1995-01-06 Kjemiluminiserende dioksetanderivater, analysekit og fremgangsmåte for deteksjon
NO20003485A NO20003485D0 (no) 1993-05-07 2000-07-06 Kjemiluminiserende dioksetanderivater samt fremgangsmÕte for deteksjon

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20003485A NO20003485D0 (no) 1993-05-07 2000-07-06 Kjemiluminiserende dioksetanderivater samt fremgangsmÕte for deteksjon

Country Status (11)

Country Link
US (3) US5582980A (no)
EP (3) EP1120422B1 (no)
JP (1) JP2837276B2 (no)
KR (1) KR0154209B1 (no)
AT (3) ATE205839T1 (no)
AU (2) AU676327B2 (no)
CA (1) CA2139348C (no)
DE (3) DE69428321T2 (no)
FI (1) FI950075A (no)
NO (2) NO309143B1 (no)
WO (1) WO1994026726A1 (no)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR8707399A (pt) 1986-07-24 1988-09-13 Quest Systems Inc Metodo de detectar uma substancia usando decomposicao enzimaticamente induzida de dioxetanos
USRE36536E (en) * 1986-07-24 2000-01-25 Tropix. Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US6022964A (en) 1989-07-17 2000-02-08 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5603868A (en) * 1992-10-30 1997-02-18 Abbott Laboratories Chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes
ATE215696T1 (de) * 1993-12-23 2002-04-15 Tropix Inc Chemilumineszenz-assay mittels energietransfer
US5631167A (en) * 1995-07-31 1997-05-20 Bayer Corporation Capsule chemistry analytical methods employing dioxetane chemiluminescence
US5721370A (en) * 1995-07-31 1998-02-24 Lumigen Inc. Water soluble tri-substituted 1,2-dioxetane compounds and assay compositions having increased storage stability
US5777135A (en) * 1995-07-31 1998-07-07 Lumigen, Inc. Di-substituted 1,2-dioxetane compounds having increased water solubility and assay compositions
WO1997014692A1 (en) * 1995-10-17 1997-04-24 Tropix, Inc. 1,2 chemiluminescent dioxetanes of improved performance
US5783381A (en) * 1995-10-19 1998-07-21 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5834456A (en) * 1996-02-23 1998-11-10 The Dow Chemical Company Polyazamacrocyclofluoromonoalkylphosphonic acids, and their complexes, for use as contrast agents
DE69834077T2 (de) * 1997-01-14 2006-08-24 Daicel Chemical Industries, Ltd., Sakai Nitrierungs- oder carboxylierungskatalysatoren
US6660529B2 (en) 1998-07-28 2003-12-09 Pe Corporation Heteroaryl substituted benzothiazole dioxetanes
JP4519320B2 (ja) 1998-07-28 2010-08-04 アプライド バイオシステムズ， エルエルシー ベンゾチアゾールジオキセタン類
US6555698B1 (en) * 1998-11-17 2003-04-29 Tropix, Inc. Chemiluminescent substrates for neuraminidase, assays for detection of neuraminidase and kits therefor
ATE441725T1 (de) * 1998-12-15 2009-09-15 Applera Corp Multienzym-nachweisverfahren
AU4342100A (en) * 1999-04-16 2000-11-02 Zymetx, Inc. Viral detection method using viral encoded enzymes and chemiluminescent substrates
US6893827B1 (en) * 2000-02-07 2005-05-17 Applera Corporation Receptor function assay for G-protein coupled receptors and orphan receptors by reporter enzyme mutant complementation
WO2002057745A2 (en) * 2001-01-08 2002-07-25 Tropix, Inc. Dendritic chemiluminescent substrates
US7368296B2 (en) * 2002-01-17 2008-05-06 Applied Biosystems Solid phases optimized for chemiluminescent detection
CA2515217A1 (en) * 2003-02-12 2004-08-26 Promega Corporation Methods and kits for dual enzymatic assays whereby light is quenched from luminescent reactions
US7390670B2 (en) 2003-02-20 2008-06-24 Lumigen, Inc. Signalling compounds and methods for detecting hydrogen peroxide
US20060079699A1 (en) * 2004-08-27 2006-04-13 Brooks Edwards Intermediate compounds and methods for synthesizing chemiluminescent dioxetane substrates
WO2006029302A2 (en) * 2004-09-09 2006-03-16 Applera Corporation Dioxetane-nanoparticle assemblies for energy transfer detection systems, methods of making the assemblies, and methods of using the assemblies in bioassays
US7451802B2 (en) * 2006-01-25 2008-11-18 Nabco Entrances, Inc. Slidable door assemblies with automatic pivot latching
JP2007225547A (ja) * 2006-02-27 2007-09-06 Fujifilm Corp 標的物質の疎水部位の検出方法
US20080248511A1 (en) * 2007-03-26 2008-10-09 Promega Corporation Methods to quench light from optical reactions
CN101462316A (zh) * 2007-12-19 2009-06-24 维斯塔斯风力***有限公司 预成型件的制备方法
EP2403843B1 (en) 2009-03-02 2018-11-07 Life Technologies Corporation Chemiluminescent compositions, methods, assays and kits for oxidative enzymes
EP2590958B1 (en) 2010-07-08 2015-08-26 Life Technologies Corporation In situ chemiluminescent substrates and assays
US20140154675A1 (en) * 2011-05-03 2014-06-05 Life Technologies Corporation Flash and Glow 1,2-Dioxetanes
CN103772433A (zh) * 2012-10-18 2014-05-07 深圳市美凯特科技有限公司 一种用于免疫分析的化学发光试剂amppd的合成方法
CN103073589A (zh) * 2012-12-30 2013-05-01 杭州师范大学 一种1,2-二氧环乙烷类化合物的合成方法
CN104557890A (zh) * 2015-01-12 2015-04-29 王国平 一种碳碳氧氧四元环化合物及其在质谱检测中的应用
DE102016119810A1 (de) * 2016-10-18 2018-04-19 Hamilton Bonaduz Ag Schichten zum Nachweis von Sauerstoff

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1521089A (en) * 1975-11-12 1978-08-09 Valeas Srl Aminoethanol derivatives
EP0134782A1 (en) * 1982-08-23 1985-03-27 The Australian National University Process for the preparation of 3-amino-5-hydroxybenzoic acids and derivatives and analogues thereof
US4983779A (en) * 1986-07-17 1991-01-08 The Board Of Governors Of Wayne State University Process for the preparation of vinyl ethers
US5616729A (en) * 1986-07-17 1997-04-01 Board Of Governors Of Wayne State University Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers
US5220005A (en) * 1986-07-24 1993-06-15 Tropix, Inc. Substituted adamantyl dioxetanes
US4956477A (en) * 1987-12-31 1990-09-11 Tropix, Inc. Synthesis of 1,2-dioxetanes
US4931223A (en) * 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US4978614A (en) * 1988-10-26 1990-12-18 Tropix, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US5112960A (en) * 1989-07-17 1992-05-12 Bronstein Irena Y Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
CA1340590C (en) * 1986-07-24 1999-06-08 John C. Voyta Chemiluminescence enhancement
US5330900A (en) * 1987-12-31 1994-07-19 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
US5538847A (en) * 1989-07-17 1996-07-23 Tropix, Inc. Chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US5089630A (en) * 1987-12-31 1992-02-18 Bronstein Irena Y Dioxetanes for use in assays
US4952707A (en) * 1988-06-30 1990-08-28 Tropix, Inc. Enzymatically-cleavable chemiluminescent fused polycyclic ring-containing 1,2-dioxetanes
US5132204A (en) * 1989-05-31 1992-07-21 Chiron Corporation Chemiluminescent double-triggered 1, 2-dioxetanes
US5326882A (en) * 1989-07-17 1994-07-05 Tropix, Inc. Chemiluminescent 3-(substituted Adamant-2'-Ylidene) 1,2-dioxetanes
CA2069957C (en) * 1990-08-30 2000-07-18 Irena Bronstein Chemiluminescent 3-(substituted adamant-2'-ylidene) 1,2-dioxetanes
US5336596A (en) * 1991-12-23 1994-08-09 Tropix, Inc. Membrane for chemiluminescent blotting applications
US5603868A (en) * 1992-10-30 1997-02-18 Abbott Laboratories Chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes

Also Published As

Publication number Publication date
DE69434814D1 (de) 2006-09-14
CA2139348A1 (en) 1994-11-24
NO20003485L (no) 1995-01-06
US5582980A (en) 1996-12-10
DE69428321T2 (de) 2002-07-04
AU676327B2 (en) 1997-03-06
ATE356822T1 (de) 2007-04-15
EP1120422A1 (en) 2001-08-01
NO20003485D0 (no) 2000-07-06
DE69434940D1 (de) 2007-04-26
ATE334996T1 (de) 2006-08-15
FI950075A0 (fi) 1995-01-05
EP1120423B1 (en) 2007-03-14
NO950065L (no) 1995-01-06
US5840919A (en) 1998-11-24
WO1994026726A1 (en) 1994-11-24
EP0649417A4 (en) 1995-02-27
AU6774194A (en) 1994-12-12
EP0649417A1 (en) 1995-04-26
NO950065D0 (no) 1995-01-06
AU2474997A (en) 1997-08-14
DE69434814T2 (de) 2007-03-29
FI950075A (fi) 1995-01-05
DE69434940T2 (de) 2007-11-29
AU695229B2 (en) 1998-08-06
ATE205839T1 (de) 2001-10-15
EP1120422B1 (en) 2006-08-02
US5851771A (en) 1998-12-22
EP0649417B1 (en) 2001-09-19
DE69428321D1 (de) 2001-10-25
JPH07509736A (ja) 1995-10-26
JP2837276B2 (ja) 1998-12-14
KR950702546A (ko) 1995-07-29
KR0154209B1 (en) 1998-11-16
EP1120423A1 (en) 2001-08-01
CA2139348C (en) 2004-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
NO309143B1 (no) Kjemiluminiserende dioksetanderivater, analysekit og fremgangsmåte for deteksjon
US6919463B2 (en) Signalling compounds for use in methods of detecting hydrogen peroxide
US6001659A (en) Assays using chemiluminescent electron-rich aryl-substituted 1,2-dioxetanes
JPH0789908A (ja) 二価陽イオン界面活性剤を使用する化学発光化合物からの増強された化学発光を与える方法および組成物
EP0736174A1 (en) Chemiluminescent energy transfer assays
NO302120B1 (no) Kjemisk luminescerende 3-(substituerte adamant 2&#39;-yliden)-1,2-dioksetaner
CA2231191A1 (en) Improved chemiluminescent 1,2-dioxetanes
AU704940B2 (en) Chemiluminescent energy transfer assays
EP0516948B1 (en) Chemiluminescent method and compositions
EP1131330B1 (en) Chemiluminescent substrates for neuraminidase, assays for detection of neuraminidase and kits therefor
JP2999810B2 (ja) １，２−ジオキセタン化合物

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees

Free format text: LAPSED IN NOVEMBER 2002