JPH04124186A - １，２−ジオキセタン化合物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｌ棗上色り里立野 本発明は化学発光性で酵素によって開裂し得る置換１，
２−ジオキセタンおよび試料中の物質を検出するための
その使用に関する。

災米■肢± ジオキセタンは、４員環を持ちその中の構成原子の２つ
は隣接する酸素原子である。ジオキセタンは熱的にまた
は光化学的に分解できカルボニル生成物、例えばエステ
ル、ケトンまたはアルデヒドを生成する。光の形（即ち
発光）でのエネルギーの放出がこの分解に伴われる。

一般に、本発明はその第１の態様において特異的結合対
の構成員（即ち、お互いに特異的に結合している２つの
物質）が光学的に検出可能な手段により検出される検定
法における改良を特色としている。その改良は式： を持つジオキセタンの酵素との反応を含んでおり、式中
Ｔは置換（即ち、１つまたはそれ以上のＣ，−Ｃ？アル
キル基または例えばカルボニル基のごときヘテロ原子基
を含んでいる）または非置換シクロアルキル環（環は６
から１２までの間の炭素原子を持つ）または多シクロア
ルキル基（２つまたはそれ以上の縮合環を持ち、各々の
環は独立して、５からＬ２までの間の炭素原子を持つ）
であり、４員ジオキサタン環にスピロ結合で結合してお
り；Ｙは蛍光発色団（即ち、Ｙはエネルギーを吸収して
励起（即ちより高いエネルギー）状態を形成することが
できる基であり、その状態からそれは光を放出してその
本来のエネルギー状態へ戻る；Ｘは水素、直鎖または分
枝鎖アルキル基（ｌから７までの間の炭素原子を持つ、
例えばメチル）、直鎖または分枝鎖ヘテロアルキル基（
１から７までの間の炭素原子を持つ、例えばメトキシ、
ヒドロキシエチルまたはヒドロキシプロピル）、アリー
ル基（少くとも１つの環を持つ、例えばフェニル）、ヘ
テロアリール基（少くとも１つの環を持つ、例えばビロ
ールまたはピラゾリル）、ヘテロアルキル基（環中２か
ら７までの間の炭素原子を持つ、例えばジオキサン）、
アラルキル基（少くとも１つの環を持つ、例えばベンジ
ル）、アルアリール基（少くとも１つの環を持つ、例え
ばトリル）または酵素で開裂し得る基、即ち、酵素によ
り開裂でき、ジオキサンに結合する電子に冨んだ部分を
得る結合を持つ基、例えばリン−酸素結合が酵素（例え
ば酸性ホスファターゼまたはアルカリ性ホスファターゼ
）により開裂可能でジオキセタンに結合した負に荷電し
た酸素を得るリン酸エステル；およびＺは水素、水酸基
または酵素で開裂し得る基（前に定義したとうり）であ
り、酵素が酵素で開裂し得る基を開裂し、ジオキセタン
に結合した負に荷電した置換基（例えば酸素アニオン）
を形成し、負に荷電した置換基がジオキセタンの分解を
起こし、蟇Ｙを含む発光物ｆｒ（即ち、光の形でエネル
ギーを放出する物質）を形成するように、ＸまたはＺの
少くとも１つは酵素で開裂し得る基であるように提供さ
れる。発光物質は最初の物質の存在の指標として検出さ
れる。発光の強度を測定することにより、最初の物質の
濃度が決定できる。

好適な実施態様においては、基Ｔ、ＸまたはＹの１つま
たはそれ以上に可溶化置換基、例えばカルボンａｆｔ基
；硫酸基またはその塩または四級アミノ塩が含まれ；ジ
オキセタンのｉＴは多シクロアルキル基（好適にはアダ
マンチル）であり；酵素で開裂し得る基はリン酸エステ
ルを含み；および酵素はホスファターゼを含んでいる。

本発明はまた試料中の最初の物質を検出するためのキッ
トを特色としている。

第２のｍ樟において、本発明は試料中の酵素を検出する
ための方法を特色としている。その方法は酵素と基Ｚが
検出される酵素により開裂できる前記ジオキセタンを接
触させることを含んでいる。

酵素が基Ｚを開裂し、ジオキセタンに結合する負に荷電
された置換基（例えば酸素アニオン）を形成させる。こ
の置換基はジオキセタンを不安定化し、それによりジオ
キセタンを分解し、ジオキセタンの基Ｙを含む発光物質
が形成される０発光物質は酵素存在の指標として検出さ
れる０発光強度の測定により酵素の濃度もまた決定でき
る。

本発明は試料中（例えば生物試料）の物質を検出する簡
単で非常に感度の高い方法を提供し、特に低濃度で存在
する物質に有用である。ジオキセタンの分解が発色団Ｙ
の励起エネルギー源として働くので、外部の励起エネル
ギー１ｌｌ（例えば光）を必要としない、さらに、ジオ
キセタン分子はすでに分解のために適当な酸化状態にあ
るので、外部からの酸化剤（例えば１１２０またはＯｘ
）の添加の必要がない。酵素−活性化分解は１つの酵素
分子が多くのジオキセタン分子の発光を起こさせるので
（それ故増幅効果を起こす）光感度である。さらに、放
射の波長（またはエネルギー）および発光の量子収率は
ジオキセタンのＹ置換基を選択することにより変えるこ
とができる（ここで使用した“量子収率７とは分解した
ジオキセタンのモル数当りの発光生成物から放射された
光子の数を意味している）、さらに、ジオキセタンのＴ
、ＸおよびＹ基を適当に改変することによりジオキセタ
ンの溶解度およびジオキセタン分解の速度論を変更でき
る。ジオキセタンはまた種々の分子（例えばタンパク質
またはハブテン）または固定化基質（例えばポリマー１
）に結合でき、またはホモボブマーまたはコポリマー中
の側基として含ませることもできる。

盪】 本発明は前記発明の要約で列挙した構造を持つジオキセ
タンを用いる。基Ｔの目的はジオキセタンを安定化させ
るためであり、即ち、酵素で開裂し得る基２が開裂する
前にジオキセタンが分解するのを防ぐためである。大き
な、かさ高い、立体障害のある分子（例えば融合多環式
分子）が最も有効な安定剤である。さらに、Ｔは好適に
はＣ−ＣおよびＣ−Ｈ−重結合のみを含んでいる。最も
好適な分子は３つの融合シクロヘキシル環から成るアダ
マンチル基である。アダマンチル基はジオキセタンの４
員環の部分にスピロ結合を通して結合されている。

基Ｙは酵素で開裂し得る基Ｚに結合している蛍光発色団
である。Ｙは酵素が基Ｚを開裂し、それにより電子が豊
富な部分を発生させ、それがジオキセタンを不安定化し
てジオキセタンの分解を起こした時に発光性となる。分
解は２つの別々のカルボニル化合物を生成し、その１つ
は、１５Ｔを含んでおり、他のものは基Ｘ、　Ｙおよび
Ｚを含んでおり；ジオキセタン分解により放出されるエ
ネルギーは後者の化合物のＹ基を発光性にする（もし基
Ｘが水素であればアルデヒドが生成される）。

発色団Ｙの励起状態エネルギー（即ち、光を放射するた
め発色団Ｙが持っていなければならないエネルギー）は
発光を基Ｙに制限するために基Ｔを含むケトンの励起状
態エネルギーより好適には低い。例えばＹがアダマンチ
ルである場合、発色団Ｙの励起状態エネルギーは好適に
はスピロマダマンタンの励起状態エネルギーよりも低い
。

任意の発色団Ｙが本発明に従って使用できる。

一般には、感度を高めるために量子収率を最大にする発
色団を使用するのが望まれる。

適した発色団として以下のものが挙げられる＝１）フェ
ニルおよびフェニル誘導体； ２）ナフタレンおよびナフタレン誘導体、例えば５−ジ
メチルアミノナフタレン−１−スルホン酸およびヒドロ
キシナフタレン； ３）アントラセンおよびアントラセン誘導体、例えば、
９．１０−ジフェニルアントラセン、９メチルアントラ
セン、９−アントラセンカルボキシアルデヒド、アント
リールアルコールおよび９フェニルアントラセン； ４）ローダミンおよびローダミン誘導体、例えはロード
ール、テトラメチルローダミン、テトラエチルローダミ
ン、ジフェニルジメチルローダミン、ジフェニルジエチ
ルローダミンおよびジナフチルローダミン； ５〕フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体、例え
ば５−ヨードアセトアミド　フルオレセイン、６−ヨー
ドアセトアミド　フルオレセインおよびフルオレセイン
−５−マレイミド；６）エオシンおよびエオシン誘導体
、例えばヒドロキシ　エオシン、エオシン−５−ヨード
アセトアミドおよびエオシン−５−マレイミド；７）ク
マリンおよびクマリン誘導体、例えば７−ジアルキルア
ミノ−４−メチルクマリン、４−ブロモメチル−７−メ
チルクマリンおよび４ブロモメチル−７−ヒドロキシク
マリン；８）エリスロシンおよびエリスロシン誘導体、
例えばヒドロキシエリスロシン、エリスロシン５−ヨー
ドアセトアミドおよびエリスロシン−５マレイミド； ９）アシリジンおよびアシリジン誘導体、例えばヒドロ
キシ　アシリジンおよび９−メチル　アシリジン； １０）ピレンおよびピレン誘導体、例えばＮ（１−ピレ
ン）ヨードアセトアミド、ヒドロキシピレンおよび１−
ピレンメチル　ヨードアセテート； １１）スチルベンおよびスチルベン誘導体、例えば６，
６′〜ジブロモスチルベンおよびヒドロキシスチルベン
； １２）ニトロベンズオキサンアゾールおよびニトロベン
ズオキサンアゾール誘導体、例えばヒドロキシニトロベ
ンズオキサンアゾール、４−クロロ７−二トロヘンズー
２−オキサ−１，３−ジアゾ−ル、２−（７−二］・ロ
ヘンズー２−オキサ−１゜３−ジアゾール−４−イル−
アミノ）ヘキサン酸：１３）キノリンおよびキノリン誘
導体、例えば６ヒドロキシキノリンおよび６−アミノキ
ノリン：１４）アクリジンおよびアクリジン誘導体、例
えばＮ−メチルアクリジンおよびＮ−フェニルアクリジ
ン； １５）　アシドアクリジンおよびアシドアクリジン誘導
体、例えば９−メチルアシドアクリジンおよびヒドロキ
シル９−メチルアシドアクリジン；１６）カルバゾール
およびカルバゾール誘導体、例えばＮ−メチルカルバゾ
ールおよびヒドロキシ−Ｎ−メチルカルバゾール； １７）蛍光性シアニン、例えばＤＣＭ（レーザ色素）、
ヒドロキシシアニン、１．６−ジフェニル−１，３，５
−ヘキサトリエン、１−（４−ジメチルアミノフェニル
）−６−フェニルヘキサトリエンおよび対応する１、３
−ブタジェン；１８）カルボシアニンおよびカルボシア
ニン誘導体、例えばフェニルカルボシアニンおよびヒド
ロキシカルボシアニン； １９）ピリジニウム塩、例えば４　（４−ジアルキルジ
アミノスチリール）Ｎ−メチルピリジニウムヨウ素酸塩
およびヒドロキシ−置換ピリジニウム塩； ２０）オキソノール・および ２１）レゾロフィンおよびヒドロキシ　レゾロフィン。

最も好適な発光団はヘンゼン、アントラセンまたはナフ
タレンのヒドロキシ誘導体であり；水酸基は基Ｚへの結
合を容易にする。

基Ｚは酵素で開裂し得る結合を通して発色団Ｙへ結合し
ている。適当な酵素との接触により酵素で開裂し得る結
合が開裂され、発色団Ｙへ結合する電子の豊富な部分が
形成され；この部分がジオキセタンの２つの個々のカル
ボニル化合物への分解（例えばもし基Ｘが水素であるな
らばケトンまたはエステルおよびアルデヒドへ）を開始
する。

電子の豊富な部分としては酸素、硫黄およびアミンまた
番よアミノアニオンが挙げられる。最も好適な部分は酸
素アニオンである。適したＺ基の例、およびこれらの群
の酵素特異性が下記の表１に与えてあり；矢印は酵素で
開裂し得る結合を示している。最も好適なＺ基はリン酸
エステル、特に酸素原子を通してフェニル発色団基Ｙへ
結合しているものであり、フェニル基は順にジオキセタ
ン環の４−炭素原子へ結合している。即ちニリン酸エス
テルはアルカリ性または酸性ホスファターゼ酵素により
開裂される。

表」 基１ 酵Ｊ、 ０゜ Ｊン酸エステル 酢酸エステル ゼ カルボキシル Ｑ ホスホ １．２−ジアシル グリセリド β Ｄ キジロンド ロ） ｌｈ Ｈ３ 聞 β−Ｄ フコシド ０ＨＩＣ チオ Ｄ−グルコシド １（、ＣＯＩ＋ υ■ β ガラクトシド α−Ｄ ガラクトシド Ｄ−グルコシド ８２ＣＯＩ＋ ｉｌ β−Ｄ−グルコシド １（、Ｃ０）Ｉ マンノシド β−Ｄ マンノシド β フ ラクトフラノシド β Ｄ−グリコシドウロネート Ｈ ■ Ｃ＝ＮＨ Ｈ２ ｐ４ルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンエステル Ｏ Ｈ Ｃ＝Ｎｌ！ ＨＫ ｐ−−トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニン　アミド 通したＸ基は前記発明の要約に記載されている。

好適にはＸは１つまたはそれ以上の可溶化置換基（即ち
、水溶液でのジオキセタンの溶解度を増加させる置換基
）を含んでいる。可溶化置換基の例としてはカルボン酸
またはカルボン酸塩基、例えばカルボキシメチルまたは
カルボキシエチル基（これらは最も良好である）；スル
ホン酸またはスルホン酸塩基、例えばオキシスルホニル
メチル；および４級アミノ塩、例えばトリアルキルアン
モニウム　プロミドが挙げられる。

好適には基２を開裂する酵素と検出される物質に特異的
親和力を持つ物質に共有結合で結合される。特異的親和
性物質の例としては抗体、例えば抗−ｈＣＧ；抗原、例
えばｈＣＧ、ここで検出される物質は抗体（例えば抗−
ｈＣＧ）である；検出される核＃（例えばＤＮＡまたは
ＲＮＡ）の全部または一部に結合できるプローブ；また
はＹＺ結合を開裂できる酵素が挙げられる。結合は好適
にはアミド結合を通してなされる。

企底 一般に、本発明のジオキサンはいくつかの方法により合
成できる。

そのような合成の１つでは式： （式中、Ｔ、ＹおよびＺは前に定義したとうり）を持つ
適当に置換されたオレフィンが最初に合成される。これ
は良く知られているマクマリ−反応〔例えばマクマリ−
ら、“オレフィンに対するカルボニルのチタン誘発還元
的カップリング、ム」■。

江聾、、」Ｌ　隘１７　（１９７８）、　ｐｐ、３２５
５−３２６６；　Ｊ、＾Ｉ。

Ｃｈｅｗ、　Ｓｏｃ　、　１ｊｌｉ　（１９８３）、　
ｐｐ１６６０−１６６１を参照のこと〕を用いて行われ
る。ケトン出発物質、Ｔ＝０が用いられる。この出発物
質において、出発物ＷＴは例えば、ジオキセタンの３−
（アダマンタ−２′−イリデン）置換基になるであろう
アダマンチル基であり得（その２′−炭素原子を通して
１．２ジオキセタンの３−炭素原子ヘスピロで結合する
場合）、またはジオキセタン環のアダマンチリデン部分
に結合する所望の置換基（例えばメトキシ基のごとき低
級アルコキシ基）または既知の技術により所望の置換基
へ変換可能な置換基になるであろう置換基を持つアダマ
ンチル基であり得る。

例えば、２−置換−４，５−ジフェニルオキサゾールは
： ・・・色素増環光酸化により容易に正体を表わすことが
できる潜在的カルボン酸誘導体源として働くことが知ら
れており、反応活性トリアミドを生成し、それは水性の
塩基性媒質中緩和な条件下でカルボン酸塩に加水分解で
きる；　−ａｓＳｅｒｍａｎ　ら、↑ｅｔｒａｈｅｄｒ
ｏｎ　　３ｉ（１９８１）、　ｐｐ、４０５９〜４０６
７を参照されたい。

５−カルボキシアダマンタン−２−オン［Ｌａｎｔｖｏ
ｅｖ、　Ｚｈ、　０ｂｓｈｃｈ、　Ｋｈｉｍ、、　１２
．２３６１〜２３６＆（１９７６）参照６また親カルボ
ン酸へ容易に加水分解できる５−カルボメトキシアダマ
ンタン−２−オンの同様な製造法のためＩｅ　Ｎｅｂｌ
ｅらの、Ｌ−立Ｉユ型」、、且１１０１−１１０３（１
９８３）も参照されたい〕または５−カルボキシメチル
アダマンクン−２オン（Ｍｉｕｒａら、Ｃｈｅｗ、　Ｐ
ｈａｓｅ、　Ｂｕｌｌ、、　３０　６７〜７３（１９８
２）参照）はそのベンゾインまたはジーｐメトキシベン
ゾインエステルを経て対応するジフェニルオキサゾール
へ変換される。オキサゾール基はマクマリ−反応後続い
てカルボン酸塩へ変換され、Ｚ−付加オレフィン中間体
が一重項酸素と反応して１．２−ジオキセタンを与える
のと同時にリン酸化される。

ケトン出発物質Ｔ＝０（例えば５−（２−（４゜５−ジ
フェニルオキサゾール−２−イル）メチル〕アダマンタ
ン〜２−オン）の２当量を１当量のアルキルエステルと
反応させる： Ｙ−Ｃ−ＯＡＩｋｙ＋ Ｚ 式中、Ｙは例えばフェニルであり、Ｚ′は前記の基Ｚで
あり、例えばその１つの酸素原子を通してフェニル基（
それは順に１，２−ジオキセタン環の４−炭素原子にな
るであろうものに供給されている）に結合されているリ
ン酸エステル基、または既知の技術により基Ｚへ変換可
能な基、例えばメトキシ基またはリン酸化可能な水酸基
であり、またアルキル基はメチルのごとき低級アルキル
基であろう。この反応は水素化アルミニウムリチウムに
対する三塩化チタンの比を標準的な２：１となし、好適
にはグライム、ジグライム、テトラヒドロフラン等々の
ごとき溶媒存在下、使用された三塩化チタンの各々のモ
ルに対し３当量のトリエチルアミンと一緒に、約６０°
Ｃから約９０℃の温度範囲で約１から約４時間加熱する
と起こり、続いて反応混合物は好適にはメタノールで反
応停止させ、無水条件下後処理される。

Ｚ′がリン酸化可能水酸基−置換発色団（例えばヒドロ
キンフェニル基）である場合、オレフィン形成反応に続
いて発色団の水酸基をリン酸化するのが望ましく、それ
は環状アシルホスフェートを用い、例えば： （２，２，２−）リフトキシ−４，５−ジメチル−１３
−ジオキサホスホレンとホスゲンを０°Ｃにて反応させ
、続いて１２０°にて２時間加熱することにより製造さ
れる）、次にこのトリエステルをピリジン（これはまた
溶媒として存在している）で脱メチル化して環状アシル
ホスフェートジエステルのＮ−メチルピリジニウム塩を
得ることにより達成される。この塩は同じピリジン溶液
に添加された前述のヒドロキシアリールエノールエステ
ルと反応させ、ヒドロキシアリールの３−ケト−３ブチ
ルオキシホスフエートジエステルをそのＮメチルピリジ
ニウム塩として得る。ジエステルは溶媒除去後、生成物
を室温で水性アセトニトリル炭酸ナトリウム緩衝液と撹
拌することにより、選択的にケトブチルオキシ基を失っ
てモノエステルへ容易に加水分解され［Ｒａｍ１ｒｅｓ
　らによる紅■ムＣｈｅｗ、　Ｉｎｔｎ’　１．　Ｅｄ
、、　１２．６ロー６７（１９７３）　、および参考文
献が含まれている、を参照されたい〕リン酸化発色団を
与える。

式： （式中、ＴＷｌ換置換水溶液中でのジオキセタンの溶解
度を増大させる可溶化置換基でありうる基または置換基
ｘ′、例えば膜、フィルム、ビーズ、ポリマーまたはポ
リマー化できる基への結合を容易にする置換基またはジ
オキセタン酵素的分解の反応速度を促進する置換基でさ
らに置換されている） の適切に置換されたオレフィンはＥｄｗａｄｓにより１
９８９年９月２２日に出願された米国特許出願第４，４
１１，３８７号（“′３８７出願”）、Ｅｄｗａｒｄｓ
らにより１９８９年９月６日に出願された米国特許出願
第２７９．１７６号じ′１７６出願“）、ＢｒｏｎｓＬ
ｅｉｎらによりこれと同時に出願された米国特許出■第
号（代理人覚え書第１８９／３００号）、およびＥｄｗ
ａｒｄｓ　らにより、これと同時にまた出願された米国
特許出願第　　　　　　号（代理人覚え書第１９１／２
８９号）、（すべての共通の譲渡証はこの出願と一緒に
）、に記載されているごとき方法によりまた合成される
。

特に、そのようなオレフィンは　′８４７出願に記載さ
れている方法に従って合成され、例示の目的で以下のご
とく図式的に示されている反応系列により合成でき、そ
の例においてはＴは置換アダマンチルまたはアダマンタ
−２′−イリデン（“Ａｄ″）であり、Ｘはメトキシで
あり、Ｙはフェニルであり、Ｚはホスホリルオキシおよ
びＺ′は前記の可溶化基または結合助長！＆（例えばカ
ルボン酸基）または分解速度促進基（例えばメトキシ基
）またはそのような蟇へ既知の方法で容易に変換可能な
基または置換基（例えばＩＱ、との反応および続いての
塩基性加水分解によりカルボン酸含有基へ変換し得る４
、５−ジフェニルオキサゾール−２−イルメトキシ基）
のうちの１つである。

ＰＯ３ ＋　　３Ｒ，ＯＨ ０・Ｃ−φ ＣＲ９＋　　ＣＨ３０１１ Ｘ′ Ｘ′ 前述の反応系列においてＲ５は低級アルキル基（Ｎえば
メチル、エチルまたは）゛チルトンを表わす。

Ｒ，はアセチル、プロピオニル、メンドリルまたはピバ
ロイルのごとき２から１４までの炭素原子を含むアシル
基を表わし、ａは例えばクロロまたはブロモのごときハ
ロゲンまたはＯＲ，を表わし、およびｈは独立して、金
属カチオン（例えばＮａ”またはに″）、プロトンまた
はアンモニウム、置換アンモニウム（Ｈｏ）ピリジニウ
ムまたは４級アンモニウムカチオンを表わす、　　’３
８７出願に記載されているごときチオレート開裂を上に
示した反応系列の工程５のＯＲ＊基の開裂のかわりに使
用できる（その場合Ｒ，は低級アルキルまたはアラルキ
ル基であろう、例えばメチルまたはベンジル）。

式： ％式％ で表わされる前記中間体は既知の化合物、またはこの分
野で認められている方法を用いて既知の出発物質から容
易に合成される。

しかしなから当業者には理解されるであろうごとく、Ｘ
′置換基は全反応系列の間開しである必要はなく、任意
の段階で他の構造的要件と一致するものへ反応により変
換されてもよい。例えば、５−メトキシアダマンクン−
２−オンはＭｅｉｊｅｒのヱ拉ｆｌ、グロニンゲン大学
、オランダ、１９８２に記載されているごとくして製造
される。この化合物は前記反応系列中の工程４のホーナ
ーエモンスカップリング反応に使用され、最終的に酵素
で開裂し得る、５−メトキシアダマンチリデン置換、シ
１−および並旦−１，２−ジオキセタンを与える。

５−ブロモアダマンクン−２−オン（Ｇｅｌｕｋ　ら、
丁ｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　　１４．５３６９（１９６８
）　）から出発すると、反応系列の工程５で生成される
エノールエーテル中間体（Ｘ’　−Ｂｒ）はアルコール
またはボンベ内の液体アンモニア中、高温および高圧で
容易に加溶媒分解を受ける。ブロモエノールエーテルフ
ェノールの一級、二級または三級アルコールとの反応速
度は、高温（１０５−１２０°）で炭酸カリウムのごと
きプロトン受容体の存在下でのみ認知できるようになる
。一般にこの反応は遅いが、きれいであり、エーテル形
成を容易にするのにしばしば用いられる銀または重金属
塩の使用を避けることができる。他のハロエノールエー
テル（Ｘ’　はクロロまたはヨードである）もまたこの
変換に使用できるが、Ｘ′がアルコキシ（例えばメトキ
シ）であるフェノール性エノールエーテルを得るために
必要とされる条件は各々の場合で変化する。この反応は
また、４．５−ジフェニル−２−ヒドロキシメチルオキ
サゾール（Ａｌｄｏｕｓら、Ｊ、Ｏｒ、Ｃ１０鳳、。

門、　ｐｐＨ５ｌ−１１５４（１，９６０）〕のごとき
ヘテロアリール置換アルコールにも応用できる。得られ
るアダマンタン環の５位が４．５−ジフェニルオキサゾ
ール−２−イルメトキシ基で置換されているエノールエ
ーテルは合成を通して維持され上に示したごとく最終工
程で開裂される。

ジオキセタン合成の第２の段階には上述のオレフィンの
ジオキセタンへの変換が含まれる。好適には、変換はオ
レフィンを一重項酸素（’Ｏりで処理することにより光
化学的に達成される。′０．は二重結合をはさんで付加
し、 下記のごとくジオキ セタンを形成する： 反応はハロゲン化溶媒（例えばメチレンクロリド）中、
冷却して（好適には約５０℃以下）実施する。

１０□は光増感剤を用いて発生される。光増感剤の例と
してはポリー結合ローズベンガル〔センシトックス（Ｓ
ｅｎｓｉｔｏｘ）　Ｉとして市販されていることが知ら
れており、ハイトロン　ラボラトリ−、ニュー　プラン
スヴイック、Ｎ、Ｊ、　　から入手可能である〕　（好
適である）およびメチレンブルー（よく知られた色素お
よびｐＨ指示薬）が挙げられる。

式： を持つジオキセタンの合成は以下のごとくである：式； を持つオレフィンをメチレンクロリドに溶解し、溶液は
ガラスパドルを備えた２−ｃｍ”パイレックス管に入れ
る：バドルは付属のガラスで閉じた棒状磁石で管から除
く。溶液を０℃へ冷却し、攪拌しなからｔｇのポリマー
−結合　ローズベンガルを添加する０反応管はＵｖ−カ
ットフィルター（コーニング３０６０　：　３６５ｎｍ
での透過＝０．５％）を付けた５００　Ｗタングステン
−ハロゲンランプ（ＧＥ　Ｑ５００　ＣＩ）からの光に
暴露しなから、攪拌溶液の表面上を酸素を通過させる。

オレフィンの消失および同時にジオキセタンの生成のモ
ニターに薄層クロマトグラフィー（ｔｉｃ）が使用され
る０反応完了後（ｔｉｅにより示されたら）溶媒を除去
しジオキセタンを単離する。

試料中の特定の物質の存在または濃度を決定するために
視覚的に検出可能な手段を使用する広範囲の種類の検定
法が存在する。前記ジオキセタンはこれらの検定に使用
できる。そのような検定の例としては抗体または抗原を
検出する免疫検定（例えばα−またはβ−ｈｃＧ）；酵
素検定；例えばカリウムまたはナトリウムイオンを検出
する化学検定；および例えばウィルス（例えば、ＨＴＬ
ＶＩＩまたはサイトメガロウィルス）または細菌（例え
ば大腸菌）を検出する核酸検定が挙げられる。常法（例
えばカルボジイミド結合）では特異的親和性物質に酵素
を結合させてきた；結合は好適にはアミド結合を通して
行われる。

一般に、検定は以下のごと〈実施される。検出し得る物
質を含むと疑われる試料を、検出し得る物質に対し特異
的親和性を持つ物質に結合された酵素を含む緩衝化溶液
を接触させる。得られる溶液は検出し得る物質が特異的
親和性−酵素化合物の特異的親和性部分へ結合されるよ
うにインキエヘートされる１次に過剰の特異的親和性−
酵素化合物を洗い流し、特異的親和性−酵素化合物の酵
素部分により開裂し得る基Ｚを持つジオキセタンを添加
する。酵素が基Ｚを開裂し、ジオキセタンの２つのカル
ボニル化合物（例えばエステルまたはケトン）への分解
を起こし；カルボニル化合物の１つに結合されている発
色団Ｙが励起され発光する０発光は試料中の検出し得る
物質の存在の指標として検出される（例えばキュベツト
またはカメラ発光計）０発光強度は物質の濃度を決定す
る為に測定される。

転出し得る物質が酵素である場合は、特異的親和性物質
は必要でない、実際、検出される酵素により開裂し得る
Ｚ基を持つジオキセタンが使用される。それ故、酵素の
ための検定では酵素含有試料にジオキセタンを添加し、
生じる発光を酵素の存在および濃度の指標として検出す
る。

特異的検定の例は以下のごとくである。

Ａ、見上上１旦捜足 ９６ウエルのマイクロタイタープレートをヒツジ抗−ヒ
］用ｇ　Ｇ　（Ｆ　（ａｂＬ断片断片性異性被覆する。

ヒトＩｇＧを含む血清試料をウェルに加え、ウェルは室
温にて１時間インキュベートする。

インキュベーソラン期間に続いて、血清試料をウェルか
ら除去し、ウェルを０．１５阿ＮａＣ／、０．０１とリ
ン酸および０．１％ウシ血清アルブミンを含む水性緩衝
液（ｐＨ７，４）で４回洗浄する。

各々のウェルへ抗−ヒトＩｇＧに結合されたアルカリ性
ホスファターゼを添加し、ウェルを１時間インキュベー
トする。次にウェルを前記緩衝化溶液で４回洗浄し、本
発明のリン酸−含有ジオキセタンの緩衝化溶液を添加す
る。ジオキセタンの酵素的分解により起こされた発光を
発光１中で検出するか、カメラ発光計中で写真フィルム
で検出する。

Ｂ、ｌ支足 ナイロン−メツシュ膜上にウサギ抗−α−ｈｃＧを吸着
させる。ｈｃｃを含む試料（例えば妊娠女性からの尿）
を膜を通して唆人させ、その後膜を０．１５Ｍ　ＷａＣ
Ｌ　０．０１Ｍ　リン酸および０．１％ウシ血清アルブ
ミンを含むｍ街化溶′ｆｉ、（ｐＨ７，４）の１ｄで洗
浄する。

アルカリ性ホスファターゼ標識抗β−ｈＣＧを膜へ加え
、膜は再び２１１ｄ！の前記緩衝化溶液で洗浄する。膜
を全光計のキュベツト中またはカメラ発光針内へ置き本
発明のリン酸−含有ジオキセタンと接触させる。ジオキ
セタンの酵素的分解から生じる発光を検出する。

Ｃ６アルカ　　ホスフ　　−ゼ ０．８Ｆ＋　　２−メチル−２−アミノプロパツールを
含む２．７ｄの水性緩衝化溶液を１２　Ｘ　７５ｍｍパ
イレックス試験管に入れ、アルカリ性ホスファターゼを
含む０．１−の血清試料を添加する。溶液は３０℃で平
衡化し、０．２　ａｄの本発明のリン酸含有ジオキセタ
ンを添加し、試験管は直ちに全光計へ入れ生じる発光を
記録する。光放射の水準はアルカリ性ホスファターゼ活
性の速度に比例するであろう。

Ｄ５　　　バイブ　　イゼーシッン サイトメガロウイルスを含むと疑われる脳を腿液（Ｃ３
Ｆ）の試料を集め膜（例えばナイロンまたはニトロセル
ロース膜）上に置く。試料は次に尿素またはグアニジニ
ウム　イソチオシアネートで化学的に処理して細胞膜お
よびウィルスＤＮＡを除くすべての細胞成分を破壊する
。そのようにして得られるウィルスＤＮＡの鎖を分離し
、ニトロセルロース　フィルターへ付着させる。ウィル
スＤＮＡへ特異的でアルカリ性ホスファターゼで標識さ
れたＤＮＡプローブをフィルターへ加える；プローブが
相補的ウィルスＤＮＡ鎖へハイブリダイズする。ハイブ
リダイゼーション後、フィルターを０．２Ｍ　ＮａＣＺ
および０．１１１Ｍ　　）リス−１ＩＣ！を含む水性緩
衝化溶液（ｐＨ・８．１０）で洗浄して過剰のプローブ
分子を除去する０本発明のリン酸−含有ジオキセタンを
添加し、ジオキセタンの酵素的分解により生じる発光を
発光１中で測定するかまたは写真フィルムで検出する。

Ｅ、ガークトシ゛−ゼ 前記検定および作業例において、α−またはβ−ガラク
トシダーゼで開裂し得るα−Ｄ−またはβ−Ｄ−ガラク
トシド（ガラクトピラノシド）基の各々を含むジオキセ
タンを添加でき、発色団から糖部分の酵素的開裂により
生しる発光を発光計で測定するかまたは写真フィルムで
検出する。

Ｆ、電気泳動 電気泳動によりタンパク質および核酸の複雑な混合物を
電場中でゲル支持体上でその分子の大きさおよび構造に
従って分離できる。この技術はタンパク分解後のタンパ
ク質の断片またかは制限エンドヌクレアーゼ切断（ＤＮ
Ａ配列決定のごとく）後の核酸の断片の分離にも応用で
きる。ゲル中での化学種の電気泳動的分離後またはゲル
から膜へ分離した化学種を移した後、結合はリガンドに
結合した酵素により証明される。例えば、ペプチド断片
はアルカリ性ホスファターゼに共有結合で結合された抗
体で証明される。ＤＮＡ配列決定における他の例ではア
ルカリ性ホスファターゼ−アジピンがビオチニル化ヌル
レオチド塩基へ結合される。その後、本発明のＡ、ＭＰ
ＰＤ１１ｆ似体がゲルまたは膜へ添加される。短いイン
キュベーションの後、ジオキセタンの酵素的活性化で発
光種が形成される結果として光が放射される。発光はＸ
−線またはインスタント写真フィルムで検出されるか、
または発光計でスキャンされる。多チヤンネル分析はさ
らに本方法を改良し、１つ以上の断片に対するプローブ
を同時に測定できるようになる。

Ｇ８口生秋！検定 固体状態検定においては、マトリックスに対する非特異
的結合を阻止するため、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
またはゼラチンのごとき非特異的タンパク質でも非特異
的結合部位を前処理するのが望まれる。ある種の市販の
ＢＳＡ調製試料は、ＡＭＰＰＤからの望ましくないパッ
クグラウンド化学発光を産み出すであろう少量のホスフ
ァターゼ活性を示す物質を含んでいることが決定された
。

しかしなから、ある種の水可溶性合成巨大分子物質がジ
オキセタンを用いる固体状態検定における非特異的結合
の有効な阻害剤である事もまた発見された。そのような
物質のうちで好適であるのは、ポリ　（ビニルベンジル
トリメチルアンモニウムクロリド）（ＴＭＱ）、ポリ〔
ビニルベンジル（ヘンシルジメチルアンモニウム　クロ
リド）〕（ＢＤＭＱ）またはポリ（ビニルベンジル（＋
−リブチルアンモニウム　クロリド）〕（ＴＢＱ）のご
とき水可溶性重合四級アンモニウム塩である。

Ｈ，ヌクレオチダーゼ 酵素ＡＴＰａｇｅのための検定は２つの工程で実施され
る。第１の工程では酵素はその至適ｐＨ（典型的にはｐ
Ｈ７，４＞で末端ホスホエステルを通して発色団−置換
ｌ、２−ジオキセタンに共有結合で結合されているＡＴ
Ｐからなる基質と反応し、ホスホリル−発色団−置換１
，２−ジオキセタンを生成する。第２の工程においては
、第１の工程の生成物を酸の添加によりｐＨを６以下（
好適にはｐ）１２４）に持っていくことにより分解し、
生しる発光を発光計で測定するかまたは写真フィルムで
検出する。類似の２工程法において、本発明の発色団−
置換１．２−ジオキセタンのＡＤＰ誘導体を基質として
用いてＡＰＰａｓｅが検定され、本発明の発色団−１換
１，２−ジオキセタンのアデニル酸誘導体を基質として
用いて５′−ヌクレオチダーゼが検定される。第２の工
程はまたホスホリル−発色団置換１，２−ジオキセタン
を分解するために酵素アルカリ性ホスファターゼを添加
することにより実施される。

■、抜敢■列訣淀 配列決定プロトコールで生しるＤＮＡまたはＲＮＡ断片
は電気泳動分離後本発明の化学発光性１２−ジオキセタ
ンを用いて検出できる。

ＤＮＡ配列決定はデジオキシ鎖終結法（Ｓａｎｇｅｒ。

Ｆ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　　（ＵＳＡ）、　７４　　：５４６３（１９７７）　
）により実施される。簡単にいうと、４つの配列決定反
応の各々に対し、−末鎖鋳型ＤＮＡがジデオキシヌクレ
オチドおよびビオチニル化ブライマー鎖ＤＮＡと混合さ
れる。アニーリング後、クレノー酵素およびデオキシア
デノシン三リン酸を４つの配列決定反応混合物の各々と
インキュベートし、次に追跡デオキシヌクレオチド三リ
ン酸を添加しインキュベーションを続ける。

続いて、反応混合物中のＤＮＡ断片をポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分離する６断片を膜
（好適にはナイロンＩＰＸ）に移し、Ｕ　Ｖ光（好適に
は短い波長の光）に暴露して断片を膜に架橋させる。

ポリマー（例えはヘパリン、カゼインまたは血清アルブ
ミン）で非特異的結合部位を阻止した後、股上のＤＮＡ
断片を本発明の特定の１．２−ジオキセタン基質の酵素
で開裂し得る基に特異的な酵素に共有結合で結合された
アビジンまたはストレプトアビジンと接触させる。アビ
ジンまたはストレプトアビジンはビオチンに宜欲に結合
するのでビオチニル化ＤＮＡ断片はここで酵素を添付さ
れたことになるであろう。例えば化学発光性基質がジソ
ジウム　３−（４−メトキシスピロ〔１，２−ジオキセ
タン−３，２’−（５’−メトキシ）トリシクロ（３，
３，ｌ、　１”　）デカン〕−４−イル）フェニル　ホ
スフェート（メトキシ−ＡＭＰＰＤ）の場合、アビジン
またはストレプトアビジンはホスファターゼに抱合され
るであろう。同様に、化学発光性基質がジソジウム３−
（４−メトキンスピロ〔１，２−ジオキセタン−３，２
’−（５’　−クロロ）トリンクロ（３，３，１，１”
°７〕デカン）　−４−イル）フェニルβ−Ｄ−ガラク
トピラノース（メ（−ギン−ＡＭＰＧＤ）の場合、アビ
ジンまたはス（・レブトアビジンはβ−ガラクトンダー
ゼに抱合されるであろう。

アルカリ性ｐＨ値（例えば約ｐＨ８，５以上）において
、ＤＮＡ断片−ビオチン−アビジン（またはストレプト
アビジン）−酵素の複合体と適当なＬ２ジオキセタンを
接触させて発光を発生させた後、ＤＮＡ断片は光感作フ
ィルム（例えばＸ−線またはインスタントフィルム）上
、または光電子発光計装置中で視覚化される。

上で概説した検出方法はＣｈｕｒｃｈらによるゲノムＤ
ＮＡ配列決定プロトコール（Ｃｈｕｒｃｈ、　Ｇ、　Ｍ
、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
　ＵＳＡ）、　８１　：１９９１（１９８４）〕にも応
用できる。化学的に切断し、電気泳動で分離したＤＮＡ
　ＩＭａｘａｍ、　Ａ、　Ｍ、ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
、Ａｃａｄ。

鉦辷」脹ｌ、　］　：　５６０（１９７７）　）を膜（
好適にはナイロンＷＩ）に移し、ＵＶ光により膜へはし
ご形を架橋し、特異的ＤＮＡ配列は：ハイブリダイゼー
ションプローブとしてビチオニル化オリゴヌクレオチド
；本発明の酵素で開裂し得る化学発光性１２−ジオキセ
タンに対し特異的な酵素に共有結合で結合されたアビジ
ンまたはストレプトアビジン：および、適当な１．２−
ジオキセタンを連続的に添加することにより検出される
。配列はしご形の像（ＰＡＧＥにより生しる）は上記の
ごとくして得られる。

配列はしご形の連続的再調査は最初に膜を界面活性剤の
加熱溶液（例えば約０．５から約５％のドデシル硫酸ナ
トリウム（ＳＤＳ）の水溶液を約８０°Ｃから９０℃で
）と接触させることにより膜からハイブリダイズしたプ
ローブおよび化学発光性物質を取り除き、約５０℃から
約７０℃に冷却し、今は裸のＤＮＡ断片を他のビオチニ
ル化オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ
て異った配列を発生させ、続いて前記のごとく画像化学
発光をつくり出すことにより達成される。

同様な視覚化法はＲＮＡ配列決定法により発生したＲＮ
Ａ断片にも応用できる。

他の実施態様も付随する特許請求の範囲に含まれている
。

例えば、酵素で開裂し得る基Ｚは基Ｙの代わりにジオキ
セタンの５ｘに結合されていてもよい。

特異的親和性物質は酵素の代わりに基Ｘ、ＹまたはＴ（
好適にはＸ）を通してジオキセタンに結合されていても
よい。この場合、特異的親和性物質が結合される基は結
合を容易にする為に例えばカルボン酸、アミノ、または
マレイミド置換基と伴に提供される。

ジオキセタンの基Ｘ、ＹまたはＴは重合化し得る基（例
えばビニル基）へ結合でき、それは重合化しホモポリマ
ーまたはコポリマーを形成できる。

ジオキセタンの基χ、ＹまたはＴは、免疫または核酸検
定に使用するために、例えば膜、フィルム、ビーズまた
はポリマーに結合できる。それらの基は結合を容易にす
る為に、例えばカルボン酸、アミノまたはマレイミド置
換基と共に提供される。

ジオキセタンの基Ｘ、ＹまたはＴは、ジオキセタン酵素
的分解の反応速度を促進する置換基を含むことができる
、例えば電子の豊富な部分（例えばメトキシ）。

ジオキセタンの基ＹおよびＴは基Ｘと同様に可溶化置換
基を含むことができる。

適切に置換されたジオキセタンは光化学的同様に化学的
にも合成できる。例えば、オレフィン中間体はオレフィ
ンをｌ（，０□およびジブロマンチン（１３３−ジブロ
モ−５，５−ジメチルヒダントイン）と反応させること
により１，２−ヒドロペルオキシドに変換できる。１，
２−ジブロモヒドロペルオキシドを塩基（例えば水酸化
ナトリウムのごときアルカリまたはアルカリ土類金属水
酸化物）または銀塩（例えば酢酸銀または酸化！りで処
理するとジオキセタンが生成する。

以下の実施例は本発明を詳細に例示するためのものであ
り、それらを制限するものととってはならず、本発明は
これらの実施例の変形および変化もその内容および特許
請求の範囲のわく内に包むつもりである。特に記さない
かぎりすべての割合およびパーセンテージは重量／容量
である（ただし、ＴＬＣ溶媒混合物は容量／容量である
）。

これらの実施例のいくつかにおいてエノールエーテル中
間体に与えられた“ＨＮＭＲデータは、芳香族プロトン
を示すためにプライム記号（′）を使用し、一方プライ
ムなしの番号はすべての場合置換アダマンタ−２′−イ
リデン環の位置を示している、それ故： ２．１ｇ（０，６ミリモル）の３−（メトキシ−５−フ
ロモトリシクロ（３，３，１，１，”’）デカ−２−イ
リデンメチル）フェニノールＣＢｒｏｎｓｔｅｉｎ　ら
により米国特許出願第　　　　　　号（代理人覚え書第
１８９／３００号）、（これと同時に出＠）に記載され
ているごとくして合成された〕の無水メタノール（１０
ｄ）　ｆ４液を、０．５ｇの無水炭酸カリウムと一緒に
ガラス試験管に入れ封入した。混合物は油浴中１１０”
Ｃ（１０５−１２０°Ｃの範囲）にて、１．５日加熱し
た。試験管の内容物をロータリーエバポレータにてｆＡ
縮し、残渣を飽和塩化ナトリウム水溶液および２０％酢
酸エチルを含むヘキサンに分配した。

有機分画を次に蒸発させると１．５６ｇ　（８６％収率
）の３−（メトキシ−５−メトキシトリシクロ〔３゜３
、　ｌ、　ｉ、３−’　３デカ−２−イルデシメチル）
フェノールを得た。シリカゲルによるカラムクロマトグ
ラフィーにより分析用試料を白色固形物として得た、ｍ
、　Ｐ、　１１４　１１５℃。

」」■（４００’ＦＩＦＩｚ、　ＣＤＣｌ　ｓ中：６７
．２（ＩＬ　ｄｄＪ＝７．７．７．６Ｈｚ、　Ｈ−５’
）、　６．８４（１８，ｄ、　Ｊ＝７．６Ｈｚ。

ＡｒＨ）、　６．７３−６．８８（２Ｈ，Ｌ　Ａｒｃ）
、　５．７６（ＩＨ，ｓ、　Ａｒ０Ｈ）、　３．４４（
１，Ｌ　ｂｒ、　ｓ、　Ｈ−１）、　３．２９（３Ｈ，
ｓ、　ＯＭｅ）３．２３（３Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ）、　２
．８２（１Ｂ、　ｂｒ、ｓ、　Ｈ−３）、　２．２４（
ＩＨ，ｂｒ、ｓ、　Ｈ−７）、　１．．５７−１．９５
（１０８ｍ）。

１施ｆｉｌｌ アルゴン下調整した０、５ｇ　（１，６６ミリモル）の
３（メトキシ−５−メトキシトリシクロ〔３，３１、１
，’・１〕デカ−２−イリデンメチル）フェノールのテ
トラヒドロフラン（５ｄ）ｉ液を０．３２ａｄ（２，３
３ミリモル）のトリエチルアミンと混合し、水浴中Ｏ℃
に冷却した。撹拌しなから、２−クロロ−２−オキソ−
１，３，２−ジオキサホスホラン（０，１８ｉｄ、２．
０ミリモル）を滴加した。５分後水浴を除き、室温で４
５分間ｌｊ！拌を続けた。反応混合１’ｌヲ２（ｌｄの
無水ジエチルエーテルで希釈し、水分を排除するためア
ルゴン下で濾過した。トリエチルアミン塩酸塩はさらに
１５ｄ！のジエチルエーテルで洗浄し炉液をロータリー
エバポレーターでｆＡ縮するとリン酸トリエステルを粘
稠な淡い橙色の油状物として得た。

アルゴン下、モルキュラーシーブで乾燥した６ｄのジメ
チルホルムアミドに熔解したトリエステルに９８ｍｇ（
２，０ミリモル）の乾燥シアン化ナトリウムを撹拌しな
から１度に加え、室温で３．５時間反応させた。真空下
（１，０ｍ＋ｉＨｇ）　、５０℃に加熱しなから溶媒を
除去した。生しる橙色−褐色残渣の試料を水に溶解し、
ＰＬＲＰポリスチレン　カラム（ポリマー　ラボラトリ
ーズ）を用いて逆相分析用クロマトグラフィー〔０，１
％炭酸す１−リウム（水）−アセトニトリル勾配溶出］
を行うと、中間体シアノエチル　ホスフェート　ジエス
テルナトリウム塩への反応が完了していることが証明さ
れた。

残渣は次に５ｄのメタノールに溶解し、０．４　ｄのナ
トリウムメトキシドの４．３７Ｍメタノール溶液（１，
６６ミリモル）を滴加し、室温で３０分間撹拌した。逆
相分析ＨＰＬＣはリン酸モノエステルへのβ−説離は完
了していることを示した。溶媒を除去し、残渣を５％水
／アセトンで摩砕するとゴム状の固形物を与えた。２％
水水子アセトン更に摩砕すると固い灰色がかった白色の
固形物を得、それを洲遇し真空下（１，、ＯｓｍＨｇ）
乾燥させると無機塩が混入した０、６２ｇの粗３−（メ
トキシ−５−メトキシトリシクロ（３，３，ｌ、　１．
”“７〕デカ−２−イリデンメチル）フェニル　リン酸
二ナトリウムを得た。

ＰＬＲＰポリスチレン　カラム（ポリマー　ラボラトリ
ーズ）上０．１％ＮａＨＣＯｘ−水−アセトニトリル勾
配溶出による逆相分取ＨＰＬＣおよび適切な分画の凍結
乾燥により０．５ｇ　（７１％）の精製された化合物を
白色の顆粒状固形物として得た。

■」朋　（４００門Ｈｚ、　Ｄ、、０中：　δ７．＋６
（ＩＩＬ　　ｔ、　Ｊ−７，８Ｈｚ、　Ｈ−５’）、　
７．０５（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝８．１Ｈｚ、　　Ａｒ旧６
．９３（］、ＩＨｂｒ、ｓ、、　Ｈ−２’）、　６．８
５（ＩＨ，ｄ、　Ｊ、＝７．ＩＨｚＡｒＨ）、　３．１
９（４８，ｓ、　ＯＭｅ　ａｎｄ　Ｈ−１）、　３．０
６（３Ｈ，ｓＯＭｅ）、　２．６５（ＩＨ，ｂｒ、　ｓ
、、　Ｉ（−３）、　２．１（ＬＨ，ｂｒ、　ｓ。

＋１−７）、　１．２９−１．９３（１０８，■）。

災施旌１ ０．５２７ｇ　（１，２５ミリモル）の３−（メトキシ
−５＝メトキシトリシクロ（３，３，１，１，’°７〕
デカ＝２−イリデンメチル）フェニル　リン酸二ナトリ
ウム塩の２０％無水メタノール−クロロホルム（５，３
Ｘｌ０−’Ｍメチレンブルー増悪色素を含む）（４７ｄ
）溶液を試験管に入れ水浴で５℃に冷却し溶液を通して
酸素ガスを通過させ酸素を飽和させる。溶液を通しての
酸素バブリングを続ける一方、冷却２５０ワツト高圧ナ
トリウムランプからの光で試験管を照射し、その間温度
は５℃に維持する。

５ミルの厚いカプトンポリイミドフィルム（デュポン）
をナトリウム蒸気ランプと試験管の間に置き、望ましく
ないＵＶ照射を戸先して除く。１０分後、等量のメチレ
ンブルーを添加し、照射をさらに１５分間続けた。

ＰＬＲＰポリスチレン　カラム（ポリマーラボラトリー
ズ）上水−アセトニトリル勾配溶出を用いる分析Ｆ（Ｐ
ＬＣは２つの生成物ピークを示した：早く溶出するピー
ク（保持時間＝５．９５分）および遅く溶出するピーク
（保持時間−６，４５分ン、早（溶出する生成物（Ａ）
と遅く溶出する生成物（Ｂ）の面積パーセント比は１．
７：１であった。

水浴上ロータリーエバポレーターで溶媒を除去し、残渣
を炭酸水素ナトリウム（２００ｍｇ）を含む水（６０ｍ
）に溶解し、０．４５ミクロンのナイロン膜を通して炉
通した。逆相分取ＨＰＬＣ（水−アセトニトリル勾配溶
出）により２つの生成物が分離された。適切な分画が合
併され、分析用ＨＰＬＣにより本質的に均一であること
が示された。凍結乾燥により０．１９１ｇの生成物Ａお
よび０．１１２ｇの生成物Ｂを微かに黄色の顆粒状固形
物として得た。

ＨＮＭＲにより生成物は異性体の２之およびＬＺ上−３
−（４−メトキシスピロ−〔ｌ、２−ジオキセタン−３
，２’−（５’−メトキシ）トリシクロ〔３，３１、１
，’”？］デカン〕−４−イル）フェニル　リン酸二ナ
トリウムであることが確認された。各々の異性体はｐＨ
ｌｏにてアルカリ性ホスファターゼによる酵素的脱リン
酸化により化学発光を生じ、独特の光灯時間のプロフィ
ールを示し、劇的に雑音レベルが減少しでいた。

’ＨＮＭＲ（４００ＭＨ２，Ｄ！０．　Ａ異性体）：６
６．９８−７．４１（４Ｈ，ＩＩ、　Ａｒ）Ｉ）、　３
．０８（３Ｈ，Ｓ、　ＯＭｅ）、　３．０１（３８，ｓ
ＯＭｅ）、　２．９７（１［（、ｂｒ、ｓ、　Ｈ４）、
　２．３４（ＩＨ，ｂｒ、５Ｈ−３）、　１．８（ＩＨ
，ｂｒ、ｓ、　Ｈ−７）、　１．３６−１．６５（８Ｈ
，ｍ）。

０．９９（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝１３．２Ｈｚ）、　０．７
８（ＬＨ，ｄ、　Ｊ＝１３．１Ｈｚ）。

’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、　ＤｚＯ，Ｂ異性体）：　
δ６．９７−７．４２＜４Ｈ，Ｌ　Ａｒｈ）、　３．０
９（３Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ）、　２．９５（ＩＨ，ｂｒ。

ｓ　　Ｈ−１）、　２．９３（３Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ）、
　２．３２（１０，ｂｒ、５Ｈ−３）、　１．．８８（
ＩＨ，ｂｒ、ｓ、　Ｈ−７）、　１．２４−１．７３（
８Ｈ，ｍ）１．０９（ＩＩＩ、ｄＬ、　　Ｊ＝１２．４
．　３．２Ｈ２）、　　０．８３（Ｉｌ、　　ｄＪ＝１
２．２Ｈ２）。

実】ｌ辻Ｍ ＡＭＰＰＤおよび対応するメトキシ　アダマンタ−２’
−１，２−ジオキセクンイリデン（ＡおよびＢ異性体）
からの全発光放射の比較はこれらの化合物の各々におけ
る全脱リン酸化実験を実施することによりなされた。

１．２−ジオキセタンの０．０５？ｌ炭酸ナトリウム／
炭酸水素ナトリウム水ｆｉｊＷｉ、　（１１１Ｍの塩化
マグネシウムを含む）（４，０ｍＭ）を調製し、３０“
Ｃで平衡化した。

１０μｌの７．６４　Ｘ　ＩＯＨのアルカリ性ホスファ
ターゼ（コウシ腸；ハイオザイム）の水溶液を加え、得
られる溶液からの化学発光をターナ−モデル２０Ｅ発光
計〔ターナーインスッルメンツ　Ｃｏ、；サニベイル、
カリホルニア）を用いて記録した。

問題としているこれらの化合物の各々に対する化学発光
減衰の速度が分当りの相対釣元単位（ＲＬＵ）で表現さ
れ、下記の表に与えである６表−一上 ＡＭＰＰ［］ ０．１ ０．３ ０．８ （Ａ異性体） これらの全発光放射は回として第１．２および３図に示
されている。

実五貫ｙ− １，０１ｇ（２，８９ミリモル）の３−（メトキシ−５
ブロモトリシクロ［３，３，Ｌ　１．”°７〕デカー２
イリデンメチル）フェノールの無水エタノール（６−〕
溶液を０．１９ｇの無水炭酸カリウムと一緒に試験管に
入れ封入し、油浴上１１０°Ｃ（１０５−１２０°Ｃの
範囲）にて３６時間加熱した。管の内容物をロータリー
エバポレーターにて濃縮し、生じる残渣は飽和塩化すｌ
−ＩＪウム水溶液および２０％酢酸エチル含をヘキサン
に分配した。を機分画を蒸発させると０．１．９ｇ　（
９９％収率）の３−〔メトキシ−５−エトキントリシク
ロ［３，３，１，ｌ、３°７〕デカ−２イリデンメチル
）フェノールを淡黄色ゴム状物として得た。シリカゲル
上、ヘンゼンからｌＯ％酢酸エチル含有ヘンゼンへの勾
配溶出を用いるカラムクロマトグラフィーを行うと、分
析用試料を粘性のあるゴム状物として得た。

’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、　ＣＤＣｊ２　ｘ中）：δ
７．１９（ＩＬ　ｔＪ＝７．６Ｈｚ、　Ｌ５’）、　６
．８３（ＬＨ，ｄ、　Ｊ＝７．６Ｈｚ）、　６．７３６
．８（２８，ｍ、　Ａｒｆｌ）、　５．７６（ＩＨ，ｓ
、　Ａｒ０Ｈ）、　３．４７（２ｔｌｑ、　Ｊ＝７Ｈｚ
、　０ＣＨｚＣＨｓ）、　　３．４２（１８，ｂｒ、ｓ
　　Ｈ−１）３．２８（３１１，Ｓ＋　ＯＭｅ）、　２
．８　（ＩＨ，ｂｒ、ｓ、　Ｌ３）、　２．２２（ＬＨ
，ｂｒ、ｓ、　Ｈ−７）、　１．５７−１．９３（１，
ＯＨ，ｍ）、　１．１５（３Ｌｔ、　Ｊ＝７Ｈｚ、　　
０ＣＨ１ＣＪＩＬ：＋）。

ＩＲ（ＣＨＣｌ　ｘ中）：　３５８４．３３３０（ＯＨ
）、　２９１８゜２８２４、１６６０．１５８６．１５
７５．１４４８．１２９４．１１６８゜ＬＯ９０，８８
４ｃｗｈ−’ 尖隻班豆 実施例Ｖの加溶媒分解をエタノール以外の多数のアルコ
ールを溶媒として使用して繰り返した。

反応速度は反応基質の濃度、反応温度、用いられたアル
コールの構造、使用された特定のアルコールへの炭酸カ
リウムの溶解度に依存するので反応時間は選択されたア
ルコールにまた依存して変化した。一般に、２−メトキ
シエターノルとの反応では反応混合物が速かに均質にな
るという事実のためただの６から８時間が必要とされ、
一方ｎブタノールとの反応には７２時間が必要とされた
。

イソプロパツールおよび皿−ブタノールのごとき立体障
害のあるアルコールは反応完了に油浴中１１０°Ｃでの
加熱を１週間必要とした。得られた生成物のスペクトル
データは下記のごとくである。

３−（メトキシ−５−（２−メトキシ）エトキシ　トリ
シクロ［３，３，１，１，，３＝’）デカ−２−イーン
メチル　フェノール： ’ＨＮＭＲ（４００ＭＨｚ、　ＣＤＣｌｚ中）：　６７
．１８（１［１ｔ　　Ｊ＝”１．６Ｈｚ、　［（−５’
）、　６．８２（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝７．６Ｈｚ、　Ａｒ
ｃ）６．７３−６．７９（２８，園、　　ＡｒＨ）、　
　５．６６（Ｉｔ（、ｓ、　　Ａｒ０Ｈ）。

３．５６（２Ｈ，ｍ、　　０ＣＨｚＣＨｚＯＣＩ（ｔ）
、　　３．５（２Ｂ、　　ｍ、　　０ＣＨｉＣＬＯＣＨ
３）、　３．４２（ＩＨ，ｂｒ、ｓ、　Ｈ−１）、　３
．３５（３Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ）３．２７（３）ｆ、　　
ｓ、　　ＯＭｅ）、　　２．７９（１１１，ｂｒ、ｓ、
　　Ｌ３）、　　２．２２（Ｉｔ（、ｂｒ、ｓ、　Ｉｆ
−７）、　　１．５５１．．９２（１０Ｂ、　ＩＩ’）
。

ＩＲ（ＣＩＩＣｆ３中）：　３５８３．　３３１ｏ（Ｏ
Ｈ）、　　２９２０．　２８４４１．６６５．　１５８
８．　１５７６、　　＋４４３．　１２９４．　１０９
２．　１０７１３．　８８４Ｃ■ ３−（メトキン−５−ブトキシドリンクロ〔３３、ｌ、
　１．、”“７〕デカ−２−イリデンメチル）フェノー
ル： ’ＨＮＭＲ（４００Ｍ）＋２．　ＣＤＣｌ！　ｚ中）：
　δ１．２（ＩＨ，ｔＪ＝７．８Ｈｚ、　　ｆｌ−５’
）、　　６．８４（１）１．　　ｄ、　　Ｊ＝７．８Ｈ
ｚ、　　ＡｒＨ）。

６．７４−６．８（２Ｈ，ｍ、　　Ａｒｃ）、　　５．
４１（ＩＨ，ｓ、　　Ａｒ０Ｈ）、　　３．４２（ＩＨ
，ｂｒ、ｓ、　　Ｈ−１）、　　３．３９（２Ｈ，ｔ、
　　Ｊ□６．８Ｈｚ、　０（ＪＩｚＣＨｚＣＩＩｚＣｌ
ｈ）、　　３．２８（１８，ｓ、　　ＯＭｅ）、　　２
．８（１）１．　　ｂｒ、ｓ、　　Ｈ−３）２．２２（
ＩＨ，ｂｒ、ｓ、Ｈ−７）、１．５８−２．０５（］、
ＯＨ，−）　　１．４９（２Ｌ　　ｔ、　　０Ｃ１（ｚ
ＣＨｚＣＨｉＣＨｉ）、　１．３３（２Ｈ，−、０ＣＨ
ｚＣＨｔＣＨｚＣＨｖ）、　　０．８８（３Ｈ，ｔ、　
　Ｊ＝７．３Ｈ２，０ＣＨｚＣＨｚＣＨｚ）。

ＩＲ（ＣＨＩｌ、中）＝３５８４．３３１０（０１（）
、　２９２４．２８４５１６６４、１５８８．１５７６
、１４４２．１２９５．１０９２．１０８０　８８２ｃ
ｍ　’ ３−（メトキシ−５−イソプロポキシトリシクロ（３，
３，１，１，’＝’）デカ−２−イリデンメチル　フェ
ノール： 」」廿（４００Ｍ）Ｉｚ、　ＣＤＣｆ；！　ｓ中）、　
δ７．１．９（ＩＬ　　ｔＪ＝７．７Ｈｚ、　　Ｎ−５
’）、　　６．７４−６．８８（３Ｈ，ｌ　　ＡｒＨ）
、　　５．８２（Ｉ）ｌ、　ｓ、　Ａｒ０Ｈ）、　３．
９５（ＩＨ，ヘプチット、　Ｊ、６．１Ｈｚ）３．４１
（］、Ｈ，ｂｒ、ｓ、　　Ｈ−１）、　　３．２７（３
Ｌ　　ｓ、　　ＯＭｅ）、　　２．８１（Ｅ、　ｂｒ、
ｓ、　Ｈ−３）、　２．２２（ＩＩｌ、　ｂｒ、ｓ、　
Ｈ−７）、　１．５７１．９３（１０）Ｉ、　　ｍ）＋
　　１．１（６Ｈ，ｄ、　　Ｊ−６，１Ｈｚ、　　０Ｃ
Ｉ（（ＣＨｌ）ｚ）。

■（ＣＩＩＣｌ　ｓ中）；　３５８３．３３１０（０１
１）、　２９２２．２８４３１６６３、１，５８８．１
５７５．１４３８．１２９５．１１７０．１０９１０９
Ｏ９９０’ ３−（メトキシ−５−ｔ−ブトキシトリシクロ［３，３
，１，１，！・）〕デカ−２−イリデンメチル）フェノ
ール： ’ＨＮＭＲ（４００Ｍ！Ｉｚ、　　ＣＤＣｌ　ｓ　中）
二　　δ７．１９（１）１．　　ｔ。

Ｊ＝７．８Ｈｚ、　　Ｂ−５’）、　　６．８４（ＩＨ
，ｄ、　　Ｊ＝６．８Ｈｚ、　　ＡｒＨ）。

６．７３−６．８（２Ｈ，ｍ、　Ａｒｃ）、　５．１８
（ＩＬ　ｓ、　Ａｒ０Ｈ）、　３．３７（ｌｔｌ、　ｂ
ｒ、ｓ、　Ｉ（−１）、　３．２８（３）［、ｓ、　Ｏ
Ｍｅ）、　２．７６（ＩＬｂｒ、　ｓ、　Ｈ−３）、　
２．１８（ＩＨ，ｂｒ、ｓ、　Ｈ−７）、　１．５６−
２．０５（１０ｆ１．　　ｓ＋）、　　１．２７（９８
，ｓ、　　Ｃ（Ｃ几、）。

」尺−（ＣＩＩＣＥ　、中）＋　３５８３．３３１０（
ＯＨ）、　２９２２２８４３、　１６６５．　１５８７
．　１５７６、　１４３８．　１３５８．　１１８０１
０９０　　１．０Ｂ０．　９８０ｃｍ実施１１ ρＢ１１３２２プラスミド（４７００ｂｐ）をトランス
−ライトキット（トロビソクスＩｎｃ、　、ヘッドフォ
ード　マサチューセン゛ン）を用いてニック］・ランス
レージョン過程にかけ、２００−２０００ｂｐの長さの
ビオチニル化−末鎖ポリヌクレオチドの混合物を発生さ
せた。

この混合物は乾燥バイオダインＡ膜上へ下記の濃度の点
の３つの平行なカラムとして点で咬着させる： ２０．０００ １０．０００ ｓ、ｏｏ。

２．５ＱＯ １，２５０ ０，６２５ ０，３１３ ８０，１５６ ９０，０７８ １，００，０３９ １１対照 Ｌノ　−末鎖　　ＤＮＡ、　　　ｌｎｇ膜を３分間紫外
光照射（ＵＶＰミネラルライト）してＤＮＡを膜に固定
した後風乾した。次に、膜を０．２％カゼイン１０．１
％ツイーン２０界面活性剤を含むＰＢＳで１時間ブロッ
クし、続いて０．２％カゼインを含むＰＢＳに溶解した
１　１５０００希釈アビジン−アルカリ性ホスファター
ゼ複合体（トロピックス　Ｉｎｃ）を添加した。膜は３
０分間インキュベートし、０．２％カゼイン１０．１　
％ツイーン２０界面活性剤を含むＰＢＳで３回洗浄しく
各々５分間）、１■Ｈ塩化マグネシウムおよび０．０２
％アジ化ナトリウムを含む０．１Ｍジェタノールアミン
水溶液、ｐｌ＋１０．０　（基質緩衝液）中で５分間１
度洗浄した。

次にドラ）２−５の列の３つのカラムを別々に膜から切
り出しく“ストリツプ１−３″）、ドツト６−１１の列
の４つのカラムも同様にする（“ストリンブ４−７）。

ストリップｌ−３を基質緩衝液で３０分間洗浄した。ス
トリップ４−７は０，１％ＢＤＭＱを含む基質緩衝液で
３０分間ブロックした。

両方の組のストリップは続いて基ｘｉ衝液液中５分間イ
ンキユヘートした後下記に示したごと（１２−ジオキセ
タンの水溶液（０，２５ｍＭ）中で５分間別々にインキ
ユヘートされた： １１１１１１号　　　　１，２−ジオキセ　ンＩ　　　
　　　Ａ、ＭＰＰＤ ２　　　　　メトキシアダマンタ−２′−イリデン（Ａ
異性体） ３　　　　　メトキシアダマンタ−２′イリデン（Ｂ異
性体） ４　　　　　　　　　ＡＭＰＰＤ イリデン（Ｂ異性体） ７　　　　　対照 すべてのストリップをカメラ発光計中に置きポラロイド
　タイプ６１２インスタント白黒フイルムを露光させた
。改良された発光強度はＡＭＰＰＤ自身と比べると３−
（’Ｉｔ換アダマンタ−２′−イリデン）１．２−ジオ
キセタンを用いると得られ、下記の表■に示された結果
を比較することによりわかる。

実１ＭＪ ハイブリチク　タンデム−Ｅ　　ＴＳＨキット（ハイブ
リチク　Ｉｎｃ、、　サンジエゴ、カリホルニア）を用
い、キットに含まれている製造元による指示に従って（
ただし抗−Ｔ　Ｓ　Ｈ−アルカリ性ホスファターゼ複合
体インキュヘーンヨン工程および洗浄後、プラスチンク
ビーズをさらに０．１Ｍジェタノールアミン、１ｍＭ塩
化マグネシウム、０．０２％アジ化アトリウム緩衝液、
ｐ旧０．０で洗浄し、同じ緩衝液の２００ｐｌ中に少し
貯蔵する）一連のＴＳＨ標準品に対しＴＳＨの免疫検定
を実施した。

ビーズの表面に結合している抗−ＴＳＨ−アルカリ性ホ
スファターゼ複合体からの化学発光信号はビーズを含む
試験管に各々ジナトリウム３（２′−スピロアダマンタ
ン）−４−メトキシ−４−（３’−ホスホリルオキシ）
フェニル−１，２−ジオキセタン（“ＡＭＰＰＤ″Ｌ３
−（４−メトキシスピロ−〔１，２−ジオキセタン−３
，２’−（５’−メトキシ）トリシクロ［３，３，１，
１，”’］デカン〕−４−イル）フェニルリン酸二ナト
リウム（Ａ異性体；　“Ａ−ＣＨ３０−ＡＭＰＰＤ”）
および対応するジソジウムＢ−巽性体（“Ｂ　−ＣＨ。

０−ＡＭＰＰＤ”）を０．１１ジエタノーＪレアミン、
１ｍＭ塩化マグネシウム０，０２％アジ化ナトリウム、
ｐＨ１，０，０ニ含ム３０（Ｊｔｔｌ　（７）０．６７
５Ｍ１ｌ街１ｆＩＲＨ’Ｅ　ｔ　ｊＭｆ　することによ
り出始めた。光放射の強度は基質添加後ベルトールドＬ
Ｂ９５２Ｔ発光計（ヘルトールトインスツルメント、ヴ
イルドハソド、ドイツ連邦共和国）を用いて、室温で５
秒間の積算として（１１２５°Ｃ）、基質添加後７．１
３．１９．２５．３１．４０５０および６０分に続けて
記録された。

ＡＭＰＰＤ、Ａ−ＣＨ，Ｏ−ＡＭＰＰＤおよびＢ−Ｃ）
（，０−ＡＭＰＰＤの互いに対するＴＳＨ。

ＲＬｔＪ対ＴＳＨは第４．５および６図に各々示されて
いる。

夫施猷 スナップ＠（Ｓｎａｐ＠）ブローブハイプリダイゼーシ
ゴン検定（Ｅ、　１．　　デュポン　ドウ　ヌムールア
ンドＣｏ、）による単純ヘルペスウィルスｒＤＮＡ中の
アルカリ性ボスファターゼ量の検出におけるＡ　Ｍ　Ｐ
　Ｐ　ｌ）および５’　−Ａ−メトキシ類（２体の感度
は下記の方法により比較された。

コール 単にベルベスウィルスＩ　　ＤＮＡに対する５ＮＡＰ＠
　　ＤＮＡプローブ試験の検出水準または感度は連続的
に希釈した）ＩＳＶ　Ｉ対照プラスミドＤＮＡを用いる
試験により決定された。

検定プロトコールには下記の工程が含まれる：ａ、　　
　Ｈ３Ｖ＋　　ＤＮＡブースミ　　昭　の製 Ｈ３Ｖ　Ｉプラスミドの貯蔵溶液は１１００ｎ　（４，
８Ｘ１０６コピー）のプラスミドを２５ｐ！の無菌、脱
イオン水に溶解し、０．３Ｎ水酸化ナトリウムで連続的
に希釈して、４．８８　ｘ　１０’　−０，９６Ｘ　１
０”コピー／　ｐｉの範囲の濃度のプラスミド試料を調
製した。試料は室温で１５分間放置して変性させた。

ｂ、　の　　　ＨＢＶブースミ゛　　ＤＮＡの足止 ジーン　スクリーン［相］　プラス（ＮＥＮ、　デュポ
ン、ポスト・ン、ＭＡ’ｌおよびバイオダインＡ（パル
　コーホレーンジン２　グレンコープ、Ｎ。

Ｙ、）膜を１Ｘ８ｃ＋＋＋片に切断した。ＨＳＶＩプラ
スミド試料の希釈液の各々の１μ！が、乾燥膜上にビベ
ットチ、プを膜表面に接触させて非常に小さな１ｍされ
たスポットが得られるようにしてつけられた。膜は続い
て標的固定化核酸を中和するためスポット当り１．　Ｏ
Ｏｐｌの２Ｍ酢酸アンモニウムで洗浄された。それらは
続いて０．６　Ｍ塩化ナトリウム、０．０８Ｍクエン酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄された。

Ｃ，プローブ　バイブ　　イゼーンヨン（ｉ）−ブレハ
イブリダイゼーション プラスミド試料を含む膜を３ｄのハイブリダイゼーショ
ン緩衝液に溶解し熱で封入し得る袋に入れる。プリハイ
ブリグイゼーションは５５℃にて１５分間実施した。

（ｉｉ）−ハイブリダイゼーション ５ＮＡＰ＠アルカリ性ホスフアターゼ標識プローブを１
００μｌの無菌、脱イオン水で再構成した。

ハイブリダイゼーション溶液は０．５ｄのハイブリダイ
ゼーション緩衝液に２．Ｊルｌ？３゛アルカリ性ホスフ
ァターゼ標識プローブ溶液を熔解することより調製され
た。ハイブリダイゼーションは新しい熱封入袋中、０．
５　ｄのハイブリダイゼーション溶液と５５゛Ｃにて３
０分間実施された。ハイブリダイゼーション後装を開き
、膜を注意深（除き下記の緩衝液で洗浄した： １．０．１Ｍ塩化ナト１ノウム、０．０２Ｆ＋　クエン
酸ナトリウム、ｐＨ７，０、ｌＯｇのＳＤＳ緩衝液を加
えて、室温で５分間を２回、 ２．０．１？Ｉ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナ
トリウム、ｐＨ７，０，１０ｄのトリトンＸ−１００（
シグマケミカルＣｏ、、　セントルイス、　ＭＯ）を加
えて５５“Ｃにて５分間を２回、 ３、上記緩衝液で、室温にて５分間を２回、４．０．１
Ｍ塩化ナトリウム、０．０２Ｍクエン酸ナトリウム、ｐ
Ｈ７，ＯＩｌ衝液で室温にて５分間を２回、 ５．０．１門ジェタノールアミン、ｌ　ｍＭ塩化マグ茅
シウム、０．０２％アジ化ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０
，０で１回。

ハイブリダイゼーンヨン緩衝液は２５０ｄの３−塩化ナ
トリウム、０．４−クエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０を
８６０ｄへ脱イオン水で希釈し、５ｇのウシ血清アルブ
ミン、５ｇのポリビニルビブリジオン（平均ＭＷ　　４
０．０００）および１．０ｇ５ＤＳを混合し、加温し、
混合させて溶解することにより調製された。

検■ ハイブリダイゼーション膜ストリップは０，１Ｍジェタ
ノールアミン、１．０■Ｈ塩化マグネシウムおよび０．
０２％アジ化ナトリウム（ｐＨ１０，０）に溶解した０
、２５驕りの１２−ジオキセタン７ａｆで飽和させた。

膜はプラスチック袋に封入し、直ちにカメラ発光計に置
き、光発射はポラロイドインスタント黒／白２０，０Ｏ
ＯＡ　Ｓ　Ａフィルム、タイプ６］２上で３０分間画像
作成された。

２、其ΣＭ士ブｊス人ＬＬ１ １　　　　　　　　９．６　　Ｘ　　１０’２　　　　
　　　　　３．２　　Ｘ　　１０７３　　　　　　　　
１．０７　　Ｘ　　１．０’４　　　　　　　　　３．
５６　　ｘ　　ｔｏ’５　　　　　　　　　１、．１９
　　Ｘ　　１０’６　　　　　　　　　３．９５　　Ｘ
　　１０５７　　　　　　　　１．３２　　ｘ　　１０
ｓ８　　　　　　　　　４．３９　　Ｘ　　１０’９　
　　　　　　　　１．４６　　Ｘ　　１．０’１０　　
　　　　　　４．８８　　Ｘ　　１０”第７図はポラロ
イド　インスタント２０，０ＯＯＡ　ＳＡ黒白フィルム
、タイプ６１２を用いて作られた２つの膜上のＡ、　Ｍ
　Ｐ　Ｐ　ＤおよびＡ−ＣＨ，Ｃ）−ＡＭＰＰＤの３０
分の画像を示している。

第７図において“Ａ”はバイオダインＡ膜ス（・す、プ
から得られた画像であり、“Ｂ”はシーンスクリーン　
プラス膜ストリップから得られた画像であり、■ストリ
ップはＡＭＰＰＤであり、および■ストリップはＡ−Ｃ
Ｈ３０−ＡＭＰＰＤである。

本発明の上記の議論は主として好適な実施態様およびそ
の実行に向けられている。当業者にはここに説明した概
念の実際の施行においてはさらなる変更および変形が付
随する特許請求の範囲で定義されるごとき本発明の精神
および範囲から離れることなく簡単になされることが容
易に明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

第１−３図は各々、実施例■に記載したごとくして得ら
れたＡＭＰＰＤおよびそのＡ−メトキシアダマンタ−２
′−イリデンおよびＢ−メトキシアダマンタ−２′−イ
リデン類似体の各々から得られた全発光放射を比較した
グラフである。 第４−６図は各々、実施例■に記載したごとくとし得ら
れたＡＭＰＰＤおよびそのＡ−メトキシアダマンタ−２
′−イリデンおよびＢ−メトキシアダマンタ−−２′−
イリデンｌ（（以体各々に対するＴＳＨＲＬｔＪ対ＴＳ
Ｈを示したグラフである。 第７図は実施例■に記載した方法による単純ヘルペスウ
ィルスＩ　　ＤＮＡ中のアルカリ性ホスファターゼ量の
検出におけイ）ＡＭＩ）ＰＤおよびそのＡ−メトキンア
ダマンタ−２′−イリデン類イ以体の感度を示したポロ
ライドインスタント２０．０００ＡＳＡ黒白フイルムタ
イプ６１２上の画像゛＝ある。 −−ａ 代理人　　弁理士　　　湯　浅　　恭　三（外４名） Ｆｌｇ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはスピロ結合を通してジオキセタンへ結合し
   ているシクロアルキル基または縮合ポリシクロアルキリ
   デン基であり；Ｙはエネルギーを吸収して励起エネルギ
   ー状態を形成できる蛍光発色団であり、その状態からそ
   れは光学的に検出し得るエネルギーを放出してその本来
   のエネルギー状態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、ア
   リール、アラルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、
   ヘテロアリール、シクロアルキルまたはシクロヘテロア
   ルキル基、または酵素により開裂し得る結合を含み、ジ
   オキセタン環に結合した電子の豊富な部分を生成する酵
   素で開裂し得る基であり；Ｚは水素、ヒドロキシまたは
   酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環に結
   合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得る基
   であり、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素で開裂し得る
   基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタンの
   溶解度を増大させる置換基または膜、フィルム、ビーズ
   、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタンの
   結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分解の
   速度を促進する置換基を含んでいる。） を持ち、酵素と反応可能で光学的に検出し得るエネルギ
   ーを放出できるジオキセタン化合物。 ２、Ｔ置換基上に置換されている可溶化置換基がカルボ
   ン酸基である特許請求の範囲第１項のジオキセタン化合
   物。 ３、Ｔ置換基上に置換されている結合を容易にする置換
   基がカルボン酸基である特許請求の範囲第１項のジオキ
   セタン化合物。 ４、Ｔ置換基上に置換されているジオキセタン酵素分解
   の速度を促進する置換基がメトキシ基である特許請求の
   範囲第１項のジオキセタン化合物。 ５、Ｙがフェニル、ナフタレン、アセトラセン、ローダ
   ミン、フルオレセイン、エオシン、クマリン、エリスロ
   シン、アシリジン、ピレン、スチルベン、ニトロベンズ
   オキサンアゾール、キノリン、アクリジン、アシドアク
   リジン、カルバゾール、蛍光性シアニン、カルボシアニ
   ン、ピリジニウム塩、オキソノールまたはレゾロフィン
   基の残基またはそれらの基の誘導体の残基である特許請
   求の範囲第１〜４項の任意の１項のジオキセタン化合物
   。 ６、Ｚが酵素で開裂し得る基であり、そこにおいて酵素
   により開裂し得る前記結合が開裂した場合、酸素、硫黄
   または窒素アニオンを得る特許請求の範囲第５項のジオ
   キセタン化合物。 ７、Ｚが酵素で開裂し得るリン酸エステル基、酢酸エス
   テル基、カルボキシル基、１−ホスホ−２，３−ジアシ
   ルグリセリド基、１−チオ−Ｄ−グリコシド基、アデノ
   シン三リン酸類似基、アデノシン二リン酸類似基、アデ
   ノシン−リン酸類似基、アデノシン類似基、α−Ｄ−ガ
   ラクトシド基、β−Ｄ−ガラクトシド基、α−Ｄ−グリ
   コシド基、β−Ｄ−グリコシド基、α−Ｄ−マンノシド
   基、β−Ｄ−マンノシド基、β−Ｄ−フルクトクラノシ
   ド基、β−Ｄ−グリコシドウロネート基、ｐ−トルエン
   スルホニル−Ｌ−アルギニン色素エステル基またはｐ−
   トルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンアミド基である特
   許請求の範囲第５項のジオキセタン化合物。 ８、Ｙがヒドロキシフェニル基の残基である特許請求の
   範囲第１項のジオキセタン化合物。 ９、Ｙがヒドロキシナフタレン基の残基である特許請求
   の範囲第１項のジオキセタン化合物。 １０、Ｙがヒドロキシアントラセン基の残基である特許
   請求の範囲第１項のジオキセタン化合物。 １１、Ｔがスピロ結合を通してジオセキタン環へ結合し
   、および水溶液中でのジオキセタンの溶解度を増大させ
   る置換基または膜、フィルム、ビーズ、ポリマーまたは
   重合し得る基に対するジオキセタンの結合を容易にする
   置換基またはジオキセタン酵素分解の速度を促進する置
   換基で置換されている５から１２までの炭素原子を各々
   が持つ２つまたはそれ以上の融合環を持つ縮合ポリシク
   ロアルキリデン基であり、Ｘがメトキシ基であり、Ｙが
   ヒドロキシフェニル基の残基であり、およびＺが酵素で
   開裂し得るリン酸エステル基である特許請求の範囲第１
   項のジオキセタン化合物。 １２、Ｔが置換アダマンタ−２′−イリデン基である特
   許請求の範囲第１１項のジオキセタン化合物。 １３、基Ｔ上の置換基がカルボン酸基である特許請求の
   範囲第１２項のジオキセタン化合物。 １４、基Ｔ上の置換基がメトキシ基である特許請求の範
   囲第１２項のジオキセタン化合物。 １５、多数の特異的結合対が光学的に検出し得る反応に
   よって検出される検定法であって： 該光学的に検出し得る反応が、分解した場合に光エネル
   ギーを生じることができその酵素が開裂し得る不安定な
   置換基が結合されている結合が意図的に開裂される前は
   室温で実験的に安定で、式：▲数式、化学式、表等があ
   ります▼ （式中、Ｔはスピロ結合を通してジオキセタンへ結合し
   ているシクロアルキル基または縮合ポリシクロアルキデ
   ンであり；Ｙはエネルギーを吸収して励起状態を形成で
   きる蛍光発色団であり、その状態からそれは光学的に検
   出し得るエネルギーを放出してその本来のエネルギー状
   態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、アリール、アラル
   キル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリール
   、シクロアルキルまたはシクロヘテロアルキル基または
   酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環に結
   合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得る基
   であり、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素で開裂し得る
   基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタンの
   溶解度を増加させる置換基または膜、フィルム、ビーズ
   、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタンの
   結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分解の
   速度を促進する置換基を含んでいる） で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性１，
   ２−ジオキセタン化合物と酵素の反応を含んでおり、そ
   の為前記酵素が前記酵素で開裂し得る基を開裂してジオ
   キセタン環に結合する電子の豊富な部分を得、ジオキセ
   タンの分解を起こして発光性物質を生成することからな
   る方法。 １６、Ｘがメトキシ基であり、Ｙがフェニル、ナフタレ
   ン、アントラセン、ローダミン、フルオレセイン、エオ
   シン、クマリン、エリスロシン、アシリジン、ピレン、
   スチルベン、ニトロベンズオキサンアゾール、キノリン
   、アクリジン、アシドアクリジン、カルバゾール、蛍光
   性シアニン、カルボシアニン、ピリジニウム塩、オキソ
   ノールまたはレゾロフィン基の残基またはそれらの基の
   誘導体の残基であり、Ｚが酵素で開裂し得る基である）
   そこにおいて前記酵素によって開裂し得る基は開裂した
   場合、酸素、硫黄または窒素アニオンを得る）特許請求
   の範囲第１５項記載の検定法。 １７、酵素で開裂し得る基Ｚがリン酸エステル基、酢酸
   エステル基、カルボキシ基、１−ホスホ−２，３−ジア
   シルグリセリド基、１−チオ−Ｄ−グリコシド基、アデ
   ノシン三リン酸類似基、アデノシン二リン酸類似基、ア
   デノシン−リン酸類似基、アデノシン類似基、α−Ｄ−
   ガラクトシド基、β−Ｄ−ガラクトシド基、α−Ｄ−グ
   ルコシド基、β−Ｄ−グリコシド基、α−Ｄ−マンノシ
   ド基、β−Ｄ−アンノシド基、β−Ｄ−フルクトフラノ
   シド基、β−Ｄ−グリコシドウロネート基、ｐ−トルエ
   ンスルホニル−Ｌ−アルギニンエステル基またはｐ−ト
   ルエンスルホニル−Ｌ−アルギニンアミド基である特許
   請求の範囲第１６項記載の検定法。 １８、Ｙがヒドロキシフェニル基の残基である特許請求
   の範囲第１７項記載の検定法。 １９、Ｙがヒドロキシナフタレン基の残基である特許請
   求の範囲第１７項記載の検定法。 ２０、Ｙがヒドロキシアントラセン基の残基である特許
   請求の範囲第１７項記載の検定法。 ２１、Ｔがスピロ結合を通してジオキセタン環へ結合し
   、および水溶液中でのジオキセタンの溶解度を増大させ
   る置換基または膜、フィルム、ビーズ、ポリマーまたは
   重合し得る基に対するジオキセタン結合を容易にする置
   換基またはジオキセタン酵素分解の速度を促進する置換
   基で置換されている５から１２までの炭素原子を各々が
   持つ２つまたはそれ以上の縮合環を縮合ポリシクロルア
   ルキリデン基であり、Ｘがメトキシ基であり、Ｙがヒド
   ロキシフェニル基の残基であり、およびＺが酵素で開裂
   し得るリン酸エステル基である特許請求の範囲第１５項
   記載の検定法。 ２２、Ｔが置換アダマント−２′−イリデン基である特
   許請求の範囲第２１項記載の検定法。 ２３、基Ｔ上の置換基がカルボン酸基である特許請求の
   範囲第２２項記載の検定法。 ２４、基Ｔ上の置換基がメトキシ基である特許請求の範
   囲第２２項記載の検定法。 ２５、前記特異的結合対が抗原および抗体から成る特許
   請求の範囲第１５項記載の検定法。 ２６、前記特異的結合対が核酸および前記核酸のすべて
   または一部に結合できるプローブからなる特許請求の範
   囲第１５項記載の検定法。 ２７、前記特異的結合対が酵素および前記酵素により開
   裂し得る基を含んでいる１，２−ジオキセタン化合物か
   らなる特許請求の範囲第１５項記載の検定法。 ２８、前記酵素で開裂し得る基が、ガラクトピラノシド
   からなり、前記酵素がガラクトシダーゼからなる特許請
   求の範囲第２７項に記載の検定法。 ２９、核酸がＤＮＡ，ＲＮＡおよびその断片である特許
   請求の範囲第２６項記載の検定法。 ３０、プローブが核酸に相補的な標識オリゴヌクレオチ
   ドである特許請求の範囲第２６項記載の検定法。 ３１、オリゴヌクレオチドプローブがビオチニル化され
   ている特許請求の範囲３０項記載の検定法。 ３２、ＤＮＡ，ＲＮＡまたはその断片が配列決定プロト
   コールで生成される特許請求の範囲第３０項記載の方法
   、 ３３、（ａ）ＤＮＡ，ＲＮＡまたはその断片を標識相補
   的オリゴヌクレオチドプローブと接触させてハクブリダ
   イズした対を形成し、 （ｂ）ハイブリダイズした対を光エネルギーを放出させ
   るため酵素によって開裂し得る１，２−ジオキセタンを
   開裂できる酵素と共有結合で複合されたオリゴヌクレオ
   チドの標識へ強く結合できる分子と接触させ、 （ｃ）そのような１，２−ジオキセタン基質を添加し、
   および （ｄ）生じる光を検出する工程からなる特許請求の範囲
   第３０項記載の検定法。 ３４、オリゴヌクレオチド標識がビオチンまたはビオチ
   ン誘導体である特許請求の範囲第３３項記載の検定法。 ３５、オリゴヌクレオチドの標識と強く相互作用できる
   分子がアビシンまたはストレプトアビジンである特許請
   求の範囲第３３項記載の検定法。 ３６、酵素が酸性またはアルカリ性ホスファターゼであ
   り、Ｘがメトキシであり、およびＹ−Ｚがメタ−リン酸
   −置換フェノキシ基である特許請求の範囲第３３項記載
   の検定法。 ３７、酵素がラクトシダーゼであり、Ｘがメトキシであ
   り、およびＹ−Ｚがメタβ−Ｄ−ガラクトシド−置換フ
   ェノキシである特許請求の範囲第３３項記載の検定法。 ３８、光エネルギーが感光性フィルムで検出される特許
   請求の範囲第３３項記載の検定法。 ３９、光エネルギーが光電セルにより検出される特許請
   求の範囲第３３項記載の検定法。 ４０、光エネルギーを放射するため前記オリゴヌクレオ
   チドプローブが前記１，２−ジオキセタンを分解できる
   酵素で共有結合で標識されている特許請求の範囲第３０
   項記載の検定法。 ４１、前記オリゴヌクレオチドプローブ上の前記標識が
   免疫化学的に抗体−酵素複合体へ結合する共有結合で結
   合された抗原を含み、ここで前記抗体は前記抗原へ対す
   るもので、前記酵素は光エネルギーを放射するため前記
   １，２−ジオキセタン化合物を分解できる特許請求の範
   囲第３０項記載の検定法。 ４２、前記酵素が酸性またはアルカリ性ホスファターゼ
   であり、Ｘがメトキシであり、およびＹ−Ｚがメタリン
   酸−置換フェノキシ基である特許請求の範囲第４０また
   は第４１項に記載の検定法。 ４３、前記酵素がガラクトシダーゼであり、Ｘはメトキ
   シであり、およびＹ−Ｚがメタβ−Ｄ−ガラクトシド−
   置換フェノキシ基である特許請求の範囲第４０項または
   ４１項記載の検定法。 ４４、前記プローブの前記核酸への結合がナイロン膜上
   で実施される特許請求の範囲第２６，３０，４０または
   ４１項の任意の１項に記載の検定法。 ４５、前記ＤＮＡ，ＲＮＡまたはその断片および前記標
   識オリゴヌクレオチドプローブ間のハイブリダイゼーシ
   ョンがナイロン膜上で行われる特許請求の範囲第３３か
   ら３９項までの任意の１項に記載の検定法。 ４６、固体マトリックスを使用して実施し、前記マトリ
   ックスへの非特異的結合が前記マトリックスを重合性四
   級アンモニウム塩で前処理することによりブロックされ
   る特許請求の範囲第１５項記載の検定法。 ４７、それが存在しない時に生じるよりも特異的光エネ
   ルギー産生を増加させる水−可溶性エンハンサーの存在
   下に実施される特許請求の範囲第１５項記載の検定法。 ４８、前記水−可溶性エンハンサーが血清アルブミンで
   あると特許請求の範囲第４７項記載の検定法。 ４９、前記エンハンサーが重合性四級アンモニウム塩で
   ある特許請求の範囲第４７項記載の検定法。 ５０、前記重合性四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベ
   ンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ〔ビニ
   ルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）
   〕またはポリ〔ビニルベンジル（トリブチルアンモニウ
   ムクロリド）〕である特許請求の範囲第４９項記載の検
   定法。 ５１、エンハンサーが正に荷電した重合性四級アンモニ
   ウム塩および前記１，２−ジオキセタン化合物の酵素触
   媒分解に続いて生成される前記１，２−ジオキセタン化
   合物の負に荷電した置換基と三成分の複合体を形成でき
   るフルオレセインから成りそれにより前記負に荷電した
   置換基およびフルオレセイン間でエネルギー移動が起こ
   り、フルオレセインにより光エネルギーが放射される特
   許請求の範囲第４７項記載の検定法。 ５２、前記重合性四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベ
   ンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ〔ビニ
   ルベンジル（ベンジルメチルアンモニウムクロリド〕ま
   たはポリ〔ビニルベンジル（トリブチルアンモニウムク
   ロリド）〕である特許請求の範囲第５０項記載の検定法
   。 ５３、分解した場合光エネルギーを生じることができ、
   その酵素が開裂し得る不安定な置換基が結合されている
   結合が計画的に開裂される前は室温で実質的に安定で、
   式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはスピロ、結合を通してジオキセタンへ結合
   しているシクロアルキル基または縮合ポリシクロアルキ
   リデンであり；Ｙはエネルギーを吸収して励起状態を形
   成できる蛍光発色団であり、その状態からそれは光学的
   に検出し得るエネルギーを放出してその本来のエネルギ
   ー状態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、アリール、ア
   ラルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリ
   ール、シクロアルキルまたはシクロヘテルアルキル基ま
   たは酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環
   に結合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得
   る基であり、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素で開裂し
   得る基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタ
   ンの溶解度を増加させる置換基または膜、フィルム、ビ
   ーズ、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタ
   ンの結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分
   解の速度を促進する置換基を含んでいる） で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性１，
   ２−ジオキセタン化合物；および前記１，２−ジオキセ
   タン化合物の前記酵素によって開裂し得る不安定な基を
   開裂できる酵素からなる試料中の第１の物質を検出する
   ためのキット。 ５４、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがメタリン酸−置換
   フェノキシ基であり、前記酵素が酸性またはアルカリ性
   ホスファターゼである特許請求の範囲第５３項記載のキ
   ット。 ５５、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがβ−Ｄ−がラクト
   シド−置換フェノキシ基であり、および前記酵素がガラ
   クトシダーゼである特許請求の範囲第５３項記載のキッ
   ト。 ５６、前記光エネルギーの検出の為の画像再現性手段を
   さらに特徴とする特許請求の範囲第５３から５５項まで
   の任意の１項に記載のキット。 ５７、前記画像再現性手段が写真フィルムである特許請
   求の範囲第５６項記載のキット。 ５８、核酸または断片を相補的な標識オリゴヌクレオチ
   ドプローブとハイブリダイゼーションさせることによる
   試料中の核酸またはその断片を検出するためのキットで
   あって： 分解した場合光エネルギーを生じることができ、その酵
   素が開裂し得る不安定な置換基が結合されている結合が
   意図的に開裂される前は室温で実質的に安定で、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはスピロ結合を通してジオキセタンへ結合し
   ているシクロアルキル基または縮合ポリシクロアルキリ
   デンであり；Ｙはエネルギーを吸収して励起状態を形成
   できる蛍光発色団であり、その状態からそれは光学的に
   検出し得るエネルギーを放出してその本来のエネルギー
   状態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、アリール、アラ
   ルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリー
   ル、シクロアルキルまたはシクロヘテロアルキル基また
   は酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環に
   結合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得る
   基であり、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素で開裂し得
   る基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタン
   の溶解度を増加させる置換基または膜、フィルム、ビー
   ズ、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタン
   の結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分解
   の速度を促進する置換基を含んでいる） で表わされる酵素によって開裂し得る化学発光性１，２
   −ジオキセタン化合物；共有結合で酵素が標識されてい
   るオリゴヌクレオチドプローブ；および前記核酸−オリ
   ゴヌクレオチドプローブハイブリダイゼーションがナイ
   ロン膜上で実施されるキット。 ５９、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがメタリン酸−置換
   フェノキシ基であり、および前記酵素が酸性またはアル
   カリ性ホスファターゼである特許請求の範囲第５８項記
   載のキット。 ６０、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがメタβ−Ｄ−ガラ
   クトシド−置換フェノキシ基であり、および前記酵素が
   ガラクトシダーゼである特許請求の範囲第５８項記載の
   キット。 ６１、前記光エネルギーの検出のための画像再現性手段
   をさらに特徴とする特許請求の範囲第５８から６０項ま
   での任意の１項に記載のキット。 ６２、前記画像再現性手段が写真フィルムである特許請
   求の範囲第６１項記載のキット。 ６３、核酸または断片を相補的な標識オリゴヌクレオチ
   ドプローブとハイブリダイゼーションさせることにより
   試料中の核酸またはその断片を検出するキットで、 分解した場合光エネルギーを生じることができ、その、
   酵素が開裂し得る不安定な基が結合されている結合が意
   図的に開裂される前は室温で実質的に安定で、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはスピロ結合を通してジオキセタンへ結合し
   ているシクロアルキル基または結合ポリシクロアルキリ
   デンであり；Ｙはエネルギーを吸収して励起状態を形成
   できる蛍光発色団であり、その状態からそれは光学的に
   検出し得るエネルギーを放出してその本来のエネルギー
   状態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、アリール、アラ
   ルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリー
   ル、シクロアルキルまたはシクロヘテロアルキル基また
   は酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環に
   結合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得る
   基であり、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素で開裂し得
   る基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタン
   の溶解度を増加させる置換基または膜、フィルム、ビー
   ズ、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタン
   の結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分解
   の速度を促進する置換基を含んでいる） で表わされる酵素によって開裂し得る化学発光性１，２
   −ジオキセタン化合物；ビオチンまたはビオチン誘導体
   で共有結合で標識されている相補的オリゴヌクレオチド
   プローブ；光エネルギーを放出するための前記１，２−
   ジオキセタン化合物を分解できる酵素に共有結合で結合
   されているアジピンまたはストレプトアビジン；および
   前記核酸またはその断片が前記オリゴヌクレオチドプロ
   ーブへナイロン膜上でハイブリダイズされるキット。 ６４、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがメタリン酸−置換
   フェノキシ基であり、および前記酵素が酸性またはアル
   カリ性ホスファターゼである特許請求の範囲第６３項記
   載のキット。 ６５、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがβ−Ｄ−ガラクト
   シド−置換フェノキシ基であり、および前記酵素がガラ
   クトシダーゼである特許請求の範囲第６３項記載のキッ
   ト。 ６６、前記光エネルギーの検出の為の画像再現性手段を
   さらに特徴とする特許請求の範囲第６３から６５項まで
   の任意の１項に記載のキット。 ６７、前記画像再現性手段が写真フィルムである特許請
   求の範囲第６６項記載のキット。 ６８、核酸または断片を相補的な標識オリゴヌクレオチ
   ドプローブとハイブリダイゼーションさせることによる
   試料中の核酸またはその断片を検出するためのキットで
   あって： 分解した場合光エネルギーを生じることができ、その酵
   素が開裂し得る不安定な置換基が結合されている結合が
   意図的に開裂される前は室温で実質的に安定で、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはスピロ結合を通してジオキセタンへ結合し
   ているシクロアルキル基または縮合ポリシクロアルキリ
   デンであり；Ｙはエネルギーを吸収して励起状態を形成
   できる蛍光発色団であり、その状態からそれは光学的に
   検出し得るエネルギーを放出してその本来のエネルギー
   状態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、アリール、アラ
   ルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリー
   ル、シクロアルキルまたはシクロヘテロアルキル基また
   は酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環に
   結合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得る
   基であり、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素で開裂し得
   る基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタン
   の溶解度を増加させる置換基または膜、フィルム、ビー
   ズ、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタン
   の結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分解
   の速度論を促進する置換基を含んでいる） で表わされる酵素によって開裂し得る化学発光性１，２
   −ジオキセタン化合物；抗原で共有結合により標識され
   ている相補的オリゴヌクレオチドプローブ；光エネルギ
   ー放射のため前記１，２−ジオキセタン化合物を分解で
   きる酵素が共有結合で結合している前記抗原に対する抗
   体；および前記核酸またはその断片が前記オリゴヌクレ
   オチドプローブへナイロン膜上でハイブリダイズされる
   ことを特徴とする。 ６９、前記酵素が酸性またはアルカリ性ホスファターゼ
   であり、Ｘがメトキシであり、およびＹ−Ｚがメタリン
   酸−置換フェノキシ基である特許請求の範囲第６８項記
   載のキット。 ７０、前記酵素がガラクトシダーゼであり、Ｘがメトキ
   シであり、およびＹ−Ｚがメタβ−Ｄ−ガラクトシド−
   置換フェノキシ基である特許請求の範囲第６８項記載の
   キット。 ７１、前記光エネルギーの検出の為の画像再現性手段を
   さらに特徴とする特許請求の範囲第６８から７０項まで
   の任意の１項に記載のキット。 ７２、前記画像再現手段が写真フィルムである特許請求
   の範囲第７１項記載のキット。 ７３、試料中のタンパク質を検出するためのキットであ
   って： 分解した場合光エネルギーを生じることができ、その酵
   素が開裂し得る不安定な置換基が結合されている結合が
   意図的に開裂される前は室温で実質的に安定で、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはスピロ結合を通してジオキセタンへ結合し
   ているシクロアルキル基または縮合ポリシクロアルキリ
   デンであり；Ｙはエネルギーを吸収して励起状態を形成
   できる蛍光発色団であり、その状態からそれは光学的に
   検出し得るエネルギーを放出してその本来のエネルギー
   状態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、アリール、アラ
   ルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリー
   ル、シクロアルキルまたはシクロヘテロアルキル基また
   は酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環に
   結合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得る
   基であり、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素で開裂し得
   る基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタン
   の溶解度を増加させる置換基または膜、フィルム、ビー
   ズ、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタン
   の結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分解
   の速度を促進する置換基を含んでいる） で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性１，
   ２−ジオキセタン化合物；光エネルギー放射のため前記
   １，２−ジオキセタン化合物を分解できる酵素に共有結
   合で結合されている前記タンパク質に対する抗体；およ
   びその上でタンパク質−抗体結合が実施される膜からな
   るキット。 ７４、前記膜がナイロンまたはニトロセルロース膜であ
   る特許請求の範囲第７３項に記載のキット。 ７５、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがメタリン酸−置換
   フェノキシ基であり、前記酵素が酸性またはアルカリ性
   ホスファターゼである特許請求の範囲第７３項記載のキ
   ット。 ７６、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがβ−Ｄ−ガラクト
   シド−置換フェノキシ基であり、および前記酵素がガラ
   クトシダーゼである特許請求の範囲第７３項記載のキッ
   ト。 ７７、前記光エネルギーの検出の為の画像再現性手段を
   さらに特徴とする特許請求の範囲第７３から７６項まで
   の任意の１項に記載のキット。 ７８、前記画像再現性手段が写真フィルムである特許請
   求の範囲第７７項記載のキット。 ７９、試料中のタンパク質を検出するためのキットであ
   って： 分解した場合光エネルギーを生じることができ、その酵
   素が開裂し得る不安定な置換基が結合されている結合が
   意図的に開裂される前は室温で実質的に安定で、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはスピロ結合を通してジオキセタンへ結合し
   ているシクロアルキル基または縮合ポリシクロアルキリ
   デンであり；Ｙはエネルギーを吸収して励起状態を形成
   できる蛍光発色団であり、その状態からそれは光学的に
   検出し得るエネルギーを放出してその本来のエネルギー
   状態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、アリール、アラ
   ルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリー
   ル、シクロアルキルまたはシクロヘテロアルキル基また
   は酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環に
   結合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得る
   基であり、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素で開裂し得
   る基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタン
   の溶解度を増加させる置換基または膜、フィルム、ビー
   ズ、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタン
   の結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分解
   の速度を促進する置換基を含んでいる） で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性１，
   ２−ジオキセタン化合物；および前記１，２−ジオキサ
   ン化合物を分解できる酵素に共有結合で結合された前記
   第１の抗体に対する第２の抗体からなるキット。 ８０、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがメタリン酸−置換
   フェノキシ基であり、前記酵素が酸性またはアルカリ性
   ホスファターゼである特許請求の範囲第７９項記載のキ
   ット。 ８１、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがβ−Ｄ−ガラクト
   シド−置換フェノキシ基であり、および前記酵素がガラ
   クトシダーゼである特許請求の範囲第７９項記載のキッ
   ト。 ８２、それが存在しないときに生じるよりも、特異的光
   エネルギー産生を増加させる水−可溶性エンハンサーを
   さらに特徴とする特許請求の範囲第５３，５８，６３，
   ６８，７３または７９項の任意の１項に記載のキット。 ８３、前記水溶性エンハンサーが血清アルブミンである
   特許請求の範囲第８２項記載のキット。 ８４、前記エンハンサーが重合性四級アンモニウム塩で
   ある特許請求の範囲第８２項記載のキット。 ８５、前記重合性四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベ
   ンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ〔ビニ
   ルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）
   ］またはポリ〔ビニルベンジル（トリブチルアンモニウ
   ムクロリド）〕である特許請求の範囲第８４項記載のキ
   ット。 ８６、前記エンハンサーが正に荷電した重合性アンモニ
   ウム塩および前記１，２−ジオキセタン化合物の酵素触
   媒分解に続いて生成される前記１，２−ジオキセタン化
   合物の負に荷電した生成物と三成分の複合体を形成でき
   るフルオレセインから成り、それにより前記負に荷電し
   た生成物およびフルオレセイン間でエネルギー移動が起
   こり、フルオレセインにより光エネルギーが放射される
   特許請求の範囲第８２項記載のキット。 ８７、前記重合性四級アンモニウム塩がポリ（ビニルベ
   ンジルトリメチルアンモニウムクロリド）、ポリ〔ビニ
   ルベンジル（ベンジルジメチルアンモニウムクロリド）
   〕またはポリ〔ビニルベンジル（トリブチルアンモニウ
   ムクロリド）〕である特許請求の範囲第８６項記載のキ
   ット。 ８８、試料中の酵素を検出するための方法であって、以
   下の工程（ａ）−（ｃ）からなる方法：（ａ）分解した
   場合光エネルギーを生じることができ、その酵素が開裂
   し得る不安定な置換基が結合されている結合が意図的に
   開裂される前は室温で実質的に安定で、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｔはスピロ結合を通してジオキセタンへ結合し
   ているシクロアルキル基または縮合ポリシクロアルキリ
   デンであり；Ｙはエネルギーを吸収して励起状態を形成
   できる蛍光発色団であり、その状態からそれは光学的に
   検出し得るエネルギーを放出してその本来のエネルギー
   状態へ戻り；Ｘは水素またはアルキル、アリール、アラ
   ルキル、アルカリール、ヘテロアルキル、ヘテロアリー
   ル、シクロアルキルまたはシクロヘテロアルキル基また
   は酵素により開裂し得る結合を含み、ジオキセタン環に
   結合した電子の豊富な部分を生成する酵素で開裂し得る
   基であた、ＸおよびＺの少くとも１つは酵素が開裂し得
   る基であり、およびＴもまた水溶液中でのジオキセタン
   の溶解度を増加させる置換基または膜、フィルム、ビー
   ズ、ポリマーまたは重合し得る基に対するジオキセタン
   の結合を容易にする置換基またはジオキセタン酵素分解
   の速度を促進する置換基を含んでいる） で表わされる、酵素によって開裂し得る化学発光性１，
   ２−ジオキセタン化合物を提供し； （ｂ）前記１，２−ジオキセタン化合物を前記酵素を含
   む前記試料と接触させ；それにより前記酵素は前記１，
   ２−ジオキセタン化合物から前記酵素によって開裂し得
   る不安定な置換基を開裂して前記１，２−ジオキセタン
   化合物に結合された負に荷電された置換基を生成し、前
   記負に荷電した置換基が前記１，２−ジオキセタン化合
   物の分解を起こして前記蛍光発色団基を含む発光性物質
   を生成し；および （ｃ）前記発光物質を前記酵素の存在の指標として検出
   する。 ８９、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがメタリン酸−置換
   フェノキシ基であり、および前記酵素が酸性またはアル
   カリ性ホスファターゼである特許請求の範囲第８８項記
   載の方法。 ９０、Ｘがメトキシであり、Ｙ−Ｚがメタβ−Ｄ−ガラ
   クトシド−置換フェノキシ基であり、および前記酵素が
   ガラクトシダーゼである特許請求の範囲第８８項記載の
   方法。