JPH09504795A

JPH09504795A - 血小板特異的キメラ免疫グロブリン及びその使用方法

Info

Publication number: JPH09504795A
Application number: JP7513453A
Authority: JP
Inventors: エス．コラー，バリー; エム．ナイト，デイビッド
Original assignee: Research Foundation of State University of New York
Current assignee: Research Foundation of State University of New York
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 1997-05-13
Also published as: AU8959398A; HK1054682B; DE69433091T2; CN1230201C; PT725655E; WO1995012412A1; EP1334730A3; ES2204937T5; CA2175214A1; CN1140295C; DE69433091T3; RU2158135C2; EP1334730A2; DK0725655T4; AU1172495A; NZ502819A; EP0725655B1; EP0725655A1; EP0725655B2; UA37249C2

Abstract

(57)【要約】血小板特異的なキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片が記載されている。このキメラ分子は、非ヒト抗原結合領域およびヒト定常領域を含む。好適な免疫グロブリンは、複合体として糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に特異的であり、受容体に対するリガンドの結合を遮断して血小板の凝集を防止する。この免疫グロブリンは、閉塞、再閉塞（例えば突然の閉塞）、狭窄、再狭窄の減少または予防に使用することができる。さらに、この免疫グロブリンは血栓造影においてばかりでなく、単独投与または血栓溶解剤と併用により抗−血栓療法にも有用である。

Description

【発明の詳細な説明】血小板特異的キメラ免疫グロブリン及びその使用方法本発明の背景血小板の凝集は、血液凝固の形成における本質的事象である。正常な環境下においては、血液の凝塊は血液細胞の血管系からの流出を防止するのに役立つ。しかしながら、ある疾病状態にあっては、凝塊は血流を制限しあるいは全く閉塞して細胞の壊死を招く。例えば、アテローム性動脈硬化症斑の位置の血小板凝集及びそれに続く血栓症は、アンギナ（angina）、急性心筋梗塞症、及び血栓崩壊(thrombolysis)や血管形成術が成功した後に生ずる再閉塞のような症状の発生の重要な原因因子である。心臓発作の患者は、凝塊のフィブリン成分を溶解する組織プラスミノーゲン・アクチベーターやストレプトキナーゼのような血栓崩壊剤で治療するのが普通である。フィブリン溶解に関連する主な併発症は、血小板凝集による再閉塞であり、これは一層の心臓障害を生じ得る。糖タンパク質である（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体は血小板凝集の原因となることが知られているから、これらの受容体をブロックする試薬は血栓崩壊治療後の再閉塞を減少させ又は防止すること及び血栓崩壊の速度を加速することが期待される。このような試薬としては、他の血管閉塞性疾病及び血栓塞栓症の治療にも有用であると期待される。血小板凝集をブロックする一つの取組みは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的なモノクローナル抗体を用いるものである。血小板凝集を阻害しそしてヒト血栓症の治療に有用にみえる、７Ｅ３と命名されたネズミ・モノクローナル抗体が公開された欧州特許出願第２０５，２０７号及び第２０６，５３２号に開示されている。ネズミ抗体がヒト治療にそれを使用する際厳しく制限されるという特徴を有することは当該分野で公知である。外来タンパク質として、ネズミ抗体はその治療効果を減少させ又は破壊する及び／又はアレルギー反応又は感作性過剰反応を患者に引き起こす免疫反応を惹起する。血栓塞栓症におけるこのような治療のやり方で再投与する必要が生ずると、この種の免疫反応の起こる蓋然性が増加する。ヒト定常領域に結合した非ヒト結合領域からなるキメラ抗体は、ネズミ抗体の免疫反応問題を克服する１手段として示唆されてきた。Proc．Natl．Acad．Sci ．USA ，81:6851(1984)及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ８５００３９２号を参照。定常領域は主として抗体分子の免疫反応性に責任があるから、ヒト起源の定常領域を持つキメラ抗体はヒトにおいて抗ネズミ応答を惹起し難いはずである。しかしながら、ヒト定常領域を所望の特異性のネズミ結合領域への連結が免疫反応性を低減するかどうか及び／又はその結果生ずるキメラ抗体の結合能を変えるかどうかは予測できるものではない。本発明の概要本発明は、非ヒト起源の可変領域すなわち抗原結合領域及びヒト起源の定常領域を含む血小板特異的なキメラ免疫グロブリンに関する。キメラ免疫グロブリンは、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体又は他の血小板成分に特異的であってもよい。これらの抗体は血小板に結合しそして血小板凝集をブロックすることができる、従って様々な臨床状態（例えば、血管形成術と同時に行われた血栓崩壊療法の後の状態）で生ずる閉塞又は再閉塞の防止又は低減、及び狭窄又は再狭窄の防止における抗血栓症剤として有用である。本発明の抗血小板抗体はイメージングにおいても有用である。図面の簡単な説明図１は、プローブとしてクローニングされた変動領域を用いた、７Ｅ３モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖ｍＲＮＡのノーザン分析の結果を示す図である。図２Ａ及び２Ｂは、プラスミドｐ７Ｅ３Ｖ_kｈＣ_k（図２Ａ）及びプラスミドｐ７Ｅ３Ｖ_HｈＣ_G4（図２Ｂ）の概略図であって、これらはキメラ７Ｅ３免疫グロブリンのそれぞれ軽鎖及び重鎖をコードするキメラ遺伝子構築物を保持する。図３は、ベクターｐ７Ｅ３Ｖ_kｈＣ_k及びｐ７Ｅ３Ｖ_HｈＣ_G4によりコードされているキメラ７Ｅ３免疫グロブリンの血小板への結合を示す図である。図４は、キメラ７Ｅ３（ｃ７Ｅ３）免疫グロブリンによる血小板凝集の阻害を示す図である。図５は、安定な冠動脈疾病を有する３人の患者における、５分間の注入により０．２５ｍｇ／ｋｇのｃ７Ｅ３・Ｆａｂを静脈投与された後の血漿からのｃ７Ｅ３・Ｆａｂ（γ₁,κ ）の初期クリアランスの迅速さを示す、血漿抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）対時間（日）をプロットしたグラフである。図６（Ａ〜Ｃ）は、抗体（γ₁,κ）の投与後２時間にキメラ７Ｅ３・Ｆａｂ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、０．２０ｍｇ／ｋｇ、又は０．２５ｍｇ／ｋｇ）の１回ボーラス投与の血小板活性に対する効果を要約する図である。用量応答は、血小板活性が受容体遮断（図６Ａ、上）、血小板凝集（図６Ｂ、中）、及び出血時間（図６Ｃ、下）について試験されるとき、明らかに認められる。線は中央値を表す。図７（Ａ〜Ｃ）は、０．２５ｍｇ／ｋｇの１回ボーラス投与で血管形成手術の前に投与されたキメラ７Ｅ３・Ｆａｂ（γ₁,κ）の抗血小板効果の期間を示す図である。線はベースラインのゼロ時間から受容体遮断のための２４時間までの中央値（図７Ａ、上）、血小板凝集（図７Ｂ、中）、及び出血時間（図７Ｃ、下）を示す。図８（Ａ〜Ｃ）は、１１人の患者に０．２５ｍｇ／ｋｇの１回ボーラス投与後にキメラ７Ｅ３・Ｆａｂ（γ₁,κ）の１２時間連続注入（１０μｇ／分）を行った場合の抗血小板活性を要約する図である。線は受容体遮断％について測定した値の中央値（図８Ａ、上）、投与前の血小板凝集の％（ゼロ時間におけるベースライン）（図８Ｂ、中）、及び出血時間（図８Ｃ、下）を表す。図９は、実施例４に記載された４７人の患者に対する、ベースラインから注入の終了後２４時間までのヘマトクリットの変化の絶対値を示す図である。図１０は、３治療グループに対する無差別化の時からの非緊急な反復経皮再血管化手術の確率を示すカプラン−マイエル（Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ）プロットである。図１１は、トライアルにはいった重要なサブグループ（右側にリスト）に対するオッド比（odds ratio）及び９５％信頼間隔を示すグラフである。データは主要効果終了点（死亡、非致命的梗塞症、緊急な血管形成手術又は外科手術、又は無反応性虚血に対する冠動脈ステント（coronary stent）の配置又は大動脈内バルーンポンプ）を示す。また、各サブグループに対する主要終了点の絶対的事象比率は表の左側に示す（事象比率（％））。図１２は、６ヶ月のフォローアップ期間にわたって事象のなかった患者すべての割合を示すグラフである。図１３は、遮断（intervention）に成功し、３０日後まで事象のなかった患者の中における６ヶ月のフォローアップ期間にわたって事象のなかった患者の割合を示すグラフである。図１４は、初期の遮断に成功した患者の中で最初の４８時間後の事象を考慮して６ヶ月のフォローアップ期間にわたって事象のなかった患者の割合を示すグラフである。図１５は、６ヶ月のフォローアップ期間にわたって大動脈関連の血管再形成術（ＰＲＡ、大動脈関連の手術）を試みなかった患者すべての割合を示すグラフである。本発明の詳細な説明本発明のキメラ免疫グロブリンは個々のキメラ免疫グロブリン重鎖とキメラ免疫グロブリン軽鎖とを含む。キメラ重鎖は、ヒト重鎖定常領域に連結した血小板特異的な（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に特異的な）非ヒト抗体の重鎖由来の抗原結合領域を含む。キメラ軽鎖は、ヒト軽鎖定常領域に連結した非ヒト抗体の軽鎖由来の抗原結合領域を含む。本発明の免疫グロブリンは一価、二価、又は多価であってもよい。一価の免疫グロブリンは、キメラ軽鎖とジスルフィド橋で結合したキメラ重鎖から形成されるダイマー（ＨＬ）である。二価の免疫グロブリンは、少なくとも１個のジスルフィド橋で結合した２個のダイマーから形成されるテトラマー（Ｈ₂Ｌ₂）である。多価の免疫グロブリンは、例えば、凝集する重鎖定常領域（例えば、μ重鎖定常領域）を用いて作成することもできる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂ のようなキメラ免疫グロブリン断片も作成することができる。キメラ免疫グロブリンの非ヒト抗原結合領域は血小板に特異的な免疫グロブリンから誘導される。好ましい免疫グロブリンは血小板のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に特異的なものであり、糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体複合体に結合するリガンドをブロックすることができるものである。血栓症は、血管壁の障害部位における血小板の吸着で始まる。血小板の吸着は、暴露された内皮下層にある細胞外マトリックスタンパク質、例えばフォンウイルブラント因子、コラーゲン、フィブロネクチン、ヴィトロネクチン、ラミニンのようなもの）に結合する血小板表面受容体によって媒介される。血小板の吸着により、血小板の単層が形成される。続いて、エピネフリン、ＡＤＰ、コラーゲン、及びトロンビンなどのアゴニストに応答して、血小板の活性化が起こる。活性化により、血小板表面で糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）が暴露されることになる。活性化血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａは、次いでフィブリノーゲンに結合することができるようになり、これは血小板凝集を媒介することができる。フォンウイルブラント因子のような他の吸着性タンパク質へのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの結合も、血小板を交差架橋しそして凝集させる原因となる。従って、フィブリノーゲン又はフォンウイルブラント因子のような吸着性分子のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａへの結合が血小板の凝集の原因となるのは、血栓形成の共通のステップであり、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体をフィブリノーゲン等の分子とＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの相互作用を妨害することができる治療剤開発のための魅力的な標的とする。さらに、抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａキメラ抗体を用いることにより、活性化された血小板の凝集を、血小板の初期吸着を阻害することなく、阻害することができると期待される。血小板凝集のこの選択的阻害は凝集のない血小板吸着が止血の維持に貢献することから、望ましいことである。血小板特異的抗体として適当なものの例としては、７Ｅ３及び１０Ｅ５が挙げられる。欧州特許出願第２０５，２０７号及び第２０６，５３２号を参照せよ。ここの記載は、参照により本明細書に取り込まれる。７Ｅ３抗体（又は同一又は機能的に均等なエピトープに対し反応性を有する抗体）は、それがＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体の複合体型に特異的であるという理由で特に好ましい。ＩＩｂ又はＩＩＩａ成分に特異的なもののようなＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に特異的な他の抗体（７Ｅ３により認識される抗原）も使用することができる。他の血小板抗原に特異的な抗体を用いることができる。例えば、Ｓ１２抗体（J．Biol．Chem.，259:9799-9804(1984); 米国特許第４，７８３，３３０号）のような血小板αグラニュール膜タンパク質ＧＭＰ−１４０に対し反応性を有する抗体を使用することができる。キメラ抗体の抗原結合領域は、非ヒト起源の免疫グロブリンから誘導することができる。ネズミ起源の抗原結合領域が好ましい。それは血小板に対するネズミ抗体、そして特にＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体は入手可能であり、あるいはネズミ系で作成することができるからである。他の動物やげっ歯類は抗原結合領域の別の起源となる〔参照、例えば、Newman et al.,Bio/technology，10: 1455-146 0(1992)〕。一つの態様においてはキメラ免疫グロブリンの抗原結合領域は、特異的又は選択的抗原結合をするのに十分な非ヒト起源の血小板特異的な免疫グロブリンの一部、例えば非ヒト免疫グロブリン由来の１個以上の相補的決定領域又はそれらの部分を少なくとも含んでいる（参照、例えば、Winter，米国特許第５，２２５，５３９号、欧州特許第０，２３９，４００号、英国特許第２，１８８，６３８号；Adair et al.,国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号公報；Jolliff e et al.，国際公開第ＷＯ９１／０９９６６号公報）。別の態様では、キメラ免疫グロブリンは、ヒト重鎖定常領域の少なくとも一部分に連結されている非ヒト免疫グロブリンの重鎖由来の可変領域を含む少なくとも１つのキメラ重鎖、及びヒト軽鎖定常領域の少なくとも一部分と共有結合している非ヒト免疫グロブリンの軽鎖由来の可変領域を含む少なくとも一つのキメラ軽鎖を含んでいる。可変領域及び定常領域の他の組み合わせも可能である（参照、米国特許第５，１６９，９３９号）。キメラ抗体の定常領域はヒト免疫グロブリン由来のものである。重鎖定常領域は５個のアイソタイプ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、又はミューのいずれかから選択することができる。さらに、種々のサブクラス（重鎖のＩｇＧサブクラスなど）の重鎖は異なるエフェクター機能を担っている。従って、所望の重鎖定常領域を選択することにより、所望のエフェクター機能を有するキメラ抗体を作成することができる。好ましい定常領域はガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）及びガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖定常領域はカッパ型とラムダ型とがあり得る。一般に、キメラ抗体は、キメラ免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖成分のおのおのに対し、ヒト定常領域の少なくとも一部をコードする第二のＤＮＡセグメントに連結した非ヒト起源の血小板特異的な可変領域の少なくとも機能的部分（例えば、連結セグメントと共に機能的に配列された可変領域）をコードする第一のＤＮＡセグメントを含む融合遺伝子を調製することにより作成される。融合遺伝子のそれぞれは、発現ベクター中に組み込まれ又は挿入され、融合遺伝子を発現可能な形で含む発現ベクターができあがる。一つの態様では、抗原結合領域を含むＤＮＡを介入配列を介して定常領域に共有結合させる。別の態様では、１個以上の介入配列を欠いている構築物を構築し取得することができる。次に、遺伝子産物を発現することができる受容細胞をこの遺伝子でトランスフェクトする。トランスフェクトされた受容細胞を、取り込まれた遺伝子の発現が行われるような条件下で培養し、そして発現された免疫グロブリン又は免疫グロブリンの鎖を回収する。Ｉｇ軽鎖及びＩｇ重鎖の可変領域をコードする遺伝子は、血小板特異的抗体を産生するリンパ系細胞から得ることができる。例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系は、本発明のキメラ抗体のための免疫グロブリン可変領域の材料を提供する。他のゲッ歯類細胞系も入手可能である。細胞系はゲッ歯類動物にヒト血小板又はＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体含有成分又は血小板の一部をチャレンジし、抗体産生細胞とミエローマ細胞系との融合ハイブリッド細胞を形成させ、該ハイブリッドをクローニングし、そして血小板又は糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対する抗体を産生するクローンを選択することにより作成することができる。定常領域は、標準的クローニング技法によりヒト抗体産生細胞から得ることができる。又は、二つのクラスの軽鎖及び五つのクラスの重鎖を表す遺伝子がクローニングされたので、ヒト起源の定常領域はこれらのクローンから容易に入手することができる。Ｆ（ａｂ’）₂及びＦａｂなどのキメラ抗体結合断片は、切断型でキメラ重鎖遺伝子を設計することにより作成することができる。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は重鎖のＣＨ₁ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むであろう。また、このような断片はキメラ免疫グロブリンの酵素的切断によって取得することができる。例えば、パパイン又はペプシンによる切断により、それぞれＦａｂ断片又はＦ（ａｂ’）₂断片を作成することができる。好ましくは、キメラ軽鎖及びキメラ重鎖（又はそれらの部分）をコードする融合遺伝子は受容細胞を同時トランスフェクトするために使用することができる二つの異なる発現ベクター中でアセンブルする。各ベクターは、二つの選択可能な遺伝子−−細菌系での選択のためのもの及び真核細胞系での選択用のもの−−を含んでいる。ここで各ベクターは異なる対の遺伝子を含んでいる。これらのベクターにより、細菌系で融合遺伝子の産生及び増幅を行い、続いて真核細胞に同時トランスフェクション及び同時トランスフェクトされた細胞の選択を行う。細菌系で選択可能な遺伝子の例としては、アンピシリン耐性を与える遺伝子及びクロラムフェニコール耐性を与える遺伝子が挙げられる。真核細胞のトランスフェタントの選択のための２つの選択可能遺伝子としては、次のものが好ましい。（ｉ）キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）、及び（ｉｉ）Ｔｎ５からのホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏと命名）が挙げられる。ｇｐｔを用いる選択は、この遺伝子によりコードされる酵素のプリンヌクレオチド合成のため基質としてキサンチンを利用する能力に基づく。類似の内因性酵素は利用できない。キサンチン及びイノシンモノホスフェートのキサンチンモノホスフェートへの転換を遮断するミコフェノール酸を含む培地中で、ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞のみが生き残ることができる。ｎｅｏ遺伝子の産物は、真核細胞中での抗生物質Ｇ４１８及び同クラスの他の抗生物質によるタンパク質合成の阻害をブロックする。この二つの選択方法は、二つの異なるＤＮＡベクターに乗せて真核細胞中に導入された免疫グロブリン鎖遺伝子の発現を選択するために同時に又は逐次的に用いることができる。好ましい受容細胞系はミエローマ細胞である。ミエローマ細胞は、トランスフェクトされたＩｇ遺伝子によりコードされる免疫グロブリンを合成し、アセンブルしそして分泌することができる。さらに、これらは免疫グロブリンのグリコシル化のための機構を有している。特に好ましい受容細胞はＳｐ２／０のようなＩｇ−非産生ミエローマ細胞系である。これらの細胞系は、トランスフェクトされた免疫グロブリン遺伝子によりコードされる免疫グロブリンのみを生産する。ミエローマ細胞は培地で増殖させることもできるし、マウスの腹膜内において増殖させることもできる、この場合分泌された免疫グロブリンは腹水から得ることができる。Ｂリンパ球のようなリンパ球またはハイブリドーマ細胞も好適な受容細胞となり得る。免疫グロブリンをコードする遺伝子を含むベクターでリンパ球をトランスフェクトする方法は数種ある。ＤＮＡをリンパ球に導入するための好ましい方法は、電気穿孔法である。この方法では、取り込まれるＤＮＡの存在下に受容細胞を電気パルスにかける。例えば、Potter et al., Proc．Natl．Acad．Sci．USA，81: 7161(1984)を参照。ＤＮＡを導入する別の方法は、プロトプラスト融合法である。この方法では、キメラＩｇ遺伝子を含む組み換えプラスミドを持つ細菌の細胞壁を剥がすためにリゾチームを使用する。得られたスフェロプラストをミエローマ細胞とポリエチレングリコールを用いて融合する。プロトプラスト融合法実施後にトランスフェクタントを選択し単離する。ＤＮＡを多くの細胞タイプに導入するために使用できる別の技術は、リン酸カルシウム沈澱法である。キメラ免疫グロブリン遺伝子は、細菌や酵母などの非リンパ球細胞においても発現させることができる。細菌内で発現させた場合、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖は封入体の一部となる。従って、これらの鎖は単離し精製した後、機能的免疫グロブリン分子の中に組み立てられなければならない。E．coliにおける発現については、E．coliからシグナル配列を含む融合蛋白として分泌させることを含めて、他の方法も利用できる（例えば、Pluckthun，A., Bio/Technology，9: 545-551(1991); Skerr a，A．et al.，Bio/Technology，9: 273-278(1991)を参照）。血小板特異的キメラ免疫グロブリンの有用性本発明の血小板特異的キメラ抗体は抗血栓治療剤として有用である。本発明のキメラ抗体（またはそれらの断片）は、たとえば血栓を有する患者や血栓形成の危険がある患者の血小板凝集や血栓形成を抑制する目的に使用することができる。本発明の抗体はまた、血小板凝集によって引き起こされる周期性血流変動（血栓形成や血栓再形成に先立ち起きることがある）を抑制する目的にも使用することができる。本発明の抗体は血栓形成または血栓再形成（再閉塞）の予防を図る様々な状況において使用することができる。さらに、本発明の抗体は狭窄または再狭窄の抑制（減少、遅延、または予防）を図る様々な状況において使用することができる。たとえば、冠状動脈疾患を有する患者やその危険がある患者は、血管の閉塞、再閉塞、狭窄、および／または再狭窄を抑制する目的で本発明の抗血小板キメラ抗体断片（たとえば抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａキメラ抗体、又は好ましくはキメラ７Ｅ３ＦａｂやＦ（ａｂ’）₂など該抗体の断片）の有効量投与が奏効しうる。本発明の抗体は、たとえば肺塞栓症、一過性虚血発作（ＴＩＡｓ）、深部血管血栓症、冠状動脈バイパス術、人工弁または人工血管（たとえば自家、非自家、または合成血管移植の場合）の挿入手術における血栓予防の目的で個体（たとえばヒトなどの哺乳動物）に投与することができる。本発明の抗体はまた、バルーン法、冠状動脈切除術、レーザー血管形成術などの適当な方法によって実施される血管形成術の術前、術中、または術後の血小板凝集および血栓症を予防する目的で個体に投与することもできる。抗体は血管形成術に先立ち投与（血管形成術前投与）してもよいし、血管形成術中、または血管形成術後に投与してもよい。上記処置により血栓症を予防することができるので、死亡、心筋梗塞、またはＰＴＣＡや冠状動脈バイパス術を要する再発性虚血発作（急性虚血発作）などの血管形成術に伴う血栓症合併症の発生率を低下させることができる。また、上記処置は、死亡、心筋梗塞、またはＰＴＣＡや冠状動脈バイパス術（血管再生術）を要する再発性虚血発作などの冠状動脈介入手術（たとえば血管形成術）に伴う虚血発作や合併症の発生率を長期的に低下させるという利益をもたらしうるが、この発生率の低下は狭窄や再狭窄の減少、遅延、または予防の指標となる。たとえば実施例４に示すように、血管形成術（経皮経管的冠状動脈形成術、ＰＴＣＡ）に先立ち抗血小板キメラ抗体（キメラ７Ｅ３Ｆａｂ断片）をアジュバント療法で投与したところ、出血時間を延長させアゴニスト誘導性血小板凝集（生体外血小板凝集測定法で測定）を低下させるという効果が見られた。実施例４および実施例５に示した実験結果から、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａの阻害とｃ７Ｅ３抗体（Ｆａｂ断片）による凝集抑制はヒトにおける生体内抗血栓作用をもたらすものと思われる。キメラ７Ｅ３抗体断片の投与に関する無作為化二重盲検プラセボ対照比較試験の結果を実施例６および実施例７に示した。実施例６に示したデータから、血管形成術を受けて剥離閉鎖（再閉塞）の危険が高まっている患者にキメラ７Ｅ３抗体断片を投与すると、剥離閉鎖（再閉塞）が予防され、急性虚血発生率を低下させうることがわかる。実施例７でさらに説明するように、血管形成術を受けて剥離閉鎖（再閉塞）の危険が高まっている患者にキメラ７Ｅ３抗体断片を投与すると、後で起こりうる再狭窄を減少させたり遅延させたり及び／又は予防することができる。抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａキメラ抗体断片を投与すると非急性虚血合併症の発生率が低下するが（実施例７参照）、この長期的効果はこれまで見られなかったものである。ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に選択的に結合する他の化合物を用いて狭窄や再狭窄を予防または減少させることによって非急性虚血合併症の発生率を下げるという臨床効果を得ることができる。また、これらの化合物の投与により閉塞や再閉塞を予防することもできる。これらの化合物の具体例としては、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニスト、免疫グロブリン系または非免疫グロブリン系ペプチド又はタンパク質（たとえば合成のものや組み換え体など）、それらの類似体、および核酸や核酸類似体などが挙げられる。冠状動脈疾患を有する患者やその危険がある患者は、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に選択的に結合することで血管の閉塞、再閉塞、狭窄、および／または再狭窄を抑制する化合物の有効量投与が奏効しうる。投与血小板が凝集すると凝固カスケードが活性化され、さらに安定なフィブリン網状構造と閉塞性クロットができるが、これらは血栓溶解剤で溶解させることができる。本発明の抗体またはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に選択的に結合する化合物は、たとえば血栓溶解後に起こりうる再閉塞を予防または減少させたりクロット溶解を促進させたりする目的で、単独で個体（たとえばヒト）に投与してもよいし、プラスミノーゲン活性化剤（たとえば組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、組み換え組織プラスミノーゲンアクチベーター）、抗凝固剤（たとえば抗トロンビン剤）などの血栓溶解剤やアスピリン、ヘパリン、ヒルローグ、ヒルジン、またはクマリン抗凝固剤（たとえばワーファリン）などの抗血小板剤とともに投与してもよい。上記化合物、抗体またはその断片は、閉塞または再閉塞を引き起こしうる血小板凝集を予防するのに十分な量および／または狭窄または再狭窄を遅延または予防するのに十分な量で、血栓溶解剤、抗トロンビン剤、抗凝固剤、または抗血小板剤の投与の前、同時、または後に投与することもできる。有効量（すなわち血小板凝集を抑制することによって血栓形成または再形成を抑制するのに十分な量や狭窄、再狭窄、または虚血発作の減少、遅延、または予防に十分な量など目的の治療効果を得るのに十分な量）の化合物、抗体または抗体断片を、無菌生理食塩水などの薬学的に許容されるビヒクルとともに非経口的に、好ましくは静脈内投与によって、投与することができる。また、緩衝媒体を添加してもよい。抗体処方は、安定剤（たとえばポリソルベート８０、ＵＳＰ／ＮＦ）などさらに別の添加物を含むこともできる。抗体は単回投与してもよいし、連続投与してもよいし、複数回輸液投与（たとえばボーラス注射後に連続輸液を行なう）してもよい。あるいは、該化合物または抗体は放出制御機構（たとえばポリマーまたはパッチ送達系による）など適当な方法によって投与することもできる。投与量は臨床症状、個体の体重、他の薬物（たとえば血栓溶解剤）の投与の有無など様々な要素によって決まる。抗血小板抗体を使用する療法を繰り返すと、薬物に関連する血小板増加が引き起こされることがある。これは、生体が抗体被覆血小板を異物として認識してそれらに対する抗体を生成した後に、正常より短時間に網状内皮系によってそれらを消失させようとすることに起因するものである。血小板表面上にはＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体が非常に高密度で存在し（血小板１個あたり受容体〜８０，０００個）、多数の血小板が循環しているので（１μｌあたり０．２５〜０．５ｘ１０⁶個）、血小板増加は抗血小板抗体療法の重要な合併症となっている。キメラ抗血小板（たとえばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）抗体を使用すればこの問題を防止することができる。本発明のキメラ抗血小板抗体は、他の方法では抗血小板抗体投与に伴う発生の可能性がある血小板増加を抑制（減少または予防）することができる。たとえば、キメラ７Ｅ３Ｆａｂを投与すると、血小板増加はほとんど見られていない（たとえば実施例６および実施例７参照）。次に、キメラ７Ｅ３Ｆａｂ抗体断片をヒトに投与すると、ネズミの場合より誘導免疫の発生率が驚くほど低下する（たとえば実施例４および実施例７参照）。血小板と結合したネズミ抗血小板キメラ抗体の大部分はたとえばＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体を介して血小板表面に結合して免疫系のアクセスを不可能にする結果、そのキメラ抗体は同じエピトープに対するヒト抗体と機能的に区別できなくなる。したがって、本発明のその他のキメラ抗血小板抗体もネズミ抗原結合領域を有しているにも関わらずやはり免疫原性を示さない。本発明の血小板特異的キメラ免疫グロブリンは血栓の画像化にも有用である。この目的のためには、一般に抗体断片が好ましい。上記のように、キメラ重鎖遺伝子の切断型を設計して免疫シンチグラフィー画像化用キメラ免疫グロブリン断片（たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（Ａｂ’）₂）を作成することができる。これらの分子を直接、またはＤＴＰＡなどの結合キレート化剤を用いて、¹³ ¹ ヨウ素、¹²⁵ヨウ素、^99mテクネチウム、¹¹¹インジウムなどの放射性同位体で標識して放射免疫シンチグラフィー剤を作成することもできる。あるいは、放射金属結合（キレート化）ドメインをキメラ抗体部位に作成して標識部位としてもよい。すなわち、ヒト以外の血小板特異的可変領域とヒト定常領域（好ましくは切断されたもの）とメタロチオネインなどの金属結合タンパク質由来の金属結合ドメインとを有するタンパク質としてキメラ免疫グロブリンを設計することができる。上記血小板特異的キメラ免疫グロブリンまたはその断片を血栓を有する疑いのある患者に投与する。標識免疫グロブリンの血栓部位局在化に十分な時間が経過した後で、標識剤から発生するシグナルをガンマカメラなどの光学的走査装置を用いて検出する。次いで、検出されたシグナルを血栓画像へと変換する。得られた画像により、生体内の血栓の位置を知り、適当な治療法を計画することが可能となる。以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。実施例実施例１血小板特異的キメラＩｇＧ４の作成Ａ．基本原理７Ｅ３ハイブリドーマからの重鎖および軽鎖遺伝子の可変領域クローン化は、可変領域と機能的再配列（および発現）させたＩｇ遺伝子の対応するＪ（連結）領域の間のゲノムにおける連鎖を利用して行なった。Ｊ領域ＤＮＡプローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることで、Ｊ領域に結合したＤＮＡを単離することができる。生殖系列配置（再配列されていないもの）状態のＤＮＡもＪプローブにハイブリダイズするが、可変領域配列とは結合せず、単離クローンの制限酵素分析によって同定することができる。したがって、クローン化は、Ｊ_HとＪ_Kを用いて再配列重鎖および軽鎖遺伝子から可変領域を単離するやり方で実施した。これらのクローンの配列が７Ｅ３ハイブリドーマ中で発現されているか否かノーザンブロッティング分析で調べた。発現された配列を含むクローンをヒト定常領域を保持する発現ベクターに導入し、マウス骨髄腫細胞にトランスフェクトして抗体産生の有無を調べた。次に産生細胞から産生された抗体の結合特異性と機能性を７Ｅ３ネズミ抗体と比較した。細胞系誘導体ネズミハイブリドーマ７Ｅ３を１９８５年５月３０日付けでAmer ican Type Culture Collection（12301 Parklawn Drive，Rockville，MD 20852 ）に寄託した。生存性試験で良好な結果が得られた後、寄託番号ＨＢ８８３２が付与された。Ｂ．材料および方法特記ないかぎり、以下に示す量と百分率はいずれも重量数であり、温度の単位は摂氏である。重鎖ゲノムライブラリーの構築７Ｅ３ハイブリドーマから重鎖可変領域を単離するために、ファージラムダベクターｇｔ１０を用いてサイズ分画ゲノムライブラリーを構築した。Ｊ_Hプローブを用いてＥｃｏＲＩ消化７Ｅ３ＤＮＡのサザーンブロッテイング分析を行なったところ、再配列重鎖座位に相当する位置に単一の３．５ｋｂバンドが検出された。この断片は７Ｅ３重鎖可変領域遺伝子を含んでいる可能性が高かった。７Ｅ３ハイブリドーマ細胞から高分子量ＤＮＡを単離し、制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩで完全消化した。次いで、ＤＮＡを０．７％アガロースゲル上で分画し、３〜４ｋｂのサイズ範囲のＤＮＡをゲルから直接単離した。フェノール／クロロホルム抽出とセファデックスＧ−５０ゲル濾過を行なった後、上記３〜４ｋｂ断片をラムダｇｔ１０アーム（Promega Biotech，Inc．社製）に連結し、Promega Biotech社製パッカジーン（Packagene ）を用いてイン・ビトロでファージ粒子に封入した。このライブラリーにつき、³² Ｐ標識Ｊ_Hプローブを用いて１５０ｍｍペトリ皿１枚あたり約３０，０００個のプラーク密度で直接スクリーニングを行なった。５ＸＳＳＣ、５０％ホルムアミド、２Ｘデンハルト試薬、２００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡ中、４２℃で１８〜２０時間にわたりプラークハイブリダイゼーションを行なった。最後に０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で洗浄した。オートラジオグラフィー実施後に陽性クローンを同定した。軽鎖ゲノムライブラリーの構築７Ｅ３軽鎖の可変領域を単離するために、ラムダベクターＥＭＢＬ−３中にゲノムライブラリーを構築した。高分子量ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａで部分消化し、１０〜４０％ショ糖密度勾配上でサイズ分画を行なった。１８〜２３ｋｂのＤＮＡ断片をＥＭＢＬ−３アームと連結し、パッカジーン（Pack agene）を用いてイン・ビトロでファージ粒子に封入した。このライブラリーにつき、Ｊ_Kローブを用いて１５０ｍｍペトリ皿１枚あたり３０，０００個のプラーク密度でスクリーニングを行なった。ハイブリダイゼーション条件と洗浄条件は重鎖ライブラリー構築の場合と同じである。ＤＮＡプローブマウス重鎖Ｊ_Hプローブは、Ｊ３セグメントとＪ４セグメントの両者を有する２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片である。マウス軽鎖Ｊ_Kプローブは、５つのＪ_Kセグメントをすべて有する２．７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片である。Amers ham，Inc.社から入手したキットを用いるニックトランスレーションにより³²Ｐ標識プローブを作成した。セファデックスＧ−５０カラムを用いる遠心分離により遊離ヌクレオチドを分離した。上記プローブの比活性は約１０⁹ｃｐｍ／μｇであった。ノーザンブロッテイング分析１５μｇの全細胞ＲＮＡを１％アガロース／ホルムアルデヒドゲル上の電気泳動に付し（マニアティスら（Maniatis，et al.）、Molecular Cloning）、ニトロセルロースに移した。ブロットを５０％ホルムアミド、２Ｘデンハルト液、５ＸＳＳＣ、および２００μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡ中、４２℃で１０時間にわたりニックトランスレートＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。最終洗浄条件は０．５ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃とした。エレクトロポーレーションを用いるＤＮＡトランスフェクション臭化エチジウム／塩化セシウム勾配中で平衡状態に達するまで遠心分離を２回行なうことによって、トランスフェクトさせようとするプラスミドＤＮＡを精製した。氷上で１０〜５０μｇのプラスミドＤＮＡをＰＢＳ懸濁８ｘ１０⁶ＳＰ２／０細胞に添加し、この混合物をバイオラッド社（Biorad）製エレクトロポーレーション装置に入れた。エレクトロポーレーションは２００ボルトで行ない、細胞を９６穴マイクロタイタープレートに置いた。４８時間後に適当な薬物選択を行ない、１〜２週後に薬物抵抗性クローンを同定した。抗体産生量の定量精製ＩｇＧを用いて求めた標準曲線を利用し、粒子濃度蛍光免疫測定法［ジョリーら（Jolley，M.E. et al．）、J．Immunol．Meth．67:21(1984)］により組織培養上清のＩｇＧタンパク質含有量を測定した。ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体被覆ポリスチレンビーズおよびフルオレセインコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体を用いて、ヒト定常領域を有するキメラ７Ｅ３抗体の濃度を求めた。測定は、自動装置（Pandex Laboratories，Inc．社）を用いて行なった。血小板特異的キメラＩｇＧ４抗体の精製組織培養上清をダイアフローＹＭ１００限外濾過膜（Amicon社）で濃縮し、プロテインＡセファロースカラムに負荷した。クエン酸ナトリウムのｐＨ勾配６．５〜３．５を用いてキメラ抗体をプロテインＡカラムから溶出させた。精製抗体をダイアフローＹＭ１００限外濾過膜で濃縮した。抗体濃度は２８０ｎｍにおける吸光度測定で求めた。結合抑制度の測定精製抗体（ネズミ７Ｅ３抗体またはキメラ７Ｅ３抗体）をヨウ素放射標識７Ｅ３抗体と競合させ、ヒト血小板結合度を比較した。クエン酸添加ヒト全血を１８７５ｒｐｍで３．５分間遠心分離することで、高血小板含有血漿（ＰＲＰ）を作成した。¹²⁵Ｉ標識７Ｅ３抗体（１５０，０００ｃｐｍ）を適当に希釈した精製試験抗体に添加し、１５０μｌのＰＲＰを添加することで反応を開始させた。室温で１〜２時間培養し、０．４ｍｌのマイクロ遠心管内の３０％ショ糖中、１２，０００ｇで４分間遠心分離することで、抗体結合血小板を遊離抗体から分離した。血小板／抗体ペレットを含む遠心管先端部を切断し、ガンマカウンターで計測した。ヨウ素放射標識７Ｅ３とキメラ７Ｅ３の間の血小板結合競合の程度を、ヨウ素標識７Ｅ３ＩｇＧと未標識７Ｅ３ＩｇＧの間の競合度と比較した。血小板凝集の抑制精製７Ｅ３抗体またはキメラ７Ｅ３抗体をクエン酸処理ヒト全血に添加し、３７℃で１０分間保温した。コラーゲンまたはＡＤＰによる活性化を行なった後、全血凝集計（Chronolog Corp.社）を用いて血小板凝集速度を測定した。Ｃ．結果血小板特異的可変遺伝子領域のクローン化Ｊ_HおよびＪ_Kプローブを用いて約１００万個のプラークをスクリーニングした後、重鎖および軽鎖ライブラリーからそれぞれ数個の陽性クローンを単離した。少なくとも３回のプラーク精製手順を繰り返した後、各陽性クローンのバクテリオファージＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ（重鎖クローン）またはＨｉｎｄＩＩＩ（軽鎖クローン）のいずれかで消化し、１％アガロースゲル上で分画した。ＤＮＡをニトロセルロースに移し、ブロットをＪ_H（重鎖）またはＪ_Kの³²Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。重鎖については、Ｊ_Hプローブとハイブリダイズする３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ断片を有する２個のクローンが得られた。Ｊ_Kプローブでは、３．０ｋｂと６．０ｋｂの２つのサイズクラスのＨｉｎｄＩＩＩ断片が同定された。７Ｅ３ハイブリドーマ由来の真性重鎖および軽鎖可変領域に対応するクローン化ＤＮＡは上記ハイブリドーマから単離したｍＲＮＡとハイブリダイズするはずである。重鎖座位または軽鎖座位にある非機能性ＤＮＡ再配列は発現されないはずである。図１に、それぞれ７Ｅ３ハイブリドーマ由来の適当なサイズのｍＲＮＡとハイブリダイズする３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ推定重鎖断片と６．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ推定軽鎖断片の存在の証拠となるノーザンブロッティング分析結果を示した。図１に示した手順で、サブクローン化断片をニックトランスレーションで³²Ｐ標識し、ＳＰ２／０（７Ｅ３ハイブリドーマの融合相手）由来の全ＲＮＡを含むノーザンブロットとハイブリダイズさせた。３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ重鎖断片は７Ｅ３ＲＮＡ中の２ｋｂのｍＲＮＡとハイブリダイズしたが、ＳＰ２／０ＲＮＡ中ではハイブリダイズしなかった。同様に、６．０ｋｂの軽鎖ＨｉｎｄＩＩＩ断片は７Ｅ３ＲＮＡ中の１２５０ｂｐのｍＲＮＡとハイブリダイズしたが、ＳＰ２／０ＲＮＡ中ではハイブリダイズしなかった。これらはそれぞれ重鎖ｍＲＮＡと軽鎖ｍＲＮＡの正しいサイズである。クローン化ＤＮＡ断片は７Ｅ３ハイブリドーマ中で発現される配列を含んでいるので、これらのデータは、上記クローンが７Ｅ３ハイブリドーマ由来真性可変領域配列を有していることを示唆している。ただ、最終的な機能試験では、これらの配列を適当な定常領域配列と組み合わせると、ネズミ７Ｅ３抗体のものと類似の親和性と特異性を有する抗体が合成されることがわかる。ベクターおよび発現系７Ｅ３ハイブリドーマからクローン化した推定軽鎖および重鎖Ｖ遺伝子を、既報［サンら（Sun，L．et al.）、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:214-218(1987 )］の発現ベクター中でヒトκおよびＧ４定常領域遺伝子に連結した。ｐＳＶ１８４ΔＨｎｅｏ１７−１ＡＶκｈＣκの１７−１ＡＶκＨｉｎｄＩＩＩ断片を、７Ｅ３由来の推定軽鎖可変領域遺伝子に対応する６．０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片で置換した。同様に、ｐＳＶ２ΔＨｇｐｔ１７−１ＡＶ_H−ｈＣ_G4の１７− １ＡＶ_HＥｃｏＲＩ断片を、７Ｅ３由来の推定重鎖Ｖ領域遺伝子に対応する３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片で置換した。生じたプラスミドをそれぞれｐ７Ｅ３Ｖ κｈＣ_Hκおよびｐ７Ｅ３Ｖ_HｈＣ_G4と命名し、その構造を図２に示した。キメラ重鎖および軽鎖遺伝子を発現させるために、上記２つのプラスミドを同時に非産生性マウス骨髄腫瘍細胞系ＳＰ２／０にトランスフェクトした。軽鎖プラスミドはＧ４１８抵抗性を付与し、重鎖プラスミドはミコフェノール酸抵抗性を付与するので、各プラスミド由来の遺伝子を保持発現するクローンを得るための二重選択を行なうことができる。Ｇ４１８とミコフェノール酸に対する抵抗性を有するコロニーから安定細胞系を樹立し、両薬物の存在下でこれらを維持した。これらの細胞系の組織培養上清について、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体で被覆したポリスチレンビーズおよび同じ抗体をフルオレセイン標識したものを用いる粒子濃度蛍光免疫測定法により、抗体の有無を分析した。調べた最初の１０種類の細胞系から、約２μｇ／ｍｌを産生する１つの細胞系（ｃ −７Ｅ３Ｆ６と命名）を選択し、さらに試験した。血小板結合活性測定プロテインＡ−セファロースカラムを用いてｃ−７Ｅ３Ｆ６抗体を精製した後、抗体を濃縮し、血小板結合活性測定でネズミ７Ｅ３ＩｇＧと比較した。図３に、ネズミ７Ｅ３とｃ−７Ｅ３Ｆ６（推定キメラ抗体）は、放射標識７Ｅ３との血小板結合競合度が同程度であることを示している。結合曲線が重なり合うので、ネズミ７Ｅ３とキメラ７Ｅ３の結合特性は本測定基準では同じであることがわかる。ｃ−７Ｅ３Ｆ６による血小板凝集の抑制試験抗体のヒト血小板凝集抑制能力を測定する機能測定法において、精製ｃ− ７Ｅ３Ｆ６とネズミ７Ｅ３を比較した。測定結果を図４に示したが、抗体濃度が同じ場合、両者は同程度にコラーゲン誘導性血小板凝集を抑制することがわかる。ｃ−７Ｅ３Ｆ６はＡＤＰ誘導性血小板凝集も同程度に抑制する。血小板結合と血小板凝集抑制の測定結果から次のことがわかる。（１）７Ｅ３ハイブリドーマから真の軽鎖可変領域遺伝子がクローン化された。（２）ヒト定常領域でネズミ定常領域を置換しても、上記測定法で測定した７Ｅ３可変領域結合性や機能性には影響がない。フィブリノーゲン被覆ビーズ測定キメラｃ−７Ｅ３Ｆ６抗体は、抗体の血小板／フィブリノーゲン被覆ビーズ間凝固抑制能力を測定する定性的機能測定において陽性であることが知られている［コルラーら（Coller，B．et al．）、J．Clin．Invest．73:325-338(1983)］。実施例２キメラＩｇＧ１およびＩｇＧ３の作成１７−１Ａ重鎖または軽鎖可変領域断片を対応する７Ｅ３可変領域断片で置換することによって、ネズミ７Ｅ３由来重鎖の可変領域をコードするＤＮＡセグメントを、発現ベクターｐＳＶ２ΔＨｇｐｔ１７−１ＡＶ_H−ｈＣ_G1およびｐＳＶ２ΔＨｇｐｔ１７−１ＡＶ_H−ｈＣ_G3［サンら（Sun et al.）、Proc．Natl．Aca d．Sci．USA 84: 214-218(1987)］上に存在するヒトγ１およびγ３定常領域に連結した。生じたキメラ重鎖遺伝子をキメラ軽鎖遺伝子とともにＳＰ２／０細胞にトランスフェクトし、γ１，Ｋおよびγ３，Ｋ抗体を分泌する安定細胞系を樹立した。実施例３ヒトにおけるキメラ７Ｅ３Ｆａｂの用途に関する初期研究キメラ７Ｅ３Ｆａｂ断片の作成精製キメラ７Ｅ３ＩｇＧ（ガンマ１重鎖、カッパ軽鎖）をタンパク分解酵素パパインで酵素消化することでキメラ７Ｅ３（ｃ７Ｅ３）のＦａｂ断片を作成した。該Ｆａｂ断片は他の消化断片や他の汚染成分（たとえばタンパク質、核酸、ウイルス）を含まない生成物を得るべく考案された一連の精製工程によって単離した。最終生成物は、０．１５Ｍの塩化ナトリウムおよび０．０１Ｍのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．２）１ｍｌあたり２ｍｇのモノクローナルキメラ７Ｅ３Ｆａｂを含む無菌非発熱原性溶液として作成した。一部の調製物では、最終濃度０．００１％（ｗ／ｖ）となるようポリソルベート８０を添加した。生成物は使用前に０．２２ミクロンのタンパク質結合性の低いフィルターで濾過した。生成物は２〜８℃で保存した。薬物動態：ヒトにおけるｃ７Ｅ３Ｆａｂの血漿クリアランス３名の安定型冠動脈疾患の患者でキメラ７Ｅ３（ｃ７Ｅ３）Ｆａｂの血漿クリアランスを調べた。０．２５ｍｇ／ｋｇ用量のｃ７Ｅ３Ｆａｂを５分間かけて静脈内輸液投与し、２分〜７２時間後に血液試料を経時採取した。抗体の特定部分が血漿中に未結合状態で存在することが予想された。この未結合抗体成分を定量するために、迅速に血漿を血小板と分離し余分な生体外結合を防止する必要があった。遊離ｃ７Ｅ３Ｆａｂの血漿中濃度は固相酵素免疫測定法（ＥＩＡ）で測定した。この測定では、ウサギ抗血清から精製したアフィニティー単離抗ネズミ７Ｅ３ＩｇＧを固相捕捉用に使用し、同じウサギ抗７Ｅ３抗体調製物のビオチン化誘導体を利用した検出系を用いた。結果を表１に示した。７Ｅ３の注射量全部が血漿中に遊離抗体として検出されるとすれば、理論的最高抗体濃度は約６．２５μｇ／ｍｌ（０．２５ｍｇ／ｋｇを１ｋｇあたり４０ｍｌの血漿量で割ったもの）となるはずであるが、注射抗体の大部分は血小板と結合するので、実際にはこの理論的最大濃度に達することはなかった。実際、もっとも早い段階の測定では（２分後）、ｃ７Ｅ３Ｆａｂの平均血漿中濃度（ｎ＝２）は２．４３μｇ／ｍＬであったが、この値は最高血漿中濃度（Ｃmax）として見られた数字と同じである。その後の時点で得られたデータから、ｃ７Ｅ３Ｆａｂの血漿中濃度は当初急速に低下することがわかる。１時間および２４時間後の時点では、血漿中に残留する投与抗体の量（ｎ＝３）はそれぞれ０．５μｇ／ｍＬと０．１μｇ／ｍＬであった。図５に示した血漿中抗体濃度（ｎｇ／ｍＬ）の経時変化曲線から、３名の患者いずれにおいてもｃ７Ｅ３Ｆａｂの初期血漿クリアランスが急速に起きることがわかる。ｃ７Ｅ３Ｆａｂ断片の薬物動態特性を調べる予備分析を行なった。いくつかの混合（無作為効果および固定効果）直線モデルならびに標準２成分モデルおよび非成分モデルを含むいくつかのモデルを用いて、血漿中濃度データをあてはめてみた。遊離血漿抗体データは標準薬物動態モデルにはよくあてはまらなかった。ｃ７Ｅ３Ｆａｂの作用部位は血小板上に存在する受容体であるから、遊離抗体の血漿中濃度が作用部位におけるその濃度と無関係であることは全く予想されないわけではない。ｃ７Ｅ３Ｆａｂの初期の血漿クリアランスが急速であることは、抗体が血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に急速に結合することを一部反映している。調べたモデルのうち無作為効果直線モデルは、血漿濃度データに最もよくあてはまることがわかった。このモデルを用いて測定した薬物動態測定項目のＣｌｐ、Ｖｄ、およびｔ_1/2の予備値を表２に示した。ヒトにおける尿中*** ０．２５ｍｇ／ｋｇのｃ７Ｅ３Ｆａｂによる静脈内注射治療を行なった３名の安定型冠動脈疾患の患者から尿試料を採取した（これら３名の患者の血漿クリアランスデータについてはすでに論じた通りである）。以下の時点での蓄尿全量を採取した。すなわち、注射後０〜２時間、２〜６時間、６〜１２時間、および１２〜２４時間である。また、投与前の尿試料も採取した。採取した尿の代表的試料について、上記ＥＩＡ法を少し改変したものを用いて、遊離Ｆａｂの有無を分析した。いずれの場合も、ｃ７Ｅ３Ｆａｂは尿中に検出されなかった。前臨床毒性試験キメラ７Ｅ３Ｆａｂを用いて１８頭のサル（Cyonomolgusとアカゲザル）で前臨床毒性試験を実施した。最高０．６ｍｇ／ｋｇ用量のボーラス注射を行なった後、最高０．８μｇ／ｋｇ／分の速度の点滴を９６時間行なった（ヘパリン、アスピリンおよび組み換え組織プラスミノーゲンアクチベーターの試験を含む）。すべてのサル、すべての用量、すべての組み合わせにおいて、７Ｅ３は安全で忍容性が良好であり、重大な出血合併症やその他の副作用は見られなかった。安定型狭心症患者におけるキメラ７Ｅ３Ｆａｂの用量増加試験１０日以上にわたり抗血小板療法を受けていない５２名の安定型アンギナ患者（４３〜７５歳の男性）を被験者とする用量増加試験を行なった。様々な用法の投与を行なった。患者には、０．１５〜０．３０ｍｇ／ｋｇのキメラ７Ｅ３Ｆａｂ（患者２０名）の単回静脈内ボーラス注射投与、またはボーラス負荷後１２〜９６時間にわたり連続静脈内輸液投与（１０μｇ／分）（患者３２名）する治療を行なった。ｃ７Ｅ３Ｆａｂのボーラス投与（０．１５〜０．３０ｍｇ／ｋｇ）後２時間目に、血小板ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体抑制度、２０μＭのＡＤＰ（アゴニスト）に対する血小板凝集反応、および出血時間を測定した。受容体阻害およびアゴニストに対する血小板凝集は既報［ゴールドら（Gold，H.K. et al．）、J．Cli n．Invest．86: 651-659(1990)］に従い測定した。出血時間はシンプレート法（S implate method）によって測定した。用量が増加すると、抑制受容体比率（受容体結合部位の利用率から計算）でみた受容体抑制度が次第に増加した。受容体抑制度の増加は血小板凝集の抑制（投与前値すなわちベースライン値で測定）および出血時間の延長と平行していた。３つの測定項目いずれについても、ピーク作用は０．２５ｍｇ／ｋｇで見られた。この用量は、キメラ７Ｅ３Ｆａｂの濃度を上げながら凝集計キュベット中で１５分間培養した正常被験者の高血小板血漿中でピーク抑制が見られた５μｇ／ｍｌの血漿中濃度に対応している。（この正常被験者の血漿の凝集度は、キュベット透過光の比率で測定した。アゴニスト添加前の血漿は比較的透明で、光透過率はゼロに設定した。アゴニストの一種ＡＤＰを抗体不含対照試料に添加したところ、凝集の進行に伴い光透過率が上昇したが、ｃ７Ｅ３Ｆａｂが存在すると用量依存的な凝集抑制が見られ、１ｍｌあたり５μｇのｃ７Ｅ３Ｆａｂでは完全に抑制された。）受容体抑制、血小板凝集抑制、および出血時間に対する作用継続時間を測定した。受容体抑制、血小板凝集抑制、および出血時間に対するピーク作用は２時間後に見られ、経時的に徐々に回復した。出血時間は６〜１２時間後には正常値付近まで回復した。受容体抑制と機能抑制のピークは０．２５ｍｇ／ｋｇで見られたので、この負荷用量投与後の連続輸液による血小板抑制の継続時間を測定することで、血小板抑制継続時間の延長が可能かどうか調べた。受容体抑制、血小板凝集抑制、および出血時間の延長は、０．２５ｍｇ／ｋｇの負荷用量投与後７２時間にわたりキメラ７Ｅ３Ｆａｂの連続輸液を１０μｇ／分の速度で受けた５名の患者において連続輸液の継続中ずっと維持された。点滴を中止するとただちに回復が始まった。同様の結果は１２、２４、４８、および９６時間の点滴にも見られた。いずれの患者も過敏反応を示さなかった。血液学的測定項目や化学的項目には有意な治療関連の傾向は見られなかった。また、重要な出血発作もなかった。有意でない出血発作がまれに見られたが、その内訳は一過性の軽度鼻血と軽度歯肉出血が歯周病患者に見られたものである。この治験の結果から、キメラ７Ｅ３Ｆａｂは数日にも及ぶ長期間にわたり血小板機能をよく抑制させるように患者に投与することができることが示された。免疫原性試験の結果ネズミ７Ｅ３Ｆ（ａｂ’）₂およびＦａｂを用いた治験（患者１５０名）で、高感度酵素結合免疫測定法による免疫応答は全患者の１６％（２４／１５０）で見られた。いずれの反応も抗体価は低く、１：５０〜１：２００の範囲が普通であった。治療群は、０．０１〜０．２５ｍｇ／ｋｇのネズミ７Ｅ３Ｆ（ａｂ’）₂ で治療した健常志願者、０．０５〜０．２０ｍｇ／ｋｇのネズミ７Ｅ３Ｆ（ａｂ’）₂で治療した不安定型アンギナ患者、および０．１ｍｇ／ｋｇのネズミ７Ｅ３Ｆ（ａｂ’）₂または０．１５〜０．３５ｍｇ／ｋｇのネズミＦａｂで治療したＰＴＣＡ患者、ならびに０．１０〜０．３０ｍｇ／ｋｇのネズミ７Ｅ３Ｆａｂの単回ボーラス静脈注射投与、０．２５または０．３０ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス注射投与後１２〜３６時間にわたりネズミＦａｂの連続輸液（０．１５μｇ／ｋｇ／分または１０μｇ／分）を行なうかネズミＦａｂの注射を６時間間隔で２回（０．２〜０．３０ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス注射後に０．０５ｍｇ／ｋｇのボーラス注射を行なう）受けることで治療された安定型アンギナ患者が含まれていた。ヒト−マウスキメラ７Ｅ３Ｆａｂにより免疫原性は顕著に低下した。用量増加試験の被験者としてキメラ７Ｅ３Ｆａｂ治療を受けた５２名の安定型アンギナ患者（上記参照）はいずれも、キメラＦａｂ用に改変した同様の測定法で測定した免疫応答を示さなかった。抗血小板活性の回復性キメラ７Ｅ３Ｆａｂ（γ１、κ）は血小板からの消失速度が遅く、血漿中遊離キメラ７Ｅ３Ｆａｂは急速に循環からクリアーされる（上記参照）。したがって、キメラ７Ｅ３の抗血小板作用は、ランダムドナー由来血小板を投与することによって容易に回復させることができる。血小板輸液によるこの回復ないし解毒作用は、ネズミＦａｂまたはキメラＦａｂのいずれかの投与で血小板凝集がほぼ完全に抑制された時点でランダムドナー由来血小板を投与された２名の患者で確認された。出血時間を測定することによって血小板機能の回復度を判定した。この性質は、出血患者の血小板機能を回復させる必要がある場合に有用である。実施例４随意冠状動脈形成術に伴う血栓合併症の予防におけるキメラ７Ｅ３抗体の用途たとえばバルーン法や冠アテレクトミーによる経皮経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）は狭窄した冠状動脈管腔の拡大手段として有効である。この手術では、血管形成術の術中および術後に急性冠状動脈閉塞が起きるという危険を伴う。既報では随意血管形成術症例における冠状動脈閉塞率は約３〜６％とされており［デトレら（Detre，K.M．et al.）、Circulation 82:739-750(1991)］、これが院内発症および死亡の主因となっている。ハイリスク患者では、血栓によって引き起こされる主な心症状の発生率は１０〜２０％である。冠状動脈形成術の術中や術後直後に見られる急性冠状動脈閉塞は深部動脈壁傷害とそれに伴う部分閉塞性「内腔フラップ」が共存して引き起こされるか（血栓形成を伴う場合とそうでない場合がある）、血管壁傷害部位に血栓形成のみによって引き起こされるものと思われる。動物モデルでは、血栓溶解成功後に再閉塞が起きる場合、まず「周期性血流変動」（ＣＦＶｓ）と呼ばれる冠状動脈血流量の周期性低下と回復が繰り返される。これらのＣＦＶｓはほぼ完全に血小板を介する現象であり、冠状動脈の狭窄部位と内皮傷害部位における血小板凝集塊の蓄積と剥離が繰り返されることによって引き起こされる。ヒトにおける冠状動脈形成術後の周期性血流変動についての記載がある。キメラ７Ｅ３抗体を用いて血管形成術中の血小板機能を抑制させることによって血小板凝集と血栓形成を予防することができる。キメラ７Ｅ３抗体は血栓閉塞の危険が高い患者においてとくに有用である。これらの患者は、急性冠状動脈血栓症の前徴として急性心筋梗塞や不安定型アンギナや剥離閉鎖の臨床症候群を引き起こす解剖学的リスク因子（たとえば狭窄部位の病変の血管造影判定など）または臨床的リスク因子（たとえば心筋梗塞、不安定型アンギナ、糖尿病、６５歳以上の女性）に基づいて判定される。随意ＰＴＣＡにおけるキメラ抗血小板抗体２相治験を行なった。第１相では、随意経皮経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）を受けた患者におけるキメラ７Ｅ３Ｆａｂの単回投与の安全性と最適投与量を判定することを目的として実施した。第２相では、ボーラス注射投与後に様々な連続輸液期間を設けた場合のキメラ７Ｅ３（ｃ７Ｅ３）の安全性と予備効果の判定を目的として実施した。第２相治験の被験者は、虚血性心合併症の危険のある随意冠状動脈形成術を受けた患者である。高リスク患者としては、Ｂ型またはＣ型病変特異性を有する不安定型アンギナまたは安定型心疾患を有する患者が含まれていた。表３に高リスク患者の判定基準を示し、表４に血管造影で判定した病変特異性を示した。予備効果は、血小板機能の抑制度と血栓症合併症の予防度によって測定した。年齢１８〜７６歳の男性と年齢１８〜７６歳の出産の可能性のない女性が両相ともに参加した。第Ｉ期（StageＩ）第Ｉ期では、患者を（実施例３に記載されている通りに調製および調剤した）キメラ7E3（γ₁、κ）Fab断片の一回ボーラス静脈内注射群に採用した。総計15 例（女性３名と男性12名）に投与した。患者の年齢の中央値は62才（46〜76才の範囲）であった。表5A及び5Bに、一回投与患者全員及び投与群内の患者個々の人口統計学的プロフィールを示す。用量増量プロトコールにおける選択的PTCAより前の約30分以内に、５例（n=5 ）それぞれにc7E3 Fab 0.15mg/kg、0.20mg/kgまたは0.25mg/kgを一回投与した。患者全員にアスピリン（標準用量）を投与し、処置時に、ヘパリン（標準用量）で完全に抗凝固処理を行った。 PTCA処置は第Ｉ期患者のための選択法として分類されたが、15例中６例に不安定安静アンギナ（unstable rest angina）が認められた。冠動脈の拡張の位置を表６（下部）に示す。第Ｉ期の患者15例中７例は単一血管における１病変のPTCA を受け、６例は単一血管における多病変PTCAを受け、２例は多血管PTCAを受けた（表６）。 c7E3の最適１回量を得るための効力基準を、注入後２時間に下記の中央値に到達する最小用量と定義した。(１)少なくとも20分間の出血期間延長、(２)受容体部位ベースラインの80％以上が遮断されるGPIIb/IIIa受容体の遮断、及び(３)20 μM ADPに応答してベースラインの20％以下となる血小板凝集の阻害。第II期第II期では、患者に0.25mg/kgのc7E3 Fabをボーラス投与し、続いてc7E3 Fab を10μg/分で６時間、12時間、あるいは24時間持続注入を行った。総計32例（女性８例および男性24例）を本試験の第II期投与群に採用した。c7E3 Fab投与患者の年齢の中央値は57才（38〜76才の範囲）であった。コントロール患者は９例（女性１例、男性８例）を採用した。コントロール患者の年齢の中央値は56才（37 〜74才の範囲）であった。コントロール患者は、c7E3を受けなかった、上記で定義されたハイリスク患者であったが、投与患者と同じ方式でモニタリングおよび追跡調査を受けた。第II期患者全員および投与群内の患者個々の人口統計学的プロフィールを表5Aおよび5Bに示す。 PTCAのためのバルーン膨張の30分前にc7E3 Fab投与を開始した。臨床的に指示された通りにアスピリンおよびヘパリンを投与し、その後、時間当たり800単位の速度における血管形成ヘパリンの投与が推奨された。各11例が６時間群および 12時間群に採用され、10例が24時間群に採用された。 c7E3 Fab投与患者32例のうち、21例が単一血管における１病変のPTCAを受け、７例が単一血管における多病変PTCAを受け、３例は多血管PTCAを受けた（表６）。１例でPTCAの種類が特定されなかった。第II期患者の冠状動脈の拡張の位置を表６に示す。コントロール患者９例のうち、８例は単一血管における１病変のPT CAを受け、１例は多血管PTCAを受けた。c7E3 Fab投与患者32例およびコントロール患者９例は、PTCA の虚血性心併発症ハイリスクと分類される臨床的特徴および血管造影図上の特徴を示した。c7E3 Fab投与患者２例およびコントロール患者１例には特記されていない危険因子があった。残りのc7E3 Fab投与患者30例およびコントロール患者８例には、虚血性併発症のリスクを増大させる同定可能な臨床的特徴または血管造影図上の特徴が少なくとも１つ認められ、ほとんどの患者に２つ以上の危険因子が存在した。表７は、コントロール群およびc7E3投与群の危険因子であり、各投与群内の患者ごとの危険因子の個別リストを表8A〜表8Dに示す。血小板機能の阻害（第Ｉ期の結果）血小板機能阻害におけるキメラ7E3 Fabの活性を査定するため、GPIIb/IIIa受容体結合部位利用効率（GPIIb/IIIa遮断の百分率の中央値として記録）、20μM のADPに応答した作動物質誘導性血小板凝集の阻害の中央値、および出血期間の中央値を連続的に測定した。作動物質に応答した受容体遮断および血小板凝集は、本質的に記述（Gold，H.K.ら， J.Clin．Invest., 86 ：651-659(1990)）通りに測定した。受容体遮断測定に関しては、時点０に受容体利用効率を測定し、利用可能な受容体の数を０％受容体遮断（ベースライン）と考えた。他の時点は、ベースラインまたは投与前測定時に利用できる受容体の数と相関的である。出血期間はシンプレート（Simplate）法で測定した。第６図は、キメラ7E3 Fabの一回ボーラス投与後２時間の、受容体遮断（第６図Ａ）、血小板凝集（第６図Ｂ）、および出血期間（第６図Ｃ）に関する用量応答である。第６図の実線は各用量群で試験した５例の中央値を示す。c7E3 Fabの用量を増加すると、遮断される受容体のパーセントからわかるように、受容体遮断が漸増した（第６図Ａ）。２時間の時点での遮断された受容体数の中央値は、 0.15mg/kg投与群では53.8％、0.20mg/kg投与群では80.2％、0.25mg/kg投与群では86.6％であった。受容体遮断の増加は、投与前値のパーセントとして表した、血小板凝集阻害と同様であった（第６図Ｂ）。0.15mg/kg投与群、0.20mg/kg投与群および0.25mg/kg投与群の２時間の時点における血小板凝集の中央値はそれぞれ、ベースラインの46.1％、44.6％および17.9％であった。同様に、注入後２時間に、用量関連性の出血期間延長がみられた（出血期間測定は３０分に省いた。第６図Ｃ）。0.15mg/kg投与群、0.20mg/kg投与群および0.25mg/kg投与群の出血期間の中央値はそれぞれ26.0分、27.5分、および30分であった。使用した条件下で、これらの測定法で測定した限りでは、抗血小板活性に関する最適用量は0.25mg/kgであると決定された。第７図は、最大血小板効果が見られた用量である、0.25mg/kgの一回ボーラス投与後の作用持続期間を示す。Ｘ軸からわかるように、線は最上部の図（第７図Ａ）では受容体遮断、真ん中の図（第７図Ｂ）における血小板凝集、最下部の図（第７図Ｃ）では出血期間に関して、ゼロ時点（ベースライン）から24時間までの中央値を示す。受容体遮断、血小板凝集、および出血期間に対するピーク作用は２時間の時点にみられ、時間が経過すると徐々に回復した。出血期間は12時間までにほぼ正常値に戻った。血小板減少を経験した患者は皆無であった。血小板機能の阻害（第II期の結果）第II期では、患者全員のGPIIb/IIIa受容体および血小板凝集データが得られた訳ではなく、24時間注入群では患者２例のみがこれらの試験を受けた。したがって、６時間のデータおよび12時間のデータのみをまとめる。６時間注入群も12時間注入群も、受容体遮断の中央値は、注入期間を通してベースラインの80％より以上に維持された。６時間注入群および12時間注入群の２時間の時点における20μM ADP誘導性血小板凝集の中央値はそれぞれ、ベースラインの13％および15％であり、12時間群では、注入期間中、25％以下のままであった。３種類の注入期間全ての２時間の時点での出血期間の中央値は30分を超えていた。第８図は、0.25mg/kg負荷用量に続いてキメラ7E3 Fabの10μg/分持続注入を12時間受けた患者で見られた結果である。12時間注入期間は軽く陰を付けた領域で表し、線は中央値を示す。注入の全期間中、受容体遮断、血小板凝集阻害および出血期間延長の程度が維持され、注入が中止されるや否や、回復が開始する。第Ｉ期患者および第II期患者の臨床結果 c7E3 Fab投与患者47例の中で、PTCA中またはPTCA後に血栓事象を経験した者は皆無であった。４７例のc7E3投与患者のうち２例を除く全例が、病変を50％未満の内腔直径狭窄に低減することによって血管造影法的に定義されたPTCA成功をおさめた。拡張に不成功であった２例のうち、患者01−012は左前下行冠動脈（lef t anterior descending coronaryartery）の90％狭窄が70％に低減したが、更なる拡張は技術的に不可能であった。２人目の症例、（患者01−019）は、以下で検討するが、最初は拡張に成功したが、大縦解離（major longitudinal dissect ion）のため冠内ステント留置（intracoronary stent placement）が必要であった（明白な血栓はなかった）。コントロール患者９例のうち１例（01−022）は、手技開始後15分に血栓性急閉鎖を経験し、救急冠動脈バイパス術(CABG)を要したが、回復した。他のコントロール患者８例は、残存狭窄50％以下までの拡張に成功した。患者01−019（12時間注入群）は左回旋冠動脈の95％病変のバルーン拡張を受け、残存狭窄は50％となった。術後、本症例は明白な血管迷走神経の症状を発現し、徐脈、低血圧、および一過性の不全収縮をきたした。本症例はカテーテル法研究所（catheterization laboratory）に戻り、持続性大縦解離のため緊急冠内ステント留置を受けた。このステントが左主冠動脈内に移動したので、本症例は緊急冠動脈バイパス術のため搬送された。研究者によれば、血管造影図上または術中に、冠内血栓症の徴候は認められなかった。本症例は周術期心筋梗塞も経験した。本症例は回復し、術後８日に退院した。 c7E3 Fab投与患者３例は各々、重大性が不確実なPTCA後胸痛の、他に例のない症状を発現した。患者01−009（0.25mg/kg一回投与群）はc7E3後９時間に胸痛を経験し、患者05-003（12時間注入群）はc7E3後21時間にアンギナを経験し、患者 06−003（12時間注入群）はc7E3後２日にアンギナを経験した。研究者らは、これらの胸痛の症状の発現は再閉塞を示す虚血症状と無関係であると報告した。患者02−004（0.25mg/kg一回投与群）はc7E3 Fab投与前に長期胸痛を経験し、 PTCA術中ずっと持続した。翌日、ECGの変化とともに心酵素の上昇が認められ（前日採取）、本症例は周術期非Ｑ波（peri-procedural non Q-wave）心筋梗塞を経験していたことがわかった（ピーククレアチニンキナーゼ＝462、MB画分＝64 ）。治験中、c7E3 Fab投与後52日に１例が死亡した。間質性肺疾患、うっ血性心不全および不安定アンギナの既往歴のある、患者06−002（６時間注入群）は近位左前下行冠動脈のPTCAに成功した。本症例は術中に持続性心室細動が出現し、電気的除細動を２回要したが、その後、本術は無事に進行した。カテーテル法研究所に搬送後、本症例にチアノーゼが現われたが、これは最初は利尿薬および酸素療法に応答した。しかし、進行性呼吸障害が現われ、その後、換気支援を必要とした。本症例はその後の病院経過で、敗血症、成人型呼吸障害症候群、貧血（要多回輸血）、および心虚血を併発した。本症例はc7E3 Fab 後52日に多系不全のため死亡した。安全性：第Ｉ期観察所見および第II期観察所見第９図は、全患者の、注入終了後24時間までのベースラインからのヘマトクリットの絶対変化を投与群ごとに示す。参考のため、ゼロ変化点を示す線を表す。コントロール患者１例（01−022）およびc7E3 Fab投与患者１例（01−019）は、 24時間の間に、救急冠動脈バイパス術後に輸血を必要としたため、両患者のヘマトクリットのデータはプロットされていない（以下参照）。-12における下方の２本目の線は、心筋梗塞における血栓崩壊（TIMI）基準（Raoら，J．Am.Coll．C ardiol ．11:1-11(1988)）を使用する少量の出血として明示する必要があるヘマトクリットの変化を示す。ヘマトクリットの変化は、コントロール患者群と全てのc7E3 Fab投与群の間で類似していた。表10は、注入終了後24時間における血小板数の中央値の変化である。未投与コントロール群およびc7E3 Fab投与群の血小板数の変化は類似した分布を示し、明白な用量関連効果は認められなかった。第Ｉ期の結果および第II期の結果に関する考察本試験の第Ｉ期は、c7E3が、用量漸増治験における安定アンギナ患者でみられたものと同じ（実施例３）、アスピリンおよびヘパリンを投与したPTCA患者母集団に特徴的な用量応答を示すことを実証した。キメラ7E3は、血小板GPIIb/IIIa 受容体の用量依存性遮断を引き起こし、この受容体遮断は血小板機能の阻害と相関関係がある。加えて、第II期の結果は、持続注入によって、24時間までの血小板Fab機能の阻害延長が達成されることを示した。注入期間と関係なく、注入中止後６〜12時間までに、全ての患者で、血小板機能の回復が開始する。血管造影法的終点および臨床的終点の両者を使用したc7E3投与患者の臨床結果は、患者のリスク・プロフィールに基づいて予測されるものよりかなり良好であった。c7E3投与群の患者の中で、術中または術後に血栓事象を経験した者は皆無であった。加えて、２例を除く全例が、血管造影法的に成功をおさめた。臨床的特徴または血管造影法的特徴に基づけば、第II期に採用された全症例および第Ｉ期に採用された15例中６例がハイリスク患者であった。個々の臨床因子（不安定アンギナ、糖尿病、65才以上の女性など）または血管造影図上の病変特異的特徴（Ｂ型またはＣ型など）により、患者の合併症のリスクが増大し、複数の因子の影響が累積する。第II期では、それ以外の臨床的または血管造影法的病変特異的危険因子の有無にかかわらず、投与患者17例が不安定アンギナに罹患していた。加えて、第Ｉ期の患者６例が不安定アンギナに罹患していると確認された。発表済のシリーズで、不安定アンギナ患者には、10〜15％の率で、重大な複雑化の要因（死亡、心筋梗塞、緊急冠動脈バイパス術、反復PTCA）があることが確認されている（De Feyter，P.J.:編，Am.H eart J．118 :860-868(1989)およびRupprecht，H．J.ら、Eur Heart J．11: 964- 973、(1990)）。血管造影図上の特徴は同様に、PTCA合併症が高度に予測されるものであった（Ellis，S.G.，1990，“Elective coronary angioplasty（選択的冠動脈血管形成術）：technique and complications（技法と合併症）”、Textb ook of Interventional Cardiology （介入的心臓学教科書）中，E．J．Topol,編，（W．B．Saunders Co.，Philadelphia）;De Feyter，P.J.ら、Circulation 83 : 927-936（1991）; Ellis，S.G.およびTopol，E.J，Am．J．Cardiol．66:932-9 37（1990）; およびACC/AHA Task Force Report（ACC/AHAプロジェクトチーム報告書）：Guidelines for percutaneous transluminalcoronary angioplasty（経皮経管冠動脈形成術のためのガイドライン），J．Am．Coll．Cardiol．12:529-5 45(1988)）。第II期c7E3投与患者29例は、病変特異的特徴を用いた適格基準を満たした。このうち12例に１つのＢ型病変が認められ、14例には２つ以上のＢ型病変が認められ、３例にはＣ型病変が認められた。加えて、本治験における患者の多くには、単一血管または２つ以上の血管に、拡張した複数の病変が認められたが、これらにも本術のリスクを増大する可能性がある（Samson，M.ら、 Am．Hea rt J ．120:1-12(1990)）。これらの患者におけるハイリスク血管造影法的に定義された危険因子の数と重症度の両者に基づけば、虚血性合併症は10〜20％の範囲内であると予測されるであろう（Ellis，S.G.:Elective coronary angioplasty（選択的冠動脈血管形成術）：t echnique and complications（技法と合併症）、Textbook of Interventional C ardiology（介入的心臓学教科書）中、（E．J．Topol編）W．B．Saunders Co.,P hiladelphia(1990);De Feyter，P.J.ら、 Circulation83: 927-936(1991)；Elli s，S.G．and Topol，E.J, Am.J．Cardiol．66:932-937(1990)）。コントロール群も、ハイリスク患者で構成されていた。しかし、一般に、コントロール患者の危険因子の数および重症度の方が低値であった。コントロール患者９例中５例には、１つのＢ型病変（４例）または不安定アンギナ（１例）のいずれかの危険因子が１つあったが、第II期c7E3投与患者32例中26例には、１つのＣ型病変か２つ以上のハイリスク特徴が認められた。この２群間の危険状態の差は、有意差である（Fisherの厳密検定p=0.018）。興味深いことに、急閉鎖を呈したコントロール患者（患者01−022、２つのＢ型特徴を伴う不安定アンギナ）は、危険因子が２つ以上であると確認された３例のうちの１例であった（コントロール患者１例には特記されていない危険特徴があった）。したがって、最高リスクにあるコントロール患者３例中１例が血栓事象を示したが、この最高リスク範疇内の２６例のc7E3 Fab患者の中で血栓事象を示した者は皆無であった。本試験は、静脈内ヘパリンおよび経口アスピリンが既に投与されている患者において、c7E3の強力な抗血小板作用が安全に達成されることも示した。コントロール患者とc7E3投与患者において、出血事象は同等で、ベースラインからのヘマトクリットの変化に投与群間の差はなかった。その他の有害事象は珍しく、その重症度は一般に軽度ないし中等度であった。治験で１例が死亡したが、これはc7 E3 Fab投与後ほぼ２カ月に間質性肺疾患および心疾患を有する患者に発生し、PT CA後に進行性呼吸器不全を示し、敗血症、成人型呼吸障害症候群および、最終的にに多臓器不全を併発した。最後に、結果を入手できた患者20例のうち、ヒト抗キメラ抗体免疫応答を経験した者は皆無であった。結論として、キメラc7E3 Fabは、PTCAを受けようとしている、アスピリンおよび静脈内ヘパリン投与した患者の血小板機能を強力かつ安全に阻害する。抗血小板作用は、出血リスクを有意に増大することなく、また免疫系反応性なしに、24 時間もの長期間、維持することが可能である。血栓性合併症のハイリスク患者の中で、c7E3投与群では血栓事象が発生せず、c7E3は本患者母集団における血栓性合併症のリスクを低減することが示唆された。実施例５冠動脈血管形成術中の急閉鎖の治療冠動脈血管形成術中の冠動脈急閉鎖は本術における罹病率および死亡率の重大な決定因子である。冠動脈急閉鎖は、選択的血管形成術症例の約３〜６％に発生する（Detre，K.M.ら、Circulation 82:739-750(1991)）が、不安定アンギナ（unstable angina pectoris）が原因で、または急性心筋梗塞後に、血管形成術を受けた患者の20〜40％までに発生することが確認されている（Ellis，S．G．ら、Circulation 77:372-379(1988)；Defeyter，P．J.ら、 Cir culation 83: 927-936(1991)）。急閉鎖の機序は、血管形成術により内皮傷害領域が創られたか拡大された動脈部位における急性血栓症である。通常は、多くの場合プラーク物質の破壊による血管の幾何学的変化のため、血流パターンの乱れが認められ、そして内膜を含めた内皮下要素の露出が認められ、内側の切開もしばしば認められる。血栓の開始には血小板の付着および凝集が必要なため、冠動脈血管形成術を複雑化する冠動脈急閉鎖の治療には、キメラ7E3 Fab抗体断片が使用される。症例報告本症例は、以前は優れた健康状態であった45才の男性医師である。本症例の胸部および頸部不快は血管形成術の１週間前に開始した。これらの症状が数日にわたって持続し、しかも悪化したとき、本症例は同僚の助言を求めた。心電図(EKG )は、前胸部Ｔ波（anterior precordial T wave）逆転を示した。本症例は地方の病院の冠動脈ケアユニットに入院し、静脈内ニトログリセリンおよびヘパリン、ならびに経口アスピリン治療を続けた。次の24時間にわたる連続的心アイソエンザイム測定は、正常範囲以上の上昇を示さなかった。次の２日にわたる連続的EKG記録は、前胸部Ｔ波の持続性偏平化を示したが、心筋梗塞の進化的変化は示さなかった。入院後第２日目に、本症例を心カテーテル法研究所に搬送し、そこで総体的に正常な心室機能と、前側左心室壁の非常に小さな運動低下領域および別の下後基底帯（inferoposterobasilar zone）の運動低下領域が左心室造影法によって明らかにされた。左心室の駆出率（ejection fraction）は72％であった。冠動脈造影法は、左優性冠動脈系と、小さくて全体として閉塞した右冠動脈を示した。左前下行(LAD)冠動脈の中部に有意な狭窄が認められた。小さく、広範に罹患した対角分枝が、中部LAD狭窄のすぐ遠位に生じていた。本症例は冠動脈ケアユニットに戻り、静脈内ニトログリセリンおよびヘパリンで更に48時間維持した。この間本症例は無痛で、心アイソエンザイムは上昇しておらず、毎日のEGKは前胸部Ｔ波の持続性偏平化のみを示した。本症例は血管形成のためにHermann病院（Houston，TX）に移送された。血管形成術の前に、本症例は静脈内ニトログリセリンおよびヘパリン、経口アスピリンを引き続き受け、経口カルシウムチャネル遮断薬を開始した。部分トロンボプラスチン時間(PTT)は、数日間、70〜90秒の範囲のままであった。血管形成術開始時における活性化凝固時間(ACT)は173秒であった。本症例は5000単位の静脈内ヘパリンを受けた。左冠動脈口にナンバー８フレンチJL 3.5ガイドカテーテルを埋め込んだ。尾部右前斜（caudal right anterior oblique）***および頭部左前斜（cranial left anterior oblique）***におけるLAD冠動脈を映像化した。LADに最初、0.018インチのドップラーガイドワイヤー（Cardiometrics, Inc.,Mountain View，CA）を取付けた。筆者らは、急閉鎖ハイリスク患者の血流モニタリングに、このガイドワイヤーを日常的に使用する。病変に近いLAD、及び病変から遠いLADからの流速シグナルを記録した。2.5mm冠動脈バルーンカテーテル（Intrepid，Baxter，Inc.，Irvine，CA）をドップラーガイドワイヤーの向こう側に進めたが、ワイヤーは冠動脈中に静止させておいた。LAD病変を広げるため、バルーンを適所に配置した。６気圧までの、一連の短時間バルーン膨張を行った。ピーク流速(APV)からの流速シグナルが12cm/秒から33cm/秒に増加したこと、及び血管造影法により映像化した通り、狭窄の重症度は低減した。これらの拡張後の数分間の観察中に、血流シグナルが減少しはじめることに気づいた。造影剤注入で、弾性反跳、プラーク崩壊、および血栓形成による血管形成部位の再狭窄が明らかにされた。病変部位にバルーンを再度導入し、別のバルーン膨張を実施した。冠動脈を再度拡張すると、血流シグナルはAPV 34cm/秒に戻った。さらに数分間のモニタリング中に、シグナルが再び低減した。本シグナルは５分以内に完全に低下し、平均ピーク速度は３cm/秒であった。本症例は胸痛を経験しはじめた。前胸部誘導のEKGモニターは、STセグメント上昇を示した。血管造影法は、動脈が完全に閉塞していることを示した。ほんの２、３分前に得られた活性化凝固時間は344秒であった。血小板GPIIb/IIIa受容体に特異的なキメラ7E3モノクローナル抗体Fab断片（c7 E3 Fab、γ₁、κ）を投与した。静脈への投与量は、１分間にキログラム当たり0 .25mgであった。c7E3 Fab投与後、約１〜２分以内に、冠動脈流速が上昇しはじめた。造影剤の注入で、冠動脈開存性の回復が明らかにされ、心筋梗塞治験における血栓崩壊１度(Thrombolysis In Myocardial Infarction Trial Grade-1;TIM I 1)血流であった。その後の15分間、冠動脈血流は引き続き増大し、AVP23cm/秒で安定した。その他の数回の造影剤注入で、冠動脈血流の改善が認められた。本症例の胸痛は静まり、モニターで観察されたSTセグメントはベースラインに戻った。プロトコールに従って、c7E3 Fab投与後15分に血管造影図をとった。本血管造影図は、TIMI 3冠動脈血流を示した。この時の流速シグナルは20cm/秒であった。その後５分の持続モニタリングで、冠動脈血流の更なる改善は認められなかった。その期間中、血管造影図のビデオ再生で、血管形成部位に依然として見える少量の血栓が存在することが確認された。このため、冠動脈内ウロキナーゼ250, 000単位を投与することに決定した。ほぼ10分かけて、この血栓崩壊剤を注入した。ドップラーガイドワイヤーで測定した限りでは、その期間中に、血流の更なる改善はみられなかった。冠動脈内ウロキナーゼ注入が完了した後、c7E3 Fabの投与後33分目に、冠動脈血管造影法をもう１度行った。動脈は開存しており、TI MI 3血流であった。ほぼ中等度であるが、明確な残存狭窄が病変部位に存続していた。加えて、血栓は、サイズはさらに縮小していたものの完全に解消していなかった。残存狭窄を低減させるために、もう一度バルーン膨張を実施することに決定した。ガイドワイヤーを超えて病変部位まで、バルーンカテーテルを再び進めた。６気圧までの最終的バルーン膨張を２分間実施した。次に、バルーンカテーテルは回収したが、ワイヤーは同じ場所にそのまま残した。血流シグナルはAPV 29cm/ 秒まで上昇し、数分間、安定したままであった。血管造影図は、存在していた残存狭窄の十分な低減を示した。次に、狭窄近位のガイドワイヤーを回収し、流速をもう一度測定した。ガイドワイヤー、バルーンカテーテルおよびガイドカテーテルを回収した。これで処置が完了した。本症例を冠動脈ケアユニットに搬送した。PTTを70〜90秒の範囲に保つため、経口アスピリン、ニトレート、カルシウムチャネル遮断薬、および静脈内ヘパリンを数日間継続した。連続的EKGは、前胸部Ｔ波逆転の解消を示し、その後のEKG は全て正常であった。連続的クレアチンキナーゼ(CK)アイソザイム値は一貫して I00U/L未満であった。PTCA術以前の血小板数は248,000であり、その後の、c7E3 Fab投与後２時間、６時間、１２時間、24時間および48時間における血小板数はそれぞれ304,000、279,000、246,000、185,000および220,000であった。術前に1 0μM ADPによって誘導された血小板凝集は、光学密度で７３％であり、その後の、２時間、６時間、12時間、24時間および48時間における値はそれぞれ０％、13％、26％、45％、および51％であった。血管形成術後１週間に、本症例はフォローアップ・カテーテル処置を受けた。LAD冠動脈は広く開存しており、TIMI 3血流であった。本症例は、同日後刻、退院した。症例報告に関する考察本症例の場合、0.25mg/kgの静脈内c7E3 Fab、250,000単位の冠動脈内ウロキナーゼ、および反復拡張を併用して、冠動脈血管形成術中の急閉鎖性の急性虚血性冠動脈症候群を治療して成功をおさめた。以上の結果から、血小板糖蛋白IIb/II Ia受容体結合および血小板架橋を阻害する抗血小板療法は、同様な臨床状況において、急性冠動脈閉塞の安定した再灌流を達成するのに役立つと考えられる。実施例６ハイリスク血管形成の虚血性合併症を防止するための抗GPIIb/IIIaキメラ抗体断片の無作為、二重盲検評価概要経皮心筋血管再生は、1977年に冠動脈血管形成術が進歩したため、劇的な率になった（Gruentzig，A.R．ら、N．Engl.J．Med.，316:1127-1132(1987)）。本術により、虚血症状およびクォリティ・オブ・ライフは改善する（Parisi，A.F.ら、N．Engl．J．Med.,326:10-16(1992)）ものの、急性合併症は重大な欠点のまま残されている。術中または術後、病院で、症例の４〜９％において、処置した血管が急に閉鎖し、そして再閉塞または急閉鎖はかなりの罹病率を伴い、死亡率は約10倍に増加する（Lincoff，A.M．ら、J．Am．Coll.Cardiol., 19:926-938(1992)）; Tenaglia，A.N．ら、Am.J．Car diol ，印刷中（1993）；Detre，K.M．ら、Circulation，82:739-750（1990）；E llis，S.G．ら、Circulation，77:372-379(1988)）。急激な血管閉鎖の機序は多くの場合不明であるが、血栓形成および血管剥離が寄与因子である。急性合併症のハイリスク患者を同定する特徴としては、冠動脈血栓を伴う臨床症候群（不安定アンギナ、急性心筋梗塞又は最近の心筋梗塞）、糖尿病、女性、及び個々の病変の複雑性の増大を示す冠動脈形態学的特徴（曲点、血栓、分岐）の存在などがある（Lincoff，A．M.ら、 J．Am.Coll．Cardiol.，19:926-938（1992）; Ellis ，S．G．ら、J.Am．Coll．Cardiol，17:（suppl B）:89B-95B（1991）；Moushmo ush，B．ら、Cath．Cardiovasc．Diagn.，27:97-103(1992); Myler，R．K.ら、 Circulation，82 (supplII)：II-88-II-95(1990)）。アスピリンは、血管形成術を受けようとしている患者の急激な血管閉鎖および急性心筋梗塞のリスクを低減することが示されている（Schwartz，L.ら、 N．En gl．J．Med.，318 :1714-1719(1988); Barnathon，E.S.ら、 Circulation,76:125 -134(1987)）が、その血小板機能に対する作用は比較的弱く、アスピリンを前投与したハイリスク患者の10〜20％の率で、虚血事象が引き続き発生する（Tenagl ia，A．M. ら、J．Am．Coll．Cardiol.，(1933、印刷中)）。対照的に、キメラ7E3抗体のFa b断片をヒトに投与すると、GPIIb/IIIa受容体の実質的遮断および血小板凝集の阻害が達成される（実施例４、血小板機能の阻害を参照されたい）。血管形成術を受ようとしている患者の初期試験で、c7E3 Fab抗体により、経皮介入中および経皮介入後の急性血管閉鎖のリスクが低減した（実施例４およびEl lis，S．G.ら、Cor．Art．Dis., 4:167-75(1993)を参照されたい）。本無作為試験は、糖蛋白IIb/IIIa受容体に選択的に結合するキメラ抗体断片の、虚血性合併症防止における有効性を更に評価するために設計したものである（EPIC治験、虚血性合併症を防止するためのc7E3 Fabの評価）。特に、血管形成術を受けようとしている術性合併症のハイリスク患者におけるキメラ7E3 Fab断片(c7E3 Fab)の臨床効果を、先見的二重盲検プラセボ対照無作為臨床治験で評価した。ハイリスク臨床状況にある、すなわち、安静痛および心電図変化の記録を伴う重度不安定アンギナ、進行性（evolving）急性心筋梗塞、又は周術期合併症のハイリスクを伴う臨床特徴及び冠動脈病変形態学的特徴を有する、冠動脈血管形成術または方向性冠動脈切除術を受ける予定の、56施設における患者2099例を本治験に含めた。患者は(a)プラセボ・ボーラスおよびプラセボ注入、(b)c7E3 Fab・ボーラスおよびプラセボ注入、または(c)c7E3 Fabのボーラスおよび注入のいずれかを受けた。一次終点は下記の要素のうちの任意の１つの発生を含む複合物であった：死亡、非致命的心筋梗塞、予定外の外科的血管再生または反復経皮術、予定外の冠動脈ステント埋め込み、または難治性虚血のための大動脈内バルーン・ポンプ挿入。ボーラスと注入で、一次終点が35％低減した（12.8％対8.3％、p=0.008）が、ボーラス単独で11％の低減が認められた（12.8％対11.4％、p=0.43）。ボーラス投与と注入投与によって達成された事象の低減は、各終点要素内で一貫しており、さらに、年齢、性別、既存の冠動脈間血栓、および急性冠動脈症候群（心筋梗塞、不安定アンギナ）など、主な患者小群でも一貫していた。出血症状の発現および輸血は、ボーラスおよび注入群で高値であり、ボーラス単独治療方式が中間であった。冠動脈介入を受けようとしているハイリスク患者の本対照治験で、血小板IIb/IIIa受容体に対する抗体断片を投与すると、虚血性合併症の有意な低減により、持続性の臨床効果が得られることが明らかにされた。方法従来の経皮介入によるリスクを分類する、以前の試験に基づいて、急血管閉鎖ハイリスクでありしかも出血のハイリスクによる重大な禁忌がなければ、患者は適格であった。患者は、３つの臨床群の１つに属する場合、ハイリスクにあると考えられた：(1)直接経皮介入または「救助」経皮介入のいずれかを受けた症状発生の12時間以内の急性誘発性心筋梗塞、(2)投薬治療にも拘わらず、先の24時間以内の安静心電図変化に伴う安静アンギナの少なくとも２つの症状の発現を伴う、梗塞後早期アンギナまたは不安定アンギナ、又は(3) （Ellis，S．G.ら、 J．Am．Coll．Cardiol.，17（Suppl B）：89B-95B(1991)）によって修正された、アメリカ心臓学会／アメリカ心臓協会基準（American Hea rt Association/American College of Cardiology criteria）を使用したハイリスク臨床基準および／または血管造影法的基準（Ryan，T.J.ら、 J．Am．Coll． Cardiol. ，12:529-45(1988)）。これらのハイリスク臨床基準および血管造影法的基準には、標的病変における２種類のＢ型特徴または１種類のＣ型特徴、あるいは65才を超える女性または糖尿病患者における１種類のＢ型特徴が含まれた。具体的患者登録基準を、以下に更に詳細に示す。（Ｉ）次に挙げる状況のうちの１つにおいて、FDA認可用具を用いた選択的または救急冠動脈バルーン血管形成術もしくは動脈切除術（atherectomy）のために照会。 (A) 下記のように定義された不安定アンギナおよび／または非Ｑ波心筋梗塞： 1) 安静アンギナ：虚血性STセグメントまたはＴ波異常を伴う安静時アンギナの２つ以上の症状の発現 2) 再発性アンギナ：入院中の標準的な薬理学的介入に応答しない、虚血性 STセグメントまたはＴ波異常を伴う再発性アンギナ、あるいは 3) 梗塞後早期アンギナ：心筋梗塞の記録から７日以内の虚血性STセグメントまたはＴ波変化を伴う安静時アンギナ、又は最小限の運動(2met)で誘発されるアンギナ、ここで、一過性虚血性STセグメントまたはＴ波異常を、次のように定義した。 a) ≧１mmのSTセグメント低下（Ｊ点（J point）後80ミリ秒）または上昇（Ｊ点後20ミリ秒）、および／または b) Ｔ波変化（通常は逆転）、さらにここで、採用時点における全症例のクレアチンキナーゼ(CK)は正常の２倍未満でなければならない。 (B) 急性Ｑ波心筋梗塞 1) 前駆血栓崩壊療法を用いない、心筋梗塞中の直接介入、または 2) 心筋梗塞中の血栓崩壊療法失敗のための救助血管形成術、ここで、採用する心筋梗塞を、下記の３つの基準のうち少なくとも２つが存在することと定義した。 (1) 長期アンギナ（30分を超える） (2) 正常の上限の２倍を超える総クレアチンキナーゼ上昇（CK-MBアイソザイム上昇により確認） (3) 次のように定義した梗塞のECG証拠 a) ３ケ所のうち少なくとも１ケ所における、少なくとも０．１ｍＶのＳＴセグメント上昇（Ｊ点後０．２秒に測定）：ｉ）３つの下誘導（II、III、aVF）のうち少なくとも２つ、または ii）６つの前胸部誘導（V1〜V6）のうち少なくとも２つ、または iii）誘導ＩおよびaVL、または iv）傷害の後電流（posterior current）と一致する前胸部誘導V1〜V4 のSTセグメント低下（ミラールール）、またはｖ）左束分枝遮断の存在下、下誘導または前誘導における一次ＳＴ変化 b) 0.04秒以上の持続期間であるか、対応するＲ波振幅の４分の１以上の深さであるか、その両者である新しい有意Ｑ波。 (C) ハイリスク臨床特徴／形態学的特徴 1) 拡張すべき動脈における、２つ以上のＢ型病変特異的特徴を伴う狭窄。病変特異的特徴はACC/AHA基準を基にした。 2) 拡張すべき動脈における、１つ以上のＣ型特徴を伴う狭窄 3) 65才以上の女性で、少なくとも１つのＢ型特徴を伴う狭窄。 4) 真性糖尿病および拡張すべき動脈における、少なくとも１つのＢ型特徴を伴う狭窄、または 5) 特徴的CK-MBアイソザイム上昇により記録された、心筋梗塞後７日以内の梗塞関連病変の血管形成術。 II．年齢18〜80才の男性、および出産の可能性がない年齢18〜80才の女性（すなわち、外科的に不妊処置をしたか、少なくとも１年間月経がないと定義された閉経後の女性）。 III．プロトコール特異的手技および試験薬投与の開始前に準備された、文書によるインフォームドコンセント。下記のうちの一つの理由により、その理由がなければ本試験に参加資格のある患者の参加を除外した。 (1) 出血性素因の既往歴 (2) 試験採用の６週間以内の大手術 (3) 最近（採用の６週間以内）の臨床上重大な胃腸または尿性器の出血 (4) 採用前２年以内の発作または重大な神経学的残存欠陥を伴うあらゆる発作 (5) 左主冠動脈の50％を超える閉塞 (6) 推定される又は記録された、脈管炎の既往歴 (7) 提示された試験薬注入より前の７日以内の、治験薬または用具の評価を含む、他の臨床調査研究への参加 (8) 無作為化前プロトロンビン時間がコントロールの1.2倍以下でない場合、試験薬への無作為化前７日以内の、経口抗凝固薬の投与 (9) 血管形成術前および血管形成術中のために計画された静脈内デキストランの使用 (10) 以前のネズミ・モノクローナル抗体の投与歴またはネズミ蛋白に対する既知のアレルギー、または (11) インフォームドコンセントを与えられないこと。全ての研究施設で研究施設内審査委員会の認可が得られ、全ての患者患者からインフォームドコンセントが得られた。1991年12月から1992 年11月の間に治験への参加募集が行われ、2099例が合衆国内の56ケ所の研究施設で採用された。研究のプロトコル患者は全て、アスピリンとヘパリンで処置した。アスピリンは、少なくとも手技の２時間前に３２５ｍｇの用量を経口投与し、その後１日１回３２５ｍｇの用量を維持した。ヘパリン（ぶた）は、初回ボーラスとして１００００ないし１２０００単位を静脈内投与し、その後１５分間隔で３０００単位までの増強ボーラスを与えたが、総量２００００単位を超えないようにした。目標は、一般に３００ないし３５０秒と考えられている「治療」範囲内の活性化全凝固時間を保つことであった（ケイ・ジー・ドファーティーら、アブストラクツ・オブ・ザ・シクスティー・サード・サイエンティフィック・セッションズ、ＩＩＩ−１８９頁（１９９１年）；ビー・ラスら、ブリティッシュ・ハート・ジャーナル・６３巻１８−２１頁（１９２０年）；ジェイ・ディー・オウギルビーら、カテーテリゼーション・アンド・カーディオバスキュラー・ダイアグノシス１８巻２０６−９頁（１９８９年））。ヘパリンは、少なくとも１２時間、１時間１０００単位の割合で恒常点滴を続けた。静脈内および冠内硝酸塩を、臨床的適応であれば使用した。キメラの７Ｅ３Ｆａｂ（γ１，κ）は、０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１Ｍ燐酸ナトリウムおよび０．００１％ポリソルベート８０を含み１ミリリットル当たり２ｍｇのモノクローナルＦａｂを含むｐＨ７．２の発熱物質不含有の溶液として供給された。退院時に必要とされた治療は、１日３２５ｍｇのアスピリンのみであった。患者は、二重盲検計画で、３つの処置群のひとつに同じように無作為に分けた。第１群の患者は、０．２５ｍｇ／ｋｇの用量でｃ７Ｅ３Ｆａｂのボーラスを受け、その後１０μｇ／分の用量でｃ７Ｅ３Ｆａｂの連続点滴を受けるものとした。第２群は、０．２５ｍｇ／ｋｇの用量でｃ７Ｅ３Ｆａｂのボーラスを受け、プラセボの連続点滴を受けるものとした。第３群は、プラセボのボーラスを受け、プラセボの連続点滴を受けるものとした。ボーラスは、手技開始の少なくとも１０分前に開始し、５分間にわたって投与し、点滴は、臨床的禁忌症状が出ない限り１２時間続けた。血小板計数用血液試料は、薬剤投与開始後３０分、２、１２および２４時間、並びにその後退院まで毎日、栓球減少症の証拠を注意深く調べるために採取した。生命窮迫性出血および栓球減少症を評価し処置するために、あらかじめ考案したアルゴリズムを使用した（ディー・シー・セーンら、アナルス・オブ・インターナル・メディシン１１１巻１０１０−２２頁（１９８９年））。プロトコルには赤血球の管理について特に指示はなく、その代わりに、各部所に存在する実施パターンにしたがって輸血が処方された。血管形成術は、標準的プロトコルにしたがって実施した。手技前および手技後血管造影は、１５０−３００μグラムの冠内ニトログリセリン投与による冠血管拡張後に実施した。手技後、血管鞘を研究薬剤点滴終了後少なくとも６時間維持した。さらに、シースをヘパリン点滴後少なくとも４時間および許容可能な活性化部分トロンボプラスチン時間が達成されて止血作用が維持されるまでその場に残した。研究の終了点独立した臨床終了点委員会（Clinical Endpoint Committee）が、研究終了点または主要な副作用である可能性のある症状発現を全て精査した。この委員会は、研究中の処置について盲検を維持し、症例報告書式、心電図および必要に応じて患者の医療記録を精査した。事象の分類には、２名の査定員の同意を必要とした。試験の主要終了点は、無作為分類後の最初の３０日内における下記事象の何れかひとつの発生を含む複合的臨床終了点である。（１）何らかの原因による死亡；（２）非致命的心筋梗塞；または（３）緊急的介入：（ａ）２回目の血管形成術。再発性急性虚血に対する反復的経皮的介入（バルーン式血管形成術または冠アテレクトミー）。予定（例えば設定手技）は終了点事象と判断しなかった；（ｂ）冠動脈バイパス移植。再発性急性虚血治療のための緊急的（非選択的）外科介入；（ｃ）冠血管内ステントの挿入。拡張血管の即時開存性を維持するための冠内ステント設置；または（ｄ）大動脈内カウンターパルセーションバルーンポンプの挿入。反復的血管形成術または外科介入の候補と考えられない患者における再発性虚血のために設置されたバルーンポンプ。この研究目的のため、「開存性」を、術者の測定で目視狭窄５０％またはそれ未満および心電図上虚血の証拠がないＴＩＭＩ２−３級の流れと定義した。終了点心筋梗塞は、次のように定義した：１．急性進展心筋梗塞の２４時間内に無作為分類した患者では、その後の非致命的心筋梗塞の診断については２種の酵素基準の内のひとつを満たすこととした：（ａ）前回の「谷」（前のピーク値より２５％下がるが正常値の上限の少なくとも２倍であると定義）から少なくとも３３％増加を示す、正常値の上限の３倍のクレアチンキナーゼ（ＣＫ）またはクレアチンキナーゼＭＢ；または（ｂ）前のピークレベルより５０％下がり正常値の２倍より低い「谷」レベルを示した後、ＣＫまたはＣＫ−ＭＢが少なくとも１００％上昇し、正常値の上限の３倍である。心臓酵素の再上昇を伴う長期狭心症（２０分超）の証明された新規発作を、再梗塞開始時の確定に使用した。証明された狭心症がない場合、再梗塞の開始は、新規上昇の直前の酵素レベルの谷の測定時と設定した。研究開始時に存在した心筋梗塞の開始２４時間以内に再発性狭心症の開始および／または酵素レベルの谷が起こった患者にのみ、定義１を使用した。全ての症例で、得られない場合を除きＣＫ−ＭＢレベルを使用し、その場合総クレアチニンキナーゼ値を使用した。２．急性梗塞後２４時間を超えた後または最近の梗塞なしに試験に参加した患者では、院内心筋梗塞の診断のために２種の基準中ひとつを満足しなければならないとした：（ａ）２以上の近接誘導における≧０．０４秒持続または対応Ｒ波幅の＞１／４の深度の新規Ｑ波；または（ｂ）正常値の上限の少なくとも３倍のＣＫ−ＭＢレベルおよび前回「谷」レベルより≧５０％の上記レベルの上昇。この定義の場合、研究開始時に急性心筋梗塞をもつ患者の再梗塞の開始時は、長期狭心症（＞２０分）の新規発作発生時または新規酵素上昇前の酵素の谷の測定時とした。この定義の適用については、どちらの時期も初回梗塞後２４時間以降である。３．退院後、心筋梗塞の診断のために下記２種の基準の内ひとつを必要とした：（ａ）２以上の近接誘導における、≧０．０４秒持続もしくは対応Ｒ波幅の≧１／４の深度の新規Ｑ波またはその両者；または（ｂ）正常値の上限の少なくとも２倍のＣＫもしくはＣＫ−ＭＢレベル。主要終了点の別の構成要素は、介入のための非計画的な血管形成術の実施として定義される緊急的反復的介入の必要性である；計画的に設定された手技は主要終了点に含めなかった。同様に、再発性虚血の処置のための緊急的冠手術または血管形成術手技の失敗のみを主要終了点に加えた。管内ステント設置は、ステントが血管形成術を受けている血管の窮迫または現実の突発閉塞の処置のために設置された場合に、主要終了点と判断した。大動脈内バルーンポンプ設置は、ポンプが反復的血管再生手技を受けていない患者の再発性虚血の処置のために設置された場合に、主要終了点と判断した。出血事象は、心筋梗塞における血栓溶解研究グループ(Thrombolysis in Myoca rdial Infarction Study Group)の基準（エイ・ケイ・ラオら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・オブ・カーディオロジー１１巻１−１１頁（１９８８年））を用いて、大、小または軽微に分類した。大出血は、頭蓋内出血または５ｇ／ｄｌを超えるヘモグロビン減少（または、ヘモグロビンが得られない場合、少なくとも１５％のヘマトクリット減少）を伴う出血と定義した。小出血は、３ｇ／ｄｌを超えるヘモグロビン減少（または、ヘモグロビンが得られない場合、少なくとも１０％のヘマトクリット減少）を伴う自発性および肉眼血尿もしくは吐血として観察されるか、または出血部位が同定されない場合、４ｇ／ｄｌを超えるヘモグロビン減少（または、ヘモグロビンが得られない場合、少なくとも１２％のヘマトクリット減少）とした。輸血を受けた患者の場合、大または小の何れの出血が起こったかを決定するために用いる総ヘモグロビン減少値を得るために、輸血単位数を、観察ヘマトクリット減少値を３で除した値に加えた（シー・エス・ランドフィールドら、アメリカン・ジャーナル・オブ・メディシン８２巻７０３−１３頁（１９８７年））。データ管理および統計患者は、デューク大学のデータコーディネーティングセンターに電話連絡することにより無作為分類した。無作為化分類は、研究部位により、また患者が急性進展心筋梗塞をもつかどうかにより階層化した。以前のデータに基づき、患者２１００名のサンプルサイズで、主要終了点の３３％減少（プラセボ群では１５％と予想）を検出力０．８、α＝０．０５で検出するために計画を行った。データは、症例報告様式で研究コーディネーターが収集し、データ登録前に盲検の研究監督が検討した。主催者は、全ての患者が登録され全ての終了点が臨床終了点委員会により裁定されるまで、無作為化コードおよび研究結果について知らされないままであった。ベースライン特性は、連続変数の中央値および２５および７５パーセンタイルとして、並びに不連続変数の百分率として、下記の表に示す。試験の主要終了点は、登録後最初の３０日以内に複合的終了点の構成要素の何れかひとつが最初に起こるまでの時間を考慮して分析した。もし３０日期間内に事象が起こらなければ、患者の追跡は３０日後に検閲した。各処置のカプラン−マイヤー生存曲線を、結果のグラフによる表示に使用した（イー・エル・カプランら、ジャーナル・オブ・アメリカン・スタチスティカル・アソシエーション５３巻４５７−８１頁（１９５８年））。全ての処置の比較は、処置意志（intention-to-treat）の原則を用いて実施した。主要終了点については、ボーラス単独患者をボーラスと点滴群の中間と考えて傾向（用量−反応）のログ−ランク検定（log-rank test）を実施した（ジェイ・ディー・カルプフライシュおよびアール・エル・プレンティス、ザ・スタティスティカル・アナリシス・オブ・フェイリュア・タイム・データ、ジョン・ワイリー・アンド・ソンズ、ニューヨーク（１９８０年））。ついで、トレンド検定が有意ならば、分析計画を対照群と２種のｃ７Ｅ３Ｆａｂ群のそれぞれとの間で２点（pairwise）ログ−ランク比較試験に供した。安全性の暫定分析は、患者の３分の１および約３分の２でデータが得られる場合に実施した。各暫定分析での用量−反応曲線の有意性の判定に用いた名目的アルファ水準は、総第１種過誤率 (type I error rate)を≦０．０５に維持するようにあらかじめ規定した。最終分析では、比較に使用した有意水準は０．０３６であった。これらの比較は主として説明を目的とするものであるが、同様な方法（トレンドの検定後に適当ならば２点処置比較を行う）を、複合的終了点の各構成要素に対する処置の関係を調査するために最終分析で使用した。また、最終分析では、出血性合併症の測定に関して処置を比較するために、この方法を、慣用されるカイ２乗分析を用いて使用した。主要なサブグループ（年齢、性、体重、臨床的サブグループ）における処置効果の見込み率と信頼区間を計算しグラフに示した。結果患者の臨床ベースライン特性は、登録基準を含む病変特性に加えて、糖尿、最近の心筋梗塞、高齢および女性が高いため、この集団は、血管形成術の急性合併症のリスクが増加していることを示している。患者の大部分は良好な左心室機能と１または２血管の疾患をもっていた。介入措置の詳細は表１２に挙げる。処置の割当による実質的差異は認められなかった。総括的主要終了点およびその構成要素を表１３に示す。プラセボと比較すると、ｃ７Ｅ３Ｆａｂによるボーラス単独群における複合事象率の１１％減少（ｐ＝０．４３）およびボーラスプラス点滴群における事象率の３５％減少（ｐ＝０．００８）という段落的効果（ｐ＝０．００９）が示された。同様な段階的効果が、表１３に示す最も重要な虚血性終了点のそれぞれについて観察された。すなわち、持続した糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ持続的な遮断は非致死性梗塞、緊急冠バイパス手術および緊急的経皮的血管再生を減少する一方、同方向の有意ではない傾向がボーラス単独で生じた短期遮断でみられた。ボーラスと点滴群における死亡の３例は、無作為分類後で薬剤投与前に死亡した患者であった；それにも拘らず、これらの死亡例は、処置意志の原則にしたがって分析に含めた。非致死性虚血事象はｃ７Ｅ３Ｆａｂにより予防されたので、非致死性心筋梗塞の重症度に関心がもたれる。表１４に示すように、Ｑ波梗塞および大きな酵素上昇を伴う梗塞の両者とも予防され、用量−反応効果が存在した。非致死性虚血事象の時期は、正確に時期がわかる事象である緊急的反復血管形成術に関して３群で異なっていた（図１０参照）。プラセボ群における事象の大部分は指標手技後の最初の時間に起こったが、ボーラス群では、レセプター最大遮断の時期に対応して、事象発生までに数時間（〜６−１２時間）の遅れが認められた。ボーラスプラス点滴群では、虚血事象開始の著明な遅れとその絶対頻度の著明な減少があった。入院中の出血性合併症のプロフィールを表１５に示す。効果の主要終了点と同様、出血に対する処置の段階的効果が明かである。ボーラスプラス点滴群の患者は、大出血率および輸血率の両者で実質的増加を示したが、ボーラス単独患者は中等度の増加しか示さなかった。外科的血管修復率は均一に分布していたが（プラセボ群およびボーラスプラス点滴群で１％並びにボーラス単独群で２％）、出血発現の大部分は冠動脈バイパス移植手術中または鼠径部血管穿刺部位で起こった。また、６名の患者は頭蓋内出血を起こし、プラセボ群で２件、ボーラス単独群で１件およびボーラスプラス点滴群で３件であったが、そのうち１件は、出血が無作為化後で血管形成術前に起こったので薬剤投与を受けなかった。２次的臨床事象の頻度は低く、処置によりこれらの結果に大きな差異はみられなかった。心不全の３０日率（２．３％，２．４％，２．３％）、持続低血圧（３．０％，３．６％，４．１％）、心室細動（３．０％，２．６％，３．４％）および臨床的虚血発症（２１％，１７％，１８％）は、プラセボ群、ボーラス群およびボーラスと点滴群でそれぞれ類似していた。処置の効果を、患者が急性梗塞、不安定狭心症またはハイリスクの病理所見の何れかにより定義したサブグループ（図１１参照）において評価したところ、ｃ７Ｅ３Ｆａｂの利点は３種の登録カテゴリー全部に存在した。同様に、処置の効果は、年齢と性で定義したサブグループ間で均質であった。体重の関数として、ｃ７Ｅ３Ｆａｂボーラスプラス点滴の効果の利点は、体重が重い患者で処置の効果が大きかったが、全ての患者スペクトルで存在した。大出血の危険性は、ボーラス単独およびボーラスプラス点滴の両療法について、体重の重い患者に較べて軽い患者で増加していた。最も軽い３分の１の患者では、大出血は、ボーラスプラス点滴、ボーラス単独およびプラセボ処置患者でそれぞれ２１対１５対７％であり、他方最も重い３分の１では、対応する出血は８、７および７％であった。最も軽い３分の１の患者における包装赤血球輸注を、ボーラスプラス点滴、ボーラス単独およびプラセボ処置患者でそれぞれ２４、２０および１１％に行ったが、最も重い３分の１では対応率は１１、７および４％であった。考察これらの結果は、経皮的冠血管形成術を受けている患者の急性虚血性事象の発生における血小板、恐らくは血小板由来伝達物質、および血小板機能の重要性を確認するものである。ＥＰＩＣ試験を、突発性血管閉鎖（再閉塞）および付随合併症の危険性が高い一団の患者を登録するために特別に計画した。以前のデータベースの分析は、患者のあるものが急性梗塞（アール・エス・スタックら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・オブカーディオロジー１１巻１１４１− ４９頁（１９８８年））、重症不安定狭心症（アール・ケイ・マイヤーら、サーキュレーション８２巻（補遺ＩＩ）ＩＩ−８８−ＩＩ−９５頁（１９９０年））または血栓の血管造影像（ディー・ディー・シュグリューら、ブリティッシュ・ハート・ジャーナル５６巻６２−６６頁（１９８６年）、ビー・ディー・ヘットマンら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・カーディオロジー１５巻１５４Ａ頁（１９９０年））のような血管血栓の臨床的指標に基づきハイリスクとして分類できることを示した。他の患者は、血管微小径、散在疾患または血管形態不良（アイ・エヌ・シンクレアーら、アメリカン・ジャーナル・オブ・カーディオロジー６１巻６１Ｇ−６６Ｇ頁（１９８８年）；エヌ・エイ・ルオッコら、アメリカン・ジャーナル・オブ・カーディオロジー６９巻６９−７６頁（１９９２年）；エス．ジー．エリスら、アメリカン・ジャーナル・オブ・カーディオロジー６３巻、３０− ４頁（１９８９））のような物理的因子のためにハイリスクであった。両タイプの患者の実数を試験に登録し、各タイプの患者に対する血小板凝集阻害の重要性を洞察ができるようにした。このような危険性の高い患者を入れると、全ての患者でアスピリンと高用量のヘパリンを使用したにも拘らず、プラセボ処置患者で１５％におよぶ率の虚血性事象が起こると予期された；この予期事象率は、ほぼ実現した。ｃ７Ｅ３Ｆａｂの投与は、非致死的心筋梗塞、緊急血管形成術の必要性および緊急冠バイパス手術の減少などの主要効果とともに、複合事象率の３５％減少をもたらした。ｃ７Ｅ３Ｆａｂボーラスは、血小板凝集に影響する時間の長さに対応して、これらの事象の発生遅延を起こした。しかし、ボーラスの４ないし６時間後に、虚血事象が起こりはじめた。事象の遅延に加えて、著明で長期の血小板阻害を生じた（実施例４参照）ボーラスと点滴の組み合わせ処置は、また急性虚血事象の発生をも予防した。複合終了点は、血管形成術周辺期間における虚血事象に対するこの処置の与えるインパクトの総括的予測を提供した。この試験から得られる最も重要な知見のひとつは、種々の終了点を通して事象減少のプロフィールが一貫していることである。心筋梗塞の減少は、実質的であり、その後の緊急措置の臨床的必要性の低下と一致していた。非致死的梗塞の分類は、経皮的冠介入の評価の主要な問題点となっている。正常値の上限を超えるクレアチニンキナーゼＭＢの上昇は通常認められ、一連の報告における患者の４ないし２１％に亘っていた（エル・ダブリュー・クラインら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・カーディオロジー１７巻６２１−６頁（１９９１年）；エイ・シー・ハントら、ヨーロピアン・ハート・ジャーナル１２巻６９０−３頁（１９９１年）；ピー・ポーレットら、アメリカン・ジャーナル・オブ・カーディオロジー６９巻９９９−１０００頁（１９８７年）；ジェイ・ジェイ・スパダロら、カテテリゼーション・アンド・カーディオバスキュラー・ダイアグノシス１２巻２３０−４頁（１９８６年））。これらの酵素上昇が一律に別個の臨床的事象に関連しない場合には、長期の不利な結果との関連性はまだ証明されていない。すなわち、関連する臨床的虚血事象がない孤立した酵素上昇の予防は、予後的に意味がないかも知れない。この微妙な領域の客観的妥当性を確認するため、酵素と心電図を系統的に集め、盲検的終了点委員会を使用して、心筋梗塞として事象を分類するのに心筋特異的酵素の少なくとも３倍の増加を必要とすることとした。ｃ７Ｅ３Ｆａｂが緩和な酵素上昇、大きな酵素上昇およびＱ波発現を伴うものを含めて、心筋梗塞の全スペクトルを減少させるとの知見は、特に救急的冠再血管形成手技の必要性もまた減少することから、予防された事象の臨床的重要性を再確認するものである。死亡率に対する効果は期待も観察もされなかったが、薬剤を受けなかったボーラスおよび点滴群患者での３死亡例が注目される。これらの死亡例は、処置意志（intention-to- treat）の原則にしたがって主要分析に計数された。死亡した他の全ての患者は、割り当てられた治療を実際に受けていた。血管形成術にともなう死亡率が低いとすると、死亡率に対する２５％の有利または不利な処置効果を検出するのに２００００名を超える患者が必要である。ハイリスク血管形成術という状況における臨床的終了点に対する糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプター遮断の有利な効果は納得できるものであり、難治性不安定狭心症において血管形成術を受けている患者に同じ抗体を使用した最近の初期試験における、肯定的な結果と一致する（エム・エル・サイムーンスら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・カーディオロジー２１巻２６９Ａ頁（１９９３年））。これがＩＩｂ／ＩＩＩａ遮断に関する最初の大規模試験なので、血小板減少症誘発に対する懸念があった。しかし、ｃ７Ｅ３Ｆａｂでは、僅かで、臨床的に重要でない血小板上昇があっただけである。具体的には、分析によると、ボーラスプラス点滴処置群（５．２％）の患者が、血小板減少症（血小板数＜１０００００／μＬ）を、ボーラス処置群（３．６％）またはプラセボ処置群（３．４％）より多く経験したことが明らかになった。すなわち、ボーラスプラス点滴処置群では、プラセボ群に比較して、血小板減少症（血小板数＜１０００００／μＬ）の発生の増加があった（２点比較ｐ＝０．０６２）。重症の血小板減少症（血小板数＜５００００／μＬ）は、ボーラスプラス点滴処置群患者で１１名（１．６％）およびプラセボ処置群患者で５名（０．７％）に起こった。ボーラスプラス点滴群およびプラセボ処置群のそれぞれでわずか４名（＜１％）の患者が、重症血小板減少症および重大な、生命に危険があるかまたは致死的な有害事象を示していた。血小板減少症の発症は全て一過性で、典型的には最初の２〜３日に起こった。出血合併症と輸注の顕著な増加が処置患者にみられた。この増加は、主として大腿穿孔部の出血の結果であり、３群間で最低ヘマトクリットまたは生命に危険がある合併症に差がなかった。手術患者が分析に含まれるか否かでは、傾向は同じであった。この盲検研究においては、どの処置が与えられているかわからないので、止血能力についての懸念から、ある施設での輸血決定の閾値が低くなっていたかもしれない。我々の以前の経験では、血栓溶解療法の処置を受けている患者における出血および輸血管理用の改良プロトコルが、血液製品投与の減少に効果があった（ティー・シー・ウオールら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・カーディオロジー２１巻５９７−６０３頁（１９９３年））。処置による利益と出血の危険性の間の体重の関数としての相互作用は予期したよりも複雑であった。主要事象の発生率と大出血の危険性は、プラセボ処置患者では体重による明らかな変化はみられなかったが、ｃ７Ｅ３Ｆａｂボーラス単独患者およびボーラスプラス点滴患者の両者では、主要起結事象の発生率及び大出血の発生率の高率化に向かう明確な傾向が体重の減少とともにみられた。経皮的血管再生の前、途中または後の患者における糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターを遮断するこの方法の臨床的有用性の判断は、血液製品投与に対する虚血事象の回避の相対的価値により判断される。この試験に登録したハイリスク患者では、バランスは好ましいようである。急性心筋梗塞または緊急的反復血管再生の予後的意義は重大であり、幸いにも輸血の危険性は連続的に低下している（ジェイ・ジー・ドナヒューら、ニュー・イングリッシュ・ジャーナル・オブ・メディシン３２７巻３６９−７３頁（１９９２年）；アール・ワイ・ドッドら、ニュー・イングリッシュ・ジャーナル・オブ・メディシン３２７巻４１９−２１頁（１９９２年）；ケイ・イー・ネルソンら、アナルス・オブ・インターナル・メディシン１１７巻５５４−９頁（１９９２年））不要な出血と輸注を減らし、抗トロンビンおよび抗血小板作用を含めた抗血栓療法をより有効に投与するための実務アルゴリズムを使用することについての努力は、この試験でみられた臨床上の利益をさらに増強するものである。実際に、器具使用患者における強力な非経口投与抗血栓剤は、抗血栓療法剤の体重調整処方に焦点を当てるべきである（例えば、ここにおいて、ヘパリン用量は体重調整されなかった）。さらに詳細な物理的評価および関係する施設に一貫して適用されるべき出血減少法を定義するプロトコルの使用は、出血合併症の発生についてより多くの情報をもたらすことができる。場合により突発閉鎖が主として血栓であったり主として機械的であったりするが、患者集団を通じて処置効果が広く一貫していることは、多数の患者で血栓形成がより重要な役割を占めることの強い証拠である。ボーラス療法で起こる事象発現の遅れおよびボーラスと点滴による事象の予防は、ほとんどの状況下で破壊された動脈表面が手技後１８ないし２４時間までに血栓形成性の多くを失うことを意味する。治療方法は、突発血管閉鎖の危険性が大きな患者における持続的抗血栓作用の必要性を考慮に入れるべきである。要約すると、この試験は、危険性の高い経皮的血管再生を受けている患者における、再閉塞または突発閉鎖の減少および／または予防における糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａレセプター持続遮断の有利な効果を示すものである。この利点は出血増加の危険性を冒して得られるものではあるが、総体的臨床結果を考察すると、手技前の臨床的および血管造影的予測因子に基づいて、急性虚血合併症の危険性が高いことが知られている患者においてこの方法が有利であることがわかる。この試験は、細胞インテグリンの機能抑制に関する有意義な治療方法について最初の確証をもたらすとともに、将来における他のセクレチンおよびインテグリン標的についてバイオテクノロジーのために、またこの特異的ＩＩｂ／ＩＩＩａ糖蛋白に対する非抗体またはペプチド法のために、道を開くものである。実施例７抗ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａキメラ抗体フラグメントの早期投与による冠介入後の臨床的再狭窄の減少バルーン血管形成術および冠介入後の再狭窄過程は極めて普遍的であり、２５％を超える症例において６か月以内に狭心症症状の再発と反復的血管再生の必要性をもたらすものであり、合衆国で年間２０億ドルを超える総費用を要している（ジェイ・ジェイ・ポプマら、サーキュレーション８４巻１４２６−１４３６頁（１９９１年）；イー・ジェイ・トポルら、サーキュレーション８７巻１４８９−１４９７頁（１９９３年）；ジェイ・ピー・アール・ヘルマンら、ドラッグス４６巻２４９−２６２頁（１９９３年））。再狭窄の主要な生物学的引き金は、介入部位で膨張したバルーンまたは代替え装置により誘発され、血小板血栓形成と内側平滑筋の休止・収縮状態から遊走・増殖・分泌機能を持つ状態へのフェノタイプの変化を伴った血管傷害である（ジェイ・エス・フォレスターら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・カーディオロジー１７巻７５８−７６９頁（１９９１年）；ジェイ・エイチ・イプら、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・カーディオロジー１７巻７７Ｂ−８８Ｂ頁（１９９１年）；ダブリュー・カッセル、サーキュレーション８６巻７２３−７２９頁（１９９３年））。種々の薬理学的作用剤が試験モデルにおいて血管傷害後に起こる特徴的血管筋内膜増殖の調節に成功し、少数の研究が血管造影上の利点を示唆しているが、有効な薬剤を証明するための患者における大規模臨床試験はまだなく、今までこの事象の可能性を減少することが知られた薬理学的治療はなかった（ジェイ・ジェイ・ポプマら、サーキュレーション８４巻１４２６−１４３６頁（１９９１年）；ジェイ・ピー・アール・ヘルマンら、ドラッグス４６巻２４９−２６２頁（１９９３年）；メルカトル研究団、サーキュレーション８６巻１００−１１０頁（１９９２年））。冠血管形成術は、補助的経口アスピリンおよび静脈ヘパリンとともに日常的に実施されている。しかし、この抗血栓法は、血小板凝集を弱く阻害するだけである。トロンビン、コラーゲンおよびアデノシン２燐酸を含む種々のアゴニストが、アスピリン療法を行っていても血小板を刺激する。血小板の分子生物学は、糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリンが血小板凝集のレセプターの役をすることを解明した（イー・エフ・プロウら、プログレス・イン・ヘモスタシス・アンド・トロンボシス２９６巻３２０−３３１頁（１９８８年）；ビー・エス・コラーら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション７６巻１０１−１０８頁（１９８５年））。キメラ７Ｅ３抗体Ｆａｂフラグメントは、血小板ＩＩｂ／ＩＩＩａインテグリンに選択的に結合する。初期の研究がキメラモノクローナル抗体Ｆａｂフラグメントの予備的安全性と有効性を確認した後、２０９９名の患者による多施設、二重盲検、プラセボ対照試験を実施した（実施例６参照）。突発閉鎖の抑制を示す急性期の主要虚血事象の減少という主要な有効性終了点に加えて（実施例６参照）、ｃ７Ｅ３が、その後の６か月フォローアップ期間での虚血事象または反復血管再生の必要性により定義される臨床的再狭窄を減少させ得ることが確認された。方法研究用母集団とプロトコルの詳細は実施例６に記載した。要点を再説すると、患者が冠血管再生術または方向性（directional）アテレクトミーを受け、進展中または最近の心筋梗塞、不安定狭心症もしくはアメリカン・ハート・アソシエーション／アメリカン・カレッジ・オブ・カーディオロジーの基準（ＡＣＣ／ＡＨＡタスク・フォース・レポート、ジャーナル・オブ・アメリカン・カレッジ・カーディオロジー１２巻５２９−５４５頁（１９８８年））により定義される危険生の高い血管造影上の病変形態をもつ場合に参加資格ありとした。除外基準は、出血性素因、年齢≧８０、２年以内の発作または６週間以内の大手術とした。プロトコルは、５６の参加施設全ての研究検討委員会で承認され、全ての患者からインフォームドコンセントを得た。患者は、経口アスピリン（１日３２５ｍｇ）を受け、初回用量は手技の２時間以上前に投与した。静脈内ヘパリンを、少なくとも３００秒の活性化血栓時間を達成するように手技中に投与した。アスピリンおよびヘパリンに加えて、患者を下記３種の選択的療法のひとつに無作為に配分した：（１）プラセボボーラスおよびプラセボ１２時間点滴；（２）活性ｃ７Ｅ３（セントコア、ペンシルバニア州マルバーン）；または（３）同用量の活性ｃ７Ｅ３ボーラス、直後に１０μｇ／分のｃ７Ｅ３を１２時間点滴。ボーラスは、少なくとも冠介入手技の１０分前に投与した。主要終了点は、何らかの原因による死亡、心筋梗塞、急性虚血のための冠動脈バイパス手術、急性虚血のための反復経皮冠介入、虚血治療のための管内ステントまたは大動脈内バルーンポンプの挿入の必要性の、３０日間における複合的発生とした。これらの事象は全て、研究中の処置に関して知らされていない独立した臨床終了点委員会により検討され、分類には少なくとも２名の査定員の同意を必要とした。６か月の追跡中、二重盲検を保った。その後の死亡または非致死的心筋梗塞の虚血事象に加えて、患者を経皮冠介入もしくは冠状動脈バイパス手術またはその両者からなる反復血管再生手技の必要性決定に供した。主旨が突然の虚血事象の代わりではなく血管再生手技の必要性であるため、急性相の終了点と異なって、結果にステントまたは大動脈内バルーンポンプの使用は含めなかった。退院後の心筋梗塞の診断基準には、２以上の近接誘導における、≧０．０４秒持続もしくは対応Ｒ波幅の≧１／４の深度の新規有意なＱ波または正常値の上限の２倍を超えるクレアチニン・キナーゼもしくはクレアチニン・キナーゼ心筋バンドを必要とした。血管再生データを、元の標的血管が反復手術または経皮血管再生を受けたかどうかとともに収集した。追跡は、９７．２％完全であった。６か月後の結果が急性期の結果と分類しているかどうかを評価するために、ベースラインから６か月までの全事象、３０日終了点後に初期介入が成功した（虚血性合併症を伴わず、臨床研究者の読みで最終狭窄５０％未満の達成として定義される）患者に起こった事象および４８時間後に初期介入が成功した患者に起こった事象を分析に含めた。３０日終了点は、多数の冠血管介入試験の先例により前向きに選択した。４８時間の区切りは、定義により、冠介入後のほとんど全部の突発閉鎖がこの時間帯に起こることが知られているために使用した（ケイ・エム・デトルら、ジャーナル・オブ・カレッジ・カーディオロジー１３巻２３０Ａ頁（１９８９年）；エイ・エム・リンコフら、ジャーナル・オブ・カレッジ・カーディオロジー１９巻９２６−９３８頁（１９９２年）；ピー．ジェイ・ファイターら、サーキュレーション８３巻９２７−９３６頁（１９９１年））。無作為化は、デュークコーディネーティングセンターに電話連絡することによりおこない、研究施設により、また患者が急性心筋梗塞をもつかどうかにより階層化した。データは、別個の６か月症例報告様式で研究コーディネーターが収集し、その品質はデータ登録前に盲検の研究監督が元記録により検討した。主催者は、全ての患者の追跡が完了され、事象が終了点委員会により裁定され、データベースが完全とわかるまで、追跡結果について知らされないままであった。統計分析全ての処置の比較は、処置意志の原則により行った。事象発生率は、カプラン −マイヤー法（イー・エル・カプランおよびピー・マイヤー、ジャーナル・オブ・アメリカン・スタチスティカル・アソシエーション５３巻４５７−８１頁（１９５８年））により推定し、結果を図示するため生存曲線を使用した。プラセボ対ボーラス対ボーラスと点滴の事象発生率における用量反応検定を（それぞれ０、１および２のスコアで）一般的ログランク(generalized l og-rankstatistics)統計法を用いて実施した。また、プラセボとｃ７Ｅ３処置のそれぞれの２点比較をログランク統計法で実施した。比例ハザード（コックス）モデルが、ベースライン特性と結果の見込み相関性の検討に適合した。これらは、モデル化された処置の相違と組み合わせて全ての処置群につき、また処置群毎に、処置群間の差異を調べるために行った。さらに、比例ハザード（コックス）モデルが、遅延事象または処置効果と関連するかもしれない因子を調べるために、４８時間追跡後の全事象の複合終了点に適合した。この分析に含めた因子は、処置、血管再生した単独または複数の病変部、手技の持続時間、ベースラインにおける心筋梗塞もしくは不安定狭心症、または他のハイリスクな登録基準、性、年齢６５≧または＜６５、体重および真性糖尿病であった。結果登録は、２０９９名の患者について１９９１年１２月１日からはじめ、１９９２年１１月１８日に終わった。全試験集団の特性は前記の通りである（実施例６、表１０参照）。初期血管再生術またはアテレクトミーが成功した、すなわちその後の臨床的再狭窄の資格がある患者のベースライン特性は、表１６に示す。初期手技成功患者のベースライン特性に処置割り当てによる顕著な差異はなかった。ｃ７Ｅ３ボーラスまたはボーラスと点滴を受けている患者は、主として最初の４８時間の、出血性合併症と、ほぼ２倍の輸血率を示した（プラセボは７％、ボーラス単独は１３％、ボーラスと点滴は１５％、ｐ＜０．００１）。１２時間点滴は、プラセボを受けている患者４８名（７．０％）、ボーラス単独患者８５名（１２．５％）、ボーラスと点滴群で１０７名（１５．８％）で、完全に完了しなかった。ｃ７Ｅ３で血小板減少症の有意な増加はなく、過敏またはアレルギー反応も現れなかった。陽性のひと抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応が、ボーラス処置患者の５．２％およびボーラスプラス点滴処置患者の６．５％で生じた。陽性ＨＡＣＡ患者のほとんどは、低い力価の反応を示した。ボーラス処置群の陽性ＨＡＣＡ反応をもつ３２名の患者は全部、力価≦１：１６００であった。陽性ＨＡＣＡ反応をもつボーラスプラス点滴群患者４０名中３４名は、力価≦１：１６００であった。ＨＡＣＡ力価が１：６４００ないし１：５１２００の者は、ボーラスプラス点滴処置群で６名であり、ボーラス処置群では全くなかった。３０日目で、プラセボ処置群（１２．８％，Ｐ＝０．００９）に比較して、ｃ７Ｅ３ボーラスと点滴処置患者で大虚血事象（死亡、心筋梗塞、緊急血管再生）の３５％減少（８．３％）があった（実施例６、表１３参照）。６か月データは表１７に示すが、これは（ａ）登録患者全部、（ｂ）登録後最初の４８時間に虚血性合併症なしに手技が成功した患者および（ｃ）初期手技が成功し最初の３０日間に事象がなかった患者団についての死亡、心筋梗塞および冠動脈バイパス手術または反復冠介入の必要性の結果を示す。６か月間で、虚血事象および血管再生の２３％減少があった（２７％対３５％、Ｐ＝０．００１；表１７参照、全患者登録、複合：死亡、ＭＩ，ＣＡＢＧ，ＰＴＣＡ）。反復標的血管再生がプラセボ処置（２２．３％）に対してｃ７Ｅ３ボーラスと点滴（１６．４％）で２６％減少した（Ｐ＝０．００７；表１７参照）ので、有利な長期効果は、主として初期手技成功患者におけるバイパス手術または反復血管再生術の必要性が少ないことによるものである。ボーラス単独患者群は、この試験に用いた基準では有意に良いといえない中間的な結果であった。別の分析において、最初の３０日間に主要効果事象を経験しなかった全患者の６か月データを研究した。この分析の結果は表１８に示す。このデータは、ｃ７Ｅ３ボーラスプラス点滴の急性期投与で反復血管再生手技の必要性が２１％減少したことを示す。また、試験に登録された全ての患者に関する全ての事象（死亡、非致死的梗塞または冠血管再生の必要性）のデータを図１２に示す。介入成功および３０日まで無事象の患者に関するデータも図１３に示す。急性期終了点の内、事象の８１％は４８時間までに起こった。これは、処置群を通じて同様であった（プラセボ８２．０％、ボーラス７９．７％、ボーラスと点滴８１．４％）。初期介入成功患者における最初の４８時間後の事象を考察することにより、最初の３０日間の選択的標的血管再生が確認される。図１４に示すように、ｃ７Ｅ３ボーラスとボーラスプラス点滴群の間に、３０日終了点後まで亜急性虚血事象にほとんど差がなかった。死亡、心筋血管再生および最初目を向けなかった血管を含む全ての血管再生の複合の代わりに、標的血管の血管再生のみに焦点を当てることが役立つ。６か月期間の全患者集団についてみると、他の処置群に比較したときボーラスと点滴群患者で標的血管の血管再生の有意な２６％の減少があった（図１５参照）。本試験条件下で、追跡中標的血管の血管再生についてボーラス単独の効果はほとんどみられなかったことが注目される。サブグループ分析では、ベースラインにおいて急性冠症候群（不安定狭心症、最近のまたは急性の心筋梗塞）をもつと診断された患者と、安定狭心症であるが危険性が高い血管造影上の形態をもっていた残りの患者を比較した（表１９）。このことは、両群について複合事象の減少に有意な効果があったことを示したが、反復冠介入の必要性の減少については安定狭心症患者でのみ有意であった（表１９）。この知見は、手技成功患者において、事象の分析をベースラインからした場合、または４８時間後からした場合について一致していた。考察大規模多施設無作為試験により得られた最近の知見は、ボーラス投与と点滴投与による血小板IIｂ／IIIａインテグリンブロックの冠動脈介入（coronary inte rvention）を受けた患者について、再狭窄の減少により臨床事象（clinicaleven ts）の発現が低下することを支持している。６ヶ月目におけるこの介入の有益効果の程度は、死亡、致命的ではない心筋梗塞および血管再生術の必要性など虚血性事象全般の約２３％の減少、標的血管再生術の２６％の減少であった。これらの結果は、ｃ７Ｅ３のボーラス投与と１２時間の点滴投与の有益効果は、急性閉塞および急性期有害事象の減少から、その後の冠動脈血管再生処置の必要性の低下にまで及ぶこと示している。この試験に使用されたモノクローナルＦａｂフラグメントは、血小板IIｂ／II Iａ表面インテグリンに対して強力な結合親和性を有し、解離性は非常に小さい。ｃ７Ｅ３の投与とともに血管形成術を受けた患者における以前の試験により、この抗体の点滴注入終了後も、IIｂ／IIIａの結合部位が少なくとも３６〜４８時間の長時間占有されること、少なくとも７２時間以上血小板凝集抑制がみられることが示されている（実施例４参照、Ellis，S.G．et al.，Cor．Art．Dis.， 4: 1675-175(1993); Tcheng，J.E. et al., Circulation，88:(1993)も参照）。これらの効果は両方共時間経過とともに減少し、ベースラインに戻るが、ｃ７Ｅ３の血小板凝集抑制効果の持続時間について興味深いのは、本試験の評価基準および条件では、ボーラス投与とプラセボの点滴投与では、臨床的に意味のある効果が急性期にも６ヶ月後の結果にもみられなかったことである。このことは、抗 −ＧＰIIｂ−IIIａ抗体の投与により急性虚血性事象または臨床症状を示す再狭窄を減少させるためには、この薬剤に比較的長時間曝露する必要があること（例えば、試験薬のボーラスと点滴の組み合わせで達成されるように）およびＧＰII ｂ／IIIａインテグリンの抑制が長い程良好な結果が得られることを示唆している。また、ｃ７Ｅ３がヴィトロネクチン受容体と結合するという報告(Hynes，R.O. ，Cell，69:11-25(1992)）も注目に値する。これはおそらくこの受容体がＧＰII ｂ／IIIａのβ₃成分を含んでいることによると考えられる。このインテグリン（ヴィトロネクチン）は、狭窄と再狭窄の調節においてある役割を果たしていると考えられており、抗−ＧＰIIｂ／IIIａのヴィトロネクチン受容体への結合が、観察された効果に関与していると考えられる。他のＧＰIIｂ／IIIａ受容体抑制剤は、標的および相同のインテグリンに対し様々な程度の特異性を有している（ Sutton，J. et al., Clinical Research AFCR，41:118A(1993)）.。これらの分子相互作用の臨床効果への寄与を分析するための比較試験を行うことができる。今回の試験では、治療群における再狭窄の程度を定量するための計画的な６ヶ月反復(repeat)血管造影は実施しなかった。多くの再狭窄試験において反復血管造影は実施されているが(Forrester，J.S.，et al.，J．Am．Coll．Cardiol.,17 : 758-769(1991); Ip，J.H．et al，J．Am．Coll. Cardiol. ，17:77B-88B(1991)；Casscells．W.，Criculation 86:723-729(1993) ；Topol，E.J. et al., N．Engl.J.Med.，329:228-233(1993)；Adelman，A.G．e t al. ，N.Engl．J．Med.，329:228-233(1993)；Serruys，P.W. etal., Circulat ion ．84:1568-1580(1991)）、無症状の患者において標的血管狭窄の診断がなされた場合に通常行われない反復措置がしばしばとられているという大きな欠点がある。一方、本発明の試験デザインは、多数の患者における実際の臨床をシュミレートしている。最近の幾つかの再狭窄試験において示されている血管造影の有益性それ自体は、単独では臨床的に充分なあるいは完全な意義はないので、反復血管再生術の必要性を有意に減少させることを示すことは、再狭窄試験の真の目標である。さらに、経皮的冠動脈介入措置後の患者において死亡および心筋梗塞が起こることは通常は無いので、有効な薬剤介入により調節すべき主な事象は、本試験で観察している標的血管の反復血管再生術である。試験薬のボーラスおよび点滴投与以外は、本試験の患者はフォローアップ終了まで注意深く２重盲検を維持するなど同様に扱われているので、観察された臨床意味のある有益な効果は、狭窄の程度が軽減したことによるとみなすことは妥当である。本試験は、臨床的再狭窄の軽減として解釈できる血管再生術必要性の臨床的に意味のある低下を立証する最初の代表的な大規模無作為試験である。これはIIｂ／IIIａ遮断剤のボーラスおよび点滴投与により達成され、損傷した血管壁の真の被膜化(passivation)を目指す。たとえｃ７Ｅ３をわずか12 時間だけ維持しても、この薬剤の抗血小板作用は数日間持続し、急性期における虚血性事象のリバウンドはみられなかった。重要なことは、６ヶ月目の標的血管の血管再生術減少という独立した有益効果は、ｃ７Ｅ３による急性薬剤介入の持続作用を示唆しており、血管壁の被覆化の臨床的証拠として提供することができる。血小板IIｂ／IIIａブロックによる再狭窄を示す臨床事象の減少は、再狭窄における血小板−血栓の役割を強調しており、これが血管形成術後または内皮損傷後の内膜新生の主要経路である可能性があげられている。（Schwartz，R.S．et al. ，J．Am．Coll．Cardiol.，20:1284-1293（1992）；Topol，E．J. Mayo Clin ．Proc ., 68, 88-90（1993）；Willerson，J．T．et al.，Proc．Natl．Acad．S ci．USA ,88:10624-10628(1991)）。中間の平滑筋細胞の増殖も再狭窄において重要な役割を果たしており（Forrester，J.S.et al.，J．Am．Coll．Cardiol.，17 :758-769(1991); Ip．J.H.et al，J．Am．Coll．Cardiol，17:77B-88B（1991）; Casscells，W., Circulation，86:723-729，(1993)）、本試験の結果は、この重要な臨床現象に対する強力な抗−血小板および抗−血栓措置は特別に効果のある可能性を示唆している。本試験は、冠動脈介入措置中において唯一の抗−血小板剤としてアスピリンを使用するという最近のアプローチ（Schwartz，L. et al., N．Eng．J．Med. ，318: 1714-1719(1988)）は、血管損傷に対する血小板の反応に拮抗するには不十分であるという意見を支持している。実施例８無作為、二重盲検、プラセボ対照試験のその他の知見シースサイズと出血の合併症ＰＴＣＡ／ＤＣＡ中のシース（sheath）サイズが出血の合併と関連するかどうかを知るために出血の合併をＥＰＩＣ試験（実施例６および７参照）において評価した。シースとガイディングカテーテル（guiding catheter）のサイズを、試験実施者により臨床的に測定した。大出血、鼠径部出血、輸血、血管修復、最低 Hctを前向きに評価した。カテーテル挿入中の治療の割当およびヘパリン使用など既知の出血予測因子を調整した後も、シースサイズは鼠径部出血の予測因子であった(p=0.0004)。シースサイズが大きいほど血管修復の頻度が高くなる傾向は有意ではなかった(p=0.0 004)。大出血（10.5%）、輸血（11.8%）、および最低Hct(34)はシースサイズによって変化しなかった。ｃ７Ｅ３ Fabの患者は、非-７Ｅ３患者よりも鼠径部出血が多かった(55% vs．30%、p＜0.0001)。これらの結果は、大きなシースサイズは鼠径部出血が多いことに関連しているが、ＰＴＣＡ／ＤＣＡの大出血の合併症には寄与していないことを示している。ｃ７Ｅ３Ｆａｂは、鼠径部出血の増加に関連しているが、これは小さなシースとガイディングカテーテルを使用することにより最小限にすることができると考えられる。血小板ＧＰIIｂ／IIIａ受容体抑制による冠動脈介入後の虚血と出血事象の合併ＥＰＩＣ〔虚血性合併症の予防におけるｃ７Ｅ３の評価（Evaluation of c7E3 in the Prevention of Ischemic Complications）〕試験（実施例６および７）は、強力な血小板受容体ＧＰIIｂ／IIIａアンタゴニスト、ｃ７Ｅ３Ｆａｂによる治療は、ハイリスク冠動脈血管形成（ＰＴＣＡ）という状況において虚血性合併症を予防するが、輸血を必要とする出血はプラセボ群の７％からｃ７Ｅ３Ｆａｂ群の１４％に増加することを示した。このことを更に検討するために、出血指標（最低ヘマトクリット、出血指数、ヘマトクリット値の変化、輸血した包装赤血球の単位）と試験の主要終了点（死亡、心筋梗塞、冠動脈パイパス移植術 (CABG)または急性虚血のためのＰＴＣＡ、操作失敗のための冠動脈ステントの挿入）の関係を検討した。出血と主要終了点の強い関連性が認められた（全ての出血指標についてp=0.0001）。この関連は、プラセボ、ボーラスｃ７Ｅ３Ｆａｂ、およびボーラス十点滴ｃ７Ｅ３Ｆａｂの各治療についてもみられた。このように顕著な出血を示す患者はより虚血性合併症を起こしやすかった。この強い関連性は、おそらく主要終了点と関連した出血の増加による可能性がある（例えばCABG）。また、出血はそれに伴う低血圧とともに、おそらく措置後の虚血性合併症の主要な要因となっていると考えられる。このことは、ＰＴＣＡの成功後に低血圧（主要な最終事象（primaryoutcome event）発症後の低血圧は除く）を示した患者では主要な最終事象の発現が有意に多く、また大出血および主要な最終事象をより経験していたことにより支持されている。結論として、出血はある患者において虚血性合併症を誘発しており、出血を減らす措置（例えば、ヘパリンの投与量の調節）をとることによって、ＧＰIIｂ／II Iａ抑制による冠動脈介入措置の抗虚血効果がさらに増強すると考えられる。ハイリスク血管形成術における攻撃的血小板抑制の経済的な利点と欠点ＥＰＩＣ無作為試験（実施例６および７参照）の２，１００名の患者において、高用量のｃ７Ｅ３Ｆａｂによる攻撃的血小板抑制により、その後の死亡、再梗塞、ハイリスク冠動脈血管形成術（ＰＴＣＡ）中の虚血再発が35％低下したが、ＰＴＣＡ後の大出血の頻度が２倍になった。これらの臨床効果を合わせて考えた場合の経済性を評価するために、前向きな経済サブスタディが実施された。病院のコスト（料金（ charge）ではない）と資源使用のデータを、各参加者について登録後の６カ月間集めた。特に合併症なしで経過した患者の平均的な病院の基準コストは＄9300であった。主要な合併症が病院の基準コストに与える影響を、多変数直線回帰モデル(multivariable linear regression model)で検討した：平均病院コスト＝＄９０６５＋＄５９２３ ★ 緊急ＰＴＣＡ＋＄２８，２１９★緊急ＣＡＢＧ＋＄３６４５★（再）梗塞＋＄３４６２★大出血このモデルは、緊急ＰＴＣＡを４．５％から０．８％に、緊急ＣＡＢＧを３．６％から２．４％、および（再）梗塞を８．６％から５．２％に減らすことによって、プラセボ療法に比較してキメラｃ７Ｅ３断片の療法は患者当たり平均＄６８２の経費を節約することを示している。しかし、この治療法では大出血を７％から１４％と２倍にすることによって、予測される経費の節約分から＄２４２が減ることになり、その結果、予測される一人当たりの純経費節減額は＄４４０となる。本試験で認められた高用量のｃ７Ｅ３Ｆａｂ（Ｘ＝＄１０，９７０±７，２８４）とプラセボ（Ｘ＝＄１１，３７６±１２，５５５）との間の平均コスト差は＄４０６であり、モデルからの予測値とよく一致している。このように、ハイリスクＰＴＣＡの虚血性合併症を有意に減少させることにより、キメラ抗−ＧＰIIｂ／IIIａ断片による攻撃的血小板抑制は、良好な臨床結果と純経費節約の両方をもたらす。治療効果を維持しつつｃ７Ｅ３投与による大出血を減らすための対策をとることにより、患者あたり＄７００までの純経費節約額を予測することができる。活性化凝固時間は血小板ＧＰIIｂ／IIIａ競合による冠動脈介入中に増加する。活性化凝固時間（ＡＣＴ）は、経皮経管冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）においてトロンビン抑制と抗凝血の程度をモニターして望ましくない血栓事故を最小限にするために使用されている。キメラモノクローナル抗体ｃ７Ｅ３Ｆａｂなどの強力な血小板抑制剤が導入されたために、ＰＴＣＡ中のＡＣＴ測定と調節の有用性は検討されていない。今のところ、ｃ７Ｅ３のＡＣＴに対する作用は不明または疑われていない。血小板ＧＰIIｂ／IIIａアンタゴニズム措置中のＡＣＴに対する影響を検討した。この試験では、ＰＴＣＡを経験した２０９９人の患者を無作為にプラセボ（ｎ＝６９６）とＧＰIIｂ／IIIａアンタゴニストであるｃ７Ｅ３Ｆａｂ（ｎ＝１４０３）に割り当てた。同様の量のヘパリンを受け、非常に高用量（＞１４，０００単位）のヘパリンを投与されている患者はプラセボ群と比較して少ないにもかかわらず、ｃ７Ｅ３Ｆａｂの投与を受けている患者において、体重で補正したＡＣＴの値は有意に高かった（ｐ＜０．００１）。結論として、血小板ＧＰIIｂ／IIIａアンタゴニストであるｃ７Ｅ３Ｆａｂにより活性化凝固時間は35〜40秒延長する。このことは、併用するヘパリン療法の用量を決めるため、及びＧＰIIｂ／IIIａを指向した冠動脈介入を行う上で重要な意義を持っている。血小板ＧＰIIｂ／IIIａ受容体に対するモノクローナル抗体による血管形成術の虚血性合併症予防を評価する試験における性差血小板ＧＰIIｂ／IIIａ受容体に対するモノクローナル抗体であるｃ７Ｅ３Ｆａｂの使用による血管形成術の虚血性合併症予防を評価する試験において性差を調査した（実施例６および７を参照）。患者は、介入の少し前に次の３つの治療の内から１つの治療を盲検的に受け、経皮的な介入（ＰＴＣＡ）を受けた：ｃ７Ｅ３のボーラス投与後に12時間のｃ７Ｅ３の点滴；ｃ７Ｅ３のボーラス投与のみ、あるいはプラセボ。女性の方が男性に比べて年齢が高く、体重が軽く、より多くの心血管系リスクファクファーを有している傾向があるにもかかわらず、死亡 (2.2％対1.3％)、ＭＩ（7.5％対6.3％）、緊急的ＰＴＣＡ(2.6％対3.1％)緊急的バイパス術(1.7％対3.2％)、ステント設置、大動脈内バルーンポンプ設置または 30日までにとられたこれらの有害な虚血事象に対する複合的な措置(10.5％対11. 0％、p＝0.74)などの頻度に男女差は無かった。これらの複合措置を予測する既知の因子（治療の割当、体重、高血圧、末梢血管疾患）および性差に統計学的な影響を与え得る因子を調整しても、これらの結果は変化しなかった。ｃ７Ｅ３Ｆａｂのボーラスと点滴は、虚血事象の頻度を男女共、同様に低下させた。女性は男性に比べて、より重篤な出血を示し（12.6％対9.8％）、より頻回に輸血（ＰＲＢＣ）を必要とし（19.5％対9.0％）、より高い出血指数を示した(△ ヘマトクリット／３＋ユニットＰＲＢＣ、2.4対1.9)。出血指数を予測するための回帰モデルにおいて、既知の出血予測因子（治療の割当、年齢、体重、基礎ヘマトクリット値、高血圧）を調整しても、性差は統計学的に独立した出血の予測因子であった(p＝.0041)。結論として、女性は男性よりも出血の頻度は高かったが、ハイリスク血管形成およびｃ７Ｅ３Ｆａｂによる治療後のその他の有害事象については女性が多いということはなかった。均等物当業者であれば、単に常識的実験手法を用いて、ここに述べた発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、また確認し得るであろう。これらの均等物は下記のクレームの範疇に含まれるものである。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１０月２０日【補正内容】１５．抗原結合領域が、モノクローナル抗体７Ｅ３に由来するものである請求項１４記載の方法。１６．非ヒト起源の血小板特異的な抗原結合領域およびヒト定常領域を含むキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の有効量をヒトに投与することを含む、ヒトにおいて血管形成術による非急性の虚血性合併症を低減又は予防する方法。１７．糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａに選択的に結合する化合物の有効量をヒトに投与することを含む、ヒトにおいて血管形成術による非急性の虚血性合併症を低減又は予防する方法。１８．該化合物が、非ヒト起源の糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ特異的な抗原結合領域およびヒト定常領域を含むキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である、請求項１７記載の方法。１９．抗原結合領域が、モノクローナル抗体７Ｅ３に由来するものである請求項１８記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者コラー，バリーエス. アメリカ合衆国ニューヨーク 10128 ニューヨーク，イースト 89ティーエイチストリート 50，アパートメント 21エフ (72)発明者ナイト，デイビッドエム. アメリカ合衆国ペンシルベニア 19312 ベリン，ホワイトホースロード 2430

Claims

【特許請求の範囲】１．非ヒト起源の血小板特異的な抗原結合領域およびヒト定常領域を含むキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の有効量を冠動脈疾患患者に投与することを含む、狭窄及び／又は再狭窄を阻害する方法。２．非ヒト起源の抗原結合領域が、糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的である請求項１記載の方法。３．抗原結合領域が、モノクローナル抗体７Ｅ３に由来するものである請求項２記載の方法。４．免疫グロブリン断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）₂断片である請求項１記載の方法。５．糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａに選択的に結合する化合物の有効量を冠動脈疾患患者に投与することを含む、狭窄及び／又は再狭窄を阻害する方法。６．該化合物が、非ヒト起源の糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的な抗原結合領域およびヒト定常領域を含むキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である、請求項５記載の方法。７．抗原結合領域が、モノクローナル抗体７Ｅ３に由来するものである請求項６記載の方法。８．非ヒト起源の血小板特異的な抗原結合領域およびヒト定常領域を含むキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の有効量をヒトに投与することを含む、ヒトにおいて冠動脈介入術を行った後の再狭窄を阻害する方法。９．手術が血管形成術である請求項８記載の方法。１０．抗原結合領域が、糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体複合体に特異的である請求項９記載の方法。１１．抗原結合領域が、モノクローナル抗体７Ｅ３に由来するものである請求項１０記載の方法。１２．免疫グロブリン断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）₂断片からなる群より選ばれるものである請求項１１記載の方法。１３．ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに選択的に結合する化合物の有効量をヒトに投与することを含む、ヒトにおいて冠動脈介入術を行った後の再狭窄を阻害する方法。１４．該化合物が、非ヒト起源の糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ特異的な抗原結合領域およびヒト定常領域を含むキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である、請求項１３記載の方法。１５．抗原結合領域が、モノクローナル抗体７Ｅ３に由来するものである請求項１４記載の方法。１６．非ヒト起源の血小板特異的な抗原結合領域およびヒト定常領域を含むキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片の有効量をヒトに投与することを含む、ヒトにおいて血管形成術による急性又は非急性の虚血性合併症を低減又は予防する方法。１７．糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａに選択的に結合する化合物の有効量をヒトに投与することを含む、ヒトにおいて血管形成術による急性又は非急性の虚血性合併症を低減又は予防する方法。１８．該化合物が、非ヒト起源の糖蛋白ＩＩｂ／ＩＩＩａ特異的な抗原結合領域およびヒト定常領域を含むキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片である、請求項１７記載の方法。１９．抗原結合領域が、モノクローナル抗体７Ｅ３に由来するものである請求項１８記載の方法。