DE69433091T2

DE69433091T2 - Verwendung von an Glycoprotein gpIIb/IIIa bindenden Substanzen zur Vermeidung von Stenosis und Restenosis

Info

Publication number: DE69433091T2
Application number: DE69433091T
Authority: DE
Inventors: Barry S. Coller; Harlan F. Weisman
Original assignee: Research Foundation of State University of New York; Centocor Inc
Current assignee: Research Foundation of State University of New York; Janssen Biotech Inc
Priority date: 1993-11-05
Filing date: 1994-11-07
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2014-11-08
Also published as: AU8959398A; HK1054682B; CN1230201C; PT725655E; WO1995012412A1; EP1334730A3; ES2204937T5; CA2175214A1; CN1140295C; DE69433091T3; RU2158135C2; EP1334730A2; JPH09504795A; DK0725655T4; AU1172495A; NZ502819A; EP0725655B1; EP0725655A1; EP0725655B2; UA37249C2

Description

Ausgangspunkt der Erfindung
Die Blutplättchen-Aggregation ist ein essentielles Ereignis bei der Bildung von Blutgerinnseln. Unter normalen Umständen dienen Blutgerinnsel dazu, das Entweichen von Blutzellen aus dem Gefäßsystem zu verhindern. Jedoch können während bestimmter Krankheitszustände Blutgerinnsel die Blutströmung verringern oder total blockieren, was eine Zellnekrose zur Folge hat.
Beispielsweise ist die Blutplättchen-Aggregation und anschließende Thrombose am Ort einer atheriosklerotischen Plaque ein bedeutender verursachender Faktor bei der Entstehung von Zuständen wie beispielsweise Angina, akutem Herzinfarkt und einer Reokklusion im Anschluß an eine erfolgreiche Thrombolyse und Angioplastie. Herzanfallpatienten werden typischerweise mit thrombolytischen Mitteln wie beispielsweise Gewebsplasminogen-Aktivator oder Streptokinase behandelt, die den Fibrin-Bestandteil der Blutgerinnsel auflösen. Eine mit der Fibrinolyse verbundene Hauptkomplikation ist die Reokklusion bzw. der erneute Verschluß basierend auf der Blutplättchenaggregation, was eine weitere Herzschädigung zur Folge haben kann. Weil Glycoprotein (GP)IIb/IIIa-Rezeptoren anerkanntermaßen für die Blutplättchenaggregation verantwortlich sind wird angenommen, dass Reagenzien, die diese Rezeptoren blockieren, die Reokklusion im Anschluß an eine thrombolytische Therapie reduzieren oder verhindern und die Geschwindigkeit der Thrombolyse beschleunigen. Es wird ebenfalls erwartet, dass solche Reagenzien in der Therapie anderer vasookklusiver und thromboembolischer Störungen von Nutzen sind.
Ein Ansatz zum Blockieren der Blutplättchenaggregation schließt monoklonale Antikörper ein, die für (GP)IIb/IIIa-Rezeptoren spezifisch sind. Ein muriner monoklonaler Antikörper, bezeichnet als 7E3, der die Blutplättchenaggregation hemmt und bei der Behandlung humaner thrombotischer Erkrankungen bzw. Thromboseerkrankungen von Nutzen ist, ist in der offengelegten europäischen Patentanmeldung Nr. 205 207 und 206 532 beschrieben. Es ist in der Technik bekannt, dass murine Antikörper Charakteristika aufweisen, die ihre Anwendung in der humanen Therapie in ernsthafter Weise beschränken. Als Fremdproteine können murine Antikörper Immunreaktionen zeigen, die ihre therapeutische Leistungsfähigkeit bzw. Wirksamkeit reduzieren oder zerstören und/oder allergische oder hypersensitive bzw. Hypersensibilisierungs-Reaktionen in Patienten hervorrufen. Der Bedarf nach einer erneuen Verabreichung solcher therapeutischer Anwendungsmethoden bei thromboembolischen Störungen erhöht die Wahrscheinlichkeit dieser Art von Immunreaktionen.
Chimäre Antikörper, die aus nicht-humanen Bindungsregionen bestehen, gebunden an humane konstante Regionen, wurden als Mittel zur Umgehung der Immunreaktivitäts-Probleme von murinen Antikörpern vorgeschlagen. Siehe Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1: 6851 (1984) und PCT-Anmeldung Nr. PCT/GB85 00392 (WO 86/01533). Weil die konstante Region in großem Maße für die Immunreaktivität eines Antikörpermoleküls verantwortlich ist, sollten chimäre Antikörper mit konstanten Regionen humanen Ursprungs weniger wahrscheinlich eine anti-murine Reaktion in Menschen hervorrufen. Es ist jedoch nicht vorhersagbar, ob die Bindung einer humanen konstanten Region an eine murine Bindungsregion mit einer erwünschten Spezifität die Immunreaktivität reduzieren und/oder das Bindungsvermögen des sich ergebenden chimären Antikörpers verändern wird.
Die WO 89/11538 beschreibt plättchenspezifische Antikörper und Fragmente, die den chimären Antikörper 7E3 einschließen, dessen Herstellung und Fragmente hiervon. Es wird festgestellt, dass diese Antikörper und Fragmente als anti-thrombotische Mittel verwendet werden können.
Journal of the American College of Cardiology 21/2SA, 1993, 269A, Abstract 768–1 beschreibt die Behandlung von Patienten mit instabiler Angina. Ein chimäres 7E3-Fragment wurde Patienten vor einer PTCA verabreicht. Eine Behandlung mit dem chimären 7E3-Fragment, Heparin und Aspirin scheint sicher zu sein.
Circulation 84/4SUP, 1991, II-590, Abstract 2344 beschreibt die Verwendung von „C-7E3" zur Hemmung der Blutplättchenfunktion während der PTCA.
WO 93/06863 beschreibt ein Verfahren zur Hemmung der Gefäßverengung an einem intravaskulären Ort. Das offenbarte Verfahren umfasst die Verabreichung eines Anti-PADGEM-Antikörpers.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung, die selektiv an Glycoprotein IIb/IIIa bindet, zur Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung der Stenose und/oder Restenose in einem Menschen. Die Verbindung ist vorzugsweise ein blutplättchenspezifisches chimäres Immunglobulin, das eine variable oder Antigen-Bindungsregion nicht humanen Ursprungs und eine konstante Region humanen Ursprungs umfasst. Diese Antikörper binden an Blutplättchen und können die Blutplättchenaggregation blockieren und sind somit als anti-thrombotische Mittel sowie bei der Hemmung von Stenose oder Restenose von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung ist durch die beigefügten Ansprüche definiert.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine Northern-Analyse der mRNAs der schweren Kette und der leichten Kette für den 7E3 monoklonalen Antikörper unter Verwendung klonierter variabler Regionen als Sonden.
Die 2A und 2B sind schematische Darstellungen der Plasmide p7E3V_κhC_κ ( 2A) und p7E3V_HhC_G4 (2B), die die chimären Genkonstrukte tragen, die jeweils die leichten und schweren Ketten eines chimären 7E3-Immunglobulin kodieren.
3 zeigt die Bindung des chimären 7E3-Immunglobulins, kodiert von den Vektoren p7E3V_κhC_κ und p7E3V_HhC_G4 an Blutplättchen.
4 zeigt die Hemmung der Blutplättchenaggregation durch ein chimäres 7E3 (c7E3) Immunglobulin.
5 ist eine graphische Darstellung eines Plots der Plasma-Antikörperkonzentration (ng/ml) gegen die Zeit (Tage), die die rasche anfängliche Clearance von c7E3 (γ₁, κ) aus dem Plasma bei drei Patienten mit einer stabilen koronaren Herzkrankheit demonstriert, im Anschluß an eine 25 mg/kg Dosis von c7E3 Fab, intravenös als eine 5-minütige Infusion verabreicht.
6(A-C) sind Darstellungen, die die Wirkung einer einfachen Bolus-Dosis an chimärem 7E3 Fab (0,15 mg/kg, 0,20 mg/kg oder 0,25 mg/kg) 2 Stunden nach Verabreichen eines Antikörpers (γ₁, κ) auf die Blutplättchenaktivität zusammenfaßt. Eine Dosis-Reaktion ist evident, wenn die Blutplättchenaktivität bezüglich der Rezeptorblockade (6A oben), der Blutplättchenaggregation (6B, Mitte) und der Blutungszeit (6C, unten) untersucht wird. Die Linien repräsentieren mediane Werte.
7(A-C) sind Darstellungen der Dauer einer Anti-Plättchenwirkung von chimärem 7E3 Fab (γ₁, κ) verabreicht vor einer Angioplastie in einer Bolus-Dosis von 0,25 mg/kg. Die Linien zeigen die medianen Werte vom Zeitpunkt null an der Basislinie bis 24 Stunden für die Rezeptorblockade (7A, oben), die Plättchen-Aggregation (7B, Mitte) und die Blutungszeit (7C, unten).
8(A-C) sind Darstellungen, die die Anti-Plättchenwirkung einer 0,25 mg/kg Bolus-Dosis, gefolgt von einer 12-ständigen kontinuierlichen Infusion (10 μg/min) an chimärem 7E3 Fab (γ₁, κ) bei 11 Patienten zusammenfaßt. Die Linien repräsentieren mediane Werte, die für die prozentuale Rezeptorblockade (8A, oben), die prozentuale Vor-Dosis (Basislinie zum Zeitpunkt null), Plättchen-Aggregation (8B, Mitte) und Blutungszeiten (8C, unten), bestimmt werden.
9 ist eine Darstellung der absoluten Veränderung des Hämatokrit von der Basislinie bis zu einem Zeitpunkt 24 Stunden im Anschluß an das Ende der Infusion für 47 Patienten, beschrieben in Beispiel 4.
10 ist ein Kaplan-Meier-Plot, der die Wahrscheinlichkeit für keine dringenden wiederholten perkutanen Revaskularisations-Verfahren vom Zeitpunkt der Randomisierung ab für die drei Behandlungs-Gruppen darstellt.
11 ist eine graphische Darstellung, die die Odds Ratios und 95% Konfidenz-Intervalle für Schlüssel-Untergruppen (rechts aufgelistet) zeigt, die in den Versuch aufgenommen wurden. Die Daten werden für den primären Wirksamkeits-Endpunkt dargestellt (Tod, nicht tödlicher Infarkt, dringende Angioplastie oder chirurgischer Eingriff oder Anordnung eines Koronar-Stents oder einer intraaortalen Ballon-Pumpe für eine refraktäre Ischämie). Zusätzlich sind die absoluten Ereignisdaten für den primären Endpunkt für jede Untergruppe links tabellarisch erfaßt (Ereignisraten (%)).
12 ist eine graphische Darstellung, die den Bruchteil aller Patienten mit keinem Ereignis während der 6-monatigen Follow Up-Periode darstellt.
13 ist eine graphische Darstellung, die die Fraktion der Patienten mit keinem Ereignis über die 6-monatige Follow Up-Periode unter solchen Patienten darstellt, die einem erfolgreichen Eingriff unterzogen wurden und die nach 30 Tagen kein Ereignis aufwiesen.
14 ist eine graphische Darstellung, die die Fraktion von Patienten mit keinem Ereignis über die 6-monatige Follow Up-Periode hinweg darstellt, unter Einbeziehung von Ereignissen nach den ersten 48 Stunden unter Patienten mit einer anfänglich erfolgreichen Intervention.
15 ist eine graphische Darstellung, die die Fraktion aller Patienten ohne Versuch einer Revaskularisation der verfahrensbezogenen Arterie (procedure related artery = PRA) über die 6-monatige Follow Up-Periode darstellt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die chimären Immunglobuline, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können individuelle chimäre schwere und leichte Immunglobulin-Ketten umfassen. Die chimä re schwere Kette umfasst eine Antigen-Bindungsregion, abgeleitet von der schweren Kette eines nicht-humanen Antikörpers, der für Blutplättchen spezifisch ist (beispielsweise spezifisch für den GPIIb/IIIa-Rezeptor), gebunden an eine konstante Region einer humanen schweren Kette. Die chimäre Leichtkette umfasst eine Antigen-Bindungsregion, die von der leichten Kette des nicht-humanen Antikörpers abgeleitet ist, gebunden an die humane konstante Region der leichten Kette.
Die vorliegenden Immunglobuline können einwertig bzw. monovalent, divalent oder polyvalent sein. Monovalente Immunglobuline sind Dimere (HL) geformt aus einer chimären schweren Kette, verbunden durch Disulfid-Brücken mit einer chimären Leichtkette. Divalente Immunglobuline sind Tetramere (H₂L₂), gebildet aus zwei Dimeren, die durch zumindest eine Disulfid-Brücke verbunden sind. Polyvalente Immunglobuline können ebenfalls erzeugt werden, beispielsweise durch Verwendung der konstanten Region einer schweren Kette, die aggregiert (beispielsweise die konstanten Regionen in der μ schweren Kette). Chimäre Immunglobulinfragmente wie beispielsweise Fab, Fab' oder F(ab')₂ können ebenfalls hergestellt werden.
Die nicht-humanen Antigen-Bindungsregionen des chimären Immunglobulins werden aus Immunglobulinen gewonnen, die für Blutplättchen GPIIb/IIIa-Rezeptoren spezifisch sind, die eine Ligandenbindung an dem Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptorkomplex blockieren können.
Die Thrombose beginnt mit dem Anlagern bzw. Anhaften von Blutplättchen am Ort einer Gefäßwand-Verletzung. Die Adhäsion von Blutplättchen wird durch Blutplättchenoberflächen-Rezeptoren vermittelt, die an extrazelluläre Matrixproteine im exponierten Subendothel binden, wie beispielsweise durch den von Willebrand-Faktor, Kollagen, Fibronectin, Vitronectin und Laminin. Die Plättchenadhäsion einen Monolayer von Blutplättchen zur Folge. Anschließend tritt eine Blutplättchenaktivierung in Reaktion auf Agonisten wie beispielsweise Epinephrin, ADP, Kollagen und Thrombin auf. Eine Aktivierung führt zur Exposition des Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptors (GPIIb/IIIa) auf der Blutplättchen-Oberfläche. GPIIb/IIIa auf aktivierten Blutplättchen ist dann dazu in der Lage, ein Fibrinogen zu binden, das die Blutplättchenaggregation vermitteln kann. Die Bindung von GPIIb/IIIa an andere adhäsive Proteine wie beispielsweise den von Willebrand-Faktor kann ebenfalls eine Blutplättchenvernetzung und Aggregation verursachen. Somit ist die Bindung von adhäsiven Molekülen wie beispielsweise Fibrinogen oder dem von Willebrand-Faktor an GPIIb/IIIa ein üblicher Schritt in der Thrombus-Bildung, um eine Blutplättchenaggregation zu verursachen, wodurch der GPIIb/IIIa Rezeptor ein attraktives Ziel für therapeutische Mittel ist, die die Interaktion von GPIIb/IIIa mit diesen Molekülen stören können. Es wird darüber hinaus angenommen, dass durch Verwendung eines Anti-GPIIb/IIIa chimären Antikörpers die Aggregation aktivierter Blutplättchen gehemmt wird, ohne die initiale Adhäsion von Blutplättchen zu stören. Diese selektive Hemmung der Blutplättchenaggregation kann wünschenswert sein, weil die Blutplättchenadhäsion ohne Aggregation zur Aufrechterhaltung der Hämostase beisteuern kann.
Beispiele für geeignete Antikörper, die für Blutplättchen spezifisch sind, schließen 7E3 und 10E5 ein. Siehe die europäische Patentanmeldung Nrn. 205 207 und 206 532, deren Lehren hier durch diese Bezugnahme mit aufgenommen sind. Der 7E3 Antikörper (oder Antikörper, der mit demselben oder einem funktionell äquivalenten Epitop reaktiv ist) ist besonders bevorzugt, weil er für die komplexierte Form des GPIIb/IIIa Rezeptors spezifisch ist. Weitere Antikörper, die für den GPIIb/IIIa Rezeptor spezifisch sind (Antigen erkannt von 7E3) wie beispielsweise solche, die für entweder die IIb oder IIIa-Komponenten spezifisch sind, können ebenfalls verwendet werden. Antikörper die für andere Blutplättchen-Antigene spezifisch sind, können verwendet werden. Beispielsweise können Antikörper, die mit Blutplättchen α-Körnermembranprotein GMP-140 reaktiv sind, wie beispielsweise der S12-Antikörper (J. Biol. Chem., 259: 9799–9804) verwendet werden.
Die Antigen-Bindungsregion des chimären Antikörpers kann aus einem Immunglobulin nicht-humanen Ursprungs gewonnen werden. Vorzugsweise ist die Antigen-Bindungsregion murinen Ursprungs, weil murine Antikörper gegen Blutplättchen und insbesondere gegen GPIIb/IIIa Rezeptoren verfügbar sind oder in murinen Systemen erzeugt werden können. Weitere Tier- oder Nagetier-Spezies stellen alternative Quellen für Antigen-Bindungsregionen bereit (siehe beispielsweise Newman et al., Bio/technology, 10: 1455–1460 (1992)). In einer Ausführungsform umfasst die Antigen-Bindungsregion des chimären Immunglobulins zumindest einen Teil eines blutplättchenspezifischen Im munglobulins nicht-humanen Ursprungs, der für eine spezifische oder selektive Antigenbindung ausreichend ist, wie beispielsweise ein oder mehrere Complementarity Determining Regions oder Anteile hiervon, die aus nicht-humanem Immunglobulin gewonnen wurden (siehe beispielsweise Winter, US-Patent Nr. 5 225 539, Europäisches Patent Nr. 0 239 400, UK-Patent Nr. 2 188 638; Adair et al.; WO 91/09967; Joliffe et al., WO 91/09966). In einer anderen Ausführungsform umfasst das chimäre Immunglobulin zumindest eine chimäre schwere Kette, die eine variable Region umfasst, abgeleitet aus der schweren Kette von nicht-humanem Immunglobulin, gebunden an zumindest einen Anteil der konstanten Region einer humanen schweren Kette und zumindest eine chimäre Leichtkette, die eine variable Region umfasst, abgeleitet von einer Leichtkette des nicht-humanen Immunglobulins, kovalent gebunden an zumindest einen Anteil eines konstanten Bereichs beziehungsweise Region einer humanen Leichtkette. Weitere Kombinationen variabler und konstanter Regionen sind ebenfalls möglich (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5 169 939).
Die konstanten Bereiche der chimären Antikörper sind aus humanem Immunglobulin abgeleitet. Die konstante Region der schweren Kette kann aus irgendeinem der fünf Isotypen Alpha, Delta, Epsilon, Gamma oder Mu ausgewählt werden. Weiterhin sind schwere Ketten verschiedener Unterklassen (beispielsweise die IgG-Unterklassen der schweren Ketten) für unterschiedliche Effektorfunktionen verantwortlich und somit können durch Auswahl der erwünschten schwere Kette-konstanten Region chimäre Antikörper mit einer erwünschten Effektorfunktion erzeugt werden. Bevorzugte konstante Regionen sind Gamma 1 (IgG1), Gamma 3 (IgG3) und Gamma 4 (IgG4). Die konstante Region der Leichtkette kann entweder Kappa- oder Lambda-Typ sein.
Im allgemeinen werden die chimären Antikörper durch Herstellen eines fusionierten Gens für jeden der leichten oder schweren Kettenbestandteile des chimären Immunglobulins hergestellt, das ein erstes DNA-Segment umfasst, das zumindest den funktionellen Anteil der Blutplättchen spezifischen variablen Region nicht-humanen Ursprungs kodiert (beispielsweise funktionell umgeformte variable Region mit einem Bindungssegment), gebunden an ein zweites DNA-Segment, das zumindest einen Teil einer humanen konstanten Region kodiert. Jedes fusionierte Gen wird in einem Expressionsvektor zusammengebaut oder in diesen eingefügt, was einen Expressionsvektor zur Foige hat, der ein fusioniertes Gen in exprimierbarer Form enthält. In einer Ausführungsform wird die DNA, die die Antigen-Bindungsregion umfasst, an die konstante Region über eine dazwischen liegende Sequenz gebunden. In einer anderen Ausführungsform können Konstrukte, denen ein oder mehrere dazwischen liegende Sequenzen fehlen, konstruiert oder gewonnen werden. Empfängerzellen, die zum Exprimieren der Genprodukte in der Lage sind, werden dann mit den Genen transfiziert. Die transfizierten Empfängerzellen werden unter Bedingungen kultiviert, die die Expression der eingebauten Gene erlauben und die exprimierten Immunglobuline oder Immunglobulin-Ketten werden wiedergewonnen.
Gene, die die variable Region der Ig leichten und schweren Ketten kodieren, können aus Lymphoid-Zellen gewonnen werden, die die plättchenspezifischen Antikörper produzieren. Beispielsweise stellen die Hybridomazelllinien, die Antikörper gegen den GPIIb/IIIa-Rezeptor erzeugen, eine Quelle für die variable Region eines Immunglobulins für die vorliegenden chimären Antikörper bereit. Weitere Nagetierzelllinien sind verfügbar. Zelllinien können durch Impfen eines Nagetieres mit einem humanen Blutplättchen- oder einem GPIIb/IIIa-Rezeptor enthaltenden Bestandteil oder einer Fraktion von Blutplättchen, Bilden von fusionierten Hybridzellen zwischen den Antikörper erzeugenden Zellen und einer Myelomazelllinie, Klonen des Hybrids und Auswählen von Klonen, die Antikörper gegen Blutplättchen oder Glycoprotein IIb/IIIa-Rezeptor erzeugen, erzeugt werden.
Konstante Regionen können aus humanen Antikörper-produzierenden Zellen durch Standardklonierungstechniken gewonnen werden. Alternativ sind, weil Gene, die die beiden Klassen von leichten Ketten und die fünf Klassen von schweren Ketten repräsentieren, kloniert wurden, konstante Regionen humanen Ursprungs aus diesen Klonen leicht verfügbar. Chimäre Antikörper bindende Fragmente wie beispielsweise F(ab')₂ und Fab-Fragmente können durch Entwickeln eines chimären Schwerekette-Gens in trunkierter Form hergestellt werden. Beispielsweise würde ein chimäres Gen, das einen F(ab')₂ Schwerekette-Anteil kodiert, DNA-Sequenzen einschließen, die die CH₁-Domäne und die Gelenkregion der schweren Kette einschließen. Alternativ können solche Fragmente durch enzymatische Spaltung eines chimären Immunglobulins gewonnen werden. Beispielsweise können jeweils Papain oder Pepsin-Spaltungen Fab oder F(ab')₂-Fragmente erzeugen.
Vorzugsweise werden die fusionierten Gene, die die leichten und schweren chimären Ketten (oder Anteile hiervon) kodieren, in zwei unterschiedlichen Expressionsvektoren zusammengebaut, die zum Cotransfizieren einer Empfängerzelle verwendet werden können. Jeder Vektor enthält zwei selektierbare Gene – eines zur Selektion in einem bakteriellen System und eines zur Selektion in einem eukaryontischen System – wobei jeder Vektor zwei unterschiedliche Gene aufweist. Diese Vektoren ermöglichen die Produktion und Amplifikation der fusionierten Gene in bakteriellen Systemen und die anschließende Cotransfektion eukaryontischer Zellen und die Selektion der cotransfizierten Zellen. Beispiele für selektierbare Gene für das bakterielle System sind die Gene, die eine Ampicillin-Resistenz verleihen und das Gen, das eine Chloramphenicol-Resistenz verleiht. Zwei selektierbare Gene zur Selektion eukaryontischer Transfektanten werden bevorzugt: (i) das Xanthin-Guaninphosphoribosyltransferase-Gen (gpt) und (ii) das Phosphortransferase-Gen aus Tn5 (als neo bezeichnet). Eine Selektion mit gpt basiert auf der Fähigkeit dieses Enzyms, das von diesem Gen kodiert wird, Xanthin als Substrat für die Purinnucleotid-Synthese zu verwenden; das analoge endogene Enzym kann dies nicht. In einem Medium, das Xanthin und Mycophenolsäure enthält, das die Umwandlung von Inosinmonophosphat zu Xanthinmonophosphat blockiert, können nur Zellen, die das gpt-Gen exprimieren, überleben. Das Produkt des neo-Gens blockiert die Hemmung der Proteinsynthese in eukaryontischen Zellen, die durch das Antibiotikum G418 und weitere Antibiotika dieser Klasse verursacht wird. Die beiden Selektionsverfahren können gleichzeitig oder sequentiell verwendet werden, um auch die Expression von Immunglobulinketten-Genen zu selektieren, die auf zwei unterschiedlichen DNA-Vektoren in eukaryontische Zellen eingebracht wurden.
Die bevorzugte Empfängerzelllinie ist eine Myelomazelle. Myeloma- bzw. Myelomzellen können Immunglobuline synthetisieren, zusammenbauen und sezernieren, die durch transfizierte Ig-Gene kodiert sind. Sie besitzen weiterhin den Mechanismus für die Glycosylierung des Immunglobulins. Eine speziell bevorzugte Empfängerzelle ist eine Ig-nicht-erzeugende Myelomazelllinie wie beispielsweise Sp2/0. Diese Zelllinien erzeugen nur das durch die transfizierten Immunglobulin-Gene kodierte Immunglobulin. Myelomazellen können in Kultur oder im Peritoneum von Mäusen gezüchtet werden, wobei das sezernierte Immunglobulin aus Ascites-Flüssigkeit gewonnen werden kann. Andere lymphoide Zellen wie beispielsweise B-Lymphocyten oder Hybridomazellen können als geeignet Empfängerzellen dienen.
Es existieren mehrere Methoden beziehungsweise Verfahren zum Transfizieren von lymphoiden Zellen beziehungsweise Lymphocytenzellen mit Vektoren, die Immunglobulin kodierende Gene enthalten. Ein bevorzugter Weg, DNA in lymphoide Zellen einzubringen, ist die Elektroporation. Bei diesem Verfahren werden die Empfängerzellen einem elektrischen Impuls in Gegenwart der DNA, die eingebaut werden soll, unterworfen. Siehe beispielsweise Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 7161 (1984). Ein weiterer Weg die DNA einzubringen ist die Protoplastenfusion. Bei diesem Verfahren wird ein Lysozym verwendet, um die Zellwände von Bakterien abzuziehen, die das rekombinante Plasmid, das das chimäre Ig-Gen enthält, beherbergen. Die sich ergebenden Sphäroplasten werden mit Myelomazellen mit Polyethylenglycol fusioniert. Nach der Protoplastenfusion werden die Transfektanten selektiert und isoliert. Eine weitere Technik, die zur Einführung von DNA in viele Zelltypen verwendet werden kann, ist die Calziumphosphat-Fällung.
Die chimären Immunglobulin-Gene können ebenfalls in nicht-lymphoiden Zellen wie beispielsweise Bakterien oder Hefen exprimiert werden. Wenn sie in Bakterien exprimiert werden, werden die Immunglobulin-schweren Ketten und -leichten Ketten Teil von Inclusion Bodies beziehungsweise Einschlußkörpern. Somit müssen die Ketten isoliert und gereinigt und darauf zu funktionellen Immunglobulin-Molekülen zusammengebaut werden. Weitere Strategien zur Expression in E. coli sind verfügbar (siehe beispielsweise Pluckthun, A., Bio/Technology, 9: 545–551 (1991): Skerra, A. et al., Bio/Technology, 9: 273–278 (1991)), einschließlich der Sekretion aus E. coli als Fusionsproteine, die eine Signalsequenz umfassen.
Nützlichkeit eines plättchenspezifischen chimären Immunglobulins
Die chimären plättchenspezifischen Antikörper dieser Erfindung wurden als antithrombotische therapeutische Mittel verwendet. Beispielsweise können die chimären Antikörper (oder Fragmente hiervon) zur Hemmung der Blutplättchenaggregation und der Thrombus-Bildung bei Patienten verwendet werden, die einen Thrombus aufweisen oder dem Risiko einer Thrombus-Bildung unterliegen. Die Antikörper können ebenfalls zur Hemmung zyklischer Strömungs-Schwankungen verwendet werden, die durch die Blutplättchenaggregation verursacht werden und die einer Thrombus-Bildung oder -Neubildung vorausgehen können. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird der Antikörper in einer Vielzahl von Situationen mit verwendet, in denen eine Stenose oder Restenose verhindert (reduziert, verzögert oder verhindert) werden soll.
Beispielsweise können Patienten, die dem Risiko einer koronaren Arterien-Erkrankung unterliegen, von der Verabreichung einer wirksamen Menge eines chimären Anti-Blutplättchenantikörper-Fragmentes der vorliegenden Erfindung Nutzen ziehen (beispielsweise ein chimärer Anti-GPIIb/IIIa-Antikörper oder vorzugsweise ein Fragment hiervon, wie beispielsweise chimäres 7E3 Fab oder F(ab')₂), um eine Stenose und/oder Restenose von Gefäßen zu vermeiden.
Beispielsweise kann der Antikörper einem Individuum (beispielsweise einem Säugetier, beispielsweise einem Menschen) zur Vorbeugung einer Thrombose bei einer Lungenembolie, bei vorübergehenden ischämischen Anfällen (TIAs), einer tiefen Venenthrombose, Karonar-Bypass-Operationen, einem chirurgischen Eingriff zur Einbringung eines Prothese-Ventils bzw. Herzklappe oder Gefäß (beispielsweise in einer autologen, nicht-autologen oder synthetischen Gefäß-Transplantation) verabreicht werden. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung können ebenfalls einem Individuum verabreicht werden, um die Plättchen-Aggregation und Thrombose vor, während oder nach Angioplastie-Verfahren zu vermeiden, die durch Ballon, Koronr-Atherektomie, Laser-Angioplastie oder andere geeignete Verfahren durchgeführt werden. Ein Antikörper kann vor dem Angioplastie-Verfahren (Prä-Angioplastie), während der Angioplastie oder nach der Angioplastie verabreicht werden. Eine solche Behandlung kann eine Thrombose vermeiden und dadurch die Rate thrombotischer Komplikationen, die einer Angioplastie folgen, wie beispielsweise Tod, Herzinfarkt oder wiederauftretende ischämische Ereignisse, die eine PTCA oder eine koronare Bypass-Operation notwendig machen (akute ischämische Ereignisse) reduzieren. Zusätzlich kann eine solche Behandlung einen Langzeitvorteil durch Reduktion ischämischer Ereignisse oder Komplikationen einer Koronararterieninterventions-Prozedur (bei spielsweise einer Angioplastie) ergeben, wie beispielsweise Tod, Herzinfarkt oder wiederauftretende ischämische Ereignisse, die eine PTCA oder eine Koronar-Bypass-Chirurgie notwendig machen (Revaskularisierungsverfahren), die für eine Reduktion, Verzögerung oder Vorbeugung einer Stenose oder Restenose indikativ sind.
Wie beispielsweise in Beispiel 4 dargestellt ist erhöht die Verabreichung eines chimären Anti-Blutplättchenantikörpers (chimäres 7E3 Fab-Fragment) als adjuvante Therapie vor einer Angioplastie (perkutane transluminale koronare Angioplastie, PTCA) wirksam die Blutungszeiten und reduziert eine Agonisten induzierte Blutplättchenaggregation wie durch ex vivo- Blutplättchenaggregations-Assays untersucht. Die Ergebnisse der Experimente, von denen in Beispiel 4 und 5 berichtet wird, legen ebenfalls nahe, dass eine Blockade von Blutplättchen-GPIIb/IIIa und eine Hemmung der Aggregation durch c7E3-Antikörper (ein Fab-Fragment) sich in eine in vivo anti-thrombotische Wirksamkeit in Menschen umsetzt.
Die Ergebnisse einer randomisierten, doppelblinden, Placebo kontrollierten Studie der Verabreichung eines chimären 7E3-Antikörper-Fragmentes sind in den Beispielen 6 und 7 präsentiert. Die in Beispiel 7 präsentierten Daten zeigen, dass die Verabreichung eines chimären 7E3-Anfikörper-Fragmentes an Patienten, die eine Angioplastie durchmachen und die ein hohes Risiko eines abrupten Verschlusses (Reokklusion) durchmachen, einen abrupten Verschluß (Reokklusion) vermeiden und die Inzidenz einer akuten Ischämie senken können. Wie es weiter in Beispiel 7 dargestellt ist, kann die Verabreichung eines chimären 7E3-Antikörper-Fragmentes an Patienten, die eine Angioplastie durchmachen und die einem hohen Risiko eines abrupten Verschlusses (Reokklusion) unterliegen, eine Restenose zu späteren Zeitpunkten reduzieren, verzögern und/oder vermeiden.
Ein Langzeitvorteil, wie durch Reduktion nicht akuter ischämischer Komplikationen gezeigt wird, die nach Verabreichung eines chimären anti-GPIIb/IIIa-Antikörper-Fragmentes zu beobachten war (siehe Beispiel 7) ist so noch nie dagewesen. Zusätzliche Verbindungen, die selektiv an den GPIIb/IIIa-Rezeptor binden, können zur Vorbeugung und Reduzierung einer Stenose oder Restenose verwendet werden mit dem klinischen Vorteil, das Auftreten nicht akuter ischämischer Komplikationen zu reduzieren. Nach Verabreichung können diese Verbindungen zusätzlich eine Okklusion oder Reokklusion vermeiden. Diese Verbindungen schließen beispielsweise GPIIb/IIIa-Antagonisten, Immunglobulin- oder Nicht-Immunglobulin-Peptide oder Proteine (beispielsweise synthetisch, rekombinant), Analoge hiervon und Nukleinsäuren oder Nukleinsäureanaloga ein. Patienten, die dem Risiko einer Koronararterien-Erkrankung unterliegen oder diese aufweisen profitieren von der Verabreichung einer wirksamen Menge einer Verbindung, die selektiv an den GPIIb/IIIa-Rezeptor bindet und dadurch eine Stenose und/oder eine Restenose von Gefäßen hemmt.
Die medizinischen Anwendungen der vorliegenden Erfindung werden in den beigefügten Ansprüchen definiert.
Verabreichung
Die Blutplättchenaggregation aktiviert die Koagulationskaskade und erzeugt ein stabileres Fibrin-Netzwerk und ein okklusives Blutgerinnsel, das durch thrombolytische Mittel aufgelöst werden kann. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung oder die Verbindungen, die selektiv an den GPIIb/IIIa-Rezeptor binden, können einem Individuum (beispielsweise einem Menschen) alleine oder in Verbindung mit einem thrombolytischen Mittel wie beispielsweise einem Plasminogenaktivator (beispielsweise Gewebsplasminogenaktivator, Urokinase, Streptokinase, rekombinanter Gewebsplasminogenaktivator) oder einem Antikoagulanz (beispielsweise einem Antithrombinmittel) oder Anti-Blutplättchenmittel wie beispielsweise Aspirin, Heparin, Hirulog, Hirudin oder einem Kumarin-Antikoagulanz (beispielsweise Warfarin) verabreicht werden, um eine Reokklusion zu vermeiden oder zu reduzieren, die nach der Thrombolyse auftreten kann und um die Blutgerinnselauflösung beispielsweise zu beschleunigen. Die Verbindungen, Antikörper oder Fragmente hiervon können ebenfalls vor, zusammen mit oder anschließend an die Verabreichung eines thrombolytischen Mittels, Antithrombin-Mittels, Antikoagulanz oder Anti-Blutplättchenmittels in Mengen verabreicht werden, die ausreichend sind, um eine Stenose oder Restenose zu verzögern oder zu vermeiden.
Eine wirksame Menge (d. h. eine Menge die ausreicht, um die erwünschte therapeutische Wirkung zu erreichen, wie beispielsweise eine Menge die ausreicht, um eine Stenose oder Restenose oder ischämische Ereignisse zu reduzieren/zu verzögern) einer Verbindung oder eines Antikörpers oder eines Antikörperfragmentes kann parenteral, vorzugsweise intravenös, in einem pharmazeutisch verträglichen Vehiculum beziehungsweise Trägerstoff wie beispielsweise einer sterilen Salzlösung verabreicht werden. Gepufferte Medien können eingeschlossen werden. Die Antikörperformulierung kann zusätzliche Additive wie beispielsweise Stabilisatoren (beispielsweise Polysorbat 80, USP/NF) enthalten. Der Antikörper kann in einer Einzeldosis, kontinuierlich oder in vielfachen Infusionen (beispielsweise einer Bolus-Infusion, gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion) verabreicht werden. Alternativ können die Verbindung oder der Antikörper durch einen kontrollierten Freisetzungsmechanismus verabreicht werden (beispielsweise durch ein Polymer oder durch ein Pflasterabgabesystem) oder durch irgendein anderes geeignetes Verfahren. Die zu verabreichende Menge hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, wie beispielsweise den klinischen Symptomen, dem Gewicht des Individuums, ob andere Arzneistoffe (beispielsweise thrombolytische Mittel) verabreicht werden.
Während der wiederholten Therapie mit Anti-Blutplättchen-Antikörpern kann eine Arzneistoff-induzierte Thrombocytopenie eintreten; diese kann Folge davon sein, dass der Körper die Antikörper-beschichteten Blutplättchen als Fremdproteine erkennt, die Antikörper gegen diese vermehrt und darauf diese über das reticuloendotheliale System schneller als normal beseitigt beziehungsweise abbaut. Wegen der einzigartig hohen Dichte des GPIIb/IIIa-Rezeptors auf der Blutplättchen-Oberfläche (ungefähr 80.000 Rezeptoren pro Blutplättchen) und wegen der großen Anzahl von Blutplättchen im Kreislauf (–0,25 – 0,5 × 10⁶ per μl) kann eine Thrombocytopenie eine bedeutende Behandlungskomplikation mit Anti-Blutplättchen-Antikörpern sein. Die Verwendung eines chimären Anti-Blutplättchen- (beispielsweise Anti-GPIIb/IIIa) Antikörpers kann dieses Problem vermeiden. Die chimären Anti-Blutplättchen-Antikörper der vorliegenden Erfindung können die Thrombocytopenie minimieren (reduzieren oder vermeiden), die ansonsten in anderer Weise nach Verabreichung eines Anti-Blutplättchen-Antikörpers eintreten könnte. Beispielsweise wurde eine minimale Thrombocytopenie nach Verabreichung eines chimären 7E3 Fab (siehe beispielsweise Beispiele 6 und 7) beobachtet.
Zweitens zeigt das chimäre 7E3 Fab-Antikörper-Fragment nach Verabreichung an Menschen eine überraschenderweise reduzierte Inzidenz einer induzierten Immogenität im Vergleich mit seinem murinen Gegenstück (siehe beispielsweise Beispiele 4 und 7). Nach Bindung der Blutplättchen wird die Großzahl der murinen Bestandteile des chimären Anti-Blutplättchen Antikörpers an die Blutplättchen-Oberfläche, beispielsweise über den GPIIb/IIIa-Rezeptor, gebunden werden und wird somit dem Immunsystem nicht mehr zugänglich sein, was den chimären Antikörper von einem humanen Antikörper, der gegen dasselbe Epitop gerichtet ist, funktionell nicht mehr unterscheidbar macht. Deswegen können weitere chimäre Anti-Blutplättchen-Antikörper der vorliegenden Erfindung in ähnlicher Weise trotz ihrer murinen Antigen bindenden Region nicht immunogen sein.
Die Erfindung wird weiter durch die nachfolgenden Beispiele veranschaulicht, die keinesfalls als einschränkend aufgefaßt werden sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Herstellung von chimärem Blutplättchen spezifischem IgG4
A. Allgemeine Strategie
Die Strategie zum Klonieren der variablen Regionen der schweren und leichten Ketten-Gene aus dem 7E3-Hybridom basierte auf der Bindung im Genom zwischen der variablen Region und der entsprechenden J(Verbindungs)Region für funktionell neu angeordnete (und exprimierte) Ig-Gene. Die J-Region DNA-Sonden können zum Screenen genomischer Bibliotheken verwendet werden, um DNA, die an die J-Regionen gebunden sind, zu isolieren; DNA in der Keimbahn-Konfiguration (nicht umgeordnet) würde ebenfalls an J-Sonden hybridisieren, ist jedoch nicht an eine variable Region-Sequenz gebunden und kann durch Restriktionsenzymanalyse der isolierten Klone identifiziert werden.
Die Klonierungsstrategie bestand deswegen darin, variable Regionen aus neu geordneten Schweren- und Leichtketten-Genen unter Verwendung von J_H und J_K zu isolieren. Diese Klone wurden getestet, um zu sehen, ob ihre Sequenzen im 7E3-Hybridom durch Northern-Analyse exprimiert wurden. Solche Klone, die exprimierte Sequenzen enthielten, wurden in Expressionsvektoren eingebaut, die humane konstante Regionen enthielten und wurden in Mausmyelomzellen transfiziert, um zu bestimmen, ob ein Antikörper hergestellt wurde. Der Antikörper aus produzierenden Zellen wurde darauf bezüglich seiner Bindungsspezifität und Funktionalität im Vergleich mit dem murinen 7E3-Antikörper getestet.
Eine Hinterlegung eines Zelllinien-Derivats, der murinen Hybridoma 7E3, wurde bei der American Typ Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 am 30. Mai 1985 vorgenommen. Die Zugangsnummer HB8832 wurde nach erfolgreichen Lebensfähigkeits-Tests zugewiesen.
B. Materialien und Methoden
Alle Teile und Prozentsätze sind auf das Gewicht bezogen, die Gradangaben auf Celsius, soweit nichts anderes angegeben ist.
Konstruktion einer genomischen schwere Kette-Bibliothek bzw. Bank
Um das Gen für die variable Region der schweren Kette aus der 7E3-Hybridoma zu isolieren wurde eine Größen-ausgewählte genomische Bibliothek unter Verwendung des Phagen-Lambda-Vektors gtlO konstruiert. Eine Southern-Analyse von EcoRI digerierter 7E3-DNA unter Verwendung einer J_H-Sonde zeigte eine einzelne 3,5 kb Bande, die einem umgeformten Schwerekette-Locus entspricht. Es war wahrscheinlich, dass dieses Fragment das 7E3-Gen für die schwere Kette der variablen Region enthielt. Hochmolekulargewichts-DNA wurde aus den 7E3-Hybridomzellen isoliert und vollständig mit der Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut bzw. digeriert. Die DNA wurde dann auf einem 0,7% Agarosegel fraktioniert und die DNA in einem Größenbereich von 3–4 kb wurde direkt aus dem Gel isoliert. Nach Phenol/Chloroformextraktion und Sephadex G-50 Gelfiltration wurden die 3–4 kb Fragmente mit Lambda gtlO-Armen ligiert (Promega Biotech, Inc.) und in Phagenteilchen in vitro unter Verwendung von Packagene von Promega Biotech gepackt. Diese Bibliothek wurde direkt in einer Dichte von ungefähr 30.000 Plaques pro 150 mm Petrischale unter Verwendung einer ³²P-markierten J_H-Sonde gescreent. Plaquehybridisierungen wurden in 5 X SSC, 50% Formamid, 2X Denthardt's Reagenz, 200 μg/ml denaturierter Lachssamen-DNA bei 42°C für 18–20 Stunden durchgeführt. Endgültige Waschungen waren 0,5 X SSC, 0,1% SDS bei 65 Grad. Positive Klone wurden nach Autoradiographie identifiziert.
Konstruktion einer genomischen Leichtketten-Bibliothek
Um das Gen für eine variable Region der 7E3-Leichtkette zu isolieren wurde eine genomische Bibliothek im Lambdavektor EMBL-3 konstruiert. Hochmolekulargewichts-DNA wurde teilweise mit der Restriktionsendonuklease Sau3A verdaut und auf einem 10–40% Saccharosedichte-Gradienten Größen-fraktioniert. DNA-Fragmente von 18–23 kb wurden mit EMBL-3 Armen ligiert und in Phagenteilchen in vitro unter Verwendung von Packagene verpackt. Diese Bibliothek wurde in einer Dichte von 30.000 Plaques pro 150 mm Platte unter Verwendung einer J_κ-Sonde gescreent. Die Hybridisierungs- und Waschbedingungen waren denjenigen, die für die Schwerekette-Bibliothek verwendet wurden, identisch.
DNA-Sonden
Die Maus-schwere Kette-J_H-Sonde ist ein 2 kb BamHI/EcoRI-Fragment, das sowohl J3 als auch J4-Segmente enthält. Die Maus-Leichtketten-J_κ-Sonde ist ein 2,7 kb HindIII-Fragment, das alle fünf J_κ-Segmente enthält. ³²P-markierte Sonden wurden durch Nick-Translation unter Verwendung eines Kits bzw. Bausatzes hergestellt, bezogen von Amersham, Inc. Freie Nukleotide wurden durch Zentrifugation durch eine Sephadex G-50 Säule entfernt. Die spezifischen Aktivitäten der Sonden waren ungefähr 10⁹ cpm/μg.
Northern Analyse
15 μg Gesamtzell-RNA wurden einer Elektrophorese auf 1% Agarose/Formaldehyd-Gelen unterworfen (Maniatis, et al., Molecular Cloning) und auf Nitrozellulose übertragen. Die Blots wurden mit Nick-translatierten DNA-Sonden in 50% Formamid, 2X Denhardt's Lösung, 5 X SSC und 200 μg/ml denaturierte Lachsspermien-DNA bei 42 Grad für 10 Stunden hybridisiert. Finale Waschbedingungen waren 0,5 X SSC, 0,1% SDS bei 65 Grad.
DNA-Transfektion unter Verwendung einer Elektroporation
Plasmid-DNA, die transfiziert werden sollte, wurde durch Zentrifugieren bis zum Gleichgewicht in Ethidiumbromid/Cäsiumchloridgradienten zwei Mal aufgereinigt. 10–50 μg Plasmid-DNA wurde 8 × 10⁶ SP2/0 Zellen in PBS auf Eis zugesetzt und das Gemisch in einem Biorad Elektroporations-Gerät angeordnet. Die Elektroporation erfolgte bei 200 Volt und die Zellen wurden in 96 Well Microtiterplatten ausplattiert. Eine geeignete Arzneistoffselektion wurde nach 48 Stunden durchgeführt und Arzneistoff-resistente Kolonien wurden nach 1–2 Wochen identifiziert.
Quantifizierung der Antikörper-Produktion
Gewebskulturüberstand wurde auf einen IgG-Protein-Gehalt durch Teilchenkonzentrations-Fluoreszenz-Immunassay untersucht (Jolley, M. E. et al., (1984) J. Immunol. Meth. 67: 21) unter Verwendung von Standardkurven, die mit gereinigtem IgG erzeugt wurden. Die Konzentration an chimärem 7E3-Antikörper mit humanen konstanten Regionen wurde unter Verwendung von Ziegen-anti-humanem IgG Fc-Antikörper beschichteten Polystyrolkügelchen und Fluoreszein-konjugiertem Ziegen-anti-humanem IgG Fc-Antikörper bestimmt. Der Assay wurde in einem automatisierten Gerät durchgeführt (Pandex Laborstories, Inc.).
Aufreinigung plättchenspezifischen IgG4-Antikörpers
Ein Gewebskulturüberstand wurde mit einer Diaflo YM100 Ultrafiltrationsmembran (Amicon) konzentriert und auf eine Protein A-Sepharose-Säule aufgeladen. Der chimäre Antikörper wurde aus der Protein-A-Säule mit einem Natriumcitrat pH-Gradienten von pH 6,5 bis pH 3,5 eluiert. Der aufgereinigte Antikörper wurde unter Verwendung einer Diaflo YM100 Ultrafiltrationsmembran konzentriert. Die Antikörperkonzentration wurde durch Bestimmung der Extinktion bei 280 nm gemessen.
Bindungshemmungs-Assay
Gereinigter Antikörper (entweder muriner 7E3 oder chimärer 7E3) wurde dazu verwendet, mit radiojodiertem 7E3-Antikörper um die Bindung an humane Plättchen zu konkurrieren. Plättchenreiches Plasma (PRP) wurde durch Zentrifugation von citriertem Gesamtblut vom Menschen bei 1.875 UpM für 3,5 Minuten hergestellt. ¹²⁵I-markierter 7E3-Antikörper (150.000 cpm) wurde der geeigneten Verdünnung des gereinigten Testantikörpers zugesetzt und die Reaktion wurde durch Zusatz von 150 μl PRP injiziert. Eine Inkubation wurde für 1–2 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt und die Blutplättchen mit gebundenem Antikörper wurden von freiem Antikörper durch Zentrifugation durch 30% Saccharose bei 12.000 g für 4 Minuten in einem 0,4 ml Microfugenröhrchen aufgetrennt. Die Rohrspitze, die das Blutplättchen/Antikörper-Pellet enthielt, wurde abgeschnitten und in einem Gamma-Zähler gezählt. Die Konkurrenz um die Bindung an die Blutplättchen zwischen jodiertem 7E3 und chimärem 7E3 wurde mit der Konkurrenz zwischen Jodid und nicht markiertem 7E3 IgG verglichen.
Hemmung der Blutplättchenaggregation
Gereinigtes 7E3 oder chimärer 7E3-Antikörper wurde citriertem Gesamtblut vom Menschen zugesetzt und bei 37 Grad für 10 Minuten inkubiert. Die Geschwindigkeit der Blutplättchenaggregation wurde nach Aktivierung mit Kollagen oder ADP unter Verwendung eines Gesamtblutaggregometers (Chronolog Corp.) gemessen.
C. Ergebnisse
Klonieren der Blutplättchen spezifischen variablen Genregionen
Mehrere positive Klone wurden aus den schwere und leichte Kette-Bibliotheken nach Screenen und ungefähr einer Million Plaques unter Verwendung jeweils der J_H und J_κ-Sonden isoliert. Im Anschluß an zumindest drei Umläufe der Plaqueaufreinigung wurden Bakteriophagen-DNA für jeden positiven Klon isoliert, entweder mit EcoRI digeriert (schwere Ketten-Klone) oder mit HindIII (leichte Ketten-Klone) und wurde auf 1% Agarose-Gelen fraktioniert.
Die DNA wurde auf Nitrocellulose übertragen und die Blots wurden mit J_H (schwere Kette) oder J_κ ³²P-markierten DNA-Sonden hybridisiert. Für die schwere Kette wurden zwei Klone erzielt, die 3,5 EcoRI DNA-Fragmente enthielten, die an die J_H-Sonde hybridisierten. Zwei Größenklassen von HindIII-Fragmenten von 3,0 und 6,0 kb wurden mit der J_κ-Sonde identifiziert.
Klonierte DNA, die den authentischen Schwere- und Leichtketten-variabler Regionen aus dem 7E3-Hybridom entsprachen, sollten an mRNA hybridisieren, die aus der Hybridoma isoliert wurde. Nicht funktionelle DNA-Neuordnungen entweder an dem Schwere- oder Leichtketten-Locus sollten nicht exprimiert werden. 1 zeigt eine Northern-Analyse die darstellt, dass das vermeintliche 3,5 kb EcoRI Schwereketten-Fragment und das 6,0 kb HindIII vermeintliche Leichtketten-Fragment jeweils an die geeignete Größe einer mRNA aus den 7E3-Hybridomen hybridisiert. Die subklonierten Fragmente wurden mit ³²P durch Nicht-Translation markiert und an Northern-Blots hybridisiert, die Gesamt-RNA enthielten, gewonnen aus SP2/0 (der Fusionspartner des 7E3-Hybridoms) oder aus 7E3, wie in 1 gezeigt ist. Das 3,5 EcoRI Schwereketten-Fragment hybridisierte mit einer 2 kb mRNA in 7E3-RNA, jedoch nicht in SP2/0-RNA. In ähnlicher Weise hybridisierte das 6,0 kb Leichtekette-HindIII-Fragment mit einer 1.250 bp mRNA in 7E3 RNA, jedoch nicht in SP2/0 RNA. Dies sind die korrekten Größen für jeweils Schwere- und Leichtketten mRNAs. Weil die klonierten DNA-Fragmente Sequenzen enthalten, die im 7E3-Hybridom exprimiert werden legen diese Daten nahe, dass die Klone die korrekten variablen Region-Sequenzen aus der 7E3-Hybridoma enthalten. Der finale Funktionstest ist jedoch die Demonstration, dass diese Sequenzen, wenn sie mit geeigneten konstanten Region-Sequenzen kombiniert werden, dazu in der Lage sind, die Synthese eines Antikörpers mit einer Spezifität und Affinität, die derjenigen des murinen 7E3 Antikörpers ähnlich ist, zu lenken.
Vektoren- und Expressionssysteme
Die vermeintlichen Leichte- und Schwerekette-V-Gene, kloniert aus der 7E3-Hybridoma, wurden an humane κ und G₄ konstante Region-Gene in Expressionsvektoren gebunden, die früher beschrieben wurden (Sun, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218 (1987)). Das 17-1A V_κ HindIII-Fragment von pSV184ΔHneo17-1AV_κhC_κ wurde durch das 6,0 kb HindIII-Fragment ersetzt, das dem vermeintlichen Leichtketten-variablen Region-Gen von 7E3 entsprach. In ähnlicher Weise wurde das 17-1A V_H EcoRI-Fragment von pSV2ΔHgpt17-1AV_HhC_G4 durch das 3,5 kb EcoRI-Fragment ersetzt, das dem vermeintlichen Schwerekette-V Region-Gen von 7E3 entsprach. Die Strukturen der sich ergebenden Plasmide, bezeichnet als p7E3V_κhC_Hκ und p7E3V_HhC_G4 sind in 2 dargestellt.
Um die Gene für die chimäre schwere und leichte Kette zu exprimieren wurden die beiden Plasmide in die nicht produzierende Mausmyelomzelllinie SP2/0 cotransfiziert. Das Leichtekette-Plasmid verleiht eine Resistenz gegenüber G418 und das Schwerekette-Plasmid verleiht eine Resistenz gegenüber Mycophenolsäure, was eine Doppelselektion zur Gewinnung von Klonen ermöglicht, die Gene aus jedem Plasmid mit sich tragen und exprimieren. Kolonien, die gegenüber G418 und Mycophenolsäure resistent sind, wurden zu stabilen Zelllinien expandiert und in Gegenwart beider Arzneistoffe gehalten. Der Gewebskulturüberstand aus diesen beiden Zellen wurde auf einen Antikörper unter Verwendung eines Teilchenkonzentrationsfluoreszenz-Immunassays mit Polystyrolkügelchen, die mit Ziegen-anti-humanem IgG Fc-Antikörper beschichtet waren und mit demselben Antikörper, der mit Fluorescein markiert war, getestet. Aus den ersten 10 Linien die überprüft wurden, wurde eine (als c-7E3F6), die ungefähr 2 μg/ml produzierte, für eine weitere Studie ausgewählt.
Plättchenbindungs-Aktivität-Assay
Nach Aufreinigung des c-7E3F6-Antikörpers unter Verwendung einer Protein-A-Sepharose-Säule wurde der Antikörper konzentriert und mit murinem 7E3 IgG im Plättchenbindungs-Aktivitäts-Assay verglichen. 3 zeigt, dass marines 7E3 und c-7E3F6 (der vermeintliche chimäre Antikörper) mit radiomarkiertem 7E3 um die Blutplättchenbindung im selben Ausmaß konkurrieren; die Bindungskurven sind übereinanderlegbar, was anzeigt, dass die Bindungseigenschaften von murinem und chimärem 7E3 durch dieses Kriterium identisch sind.
Hemmung der Blutplättchenaggregation durch c-7E3F6
Gereinigter c-7E3F6 wurde mit murinem 7E3 in einem funktionellem Assay verglichen, der die Fähigkeit des Testantikörpers mißt, die Aggregation humaner Blutplättchen zu hemmen. Die Ergebnisse eines solchen Assays sind in 4 dargestellt und demonstrieren, dass sowohl beide Antikörper eine Kollagen-induzierte Blutplättchenaggregation im selben Ausmaß bei derselben Antikörperkonzentration hemmen. c-7E3F6 hemmt ebenfalls eine ADP-induzierte Blutplättchenaggregation in einem ähnlichen Umfang.
Die Ergebnisse des Blutplättchenbindungs-Assays und der Hemmung des Blutplättchenaggregations-Assays zeigen dass: (1) die korrekten variablen Region-Gene tatsächlich aus der 7E3-Hybridoma kloniert wurden; und (2) die Substitution der humanen konstanten Regionen der marinen konstanten Region keine Wirkung auf die Bindung oder funktionelle Eigenschaften der 7E3 variablen Regionen aufwies, wie durch diese Assays gemessen wurde.
Fibrinogen-beschichtete Kügelchen-Assay
Der chimäre c-7E3F6-Antikörper wurde in einem qualitativen funktionellen Assay positiv befunden, der die Fähigkeit eines Antikörpers mißt, die Agglutination zwischen Blutplätt chen und Fibrinogen-beschichteten Kügelchen zu hemmen. Coller, B. et al., (1983) J. Clin. Invest. 73: 325–338.
Beispiel 2
Herstellung von chimärem IgG1 und IgG3
Das DNA-Segment, das die variable Region der schweren Kette aus dem murinen 7E3-Antikörper kodiert wurde an die humanen γ1- und γ3-konstanten Regionen gebunden, die auf den Expressionsvektoren pSV2ΔHgpt17-1AV_H-hC_G1 und pSV2ΔHgpt17-1AV_H-hC_G3 vorlagen (Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218 (1987)), indem die 17-1A schwere oder leichte Kette variable Region-Fragmente mit den entsprechenden 7E3 variablen Region-Fragmenten ersetzt wurden. Die sich ergebenden chimären Schwerelcette-Gene wurden mit dem chimären Leichtketten-Gen in SP2/0-Zellen cotransfiziert, um stabile Zelllinien zu erzeugen, die γ1, κ und γ3,κ-Antikörper sezernieren.
Beispiel 3
Initiale Studien der Verwendung von chimären 7E3 Fab in Menschen
Herstellung von chimären 7E3 Fab-Fragmenten
Das Fab-Fragment von chimärem 7E3 (c7E3) wurde durch enzymatische Verdauung von gereinigtem chimärem 7E3 IgG (Gamma 1-Schwerekette, Kappa-Leichtkette) mit dem proteolytischen Enzym Papain hergestellt. Das Fab-Fragment wurde durch eine Reihe von Aufreinigungsschritten isoliert, die zur Gewinnung eines Produktes entwickelt wurden, das frei von anderen Digestions-Fragmenten und weiterer kontaminierender Bestandteile war (beispielsweise Protein, Nukleinsäure, Viren). Das Endprodukt wurde als sterile, nicht-pyrogene Lösung hergestellt, die 2 mg monoklonalen chimären 7E3 Fab pro ml 0,15 M Natriumchlorid, 0,01 M Natriumphosphat pH 7,2 enthielt. In bestimmten Zubereitungen wurde Polysorbat 80 in einer Endkonzentration von 0,001% (g/v) eingeschlossen. Vor der Verwendung wurde das Produkt durch einen 0,22 μm Filter mit geringer Proteinbindung filtriert. Das Produkt wurde bei 2–8°C aufbewahrt.
Pharmacokinetik: Plasma-Clearance von c7E3 Fab bei Menschen
Die Plasma-Clearance von chimären 7E3 (c7E3) Fab-Fragmenten wurde bei drei Patienten mit stabiler koronarer Krankheit bzw. koronarer Herzkrankheit untersucht. Im Anschluß an eine 0,25-mg/kg-Dosis von c7E3 Fab, intravenös als 5-minütige Infusion verabreicht, wurden Blutproben zu verschiedenen Zeitpunkten von zwei Minuten bis 72 Stunden entnommen. Es wurde angenommen, dass ein bestimmter Anteil des Antikörpers im Plasma in einem ungebundenen Zustand existieren würde. Um diesen ungebundenen Antikörperbestandteil zu quantifizieren war es notwendig, das Plasma rasch von den Blutplättchen abzutrennen, um eine weitere Bindung ex vivo zu verhindern. Die Plasmakonzentration von freiem c7E3 Fab wurde durch Festphasenenzym-Immun-Assay (EIA) gemessen. Der Assay verwendete einen Affinitäts-isolierten anti-inurinen 7E3 IgG, aufgereinigt aus Kaninchen-Anti-Seren zum Fest-Phasen-Einfangen und ein Nachweissystem auf Grundlage eines biotinylierten Derivats derselben Kaninchen-anti-7E3-Antikörper-Zubereitung. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1

NB: Nicht bestimmt/unter der Nachweisgrenze des Assays (0,025 μg/ml).
NA: Nicht verfügbar.

Wenn die gesamte injizierte Dosis von 7E3 als freier Antikörper im Plasma nachgewiesen wurde, wäre das theoretische Maximum der Antikörperkonzentration ungefähr 6,25 μg/ml (0,25 mg/kg geteilt durch 40 ml Plasma/kg). Jedoch würde diese theoretisch maximale Konzentration niemals wegen des großen Bestandteils des injizierten Antikörpers, der an die Blutplättchen bindet, erreicht werden. Tatsächlich war zum frühesten Meßzeitpunkt (2 Minuten) die durchschnittliche Plasmakonzentration (n = 2) des c7E3 Fab 2,43 μg/ml; dieser Wert war die beobachtete maximale Plasmakonzentration (C_max). Die zu aufeinanderfolgenden Postinjektionszeiten gewonnenen Daten zeigen eine rasche initiale Abnahme der Plasmakonzentration von c7E3 Fab. Durch die 1-Stunden- und 24-Stundenmessungen betrug der verabreichte Antikörper, der im Plasma zurückblieb (n = 3) weniger als 0,5 μg/ml bzw. 0,1 μg/ml. Ein Plot der Plasmaantikörperkonzentration (ng/ml) gegen die Zeitdaten, präsentiert in 5 demonstierte graphisch die rasche anfängliche Clearance von c7E3 Fab aus dem Plasma bei allen drei Patienten.
Eine vorläufige Analyse der pharmakokinetischen Eigenschaften des c7E3 Fab-Fragmentes wurde vorgenommen. Mehrere Modelle, einschließlich mehrerer gemischter (zufallsbedingte und fixierte Effekte) lineare Modelle ebenso wie Standard-Zwei-Kompartiment- und Nicht-Kompartiment-Modelle wurden dazu verwendet, die Plasmakonzentrationsdaten anzupassen. Die freien Plasmaantikörperdaten paßten nicht adäquat zu pharmakokinetischen Standardmodellen. Weil die Stelle der Wirkung für c7E3 Fab ein Rezeptor ist, der auf Blutplättchen angeordnet ist, ist es nicht unerwartet, dass die Plasmakonzentration an freiem Antikörper nicht zu seiner Konzentration am Wirkort in einfacher Weise in Beziehung stehen würde. Die rasche initiale Clearance des c7E3Fab aus dem Plasma widerspiegelt teilweise die rasche Antikörperbindung an Blutplättchen GPIIb/IIIa-Rezeptoren. Von den überprüften Modellen wurde gezeigt, dass das lineare Modell der zufallsbedingten Effekte am besten zu den Plasmakonzentrationsdaten paßte. Unter Verwendung dieses Modells wurden vorläufige Werte für die pharmakokinetischen Parameter Cl_p, V_d und t_1/2. bestimmt und in Tabelle 2 präsentiert. Tabelle 2

Cl_p: Plasma-Clearance ist als die Rate der Abnahme der Plasmakonzentration geteilt durch die Konzentration definiert und wird als Rate pro Stunde errechnet, d. h., wenn die Rate bei einem vorgegebenen Zeitpunkt für eine Stunde anhielt, wäre die berechnete Rate der Anteil des Arzneistoffs, der in dieser Stunde entfernt wurde.
V_d: Das Verteilungsvolumen ist als die Dosis definiert, die verabreicht wurde, geteilt durch die gemessene Plasmakonzentration multipliziert mit dem Plasmavolumen. Ein 3-Liter-Plasmavolumen, das für eine 70 kg Person typisch ist, wurde bei den Berechnungen verwendet.
t_1/2: Eliminationshalbwertszeit.

Urinexkretion bei Menschen
Urinproben wurden von drei Patienten mit einer stabilen koronaren Herzkrankheit gesammelt, die intravenös mit 0,25 mg/kg c7E3 Fab behandelt wurden (Plasma-Clearance-Daten für diese gleichen drei Patienten sind oben diskutiert). Der gesamte Urin-Output wurde für die nachfolgenden Post-Injektionszeitspannen gesammelt: 0–2 Stunden, 2–6 Stunden, 6–12 Stunden und 12–24 Stunden. Zusätzlich wurde eine Probe aus Prä-Dosis-Urin ebenfalls gesammelt. Repräsentative Proben der gesammelten Urinproben wurden bezüglich freiem 7E3 Fab unter Verwendung einer schwachen Modifikation des EIA, oben beschrieben, analysiert. In allen Fällen wurde kein c7E3 Fab im Urin nachgewiesen.
Präklinische Toxikologie
Präklinische Toxikologiestudien wurden bei 18 Affen (Cyonomolgus und Rhesus) unter Verwendung von chimärem 7E3 Fab durchgeführt. Bolus-Dosen von bis zu 0,6 mg/kg, gefolgt von einer Infusion von bis zu 0,8 μg/kg/min für 96 Stunden wurden verabreicht (schließt Studie mit Heparin, Aspirin bzw. Acetylsalicylsäure und rekombinantem Gewebsplasminogenaktivator ein). Bei allen Affen war in allen Dosen 7E3 sicher und wurde wohl toleriert mit keinen signifikanten Blutungskomplikationen oder anderen abträglichen Ereignissen.
Dosis-Eskalation von chimärem 7E3 Fab bei stabilen Angina-Patienten
Eine Dosis-Eskalationsstudie wurde durchgeführt, die 52 stabile Angina-Patienten mit einschloß (Männer von 43 bis 75 Jahren), bei denen eine Anti-Blutplättchen-Therapie für mehr als 10 Tage nicht mehr erfolgt war. Eine Vielzahl von Dosierungsvorschriften wurde angewendet. Die Patienten empfingen entweder einfache intravenöse Bolus-Injektionen von 0,15 bis 0,30 mg/kg von chimärem 7E3 Fab (20 Patienten) oder eine Bolus-Belastung gefolgt von kontinuierlichen intravenösen Infusionen (10 μg/min) von 12 bis 96 Stunden Dauer (32 Patienten).
Eine Blutplättchen GPIIb/IIIa-Rezeptorblockade, eine Blutplättchenaggregationsreaktion in Reaktion auf 20 μM ADP (Agonist) und Blutungszeitpunkte wurden 2 Stunden nach Verabreichen einer Bolus-Dosis eines c7E3 Fab (0,15–0,30 mg/kg) bestimmt. Eine Rezeptorblockade und Blutplättchenaggregation in Reaktion auf Agonisten wurde im wesentlichen wie beschrieben bestimmt (Gold, H. K. et al., J. Clin. Invest. 86: 651–659 (1990)). Die Blutungszeiten wurden durch das Simplate-Verfahren bestimmt. Mit zunehmenden Dosen existierte eine progressive Zunahme der Rezeptorblockade, wie durch den Prozentsatz der blockierten Rezeptoren angezeigt wird (bestimmt aus der Verfügbarkeit von Rezeptorbindungsstellen). Die Zunahme der Rezeptorblockade verlief parallel mit der Hemmung der Blutplätchenaggregation (gemessen als Prozent des Vordosis-Wertes oder der Basislinie) und durch Zunahme der Blutungszeit.
Der Peakeffekt bezüglich aller drei Parameter wurde bei 0,25 mg/kg beobachtet. Die Dosis entspricht einer Plasmakonzentration von 5 μg/ml – der Konzentration, bei der die Peakhemmung in einem Blutplättchen reichen Plasma von einem normalen Subjekt ersichtlich war, das für 15 Minuten in eine Aggregometerküvette in Gegenwart zunehmender Konzentrationen an chimärem 7E3 Fab inkubiert wurde. (Der Umfang der Aggregation des Plasma des normalen Subjektes wurde durch den Prozentsatz des Lichtes, das durch die Küvette hindurch schien, gemessen. Vor Zusatz eines Agonisten wurde das Plasma relativ opaque und der Prozentsatz von Licht, der hindurch schien, wurde auf null eingestellt. Wenn der Agonist ADP einer Kontrollprobe ohne Antikörper zugesetzt wurde, nahm die Lichttransmission schrittweise zu, wenn die Aggregation zunahm. Wenn jedoch der c7E3 Fab vorliegt, wurde eine Dosis-abhängige Blockade der Aggregation mit einer vollständigen Hemmung bei 5 μg/ml c7E3 Fab beobachtet).
Die Wirkdauer bezüglich der Rezeptorblockade, die Hemmung der Blutplättchenaggregation und die Blutungszeit wurden bestimmt. Die Peakwirkungen auf die Rezeptorblockade, die Blutplättchenaggregation und die Blutungszeit war bei 2 Stunden mit einer graduellen Erholung über die Zeit hinweg ersichtlich. Die Blutungszeiten kehrten bei 6–12 Stunden zu nahezu normalen Werten zurück.
Weil die Peak-Rezeptorblockade und die funktionelle Hemmung mit 0,25 mg/kg erreicht wurde, wurde die Dauer der Blutplättchenhemmung durch kontinuierliche Infusionen im Anschluß an diese Beladungs-Dosis untersucht um zu bestimmen, ob die Dauer der Blutplättcheninhibition verlängert werden könnte. Der Umfang der Rezeptorblockade, die Hemmung der Blutplättchenaggregation und die Verlängerung der Blutungszeit wurden für die Zeitdauer einer kontinuierlichen Infusion bei fünf Patienten aufrecht erhalten, die eine 10 μg/min kontinuierliche Infusion von chimärem 7E3 Fab für 7 Stunden folgend der 0,25 mg/kg Beladungs-Dosis empfingen. Die Erholung begann sobald die Infusion unterbrochen wurde. Ähnliche Ergebnisse waren bei 12, 24, 48 und 96-Stunden Infusionen ersichtlich.
Keiner der Patienten erfuhr eine Hypersensibilisierungsreaktion. Es existierten keine signifikanten behandlungsbezogenen Trends in den Hämatologie- oder in Chemie-Laborwerten. Noch existierten irgendwelche bedeutenderen Blutungsereignisse. Insignifikante Blutungsereignisse waren selten und schlossen ein vorübergehendes mildes Nasenbluten, Zahnfleisch-Aussickern bei Patienten mit einer periodentalen Erkrankung ein. Die Ergebnisse des Versuchs zeigten, dass chimäres 7E3 Fab Patienten unter Verwendung von Dosisvorschriften verabreicht werden kann, die eine tiefgreifende Hemmung der Blutplättchenfunktion für Zeitspannen von sogar mehreren Tagen erzeugen.
Immunogenitäts-Ergebnise
Bei Versuchen mit murinem 7E3 F(ab')₂ und Fab (150 Patienten) traten Immunreaktionen, die unter Verwendung eines empfindlichen Enzym-gebundenen Immun-Assay-Systems nachgewiesen wurden, bei 16% (24/150) der Patienten auf. Alle Reaktionen wiesen einen niedrigen Titer auf, typischerweise im Bereich von 1 : 50 bis 1 : 200. Die Behandlungsgruppe schloß normale Freiwillige ein, die mit 0,01–0,25 mg/kg murinem 7E3 F(ab')₂ behandelt wurden, instabile Angina-Patienten, die im 0,05–0,20 mg/kg murinem 7E3 F(ab')₂ und PTCA-Patienten, die mit 0,1 mg/kg murinem 7E3 F(ab')₂ oder 0,15–0,35 mg/kg murinem Fab behandelt wurden, ebenso wie stabile Angina-Patienten, die mit einer einzigen intravenösen Bolus-Injektion von 0,10–0,30 mg/kg murinem 7E3 Fab, einer einzelnen Bolus-Dosis von entweder 0,25 oder 0,30 mg/kg gefolgt von einer kontinuierlichen Infusion für 12–36 Stunden (0,15 μg/kg/min oder 10 μg/min) murinem Fab oder mit zwei Injektionen von murinem Fab getrennt um sechs Stunden behandelt wurden (ein einziger Bolus von 0,2 mg/kg – 0,30 mg/kg gefolgt von einem Bolus von 0,05 mg/kg).
Die Immunogenität war bei dem humanem Maus chimärem 7E3 Fab merklich reduziert. Keiner der 52 Patienten mit einer stabilen Angina, die in dieser Dosis-Eskalationsstudie mit einbezogen und mit chimärem 7E3 Fab (siehe oben) behandelt wurde, zeigte eine Immunreaktion auf eine Behandlung, wie es durch einen einfachen Assay gemessen wurde, der an den chimären Fab angepaßt war.
Reversibilität der Anti-Blutplättchen-Aktivität
7E3 Fab (γ₁, κ) weist eine langsame Ablösungsgeschwindigkeit von Blutplättchen auf und chimäre 7E3 Fab in freiem Plasma wird rasch aus dem Kreislauf geklärt (siehe oben). Somit sind die Anti-Blutplättchenwirkungen von chimärem 7E3 durch Verabreichung zufallsbedingter Donor-Blutplättchen reversibel. Diese Umkehr- oder Antidot-Wirkung durch Transfusion von Blutplättchen wurde bei 2 Patienten gezeigt, die entweder murinen Fab oder chimären Fab empfingen und die zufällige Donor-Blutplättchen während einer Zeit empfingen, wenn sie eine beinahe vollständige Hemmung der Blutplättchenaggregation aufwiesen. Die Wiederherstellung der Blutplättchenfunktion wurde durch Messung der Blutungszeiten bestimmt. Diese Eigenschaft ist in Situationen nützlich, in denen ein Blutungsereignis eine Wiederherstellung der Blutplättchenfunktionen bei einem Patienten notwendig macht.
Beispiel 4
Die Verwendung chimärer 7E3 Antikörper bei der Vorbeugung thrombotischer Komplikationen einer elektiven Koronar-Angioplastie
Eine perkutane transluminale Koronar-Angioplastie (Percutaneous transluminal coronary angioplasty = PTCA) durch Ballon- oder Koronar-Atherektomie ist ein wirksames Verfahren zur Vergrößerung des Lumens von stenosierten Koronar-Arterien. In diesem Verfahren besteht ein inhärentes Risiko einer akuten Koronar-Okklusion während und nach der Angioplastie. Die berichtete Rate der Koronar-Okklusion variiert von ungefähr 3% bis ungefähr 6% der elektiven Angioplastie-Fälle (Detre, K. M. et al., Circulation 82: 739–750 (1991)) und ist die Hauptursache der Krankenhaus-Morbidität und Mortalität. Bei Hochrisikopatienten liegt die Inzidenz von bedeutenderen Herzereignissen bzw. Zwischenfällen, die durch eine Thrombose verursacht sind, zwischen 10–20%.
Ein akuter Koronar-Verschluß während oder unmittelbar nach einer Koronar-Angioplastie scheint durch die Kombination einer tiefen arretieren Wandverletzung mit sich ergebenden teilweise okklusiven "intimalen Lappen" mit oder ohne darüber liegender Thrombus-Bildung oder einer Thrombus-Bildung alleine an einer Stelle einer Gefäßwand-Verletzung, verursacht zu sein. In Tiermodellen gehen einer Reokklusion nach erfolgreicher Thrombolyse Perioden von zyklischen Reduktionen und Restaurationen der koronaren Blutströmung voraus, die als „zyklische Strömungsvariation" (CFVs) bezeichnet werden. Diese CFVs sind fast überwiegend ein Plättchen-vermitteltes Phänomen und sind auf eine wiederholte Akkumulation und Verschiebung von Blutplättchenaggregaten an Stellen einer Koronar-Stenose und Endothel-Verletzung zurückzuführen. Zyklische Strömungsvariationen nach einer Koronar-Angioplastie wurde bei Menschen beschrieben. Chimärer 7E3-Antikörper kann zur Hemmung der Blutplättchenfunktion während der Angioplastie verwendet werden und dadurch eine Blutplättchenaggregation und Thrombose verhindern. Der chimäre 7E3-Antikörper ist insbesondere bei Patienten von Nutzen, die einem hohen Risiko eines thrombotischen Verschlusses bzw. einer Okklusion unterliegen. Diese Patienten können auf Grundlage anatomischer (beispielsweise angiographisch definierter Eigenschaften einer Verletzung an der Stelle der Stenose) oder klinischen Risikofaktoren (beispielsweise eines Herzinfarktes, einer instabilen Angina, Diabetes, Frauen in einem Alter von 65 Jahren oder älter) identifiziert werden, die eine Prädisposition für eine akute Koronar-Thrombose darstellen und die klinischen Syndrome eines akuten Herzinfarktes, einer instabilen Angina oder eines abrupten Verschlusses erzeugen.
Chimäre Anti-Blutplättchen-Antikörper in der elektiven PTCA
Der Versuch wurde in zwei Stadien durchgeführt. Das primäre Ziel des ersten Stadiums bestand darin, die Sicherheit und optimale Dosis einer Einfachdosis von chimärem 7E3 Fab in Patienten zu bestimmen, die einer elektiven perkutanen transluminalen Koronar-Angioplastie (PTCA) unterzogen wurden. Stadium II wurde durchgeführt, um die Sicherheit und präliminare Wirksamkeit von chimärem 7E3 (c7E3) zu evaluieren, wenn er durch Bolus-Infusion gefolgt von verschiedenen kontinuierlichen Infusions-Dauern verabreicht wurde. Die Stadium II Studie umfaßte elektive Koronar-Angioplastie-Patienten, die einem Risiko für ischämische Herz-Komplikationen unterlagen. Hochrisikopatienten schlossen solche mit einer instabilen Angina oder einer stabilen Koronar-Erkrankung mit Typ B- oder C-Läsions spezifischen Eigenschaften ein. Tabelle 3 listet die Definitionskriterien für Hochrisikopatienten auf und Tabelle 4 listet die angiographisch definierten Läsionsspezifischen Eigenschaften auf. Eine vorläufige Wirksamkeit wurde als die Hemmung der Blutplättchenfunktion und eine Vorbeugung thrombotischer Komplikationen gemessen. Männer zwischen 18 und 76 Jahren und Frauen ohne Schwangerschaftsmöglichkeit in einem Alter von 18 und 76 Jahren waren zur Einbeziehung in beiden Stadien des Versuches auswählbar.
Tabelle 3
Tabelle 4
Stadium I
Im Stadium I wurden die Patienten in Gruppen eingeteilt, die eine einzige intravenöse Bolus-Injektion von chimärem 7E3 (γ₁, κ) Fab-Fragment (hergestellt und formuliert wie in Beispiel 3 beschrieben) empfingen. Insgesamt 15 Patienten (3 Frauen und 12 Männer) wurden behandelt. Das mediane Alter der Patienten betrug 62 Jahre (im Bereich von 46 Jahren bis 76 Jahren). Ein demographisches Profil ist in den Tabellen 5A und 5B für alle Ein-Dosis-Patienten und für Patienten innerhalb der einzelnen Dosis-Gruppen aufgelistet.
Fünf Patienten (n = 5) empfingen jeweils Einzeldosen von 0,15 mg/kg, 0,20 mg/kg oder 0,25 mg/kg c7E3 Fab innerhalb ungefähr 30 Minuten vor einer elektiven PTCA in einem Dosis-Eskalierungsprotokoll. Alle Patienten wurden mit Aspirin beziehungsweise Acetylsalicylsäure behandelt (Standarddosis) und vollständig mit Heparin (Standarddosis) zum Zeitpunkt des Verfahrens antikoaguliert.
Obwohl die PTCA-Verfahren für Stadium I-Patienten als elektiv klassifiziert wurden, wiesen sechs der 15 Patienten eine instabile Restangina auf. Die Koronar-Lokalisierung der Dilatationen ist in Tabelle 6 (unten) zusammengefaßt. Sieben der 15 Stadium I-Patienten nachten eine PTCA einer Läsion in einem einzigen Gefäß durch, sechs eine Multi-Läsions-PTCA in einem einzigen Gefäß und bei zwei Patienten wurde eine Multi-Gefäß-PTCA durchgeführt (Tabelle 6).
Die Leistungsfähigkeitskriterien zur Gewinnung einer optimalen Einzeldosis von c7E3 wurden prospektiv als die minimale Dosis definiert, die mediane Werte des nachfolgenden zum Zeitpunkt 2 Stunden nach der Infusion erreichten: (1) Verlängerung der Blutungszeit TEXT FEHLTumindest 20 Minuten; (2) Blockade von GPIIb/IIIa-Rezeptoren, die größer als 80% TEXT FEHLT blockierten Basislinienrezeptorstellen waren; und (3) eine Hemmung der Blutplättchenaggregation in Reaktion auf 20 μM ADP zu ≤20% der Basislinie. Tabelle 5A Chimärer 7E3 Anti-Blutalättchenantiköraer Patientenklassifikation nach Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht und Rasse
Chimärer 7E3 Anti-Blutulättchenantikörner Patientenklassifikation nach Alter, Gewicht, Größe, Geschlecht und Rasse

Tabelle 6 Angiographische Eigenschaften

RCA: Rechte Koronar-Arterie
LCX: Linke Herzkranzarterie
LAD: Linke vordere absteigende Koronar-Arterie

Stadium II
Im Stadium II wurden Patienten mit einer 0,25 mg/kg Bolus-Dosis gefolgt von einer kontinuierlichen Fusion von 10 μg/min c7E3Fab für 6, 12 oder 24 Stunden behandelt. Insgesamt 32 Patienten (8 Frauen und 24 Männer) wurden in die Behandlungsgruppe von Stadium II der Studie mit eingeschlossen. Das mediane Alter der c7E3 Fab-behandelten Patienten war 57 Jahre (im Bereich 38–76). Neun Kontrollpatienten (1 Frau, 8 Männer) wurden mit eingeschlossen. Das mediane Alter der Kontrollpatienten war 56 Jahre (Bereich 37–74). Die Kontrollpatienten waren Hochrisikopatienten wie oben definiert, die jedoch kein c7E3 empfingen, jedoch überwacht und in derselben Weise wie die behandelten Patienten verfolgt wurden. Ein demographisches Profil für alle Stadium II-Patienten und für die Patienten innerhalb der individuellen Dosis-Gruppen ist in den Tabellen 5A und 5B aufgelistet.
Eine Behandlung mit c7E3 Fab wurde 30 Minuten vor Ausblasen eines Ballons für die PTCA begonnen. Acetylsalicylsäure und Heparin wurden wie klinisch indiziert gegeben, mit der Empfehlung, dass im Anschluß an die Angioplastie Heparin in einer Geschwindigkeit von 800 Einheiten pro Stunde gegeben wurde. Elf Patienten wurden jeweils in die 6- und 12-Stunden-Gruppen eingeschlossen und 10 Patienten wurden in die 24-Stunden-Gruppen eingeschlossen.
Von den 32 c7E3 Fab-behandelten Patienten machten 21 Patienten eine PTCA einer Läsion in einem einzigen Gefäß durch, 7 Patienten einer Multi-Läsions-PTCA in einem einzigen Gefäß und 3 Patienten wiesen eine Multi-Gefäß-PTCA auf (Tabelle 6). Der PTCA-Typ war bei einem Patienten nicht spezifiziert. Die koronare Anordnung der Dilatationen der Stadium II-Patienten ist in Tabelle 6 von 9 Kontrollpatienten zusammengefaßt, von denen 8 einer PTCA einer Läsion in einem einzigen Gefäß unterzogen wurden und ein Patient eine Multi-Gefäß-PTCA aufwies. Die 32 c7E3 Fab behandelten Patienten und die 9 Kontrollpatienten wiesen klinische oder angiographische Charakteristika auf, die diese als Hochrisiko für eine ischämische Herzkomplikation der PTCA klassifizieren würden. Zwei c7E3 Fab-behandelte Patienten und ein Kontrollpatient wiesen unspezifizierte Risikofaktoren auf. Die verbleibenden 30 c7E3 Fab-behandelten Patienten und 8 Kontrollpatienten wiesen zumindest ein identifizierbares klinisches Merkmal oder angiographische Eigenschaft auf, die diese einem erhöhten Risiko einer ischämischen Komplikation zuordnete und die meisten wiesen mehr als einen Risikofaktor auf. Tabelle 7 faßt diese Risikofaktoren für die Kontrolle und die c7E3-Behandlungsgruppen zusammen und individuelle Auflistungen von Risikofaktoren pro Patient innerhalb jeder Dosis-Gruppe sind in den Tabellen 8A bis 8D dargestellt. Tabelle 7
Tabelle 8A

LCX: linke Herzkranzarterie
LAD: linke vordere absteigende Koronar-Arerie
OM: stumpfe Randverzweigungen von LCX

LCX: linke Herzkranzarterie
LAD: linke vordere absteigende Koronar-Arterie
LADD: diagonale Verzweigung von LAD
OM_n: stumpfe Randverzweigungen von LCX

LCX: linke Herzkranzarterie
LAD: linke vordere absteigende Koronar-Arterie
DB: =
OM_n: stumpfe Randverzweigungen von LCX

Inhibierung der Blutplättchenfunktion (Ergebnisse des Stadiums I)
Um die Wirksamkeit des chimären c7E3 Fab bei der Hemmung der Blutplättchenfunktion zu bestimmen, wurden die GPIIb/IIIa-Rezeptorbindungsort-Verfügbarkeit (aufgezeichnet als medianer Prozentsatz von GPIIb/IIIa, der blockiert wurden), die mediane Hemmung und die Agonisten-induzierte Blutplättchenaggregation in Reaktion auf 20 μM ADP und die medianen Blutungszeiten seriell gemessen. Eine Rezeptorblockade und Blutplättchenaggregation in Reaktion auf Agonisten wurde im wesentlichen wie beschrieben bestimmt (Gold, H. K. et al., J. Clin. Invest., 86: 651–659 (1990)). Für Rezeptorblockaden-Messungen wurde die Rezeptorverfügbarkeit zum Zeitpunkt 0 gemessen und die Anzahl an Rezeptoren, die verfügbar war, wur de als 0% Rezeptoren, die blockiert waren, angenommen (Basislinie). Andere Zeitpunkte sind zur Anzahl von Rezeptoren relativ, die an der Basislinie oder der Prä-Dosis-Messung verfügbar sind. Die Blutungszeit wurde durch das Simplate-Verfahren bestimmt.
6 faßt die Dosis-Wirkung 2 Stunden nach einer einzigen Bolus-Dosis eines chimären 7E3 Fab bezüglich der Rezeptorblockade (6A), der Blutplättchenaggregation (6B) und der Blutungszeit (6C) zusammen. Die durchgezogenen Linien in 6 zeigen die medianen Werte der 5 untersuchten Patienten bei jeder Dosis-Gruppe an. Mit zunehmenden Dosen an c7E3 Fab bestand eine progressive Zunahme der Rezeptorblockade, wie es in Prozent an Rezeptoren dargestellt ist, die blockiert sind (6A). Die mediane Anzahl an Rezeptoren, die zum Zeitpunkt 2 Stunden blockiert war, betrug 53,8% für die 0,15 mg/kg, 80,2% für die 0,20 mg/kg und 86,6% für die 0,25 mg/kg Dosis-Gruppen. Der Zunahme der Rezeptorblockade folgte parallel eine Hemmung der Blutplättchenaggregation, bezeichnet als Prozent des Vor-Dosis-Wertes (6B). Die mediane Blutplättchenaggregation zum Zeitpunkt 2 Stunden betrug 46,1%, 44,6% und 17,9% der Basislinie für die 0,15 mg/kg, 0,20 mg/kg und jeweils die 0,25 mg/kg Dosis-Gruppen. Desgleichen war eine Dosis-bezogene Verlängerung der Blutungszeit zum Zeitpunkt 2 Stunden nach der Infusion ersichtlich (Blutungszeitmessungen waren bei 30 Minuten trunkiert; 6C). Die medianen Blutungszeiten betrugen 26,0 Minuten, 27,5 Minuten und 30 Minuten für die 0,15 mg/kg, 0,20 mg/kg beziehungsweise 0,25 mg/kg Dosen. Unter den verwendeten Bedingungen und wie durch diese Assays gemessen wurde die optimale Dosis für eine Anti-Blutplättchen-Aktivität als 0,25 mg/kg bestimmt.
7 zeigt die Dauer der Wirkung im Anschluß an eine einzige Bolus-Dosis von 0,25 mg/kg, der Dosis, bei der maximale Blutplättchenwirkungen ersichtlich waren. Die Linien zeigen die medianen Werte vom Zeitpunkt null (Basislinie) bis 24 Stunden, wie auf der X-Achse dargestellt, bezüglich der Rezeptorblockade im oberen Feld (7A), der Blutplättchenaggregation im mittleren Feld (7B) und der Blutungszeit im unteren Feld ( 7C) an. Die Spitzeneffekte auf die Rezeptorblockade, Blutplättchenaggregation und Blutungszeit sind bei 2 Stunden ersichtlich, mit einer graduellen Erholung über die Zeit hinweg. Die Blutungszeiten kehrten bei 12 Stunden zu nahezu normalen Werten zurück. Keiner der Patienten erfuhr eine Thrombocytopenie.
Hemmung der Blutplättchenfunktion (Ergebnisse des Stadiums II)
In Stadium II wurden GPIIb/IIIa-Rezeptor- und Blutplättchenaggregationsdaten nicht bei allen Patienten gewonnen und nur bei zwei Patienten in der 24-stündigen Infusion wurden diese Studien durchgeführt. Deswegen sind nur die 6- und 12-Stunden-Daten zusammengefaßt. Sowohl in den 6- als auch 12-Stunden-Infusions-Gruppen wurde die mediane Rezeptorblockade zu mehr als 80% der Basislinie während der Dauer der Infusion aufrecht erhalten. Die mediane 20 μM ADP-induzierte Blutplättchenaggregation für die 6- und 12-Stunden Infusions-Gruppen betrug 13% und 15% der Basislinie jeweils bei 2 Stunden und blieben in der 12-Stunden-Gruppe für die Dauer der Infusion unter 25%. Die mediane 2-Stunden-Blutungszeit für alle drei Infusions-Dauern war größer als 30 Minuten. 8 zeigt die bei Patienten beobachteten Ergebnisse, die 10 μg/min einer kontinuierlichen Infusion von chimärem 7E3 Fab für 12 Stunden folgend der 0,25 mg/kg Beladungs-Dosis erhielten. Die 12-stündige Infusionszeitspanne ist in den leicht schattierten Flächen dargestellt und die Linien repräsentieren die medianen Werte. Das Ausmaß der Rezeptorblockade, die Hemmung der Blutplättchenaggregation und die Verlängerung der Blutungszeit werden für die Gesamtdauer der Infusion aufrecht erhalten unter einer Erholung, die begann, sobald die Infusion unterbrochen wurde.
Tabelle 9
Klinische Ergebnisse bei Patienten des Stadiums I und Stadiums II
Keiner der 47 c7E3 Fab-behandelten Patienten erfuhr ein thrombotisches Ereignis während oder nach einer PTCA. Alle bis auf zwei der 47 c7E3 behandelten Patienten wies eine erfolgreiche PTCA auf, wie es angiographisch durch eine Reduktion der Läsion(en) auf weniger als 50% Verengung des nominalen Durchmessers definiert war. Von den beiden nicht erfolgreichen Dilatationen wies der Patient 01–012 eine Reduktion einer 90% Verengung der linken vorderen absteigenden Koronar-Arterie auf 70% auf, jedoch war eine weitere Dilatation technisch nicht möglich. Der zweite Patient (Patient 01–019) unten dargestellt, wies eine anfänglich erfolgreiche Dilatation auf, benötigte jedoch ein intrakoronare Stent-Anordnung für eine Hauptdissektion in Längsrichtung (ohne evidenten Thrombus). Einer der Kontrollpatienten (01–022) erfuhr einen abrupten thrombotischen Verschluß 15 Minuten im Verfahren und benötigte eine Koronararterien-Bypass-Notoperation (Coronary Artery Bypass Surgery = CABG), von der er sich erholte. Die weiteren 8 Kontrollpatienten wiesen erfolgreiche Dilatationen auf 50% oder weniger Restverengung auf.
Patient 01–019 (12-Stunden-Infusions-Gruppe) wies eine Ballon-Dilatation einer 95% Läsion der linken Herzkranzarterie mit einer 50% Restverengung auf.
Nach dem Verfahren erfuhr der Patient eine ersichtliche vasovagale Episode, die zur Bradykardie, Hypotension und einer vorübergehenden Asystole führte. Er wurde in das Katheterisierungs-Labor zurückverbracht und erfuhr eine dringende interkoronare Stent-Anordnung über eine durchgehenden größeren Abschnitt in Längsrichtung. Der Stent wurde in der linken Hauptkoronararterie entfernt und der Patient wurde einer Koronararterien-Bypassnotoperation unterworfen. Gemäß des Forschers bestand kein Hinweis auf eine intrakoronare Thrombose, weder angiographisch noch intraoperativ. Dieser Patient erfuhr ebenfalls einen peri-operativen Herzinfarkt. Der Patient erholte sich und wurde 8 Tage nach dem chirurgischen Eingriff entlassen.
Es existierten 3 c7E3 Fab-behandelte Patienten, die jeweils eine isolierte Episode von Brustschmerzen nach PTCA mit unbestimmter Signifikanz erfuhren. Patient 01–009 (0,25 mg/kg Einzeldosisgruppe) erfuhr 9 Stunden nach c7E3 einen Brustschmerz, Patient 05–003 (12-Stunden-Infusionsgruppe) erfuhr eine Angina 21 Stunden nach c7E3 und Patient 06-003 (12-Stunden-Infusionsgruppe) erfuhr eine Angina 2 Stunden nach c7E3. Die Forscher berichteten, dass diese Episoden des Brustschmerzes mit den ischämischen Symptomen, die auf eine Reokklusion hindeuten, nicht in Beziehung standen.
Patient 02–004 (0,25 mg/kg Einzeldosis- bzw. Einfachdosisgruppe) erfuhr verlängerte Zeitspannen an Brusischmerz vor c7E3 Fab-Behandlung, die während des PTCA-Verfahrens fortwährten. Am nachfolgenden Tag verändert sich das EKG begleitet von erhöhten Herzenzymen (gewonnen am vorangegangenen Tag), was darauf hinweist, dass dieser Patient einen peri-prozessualen, Nicht-Q-Wellen-Herzinfarkt (Peak Kreatininkinase = 462, MB-Fraktion = 64) erfuhr.
Es gab einen Todesfall im Versuch, der 52 Tage nach c7E3 Fab-Verabreichung auftrat. Patient 06–002 (6-Stunden-Infusionsgruppe), der eine Krankheitsgeschichte einer interstitiellen Lungenkrankheit, dekompensierte Herzinsuffizienz und instabile Angina aufwies, wurde einer erfolgreichen PTCA der proximalen linken anterioren absteigenden Koronararterie unterzogen. Während des Verfahrens entwickelte der Patient ein anhaltendes Kammerflimmern, was eine zweimalige elektrische Defibrillation erforderlich machte, das Verfahren schritt jedoch danach ohne Ereignisse fort. Nach Verlassen des Katheterisierungs-Labors entwickelte der Patient eine Zyanose, die anfänglich auf Diuretika- und Sauerstoff-Therapie ansprach. Jedoch entwickelte dieser Patient nachfolgend eine progressive respiratorische Schwächung bzw. Schädigung und benötigte später eine Atemhilfe. Der nachfolgende Krankenhausaufenthalt des Patienten wurde durch eine Sepsis, durch adulte Schocklunge, Anämie (die vielfache Transfusion erforderlich machte) und kardiale Ischämie kompliziert. Dieser Patient starb 52 Tage nach c7E3 Fab aufgrund eines Multi-Systemversagens.
Sicherheit: Stadium-I- und Stadium-II-Beobachtungen
9 zeigt die absolute Veränderung des Hämatokrits von der Basislinie bis zu 24 Stunden folgend dem Ende der Infusion für alle Patienten pro Dosisgruppe. Als Referenz ist eine Linie dargestellt, die den Null-Veränderungspunkt anzeigt. Die Hämatokrit-Daten für einen Kontrollpatienten (01–022) und einen c7E3 Fab-behandelten Patienten (01–019) sind nicht geplottet, weil beide Patienten Bluttransfusionen benötigten, im Anschluss an eine dringende Koronarbypass-Operation in den ersten 24 Stunden (siehe unten). Eine zweite niedrigere Linie bei –12 zeigt die Veränderung des Hämatokrits an, die als geringere Blutung zu bezeichnen ist, unter Verwendung der Thrombolysis in Myocardial Infarction (TIMI) Kriterien (Rao et al., J. Am. Coll. Cardiol. 11: 1–11 (1988)). Die Veränderungen des Hämatokrits sind zwischen den Kontrollpatienten und allen c7E3 Fab-Dosis-Gruppen ähnlich. Tabelle 10 fasst die mediane Veränderung der Blutplättchen-Zählung bei 24 Stunden vor dem Ende der Infusion zusammen. Die Veränderung der Blutplättchen-Zählung in der unbehandelten Kontrolle und in c7E3 Fab-behandelten Gruppen wiesen ähnliche Verteilungen auf, ohne offensichtliche Dosis-bezogene Wirkung.
Tabelle 10
Diskussion der Ergebnisse von Stadium I und Stadium II
Stadium I dieser Studie etablierte, dass c7E3 die selbe Dosis-Wirkung zeigte, die in der PTCA-Population, behandelt mit Aspirin und Heparin, charakteristisch war, wie es bei stabilen Angina-Patienten in einem Dosiseskalations-Versuch ersichtlich war (Beispiel 3). Chimäres 7E3 erzeugt eine Dosis-abhängige Blockade von Blutplättchen GPIIb/IIIa-Rezeptoren und diese Rezeptorblockade korreliert mit der Hemmung der Blutplättchen-Funktion. Zusätzlich demonstrieren Stadium-II-Ergebnisse, dass eine verlängerte Hemmung der Blutplättchen Fab-Funktion bis zu 24 Stunden durch eine kontinuierliche Infusion erreicht werden kann. Bei allen Patienten beginnt die Wiederherstellung der Blutplättchen-Funktion bei 6–12 Stunden nach Beendigung der Infusion, unabhängig von der Zeitdauer der Infusion.
Das klinische Outcome der c7E3-behandelten Patienten unter Verwendung sowohl von angiographischen als auch klinischen Endpunkten war beträchtlich besser als aufgrund ihres Risikoprofils erwartet. Kein Patient in der c7E3-Behandlungsgruppe erfuhr während oder nach dem Verfahren ein thrombotisches Ereignis. Zusätzlich wiesen alle zwei Patienten angiographisch erfolgreiche Verfahren auf. Alle Patienten, die in Stadium II miteinbezogen waren und 6 der 15 Patienten, die Stadium I einbezogen waren, waren Hochrisiko-Patienten auf Basis der klinischen oder angiographischen Charakteristika. Ein individueller klinischer Faktor (wie beispielsweise instabile Angina, Diabetes, Frauen über 65) oder angiographische Läsions-spezifische Eigenschaften (wie beispielsweise Typ B oder Typ C) ordnet einen Patienten einem erhöhten Risiko von Komplikationen zu und die Auswirkungen vielfacher Faktoren sind kumulativ.
In Stadium II wiesen 17 behandelte Patienten eine instabile Angina mit oder ohne zusätzlichen klinischen oder angiographischen Läsions-spezifischen Risikofaktoren auf. Zusätzlich wurden sechs Patienten in Stadium I mit einer instabilen Angina identifiziert. Veröffentlichte Reihen haben festgestellt, dass instabile Angina-Patienten eine Hauptkomplikationsrate (Tod, Herzinfarkt, dringende Koronarbypass-Operation oder wiederholte PTCA) von 10–15% aufweisen (De Feyter, P. J.: Editorial. Am. Heart J. 118: 860–868 (1989) und Ruprecht, H. J. et al., Eur Heart J., 11: 964–973 (1990)). Angiographische Eigenschaften geben in ähnlicher Weise eine starke Vorhersage von PTCA-Komplikationen (Ellis, S. G., 1990, „Elective koronary angioplasty: technique and complications", In: Textbook of Conventional Cardiology, E. J. Topol, Hsg., (W. B. Saunders Co., Philadelphia); De Feyter, P. J. et al., Circulation 83: 927–936 (1991); Ellis, S. G. und Topol, E. J., Am. J. Cardiol. 66: 932–937 (1990); und ACC/AHA Task Force Report: Guidelines for percutaneous transluminal coronary angioplasty, J. Am. Coll. Cardiol., 12: 529–545 (1988)). 29 Stadium II c7E3-behandelte Patienten entsprachen den Teilnahmekriterien mittels Läsions-spezifischer Eigenschaften. Von diesen wiesen 12 Patienten eine Typ-B-Läsion auf, 14 wiesen zwei oder mehr Typ-B-Läsionen auf und drei wiesen Typ-C-Läsionen auf. Zusätzlich wiesen viele der Patienten im Versuch multiple Läsionen auf, die in einem einzigen oder mehr als einem Gefäß dilatiert waren, was potentiell das Risiko des Verfahrens erhöht (Samson, M. et al., Am. Heart J. 120: 1–12 (1990)). Auf Basis sowohl der Anzahl aus auch des Schweregrades eines Hochrisikos, das angiographisch Risikofaktoren in diesen Patienten definierte, würden ischämische Komplikationen in einem Bereich von 10–20% zu erwarten sein (Ellis, S. G.: Elective coronary angioplasty: technique and complications, In: Textbook of Interventional Cardiology, (Hsg. E. J. Topol), W. B. Saunders Co., Philadelphia (1990); De Feyter, P. J., Circulation 83: 927–936 (1991); Ellis, S. G. und Topol, E. J., Am. J. Cardiol. 66: 932–937 (1990)).
Die Kontrollgruppe enthielt ebenfalls Hochrisiko-Patienten. Im Allgemeinen jedoch war die Anzahl und der Schweregrad der Risikofaktoren bei den Kontrollpatienten niedriger. Fünf der neun Kontrollpatienten wiesen einen einzigen Risikofaktor entweder einer Typ-B-Läsion (vier Patienten) oder einer instabilen Angina (ein Patient) auf, wohingegen 26 von 32 Stadium-II-c7E3-behandelten Patienten entweder eine Typ-C-Läsion oder zwei oder mehr andere Hochrisiko-Eigenschaften aufwiesen. Dieser Unterschied im Risikostatus zwischen den beiden Gruppen ist signifikant unterschiedlich (Fisher's exact test p = 0,018). Interessanterweise war der Kontrollpatient mit dem abrupten Verschluss (Patient 01–022, instabile Angina mit zwei Typ-B-Charakteristika) einer von drei Patienten, die mit mehr als einem Risikofaktor identifiziert wurden (ein Kontrollpatient wies nicht-spezifizierte Risikoeigenschaften auf). Somit wies, während einer von drei Kontrollpatienten bei höchstem Risiko ein thrombotisches Ereignis aufwies, keiner der 26 c7E3 Fab-Patienten in dieser höchsten Risikokategorie ein thrombotisches Ereignis auf.
Diese Studie zeigt ebenfalls, dass die potenten Anti-Blutplättchen-Wirkungen von c7E3 sicher bei Patienten erreicht werden können, die bereits mit intervenösem Heparin und oralem Aspirin (ASS) behandelt wurden. Blutungsereignisse wurden in den Kontroll- und c7E3-behandelten Patienten ohne Unterschied der Hämatokrit-Veränderungen von der Basislinie zwischen den Dosierungsgruppen verglichen. Weitere abträgliche Ereignisse waren selten und wiesen typischerweise einen milden oder moderaten Schweregrad auf. Es gab nur einen Todesfall im Versuch und dieser trat ungefähr zwei Monate nach c7E3 Fab-Behandlung bei einem Patienten mit einer interstitiellen Lungenerkrankung und Herzfehler auf, der eine progressive akute respiratorische Insuffizienz im Anschluss an eine PTCA, kompliziert durch eine Sepsis, Schocklunge und letztendlich multiples Organversagen aufwies.
Zuletzt erfuhr keiner der 20 Patienten, für die Ergebnisse vorlagen, eine humane anti-chimäre Antikörperimmunreaktion.
Folglich hemmt der chimäre 7E3 Fab wirksam die Blutplättchen-Funktion sicher bei Patienten, die mit Acetylsalicylsäure und intervenösem Heparin behandelt wurden, die einer PTCA unterzogen wurden. Die Anti-Blutplättchen-Wirkung kann sogar 24 Stunden ohne signifikante Zunahme des Blutungsrisikos und ohne Immunsystem-Reaktivität aufrechterhalten werden. Unter den Patienten mit einem hohen Risiko einer thrombotischen Komplikation traten keine thrombotischen Ereignisse in der Gruppe auf, die mit c7E3 behandelt wurden, was nahelegt, dass c7E3 das Risiko von thrombotischen Komplikationen in dieser Patientenpopulation reduzieren kann.
Beispiel 5
Behandlung eines abrupten Verschlusses während einer Koronar-Angioplastie
Ein abrupter Koronararterien-Verschluss während einer Koronar-Angioplastie ist die Hauptdeterminante der Morbidität und Mortalität in diesem Verfahren. Sie tritt bei ungefähr 3–6% aller teilnehmenden Angioplastie-Fälle auf (Detre, K. M. et al., Cirulation 82: 739–750 (1991)), es wurde jedoch erwähnt, dass sie in bis zu 20–40% der Patienten auftritt, die bezüglich einer instabilen Angina pectoris oder nach einem akuten Herzinfarkt einer Angioplastie unterzogen wurden (Ellis, S. G. et al., Circulation 77: 372–379 (1988); De Feyter, P. J. et al., Circulation 83: 927–936 (1991)). Der Mechanismus des abrupten Verschlusses ist eine akute Thrombose an der arteriellen Stelle, an der eine Angioplastie eine Fläche einer Endothel-Verletzung erzeugte oder erweiterte. Es existieren üblicherweise gestörte Strömungsmuster, die auf eine veränderte Geometrie bzw. Abmessung des Gefäßes zurückzuführen sind, oftmals von einer Spaltung bzw. einem Riss des Plaque-Materials, und es existiert eine Exposition subendothelialer Elemente, die intimale und oftmals mediale Abschnitte mit einschließen. Weil der Beginn eines Thrombus eine Adhäsion und Aggregation von Blutplättchen erfordert, wurde das chimäre 7E3 Fab-Antikörperfragment zur Behandlung eines abrupten Koronararterienverschlusses verwendet, der eine Koronar-Angioplastie-Prozedur kompliziert.
Fallbericht
Der Patient ist ein 45 Jahre alter männlicher Arzt, der bis jetzt eine ausgezeichnete Gesundheit aufwies. Beginnend eine Woche vor diesem Angioplastie-Verfahren begann er ein Brust- und Nacken-Unbehagen zu empfinden. Als diese Symptome fortdauerten und sich über mehrere Tage hinweg verschlechterten, suchte er den Rat eines Kollegen. Ein Elektrokardiogramm (EKG) zeigte anteriore präkordiale T-Welleninversionen. Der Patient wurde stationär in der Herzsektion eines örtlichen Krankenhauses aufgenommen und es wurde ihm intravenös Nitroglycerin und Heparin und oral Acetylsalicysäure (ASS) verabreicht. Serielle Herzisoenzym-Bestimmungen über die nächsten 24 Stunden zeigten keine Erhöhung über den normalen Bereich. Serielle EKG-Aufzeichnungen über die nächsten beiden Tage zeigten eine persistente Abflachung der vorderen präkordialen T-Wellen, jedoch keine entwicklungsbedingten Veränderungen eines Herzinfarktes. Am zweiten Tag nach der Hospitalisierung wurde der Patient zum Herzkatheterisierungs-Labor gebracht, wo eine linke Ventrikulographie eine insgesamt normale linke Ventrikelfunktion zeigte, mit einer sehr kleinen hypokinetischen Gegend in der anterolateralen linken Ventrikelwand und eine weitere hypokinetische Gegend in der Inferoposterobasiliarzone. Die linke Ventrikelauswurffraktion war 72%. Eine Koronararteriographie zeigte ein links-dominantes Koronarsystem mit einer kleinen oder vollständig verschlossenen rechten Koronararterie. Es existierte eine signifikante Stenose im Mittelteil der linken anterioren absteigenden (LAD) Koronararterie. Eine kleine und unklar erkrankte diagonale Verzweigung entsprang gerade distal der Mittel-LAD-Stenose.
Der Patient wurde zur Herzsektion zurückgebracht und blieb für weitere 48 Stunden intravenös Nitroglycerin und Heparin ausgesetzt. Er war während dieser Zeit schmerzfrei, die Herzenzyme waren nicht erhöht und tägliche EKGs zeigten nur die persistente Abflachung der anterioren präkordialen T-Wellen. Er wurde an das Hermann Hospital (Houston, TX) für eine Angioplastie überwiesen.
Vor dem Angioplastie-Verfahren empfing der Patient fortgesetzt intravenöses Nitrogylcerin und Heparin, oral Aspirin und ihm wurde ein orales Kalziumkanalblockierendes Mittel verabreicht. Die partielle Thromboplastin-Zeit (PTT) verblieb für mehrere Tage im 70–90 Sekundenbereich. Zu Beginn des Angioplastie-Verfahrens betrug die aktivierte Verklumpungszeit (Activated Clotting Time = ACT) 173 Sekunden. Der Patient empfing 5000 Heparin-Einheiten intravenös. Das linke Koronarostium wurde mit einem Nr.-8-French-JL-3,5-Führungskatheter versehen. Die LAD-Koronararterie wurde in der kaudalen rechten vorderen schrägen und in der kranialen linken vorderen schrägen Projektion dargestellt. Die LAD wurde zunächst mit einem 0,018 Zoll Dopplerführungsdraht (Cardiometrics, Inc., Mountain View, CA) instrumentiert. Dieser Führungsdraht wird von uns routinemäßig zur Strömungs- bzw. Durchflussüberwachung bei Patienten mit einem höheren Risiko für einen abrupten Verschluss verwendet. Strömungsgeschwindigkeitssignale aus dem LAD, proximal und distal zur Läsion, wurden aufgezeichnet. Ein 2,5 mm Koronarballon-Katheter (Intrepid, Baxter, Inc., Irvine, CA) wurde über den Dopplerführungsdraht vorwärts gebracht, während der Draht in der Koronararterie stationär gehalten wurde. Der Ballon wurde so angeordnet, dass er die LAD-Läsion spreizte. Sequentielle kurze Ballon-Inflationen wurden bei 6 Atmosphären Druck vorgenommen. Der Schweregrad der Stenose wurde reduziert, wie es durch die Angiographie ebenso wie durch die Zunahme des Durchflussgeschwindigkeitssignals aus einer Peak-Durchströmungsgeschwindigkeit (APV) von 12 cm/sek auf 33 cm/sek visualisiert wurde.
Während mehrerer Minuten der Beobachtung im Anschluss an diese Dilatationen wurde bemerkt, dass das Durchströmungssignal sich zu vermindern begann. Eine Kontrastinjektion zeigte einer erneute Verengung der Angioplastie-Stelle durch elastischen Rückprall, Plaque-Riss und Thrombus-Bildung. Der Ballon wurde erneut an die Stelle der Läsion eingebracht und ein weiteres Ausblasen des Ballons wurde durchgeführt. Die Arterie wurde erneut expandiert und das Strömungssignal kehrte erneut auf ein APV von 34 cm/sek zurück.
Während mehrerer zusätzlicher Minuten der Überwachung nahm das Signal erneut ab. Innerhalb von 5 Minuten war das Signal ziemlich gering bei einer durchschnittlichen Spitzen-Geschwindigkeit von 3 cm/sek. Der Patient begann einen Brustschmerz zu empfinden. Die EKG-Überwachung einer anterioren Brustwand-Ableitung zeigte eine Erhöhung des ST-Segments. Eine Angiographie zeigte, dass die Arterie vollkommen verschlossen war. Die aktivierte Gerinnungszeit, die gerade ein paar Minuten vorher erzielt wurde, betrug 344 Sekunden.
Das chimäre 7E3 monoklonale Antikörper-Fab-Fragment, das für den Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Rezeptor (c7E3 Fab, γ₁, κ) spezifisch ist, wurde verabreicht. Die Dosis betrug 0,25 mg pro kg, die über eine Stunde intravenös verabreicht wurde. Innerhalb der nächsten 1–2 Minuten nach Verabreichung von c7E3 Fab begann die Geschwindigkeit der Koronarströmung zuzunehmen. Eine Injektion von Kontrastmittel zeigte eine Wiedererholung der Koronardurchgängigkeit mit einer Thrombolysis In Myocardial Infarction Trial Grade-I (TIMI 1) Strömung. Über die anschließenden 15 Minuten hinweg fuhr die Koronarströmung fort zuzunehmen und stabilisierte sich bei einer APV von 23 cm/sek. Mehrere weitere Injektionen von Kontrastmittel zeigten eine verbesserte Koronarströmung. Der Brustschmerz des Patienten nahm ab und das in der Monitor-Ableitung beobachtete ST-Segment kehrte zur Basislinie zurück.
15 Minuten nach der Verabreichung von c7E3 Fab wurde ein Angiogramm gemäß Vorschrift durchgeführt. Dieses Angiogramm zeigte eine koronare TIMI3-Strömung. Dieses Strömungsgeschwindigkeitssignal zu diesem Zeitpunkt betrug 20 cm/sek. Eine kontinuierliche Überwachung während der folgenden 5 Minuten zeigte keine Verbesserung der Koronarströmung. Während dieses Zeitpunkts bestätigte die Videowiederholung des Angiogramms, dass eine kleine Menge an Thrombus noch an der Angioplastie-Stelle sichtbar war. Aus diesem Grunde wurde entschieden, intrakoronar 250.000 Urokinase-Einheiten zu verabreichen. Dieses thrombolytische Mittel wurde über ungefähr die nächsten 10 Minuten infundiert. Zu diesem Zeitpunkt trat keine weitere Verbesserung der Strömung ein, wie es durch den Doppler-Führungsdraht gemessen wurde. Nach Abschluss der intrakoronaren Urokinase-Infusion, bei der 33. Minute nach Verabreichung von c7E3 Fab, wurde ein weiteres Koronarangiogramm durchgeführt. Die Arterie war mit einer TIMI3-Strömung durchgängig. Eine moderate, jedoch begrenzte Restenose persistierte an der Läsionsstelle. Es wurde zusätzlich beobachtet, dass der Thrombus weiter eine verkleinerte Größe aufwies, sich jedoch nicht vollständig aufgelöst hatte. Es wurde die Entscheidung vorgenommen, eine weitere Ballon-Inflation durchzuführen, um zu versuchen, die Restenose zu reduzieren.
Der Ballonkatheter wurde erneut über den Führungsdraht an den Ort der Läsion vorangeschoben. Eine endgültige Ballon-Inflation auf 6 Atmosphären für 2 Minuten wurde darauf durchgeführt. Darauf wurde der Ballonkatheter entfernt, während der Draht an der Stelle verblieb. Das Strömungssignal nahm bis zu einer APV von 29 cm/sek zu und blieb über mehrere Minuten hinweg stabil. Ein Angiogramm zeigte eine adäquate Reduktion der Restenose, die vorgelegen hatte. Der Führungsdraht wurde darauf proximal zur Stenose zurückgezogen und eine weitere Aufzeichnung der Strömungsgeschwindigkeit wurde vorgenommen. Der Führungsdraht, Ballonkatheter und Führungskatheter wurde entfernt. Dies vervollständigte das Verfahren.
Dieser Patient wurde darauf zur Herzsektion zurückgebracht. Er blieb bei oral ASS, Nitraten, einem Kalziumkanal-Blocker und intravenösem Heparin für mehrere Tage, um den PTT im 70–90 Sekundenbereich zu halten. Reihen-EKGs zeigten die Auflösung der anterioren präkordialen T-Welleninversionen und alle nachfolgenden EKGs waren normal. Die seriellen Kreatinkinase (CK) Isoenzymwerte waren konsistent <100 U/L. Die Blutplättchenzählung vor dem PTCA-Verfahren betrug 248.000 und anschließende Blutplättchenzählungen bei 2 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden nach c7E3 Fab-Verabreichung waren 304.000, 279.000, 246.000, 185.000 bzw. 220.000. Die Blutplättchenaggregation, die durch 10 μM ADP induziert war, betrug 73% durch optische Densitometrie vor dem Verfahren und anschließende Werte bei 2 Stunden, 6 Stunden, 12 Stunden, 24 Stunden und 48 Stunden waren 0%, 13%, 26%, 45% bzw. 51 %. Eine Woche nach dem Angioplastieverfahren wies der Patient eine Follow-up-Katheterisierung auf. Die LAD-Koronararterie erwies sich mit einer TIMI3-Strömung als weit durchlässig. Er wurde später am selben Tag nach Hause entlassen.
Diskussion des Fallberichtes
Bei diesem Patient behandelte eine Kombination aus 0,25 mg/kg c7E3 Fab intravenös, 250.000 U Urokinase intrakoronar und wiederholte Dilatation das akute ischämische Koronarsyndrom eines abrupten Verschlusses während der Koronar-Angioplastie erfolgreich. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Antiblutplättchen-Therapie, die die Blutplättchen-Glycoprotein-IIb/IIIa-Rezeptorbindung und eine Blutplättchenkreuz-Bindung hemmt, bei der Unterstützung wirksam sein könnten, um eine stabile Re-Perfusion akut verschlossener Koronararterien in ähnlichen klinischen Situationen zu erreichen.
Beispiel 6
Randomisierte, doppel-verblindete Evaluation des Anti-GPIIb/IIIa chimären Antikörperfragmentes zur Vorbeugung ischämischer Komplikationen bei einer Hochrisiko-Angioplastie
Überblick
Die perkutane myocardiale Revaskularisierung hat seit dem Auftreten der Koronar-Angioplastie im Jahr 1977 in einer dramatischen Geschwindigkeit zugenommen (Gruentzig, A. R. et al., N. Engl. J. Med., 316: 1127–1132 (1987)). Obwohl das Verfahren mit einer Verbesserung der Symptome der Ischämie und der Lebensqualität verbunden ist (Parisi, A. F. et al., N. Engl. J. Med., 326: 10–16 (1992)), bleiben akute Komplikationen ein Hauptnachteil. Das behandelte Gefäß verschließt sich abrupt während oder nach dem Verfahren im Krankenhaus bei 4–9% der Fälle und ein erneuter Verschluss oder ein abrupter Verschluss ist mit einer beträchtlichen Morbidität und einer ungefähr 10-fachen Zunahme der Mortalität verbunden (Lincoff A. M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 19: 926–938 (1992); Tenaglia, A. N. et al., Am J. Cardiol. in press (1993); Detre, K. M. et al., Circulation, 82: 739–750 (1990); Ellis, S. G. et al., Circulation, 77: 372–379 (1988)). Obwohl der Mechanismus des abrupten Gefäßverschlusses oftmals unbestimmt ist, sind die Thrombusbildung und die Gefäßdissektion beitragende Faktoren. Charakteristika, die Patienten mit einem hohen Risiko akuter Komplikationen identifizieren, sind das Vorhandensein eines klinischen Syndroms, das mit einem Koronarthrombus verbunden ist (instabile Angina, akuter oder kürzlicher Herzinfarkt), Diabetes, weibliches Geschlecht und koronare morphologische Eigenschaften (Krümmungspunkte, Thrombus, Vergabelung), die auf eine erhöhte Komplexizität der individuellen Läsion hinweisen (Lincoff A. M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 19: 926–938 (1992); Ellis, S. G. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 17: (Suppl)B): 89B–95B (1991); Moushmoush, B. et al., Cath. Cardiovasc. Diagn., 27: 97–103 (1992); und Myler, R. K. et al., Circulation, 82 (Suppl II): II-88-II-95 (1990)).
Obwohl gezeigt wurde, dass ASS das Risiko eines abrupten Gefäßverschlusses und eines akuten Herzinfarkts bei Patienten, die eine Angioplastie durchmachen, reduziert (Schwartz, L. et al., N. Engl. J. Med., 318: 1714–1719 (1988); Barnathon, E. S. et al., Circulation, 76: 125–134 (1987)), sind seine Wirkungen auf die Blutplättchenfunktion relativ schwach und ischämische Ereignisse treten nach wie vor in einer Rate von 10–20% bei Hochrisiko-Patienten auf, die mit ASS vorbehandelt wurden (Tenaglia, A. M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., (1993, in Druck)). Im Gegensatz hierzu erreicht die Verabreichung des Fab-Fragmentes des chimären 7E3-Antikörpers an Menschen eine beträchtliche Blockade der GPIIb/IIIa-Rezeptoren und eine Hemmung der Blutplättchenaggregation (siehe Beispiel 4, Hemmung der Blutplättchenfunktion).
In einer initialen Studie von Patienten, die eine Angioplastie durchmachten, reduzierte c7E3 Fab das Risiko eines abrupten Gefäßverschlusses während und nach einer perkutanen Intervention (siehe Beispiel 4 und Ellis, S. F. et al., Cor. Art. Dis., 4: 167–75 (1993)). Die gegenwärtige randomisierte Studie wurde entwickelt, um die Leistungsfähigkeit chimärer Antikörperfragmente, die selektiv an den Glycoprotein-IIb/IIIa-Rezeptor binden, bei der Vorbeugung ischämischer Komplikationen (EPIC-Versuch, Evaluation von c7E3 Fab zur Vorbeugung ischämischer Komplikationen) weiter zu evaluieren. Insbesondere wurde die klinische Leistungsfähigkeit eines chimären 7E3 Fab-Fragmentes (c7E3 Fab) bei Patienten, die eine Angioplastie durchmachten, die einem hohen Risiko von prozessualen Komplikationen unterlagen, in einer prospektiven, doppelblinden, Placebo-kontrollierten, randomisierten klinischen Studie evaluiert. Die Studie bzw. der Versuch schlossen 2.099 Patienten an 56 Orten ein, von denen festgelegt wurde, dass sie eine Koronar-Angioplastie oder eine direktionale Koronaratherektomie in klinischen Hochrisiko-Situationen durchmachen sollten: Schwerwiegende instabile Angina mit Ruheschmerz und dokumentierten elektrokardiographischen Veränderungen, sich entwickelnder akuter Herzinfarkt oder klinische und Koronarläsions-morphologische Eigenschaften, die mit einem hohen Risiko von peri-prozessualen Komplikationen verbunden waren. Patienten empfingen entweder (a) einen Placebo-Bolus und eine Infusion, (b) einen Bolus von c7E3 Fab und eine Placebo-Infusion oder (c) einen Bolus und eine Infusion von c7E3 Fab. Der primäre Endpunkt war zusammengesetzt und schloss das Auftreten irgendeiner der nachfolgenden Komponenten ein: Tod, nicht-fataler bzw. -tödlicher Herzinfarkt, nicht-geplante chirurgische Revaskularisierung oder wiederholtes perkutanes Verfahren, nicht-geplante koronare Stent-Implantation oder intraaortale Ballonpumpeninsertion einer refraktären Ischämie.
Der Bolus und die Infusion hatten eine 35%ige Reduktion des primären Endpunktes zur Folge (12,8 gegen 8,3%, P = 0,008), wohingegen eine 11%ige Reduktion bei dem Bolus alleine zu beobachten war (12,8 gegen 11,4%, P = 0,43). Die Reduktion der Ereignisse, die durch eine Verabreichung von Bolus plus Infusion erreicht wurde, stimmte mit jeder der Endpunkt-Komponenten überein und zusätzlich in den Hauptpatientenuntergruppen, einschließlich Alter, Geschlecht, Vorexistenz eines Interkoronar-Thrombus und akuter Koronarsyndrome (Herzinfarkt, instabile Angina). Blutungsepisoden und Transfusionen waren in der Bolus- und Infusionsgruppe erhöht, und Mittel für die Bolus-Alleine-Vorschrift. Dieser kontrollierte Versuch von Hochrisiko-Patienten, die einem Koronar-Eingriff unterzogen wurden; zeigte, dass die Verabreichung eines Antikörperfragmentes, das gegen den Blutplättchen-IIb/IIIa-Rezeptor gerichtet war, zu einem anhaltenden klinischen Vorteil durch signifikante Reduktion ischämischer Komplikationen führte.
Verfahren
Auf Grundlage kürzlicher Studien, die das Risiko bei einem herkömmlichen perkutanen Eingriff quantifizieren, waren Patienten dann auswählbar, wenn sie einem hohen Risiko für einen abrupten Gefäßverschluss unterlagen und keine bedeutendere Kontraindikation aufgrund eines Blutungsrisikos aufwiesen. Patienten wurden einem Hochrisiko unterliegend angesehen, wenn sie eine der drei klinischen Gruppen waren: (1) akut sich entwickelnder Herzinfarkt innerhalb von 12 Stunden nach Beginn von Symptomen und die entweder einem direkten oder perkutanen „Rettungs" Eingriff unterzogen wurden; (2) frühe Postinfarkt-Angina oder instabile Angina mit zumindest zwei Episoden einer Ruheangina, verbunden mit zurückbleibenden elektrokardiographischen Veränderungen in den vorherigen 24 Stunden trotz medizinischer Therapie; oder (3) klinische und/oder angiographische Hochrisiko-Kriterien unter Verwendung der Kriterien des American Heart Association/American College of Cardiology (Ryan, T. J. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 12: 529–45 (1988)) wie modifiziert von (Ellis, S. G. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17 (Erg. B): 89B–95B (1991)). Diese klinischen und angiographischen Hochrisiko-Kriterien schlossen entweder zwei Typ-B-Eigenschaften oder eine Typ-C-Eigenschaft in der Zielläsion oder eine Typ-B-Eigenschaft bei einer Frau über 65 Jahren oder bei einem Patienten mit Diabetes, ein.
Die speziellen Einschlusskriterien sind ausführlich unten dargestellt:
(I) Bezogen auf eine elektive oder dringende Koronarballon-Angioplastie oder Atherektomie mit einer von der FDA zugelassenen Vorrichtung in einer der nachfolgenden Situationen:
(A) Instabile Angina und/oder Nicht-Q-Wellen-Herzinfarkt, definiert als:

1) Angina im Ruhezustand: zwei oder mehr Episoden einer Angina im Ruhezustand mit einem ischämischen ST-Segment oder T-Wellenabnormalitäten; oder
2) Wiederauftretende Angina: wiederauftretende Angina mit einem ischämischen ST-Segment oder T-Wellenabnormalitäten während der Aufnahme im Krankenhaus, die auf eine pharmakologische Standardintervention nicht ansprechen; oder
3) Frühe Post-Infarktangina: Angina innerhalb von 7 Tagen eines dokumentierten Herzinfarktes bei einer Angina im Ruhezustand, begleitet von einem ischämischen ST-Segment oder T-Wellenveränderungen; oder einer Angina, die durch durch minimale Belastung hervorgerufen wurde (2 Treffer), wobei ein vorübergehendes ischämisches ST-Segment oder T-Wellenabnormalitäten wie folgt definiert war:

a) ≥1 mm ST-Segmentdepression (80 msek nach dem J-Punkt) oder Erhöhung (20 msek nach dem J-Punkt) und/oder
b) T-Wellenveränderungen (üblicherweise Inversion) und wobei die Kreatinkinase (CK) für alle Patienten zum Zeitpunkt der Einbeziehung weniger als zweimal normal gewesen sein musste.

(B) Akuter Q-Wellen-Herzinfarkt

1) Direkter Eingriff während des Herzinfarktes ohne vorhergehenden thrombolytische Therapie, oder
2) Not-Angioplastie für eine fehlgeschlagene thrombolytische Therapie während des Herzinfarktes, wobei ein miteinbezogener Herzinfarkt als das Vorliegen von zumindest zwei der nachfolgenden drei Kriterien definiert ist:

(1) Verlängerte Angina (mehr als 30 Minuten);
(2) Gesamtkreatininkinase-Erhöhung auf mehr als zweimal die Obergrenze des Normalen (bestätigt durch CK-MB-Isoenzym-Anhebung)
(3) EKG-Beweis eines Infarktes, der wie folgt definiert ist:
a) ST-Segment-Erhöhung von zumindest 0,1 mV (gemessen 0,2 Sekunden nach dem J-Punkt) bei zumindest einer der drei Stellen:
i) zumindest 2 von 3 unteren Ableitungen (II, III, aVF); oder
ii) zumindest 2 von 6 Brustwand-Ableitungen (V₁–V₆); oder
iii) Ableitungen I und aVL; oder
iv) ST-Segment-Unterdrückung der Brustwand-Ableitungen (V₁–V₄), die mit dem nachfolgenden Verlauf der Verletzung konsistent waren (Spiegelregel); oder
v) in Gegenwart eines Linksschenkelblockes primäre ST-Veränderungen in den unteren oder vorderen Ableitungen;
b) neue signifikante Q-Wellen von ≥0,04 Sekunden Dauer oder mit einer Tiefe ≥ ein Viertel der entsprechenden R-Wellenamplitude, oder beides.

(C) Klinische/morphologische Hochrisiko-Eigenschaften

1) Stenose mit zwei oder mehr Typ-B-Läsions-spezifischen Eigenschaften in der zu dilatierenden Arterie. Läsions-spezifische Eigenschaften waren auf ACC/AHA-Kriterien basiert;
2) Stenose mit einer oder mehreren Typ-C-Eigenschaften in der zu dilatierenden Arterie;
3) Alter ≥65 Jahre, kombiniert mit weiblichem Geschlecht und Stenose mit zumindest einer Typ-B-Eigenschaft;
4) Diabetes mellitus und Stenose mit zumindest einer Typ-B-Charakteristik in der zu dilatierenden Arterie; oder
5) Angioplastie einer Infarkt-bezogenen Läsion innerhalb von 7 Tagen nach Herzinfarkt, der durch eine charakteristische CK-MB-Isoenzym-Erhöhung dokumentiert wurde.

II. Männer zwischen einem Alter von 18 und 80 und Frauen zwischen einem Alter von 18 und 80, die nicht mehr gebärfähig waren (d. h. chirurgisch sterilisiert oder post-Menopausal, die so definiert waren, dass sie seit zumindest einem Jahr keine Menstruationsperiode mehr hatten).
III. Schriftlich abgegebenes Einverständnis vor Beginn der Vorschrift-spezifischen Verfahren und Studienverwaltung.
Patienten, die sich in anderer Weise für die Studie qualifizierten, wurden von der Teilnahme aus einem der nachfolgenden Gründe ausgeschlossen:

(1) Krankheitsgeschichte einer hämorrhagischen Diathese;
(2) Schwerwiegender chirurgischer Eingriff innerhalb von 6 Wochen nach Einbeziehung in die Studie;
(3) Kürzliche (innerhalb 6 Wochen der Einbeziehung) gastrointestinale oder genitourinare Blutung von klinischer Bedeutung;
(4) Schlaganfall innerhalb von 2 Jahren vor Einbeziehung oder irgendein Schlaganfall mit einem signifikanten neurologischen Restdefizit;
(5) Mehr als 50% Okklusion der linken Hauptherzarterie;
(6) Vermeintliche oder dokumentierte Krankheitsgeschichte einer Vaskulitis;
(7) Teilnahme in anderen klinischen Forschungsstudien, die die Auswertung eines zu untersuchenden Arzneistoffs oder Vorrichtung innerhalb von 7 Tagen vor der Infusion des vorgeschlagenen Studien-Mittels einschloss;
(8) Verabreichung oraler Antikoagulatien innerhalb von 7 Tagen vor der Randomisierung gegenüber dem Studien-Mittel, es sei denn, dass die Vor-Randomisierungs-Prothrombinzeit ≤1,2 mal der Kontrolle beträgt;
(9) Verwendung von intravenösem Dextran vor oder geplant während der Angioplastie-Behandlung;
(10) Krankheitsgeschichte einer früheren Verabreichung muriner monoklonaler Antikörper oder bekannte Allergene gegenüber murinen Proteinen; oder
(11) Unvermögen, das Einverständnis zu erklären.

Die Zustimmung der institutionalisierten Aufsicht wurde in allen Institutionen gewonnen und die Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erreicht. Die Rekrutierung in dem Versuch trat zwischen Dezember 1991 und November 1992 ein; 2.099 Patienten wurden in 56 Institutionen in den Vereinigten Staaten miteinbezogen.
Studienvorschrift
Alle Patienten wurden mit ASS und Heparin behandelt. ASS wurde oral in einer Dosis von 325 mg zumindest 2 Stunden vor dem Verfahren verabreicht und wurde in einer Dosis von 325 mg einmal pro Tag danach aufrechterhalten. Heparin (Schwein) wurde als initialer Bolus von 10.000–12.000 Einheiten intravenös verabreicht, gefolgt von inkrementalen Bolus-Gaben von bis zu 3.000 Einheiten in 15-minütigen Intervallen, jedoch nicht überschreitend insgesamt 20.000 Einheiten; das Ziel bestand darin, die aktivierte Blutgerinnungszeit in einem „therapeutischen" Bereich zu halten, der im Allgemeinen als 300–350 Sekunden während des Verfahrens erachtet wurde (Dougherty, K. G. et al., Abstracts of the 63^rd Scientific Sessions, III-189 (1991); Rath, B. et al., Br. Heart. J., 63: 18–21 (1990); Ogilby J. D. et al., Cath. Cardiovasc. Diag., 18: 206–9 (1989)). Heparin wurde in konstanter Infusion in einer Geschwindigkeit von 1.000 Einheiten pro Stunde für zumindest 12 Stunden weiterhin verabreicht. Intravenöse und intrakoronare Nitrate konnten wie klinisch indiziert verwendet werden. Chimärer 7E3 Fab (γ₁, κ) wurde als sterile, nicht-pyrogene Lösung verabreicht, die 2 mg monoklonalen Fab pro ml 0,15 M Natriumchlorid, 0,01 M Natriumphosphat und 0,001% Polysorbat 80, pH 7,2, enthielt. Die einzige Medikation, die bei Entlassung erforderlich war, war ASS in einer Dosis von 325 mg pro Tag.
Die Patienten wurden gleichermaßen in einem, von drei Behandlungsarmen mit einem doppelblinden Studiendesign randomisiert aufgeteilt. Eine Gruppe von Patienten empfing einen Bolus von c7E3 Fab in einer Dosis von 0,25 mg/kg, gefolgt von einer 12-stündigen kontinuierlichen Infusion von c7E3 Fab in einer Dosis von 10 μg/min. Eine zweite Gruppe empfing eine Bolus-Dosis von 0,25 mg/kg c7E3 Fab und eine 12-stündige kontinuierliche Infusion einer Placebo-Lösung. Eine dritte Gruppe empfing einen Placebo-Bolus und eine 12-stündige kontinuierliche Infusion einer Placebo-Lösung. Der Bolus wurde zumindest 10 Minuten vor dem Verfahren begonnen und über 5 Minuten verabreicht und die Infusion wurde für 12 Stunden fortgesetzt, es sei denn, dass sich eine klinische Kontraindikation entwickelte.
Blutproben für Blutplättchenzählungen wurden bei 30 Minuten, 2, 12 und 24 Stunden im Anschluss an den Beginn der Arzneistoffgabe und dann täglich bis zur Entlassung aus dem Krankenhaus entnommen, um die Evidenz einer Thrombozytopenie sorgfältig zu überprüfen. Ein vorher entwickelter Algorithmus wurde dazu verwendet, eine lebensbedrohende Blutung und Thrombozytopenie zu evaluieren und zu behandeln (Sane, D. C. et al., Ann. Intern. Med., 111: 1010–22 (1989)). Die Vorschrift enthielt keine spezifischen Indikationen, die eine Transfusion von roten Blutzellen bestimmte; anstelle dessen waren Transfusionen gemäß lokaler Praxismuster, die an jedem Ort existierten, vorgeschrieben. Eine Angioplastie wurde gemäß Standardvorschriften durchgeführt. Prä- und Postverfahrens-Angiographie wurde nach Koronarvasodilatation mit 150–300 μg intrakoronarem Nitroglycerin durchgeführt. Nach dem Verfahren wurden die Gefäßhüllen für zumindest 6 Stunden nach dem Ende der Studienmittel-Infusion aufrechterhalten. Zusätzlich wurden die Hüllen bis zumindest 4 Stunden nach dem Ende der Heparin-Infiusion und bis eine akzeptable aktivierte Teilthromboplastin-Zeit zur Aufrechterhaltung der Hämostase erreicht wurde, am Ort belassen.
Studienendpunkte
Ein unabhängiges klinisches Endpunkte-Komitee überwachte alle Episoden, die einen Studienendpunkt oder ein wichtiges nachteiliges Ereignis repräsentieren könnten. Dieses Komitee, das gegenüber der Behandlung während der gesamten Studie verblindet blieb, überblickte die Formblätter für die Fallberichte, die Elektrokardiogramme und die dazugehörigen medizinischen Berichte, falls dies erforderlich war. Eine Übereinstimmung von zwei Überwachern war erforderlich, um ein Ereignis zu klassifizieren.
Der primäre Endpunkt des Versuchs war ein zusammengesetzter klinischer Endpunkt, der das Auftreten irgendeiner der nachfolgenden Ereignisse in den ersten 30 Tagen nach der Randomisierung miteinschloss:

(1) Tod durch irgendeine Ursache;
(2) nicht-fataler Herzinfarkt; oder
(3) dringender Eingriff
(a) zweite Angioplastie. Wiederholte perkutane Intervention einer wiederauftretenden akuten Ischämie (Ballon-Angioplastie oder koronare Atherektomie). Geplante (beispielsweise abgestufte) Verfahren wurden nicht als Endpunkt der Ereignisse angesehen;
(b) Koronararterien-Bypass-Transplantation. Eine dringende (nicht-elektive) chirurgische Intervention zur Behandlung einer wiederauftretenden akuten Ischämie;
(c) Einfügung eines endovaskulären Koronar-Stents. Die intrakoronare Stent-Anordnung, um die sofortige Durchlässigkeit des gedehnten Gefäßes aufrechtzuerhalten; oder
(d) die Einfügung einer intraaortalen Gegenpuls-Ballonpumpe. Die Ballonpumpe, die in einer wiederauftretenden Ischämie bei Patienten angeordnet wurde, wurden nicht als Kandidaten für eine wiederholte Angioplastie oder einen chirurgischen Eingriff angesehen.

Für die Zwecke dieser Studie ist der Begriff „Durchlässigkeit" als TIMI-Grad2-3-Strömung mit weniger als oder gleich 50% visueller Stenose wie durch den Operator bestimmt und keinem EKG-Beweis einer Ischämie definiert.
Myokardiale Endpunkt-Infarkte waren wie folgt definiert:

1. Bei Patienten, die innerhalb von 24 Stunden nach einem sich akut entwickelnden Herzinfarkt randomisiert wurden, war eines von zwei enzymatischen Kriterien für die Diagnose eines anschließenden nicht-fatalen Infarkts erforderlich: (a) ein Kreatinkinase (CK) oder Kreatinkinase MB von zumindest dreimal der Obergrenze des Normalen, was eine Zunahme von zumindest 33% aus dem vorherigen „Tal" repräsentiert (definiert als eine 25%ige Abnahme von einem vorherigen Spitzenwert, der jedoch zumindest zweimal auf dem Wert der Obergrenze des Normalen verbleibt); oder (b) eine Zunahme des CK oder CK-MB von zumindest 100% und ein Zurückbleiben des oberen Limits des Normalen um zumindest dreimal, im Anschluss an eine 50%ige Abnahme von einem vorherigen Spitzenwert und ein „Tal"-Wert von weniger als zweimal der Obergrenze des Normalen. Eine dokumentierte neue Episode einer verlängerten Angina (mehr als 20 Minuten), die eine erneute Erhöhung von Herzenzymen begleitet, wurde dazu verwendet, den Zeitpunkt des Ausbruches einer Reinfarktion zu etablieren. In Gegenwart einer dokumentierten Angina wurde der Beginn der Reinfarktion als der Zeitpunkt der Messung des Talenzym-Niveaus bzw. -Grades, der unmittelbar einer neuen Anhebung bzw. Erhöhung vorausgeht, eingestellt. Definition 1 wurde nur für solche Patienten verwendet, bei denen der Ausbruch einer wiederauftretenden Angina und/oder das Talenzym-Niveau innerhalb von 24 Stunden nach Beginn des Herzinfarktes, der bei Studieneintritt vorlag, auftrat. In allen Fällen wurde das CK-MB-Niveau verwendet, soweit nichts anderes verfügbar war, und in diesem Falle wurden die Gesamt-Kreatinkinase-Werte verwendet.
2. Bei Patienten, die in den Versuch mehr als 24 Stunden nach einem akuten Infarkt oder ohne kürzlichen Infarkt eintraten, mussten ein oder zwei Kriterien für eine Diagnose einer Im-Krankenhaus-Myokard-Infarktion erfüllt werden: (a) eine neue Q-Welle ≥0,04 Sekunden Dauer oder mit einer Tiefe >1/4 der entsprechenden R-Wellen-Amplitude in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Ableitungen; oder (b) ein CK-MB-Niveau zumindest dreimal der Obergrenze des Normalen und eine Zunahme des Niveaus >50% über das vorherige „Tal"-Niveau. Für diese Definition war der Zeitpunkt des Ausbruchs der Re-Infarktion bei Patienten mit akutem Herzinfarkt bei Studieneintritt entweder der Zeitpunkt des Auftretens einer neuen Episode einer verlängerten Angina (>20 Minuten) oder der Zeitpunkt der Messung des Talenzym-Niveaus, das einer neuen Enzym-Erhöhung vorausgeht. Damit diese Definition anwendbar ist, muss jede Zeit im Anschluss an den Erstinfarkt größer als 24 Stunden gewesen sein.
3. Nach Entlassung aus dem Krankenhaus war eines der beiden nachfolgenden Kriterien erforderlich, um einen Herzinfarkt zu diagnostizieren: (a) eine neue signifikante Q-Welle ≥0,4 Sekunden Dauer oder mit einer Tiefe ≥1/4 der entsprechenden R-Wellen-Amplitude, oder beides, in zwei oder mehreren aufeinanderfolgenden Ableitungen; oder (b) ein CK- oder CK-MB-Niveau von mehr als zweimal der Obergrenze des Normalen.

Ein weiterer Bestandteil des primären Endpunkts war der Bedarf nach einem dringenden wiederholten Eingriff, definiert als Rückkehr zur Angioplastie-Einrichtung für eine Intervention; geplante schrittweise Verfahren wurden in dem primären Endpunkt nicht miteingeschlossen. In ähnlicher Weise wurde lediglich eine dringende koronare Chirurgie zur Behandlung einer wiederauftretenden Ischämie oder eines fehlgeschlagenen Angioplastie-Verfahrens als primärer Endpunkt gezählt. Eine intrakoronare Stent-Anordnung wurde als primärer Endpunkt betrachtet, wenn der Stent zur Behandlung eines drohenden oder aktuellen abrupten Verschlusses des Gefäßes, das einer Angioplastie unterzogen wurde, angeordnet wurde. Eine intraaortale Ballonpumpen-Anordnung wurde als primärer Endpunkt angesehen, wenn die Pumpe für eine wiederauftretende Ischämie in einem Patienten angeordnet wurde, der keinem wiederholten Revaskularisierungs-Verfahren unterzogen wurde.
Die Blutungsereignisse wurden als größer, kleiner oder insignifikant unter Verwendung der Kriterien der Thrombolysis in Myocardial Infarction Study Group klassifiziert (Rao, A. K. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 11: 1–11 (1988)). Größere Blutungen wurden als intrakraniale Blutung oder eine Blutung definiert, die mit einer Abnahme des Hämoglobins von mehr als 5 g/dl assoziiert waren (oder, wenn das Hämoglobin nicht verfügbar war, eine Hämatokrit-Abnahme um zumindest 15%). Kleinere Blutungen waren entweder spontan oder wurden als grobe bzw. größere Hämaturie oder Hämatemesis beobachtet, verbunden mit einer Abnahme des Hämoglobins von mehr als 3 g/dl (oder, wenn der Hämoglobin-Wert nicht verfügbar war, eine Abnahme des Hämatokrit von zumindest 10%), oder, wenn keine Blutungsstelle identifiziert wurde, eine Abnahme von Hämoglobin von mehr als 4 g/dl (oder wenn Hämoglobin nicht verfügbar war, eine Hämatokrit-Abnahme von zumindest 12%). Bei Patienten, die eine Bluttransfusion durchmachten, wurde die Anzahl von Einheiten, die transfundiert wurden, dem beobachteten Abfall des Hämatokrits, geteilt durch 3, hinzugefügt, um die Gesamtabnahme des Hämoglobins zu erzielen, um zu entscheiden, ob eine größere oder kleinere Blutung auftrat (Landefield, C. S. et al., Am. J. Med., 82: 703–13 (1987)).
Datenmanagement und Statistik
Die Patienten wurden über Telefon-Kommunikation mit dem Datenkoordinierungszentrum an der Duke University randomisiert. Die Randomisierung wurde bezüglich des Studienortes geschichtet und gemäß der Frage, ob der Patient einen akut sich entwickelnden Herzinfarkt aufwies. Basierend auf früheren Daten wurde eine Probengröße von 2.100 der Patienten geplant, um eine 33%ige Reduktion des primären Endpunktes nachzuweisen (der in der Placebo-Gruppe als 15% vorausgesagt wurde) mit einer Stärke von 0,8 und α = 0,05.
Die Daten wurden durch Studienkoordinatoren auf Fallbericht-Formblättern gesammelt und durch verblindete Studien-Monitoren vor Daten-Eingang überwacht. Der Sponsor verblieb gegenüber dem Randomisierungscode und den Studienergebnissen verblindet, bis alle Patienten miteinbezogen waren und alle Endpunkte durch das klinische Endpunkte-Komitee beurteilt wurden.
Die Baseline-Eigenschaften sind als Mediane und 25te und 75te Percentile für kontiuierliche Variablen und als Prozentsätze für diskrete Variablen in den nachstehenden Tabellen gezeigt. Der primäre Endpunkt des Versuches wurde durch Betrachten der Zeit analysiert, bis das erste Auftreten irgendeines der Bestandteile des zusammengesetzten Endpunktes innerhalb der ersten 30 Tage nach Einbeziehung betrachtet wurde. Falls während des 30-tägigen Intervalls kein Ereignis auftrat, wurde das Follow-up der Patienten nach 30 Tagen zensiert. Kaplan-Meier-Überlebenszeitkurven für jede Behandlung wurden dazu verwendet, die Ergebnisse graphisch darzustellen (Kaplan, E. L. et al., J. Am. Stat. Assn., 53: 457–81 (1958)). Alle Behandlungsvergleiche wurden unter Verwendung des Intention-to-treat-Prinzips durchgeführt. Für den primären Endpunkt wurde ein Log-Rank-Test für den Trend (Dosis-Wirkung) durchgeführt, unter Berücksichtigung der Patienten, die nur den Bolus erhielten, die zwischen der Bolus und Infusionsgruppe lagen (Kalbfleisch, J. D. und R. L. Prentice, The Statistical Analysis of Failure Time Data, John Wiley and Sons, New York (1980)). Der Analyseplan erforderte dann paarweise Log-Rank-Vergleiche zwischen der Kontrollgruppe und jeder der beiden c7E3 Fab-Gruppen, wenn der Trend-Test signifikant war. Zwischenanalysen der Sicherheit wurden durchgeführt, wenn Daten bezüglich eines Drittels und ungefähr zwei Drittel der Patienten verfügbar waren. Das nominale α-Niveau, das zur Beurteilung der Signifikanz des Test für die Dosis-Wirkung bei jeder Zwischenanalyse verwendet wurde, wurde vorher so spezifiziert, dass eine Gesamt-Typ-1-Fehlerrate <0,05 aufrechterhalten wurde. Bei der Endanalyse war das Signifikanzniveau, das zum Vergleich verwendet wurde, 0,036. Eine ähnliche Strategie (Test) für einen Trend, gefolgt von paarweise Behandlungs-Vergleichen wie geeignet), wurden in der Endanalyse verwendet, um das Verhältnis der Behandlung zu jedem Bestandteil des zusammengesetzten Endpunktes auszuwerten, obwohl dieser Vergleich in erster Linie zu Erklärungszwecken verwendet wurde. Die Endanalyse verwendete ebenfalls diese Strategie, um die Behandlungen bezüglich der Messungen von Blutungskomplikationen zu vergleichen, unter Verwendung des konventionellen chi-Quadrattestes. Die Odds-Ratios und Konfidenzintervalle für den Behandlungseffekt in den großen Untergruppen (Alter, Geschlecht, Gewicht, klinische Subgruppe) wurden berechnet und graphisch dargestellt.
Ergebnisses
Die klinischen Baseline-Eigenschaften der Patientengruppen zeigen, dass die Population einem erhöhten Risiko bezüglich akuter Komplikationen einer Angioplastie wegen hohen Anteilen an Diabetes, kürzlichen Herzinfarkten, fortgeschrittenem Alter und weiblichem Geschlecht in Kombination mit den Läsionseigenschaften, die die Eintrittskriterien umfassen (siehe Tabelle 11) unterlagen. Die Großzahl der Patienten wies eine oder zwei Gefäßerkrankungen mit eine guten linken Ventrikelfunktion auf. Details der Interventions-Verfahren sind in Tabelle 12 aufgelistet. Keine beträchtlichen Unterschiede gemäß der Behandlungszuordnung waren offensichtlich.
Der primäre Gesamtendpunkt und dessen Bestandteile sind in Tabelle 13 dargestellt. Verglichen mit Placebo wird eine abgestufte Wirkung von c7E3 Fab demonstriert (p = 0,009) mit einer 11%igen Reduktion der zusammengesetzten Ereignisraten in der Bolus-Alleine-Gruppe (p = 0,43) und einer 35%igen Reduktion in Ereignisraten in der Bolus plus Infusionsgruppe (p = 0,008). Derselbe abgestufte Effekt war für jeden der meisten bedeutenden ischämischen Endpunkte zu beobachten, die in Tabelle 13 dargestellt sind. Somit reduzierte die anhaltende Glycoprotein-IIb/IIIa-Blockade einen nicht-fatalen Infarkt, eine koronare Bypass-Notoperation und eine perkutane Not-Revaskularisierung während ein insignifikanter Trend in derselben Richtung bei der Kurzzeit-Blockade vorlag, die durch den Bolus allein produziert wurde. Drei der Todesfälle in der Bolus- und Infusionsgruppe trat bei Patienten auf, die nach der Randomisierung starben, jedoch bevor sie den Arzneistoff empfingen; trotzdem werden diese Todesfälle in die Analyse gemäß dem Intention-to-treat-Prinzip eingeschlossen.
Weil nicht-fatale bzw. nicht-tödliche ischämische Ereignisse durch c7E3 Fab vermieden wurden, ist der Schweregrad der nicht-tödlichen Myokardinfarkte, die vermieden wurden, von Interesse. Wie in Tabelle 14 dargestellt ist, wurden sowohl Q-Wellen-Infarkte als auch Infarkte, die mit großen Enzymsteigerungen verbunden sind, vermieden und ein Dosis-Wirkungseffekt lag vor. Tabelle 11

Tabelle 12
Tabelle 13

HI: Herzinfarkt;
PTCA: Perkutane Angioplastie oder Atherektomie;
CABG: Koronararterien-Bypass-Transplantation.

HI: Herzinfarkt;
Großer Nicht-Q-Wellen-HI: ist durch einen Peak CK-MB oder Gesamt-CK >5 mal die Obergrenze des Normalen definiert;
Kleiner Nicht-Q-Wellen-HI: ist durch einen Peak CK-MB oder Gesamt-CK 3–5 mal der Obergrenze des Normalen definiert.

Das Timing der nicht-tödlichen ischämischen Ereignisse wurde in drei Gruppen für eine dringende wiederholte Angioplastie unterschieden, ein Ergebnis, das genau zeitlich eingeordnet werden konnte (siehe 10). Die Mehrzahl der Ereignisse in der Placebo-Gruppe trat in den ersten Stunden nach dem Index-Verfahren auf, während eine Verzögerung von mehreren Stunden (6–12 Stunden) bis zum Auftreten der Ereignisse in der Bolus-Gruppe evident war, was der Zeit der maximalen Rezeptorblockade entspricht. Es existierte eine bemerkenswerte Verzögerung im Beginn der ischämischen Ereignisse in der Bolus- + Infusions-Gruppe ebenso wie eine bemerkenswerte Reduktion ihrer absoluten Häufigkeit.
Das Profil der Blutungskomplikationen während der Hospitalisierung ist in Tabelle 15 dargestellt. Wie beim primären Endpunkt der Leistungsfähigkeit ist eine abgestufte Wirkung der Behandlung auf die Blutung evident. Die Patienten in der Bolus- + Infusions-Gruppe zeigten eine beträchtliche Abnahme sowohl in der Blutungsgeschwindigkeit als auch in der Transfusionsgeschwindigkeit, während Patienten, die Bolus alleine empfingen, eine nur moderate Zunahme zeigten. Die Mehrzahl der Blutungsepisoden trat während der Koronararterien-Bypass-Transplantation oder an der Stelle einer vaskulären Punktur in der Leiste auf, obwohl die Rate bzw. Geschwindigkeit der chirurgischen Gefäßreparatur gleichmäßig verteilt war (1% in der Placebo und Bolus- + Infusions-Gruppen und 2% in der Nur-Bolus-Gruppe). In ähnlicher Weise wiesen 6 Patienten eine intrakraniale Blutung auf, mit zwei Ereignissen in der Placebo-Gruppe, einer in der Nur-Bolus-Gruppe und dreien in der Bolus- + Infusion-Gruppe, von denen einer den Arzneistoff nicht enthielt, weil das Ereignis nach Randomisierung, jedoch vor der Angioplastie auftrat.
Tabelle 15
Die Häufigkeit sekundärer klinischer Ereignisse war gering und keine bedeutenderen Unterschiede in diesen Outcomes wurden gemäß der Behandlung beobachtet. Die 30-Tage-Raten des Herzversagens (2,3%, 2,4%, 2,3%) der anhaltenden Hypotension (3,0%, 3,6%, 4,1%), des Kammerflimmerns (3,0%, 2,6%, 3,4%) und des klinischen Auftretens einer Ischämie (21%, 17%, 18%) waren in den Placebo-, Bolus- und Bolus- und Infusions-Gruppen jeweils ähnlich.
Wenn die Behandlungswirkung in den Subgruppen (siehe 11) ausgewertet wurde, die gemäß der Frage definiert waren, ob die Patienten in einen akuten Infarkt, eine instabile Angina oder eine Hochrisiko-Anatomie einbezogen waren, war der Vorteil des c7E3 Fab in allen drei Einbeziehungs-Kategorien vorhanden. In ähnlicher Weise war der Effekt über die Subgruppen, die durch Alter und durch Geschlecht definiert waren, homogen. Als eine Funktion des Gewichtes war der Effizienzvorteil von c7E3 Fab-Bolus + Infusion im gesamten Spektrum der Patienten vorhanden, obwohl die Behandlungswirkung bei schwereren Patienten ausgeprägter war.
Das Risiko einer größeren Blutung war bei leichteren Patienten im Vergleich mit schwereren Patienten sowohl für die Nur-Bolus- als auch die Bolus- + Infusions-Vorschriften erhöht. Im leichtesten Terzil von Patienten trat eine größere Blutung bei 21 gegen 15 gegen 7% jeweils für Bolus + Infusion, Nur-Bolus- und Placebo-behandelten Patienten auf, wohingegen im schwersten Terzil die entsprechenden Blutungsraten 8, 7 und 7% waren. Die Transfusion von verpackten roten Blutzellen im leichtesten Terzil der Patienten trat jeweils bei 24, 20 und 11% für Bolus + Infusion, Nur-Bolus- und Placebobehandelten Patienten auf, wohingegen die entsprechenden Raten im schwersten Terzil 11, 7 und 4% betrugen.
Diskussion
Diese Ergebnisse bestätigen die Bedeutung von Blutplättchen, vermeintlichen Blutplättchen-abgeleiteten Medatoren und der Blutplättchenfunktion beim Auftreten akuter ischämischer Ereignisse in Patienten, die eine perkutane transluminale Koronar-Angioplastie durchmachen. Der EPIC-Versuch war so entwickelt worden, dass speziell eine Kohorte von Patienten miteinbezogen wurde, die einem hohen Risiko eines abrupten Gefäßverschlusses (Re-Okklusion) und deren begleitenden Komplikationen unterlagen. Eine Analyse von früheren Datenbanken zeigte, dass einige Patienten als auf Grundlage von klinischen Indikatoren eines Thrombus im Gefäß Hochrisiko-eingeordnet wurden, wie beispielsweise bei akutem Infarkt (Stack, R. S. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 11: 1141–49 (1988)), ernsthafter instabiler Angina (Myler, R. K. et al., Circulation, 82 (Suppl II): II-88-II-95 (1990)) oder dem angiographischen Auftreten eines Thrombus (Sugrue, D. D. et al., Br. Heart J., 56: 62–66 (1986); Hettleman, B. D. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 15: 154A (1990)}. Weitere Patienten unterlagen einem hohen Risiko wegen mechanischen Faktoren, wie beispielsweise einem kleinen Gefäßinnendurchmesser, einer diffusen Erkrankung oder einer nachteilhaften Gefäßmorphologie (Sinclair, I. N. et al., Am. J. Cardiol., 61: 61G–66G (1988); Ruocco, N. A. et al., Am. J. Cardiol., 69: 69–76 (1992); Ellis, S. G. et al., Am. J. Cardiol., 63: 30–4 (1989)). Eine beträchtliche Anzahl beider Typen von Patienten wurde in den Versuch miteingeschlossen und ermöglichte uns eine gewisse Einsicht in die Relevanz der Hemmung der Blutplättchenaggregation für jeden Typ von Patienten zu gewinnen. Der Einschluss dieser Hochrisiko-Patienten hatte erwartungsgemäß eine ischämische Ereignisrate von 15% bei den Placebo-behandelten Patienten zur Folge, trotz der Verwendung von ASS und Hochdosis-Heparin bei jedem Patienten; diese erwartete Ereignisrate wurde nahezu realisiert.
Die Verabreichung von c7E3 Fab hatte eine 35%ige Reduktion der zusammengesetzten Ereignisrate zur Folge, wobei die primäre Wirkung in der Reduktion des nicht-tödlichen Herzinfarktes, des Bedarfs nach einer Notfall-Angioplastie und einer Notfall-Bypass-Operation, beobachtet wurde. Der Bolus von e7E3 erzeugt eine Verzögerung des Ausbruchs dieser Ereignisse, was der Zeitspanne entspricht, in der die Blutplättchenaggregation beeinflusst wird. 4–6 Stunden nach dem Bolus jedoch begannen die ischämischen Ereignisse aufzutreten. Dieses Intervall entspricht der Zeitspanne, die folgt, in der die Blutplättchenaggregation auf ungefähr 50% ihres Basiswertes am Anschluss an einen Bolus von murinem c7E3 Fab zurückkehrt.
Zusätzlich zur Verzögerung von Ereignissen verhinderte die kombinierte Bolus- und Infusionsbehandlung, die eine tiefgreifende und verlängerte Blättcheninhibition erzeugt (siehe Beispiel 4) ebenfalls das Auftreten akuter ischämischer Ereignisse. Der zusammengesetzte Endpunkt stellt eine Gesamtschätzung des Einflusses dieses therapeutischen Ansatzes auf ischämische Ereignisse in der Perangioplastie-Zeitspanne bereit.
Eines der am meisten und bedeutendsten Erkenntnisse aus diesem Versuch ist die Konsistenz des Ereignisreduktionsprofiles quer über verschiedene Endpunkte hinweg. Die Reduktion des Herzinfarktes war beträchtlich und mit der simultanen Reduktion des klinischen Bedarfs nach anschließenden Notfallbehandlungen konsistent. Die Klassifikation eines nicht-tödlichen Infarktes wurde ein Hauptgegenstand der Evaluation perkutaner koronarer Interventionen. Die Erhöhung des Kreatinkinase-MB-Isoenzyms über das Oberlimit des Normalen sind üblich und bewegen sich von 4 bis 21% von Patienten in berichteten Versuchsreihen (Klein, L. W. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 621–6 (1991); Hunt, A. C. et al., Eur. Heart J., 12: 690–3 (1991; Pauletto, P. et al., Am J. Cardiol., 69: 999–1000 (1987); Spadaro, J. J. et al., Cath. Cardiovasc. Diagn., 12: 230–4 (1986). Wenn diese Enzymerhöhungen nicht gleichmäßig mit getrennten klinischen Ereignissen assoziiert sind, wurde bis jetzt keine Verbindung mit nachteiligen Langzeitereignissen dokumentiert. Somit kann die Vorbeugung isolierter Enzymerhöhungen ohne assoziierte klinische ischämische Ereignisse prognostisch nicht aussagekräftig ein. Um die Objektivität auf diesem subtilen Gebiet sicherzustellen, wurden Enzyme und Elektrokardiogramme systematisch gesammelt, ein verblindetes Endpunkte-Komitee wurde verwendet und zumindest eine dreifache Zunahme der Herzmuskel-spezifischen Enzyme war erforderlich, um ein Ereignis als einen Herzinfarkt zu klassifizieren. Die Erkenntnis, dass c7E3 Fab das volle Spektrum von Myokardinfarkten reduzierte, einschließlich solcher, die mit moderaten Enzymerhöhungen, großen Enzymerhöhungen und einer Q-Wellen-Entwicklung verbunden sind, stellt eine erneute Versicherung der klinischen Bedeutung der Ereignisse bereit, die vermieden wurden, insbesondere, weil der Bedarf nach koronaren Revaskularisations-Notfallverfahren ebenfalls reduziert war.
Obwohl keine Wirkung auf die Mortalität erwartet oder beobachtet wurde, sollte das Auftreten von drei Todesfällen in der Bolus- und Infusionsgruppe bei Patienten, die niemals den Arzneistoff empfingen, erwähnt werden. Diese Todesfälle wurden in der Primäranalyse gemäß des Intention-to-treat-Prinzips gezählt. Alle anderen Patienten, die tatsächlich starben, empfingen die ihnen zugeordnete Therapie. Unter Vorgabe der niedrigen Mortalität, die mit der Angioplastie verbunden ist, wären mehr als 20 Patienten erforderlich, um eine 25%ige vorteilhafte oder abträgliche Behandlungswirkung auf die Mortalität nachzuweisen.
Die vorteilhafte Wirkung einer Glycoprotein-IIb/IIIa-Rezeptorblockade auf die klinischen Endpunkte in den Fällen einer Hochrisiko-Angioplastie ist überzeugend und ist mit den positiven Ergebnissen einer kürzlichen Initialstudie unter Verwendung desselben Antikörpers in Patienten konsistent, die im Falle einer refraktären instabilen Angina einer Angioplastie unterzogen wurden (Simoons, M. L. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 21: 269A (1993)).
Mit diesem ersten groß angelegten Versuch einer IIb/IIIa-Rezeptorblockade bestanden Bedenken bezüglich der Induktion einer Thrombozytopenie. Es existierte jedoch eine nur sehr kleine, klinisch unbedeutende Zunahme der Thrombozytopenie mit c7E3 Fab. Insbesondere zeigte eine Analyse, dass mehr Patienten in der Bolus + Infusionsbehandlungsgruppe (5,2%) eine Thrombozytopenie erfuhren (Blutplättchenzählung < 100.000 /μl) als in der Bolus- (3,6%) oder in der Placebo- (3,4%) Behandlungsgruppe. Somit existiert eine Zunahme der Inzidenz einer Thrombozytopenie (Blutplättchenzählung <100.000/μl) in der Bolus + Infusionsbehandlungsgruppe im Vergleich mit der Placebogruppe (paarweise p = 0,062). Eine ernsthafte Thrombozytopenie (Blutplättchenzählung <50.000/μl) trat bei 11 (1,6%) der Patienten in der Bolus + Infusionsbehandlungsgruppe und bei 5 (0,7%) der Patienten in der Placebobehandlungsgruppe auf. Nur 4 Patienten (<1%) in jeder der Bolus + Infusions- und Placebobehandlungsgruppen wiesen sowohl eine schwere Thrombozytopenie als auch ernsthafte lebensbedrohliche oder tödliche abträgliche Wirkungen auf. Alle Episoden der Thrombozytopenie waren vorübergehend und traten typischerweise während der ersten wenigen Tage auf.
Eine signifikante Zunahme der Blutungskomplikationen und Transfusion wurde bei behandelten Patienten beobachtet. Diese Zunahme trat in erster Linie als Folge einer Blutung an der fernoralen Punktur-Stelle auf und hatte keinen bemerkenswerten Unterschied der Nadir-Hämatokrite oder der lebensbedrohlichen Komplikationen zwischen diesen drei Gruppen zur Folge. Die Trends blieben dieselben, gleichgültig ob oder ob nicht Chirurgie-Patienten in die Analyse miteingeschlossen wurden. In dieser verblindeten Studie hat die Unsicherheit darüber, welche Behandlung vorgenommen wurde, zu eine niedrigeren Schwelle für eine Transfusion an einigen Orten geführt, was auf Bedenken bezüglich der Verfügbarkeit der Stoppung von Blutungen zurückzuführen ist. Unsere frühe Erfahrung hat demonstriert, dass ein raffinierteres Protokoll zur Behandlung einer Blutung und Verabreichung von Transfusionen bei Patienten, die mit einer thrombolytischen Therapie behandelt wurden, die Verabreichung von Blutprodukten effektiv reduzieren kann (Wall, T. C. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 21: 597–603 (1993)).
Das Zwischenspiel zwischen dem Behandlungsvorteil gegen das Blutungsrisiko als Funktion des Gewichtes ist komplexer als erwartet. Obwohl die primäre Ereignisrate und das Risiko einer größeren Blutung nicht spürbar gemäß des Gewichtes in Placebobehandelten Patienten variierte, existierte ein klarer Trend mit abnehmendem Gewicht hin zu einem höheren Anteil an primären Outcome-Ereignissen und einem höheren Anteil an größeren Blutungen sowohl bei den c7E3 Fab Nur-Bolus-Patienten als auch den Bolus + Infusionspatienten.
Eine Beurteilung der klinischen Nützlichkeit dieses Ansatzes zur Blockierung der Glycoprotein-IIb/IIIa-Rezeptoren in Patienten vor, während oder nach einer perkutanen Revaskularisation hängt vom relativen Wert des Vermeidens ischämischer Ereignisse gegen diejenigen vorgegebener Blutprodukte ab. Bei den Hochrisiko-Patienten, die in diesen Versuch miteingeschlossen waren, scheint die Balance vorteilhaft zu sein. Die prognostischen Implikationen eines akuten Herzinfarktes oder einer wiederholten Notrevaskularisation sind ernsthaft und erfreulicherweise nimmt das Risiko einer Transfusion ab (Donahue, J. G. et al., N. Engl. J. Med., 327: 369–73 (1992); Dodd, R. Y., N. Engl. Med., 237: 419–21 (1992); Nelson, K. E. et al., Ann. Intern. Med., 117: 554–9 (1992)). Versuche, praktische Algorithmen zur Reduktion nicht-notwendiger Blutungen und Transfusionen zu verwenden und die antithrombotische Therapie effektiver zu dosieren, einschließlich von Anti-Thrombin- und Anti-Blutplättchen-Wirkungen sollte weiterhin die klinischen Vorteile, die in diesem Versuch beobachtet wurden, verbessern. In der Praxis müssen sich potente, parenteral verabreichte antithrombotische Mittel bei instrumentierten Patienten auf eine gewichtseingestellte Dosierung der antithrombotischen Therapie fokussieren (beispielsweise wurden die Heparindosen hierin nicht auf das Gewicht eingestellt). Die Verwendung einer detaillierteren mechanistischen Auswertung und von Vorschriften, die Ansätze zum Reduzieren einer Blutung definieren, die konstistent über die teilnehmenden Zentren angewandt werden, können mehr Information über das Auftreten von Blutungskomplikationen erzielen.
Die breite Konsistenz der Behandlungs-Wirkung quer über die Patientenpopulation hinweg ist ein starker Beweis dafür, dass, obwohl in einigen Fällen ein abrupter Verschluss in erster Linie thrombotisch oder in erster Linie mechanisch sein kann, eine Thrombusbildung eine bedeutendere Rolle bei vielen Patienten aufweist. Die Verzögerung bei Ereignissen, die durch die Bolus-Therapie und durch die Vorbeugung von Ereignissen durch Bolus und Infusion erzeugt werden, impliziert, dass in den meisten Situationen die Oberfläche der verletzten bzw. zerstörten Arterie zum Zeitpunkt 18–24 Stunden nach dem Verfahren viel von ihrer Thrombogenizität verloren hat. Therapeutische Ansätze sollten den Bedarf für eine anhaltende antithrombotische Wirkung bei Patienten mit einem signifikanten Risiko eines abrupten Gefäßverschlusses mitberücksichtigen.
Zusammenfassend zeigt dieser Versuch eine vorteilhafte Wirkung einer anhaltenden Blockade des Glycoprotein-IIb/IIIa-Rezeptors bei Patienten, die perkutanen Hochrisiko-Revaskularisationsverfahren beim Reduzieren und/oder Vorbeugen einer Reokklusion oder eines abrupten Verschlusses unterzogen werden. Obwohl dieser Vorteil unter dem Risiko einer erhöhten Blutung erreicht wurde, begünstigt eine Erwägung der klinischen Gesamtergebnisse diesen Ansatz bei der Behandlung von Patienten, von denen bekannt ist, dass sie einem hohen Risiko von akuten ischämischen Komplikationen unterliegen, auf Grundlage klinischer und angiographischer Prädiktoren vor dem Verfahren. Der Versuch stellt die erste Validierung eines aussagekräftigen therapeutischen Ansatzes der Hemmung der Funktion von Zellintegrinen bereit und ebnet den Weg für andere Selektin- und Integrin-Targets für die Biotechnologie der Zukunft ebenso wie Nicht-Antikörper oder – Peptidansätze für dieses spezifische IIb/IIIa-Glycoprotein.
Beispiel 7
Reduktion einer klinischen Restenose im Anschluss an eine Koronarintervention mit einer frühen Verabreichung eines Anti-GPIIb/IIIa-chimären Antikörperfragmentes
Der Prozess der Restenose im Anschluss an eine Ballonangioplastie und perkutane koronare Interventionen ist extrem häufig und führt zum Wiederauftreten von Angina-Symptomen und dem Bedarf wiederholter Revaskularisierungs-Verfahren bei mehr als 25 % der Fälle innerhalb von 6 Monaten bei Gesamtkosten von mehr als 2 Milliarden Dollar pro Jahr in den Vereinigten Staaten (Popma, J. J. et al:, Circulation, 84: 1426–1436 (1991); Topol, E. J. et al., Circulation, 87: 1489–1497 (1993); Herrman, J.-P. R. et al., Drugs, 46: 249–262 (1993)). Der biologische Hauptauslöser der Restenose ist eine Gefäßverletzung, die durch einen aufgeblasenen Ballon oder eine alternative Vorrichtung an der Stelle des Eingriffes induziert wurde und von einer Blutplättchen-Thrombusbildung und Veränderung des Phänotyps der medialen glatten Muskelzellen aus ihrem ruhenden, kontraktilen Zustand zu einem solchen Zustand begleitet werden, der zu einer migratorischen, proliferativen und sekretorischen Funktion in der Lage ist (Forrester, J. S. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 758–769 (1991); Ip, J. H. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 77B–88B (1991); Casscells, W., Circulation, 86: 723–729 (1993)). Obwohl verschiedene pharmakologische Mittel erfolgreich in experimentellen Modellen bei der Modulierung des charakteristischen myointimalen Wachstums waren, das nach einer Gefäßverletzung auftritt und obwohl kleine Studien einen angiographischen Vorteil nahegelegt haben, existieren bis jetzt keine groß angelegten klinischen Versuche mit Patienten, die ein effektives Mittel zeigen, und es existiert bis jetzt keine bekannte pharmakologische Behandlung zur Reduktion der Wahrscheinlichkeit dieses Ereignisses (Popma, J. J. et al., Circulation, 84: 1426–1436 (1991); Herrman, J.-P. R. et al., Drugs, 46: 249–262 (1993); Mercator Study Group, Cirulation, 86: 100–110 (1992)).
Eine Koronar-Angioplastie wird routinemäßig unter adjurtktiver Behandlung mit oralem ASS und intravenösem Heparin durchgeführt. Dieser antithrombotische Ansatz ist jedoch für die Blutplättchenaggregation nur schwach inhibitorisch. Eine Vielzahl von Agonisten, einschließlich Thrombin, Kollagen und Adenosindiphosphat kann Blutplättchen sogar in Gegenwart einer ASS-Therapie stimulieren. Die Molekularbiologie der Blutplättchen hat das Glycoprotein-IIb/IIIa-Integrin als den Rezeptor ans Licht gebracht, der für die Blutplättchenaggregation verantwortlich ist (Plow, E. F. et al., Prog. Hemostas. Thromb., 296: 320–331 (1988); Coller, B. S., J. Clin. Invest., 76: 101–108, (1985)). Das chimäre 7E3 Antikörper Fab-Fragment bindet selektiv an das Blutplättchen IIb/IIIa-Integrin. Nach initialen Studien, die eine vorläufige Sicherheit und Leistungsfähigkeit des chimären monoklonalen Antikörper Fab-Fragmentes bestätigten, wurde eine multizentrische, doppelverblindete, Placebo-kontrollierte Studie bzw. Versuch bei 2.099 Patienten durchgeführt (siehe Beispiel 6). Zusätzlich zum primären Effizienz-Endpunkt einer Reduktion größerer ischämischer Ereignisse in der Akutphase, die eine Unterdrückung eines abrupten Verschlusses repräsentieren (siehe Beispiel 6) wurde bestimmt, dass c7E3 zur Reduktion der Inzidenz einer klinischen Restenose in der Lage ist, wie es durch die ischämischen Ereignisse oder den Bedarf für eine wiederholte Revaskularisierung während der anschließenden 6-monatigen Follow-up-Phase definiert ist.
Verfahren
Details der Studienpopulation und der Vorschrift sind in Beispiel 6 beschrieben. Um zu rekapitulieren, wurden Patienten für eine Teilnahme ausgewählt, wenn diese einer Koronar-Angioplastie oder einer direktionalen Atherektomie unterworfen wurden und einen sich entwickelnden oder kürzlich zurückliegenden Herzinfarkt, eine instabile Angina oder eine angiographische Hochrisiko-Läsionsmorphologie aufwiesen, wie es durch die Kriterien der American Heart Association/American College of Cardiology (ACC/AHA Task Force Report, J. Am. Coll. Cardiol., 12: 529–545 (1988)) definiert ist. Die Ausschlusskriterien waren eine Blutungsneigung bzw. hämorrhagische Diathese, ein Alter ≥80 Jahre, Schlaganfall innerhalb von 2 Jahren oder einen größeren chirurgischen Eingriff innerhalb von 6 Wochen. Die Vorschrift wurde vom International Review Board bei allen 56 teilnehmenden Orten bzw. Stellen zugelassen bzw. bestätigt und eine Einverständniserklärung wurde bei allen Patienten erhalten.
Die Patienten erhielten oral ASS (325 mg/Tag), wobei die erste Dosis zumindest 2 Stunden vor dem Verfahren verabreicht wurde. Intravenöses Heparin wurde während des Verfahrens gegeben, um eine aktivierende Gerinnungszeit von zumindest 300 Sekunden zu erreichen. Zusätzlich zu ASS und Heparin wurde dem Patienten zufallsbedingt eine von drei alternativen Vorschriften zugeordnet: (1) Placebo-Bolus und Placebo, 12-stündige Infusion; (2) wirksamer c7E3 (Centocor, Malvern, PA) Bolus zu 0,25 mg/kg und Placebo, 12-stündige Infusion; oder (3) wirksamer c7E3 Bolus in derselben Dosis unmittelbar gefolgt von einer c7E3 Infusion zu 10 μg/min für 12 Stunden. Der Bolus wurde zumindest 10 Minuten vor dem koronaren Interventionsverfahren gegeben.
Der primäre Endpunkt war die zusammengesetzte 30-Tage-Inzidenz des Todes durch jegliche Ursache, des Herzinfarktes, Koronararterien-Bypass-Chirurgie für akute Ischämie, wiederholte perkutane koronare Intervention bezüglich einer akuten Ischämie, Bedarf für einen endoluminalen Stent oder Einführung einer intraaortalen Ballonpumpe zur Behandlung der Ischämie. All diese Ereignisse wurden durch ein unabhängiges klinisches Endpunkte-Komitee überwacht, das gegenüber der Behandlung während der gesamten Studie verblindet blieb und die Übereinstimmung zumindest zweier Beobachter bezüglich der Klassifikation erforderte.
Während des 6-monatigen Follow-ups, wurde die Doppelverblindung aufrechterhalten. Zusätzlich zu anschließenden ischämischen Ereignissen des Todes oder eines nicht-fatalen Herzinfarktes wurden die Patienten verfolgt, um den Bedarf für ein wiederholtes Revaskularisations-Verfahren zu bestimmen, das aus perkutanen koronaren Interventionen oder koronaren arteriellen Bypass-Eingriffen, oder beidem, zu bestimmen. Anders als beim Akutphasen-Endpunkt wurde die Stent-Legung oder die Verwendung einer intraaortalen Ballonpumpe nicht als Outcome miteingeschlossen, weil der Fokus eher der Bedarf nach Revaskularisations-Verfahren als der Ersatz für ein plötzliches ischämisches Ereignis war.
Die Kriterien für die Diagnose eines Herzinfarktes nach der Entlassung aus dem Krankenhaus erfordert entweder eine neue signifikante Q-Welle ≥0,04 Sekunden Dauer oder mit einer Tiefe ≥1/4 der entsprechenden R-Wellenamplitude in zwei oder mehr aufeinanderfolgenden Ableitungen; oder eine Kreatinkinase oder Kreatinkinasemyokard-Bande größer als zweimal der Obergrenze des Normalen. Die Revaskularisierungsdaten wurden ebenso gesammelt wie die Tatsache, ob das ursprüngliche Zielgefäß wiederholter chirurgischer oder perkutaner Revaskularisierung unterworfen wurde. Das Follow-up war zu 97,2% vollständig.
Um zu bestimmen, ob die 6-Monats-Outcomes von den Akutphasenergebnissen getrennt waren, schloss die Analyse alle Ereignisse von der Basislinie bis 6 Monate, die Ereignisse, die 30 Tage nach dem Endpunkt der Patienten mit einer anfänglich erfolgreichen Intervention (definiert als Erreichen einer End-Stenose von weniger als 50% gemäß der Ablesung des klinischen Untersuchers und ohne ischämische Komplikation) und Ereignisse ein, die nach 24 Stunden bei dem Patienten mit einer anfänglich erfolgreichen Intervention eintraten. Der 30-Tage-Endpunkt wurde prospektiv wegen dem Vorhergehen bei vielen kardiovaskulären Interventionsversuchen ausgewählt. Der 48-Stunden-Cut-off wurde verwendet, weil bekannt ist, dass per Definition nahezu alle abrupten Verschlussereignisse, die im Anschluss an eine koronare Intervention auftreten, innerhalb dieses Zeitfensters auftreten (Detre, K. M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 13: 230A (1989); Lincoff A. M. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 19: 926–938 (1992); de Feyter, P. J. et al., Circulation, 83: 927–936 (1991)).
Eine Randomisierung wurde über einen Telefonanruf des Duke Coordinating Center durchgeführt und durch die Studienstelle geschichtet und ob die Patienten einen akuten Herzinfarkt aufwiesen. Die Daten wurden durch Studienkoordinatoren auf getrennten 6-Monate-Fallbericht-Formblättern gesammelt, die durch Quellendokumentation durch verblindete Studienmonitoren vor dem Eintritt der Daten qualitätsgesichert wurden. Der Sponsor verblieb gegenüber den Follow-up-Ergebnissen verblindet, bis alle Patienten ihr Follow-up abgeschlossen hatten, die Ereignisse wurden durch das Endpunkte-Komitee beurteilt und die Datenbank wurde vervollständigt.
Statistische Analyse
Alle Behandlungs-Vergleiche wurden unter dem Intention-to-treat-Prinzip durchgeführt. Die Ereignisraten wurden unter Verwendung des Kaplan-Meier-Verfahrens geschätzt (Kaplan, E. L. und P. Meier, J. Am. Stat. Assn., 53: 457–481 (1958)) und die Überlebenszeitkurven wurden dazu verwendet, die Ergebnisse graphisch darzustellen. Ein Test für die Dosis-Wirkung in den Ereignisraten von Placebo zu Bolus und zu Bolus und Infusion (mit den Scores 0, 1 bzw. 2) wurden unter Verwendung der verallgemeinerten Log-Rank-Statistik durchgeführt. Paarweise Vergleiche zwischen Placebo und jeweils den c7E3-Armen wurden ebenfalls unter Verwendung der Log-Rank-Statistik durchgeführt. Proportional Hazards (Cox) Modelle wurden angepasst, um mögliche Beziehungen zwischen Basislinien-Eigenschaften und Outcome zu überprüfen. Diese wurden mit allen Behandlungsgruppen durchgeführt, kombiniert mit den modellierten Behandlungsdifferenzen und getrennt pro Behandlungsgruppe, um die Unterschiede zwischen den Behandlungs-Armen zu überprüfen. Zusätzlich wurden die Proportion Hazards Regressions (Cox) Modelle für alle Ereignisse des zusammengesetzten Endpunktes nach dem 48-stündigen Follow-up angepasst, um Faktoren zu überprüfen, die mit späten Ereignissen oder Behandlungswirkungen assoziiert sein könnten. Die in dieser Analyse eingeschlossenen Faktoren waren Behandlung, einfache Läsion oder vielfache Läsionen, die revaskularisiert wurden, die Dauer des Verfahrens, Herzinfarkt oder instabile Angina an der Basislinie oder andere Hochrisikoeintritts-Kriterien, Geschlecht, Alter ≥65 Jahren oder <65 Jahren, Gewicht und Diabetes mellitus.
Ergebnisse
Die Einbeziehung begann am 01. Dezember 1991 und endete am 18. November 1992 mit 2.099 Patienten. Die Merkmale der gesamten Studienkohorte sind oben dargestellt (siehe Beispiel 6, Tabelle 10). Die Basislinien-Eigenschaften der Patienten, die erfolgreich einem initialen Angioplastie- oder Atherektomie-Verfahren unterworfen wurden und die somit für eine anschließende klinische Restenose in Frage kamen, sind in Tabelle 16 dargestellt. Es existierten keine signifikanten Unterschiede in den Basislinien-Merkmalen der Patienten, die einem erfolgreichen initialen Verfahren durch Behandlungszuordnung unterzogen wurden.
Tabelle 16
Patienten, die c7E3 Bolus oder den Bolus und Infusion empfingen, wiesen eine signifikante Zunahme der Blutungskomplikationen, vorherrschenderweise in den ersten 48 Stunden, mit einer ungefähren Verdopplung der Transfusionsrate auf (Placebo 7%, nur Bolus 13%, Bolus und Infusion 15%, p = 0,001). Die 12-stündige Infusion war bei 48 Patienten (7,0%), die den Placebo empfingen, 85 Patienten (12,5%), denen lediglich der Bolus zugeordnet wurde, und 107 Patienten (15,8%) in der Bolus und Infusions-Gruppe nicht vollständig abgeschlossen.
Es existierte keine signifikante Zunahme der Thrombozytopenie bei c7E3 und keine Hypersensibilisierung oder allergische Wirkungen wurden manifestiert. Positive humane anti-chimäre Antikörper-(HACA)Reaktionen traten bei 5,2% der Bolus-behandelten Patienten und bei 6,5% der Bolus + Infusions-behandelten Patienten auf. Die meisten der Patienten mit einer positiven HACA-Reaktion wiesen Niedrig-Titer-Reaktionen auf. Alle der 32 Patienten, die eine positive HACA-Reaktion in der Bolus-Behandlungsgruppe aufweisen, wiesen einen Titer ≤1 : 1600 auf. 34 der 40 Patienten in der Bolus + Infusions-Behandlungsgruppe, die eine positive HACA-Reaktion aufweisen, wiesen einen Titer ≤ 1 : 1600 auf. Es existierten 6 Patienten in der Bolus + Infusionsbehandlungsgruppe, jedoch keiner in der Bolus-Behandlungsgruppe mit HACA-Titern im Bereich zwischen 1 : 6400 und 1 : 51200.
Bei 30 Tagen existierte eine 35%ige Reduktion größerer ischämischer Ereignisse (Tod, Herzinfarkt, dringende Revaskularisierung) für Patienten, die mit c7E3 Bolus und Infusion (8,3%) behandelt wurden, im Vergleich mit einer Placebo-Behandlung (12,8%, p = 0,009) (siehe Beispiel 6, Tabelle 13). Die 6-Monats-Daten sind in Tabelle 17 dargestellt, die die Outcomes von Tod, Herzinfarkt und dem Bedarf einer Koronararterien-Bypass-Operation oder eines wiederholten koronaren Eingriffes mit einer Zielgefäß-Revaskularisierung für (a) alle miteinbezogenen Patienten, (b) solchen Patienten mit einem erfolgreichen Verfahren ohne einer ischämischen Komplikation in den ersten 48 Stunden nach Einbeziehung und (c) für die Kohorte von Patienten, die eine anfänglich erfolgreiche Behandlung aufwiesen und kein Ereignis in den ersten 30 Tagen aufwiesen, zeigt. Bei 6 Monaten existierte eine 23%ige Reduktion ischämischer Ereignisse und einer Revaskularisierung (27% gegen 35%, p = 0,001, siehe Tabelle 17, alle miteinbezogenen Patienten, zusammengesetzt Tod, HI, CABG, PTCA). Die günstige Langzeitwirkung war hauptsächlich auf den geringeren Bedarf nach einer Bypass-Operation oder einer wiederholten Angioplastie bei Patienten mit einem anfänglich erfolgreichen Verfahren zurückzuführen, weil die wiederholte Zielgefäß-Revaskularisierung um 26% für c7E3-Bolus und Infusion (16,4%) gegen eine Placebo-Behandlung (22,3%, p = 0,007, siehe Tabelle 17) erniedrigt war. Die Nur-Bolus-Patientengruppe wies ein dazwischenliegendes Outcome auf, das nicht signifikant besser als der Placebo bezüglich der in diesem Versuch verwendeten Kriterien war.
In einer getrennten Analyse wurden 6-Monats-Daten aller Patienten, die kein primäres Leistungsergebnis in den ersten 30 Tagen zeigten, untersucht. Die Ergebnisse dieser Analyse sind in Tabelle 18 dargestellt. Diese Daten zeigen eine 21%ige Reduktion des Bedarfs nach wiederholten Revaskularisierungsverfahren nach der Akutphasenverabreichung von c7E3-Bolus + Infusion.
Tabelle 17
Tabelle 18
Die Daten für alle Ereignisse (Tod, nicht-tödlicher Infarkt oder Bedarf nach einer koronaren Revaskularisierung) für alle Patienten, die in den Versuch eingeschlossen waren, sind ebenfalls in 12 dargestellt. Die Daten für Patienten, die einer erfolgreichen Intervention unterzogen wurden und keine Ereignisse bis 30 Tage aufwiesen, sind ebenfalls in 13 dargestellt.
Vom Akutphasen-Endpunkt traten 81% der Ereignisse zum Zeitpunkt 48 Stunden auf. Dies war in allen Behandlungsgruppen ähnlich (82,0% Placebo, 79,7% Bolus, 81,4 Bolus und Infusion). Unter Betrachtung von Ereignissen nach den ersten 48 Stunden bei Patienten mit einem anfänglich erfolgreichen Eingriff wird das elektive Target Gefäß-Revaskularisierung in den ersten 30 Tagen identifiziert. Wie in 14 dargestellt ist, existiert nur ein geringer Unterschied für subakute ischämische Ereignisse zwischen dem c7E3-Bolus- und den Bolus + Infusions-Gruppen bis nach dem 30-Tage-Endpunkt.
Anstelle der Zusammensetzung aus Tod, myokardialer Revaskularisierung und irgendeiner Revaskularisierung, die Gefäße miteinschloss, die ursprünglich nicht im Versuch mit eingeschlossen waren, ist es hilfreich, auf lediglich Zielgefäß-Revaskularisierung zu fokussieren. Für die gesamte Patientenkohorte während der 6-monatigen Periode existierte eine signifikante 26%ige Reduktion der Zielgefäß-Revaskularisierung für die Bolus- und Infusionsgruppen-Patienten im Vergleich mit den anderen Behandlungsgruppen (siehe 15). Es sei erwähnt, dass ein geringer Effekt des Bolus alleine auf die Zielgefäß-Revaskularisierung während des Follow-up unter den Bedingungen des Versuches beobachtet wurde.
Eine Untergruppenanalyse verglich Patienten, bei denen an der Basislinie akute koronare Syndrome diagnostiziert wurden (instabile Angina, kürzlicher oder akuter Herzinfarkt), wobei die verbleibenden Patienten eine stabile Angina, jedoch eine Hochrisikoangiographie-Morphologie aufwiesen (Tabelle 19). Dies zeigte eine signifikante Wirkung der Reduktion zusammengesetzter Ereignisse für beide Subgruppen, jedoch war die Reduktion für wiederholte Koronarinterventionen nur bei den stabilen Angina-Patienten signifikant (Tabelle 19). Diese Erkenntnis war konsistent, gleichgültig ob die Ereignisse von der Basislinie oder nach 48 Stunden in den Patienten mit einem erfolgreichen Verfahren analysiert wurden.
Tabelle 19
Diskussion
Die aktuellen Erkenntnisse aus einem großangelegten, multizentrischen, randomisierten Versuch unterstützen eine Reduktion klinischer Ereignisse, die für Patienten, die einem koronaren Eingriff unterzogen werden, die jedoch einen Bolus und eine Infusion von Blutplättchen-II2/IIIa-Integrin-Blockade-Mitteln empfingen, weniger Restenose reflektieren. Das Ausmaß des Vorteils zum Zeitpunkt 6 Monate betrug ungefähr 23% Reduktion der ischämischen Gesamtereignisse, einschließlich Tod, nicht-tödlichem Herzinfarkt und dem Bedarf nach einer Revaskularisierung und eine 26%ige Abnahme der Zielgefäß-Revaskularisierung. Diese Ereignisse erstrecken den Vorteil von c7E3 Bolus und 12-Stunden-Infusion vom Reduzieren eines abrupten Verschlusses und der abträglichen Outcomes der akuten Phase zu einem verringerten Bedarf nach anschließender koronaren Revaskularisierungs-Verfahren.
Das monoklonale Fab-Fragment, das in dem Versuch verwendet wurde, weist eine wirkungsvolle Affinität zur Bindung an das Blutplättchen-IIb/IIIa Oberflächen-Integrin unter nur minimaler Dissoziation auf. Frühere Studien in Patienten, die einer Angioplastie mit c7E3 unterworfen wurden, haben gezeigt, dass sogar nachdem die Infusion des Antikörpers beendet ist, eine persisitente Belegung der IIb/IIIa-Bindungsstellen für zumindest 36–48 Stunden und ein Beweis für die Hemmung der Blutplättchenaggregation für zumindest 72 Stunden existierte (siehe Beispiel 4; siehe ebenfalls Ellis, S. G. et al., Cor. Art. Dis., 4: 1675–175 (1993); Tcheng, J. E. et al., Circulation, 88: (1993)). Während diese beiden Effekte sich über die Zeit hinweg verringern und zur Basislinie zurückkehren, ist die Dauer der inhibitorischen c7E3-Wirkung auf die Blutplättchenaggregation im Hinblick auf die Beobachtung interessant, dass der Bolus + Placebo-Infusion keine klinisch aussagekräftige Wirkung weder auf die akuten noch 6-Monate-Outcomes unter den in diesem Versuch verwendeten Kriterien und Bedingungen aufwies. Diese Beobachtung legt nahe, dass eine Reduktion akuter ischämischer Ereignisse oder einer klinischen Restenose über die Verabreichung von Anti-GPIIb/IIIa-Antikörper eine verlängerte Exposition gegenüber dem Mittel erfordern mag (beispielsweise wie sie durch Bolus + Infusion von Arzneistoff erreicht wird) und dass eine verlängerte Unterdrückung des GPIIb/IIIa-Integrins durch eine weitere Verbesserung der Outcomes begleitet sein könnte.
Es ist ebenfalls erwähnenswert, dass berichtet wurde, dass c7E3 an den Vitronektin-Rezeptor bindet (Hynes, R. O., Cell, 69: 11–25 (1992)), vielleicht weil dieser Rezeptor die (β₃-Komponente von GPIIb/IIIa enthält. Dieses Integrin (Vitronektin) mag eine Rolle bei der Modulierung der Stenose oder Restenose aufweisen und die Bindung des Anti-GPIIb/IIIa an den Vitronektin-Rezeptor mag zu dem beobachteten Effekt beitragen. Andere GPIIb/IIIa-Rezeptorinhibitoren weisen einen variierenden Grad einer Spezifität für das Target und für homologe Integrine auf (Sutton, J. et al., Clinical Research AFCR, 41: 118A (1993)). Vergleichsstudien können durchgeführt werden, um den Beitrag dieser molekularen Interaktionen zum klinischen Outcome zu bewerten.
Im gegenwärtigen Versuch wurde eine systematische 6-monatige wiederholte Angiographie nicht durchgeführt, um den Umfang der erneuten Verengung in den Behandlungsgruppen quantitativ zu bestimmen. Obwohl eine wiederholte Angiographie bei vielen Restenose-Versuchen durchgeführt wurde (Forrester, J. S. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 758–769 (1991); Ip, J. H. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 77B–88B (1991); Casscells, W., Circulation, 86: 723–729 (1993); Topol, E. J. et al., N. Engl. J. Med., 329: 228–233 (1993); Adelman, A. G. et al., N. Engl. J. Med., 329: 288–233 (1993); Serruys, P. W. et al., Circulation, 84: 1568–1580 (1991)) weist sie einen großen Nachteil auf, weil die Diagnose von Zielgefäß-Stenosen bei asymptomatischen Patienten oftmals zu wiederholten Verfahren führt, die in der Praxis nicht auftreten würden. Im Gegensatz hierzu bietet das vorliegende Design eine Simulierung der klinischen Praxis in einer großen Population von Patienten. Es ist das Hauptziel der Restenose-Versuche, eine signifikante Reduktion des Bedarfs für wiederholte Revaskularisierungs-Verfahren zu demonstrieren, weil der Angiographie-Vorteil per se, der in einigen kürzlichen Restenose-Versuchen dokumentiert wurde, nicht einzigartig adäquat oder vollständig klinisch relevant ist. Darüber hinaus ist, weil Tod und Herzinfarkt bei Patienten im Anschluss an eine perkutane koronare Intervention unüblich sind, das Haupt-Outcome, das durch eine wirksame pharmakologische Intervention moduliert werden sollte, eine wiederholte Zielgefäß-Revaskularisierung, wie es hier beobachtet wurde. Weil die Patienten in der Studie in ähnlicher Weise behandelt wurden, außer bezüglich der Studien Arzneistoff-Bolus und Infusion einschließlich einer sorgfältigen Bewahrung der Doppelverblindung bis das Follow-up abgeschlossen war, ist es vernünftig zu schließen, dass ein Reduktion der Verengung den beobachteten klinisch bedeutsamen Vorteil erklärt.
Dies repräsentiert den ersten großangelegten randomisierten Versuch, um eine klinisch aussagekräftige Reduktion des Bedarfs für anschließende Revaskularisierungs-Verfahren zu demonstrieren, die als geringere klinische Restenose interpretiert werden können. Dies wurde mit einem Bolus und Infusion einer IIb/IIIa-Blockade erreicht und deutet auf eine echte Passivierung der verletzten Gefäßwand hin. Selbst wenn die Infusion von c7E3 nur 12 Stunden aufrechterhalten wurde, hat das Mittel für mehrere Tage einen ausgedehnten Anti-Blutplättchen-Effekt und es bestand kein Beweis für einen Rebound ischämischer Ereignisse in der Akutphase. Bedeutenderweise legt der unabhängige Vorteil einer reduzierten Zielgefäß-Revaskulasierung am Zeitpunkt 6 Monate einen andauernden Effekt der akuten c7E3 pharmakologischen Intervention nahe und kann als klinischer Beweis der Gefäßwandpassivierung angeboten werden.
Die Erkenntnis einer geringeren klinischen Evidenz der Restenose bei einer Blutplättchen-IIb/IIIa-Blockade betont weiterhin die Rolle des Blutplättchen-Thrombus in der Restenose, der in der Entwicklung der Post-Angioplastie oder bei einer endothelialen Verletzung einer neointimalen Läsion als potentieller Schlüsselweg aufgezeigt wurde (Schwartz, R. S. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 20: 1284–1293 (1992); Topol, E. J., Mayo Clin. Proc., 68: 88–90 (1993); Willerson, J. T. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10624–10628 (1991)). Während die Proliferation glatter Muskelzellen ebenfalls eine bedeutende Rolle bei der Restenose spielen kann (Forrester, J. S. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 17: 758–769 (1991); Ip, J. H. et al., J. Am. Coll. Cardiol. 17: 77B–88B (1991); Casscells, W., Circulation, 86: 723-729 (1993)), legen die Ergebnisse hier nahe, dass bedeutende Anti-Blutplättchen- und antithrombotische Ansätze für dieses bedeutende klinische Phänomen besonders fruchtvoll sein können. Die Versuche unterstützen die Vorstellung, dass der gegenwärtige Ansatz der Verwendung von ASS während der koronaren Intervention (Schwartz, L. et al., N. Engl. J. Med., 318: 1714–1719 (1988)) als einziges Anti-Blutplättchen-Mittel nicht ausreichend ist, um die Blutplättchenreaktion auf eine Gefäßverletzung zu antagonisieren.
Beispiel 8
Zusätzliche Erkenntnisse aus dem randomisierten, doppelverblindeten, Placebokontrollierten Versuch
Hüllgröße und Blutungskomplikationen
Blutungskomplikationen wurden im EPIC-Versuch bestimmt (siehe Beispiele 6 und 7), um zu bestimmen, ob die Hüllgröße während PTCA/DCA mit Blutungskomplikationen korreliert. Die Hüll- und Führungskatheder-Größe wurde klinisch durch den Chirurgen bestimmt. Größere Blutungsepisoden, Leistenblutung, Transfusion, Gefäßheilung, Nadir-Hct wurden prospektiv bestimmt.
Die Hüllgröße sagte eine Leistenblutung sogar nach Einstellung für bekannte Blutungsprädiktoren voraus, einschließlich der Behandlungszuordnung und der Heparin-Verwendung während der Katheterisierung (p = 0,0004). Der Trend hin zu mehr Gefäßheilung bzw. -Reparatur mit größeren Hüllgrößen war nicht signifikant (p = 0,0004). Größere Blutungen (10,5%), Transfusionen (11,8%) und der Nadir-Hct (34) variierten mit der Hüllgröße nicht. c7E3 Fab-Patienten wiesen mehr Leistenblutungen als Nicht-7E3-Patienten auf (55% gegen 30%, p < 0,0001).
Diese Ergebnisse zeigen, dass Hüllen mit größeren Größen mit einer größeren Leistenblutung verbunden sind, jedoch nicht zu größeren Blutungskomplikationen der PTCA/DCA beitragen. Der c7E3 Fab ist mit einer erhöhten Leistenblutung assoziiert, dies kann jedoch durch Verwendung kleinerer Hüllen und Führungskatheter minimiert werden.
Co-Inzidenz ischämischer und Blutungs-Ereignisse nach Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Rezeptorinhibierung zur koronaren Intervention
Der EPIC (Evaluierung von c7E3 bei der Prävention ischämischer Komplikationen)-Versuch (siehe Beispiele 6 und 7) zeigte, dass eine Therapie mit c7E3 Fab, einem wirkungsvollen Blutplättchenrezeptor-GPIIb/IIIa-Antagonisten, ischämische Komplikationen in der Situation einer Hochrisiko-Koronarangioplastie (PTCA) verhindert, dass jedoch Blutungsepisoden, die eine Transfusion benötigten, von 7% in der Placebo-Gruppe auf 14% in der c7E3 Fab-Gruppe zunahmen. Um dies weiter zu untersuchen, wurde das Verhältnis zwischen den Blutungsindices (Nadir-Hämatokrit, Blutungsindex, Veränderung des Hämatokrit, Einheiten gepackter roter Blutzellen, die transfundiert wurden) und der primäre Endpunkt der Studie (Tod, Herzinfarkt, Koronararterien-Bypass-Transplantation (CABG) oder PTCA für eine akute Ischämie oder die Einfügung eines koronaren Stents bei Prozessversagen) untersucht. Eine starke Assoziation zwischen Blutung und dem primären Endpunkt wurde bemerkt (p = 0,0001 für alle Blutungsindices). Diese Assoziation lag ebenfalls für jede der Therapien vor: Placebo, Bolus c7E3 Fab und Bolus + Infusion c7E3 Fab. Somit war wahrscheinlicher, dass Patienten mit einer signifikanten Blutung ischämische Komplikationen aufwiesen. Die starke Beziehung kann auf die erhöhte Blutung zurückzuführen sein, die mit primären Endpunkt-Ereignissen assoziiert ist (beispielsweise CABG). Alternativ kann eine Blutung mit einer damit in Verbindung stehenden Hypotension ein bedeutender beitragender Faktor zu post-prozessualen ischämischen Komplikationen sein. Um dies zu stützen war signifikant wahrscheinlicher, dass Patienten, die eine Hypotension entwickelten (ausgenommen eine Hypotension nach einem primären Outcome-Ereignis) nach erfolgreicher PTCA ein primäres Outcome-Ereignis aufwiesen und erfuhren wahrscheinlicher eine größere Blutung und ein primäres Outcome-Ereignis.
Folglich scheint eine Blutung ischämische Komplikationen bei einigen Patienten zu induzieren und Maßnahmen zur Reduktion einer Blutung (beispielsweise Modifikationen der Heparin-Dosis) können die anti-ischämische Leistungsfähigkeit der GPIIb/IIIa-Hemmung für die koronare Intervention weiter steigern.
Ökonomische Vorteile und Nachteile einer aggressiven Blutplättchenhemmung während einer Hochrisiko-Angioplastie
Im randomisierten EPIC-Versuch mit 2.100 Patienten (siehe Beispiele 6 und 7) war eine aggressive Blutplättchenhemmung mit einer hohen Dosis an c7E3 Fab mit einer 35%igen Abnahme des anschließenden Todes, Reinfarktion und erneut auftretender Ischämie während einer Hochrisiko-Koronarangioplastie (PTCA) verbunden, jedoch auch mit zweimal mehr größeren Post-PTCA-Blutungen. Um die ökonomischen Folgen dieser Kombination klinischer Wirkungen zu evaluieren, wurde eine prospektive ökonomische Sub-Studie durchgeführt. Die Krankenhauskosten (keine Honorare) und die Verwendungsdaten der Ressourcen wurden prospektiv auf jeden Teilnehmer für 6 Monate im Anschluss an die Einbeziehung gesammelt. Durchschnittliche Basislinien-Krankenhauskosten für Patienten mit einem unkomplizierten Krankenhausaufenthalt betrugen 9.300 $. Die Wirkungen größerer Komplikationen auf die Basislinien-Krankenhauskosten wurden unter Verwendung eines multivariablen linearen Regressionsmodells überprüft: Mittlere Krankenhauskosten = 9.065 $ + 5.923 $*dringende PTCA + 28.219 $*dringende CABG + 3.645 $*(Re-)Infarktion + 3.462 $*größere Blutung
Dieses Modell zeigt, dass durch Reduzieren der dringenden PTCA von 4,5 auf 0,8%, einer dringenden CABG von 3,6 auf 2,4% und der (Re)Infarktion von 8,6% auf 5,2%, eine Therapie mit dem chimären 7E3-Fragment durchschnittlich 682 $ pro Patient gegenüber der Placebo-Therapie ersparte. Jedoch verlor die Therapie durch Verdoppeln der Rate der größeren Blutung von 7% auf 14% 242 $ ihres potentiellen Kostenvorteils, was geplante Kosteneinsparungen pro Person von 440 $ mit sich brachte. Der beobachtete durchschnittliche Kostenunterschied zwischen Hochdosis c7E3 Fab (x = 10.970 $ ± 7.284) und Placebo (x = 11.376 $ ± 12.555) betrugen 406 $, was eng mit der Modellvorhersage übereinstimmte.
Somit bietet die aggressive Blutplättchenhemmung mit einem chimären Anti-GPIIb/IIIa-Fragment durch signifikantes Reduzieren der ischämischen Komplikationen einer Hochrisiko-PTCA sowohl die verbesserten medizischen Outcomes als auch Netto-Kosteneinsparungen. Maßnahmen zur Senkung größerer Blutungsraten nach Verabreichung von c7E3 könnten geplante Netto-Kosteneinsparungen von bis zu 700 $ pro Patient ergeben.
Die aktivierte Gerinnungszeit wird während der Koronarinterventionen mit Blutplättchen-GPIIb-IIIa-Antagonismus erhöht
Die aktivierte Gerinnungszeit (ACT) wurde während einer perkutanen transluminalen Koronar-Angioplastie (PTCA) dazu verwendet, das Ausmaß der Thrombin-Hemmung und Antikoagulation in einem Versuch zu überwachen, abträgliche thrombotische Ereignisse zu minimieren. Bei der Einbringung wirkungsvoller Blutplättchen-Inhibitoren wie beispielsweise des chimären monoklonalen Antikörpers 7E3 Fab wurde die Nützlichkeit der Messung und Regulierung von ACT während der PTCA nicht überprüft. Zu diesem Punkt war eine Wirkung von c7E3 auf ACT weder bekannt noch vermutet. Der mögliche Einfluss eines Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Antagonismus auf den prozessualen ACT wurde untersucht. Im Versuch wurden 2.099 Subjekte, die einer PTCA unterworfen wurden, randomisiert, um entweder Placebo (N = 696) oder GPIIb/IIIa-Antagonist, c7E3 Fab (N = 1403) zu empfangen. Trotz Aufnahme einer ähnlichen Menge an Heparin und obwohl weniger Patienten sehr hohe Heparin-Dosen (>14.000 Einheiten) im Vergleich zur Placebo-Gruppe empfingen, wiesen solche, die c7E3 Fab empfingen, einen signifikant höheren (p < 0,001) ACT auf, wenn dies bezüglich des Körpergewichtes korrigiert wurde.
Folglich wird die aktivierte Blutgerinnungszeit durch den Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Antagonisten c7E3 Fab um 35–40 Sekunden erhöht. Dies hat bedeutende Implikationen für die Dosierung einer gleichzeitigen Heparin-Therapie und für die Durchführung von Koronararterien-Interventionen in der Einstellung einer GPIIb/IIIa-ausgerichteten Therapie.
Geschlechtsunterschiede in einem Versuch, der die Vorbeugung ischämischer Komplikationen einer Angioplastie mit einem monoklonalen Antikörper gegen den Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Rezeptor auswertet
Geschlechtsunterschiede wurden in einem Versuch untersucht, der die Vorbeugung bzw. Vermeidung ischämischer Komplikationen in einer Angioplastie mit der Verwendung eines c7E3 Fab, eines monoklonalen Antikörpers gegen den Blutplättchen-GPIIb/IIIa-Rezeptor (siehe Beispiele 6 und 7), auswertete. Die Patienten wurden einer perkutanen Intervention unterzogen (PTCA) und empfingen eine von drei verblindeten Behandlungen kurz der Intervention vorangehend: c7E3-Bolus, gefolgt von einer 12-stündigen c7E3-Infusion, nur c7E3-Bolus oder Placebo.
Trotz der Tatsache, dass Frauen dazu neigten, älter zu sein, ein geringeres Gewicht und größere kardiovaskuläre Risikofaktoren als Männer aufzuweisen, unterschieden sich Frauen und Männer in der Todeshäufigkeit (2,2% gegen 1,3%), HI (7,5% gegen 6,3%), Not-PTCA (2,6% gegen 3,1%), einer dringenden Bypass-Operation (1,7% gegen 3,2%), einer Stent-Anordnung, einer intraaortalen Ballonpumpenanordnung oder eines zusammengesetzten Maßes solcher nachteiliger ischämischer Ereignisse bei 30 Tagen (10,5% gegen 11,0%, p = 0,74), nicht. Eine Einstellung für bekannte Prädiktoren bzw. Vorhersagefaktoren des zusammengesetzten Maßes (Behandlungszuordnung, Gewicht, Hypertension, periphere vaskuläre Erkrankung) ebenso wie viele potentielle statistische Interaktionen mit dem Geschlecht veränderten diese Ergebnisse nicht. Eine Behandlung mit einem c7E3 Fab-Bolus und -Infusion senkten die Frequenz ischämischer Ereignisse in ähnlicher Weise in beiden Geschlechtern.
Frauen zeigten ernsthaftere Blutungen (12,6% gegen 9,8%), die eine Transfusion (PRBC) häufiger erforderten (19,5% gegen 9,0%) und wiesen einen höheren Blutungsindex (Δ Hämatokrit/3 + Einheiten PRBC, 2,4 gegen 1,9) als Männer auf. In einem Regressionsmodell zur Vorhersage des Blutungsindexes blieb trotz der Einstellung für bekannte Prädiktoren der Blutung (Behandlungsallokationen, Alter, Gewicht, Basislinien-Hämatokrit, Hypertension) das Geschlecht ein statistisch unabhängiger Prädiktor (p = 0,0041).
Als Folge erfuhren Frauen eine größere Blutung als Männer, zeigten jedoch in der Folge einer Hochrisiko-Angioplastie und einer Behandlung mit dem c7E3 Fab kein Mehr an anderen nachteiligen Ergebnissen.

Claims

Verwendung einer Verbindung, die selektiv an Glykoprotein IIb/IIIa bindet, zur Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung einer Stenose und/oder Restenose bei einem Menschen.
Verwendung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung der Stenose und/oder Restenose bei einem menschlichen Patienten mit einer Koronararterien-Erkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung der Stenose und/oder Restenose im Anschluss an ein Koronararterien-Eingriffsverfahren bei einem Menschen.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung eines Medikamentes zur Hemmung der Stenose und/oder Restenose im Anschluss an eine Angioplastie bei einem Menschen, beispielsweise einer perkutanen transluminalen Koronar-Angioplastie.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung ein Immunglobulin oder Immunglobulin-Fragment mit einer Spezifität für Glykoprotein IIb/IIIa ist.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Immunglobulin oder das Immunglobulin-Fragment die Blutplättchenaggregation hemmt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verbindung ein chimäres Immunglobulin oder ein chimäres Immunglobulin-Fragment mit einer Spezifität für Glykoprotein IIb/IIIa ist, wobei das Immunglobulin oder -Fragment eine Antigen-bindende Region nicht menschlichen Ursprungs, die für Glykoprotein IIb/IIIa spezifisch ist und eine menschliche konstante Region umfasst.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Antigen-bindende Region nicht menschlichen Ursprungs vom monoclonalen Antikörper 7E3 stammt.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei das Immunglobulin-Fragment ein Fab, Fab' oder F(ab')₂ Fragment ist.
Verwendung einer Verbindung, die selektiv an Glykoprotein IIb/IIIa bindet, zur Herstellung eines Medikamentes zur Reduzierung oder Prävention nicht-akuter ischämischer Komplikationen einer Angioplastie bei einem Menschen.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Verbindung ein Immunglobulin oder Immunglobulin-Fragment mit einer Spezifität für Glykoprotein IIb/IIIa ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei das Immunglobulin oder Immunglobulin-Fragment die Blutplättchenaggregation hemmt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei die Verbindung ein chimäres Immunglobulin oder chimäres Immunglobulin-Fragment mit einer Spezifität für Glykoprotein IIb/IIIa ist, wobei das Immunglobulin oder -Fragment eine Antigen-bindende Region nicht menschlichen Ursprungs umfasst, die für Glykoproteine IIb/IIIa spezifisch ist und eine humane konstante Region aufweist.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Antigen-bindende Region nicht menschlichen Ursprungs aus dem monoclonalen Antikörper 7E3 stammt.
Verwendung nach Anspruch 13 oder 14, wobei das Immunglobulin-Fragment ein Fab, Fab' oder F(ab')₂ Fragment ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Verbindung selektiv an Glykoprotein IIb/IIIa und den Vitronectinrezeptor bindet.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Verabreichung in Verbindung mit einem Mittel vorgesehen ist, das aus einem thrombolytischen Mittel und einen Antikoagulans ausgewählt ist.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Mittel Heparin ist.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei das Heparin in einer Menge vorliegt, die auf das Gewicht des Patienten eingestellt ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Medikament zur Verabreichung in Verbindung mit einem Antithrombozyten-Mittel vorgesehen ist.