JP2001502895A - アルファ―２―抗プラスミンに対するキメラ、ヒト化および一本鎖抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 モノクローナル抗体ＲＷＲと競合せず、（１）ヒトおよび非ヒト循環α２−抗プラスミンと（２）ヒトおよび非ヒトフィブリン架橋α２−抗プラスミンとの両者に結合および抑制することができ、キメラ抗体、ヒト化抗体、および一本鎖抗体よりなる群から選ばれたものである免疫学的分子。本発明はさらに該免疫学的分子をコードする核酸分子に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アルファ-2-抗プラスミンに対するキメラ、ヒト化および一本鎖抗体 発明の背景 連邦政府が後援する研究開発においてなされた発明に対する権利に関する陳述 この発明の一部は米国国立衛生研究所によって授与された契約番号HL-02348に 基き政府の支援を受けてなされた。当該政府はこの発明に一定の権利を有する。 発明の分野 本発明は、患者の肺塞栓症、心筋梗塞、血栓症および脳卒中を治療するための 組成物と方法に関し、より具体的にはアルファ-2-抗プラスミン結合分子を投与 することからなるフィブリン溶解増進療法に関する。また本発明は、アルファ-2 -抗プラスミン結合分子を血栓溶解薬と共に投与することからなるフィブリン溶 解増進治療に関する。 背景技術の説明 静脈血栓症と肺塞栓症は、一年間に約270,000の入院数があり、米国における 罹患率と死亡率の主要原因になっている（Anderson,F.Aら,Arch.Intem.Med．151 :933-938(1991)）。また一年間に約50,000〜200,000人の患者が肺塞栓症で死亡 すると見積もられている（Lilienfeld,D.E.ら,Chest 98:1067-1072(1990)）。肺 塞栓症に関する死亡率（治療を受けた患者の9.2％と見積もられている）が過去3 0年間改善していないことは、心筋梗塞に関する死亡率とは驚くべき対照をなし ている（Lilienfeld,D.E.ら,Chest 98:1067-1072(1990);Giuntini,C.ら,Chest10 7:3S-9S(1995)）。さらに、静脈血栓塞栓症の生存者は再発性血栓症、静脈炎後 症候群および肺高血圧症の危険にさらされることが知られている(Sutton,G.C.ら ,Br.Heart J.39:1135-1192(1977);Salzman,E.W.およびHirsch,J.著「TheEpiderm iology,Pathogenesis and Natural History of Venous Thrombosis」（Hemostas is and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice（Coleman,R.W.ら 編,第３版，ペンシルバニア州フィラデルフィア）の1275〜1296頁)）。 Ａ．血餅形成と血餅溶解の機序 血餅（患者中の血栓）は様々な比率のフィブリンと血小板からなる。血液凝固 の基本的反応には可溶性血漿タンパク質（フィブリノゲン）の不溶性フィブリン への変換が伴う。フィブリノゲンのフィブリンへの変換はセリンプロテアーゼで ある酵素トロンビンによって触媒される。 血餅溶解はプラスミンによって媒介される。自然の条件下では、プラスミノゲ ンがプラスミノゲン活性化因子によってプラスミンに変換される。天然のプラス ミン阻害因子にはα2-抗プラスミン、α2-マクログロブリンおよびα-1-アンチ トリプシンがあり、これらはすべて糖タンパク質である。アルファ-2-抗プラス ミンはプラスミンに対してα2-マクログロブリンよりはるかに高い親和性を持ち 、1:１の比率でプラスミンに特異的に結合する。より大きなα-マクログロブリ ンプールはリザーバ阻害因子として作用する（Kane,K.K.,Ann.Clin.Lab.Sci.14: 443-449(1984)）。したがってt-PAの投与による血餅溶解はプラスミン阻害因子 による迅速で不可逆的なプラスミンの不活化によって制限される。 Ｂ．静脈血栓症と肺塞栓症の治療 静脈血栓塞栓症の標準的治療法は、アンチトロンビンIIIによるトロンビンお よび第Xa因子阻害を強化するヘパリンである（Goldhaber,S.,Chest 107:45S-51S (1995)）。ヘパリンは新しい血栓（血餅）の形成を減少させるが、静脈血栓塞栓 症患者の診断時に存在することの多い大きな血栓の早期の内因的溶解はほとんど ないことが臨床試験によって示唆されている（Goldhaber,S.Z.ら,Lancet 2:886- 889(1986);「The Urokinase Pulmonary Embolism Trial」Circulation 47:1-108 (1973);Goldhaber,S.Z.ら,Am.J.Med.88:235-240(1990);Goldhaber,S.Z.ら,Lance t 341:507-511(1993)）。大きい血栓は罹患率および死亡率の増加と相関するの で、静脈血栓塞栓症患者におけるプラスミノゲン活性化因子の効果がいくつかの 研究で調べられている（Goldhaber,S.Z.ら,Lancet2:886-889(1986);「The Uroki nase Pulmonary Embolism Trial」Circulation 47:1-108(1973);Goldhaber,S.Z. ら,Am.J.Med.88:235-240(1990);Goldhaber,S.Z.ら,Lancet 341:507-511(1993)） 。 ヘパリンのみの場合と比較して、プラスミノゲン活性化因子は静脈血栓塞栓の 溶解に有意な増加をもたらすが、患者はしばしば治療直後に肺または深部静脈に 多量の残留血栓を残したままとなる（Goldhaber,S.Z.ら,Lancet 2:886-889(1986 );「The Urokinase Pulmonary Embolis Trial」Circulation 47:1-108(1973);Go ldhaber,S.Z.ら,Am.J.Med.88:235-240(1990);Goldhaber,S.Z.ら,Lancet 341:507 -511(1993)）。肺塞栓症患者の無作為化対照試験は、それらの試験に登録された 患者数が少ないためであるのだろうが、いずれもプラスミノゲン活性化因子がも たらす死亡率上の恩恵を立証してはいない。プラスミノゲン活性化因子の心筋梗 塞への使用は、冠血栓症患者の45〜70％がこれらの薬剤でまる90分間の再潅流を 達成しえなかったことを示している。 なぜ静脈血栓塞栓症がフィブリン溶解に抵抗するかはまだわかっていない。サ イズ、収縮、血流への曝露、年齢などの物理的特徴は、これらの大きくフィブリ ンに富む血栓の溶解に影響するだろう（Prewitt,R.M.Chest 99:157S-164S(1991) ）。しかしこれら血栓のフィブリン溶解耐性は、第XIII因子、プラスミノゲン活 性化因子阻害剤１（PAI-1）、アルファ-2-抗プラスミン（α2AP）などの特定の 分子因子によっても調節されるらしい（Collen,D.,Eur.J.Biochem.69:209-216(1 976):Moroi,M.およびAoki,N.,J.Biol.Chem.251:5956-5965(1976);Munertz,S.お よびClemmensen,I.,Biochem.J.159:545-553(1976);Sakata,Y.およびAoki,N.,J.C lin.Invest.69:536-542(1982);Robbie,L.A.ら,Thromb.Haemostas．70:301-306(1 993);Francis,C.W.およびMarder,V.J.,J.Chn.Invest．80:1459-1465(1987);Jans en,J.W.C.M.ら,Thromb．Haemostas.57:171-175(1987);Reed，G.L.ら,Trans.Asso c.Am.Phys.104:21-28(1991);Stringer,H.A.およびPannekoek,H.,J.Biol.Chem.27 0:11205-11208(1995);Carmehet,P.ら,J.Clin.Invest.92:2756-2760(1993);Lang, I.M.ら,Circulation 89:2715-2721(1994);Marsh,J.J.ら,Circulation 90:3091-3 097(1994)）。 α2APはプラスミン（血栓を崩壊させる酵素）の超迅速共有結合阻害剤である から、α2APは血栓耐性のとりわけ有望な原因である（Collen,D.,Eur.J.Biochem .69:209-216(1976);Moroi,M.およびAoki,N.,J.Biol.Chem.251:5956-5965(1976); Mullertz,S.およびClemmensen,I.,Biochem.J.159:545-553(1976)）。さらにα2A Pはフィブリン表面に共有結合的に架橋され る唯一のフィブリン溶解阻害因子である（Sakata,Y.およびAoki,N.,J.Clin.Inve st.69:536-542(1982)）。この（活性化第XIII因子による）架橋は、α2APがフィ ブリン溶解の開始を阻害する場であるフィブリン表面に、α2APを集中させる（S akata,Y.およびAoki,N.,J.Clin.Invest.69:536-542(1982)）。過去の試験管内試 験で、α2AP欠損患者に由来する血餅は自発的に溶解することが示されており、 これはα2APが内因性プラスミノゲン活性化因子に対する血栓の耐性に決定的な 役割を果たすことを示唆している（Aoki,N.ら,BIood 62:1118-1122(1983);Miles ,L.Aら,Blood 59:1246-1251(1982)）。これらの知見は、α2APが肺塞栓症患者に みられる血栓耐性の分子媒介因子であるという仮説につながった。この仮説を検 証するために、我々はα2APの特異的阻害剤を作成し、実験的肺塞栓の溶解の調 節にα2APが果たす役割の決定にそれを使用した。 ある人が治療を受ける前にフィブリン凝塊（血栓）を形成した場合は、フィブ リン血栓を溶解しうる薬剤を使用してその凝塊を溶解することにより、冒された 血管に血液を再び流しうる。そのような薬剤にはプラスミン、抗凝血物質（例え ばヘパリン、ヒルジン、活性化プロテインＣなど）、プラスミノゲン活性化因子 （例えばストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミ ノゲン活性化因子、スタフィロキナーゼ、吸血蝙蝠プラスミノゲン活性化因子な ど）その他の薬剤がある（Ganz,W.ら,J.Amer．Coll.Car-diol.1:1247-1253(1983 );Rentrop,K.P.ら,Amer.J.Cardiol.54:29E-31E(1984);Gold,H.K.ら,Amer.J.Card iol 53:122C-125C(1984)）。 現在、肺塞栓症、心筋梗塞、血栓症および脳卒中の治療は血栓溶解薬の投与に よって部分的に達成されている。そのような薬剤を治療に使用するとしばしば不 完全な溶解が起こり、血栓の再形成と冒された血管の再閉塞が促進される。した がって、フィブリノゲンの分解を最小限に抑え、血栓の再形成を防止しつつ、フ ィブリン溶解を増進する、血栓溶解療法の改善が必要とされている。 Ｃ．アルファ-2-抗プラスミン抗体 アルファ-2-抗プラスミン（α2AP）は３つの機能ドメイン、すなわちプラスミ ンとの反応部位、プラスミン（プラスミノゲン）またはLBS結合部位［プラスミ ン（プラスミノゲン）のLBS（リジン結合部位）に相補的］およびフィブリンへ の架橋部位を持っている。Mimuro,J.ら,Blood 69:446-453(1987)。Mimuroらはα 2APに対する抗体を開示しており、そのうちの一つ（JPTI-1）はα2APの反応部位 に特異的で、α2AP複合体の形成を妨げることにより抗プラスミン活性を阻害す る。しかしMimuroらは血餅溶解を増進するためにJPTI-1抗体を投与することは教 示していない。α2APに特異的なその他の抗体はPlow,E.F.ら,J.Biol.Chem.255:2 902-2906(1989)、Wimen,B.ら,Scan.J.Clin.Lab.Invest．43:27-33(1983)、Hatte y,E.ら,Thromh.Res.45:485-495(1987)、Collenの米国特許第4,346,029号（1989 ）およびCollenの米国特許第4,198,335号（1980）によって教示されている。 発明の要約 本発明は、患者の肺塞栓症、心筋梗塞、血栓症および脳卒中を治療するための 改善された血栓溶解療法に関する。本発明は（１）ヒトおよびヒト以外の循環α 2-抗プラスミン類と（２）ヒトおよびヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミ ン類の両方に結合できる免疫分子に向けられる。好ましい態様として、その免疫 分子はキメラ抗体、ヒト化抗体または一本鎖抗体である。また本発明は、患者の 肺塞栓症、心筋梗塞、血栓症および脳卒中を治療する方法であって、（１）ヒト およびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２）ヒトおよびヒト以外のフィブ リン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できるα2-抗プラスミン結合分子を投 与することからなる方法にも向けられる。さらに本発明は、患者の肺塞栓症、心 筋梗塞、血栓症および脳卒中を治療する方法であって、そのような治療を必要と する患者に、 （a）（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２）ヒトおよび ヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できる免疫分子の治 療有効量と、 （b）血栓溶解薬の治療有効量（ただし免疫分子（a）は血栓溶解薬（b）とは異 なるものとする） とを同時投与することにより、その患者を治療することからなる方法を提供する 。 本発明は、（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（2）ヒト およびヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できるモノク ロ ーナル抗体またはその断片を提供する。一態様として、本発明はモノクローナル 抗体77A3である。もうひとつの態様として、本発明はモノクローナル抗体49C9で ある。さらなる態様として、本モノクローナル抗体は70B11である。 また本発明は、次の操作からなるモノクローナル抗体製造法を提供する： （a）α2-プラスミンまたはその断片で動物を免疫し、 （b）その動物から得た細胞を腫瘍細胞と融合してハイブリドーマ細胞株を作成 し、 （c）そのハイブリドーマ細胞株をクローン化し、 （d）（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２）ヒトおよび ヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できるモノクローナ ル抗体に関する選択を行い、 （e）そのモノクローナル抗体を得る。 本発明は（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２）ヒトお よびヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できるモノクロ ーナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。一態様として、本発明 はハイブリドーマ細胞株77A3（ATCC受託番号HB-12192；1996年９月20日アメリカ ンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection；20862メ リーランド州ロックビル・パークローンドライブ1230)に寄託）である。 本発明は、次の操作からなるハイブリドーマ細胞株製造法に向けられる： （a）α2-抗プラスミンまたはその断片で動物を免疫し、 （b）その動物から得た細胞を腫瘍細胞と融合してハイブリドーマ細胞株を作成 し、 （c）（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２）ヒトおよび ヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できるモノクローナ ル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を得る。 また本発明は、肺塞栓症、心筋梗塞、血栓症および脳卒中を含む、患者の多く の疾患および状態を治療する方法であって、（１）ヒトおよびヒト以外の循環α 2-抗プラスミン類と（２）ヒトおよびヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミ ン類の両方に結合できる免疫分子の治療有効量を投与することによりその患者を 治療することからなる方法を提供する。 さらに本発明は、患者の肺塞栓症、心筋梗塞、血栓症または脳卒中を治療する 方法であって、そのような治療を必要とする患者に、 （a）（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２）ヒトおよび ヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できる免疫分子の治 療有効量と、 （b）血栓溶解薬の治療有効量（ただし免疫分子（a）は血栓溶解薬（b）とは異 なるものとする） とを同時投与することによりその患者を治療することからなる方法を提供する。 好ましい態様として、その血栓溶解薬はプラスミン、抗凝血物質またはプラス ミノゲン活性化因子である。一態様として、その抗凝血物質はヘパリン、ヒルジ ンおよび活性化プロテインＣからなる群より選択される。もうひとつの態様とし て、そのプラスミノゲン活性化因子はスタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ 、プロウロキナーゼ、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子および吸血 蝙蝠プラスミノゲン活性化因子からなる群より選択される。 本発明のその他の態様には、静脈内注入または静脈内ボーラス注射によって、 もしくは免疫分子（a）を含有する第一ボーラスとそれに続いて投与される血栓 溶解薬（b）を含有する第二ボーラスによって、患者に与えられる免疫分子があ る。さらなる態様には、患者の体重１kgにつき3〜300ナノモルの投与量で患者に 与えられる免疫分子（a）と、患者の体重１kgにつき0.01〜3.0mgの投与量で患者 に与えられる血栓溶解薬（b）がある。 本発明は、患者の肺塞栓症、心筋梗塞、血栓症または脳卒中を治療する方法の 実施に有用な、２またはそれ以上の容器手段を収容するべく厳密に仕切られたキ ットであって、 （１）治療有効量の免疫分子（a）を含有する第一容器と、 （２）治療有効量の血栓溶解薬（b）を含有する第二容器（ただし免疫分子（a） は血栓溶解薬（b）とは異なるものとする） を含むキットを提供する。 また本発明は（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２）ヒ トおよびヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できる免疫 分子をコードする核酸分子をも提供する。またここに記述する免疫分子の結合部 位のアミノ酸配列を含んでなる分子をも提供する。 図面の簡単な説明 図１:モノクローナル抗体49C9、70B11、77A3、RWRおよび抗ジゴキシン(対照) の¹²⁵I-α2-抗プラスミンへの結合の比較。マイクロタイタープレートのウェル をヤギ抗マウス抗体でコーティングした。そのウェルを２つ一組として49C9、70 B11、77A3、RWRまたは対照（抗ジゴキシン）モノクローナル抗体と共にインキュ ベートした（Mudgett-Hunter,M.ら,Mol.Immunol.22:477-488(1985)）。洗浄後、¹²⁵ I-α2AP(60,000cpm)を１時間加えた。ウェルをすすぎ、結合した¹²⁵I-α2AP の量をガンマカウンタで測定した。 図２:モノクローナル抗体49C9、70B11、77A3、RWRおよび抗ジゴキシンの固定 化70B11との競争結合アッセイ。マイクロタイタープレートのウェルを２つ一組 として精製モノクローナル抗体（70B11）で１時間コーティング（10μｇ/ml）す ることにより、競争ラジオイムノアッセイを行なった。そのウェルを洗浄し、1 ％BSAで１時間ブロックした。洗浄後、25μｌの競争モノクローナル抗体、同じ モノクローナル抗体または陰性対照モノクローナル抗体を異なるウェルに加え（ 50μｇ/ml）、次いで25μｌの¹²⁵I-α2-抗プラスミン（100,000cpm）を加えた。 １時間インキュベートした後、それらのウェルを洗浄し、切断し、その放射活性 をガンマシンチレーションカウンタで測定した。 図３：ウロキナーゼ投与量の関数としての種々のモノクローナル抗体（または TBSのみ）による溶解量の比較。方法の詳細な説明については下記実施例１を参 照されたい。溶解量はガンマ計測によって決定した。溶解百分率は100×（総上 清cpm÷総血餅cpm）と定義した。 図４:モノクローナル抗体77A3の不在下または存在下での用量反応試験。ウロ キナーゼによる溶解は77A3により約100倍増加する。 図５:77A3精製の還元SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動。77A3を含有する腹 水を収集し、精製した。レーン１：タンパク質標品（分子量をkDaの単位で左側 に示す）。レーン２:40％硫酸アンモニウムによる沈殿後の上清。レーン３:精製 77A3。還元された77A3免疫グロブリンは重鎖に対応する約50kDaのバン ドと、軽鎖に対応する約25kDaのバンドからなる。 図６:試験管内フェレット血漿凝塊の溶解速度に対する77A3の効果。微量の¹²⁵ I-標識ヒトフィブリノゲンを使って形成させたフェレット血漿凝塊を100μｌのT BS（対照）または精製モノクローナル抗体（25μｇ，77A3またはRWR）と共にイ ンキュベートした。血餅溶解は試験管１本につき0.1単位のrt-PAを添加すること によって開始させた。凝塊を37℃でインキュベートし、Reed,G.L.IIIら，Proc.N atl.Acad.Sci．USA 87:1114-1118(1990)に記述されているように、放射標識フィ ブリン分解産物の上清への放出を調べるために試料を採取することによって溶解 量を決定した。 図７:フェレットにおける機能的α2APレベルに対するモノクローナル抗体77A3 の生体内投与の効果。用量調査実験として、２匹の麻酔したフェレット（A,B） に77A3（22.5mg/kg）を静脈内投与し、注入前（時刻0）と注入の１時間および４ 時間後に採血したクエン酸血漿試料中の機能的α2AP量を測定した。データは血 漿試料中のα2AP阻害百分率（平均±SD）を表わす。 図８：生体内での肺塞栓の溶解に対するrt-PAとα2AP阻害の効果。麻酔したフ ェレットにヘパリン（100U/kg）をボーラス投与し、¹²⁵I-標識フィブリン凝塊を 肺内に塞栓形成させた。塞栓形成後、３つのフェレット群にrt-PA（0、1または2 mg/kg）を２時間かけて静脈投与した（無地のバー）。他の２つのフェレット群 にはrt-PA（1mg/kg）と対照モノクローナル抗体（抗ジゴキシン，黒いバー，22. 5mg/kg）またはα2APを阻害するモノクローナル抗体（77A3，斜線入りのバー， 同投与量）を与えた。このグラフは各処置群に関する溶解量（平均±SD）を表わ す。各処置群のフェレット数を記載し、群間の相違に関するＰ値を表示してある 。 図９:ヘパリン、rt-PAおよびα2AP阻害剤で処置された動物における残留フィ ブリノゲンレベル。肺塞栓形成前と実験の終了時にフェレットから血液試料を（ アプロチニン添加EDTAに）集めた。残留フィブリノゲンレベルは、Rampling,M.W .およびGaffney,P.J.,Clin.Chim.Acta.67:43-52(1976)に記述されているように 測定した。このグラフはrt-PAのみを投与した動物(0、1または2mg/kg;無地のバ ー)と、rt-PAおよびα2AP阻害剤を投与した動物（斜線入りのバー） に関するフィブリノゲンレベル残留百分率（平均±SD）を表わす。 図10：49C9（配列番号1）、70B11（配列番号2）および77A3（配列番号3）由来 の精製軽鎖のアミノ末端のペプチド配列を示す。 図11：49C9のシグナルペプチド（配列番号５のアミノ酸−20〜−1）と軽鎖可 変領域（配列番号５のアミノ酸1〜107）のcDNA配列（配列番号4）および対応す る推定アミノ酸配列を示す。 図12：70B11のシグナルペプチド（配列番号７のアミノ酸−20〜−1）と軽鎖可 変領域（配列番号７のアミノ酸1〜107）のcDNA配列（配列番号6）および対応す る推定アミノ酸配列を示す。 図13：77A3のシグナルペプチド（配列番号９のアミノ酸−20〜−1）と軽鎖可 変領域（配列番号９のアミノ酸1〜107）のcDNA配列（配列番号8）および対応す る推定アミノ酸配列を示す。 図14：49C9のシグナルペプチド（配列番号11のアミノ酸−19〜−1）と重鎖可 変領域（配列番号11のアミノ酸1〜119）のｃＤＮＡ配列（配列番号10）および対 応する推定アミノ酸配列を示す。 図15：70B11のシグナルペプチド（配列番号13のアミノ酸−19〜−1）と重鎖可 変領域（配列番号13のアミノ酸1〜119）のcDNA配列（配列番号12）および対応す る推定アミノ酸配列を示す。 図16：77A3のシグナルペプチド（配列番号15のアミノ酸−19〜−1）と重鎖可 変領域（配列番号15のアミノ酸1〜119）のcDNA配列（配列番号14）および対応す る推定アミノ酸配列を示す。 図17：ヒト化77A3-1およびヒト化77A3-2軽鎖のcDNA配列（配列番号16）と対応 するアミノ酸配列（配列番号17）。CDRループに該当する位置を実線で囲ってあ る。 図18：ヒト化77A3-1重鎖のcDNA配列（配列番号18）と対応するアミノ酸配列（ 配列番号19）。CDRループに該当する位置を実線で囲ってある。 図19：ヒト化77A3.2重鎖のcDNA配列（配列番号20）と対応するアミノ酸配列（ 配列番号21）。CDRループに該当する位置を実線で囲ってある。 図20：色素原基質を使ったプラスミンアッヤイにおけるネズミ77A3（×）、 キメラ77A3（●）およびヒト化77A3-1（■）の結果を示す。 図21：次の軽鎖アミノ酸配列を示す:h77A3-1とh77A3-2（配列番号17）;m77A3 （配列番号9）;m49C9（配列番号5）;m70B11（配列番号7）;m77A3、m49C9およびm 70B11間のコンセンサス配列を示すネズミコンセンサス（配列番号75）;77A3と49 C9間のコンセンサス配列を示す77A3I49C9コンセンサス（配列番号76）;h77A3-1 、h77A3-2、m77A3、m49C9およびm70B11間のコンセンサス配列を示す「全」（配 列番号77）。CDRループに該当する位置を囲ってある。 図22：次の重鎖アミノ酸配列を示す:h77A3-1（配列番号19）;h77A3-2（配列番 号21）;m77A3（配列番号15）;m49C9（配列番号11）;m70B11（配列番号13）;h77A 3-1とh77A3-2間のコンセンサス配列であるヒト化コンセンサス（配列番号78）;m 77A3、m49C9およびm70B11間のコンセンサス配列であるネズミコンヤンサス（配 列番号79）；77A3と49C9間のコンセンサス配列である77A3/49C9コンセンサス（ 配列番号80）;h77A3-1、h77A3-2、m77A3、m49C9およびm70B11間のコンセンサス 配列である「全」（配列番号81）。CDRループに該当する位置を囲ってある。 好ましい態様の詳細な説明 アルファ-2-抗プラスミン（α2AP）は肺塞栓症患者における血栓耐性の分子媒 介物質である。フィブリン溶解の調節にα2Apが果たす役割を決定するために使 用されるα2APの特異的阻害剤について説明する。 Ａ．免疫分子 以下の説明では免疫学関係の当業者によく知られている種々の方法論に言及す る。免疫学の一般的原理を述べた標準的な参考文献には、Klein,J.,Immunology: The Science of Cell-Noncell Discrimination,John Wiley & Sons社（ニューヨ ーク；1982）、Kennett,R.ら,Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimensi on in Biological Analyses,Plenum Press社（ニューヨーク；1980）、Campbell ,A著「Monoclonal Antibody Technology」（Laboratory Techniques in Biochem istry and Molecu1ar Biology，第13巻,Burdon,R.ら編,Elsevier社（アムステル ダム；1984）の一章）、Eisen,H.N.,Microbiology,第３版,Davis,B.D. ら,Harper & Row社（フィラデルフィア；1980)）がある。 本明細書で使用する用語「α2AP結合分子」は抗体（ポリクローナルまたはモ ノクローナル）ならびにリガンドを包含する。本明細書において「免疫分子」と は、モノクローナル抗体の結合領域を含んでなるポリペプチドを指す。したがっ てモノクローナル抗体、抗体断片、キメラ抗体、ヒト化抗体ならびに抗体結合領 域を含む融合タンパク質は「免疫分子」である。「抗体（Ab）」または「モノク ローナル抗体（MAb）」という用語は完全な分子ばかりでなく、α2APに特異的に 結合できる抗体断片（例えばFv、Fab、F(ab')₂断片など）、一本鎖抗原結合タン パク質、「ヒト化」抗体およびキメラ抗体をも包含するものとする。Fab断片とF (ab')₂断片は完全な抗体のFc断片を欠き、循環系からより迅速に消失し、完全な 抗体より低い非特異的組織結合性を持ちうる（Wahlら,J.Nucl.Med.24:316-325(1 983)）。したがってこれらの断片が好ましい。 ある抗体がある分子と特異的に反応することにより、その分子をその抗体に結 合させうる場合、その抗体はその分子を「結合できる」という。本明細書におい て「ハプテン」という用語は、抗体によって結合されうる任意の分子を指すもの とする。用語「エピトープ」は、ハプテンのうち抗体によって認識および結合さ れうる部分を指すものとする。ハプテンまたは抗原は１つのエピトープまたは２ つ以上のエピトープを持ちうる。「抗原」または「免疫原」とは、動物にその抗 原のエピトープに結合できる抗体を産生させる能力をも持つハプテンである。上 に述べた特異的反応とは、そのハプテンが高度に選択的な様式で対応する抗体と 反応し、かつ、他の抗原によって誘発されうるその他多数の抗体とは反応しない ことを示すものとする。 本発明の抗体は様々な方法のいずれでも製造できる。α2APを結合できるポリ クローナル抗体を含む血清の産生を誘導するには、例えばα2APを発現する細胞 （またはその画分、溶解液など）を動物に投与すればよい。好ましい方法として 、本発明のα2AP製剤は、天然の夾雑物を実質上含まないように製造および精製 される。次に、より比活性の高いポリクローナル抗血清を生産するべく、そのよ うな製剤を動物に導入する。 本発明の抗体はファージディスプレイ技術でも製造できる。ファージディスプ レイを用いた抗体製造法は当技術分野で知られている。例えば米国特許第5,565, 332号、Clarksonら,Nature 352:624-628(1991)、Huse,Science 246:1275-1281(1 989)、Kang,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:11120-11123(1993)、Marks，J.Mol.Bio l.222:581-597(1991)、McCaffertyら，Nature 348:552-554(1990)を参照された い。 好ましい一方法として、本発明の免疫原分子はモノクローナル抗体（またはα 2AP結合分子）である。そのようなモノクローナル抗体はハイブリドーマ技術を 使って製造できる（Kohlerら,Nature 256:495(1975);Kohlerら,Eur.J.Immunol.6 :551(1976);Kohlerら，Eur.J.Immunol．6:292(1976);Hammerhlingら,Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas,Elsevier社(ニューヨーク)の563-681頁（1 981））。一般にそれらの方法では動物（好ましくはマウス）を抗原または抗原 を発現する細胞で免疫する。好ましい抗原は精製α2APである。最も好ましい抗 原は、血漿凝塊をトリプシン消化した後、セファロースに結合したモノクローナ ル抗体RWR（Reed,G.L.IIIら，Trans.Assoc.Am.Phys.101:250-256(1988);米国特 許第5,373,812号(1994年12月13日発行)）でアフニティー精製したα2AP断片（フ ィブリン結合領域）である。好適な細胞は抗α2AP抗体を分泌するその能力によ って認識できる。そのような細胞は任意の適当な組織培養培地で培養できるが、 10％牛胎仔血清（約56℃で非働化）と約10μｇ/mlの非必須アミノ酸、約1000U/m lのペニシリンおよび約100μｇ/mlのストレプトマイシンを添加したアール改変 イーグル培地で細胞を培養することが好ましい。上記マウスの脾細胞を摘出し、 適当な骨髄腫細胞株と融合する。体細胞融合の方法はGalfre,G.およびMilstein, C.,Meth.Enzymol.73:3-46(1981)に記述されている。融合後、得られたハイブリ ドーマ細胞をHAT培地で選択的に維持し、Wandsら,Gastroenterology 80:225-232 (1981)に記述されているように限界希釈法でクローン化する。次に、そのような 選択によって得られたハイブリドーマ細胞をアッセイすることにより、α2APを 結合できる抗体を分泌するクローンを同定する。 また、α2AP抗原に結合できるさらなる抗体を、抗イディオタイプ抗体を使っ た二段階法で製造することもできる。この方法では、抗体自体が抗原であり、そ れゆえ別の抗体に結合する抗体を得ることができるという事実を利用する。この 方法ではα2AP特異抗体を使って動物（好ましくはマウス）を免疫する。次にそ のような動物の脾細胞を使ってハイブリドーマ細胞を作成し、そのハイブリドー マ細胞をスクリ−ニングすることにより、α2AP特異抗体に結合するというその 能力をα2AP抗原によって遮断しうる抗体を産生するクローンを同定する。この ような抗体はα2AP特異抗体に対する抗イディオタイプ抗体からなり、これを使 って動物を免疫することにより、さらなるα2AP特異抗体の形成を誘導できる。 本発明抗体のFab断片、F(ab')₂断片およびその他の断片を、ここに開示する方 法に従って使用できることは理解されるだろう。このような断片は通例、パパイ ン（Fab断片を製造する場合）やペプシン（F(ab')₂断片を製造する場合）などの 酵素を使ったタンパク質分解的切断によって生産される。また、α2AP結合性断 片は、組換えDNA技術の適用や、合成化学もしくはビオチニル化でも生産できる 。 上述のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得られる遺伝子 構築物を用いて製造されるヒト化抗体またはキメラ抗体も、本発明の範囲に含ま れるものとする。ヒト化抗体はネズミ抗体のフレームワーク領域やその他の領域 が非ネズミ抗体の相同領域で置換された抗体である。キメラ抗体はネズミ定常領 域が非ネズミ定常領域で置換されている抗体である。キメラ抗体の製造法は当技 術分野で知られている。総説としてはMorrison,Science,229:1202-1207(1985)や Oiら,BioTechniques 4:214(1986)を参照されたい。またCabillyらの米国特許第4 ,816,567号（1989年３月28日）、TaniguchiらのEP171496(1986年２月19日)、Mor risonらのEP173494(1986年３月５日)、NeubergerらのWO8601533(1986年３月13日 )、RobinsonらのWO8702671(1987年５月７日)、Boulianneら,Nature 312:643-646 (1984)、Neubergerら,Nature 314:268.270(1985)も参照されたい。ヒト化抗体の 製造法は当技術分野で知られている。例えば米国特許第5,585,089号、Jonesら,N ature 321:522-525(1986)、Ketdeboroughら,Protein Engineering 4:773-783(19 91)を参照されたい。 本発明では（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２）ヒト およびヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できる一本鎖 抗体も提供される。一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野でよく知られている 。例えば米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,51 3号、米国特許第5,455,030号を参照されたい（これら特許はすべて参考文献とし て本明細書の一部を構成する）。 また上記モノクローナル抗体の変種も本発明の範囲に含まれるものとする。 本発明者らは、（１）ヒトおよびヒト以外の循環α2-抗プラスミン類と（２） ヒトおよびヒト以外のフィブリン架橋α2-抗プラスミン類の両方に結合できる数 種類の免疫分子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を決定した。したがって本発 明は、本発明の免疫分子またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含んで なる核酸分子を提供する。 遺伝コードの縮重と遺伝コードが既知であるという事実から、本発明のヌクレ オチドと同じアミノ酸配列をコードする他のヌクレオチド配列はすべて決定でき 、それらは本発明の実施に使用できる。 次に挙げる抗体鎖をコードするヌクレオチド配列を含有するDNAクローンは199 7年９月19日にアメリカンタイプカノレチャーコレクション（20862メリーランド 州ロックビル・パークローンドライブ1230）に寄託された：77A3の軽鎖（77A3LC ），ATCC受託番号 ；49C9の軽鎖（49C9LC），ATCC受託番号 ；70B11 の軽鎖（70B11LC），ATCC受託番号 ；77A3の重鎖（77A3HC），ATCC受託番 号 ；49C9の重鎖（49C9HC），ATCC受託番号 ；70B11の重鎖（70B11HC ），ＡTCC受託番号209288。 本発明の核酸分子には次に挙げるものが含まれる：配列番号９に示すまたはAT CC受託番号 に含まれるクローンによってコードされる77A3の成熟軽鎖を コードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子；配列番号５に示すまたはATCC 受託番号 に含まれるクローンによってコードされる49C9の成熟軽鎖を コードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子；配列番号７に示すまたはATCC 受託番号209292に含まれるクローンによってコードされる70B11の成熟軽鎖をコ ードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子。 また抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子、例えば配列 番号15に示すまたはATCC受託番号 に含まれるクローンによってコー ドされる77A3の成熟重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子、配 列番号11に示すまたはATCC受託番号 に含まれるクローンによってコード される49C9の成熟重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子、配列 番号13に示すまたはATCC受託番号 に含まれるクローンによってコードさ れる70B11の成熟重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子なども 本発明に包含される。 またヒト化抗体をコードする核酸分子、例えば配列番号17のアミノ酸残基1〜1 07をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号19のアミノ酸 残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号21の アミノ酸残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子なども 包含される。 また抗体の重鎖および軽鎖の「コンセンサス（共通）」アミノ酸配列をコード する核酸分子、例えば配列番号75のアミノ酸残基1〜107をコードするヌクレオチ ド配列を含んでなる核酸分子、配列番号76のアミノ酸残基1〜107をコードするヌ クレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号77のアミノ酸残基1〜107をコー ドするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号78のアミノ酸残基1〜1 19をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号79のアミノ酸 残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号80の アミノ酸残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列 番号81のアミノ酸残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分 子なども本発明の範囲に含まれるものとする。 本発明の免疫分子をコードする核酸分子は組換えタンパク質を発現させるため に使用できる。本発明の免疫分子をコードする核酸分子は従来の技術に従ってベ クターに挿入できる。「ベクター」とは目的の配列を宿主内でクローニングまた は発現させるために使用される核酸伝達手段であると解釈すべきである。 一態様として、本組換えベクターは本発明の免疫分子を発現することができる 。あるベクターがあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共に、その ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写および 翻訳調節因子情報を含有する場合、そのベクターはそのポリペプチドを「発現す る ことができる」という。２つのヌクレオチド配列は、その２つのヌクレオチド配 列間の連係の性質がフレームシフト突然変異の導入をもたらさず、目的の配列の 転写を指示するというそのプロモーター領域配列の能力を妨げず、またはそのプ ロモーター領域配列によって転写されるという目的配列の能力を妨げないのであ れば、「作動可能に連結」しているという。したがってプロモーター領域は、そ のプロモーターが目的のヌクレオチド配列の転写を達成できるのであれば、その ヌクレオチド配列に作動可能に連結していることになる。 組換えベクターを構築したら、トランスフェクション、形質導入、エレクトロ ポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、マイクロインジェクションなどといっ た種々の従来技術によって、それを原核または真核宿主細胞に導入できる。原核 宿主には大腸菌、バチルス、ストレプトマイセス、サルモネラなどの細菌がある 。最も好ましい原核宿主は大腸菌である。真核宿主には酵母細胞、昆虫細胞、哺 乳類細胞（COS細胞、CHO細胞、骨髄腫細胞など）がある。本発明の一態様として 、CHO細胞が好ましい。 本発明の一態様として、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含んでな る核酸分子をあるベクターに導入し、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列 を含んでなる核酸分子をもうひとつのベクターに導入する。両ベクターを同じ宿 主細胞に導入する。別法として、両鎖を同じベクターに導入してもよい。 適当な宿主での発現の後、そのポリペプチドはアフィニティークロマトグラフ ィーなどの標準的技術を使って容易に単離できる。 また、ここに記述する免疫分子の結合領域のアミノ酸配列を含んでなる分子も 本発明の範囲に包含されるものとする。ここに記述する免疫分子の結合領域のア ミノ酸配列を含んでなる分子としてはモノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ 抗体、それら抗体の断片、一本鎖抗体、融合タンパク質などが挙げられるが、こ れらに限るわけではない。そのような分子は後述する本発明のアッセイと治療法 に使用できる。 本発明免疫分子の結合領域のアミノ酸配列を、軽鎖については図21に、重鎖に ついては図22に示す。図21には、h77A3-1とh77A3-2（配列番号17のアミノ酸残基 24〜34、50〜56および89〜97）、m77A3（配列番号９のアミノ酸残基 24〜34、50〜56および89〜97）、m44C9（配列番号５のアミノ酸残基24〜34、50 〜56および89〜97）、m70B11（配列番号７のアミノ酸残基24〜34、50〜56および 89〜97）、ネズミコンセンサス（配列番号75のアミノ酸残基24〜34、50〜56およ び89〜97）、77A3/49C9コンセンサス（配列番号76のアミノ酸残基24〜34、50〜5 6および89〜97）および全軽鎖のコンセンサス（配列番号77のアミノ酸残基24〜3 4、50〜56および89〜97）の軽鎖結合領域のアミノ酸配列が大きい方の枠内に示 してある。 図22には、h77A3-1(配列番号19のアミノ酸残基26〜35、50〜66および99〜108) 、h77A3-2(配列番号21のアミノ酸残基26〜35、50〜66および99〜108)、m77A3(配 列番号15のアミノ酸残基26〜35、50〜66および99〜108)、m49C9（配列番号11の アミノ酸残基26〜35、50〜66および99〜108）、m70B11（配列番号13のアミノ酸 残基26〜35、50〜66および99〜108）、ヒト化コンセンサス（配列番号78のアミ ノ酸残基26〜35、50〜66および99〜108）、ネズミコンセンサス（配列番号79の アミノ酸残基26〜35、50〜66および99〜108）、77A3/49C9コンセンサス（配列番 号80のアミノ酸残基26〜35、50〜66および99〜108）および全重鎖のコンセンサ ス（配列番号81のアミノ酸残基26〜35、50〜66および99〜108）の重鎖結合領域 のアミノ酸配列が一部重なった枠内に示してある。 Ｂ．アッセイ 免疫ブロットの方法は当該技術分野において公知である(例えば、リード（Ree d，G．L.）ら、Immunol．150:4407-4415(1993))。好ましい方法において、該α ２ＡＰをスラブミニゲル上で、還元条件下および非還元条件下で電気泳動する。 該ゲルをポリビニリデンジフルオリド膜に電気泳動的転写する。該ブロットをミ ニブロッター装置のチャンネル内で異なるハイブリドーマ上清にさらす。洗浄後 、結合した抗体を¹²⁵Ｉ−ヤギ抗マウス抗体とインキュベートすることにより検 出する。さらに洗浄した後、該膜をホスホルイメージャー（phosphorimager）（ モレキュラー・デバイシズ（Molecular Devices）、サニーベイル（Sunnyvale） 、カリフォルニア）中で露光する。 ラジオイムノアッセイの方法もまた公知である。例えば、マイクロタイタープ レートのウェルをヤギ抗マウス抗体でコートする。該ウェルを洗浄し、ＢＳＡで 停止させる。該ハイブリドーマ上清を空のウェルに加える。インキュベート後、 該ウェルを洗浄し、ついで¹²⁵Ｉ−α２ＡＰを加える。洗浄後、該ウェルを切り 出し、ついで結合抗体をγシンチレーションカウンターによって測定した。競合 アッセイに関して，マイクロタイタープレートのウェルを競合するＭＡｂでコー トする。好ましい態様において、ＭＡｂの¹²⁵Ｉ−α２ＡＰへの結合（好ましく は、α２ＡＰのフィブリン結合領域断片でありＲＷＲに結合することによって得 られる）を逆固相ラジオイムノアッセイによってアッセイする。 クロットアッセイ（clot assay）の方法もまた公知である(例えば、リードら 、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1114-1118(1990)参照)。好ましい態様におい て、血漿を¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲンと混合し、ついでCaCl₂およびトロンビンと 混合することによって凝血させる。血塊に加圧し、トリス−緩衝食塩水で洗浄し 、未結合タンパク質を除去する。該上清を除去し、該凝塊をγカウンターで測定 する。二個ずつの凝塊の各組を多様な量のプラスミノーゲンアクチベーター、抗 凝血剤およびＭＡｂを含むか、またはＭＡｂを含まないトリス−緩衝食塩水に加 える。該凝塊をインキュベートし、ついで多様な間隔で該溶液の一部を一次的に 取り、γカウンターにより溶解量を決定した。溶解のパーセンテージを１００Ｘ にて定義する（総上清ｃｐｍ／総凝型塊ｃｐｍ）。 フィブリノーゲンアッセイは公知である。血液サンプルおよび低血小板血漿を フィブリノーゲンについて、例えば、ナトリウムサイファイト法(ランプリング （Rampling，N．W.）およびガフィニー（Gaffiney，P.J.）、Clin．Chim．Acta. 67:43-52(1976))によってアッセイする。 血漿中のα−２−抗プラスミンレベルを例えば、リードら、Proc．Natl．Acad .Sci．USA 87:1114−1118(1990))に記載されるようにプラスミン阻害のための色 素原基質(chromogenic substrate)アッセイ（スタクロムキット（Stachrom kit ）などでアッセイする。 統計学的検定を例えば、多重比較試験に関するボンフェロニーダン（Bonferri ni-Dunn）手法によって、一種の分散分析などにより分析してよい。 イン・ビボにおける肺塞栓実験を以下の実施例２に記載する。 Ｃ．処置方法 「患者」なる語は、ヒトまたはヒトの他の動物を意図する。ヒトの他の動物に は、例えば、ヒヒ、ミドリザル、イヌ、カニクイザル、マーモセット、フェレッ ト、モルモットおよびアレチネズミが挙げられる。 「凝塊」なる語は、イン・ビトロの血液またはフィブリン凝塊または患者の「 血栓形成(thrombi)」を意図する。本発明の方法により処置される疾患には、以 下に限るものではないが、肺塞栓；不安定性狭心症および非−Q波心筋梗塞を含 む急性冠動脈症候群；静脈性血栓症（例えば、深部静脈血栓など）および動脈性 血栓症（例えば、腎血栓、腸間膜および手足血栓など）を含む多様な血栓形成； 脳血栓症および血栓形成症；腎静脈および末梢動脈血栓、心筋梗塞、脳卒中およ び他の血栓症を含む。本方法はまた、経皮経管冠動脈形成、末梢動脈形成、バイ パス移植およびステント形成術を含む外科手術の二次的に起こる、または同血栓 症の状態を処置するためにも使用され得る。「処置する」または「処置」なる語 は、例えば、血栓を溶解するかまたはフィブリン溶解を増強することによって血 栓の形成を阻害することをいう。 「同時投与」なる語は、ハプテン結合分子の各々および血栓溶解剤が薬理学的 に活性である時期が重複する時間枠の間に投与されることを意図する。二つの薬 剤が同時にまたは連続して投与されるであろう。 本発明のα２ＡＰ結合分子はモノクローナル抗体またはその断片であってよい 。免疫グロブリンのFc部位によって引き起こされる免疫応答を最小限にするため に、本目的のための抗体のようなF(ab')₂断片を使用することは好ましい。ｓＦ ｖなどの単鎖抗体も好ましい。モノクローナル抗体を調製する方法は、カプロウ スキ（Kaprowski,H.）ら、米国特許第４,１７２,１２４号およびコーラー（Kohl er）ら、Nature256：495-497(1975))によって開示されている。プラスミンの阻 害を妨害することができるモノクローナル抗体の調製は、ミムロ（Mimuro,J.） ら、Blood 69:446-453(1987))によって教示され、本願の実施例に記載されてい る。 「抗原」なる語は、例えばα２ＡＰなどの抗体によって結合されることができ る分子をいう。本発明により使用されるため、「抗原結合分子」はプラスミンイ ンヒビターに結合することができなければならず、それによってインヒビターが インヒビター−プラスミン複合体を形成することを避ける。そのような抗原結合 分子のような任意の分子は本発明により使用されてよい。好ましい態様は、α２ ＡＰまたはその断片に結合することができるα２ＡＰ−結合分子である。本目的 のため特に好ましいα２ＡＰ結合分子は、モノクローナル抗体である。モノクロ ーナル抗体の好ましい態様は、以下により詳細に記載するが、７７Ａ３、７０Ｂ １１または４９Ｃ９である。ＭＡｂ ７７Ａ３を製造するハイブリドーマをブダ ペスト条約の権限の下国際寄託機関であるアメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクション、アメリカ合衆国２０８５２メリーランド州、ロックビル、パークロ ーン・ドライブ１２３０１番に１９９６年９月２０日に寄託した；ＡＴＣＣ受託 番号はＨＢ−１２１９２号である。 また好ましい態様は、キメラ抗体およびヒト化抗体である。この目的のため特 に好ましいキメラ抗体は、ｃ７７Ａ３であり、以下により詳細に記載する。この 目的のため特に好ましいヒト化抗体はｈ７７Ａ３−１およびｈ７７Ａ３−２であ り、以下により詳細に記載する。特に好ましい抗体断片および単鎖抗体には、以 下に記載するｓＦｖ７７Ａ３−１およびｓＦｖ７７Ａ３−２が挙げられる。 「血栓溶解剤」なる語は、フィブリンおよび／または血小板凝塊（または血栓 ）を溶解するか、またはそのような凝塊の形成を阻害することができる任意の 薬剤を意図する。血栓溶解剤の例には、プラスミン、プラスミノーゲンアクチベ ーター（例えば、スタフィロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、プロウロキナーゼ 、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲンアクチベーターおよびチスイコウモリプ ラスミノーゲンアクチベーターなど）；抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ヒルジン および活性型プロテインＣなどのフィブリン形成阻害剤）；および例えばチクロ ピジン、アスピリンおよびクロピディグレル（clopidigrel）などの抗血小板剤 および糖タンパク質IIb/IIIa機能の阻害剤などの）が挙げられる。これら目的の ためのｔ−ＰＡ使用は特に好ましい。天然のｔ−ＰＡも使用することができるが 、組換えｔ−ＰＡ（rｔ−ｐＡ）を使用するのが好ましい。本発明は、さらに上 記血栓溶解剤のハイブリッド、生理学的に活性な断片または変異形態を使用する であろう。例えば、本明細書で使用する「組織プラスミノーゲンアクチベーター 」なる語は、そのようなハイブリッド、断片および変異体ならびに天然に存在す るおよび組換えによって得られる組織プラスミノーゲンアクチベーターの両者を 含むと意図する。 上述のように、本発明の方法は、α２ＡＰ結合分子単独または血栓溶解剤と組 み合わせての投与を含む。単独で投与される場合、該分子は内在性のプラスミノ ーゲンアクチベーターによる凝塊の溶解の有意な増加により、内在的にフィブリ ン溶解または血栓溶解を高める。さらに、α２ＡＰ結合分子の投与は、ｔ−ＰＡ 単独の投与量と同量で得られるフィブリノーゲンの消費を増加しない。従って、 α２ＡＰの凝塊特異的な阻害の本方法は、該プラスミノーゲンアクチベーターの 有効性を増強し、かつそのフィブリン選択性を保持する。 別法として、該α２ＡＰ結合分子は血栓溶解剤とともに投与される。この態様 において、該α２ＡＰ結合分子および本発明の血栓溶解剤は受容者に同時投与さ れることを意図している。血栓溶解剤の投与の前に患者に該α２ＡＰ結合分子を 提供することは好ましい。 本発明のα２ＡＰ結合分子は、プラスミンインヒビターによってプラスミンの 阻害を妨害する目的で使用される。血栓溶解剤と該α２ＡＰ結合分子を同時投与 すると共同性効果を引き起こし、それによってα２ＡＰ結合分子および血栓溶解 剤の効果が単に添加される時に期待されるより、多大な程度、凝塊の溶解（血栓 溶解）を増やす。 本発明のα２ＡＰ結合分子にはα２ＡＰの凝塊特異的インヒビターを含む。ｔ −ＰＡおよび該特異的インヒビター、特にα２ＡＰに対するモノクローナル抗体 の組み合わせにより、プラスミノーゲンアクチベーター単独の投与量と同等効果 で得られるフィブリンの消費を増加しないことが証明されている。さらに、α２ ＡＰの凝固特異的阻害はプラスミノーゲンアクチベーターの有効性を増加し、か つフィブリン選択性を妨害する。そのような薬剤、例えばフィブリン選択性では ないウロキナーゼに関して、血塊結合性α２ＡＰの阻害は、同様またはそれより 深遠なる有効性を増強し、ならびにフィブリンの消費を少なくする。 従って、血塊結合性α２ＡＰの阻害は内在性のプラスミノーゲンアクチベータ ーによる凝固溶解を増強する。さらに、血栓溶解剤と組み合わせて投与される場 合、血栓溶解は血栓溶解剤単独で投与される量によって達成される溶解に比較し て有意に増大する。血栓溶解剤およびα２ＡＰインヒビターの組み合わせによっ て増加した溶解は、循環するフィブリンまたはα２ＡＰレベルの低下なしに起こ る。正味結果は２つの薬剤の間の共同相互作用である。単独で使用される場合、 プラスミンの阻害を妨害することができるα２ＡＰ結合分子および患者に提供さ れる場合、それによって増強される凝塊溶解は「治療上有効な」量である。凝塊 溶解および凝塊の再形成を妨害するために、患者体重１kg当たり３〜３００ナノ モル間のα２AP結合分子を提供するのは望ましい。１態様において、６０〜４８ ０分かけて０．００６〜５ナノモル／kg／分の速度での持続的な静脈注射によっ てこの用量が投与されるであろう。別法として、該α２ＡＰ結合分子を３〜６０ ０ナノモル／kg、最も好ましくは患者体重１kg当たり（α２ＡＰ結合分子）３０ 〜６０ナノモル間の用量で静脈注入可能な丸剤にて提供することも可能である。 該α２ＡＰ結合分子がこの方法にて投与されると、１つの丸剤で潜在的な凝塊の 再形成を妨害するのに十分である。本発明のα２ＡＰ結合分子は注入可能な丸剤 を調製するために任意の生理学的に耐性のある液体に溶解することができる。生 理食塩水中で該α２ＡＰ結合分子を溶解することによってそのような丸剤を調製 することが好ましい。 プラスミンの阻害を妨害することができるα２ＡＰ結合分子が血栓溶解剤と同 時に投与される場合、患者体重１kg当たり３〜３００ナノモル間のα２AP結合分 子を提供するのは望ましい。１態様において、６０〜４８０分かけて持続的な静 脈注射によってこの用量が投与されるであろう。別法として、該α２ＡＰ結合分 子を３〜６００ナノモル／kg、最も好ましくは、患者体重１kg当たり（α２ＡＰ 結合分子）３０〜６０ナノモル間の用量で静脈注入可能な丸剤にて提供すること も可能である。そのような溶解を引き起こすことができる血栓溶解剤の量を「治 療上有効な」量という。患者体重１kg当たり０.０１〜３.０mg間を提供するのが 望ましい。１態様において、該血栓溶解剤は延長された時間（すなわち約１８０ 〜約１４４０分）かけて提供される。好ましい態様において、本発明の血栓溶解 剤は０.５〜１.０mg／kgおよび最も好ましくは０.５〜０.７５mg／kgを含む静脈 注入丸剤を提供する。例えば、肺塞栓については、持続注入によるｔ−ＰＡの用 量は２時間で、〜１００mgである(ゴールドハーバー（Goldhaber，S.C.）ら、La ncet 341:507(1993))。本発明で使用する血栓溶解剤の用量は、一般的に当該技 術分野において公知である（例えば、Hemolysis and Thrombosis:Basic Princip ales and Clinical Practice、第３版、フィラデルフィア、ペンシルバニア（１ ９９４）参照）。 本発明の血栓溶解剤は、注入可能な丸剤を調製するために、任意の生理学的に 耐性のある液体中で溶解されるであろう。しかしながら、生理学的食塩水中で血 栓溶解剤を溶解することによってそのような丸剤を調製することが望ましい。 従って、好ましい態様によって処置される患者は血栓溶解剤の静脈注入可能な 丸剤と組み合わせてα２ＡＰ結合分子の静脈注入可能な丸剤を受けるであろう。 この好ましい処置は血栓溶解に必要とするｔ−ＰＡの量を最少化し、従って、フ ィブリンの破壊の程度を低減し、かつ一般的溶血傾向を減少させる。重要なこと には、好ましい処置の使用は、該α２ＡＰ結合分子または血栓溶解剤が注入単独 で提供される場合の血栓溶解の速度をはるかに超える速度で閉塞している血栓を 溶解する結果となる。さらに、再閉塞の危険は実質的に減少する。 フィブリン溶解の以前のモデル（３）において、α２ＡＰに課された主たる役 割は循環するプラスミンを不活性化し、かつ全身性溶解状態を妨害することであ る。従って、α２ＡＰインヒビターがフィブリン溶解なしに凝固の溶解を増加す ることができるのは驚くべきことである。α２ＡＰインヒビターによる血栓溶解 の顕著な拡充は、フィブリン溶解を調節することにおけるフィブリン結合α２Ａ Ｐの重要性を強調する。患者の抗体は、ｔ−ＰＡなどのフィブリン選択性の薬剤 ならびに非選択性のウロキナーゼおよびストレプトキナーゼなどのアクチベータ ーにより凝塊の溶解を増大し、フィブリン結合α２ＡＰは、任意の外在性のプラ スミノーゲンアクチベーターによる溶解の割合を決定するのに重要な役割を果た していることと思われる。 これらの予期されない発見は、以前は出血傾向の増加無しでは凝血溶解の速度 を増加させることが不可能であったため、重要である。好ましい態様は、従って 、血栓溶解剤の丸薬の投与と組み合わせたα2AP−結合分子の丸薬の投与が、そ れぞれの化合物を単独で投与したときに得ることができるのと比べて、速い速度 で閉塞血栓を溶解することができる、処置法を提供する。更に、好ましい態様は 、フィブリノーゲン破壊および再閉塞の両方の危険性を小さくして、この目的を 達成する。従って、薬剤の組み合わせは、血栓溶解治療の可能性および特性を有 意に増加させる。 当業者には明白なように、抗−α2AP結合分子または血栓溶解剤の必要な投与 量は、患者の病気の重症度に、そして患者の身長、体重、性別、年齢および病歴 のような基準に依存する。 本発明のα2AP−結合分子または血栓溶解剤は、製薬学的に許容される担体媒 体との混合のような、製薬学的に有用な組成物の製造の既知の方法に従って調剤 できる。適当な媒体およびそれらの調剤は、例えば、Remington'ｓPharmaceutic al Sciences，16th Ed.，Osol，A.，ed.，Mack，Easton PA（1980）に記載され ている。有効な投与に適した製薬学的に許容される組成物を形成するために、こ のような組成物は、有効な量のα2AP−結合分子または血栓溶解剤を、単独で、 または適当な量の担体媒体と共に含む。 更なる製薬法を使用して、作用持続時間をコントロールし得る。コントロール された放出製剤は、本発明のα2AP−結合分子または血栓溶解剤と複合体形成す るためまたはそれらを吸着するためのポリマーの使用により達成され得る。コン トロールされた送達は、適当な巨大分子(例えば、ポリエステル、ポリアミノ酸 、 ポリビニルピロリドン、エチレンビニル酢酸、メチルセルロース、カルボキシメ チルセルロースまたは硫酸プロタミン)の選択により行い得る。医薬放出の速度 は、このような巨大分子の濃度を変えることによりまたコントロールし得る。作 用持続時間のコントロールのための他の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミ ノ酸、ヒドロゲル、ポリ(乳酸)またはエチレンビリル酢酸コポリマーのような重 合物質の粒子への治療剤の包含を含む。あるいは、例えば、コアセルベーション 法または界面重合により、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたは ゼラチンミクロカプセルまたはポリ(メチルメタクリル酸)ミクロカプセルを使用 して製造したマイクロカプセルに、またはコロイド医薬送達系、例えば、リポソ ーム、アルブミンミクロスフェア、ナノ粒子、ナノカプセルに、またはマクロエ マルジョンに治療剤を包含させることが可能である。このような教示は、Reming ton's Pharmaceutical Sciences，16th Ed.，Osol，A.，ed.，Mack,Easton PA（ 1980）に記載されている。 血栓溶解剤またはα2AP−結合分子は、当分野で既知の手段により患者に投与 し得る。挿入のこのような手段は、経口手段、経鼻手段、皮下手段、筋肉内手段 、静脈内手段、動脈内手段または非経口手段を含む。肺動脈塞栓症、心筋梗塞、 血栓症または脳卒中の処置の好ましい一つの方法において、患者は０.５から１. ０mg／kgの間の血栓溶解剤を含む丸薬(静脈内注射された)を投与される。 一般に、本明細書に記載の結果は、阻害剤、特にモノクローナル抗体が、その 酵素の阻害剤を中和することにより触媒的機能を増加させることに使用できるこ とを証明する。この実験は、阻害剤により密接に支配される生理学的方法に適用 できる。凝血が、酵素(一般的にセリンプロテアーゼ)の作用が阻害剤の作用に競 合する精巧にバランスの取れたシステムであるため、しばしば凝血におけるセル ピン(セリンプロテアーゼ阻害剤)病理学的変化が、酵素活性の増加または阻害剤 の中和により処置できる。 本発明を一般的に記載したが、それは、説明の目的で包含させるのであって、 限定させる意図はないある具体的実施例を参考にして、より理解される。 実施例１ α−２−アンチプラスミンを指向する抗体の製造 Ａ．モノクローナル抗体製造、精製および特徴付け ２匹のBalb/Cマウスを、ヒト凝固血漿のトリプシン消化由来の精製ヒトα2AP フラグメント２５μｇで皮下的に免疫化した。α2APフラグメントは、SEPHAROSE 結合モノクローナル抗体であるRWR(Reed，G．L．III et al.，Trans．Assoc．Am .Phys．101:250-256(1988);１９９４年１２月１３日公開の米国特許第５,３７２ ,８１２号)で、ヒトα2APに対して親和性精製した。マウスを最初に完全フロイ ンドアジュバントで免疫化し、不完全フロイドアジュバント中のα2APフラグメ ント５０μｇで９０日後に追加免疫した。抗血清力価を固相放射免疫アッセイ(R eed,G．L．III et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1114-1118(1990))で、 マイクロタイターウェルに固定化されたα2APで試験した。融合４日前、α2APの 最高力価のマウスをα2AP １００μｇで腹腔内で過剰免疫化した。体細胞融合 は記載のように行った(Galfre，G.およびMistein，C.，Meth．Enzymol．73:3-46 (1981))。 ハイブリドーマの、α2APフラグメントに対する抗体の産生およびα2APを阻害 する能力を、Reed，G．L．III et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1114-1 118(1990)に記載のように試験した。モノクローナル抗体(MAbs)の¹²⁵Ｉ−α2AP への結合を、固相放射免疫アッセイで試験した。マイクロタイタープレートのウ ェルをヤギ抗マウス抗体(２５μｌ、５μｇ／ml)で２時間コートした。ウェルを 濯ぎ、非特異的タンパク質結合部位を、トリス緩衝化食塩水、ｐＨ７．４中の１ ％ウシ血清アルブミンで１時間ブロックした。洗浄後、ハイブリドーマ上清２５ μｌをウェルに添加し、１時間インキュベートした。ウェルを濯ぎ、¹²⁵Ｉ−α2 AP(２５μｌ、６０,０００cpm)を１時間添加した。¹²⁵Ｉ−α2APを次いで除去し 、ウェルを濯ぎ、ガンマ計数した。 クローン化ハイブリドーマ(限定希釈)をプリスタン初回刺激Balb/Cマウスの腹 水に拡大した。抗体を濾過腹水から、４０％硫酸アンモニウムで沈殿し、１０ｍ Ｍ ＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ７.２で透析し、そしてDEAE-AFFIGEL BLUESEPHALOSE(BioR ad，Hercules，CA)で０から１００ｍＭ ＮａＣｌの直線勾配でイオン交換クロ マトグラフィーを行い、精製した。 Ｂ．イムノブロット これは、主にReed，G．L．et al.，J．Immunol．150:4407-415(1993)に記載の ように行った。精製ヒトα2AP(５μｇ、American Diagnostica，Greenwich,CT) を、１２％スラブミニゲル(BioRad，Hercules，CA)で、大きな１サンプルレーン で、還元および非還元条件下で電気泳動した。サンプルを、ポリビニリデンジフ ロライド膜(Millipore，Bedford，MA)にエレクトロブロット(Kyhse-Anderson，1 084)し、非特異的結合部位を５％乾燥乳でブロックした。ブロットを異なるハイ ブリドーマ上清に、１時間、ミニブロッター装置(Immunetics,Cambridge，MA)の 溝中で曝した。洗浄後、結合抗体を、¹²⁵Ｉ−ヤギ抗マウス抗体(１５０万cpm／ 膜)とインキュベートすることにより検出した。更なる洗浄後、膜をホスホロイ メージャー(Molecular Devices，Synnyvale，CA)に曝した。 Ｃ．放射免疫アッセイ マイクロタイタープレートのウェルをヤギ抗マウス抗体(２５μｌ、５μｌ／m l)で２時間、２１℃でコートした。それを洗浄し、１％ＢＳＡ（ウシアルブミン 血清）で１時間ブロックした。空のウェルに、２つづつ、ハイブリドーマ上清２ ５μｌを添加した。１時間インキュベーション後、ウェルを洗浄し、¹²⁵Ｉ−α2 APを、更に１時間ウェルに添加した。洗浄後、ウェルを切断し、結合抗体をガン マシンチレーションカウンターで計数した。 競合放射免疫アッセイを、マイクロタイタープレートのウェルを精製 MAb(70B11)２５μｌで２つづつ(１０μｇ／ml)１時間コートして行った。ウェル を洗浄し、１％ＢＳＡで１時間ブロックした。洗浄後、競合MAb、同じMAbまたは ネガティブコントロールMAb２５μｌを異なるウェル(５０μｇ／ml)に、続いて^{1 25} Ｉ−α２−アンチプラスミン(１００，０００cpm)を添加した。１時間のイン キュベーション後、ウェルを洗浄し、切断し、放射活性をガンマシンチレーショ ンカウンターで計数した。 Ｄ．凝固血漿溶解アッセイ これは、主にReed，G．L．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 87:1114-118 (1990)に記載のように行った。貯蔵新鮮凍結血漿を、マサチューセッツ・ジェネ ラル・ホスピタル・ブラッド・バンクの無作為の５名のドナーから得た。血漿を¹²⁵ Ｉ−フィブリノーゲンと混合し、〜１,０００cpm／μｌを達成した。血漿を １時間、３７℃で、１２×６５mm試験管中で、５０μｌをＣａＣｌ₂５０μｌ(最 終５ｍＭ)およびトロンビン(１Ｕ／ml)と混合することにより凝血させた。血塊 を圧縮し、トリス−緩衝化食塩水(ｐＨ７.４)１ｍｌで洗浄して非結合タンパク 質を除去した。上清を除去し、血塊をガンマカウンターで計数した。各セットの ２つの血塊に、種々の量のウロキナーゼ１００μｌ、１ｕ／mlのヒルジン含有貯 蔵血漿１００μｌおよびMAb ７μｇ(図４)または２１μｇ(図２１)含有またはMA bを含まないトリス緩衝化食塩水１００μｌを添加した。血塊を３７℃水浴に入 れ、種々の間隔で１００μｌの溶液を一時的に除去し、ガンマ計数して溶解の量 を測定した。溶解パーセントは、１００×(全上清cpm÷全血塊cpm)として定義し た。 Ｅ．結果 スクリーニングアッセイでα2AP機能を阻害するように見える３つのハイブリ ドーマを選択した。これらのMAbsの血清型は：49C9(Igγ2aK)、70B11(Igγ1K)お よび77A3(Igγ2aK)であった。図１は、逆相固相アッセイにおけるこれらのMAbs の¹²⁵Ｉ−α2APへの結合を比較する。元々のα2AP阻害剤RWRと比較した場合、こ れらのMAbsは大きい親和力で結合した。MAbsが同じエピトープに結合するかを測 定するために、競合アッセイを70B11に関して図２に示す。ネガティブコントロ ールと比較して、抗ジゴキシンMAb、RWRは固定化70B11への¹²⁵Ｉ−α2APの結合 に明白な阻害作用を示さなかった。比較して、70B11を競合剤として使用した場 合、予測されるように、固定化70B11への¹²⁵Ｉ−α2APの結合は完全に阻害され た。しかしながら、49C9および77A3はまた同様に優れた競合剤であった。これら のアッセイの結果は、表として下記表１に示す。MAbs 49C9、70B11、77A3はま た互いに¹²⁵Ｉ−α2APへの結合を完全に阻害したが、RWRの結合に阻害作用は示 さなかった。この逆もまた正しく、競合剤としてのRWRは他のMabsへの¹²⁵Ｉ−α 2APの結合に作用を示さなかった。これは、MAbs 49C9、70B11および77A3が同じ エピトープへの結合の競合をしているが、RWRはα2APの別の領域に結合するよう に見えることを示す。 MAbsがα2APの連続的または非連続的エピトープを認識するかを測定するため に、免疫ブロット実験を変性および還元α2APで行った。これらの実験において 、 RWRは、変性および還元α2APに良く結合し、SDSとの沸騰にもジスルフィド結合 の還元にも影響されないエピトープを認識することを示す。比較して、MAbs49C9 、70B11および77A3は変性α2APに結合せず、配座依存的エピトープを認識するこ とを示唆する。 血塊溶解アッセイを、ウロキナーゼによるフィブリン溶解を増幅するこれらの MAbsの相対的効果を試験するために行った。図３は、異なる精製MAbs ７μｇ( またはTBS単独)により達成された溶解の量をウロキナーゼの投与量の関数として 比較している。ウロキナーゼ単独(TBS)またはコントロール抗ジゴキシンMAbsを 伴うウロキナーゼと比較して、RWR、49C9、70B11および77A3は血塊溶解を総て加 速した。しかしながら、これらのアッセイで、49C9、70B11および77A3はRWRより も有意に強力であると見える。これらの抗体の一つで達成されたウロキナーゼの フィブリン溶解効果の効果を試験するために、用量反応実験をMab 77A3非存在 下または存在下で行った。図４は、Mab 77A3がおよそ１００倍までウロキナー ゼの溶解効果を明らかに増加させることを示す。 これらのMAbsの機能的およびエピトープ結合特異性を更に区別する手段として 、それらが、凝血血漿溶解アッセイにおける異なる動物種由来のα2APを阻害す る能力を試験した。異なる種の動物血漿試験において、RWRはヒトα2APのみを阻 害するように見えた。比較して、他のMAbsは広い種交差反応性およびほとんど総 ての霊長類およびある非霊長類α2APを阻害する能力を示した。 実施例２ 肺塞栓症のインビボ研究 Ａ．材料 材料は、下記の供給元から入手した：比活性５８０,０００ＩＵ/mgのrt−ＰＡ 、Genentech(South San Francisco，California)；ケタミン(１００mg/ml)、For t Dodge Laboratories(Fort Dodge，Iowa)；マレイン酸アセプロマジン、Fermen ta Animal Health Co．(Kansas City，MO)；ヘパリン(１０００Ｕ/ml)、Elkins- Sinn Inc．(Cherry Hill，NJ)；ヨウ化ナトリウム、Aldrich Chemical Co．(Mil waukee，WI)；塩化カルシウム、Mallinckrodt(Paris，Kentucky)；静注用の生理 食塩水、Travenol Laboratories(Deerfield，IL)；α２ＡＰアッセイキット、St achrom(Asnieres，France)；精製α２ＡＰおよびフィブリノーゲン、American D iagnostica(Greenwich，CT)；ヤギ抗マウス抗体、Cappel Organon Technika(Dur ham，NC)；無作為ドナーからプールしたヒト血漿、Massachusetts General Hosp ital(Boston)；ウシトロンビン、Parke-Davis(Morris Plains，NJ);Na¹²⁵I、Dup ont-NEN(Cambridge，MA)；Bard Parker外科用ブレード、Becton Dickinson(Fran klin Lake，NJ)；４.０絹縫糸、American Cyanamid Co．(Danbury，CT)；SURFLO IVカテーテルおよび２０ゲージ１-１/４ インチVENOJECT管Ｋ₃ＥＤＴＡ入り、Terumo Medical Corp．(Elkton，MD)；滅菌 三段コック栓、Mallinckrodt Critical Care(Glens Falls，NY)；自動注射器注 入ポンプ、Baxter Health Care Corp．(Hooksett，NH)；注入ポンプ管および微 小口径６０インチ伸縮セット、Puerto RicoのMcGaw(Sabana Grand，Puerto Rico )；外科器具、VWR(Boston)；管系、Namic(Glens Falls，NY)；フェレット(〜.８ −１kg)、Marchall Farms(New York，NY)；アプロチニン、Sigma(St.Louis，MO) ；および超遠心管、National Scientific Supply Co．(San Rafael,CA)。 Ｂ．インビトロ血塊溶解アッセイ プール後に凍結させ、クエン酸処理したフェレットの血漿(１１００μｌ)を^{12 5} Ｉ−標識ヒトフィブリノーゲン(〜４０,０００cpm/血塊)１５μｌと混合した。 フェレットの血漿(３５μｌ)を、１２個の６５mmプラスチック管中、１０mＭＣ ａＣｌ₂含有トリス緩衝化塩水(ＴＢＳ)３５μｌと混合し、３７℃で１時間凝血 させた。この血塊をＴＢＳで洗浄し、上清を除去し、次いで、ＴＢＳ１００μｌ または精製ＭＡｂ(ＲＷＲまたは７７Ａ３)２５μｇを管に２つ全く同一に加えた 。管当り０.１Ｕのrt−ＰＡを加えることにより、血塊溶解を開始させた。血塊 を３７℃で５時間インキュベーションし、(Reed，G．L．III et al.，Proc．Nat l.Acad．Sci．USA 87:1114-1118(1990))に記載のようにして、上清への放射性標 識フィブリン分解産物の放出についてサンプリングすることにより溶解物量を測 定した。 Ｃ．肺塞栓症実験 雌フェレットにケタミンおよびアセプロマジンの混合物(ケタミン[１００mg/m l]１部に対し、アセプロマジン[１０mg/ml]２部)を筋肉内注射(０.４ml)するこ とにより麻酔をかけた。動物の麻酔を維持するのに必要なだけ腹膜内注射を繰り 返した。頸の腹側の中線に沿って切開した後、適当に解剖して頚静脈と頚動脈を 露出させ、２０Ｇカテーテルを挿入し、その近位および遠位端を４-０絹縫糸で 固定した。カテーテルに三段コルク栓を付けた。 集めたクエン酸処理済みヒト血漿を¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲンと混合して、〜 １,０００,０００cpm/mlにした。¹²⁵Ｉ−フィブリノーゲン標識血漿(４５μｌ) をウシトロンビン(１００Ｕ/ml)２.５μｌおよび塩化カルシウム(０．４Ｍ)２. ５μｌと混合することにより、個々の血塊を形成させた。これらのクロットを３ ７℃で９０分間インキュベーションし、圧縮し、塩水で３回入念に洗浄して、非 結合タンパク質を除去した。血塊注射直前に、血塊の放射能含量をガンマカウン ターで測定した。血液サンプルはベースラインと実験の最後で採った。ヨウ化ナ トリウム(１０mg)を注射してチロイド摂取をブロックした。内部頚静脈を介して 肺内へ注射することにより血塊が塞栓を形成した。体重１kg以下のフェレットに は、３血塊を与え、体重１kg以上のものには４血塊を与えた。胸部に放射能が蓄 積していることから、上手く塞栓形成されたことが分かった。血塊を注射した後 、呼吸しやすいように、フェレットを横向けにした。 操作中、全ての動物に１５０秒以上の活性化部分トロンボプラスチン時間(ａ ＰＴＴ)を維持するのに十分な用量の１００Ｕ/kg(ボーラス)の重量調整したヘパ リンを与えた。α２ＡＰインヒビター（滅菌濾過済み、塩水中１４mg/ml)または 精製対照ＭＡｂ(抗ジゴキシン)を単回用量(２２.５mg/kg)として静脈内に与えた 。rt−ＰＡを２時間にわたる連続注入(５ml生理食塩水中、１または２mg/kg)と して与えた。肺塞栓形成後、動物を計４時間観察し、致死麻酔注射またはＣＯ₂ 吸入により屠殺した。胸部を切開し、全ての胸部内構造をガンマカウンティング のために取り出し、残った血栓を検出した。血塊溶解パーセントは、胸部の残存 放射能総量(cpm)を初期血栓中のもので割ることにより、各フェレットについて 測定した。 この実験プロトコールは、Harvard Medical Area Standing Committee on Ani malsにより承認されている。このHarvard Medical Schoolのアニマルマネージメ ントプログラムは、アメリカ実験動物保護協会(American Association of Labor atory Animal Care)により認定されており、その操作は、実験動物の保護と使用 についての指針(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(DHH S Publication No．[NIH]85-23，1985年改訂)、the Public Health Service Pol icy on the Humane Care and Use of Laboratory Animals by Awardee Institut ions，and the NIH Principles for the Utilization and Care of Vertebrate Animals Used in Testing，Research，and Trainingに記載 のとおり、国立衛生研究所の基準に従い行われた。 Ｄ．統計学的試験 データは、変数の一方向分析、続いて複数比較試験のBonferroni-Dunn法によ り分析した。 Ｅ．フィブリノーゲンアッセイ 血液サンプルは、アプロチニン(５０カリクレインＵ/ml)を含むＫ₃ＥＤＴＡ（ 最終溶液０.１５％）にて集めた。血小板の乏しい血漿は、全血の遠心(Mustard ，J.F．et al.，Meth．Enzymol．169：3-11(1989))により入手し、亜硫酸ナトリ ウム法(Rampling，M．W．and Gaffney，P．J.，Clin．Chim．Acta．67：43-52(1 976))によりフィブリノーゲンについてアッセイした。 Ｆ．α２−抗プラスミンアッセイ α２ＡＰレベルを測定するために、我々は、フェレットの血液をクエン酸ナト リウム(１/１０容量)にて集め、遠心して、血漿を得た(Mustard，J．F．et al., Meth．Enzymol．169:3-11(1989))。(Reed，G．L．III et al.，Proc．Natl.Acad ．Sci．USA 87:1114-1118(1990))に記載のように、プラスミン阻害用の発色基質 アッセイにより血漿を機能性α２ＡＰについて試験した。 Ｇ．結果 ハイブリドーマのパネルから、我々は、７７Ａ３、即ち、ヒトα２ＡＰにしっ かりと結合したＭＡｂを選択した。ＭＡｂ ７７Ａ３をマウス腹水からイオン交 換クロマトグラフィーにより精製し、その純度をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ル分析により確認した(図５)。インビボでの実験的肺塞栓症におけるα２ＡＰの 役割を研究するために、我々は、数種の動物血漿血塊溶解アッセイにおいて精製 ７７Ａ３を試験し、ヒト以外のα２ＡＰに結合して阻害し得るかどうかを測定し た。７７Ａ３は、試験した多種の小動物(例えば、ハムスター、アレチネズミ、 モルモット、ラット等)の血漿の中でも、フェレット血漿と顕著に交差反応した 。図６は、７７Ａ３の溶解効果をヒトα２ＡＰのもう１つのＭＡｂインヒビター ＲＷＲ(Reed，G．L．III et al.，Trans．Assoc．Am．Phys．101：250-256(1988 )；米国特許第５,３７２,８１２、１９９４年１２月１３日発行)の場合および緩 衝液単独の場合と比較したものである。図６は、対照(緩衝液単独)との比 較において、７７Ａ３が低用量のrt−ＰＡ(０.１単位）により誘導されるフェレ ット血漿血塊の溶解を加速したことを示す。反対に、ヒトα２ＡＰを阻害する(R eed，G．L．III et al.，Trans．Assoc．Am．Phys．101：250-256(1988)；米国 特許第５,３７２,８１２、１９９４年１２月１３日発行)がヒト以外のα２ＡＰ とは交差反応しないＲＷＲは、なんら検出可能な効果を持たなかった。この実験 は、７７Ａ３がフェレットのα２ＡＰを阻害し、インビトロでのフェレット血塊 溶解を増幅したことを示した。 ７７Ａ３の交差反応性により、我々は、肺塞栓症のフェレットモデルにおける α２ＡＰの役割を調べることができた。ヒトでは、肺塞栓症は通常ヘパリンで処 理される(Goldhaber，S.，Chest 107:45S-51S(1995))。そのため、フェレットを 重量調整したボーラス用量のヘパリン１００Ｕ/kgで処理した。この用量は、実 験(ｎ＝３)中のａＰＴＴを１５０秒以上に維持するのに十分であった。血液中の α２ＡＰ活性に対する静脈内ＭＡｂ ７７Ａ３の効果を調べるために、我々は、 フェレットα２ＡＰのレベルに対してモル過剰である２２.５mg/kgの用量を選択 した。静脈内投与後１および４時間でのフェレットα２ＡＰ活性のエクスビボ測 定は、〜７５％のフェレットα２ＡＰ活性がこの用量で阻害されたことを示した (図７、ｎ＝２)。 次いで、我々は、ヘパリン１００Ｕ/kgおよび７７Ａ３ ２２.５mg/kgを用いて 、これらの物質およびrt−ＰＡの肺塞栓溶解に対する効果を調べた(図８)。全て の動物にヘパリンを与えた。rt−ＰＡを与えなかった対照動物(ｎ＝８)は、その 肺塞栓の１５．６±１０．５％(平均±ＳＤ)の溶解を示した。２時間にわたり１ mg/kg(ｎ＝４)のrt−ＰＡを与えた動物では、３８.５±６.３％の溶解を示し、 これは、ヘパリン単独を与えた場合に得られた溶解よりも顕著に高かった(Ｐ＜. ０１)。同様に、１mg/kgのrt−ＰＡを与えた動物および対照(抗ジゴキシン)ＭＡ ｂ(ｎ＝３)は、３５.２±４.６％の溶解を示した。２mg/kg(ｎ＝４)のrt−ＰＡ で処理したフェレットは、１mg/kgで処理したものに対し、最小の溶解増加度を 示した(４５.０±６.５％対３８.５±６.３％、ｐ＜.０５)。しかしながら、α ２ＡＰインヒビターと共に１mg/kgのrt−ＰＡを与えた動物(ｎ＝４)は、対照(抗 ジゴキシン)MAbを含むまたは含まない(p＜.０１)、等量のrt−ＰＡ単独を与 えたもの(p＜.０１)よりも、または２倍用量のrt−ＰＡ単独を与えたもの(P＜． ０５)よりも高い溶解(５６.２±４.７％)を示した。 血栓表面上のプラスミンを阻害する以外に、α２ＡＰおよび他のインヒビター は、血中のプラスミンを不活性化する(Collen，D.，Eur．J．Biochem．69:209-2 16(1976);Moroi，M．and Aoki，N.，J．Biol．Chem．251:5956-5965(1976);Mull ertz，S．and Clemmensen，I.，Biochem J．159:545-553(1976))。我々は、血中 のフィブリノーゲンレベルを測定して、α２ＡＰの阻害が循環凝血因子の非特異 的プラスミノリシスを導くかどうかを調べた。図９は、４つの処理グループにお ける残存フィブリノーゲンレベルをその初期値の関数として表示するものである 。rt−ＰＡを与えなかった動物では、フィブリノーゲンレベルは、穏やかに変化 したが、実験中には減少しなかった。１mg/kgおよび２mg/kgのrt−ＰＡ単独を与 えたフェレットは、フィブリノーゲンレベルにおける有意な変化を何も示さなか った。同様に、rt−ＰＡおよびα２ＡＰインヒビターを組み合わせて与えた動物 は、循環フィブリノーゲンレベルにおける検出可能な変化を何も示さなかった。 Ｈ．考察 臨床的および実験的研究により、肺動脈塞栓および静脈血栓が内生の繊維素溶 解およびプラスミノーゲンアクチベーターによって誘導される溶解に耐性である ことが示される(Goldhaber，S.，Chest 107：45S-51S(1995)；Goldhaber，S.Z. ら、Lancet 2：886-889(1986)；The Urokinase Pulmonary Embolism Trial,Circ ulation 47：1-108(1973)；Goldhaber，S.Z．ら、Am．J．Med．88：235-240(199 0)；Goldhaber，S.Z．ら、Lancet 341：507-511(1993))。この溶解に対する耐性 は部分的には、繊維素溶解を妨害するように作用する血栓中の特異的な分子因子 のせいである。血栓形成の間に、α２ＡＰは活性化第ＸＩＩＩ因子によってフィ ブリンに共有結合で架橋される(Sakata，Y．およびAoki，N.，J.Clin．Invest． 69：536-542(1982))。インビトロでの研究は、凝血塊中にα２ＡＰが存在しない か、あるいはＭＡｂｓによって阻害した場合、凝血塊が自発的溶解を受けること を示す(Aoki，N．ら、Blood 62：1118-1122(1983)；Miles,L.A．ら、Blood 59： 1246-1251(1982)；Reed，G.L．IIIら、Trans．Assoc．Am. Phys．101：250-256(1988)；Reed，G.L．IIIら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 8 7：1114-1118(1990))。逆に言えば、凝血塊中のα２ＡＰ量をインビトロで補っ て増加させた場合、繊維素溶解は阻害される(Sakata，Y．およびAoki，N.,J．Cl in．Invest．69：536-542(1982))。本研究では我々はα２ＡＰが繊維素溶解の調 節の主要な役割を担い、肺動脈塞栓において獲得される血栓の耐性に寄与してい るという仮説について研究した。 我々はα２ＡＰを阻害する場合および阻害しない場合の、クロアシイタチ（fe rrets）における肺動脈塞栓の正味の溶解に対するrt−ＰＡの作用を測定した。 ヘパリンは肺動脈塞栓を有するヒト用の確立した治療薬であるから、我々はヘパ リンのみで処置した動物を対照群と考えた。クロアシイタチに投与した重量調節 のボーラス投与量のヘパリンは、実験を通して高レベルの抗凝血を維持するため に十分な量であった。ヒトで用いる量（１ｍｇ／ｋｇ）と同等な投与量のrt−Ｐ Ａで処置した動物では、ヘパリンのみで処置した動物での溶解と比較して肺動脈 塞栓の溶解が非常に高められた。rt−ＰＡの投与量をヒトで安全な投与量より高 い投与量である２ｍｇ／ｋｇに増加させても、溶解は極めて少ししか増加しなか った。ｔ−ＰＡ誘導性の溶解についての用量応答における同様の安定状態は、犬 での肺動脈塞栓の実験的研究（Werier，J．ら、Chest．100：464-469(1991)）に 記載されている。しかし、α２ＡＰの特異的な阻害は、実験的な肺動脈塞栓のrt −ＰＡ（１ｍｇ／ｋｇ）による溶解の効力を顕著に増加させ、同じ用量のrt−Ｐ Ａで（単独で、あるいは対照ＭＡｂとともに）処置したクロアシイタチにおいて 見られた溶解より非常に大量の溶解を引き起こし、α２ＡＰを阻害して生じた溶 解はまた、高い用量のrt−ＰＡ（２ｍｇ／ｋg）で処置したクロアシイタチにお いて生じた溶解より高い値であった。同時に、α２ＡＰ阻害剤で処置した動物に おいて得られた総溶解量がより高いにもかかわらず、循環フィブリノーゲンの消 費はあまり多くなかった。これらの実験的肺動脈塞栓の研究では、α２ＡＰはrt −ＰＡ誘導性の溶解に対する血栓の耐性に重要な役割を担っていた。さらなる研 究により、この工程において循環の、ならびに血栓に結合したα２ＡＰの相対的 定量的な役割を確立することが必要であろう。 α２ＡＰの他に、他の分子因子が肺動脈塞栓の血栓の耐性を調節するかもしれ ない。第一の候補はｔ−ＰＡおよび尿様プラスミノーゲンアクチベーター（ｕ− ＰＡまたはウロキナーゼ）のセリンプロテアーゼ阻害剤であるＰＡＩ−１である (Stringer，H.A．およびPannekoek，H.，J．Biol．Chem．270：11205-11208(199 5)；Carmeliet，P．ら、J．Clin．Invest．92：2756-2760(1993)；Lang，I.M． ら、Circulation 89：2715-2721(1994)；Marsh，J.J．ら、Circulation 90：309 1-3097(1994))。ＰＡＩ−１はインビトロでフィブリンと結合することが示され ているが(Stringer，H.A．およびPannekoek，H.，J．Biol．Chem．270：11205-1 1208(1995))、α２ＡＰと異なり、血栓のフィブリンと特異的に架橋されない。M arshら（Marsh，J.J．ら、Circulation 90：3091-3097(1994)）はイヌ科のモデ ルにおいて、組換えＰＡＩ−１を発達した血栓に加えることによって、ＰＡＩ− １に富む凝血塊が肺動脈塞栓の自発的な溶解を抑制することができることを示し ている；しかし自己由来血栓の溶解におけるＰＡＩ−１の役割は研究されなかっ た。血栓摘出により摘出された肺動脈塞栓の病理学的研究により、新鮮な血栓の 周辺部の内皮細胞ではＰＡＩ−１の発現が増加するが、血栓自身には検出できな いことが示されている(Lang，I.M．ら、Circulation 89：2715-2721(1994))。（ 遺伝子欠失による）ＰＡＩ−１−欠損マウスは正常のマウスよりもエンドトキシ ン誘導性の静脈血栓を発達させる可能性が低い（Carmeliet，P．ら、J．Clin．I nvest．92：2756-2760(1993)）ため、発達している血栓周辺部の内皮細胞におけ るＰＡＩ−１の発現は機能的に重要であるかもしれない。しかし、薬理的プラス ミノーゲンアクチベーターに対する血栓の耐性についてのＰＡＩ−１の役割はあ まりはっきりしていない：ｔ−ＰＡを投与された患者では、ＰＡＩ−１の阻害能 力が完全に隠れてしまい(Lucore，C.L．およびSobel，B.E.，Circulation 77:66 0-669(1988))、またＰＡＩ−１の効果がまったくないストレプトキナーゼを投与 した患者でも血栓の耐性が観察された。 肺動脈塞栓における血栓の耐性について、他の可能性ある原因は活性化第ＸＩ ＩＩ因子である。インビトロでのいくつかの研究は、この凝血酵素がフィブリン 鎖を互いに架橋させ、ならびにα２ＡＰをフィブリンと架橋させることによって 、凝血塊のフィブリンをプラスミンによる分解に対してより耐性にすることを示 す(Sakata，Y．およびAoki，N.，J．Clin．Invest．69:536-542(1982)； Robbie，L.A．ら、Thromb．Haemostas．70:301-306(1993)；Francis,C.W．およ びMarder，V.J.，J．Clin．Invest．80：1459-1465(1987)；Jansen,J.W.C.M．ら 、Thromb．Haemostas．57：171-175(1987)；Reed，G.L．ら、Trans.Assoc．Am． Phys．104：21-28(1991))。しかし、インビボの活性化第ＸＩＩＩ因子および血 栓の耐性についてはほとんど知られていない。このことはおそらく、第ＸＩＩＩ 因子の強力な阻害物質が最近利用可能になったばかり（Reed，G.L．およびLauka cova，D.，Thromb．Haemostas．74:680-685(1995)）であるせいであろう。ある 研究は、第ＸＩＩＩ因子が部分的に阻害された場合、ｔ−ＰＡに応じて加速され た速度で冠動脈血栓が溶解することを示している(Shebuski,R.J．ら、Blood 75 ：1455-1459(1990))。この観察により、第ＸＩＩＩ因子がまた、そのフィブリン −フィブリンおよびα２ＡＰ−フィブリンを架橋する作用により、血栓の耐性に 貢献することが示される。 肺動脈塞栓および深部静脈血栓を有する患者の血栓の溶解を改善することは未 だに難題である。不幸にも、プラスミノーゲンアクチベーターの投与量を増加さ せることは確実なアプローチではない。高い投与量のｔ−ＰＡは大脳出血の危険 性を許容できないほど増大させることに繋がる(Passamani，E．ら、J．Am．Coll ．Cardiol．10：5lB-64B(1987))。さらに本研究および他の研究（Werier，J．ら 、Chest．100：464-469(1991)）では、高い投与量のｔ−ｐＡ（＞２ｍｇ／ｋｇ ）は正味の溶解をほんの少し増加させただけであった。現在、ＦＤＡが認可する ウロキナーゼおよびストレプトキナーゼの投与量はプラスミノーゲンの「涸渇」 を引き起こし；これゆえ、これらの物質の投与量を増加させても正味の溶解に影 響する可能性は低い(Onundarson，P.T．ら、J．Lab．Clin．Med．120：120-128( 1992))。血栓生成および活性に対するいくつかの強力な阻害物質が開発されてい る。これらの物質はさらなる新しい血栓の形成を減少させるかもしれないが、診 断時の患者に一般に存在する大きな血栓の溶解を直接改善しないであろう。これ らの考察は、血栓の生理的または薬理的溶解を妨害する分子因子への基本的な洞 察が静脈血栓塞栓症の改良された処置を導くのに必要であろうことを示す。本研 究の結果は、α２ＡＰが実験的肺動脈塞栓における血栓の耐性の主な要因である ことを示し、α２ＡＰの阻害は血栓症を有する患者中の溶解を改 善するかもしれないことを示す。 実施例３ 抗体ｃＤＮＡのクローニングおよび配列決定 Ａ．抗体のアミノ末端配列 モノクローナル抗体（４９Ｃ９、７０Ｂ１１および７７Ａ３）を腹水中に拡散 させ、ＤＥＡＥアフィゲルブルー（DEAE Affigel Blue）でのイオン交換クロマ トグラフィー、またはLukacova，D．ら、Biochemistry 30：10164-10170（1991 ）に記載のプロテインＡアガロースによって精製した。この精製ＭＡｂｓ（１５ μｇ）を１０％ミニゲルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥ（BioRad，Hercules，CA）にかけ た。半乾燥技術（Kyhse-Anderson，J.，J．Biochem．Biophys．Meth．10：203-2 09(1984)）を用い、４℃で２時間７５ミリアンペア（Millipore電気ブロット装 置）で、このタンパク質サンプルをＰＶＤＦ膜（Millipore，Bedford，MA）に電 気ブロットした。バンドをポンソーダイ（Ponceau Dye、Sigma，St．Louis）で 染色し、切り取った。抗体軽鎖のアミノ末端配列を図１０に示す（配列番号：１ −３）。 Ｂ．抗体ｃＤＮＡの分子クローニング クローン化したハイブリドーマセルライン４９Ｃ９、７０Ｂ１１および７７Ａ ３を１５０ｍｍ組織培養プレートにおいて４．５ｇ／Ｌのグルコースおよびペニ シリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコの修飾イーグル培地中の２０ ％ウシ胎児血清中で生育させた。細胞を収集し、１２００ｒｐｍで７分間遠心し た。この細胞ペレットを滅菌リン酸緩衝塩溶液（ｐＨ７．４）に再懸濁し、再遠 心した。次いでＲＮＡゾル（RNAzol、Teltest，Friendswood，TX）５ｍＬを加え 、ペレットを２分間ホモジナイズした。クロロホルム（５００μＬ）を加え、混 合物をボルテックス（vortex）し、氷上で１５分間インキュベートした。このサ ンプルを１２，０００ｒｐｍで１５分間遠心した。水層をイソプロパノール４． ５ｍＬと混合し、ボルテックスした。この混合物を−７０℃で９０分間沈殿させ 、１２，０００ｒｐｍで１５分間再遠心した。ペレットをＤＥＰＣ処理水中の７ ０％エタノール２ｍＬで洗浄した。繰り返し遠心後、上清を除去し、ペレットを 風乾した。このペレットをジエチルピロカルボネート（ＤＥＰＣ）処理水２００ μＬに溶解し、３Ｍ ＮａＣｌ ２０μＬおよびエタノール８００μＬを加えた 。ｍＲＮＡを−７０℃で一晩沈殿させ、ペレットをＤＥＰＣ水に再懸濁した。 逆転写を導くプライマーを用い、次いで記載（Gene Amp Thermostable rTth R everse Transcriptase RNA PCRキット（Perkin-Elmer Cetus，San Francisco，C A）のポリメラーゼ連鎖反応を行い、軽および重鎖配列に対応するｃＤＮＡを単 離した。軽鎖の不変領域に対応する３'プライマー（５'Ｎ６ＧＡＡＴＴＣＡＣＴ ＧＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡ３'(配列番号：２２)）を用いて軽鎖ｍ ＲＮＡを逆転写用に準備し(Coloma，M.J.，ら、Biotechniques 11：152-154，15 6(1991))、重鎖の不変領域に対応する３'プライマー（５'Ｎ６ＧＡＡＴＴＣＡ( ＴＣ)ＣＴＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧ(ＡＧ)(ＡＧ)ＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣ３' (配列番号：２３))を用いて重鎖を準備した(Coloma，M.J.，ら、Biotechniques 11：152-154，156(1991))。軽鎖のアミノ末端配列は既知であるから、５'センス 配列でありそうな配列に対応する特異的プライマーをｃＤＮＡ増幅用に用いた（ ５'ＡＣＴＡＧＴＣＧＡＣＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＴＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧ Ｇ(ＧＣ)ＧＴＴＧ３'(配列番号：２４)；Jones，S.T.，およびBendig，M.M.，Bi o／Technology 9：88-89（Erratum）(1991))。重鎖のクローニングには、記載（ Jones，S.T.，およびBendig，M.M.，Bio／Technology 9：88-89（Erratum）(199 1)）のマウス重鎖可変プライマー１−１２を用いた。すべての重鎖はプライマー ９を用いて最も良く増幅され；しかし、プライマー１２、１０および６を用いた 場合でも少し増幅が見られた。低融解アガロースフラクションを用いてＰＣＲ産 物を単離し、ベクターに連結した。軽鎖ＰＣＲ産物をＰＣＲＩＩベクター（Invi trogen，San Diego，CA）に連結し、プライマー９から得られた重鎖ＰＣＲ産物 をＰＣＲＩＩ.１ベクター（Invitrogen，San Diego，CA）に連結した。形質転換 後、プラスミドＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲ１で制限消化した。重鎖および軽鎖由 来の各２つのクローンを培養し、ＤＮＡを収集した。ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ自動配 列決定装置でＴ７およびＭ１３プライマーを用いて、ｃＤＮＡクローンの両鎖の 配列を決定した。これらのｃＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列を図１１−１６ （配列番号４−１５）に示す。 実施例４ キメラ抗体およびヒト化抗体の製造と特徴付け キメラ抗体またはヒト化抗体の配列を設計するには考慮すべき多くのパラメー ターがある。定常領域を有する完全抗体を作製してもよく、または抗体フラグメ ント（ＦａｂおよびＦａｂ’２）を作製することができる。定常領域はネズミま たはヒトのものであってよい。ネズミ定常領域をヒト定常領域で置換して「キメ ラ」抗体を形成する操作は認められている。キメラ抗体はネズミ抗体より免疫原 性が低く、臨床でより受け入れられやすい。 抗体のサブクラスも考慮しなければならない。組換え抗体をＩｇＧの形で発現 させるのはごく普通であるが、このクラス内のＩｇＧは組換えキメラヒトＩｇＧ １、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選ばれなければならない。これら サブクラスは異なった生物学的特性を有する。本発明者らは、１）ＩｇＧ１やＩ ｇＧ３の強い補体活性化特性は必要でなく、２）ＩｇＧ２はＩｇＧ４より製造に 適すと思われることから、ＩｇＧ２を用いる伝統的方法をとった。同じ方法によ り他のどのサブクラスでも同じ特異性を持つものが作製されよう。 可変領域を設計する際にも考慮すべきパラメータがある。抗体はキメラまたは ヒト化したものに構築されよう。キメラ抗体（ネズミＶ領域、ヒト定常領域）は 、より伝統的な方法であり、ネズミ抗体と非常に類似の抗原結合活性を実質的に 保証する。ヒト化により抗体の親和性および／または生物活性は低下する危険性 があるが、抗体の免疫原性は低くなると予測できる。本発明者らはキメラ抗体と ３種類のヒト化抗体を作製した。 あらゆる特定の抗体のヒト化では、用いた方法に応じて多くの異なる可変領域 が生じ得る。最も簡単なレベルでは、ヒト化は、鋳型としてヒト可変領域を選び 、次いでどの残基を「ヒト」に、どれを「ネズミ」にするかを決定することから なる。すなわち、ヒト鋳型の選択とどの残基をヒトとして維持するかの選択は最 終配列に影響を及ぼすであろう。 一般的に、本発明者らが用いた方法は鋳型となる可変領域遺伝子をヒト生殖細 胞系の中から選ぶことである。あるいはまた、該遺伝子は再配列した可変領域遺 伝子から選ぶことができる（それらはいずれも体細胞突然変異を受けているか、 いないものである）。最初の方法は、体細胞突然変異が免疫原性エピトープを導 入することがある（生殖細胞系遺伝子ではそのような可能性が低い）ので合理的 である。さらに、選択は、ヒトで機能的タンパク質として再配列され、発現する ことが知られている生殖細胞系遺伝子に限られた。 鋳型に用いる生殖細胞系遺伝子の選択は、ネズミ配列とヒト配列の全体的な配 列の類似性と、２つの配列の構造的類似性(ChothiaおよびLesk，J.Mol.Biol.196 :901(1987))、予想される、選択した重鎖鋳型と選択した軽鎖が対をなす能力、 大多数のヒトにおける生殖細胞系遺伝子の存在により決定される。どの残基をネ ズミのものとすべきかの選択は、どの残基が抗原と接触すると考えられるかと、 どれが抗原と接触する残基の位置と方向を維持するのに必要かにより決定される 。 可変領域はオリゴヌクレオチドから組み立てられ、ヒトγ２定常領域（ＶＨ領 域の）とヒトκ定常領域（ＶＬ領域の）を含む発現ベクターに挿入される。重お よび軽鎖ベクターは、ヌクレオチド配列と、ＣＯＳ細胞中で抗原結合免疫グロブ リン（Ｉｇ）の合成をもたらす能力（一時的発現）により確認された。次に、選 択した重および軽鎖ベクターをＣＨＯ細胞に同時にトランスフェクトし、キメラ およびヒト化抗体を発現する安定な細胞系を生産した。抗体を精製し、抗原結合 ＥＬＩＳＡによる活性、プラスミンアッセイにおけるα２−ＡＰの阻害活性を阻 害する能力、ウロキナーゼによるヒト血餅の溶解を促進する能力について試験し た。 Ａ．キメラおよびヒト化抗体ベクターの構築 機能的軽鎖可変領域はＶ遺伝子部分とＪ遺伝子部分の再配列と並列により形成 される。したがって、これらの各部分について最もよくマッチするものを探し、 それらを結合してヒト鋳型を形成する必要がある。ヒトＶｋ生殖細胞系遺伝子の データベースに対するネズミ７７Ａ３（ｍ７７Ａ３）軽鎖のアミノ酸１−９５（ Kabit番号付法、Ｖ遺伝子固有）のＦＡＳＴＡ調査（Wisconsin Package Interfa ce使用）は、ｍ７７Ａ３が明らかにヒトＶｋＩサブグループと最も類似している ことを示した（相同性６９．２％〜７１．６％に対しこのサブグループ以外の配 列に対する相同性は６０％以下）。構造的に重要な位置がマッチし、ヒトで優性 に発現することから、ＶｋＩ配列の中からGenBank加入＃Ｘ５９３１２ の遺伝子（Ｏ２／Ｏ１２遺伝子としても知られる）を有望な候補として選んだ。 軽鎖のヒト鋳型はヒトＪｋ２配列を付加して完成させた。７７Ａ３のネズミＪ領 域との類似性の程度が高いことから、このＪ領域を選んだ。 機能的重鎖可変領域はＶ遺伝子部分、Ｄ遺伝子部分、およびＪ遺伝子部分を再 配列し、並列することにより形成される。したがって、これらの各部分と最もよ くマッチするものを探し、それらが結合してヒト鋳型を形成する必要がある。ヒ トＶＨ生殖細胞系遺伝子のデータベースに対するネズミ７７Ａ３重鎖のアミノ酸 １−９４（Kabit番号付法、Ｖ遺伝子固有）のＦＡＳＴＡ調査（Wisconsin Packa ge Interface使用）は、ｍ７７Ａ３重鎖が明らかにヒトＶＨ７ファミリーと最も 類似しており（相同性７７％）、次に最もよくマッチしていたのはヒトＶＨ１フ ァミリーである（相同性約６０％）ことを示した。ヒトＶＨ７ファミリーはほど んど偽遺伝子からなり、活性遺伝子のみ（７−０４．１、加入＃Ｘ６２１１０） がヒトポピュレーションでは多形性であるため（すなわち、すべての人々がそれ をもっているわけではない）、ある人々では、このＶ遺伝子は他のものより免疫 原性が高いかもしれない。重鎖の別のヒト鋳型として、加入番号Ｚ１２３１６（ １−１８遺伝子）のＶ遺伝子を選んだ。この配列はＨ２ループとＦＲ３領域を除 いて７−０４．１と非常に類似している。Ｄ領域は完全にＨ３ループ内にあり、 その配列は一般に抗原との結合にとって中心的であり、ヒト化抗体中で完全にネ ズミ配列に従うと思われるため、そのヒト鋳型は考慮しなかった。重鎖のヒト鋳 型はヒトＪＨ５配列を付加して完成された。７７Ａ３のネズミＪ領域と類似性が 高いため、このＪ領域を選んだ。 重および軽鎖可変領域のヒト鋳型を選択し、次いで、ネズミ配列に従う位置と 、ヒト配列に従う位置を決定する必要がある。ネズミ配列に従う位置を選択する には以下の基準を用いた：ＣＤＲループ内にあるすべての位置、ＣＤＲループの 構造および／または空間的位置に影響を及ぼすことが知られているすべての位置 （所謂、構造的決定因子、ChothiaおよびLeskNJ、Mol.Biol.196:901(1987)、Les tおよびTramontano，Antibody Engineering中,W.H.Freeman and Co.、7-38頁(19 92))、ＣＤＲループ中の残基と相互作用するほど十分近くにある残基、およびＶ Ｈ−ＶＬドメインインターフェースの、またはその近傍の残基。他のすべて の残基はヒト配列に従った。これらの項目については以下でより詳細に考察する 。 ＣＤＲループ内にある位置は、濃い境界線を有するボックス内に含まれること が示されており、構造決定基は図１７−１９の位置番号の下の列に^*で印をつけ ている。 ＣＤＲループと相互作用するほど十分近くにある残基を決定するには、ネズミ ７７Ａ３のＦｖ領域の近似分子モデルを作製する必要があった。抗リゾチームｍ Ａｂ（Ｄ１．３）の可変軽鎖と抗ノイラミニダーゼｍＡｂの可変重鎖（lncca） を結合させたものを構造鋳型として分子モデルを作製した。ＣＤＲループ配列を 規範的なループ構造に割り当て、考えられるＣＤＲ Ｈ３の構造をProtein Data Bankから抽出した。モデル作製プロトコールはBajorath & Novotny (Therapeuti c Immunol.2:95-105(1995))に記載の方法に従った。同様に、ＶＨ−ＶＬドメイ ンインターフェースのかまたはその近傍の残基を同定し、ネズミ残基をヒト化抗 体に用いた。ｈ７７Ａ３−１重鎖、ｈ７７Ａ３−２重鎖、および共通軽鎖のすべ てに、ＣＤＲループ以外を用いるそれぞれ７、１８、および１１ネズミ残基があ った。 これらの鎖を包含するベクターを製造するには、アミノ酸配列をヌクレオチド 配列に逆翻訳（back translate）する必要がある。これは、ほとんどの部分にお いて、アミノ酸残基を特にヒト鋳型から誘導する場合はヒト鋳型由来のヌクレオ チド配列を用いて、そしてその他の場合はネズミ配列由来のヌクレオチドを用い て簡単に行なわれた。制限部位を除くために、２、３の位置でサイレント置換が なされた。 最後に、該配列にシグナルペプチドを加えなければならない。キメラおよびヒ ト化両軽鎖には、ネズミ７７Ａ３軽鎖のシグナルペプチドに対応するシグナルペ プチドを用いた。キメラおよびヒト化重鎖には、軽鎖に用いたのと同じシグナル ペプチドを用いた。あるいはまた、キメラおよびヒト化重鎖にはネズミ７７Ａ３ ＶＨのシグナルペプチドに対応するペプチドまたは他のあらゆるシグナルペプチ ドを用いることができる。 ｈ７７Ａ３−１とｈ７７Ａ３−２の２種類のヒト化抗体を作製した。ｈ７７Ａ ３−２の構築物中にｈ７７Ａ３−１用に設計したオリゴヌクレオチドを含めるこ とにより第三のヒト化重鎖を作製した。これにより重鎖の９および１１位のアミ ノ酸ＳｅｒおよびＬｅｕ以外はｈ７７Ａ３−２と同一のハイブリッド分子が生じ た。１種類のキメラ抗体、ｃ７７Ａ３を作製した。 ｈ７７Ａ３−１およびｈ７７Ａ３−２重および軽鎖のアミノ酸およびヌクレオ チド配列を図１７−１９（配列番号１６−２１）に示す。共通軽鎖を図１７に示 す（成熟タンパク質は配列番号１７のアミノ酸残基１−１０７である）。ｈ７７ Ａ３−１の重鎖を図１８に示す（成熟タンパク質は配列番号１９のアミノ酸残基 １−１１９である）。ｈ７７Ａ３−２の重鎖を図１９に示す（成熟タンパク質は 配列番号２１のアミノ酸残基１−１２３である）。 キメラおよびヒト化７７Ａ３軽鎖および重鎖の発現ベクターは３段階で作製さ れた：（１）ヒト軽鎖または重鎖定常領域遺伝子を含むカセットの構築（それぞ れ、ｐＤ１６−ｈＣｋａとｐＤ２０−ｈｙ２ａ）、（２）軽鎖または重鎖可変領 域を含有するＰＣＲ生成物の製造、（３）適切な発現カセットに可変領域を挿入 。 プラスミドｐＤ１３を構築し、２段階でｐｃＤＮＡ３プラスミドから誘導した 。ＮａｅＩ消化によりｐｃＤＮＡ３からＳＶ４０プロモーター／エンハンサーと ネオマイシン耐性遺伝子を切りだし、３．８２ｋｂの断片を単離した。これら遺 伝子をＳＶ４０プロモーター／エンハンサーおよびｐＳＶ２−ｄｈｆｒ由来のｄ ｈｆｒ遺伝子で置換した。ＰｖｕｌｌとＢａｍＨＩで消化してｐＳＶ２−ｄｈｆ ｒ配列を含むＤＮＡを１．９３ｋｂ断片として単離した。３．８２ｋｂ断片と１ ．９３ｋｂ断片を連結し、ｐＳＶ２−ｄｈｆｒ由来の１．９３ｋｂ断片の突出し た末端を充填し、次いで、これを用いてＭＣ１０６１細菌を形質転換した。Ｈｉ ｎｄIII消化による８９０ｂｐ断片の放出により正しい生成物を確認した（ｐＤ １２と呼ぶ）。 上で得られたベクターをＡｓｐ７１８とＢｓｐ１２０Ｉで消化してポリリンカ ーを別の制限部位で置き換えた。以下のオリゴヌクレオチドをベクターとアニー ルし、ＥｘｏIIIクローニング法によりクローンし(K.Hsiao,Nucl.Acid.Res.21:5 528-5529(1993))、プラスミドpD１３を完成した：得られたプラスミドを用いてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し 、ポリリンカー領域をシーケンシングすることにより正しい生成物を確認した。 ＣＭＶプロモーターの上流にポリリンカー配列を加えて線状化し、ＳＶ４０プ ロモーター／エンハンサーとネオマイシン耐性遺伝子を欠失させ、それらをヒス トンＨ３転写終止配列、ＳＶ４Ｏプロモーター（エンハンサーが欠失）およびＤ ＨＦＲ遺伝子と置き換え、ＣＭＶプロモーターの上流にガストリン転写終止配列 を挿入する、一連の工程によってｐｃＤＮＡ３プラスミド（Invitrogen）からプ ラスミドｐＤ１６を誘導した。 ｐｃＤＮＡ３（Invitrogen）をＢｇｌIIで消化し、以下のオリゴヌクレオチド とアニールした： ５’プライマー： ３’プライマー： 次に、プラスミドを連結した。連結後、得られたプラスミド（ｐｃＤＮＡ３−Ｌ ＳＩ）を用いてコンピテントＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５αを形質転換し、ＮｈｅＩお よびＮｒｕＩの制限酵素による消化を行ない、２３０ｂｐ断片の放出により正し い構築物を確認した。 次に、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＬＳＩをＮｇｏＭＩ、ＰｖｉＩおよびＢｓｍ Ｉで消化した。消化後、２．０ｋｂ ＮｇｏＭＩ−ＰｖｕＩ断片を単離した。プ ラスミドｐＤ１２（上記）をＰｖｉＩとＳｐｈＩで消化してＳＶ４０エンハンサ ーを除去し、３．６ｋｂ断片を単離した。ヒストンＨ３転写終止配列をコードす る以下のオリゴヌクレオチドをアニールし、次いで２．０ｋｂ ＮｇｏＭＩ−Ｐ ｖｕＩ断片および３．６ｋｂ ＰｖｕＩ−ＳｐｈＩ断片と連結した： ５’プライマー： ３’プライマー： 得られたプラスミドpcＴｗＤ−LS１が、NheＩ＋NciＩで消化後３.３、０.９５、 ０.８２および０.６３kbフラグメントの生成、およびSphＩ＋BstEIIで消化後、 ４.２、１.０、０.２６および０.２３kbフラグメントの生成によって確認された 。 プラスミドpD１６を生成させるためのガストリン転写終末配列の挿入はBssHII およびNarＩによるpcＴｗＤ−ＬＳ１の消化および５.７kbフラグメントの分離、 および下記のアニールされたオリゴヌクレオチド： ５'プライマー： ３'プライマー： との結合によって行われた。 結合後、生成物は受容能力のあるE.coliＭＣ１０６１を形質転換するために用 いられ、正しい構築がNgoMＩ＋SpeＩによる消化後、４.８、０.６６および０.３ １kbフラグメントの生成、およびNgoMＩ＋NcoＩによる消化後、３.３、１.０、 ０.８２および０.６７kbフラグメントの生成によって確認された。 プラスミドpD１７は直線化ポリリンカーからNheＩ部位を取り出すことによっ てpD１６から誘導された。これはBstIIおよびNheＩによるpD１６の消化、および クレノーポリメラーゼを用いる突出末端の補充によって行われた。反応混合物は 自己結合し、受容能力のあるE.coliＤＨ５αの形質転換に用いられた。 pD１７は、Asp７１８１およびBsp１２０１によって消化され、pD１３から １１３bpAsp７１８１／Bsp１２０Ｉポリリンカーによって置換されたポリリンカ ーが除去された。結合後、得られた中間体プラスミドpD２０は重鎖Ｖ遺伝子の挿 入のために必要とされるNheＩ部位を持っており、pD２０はNheＩによる直線化に よってpD１７と区別され、pD１６、pD１７およびpD２０の直線部位ポリリンカー を一度だけ切断するBssHIIによる直線化によってpD１３と区別された。最終的に pD２０内のポリリンカー確認のためにＤＮＡ配列決定が用いられた。 ２.９kbEcoRＩフラグメントがpGk.１１から分離され(Wallsら、Nucl．Acid．R es．21:2921-2929(1993))、これがあらかじめEcoRＩで消化されたプラスミドpD １３(上掲)に結合された。ひとＣκエクソンおよび近接イントロン配列を含むこ の構築物(pD１３−hCka)はE.coliＤＨ５αの形質転換に用いられ、正確な生成物 が制限酵素消化によって確認された。EcoRＩによる消化は５.７、２.８および０ .３kbのフラグメントを生じさせ、SacＩによる消化は７.１、１.１および０.５k bのフラグメントを生じさせた。 軽鎖発現カセットの構築は、近接ポリリンカー配列と一緒にＣκフラグメント をpD１３から取り出し、これをpD１６に挿入することによって行われた。プラス ミドpD１３−hCkaはAsp７１８１およびBsp１２０１で消化され、Ｃκフラグメン トおよびポリリンカー配列を放出させた。この同じ酵素をpD１６の直線化に用い 、Ｃκ含有フラグメントをpD１６に結合し、pD１３−hCkaが形成させた。ＤＨ５ αE.coliの形質転換および増幅の後、正確な構築物がAsp７１８１およびBsp１２ ０１による消化後、２.９kbフラグメントの放出、pD１３ではなくpD１６に存在 する制限酵素による消化後の直線化によって確認された。このヌクレオチド配列 はまた構築物の種々の領域の配列決定によって確認された。ひとγ２遺伝子をコ ードするゲノムＤＮＡフラグメントはpIＣ中にプレアッセンブリーされ、ついで 下記のようにしてpD２０に移された。ひとγ２遺伝子を含むファージクローンフ ァージ５Ａ(EllisonおよびHood，Proc．Natl．Acad．Sci，79:1984-1988(1982)) をHindIIIで消化し、pUC１８のHindIII部位にクローニングし、ベクターpγ２を 形成させた。pγ２中γ２遺伝子の末端はポリリンカー領域に隣接している。 pGはHindIIIおよびBglIIによる消化、クレノー補充および再結合によって、pS V２−gptから誘導された。これは１２１bpのHindIII−BglIIフラグメントの取り 出しに用いられた。ついでpγ２はBamHＩで消化され、pGのBamHＩ部位に挿入さ れ、pGγ２.２が形成された。pGγ２.２は後のクローニング工程の妨げになるBa mHＩ部位３'コード領域を含む。この制限酵素部位を除去するために、pGγ２.２ を最初にBglIIで消化し、粘着末端をクレノーＤＮＡポリメラーゼＩで補充し、 ついでプラスミドを再結合した。得られた中間体プラスミド、pGγ２.３をBglII での消化されないかについてスクリーニングした。 可変領域遺伝子における後のクローニングの目的のためには、γ２含有カセッ トに制限酵素部位を提供することが重要である。これは、好ましくはNheＩ部位( Colona M.J．ら、J．Immunological Methods 152:89-104(1992))をコードするＣ Ｈ１エクソンの最初の２個のアミノ酸をコードするヌクレオチドを変異させるこ とによって行われる。予め、ひとγ４遺伝子からNheＩ−Bst EIIフラグメントを クローニングした。この領域内で、ひとγ２およびひとγ４遺伝子は同じアミノ 酸をコードしている。すなわち、γ４含有ベクター(pIChγ４.１)はγ２遺伝子 の５'末端の資源として役立ち得た。このベクターは下記のようにして得られた 。ひとγ４遺伝子を含むファージ５Ｄからの８.６kb BamHＩフラグメントをpUC にサブクロ−ニングし、プラスミドpUChγ４を得た。pUChγ４は下記のプライマ ー： センスプライマー： およびアンチセンスプライマー：を含むＰＣＲ反応のテンプレートとして用いられた。 このセンスプライマーは、合成NheＩ部位(下線部)に隣接するpIC２０Ｒ(Marsh J.L．ら、Gene 32:481-485(1984))にＰＣＲ生成物をサブクローニングするため のCla１部位を含む。NheＩ部位のための基部は、ひとγ１、γ２、γ３またはγ ４ ＣＨ１エクソンのための最初の２個のアミノ酸(アラニンおよびセリン)をコ ードし得ることに注目すべきである。このアンチセンスプライマーは、ひとγ４ およびγ２遺伝子のＣＨ１エクソンに存在するBst EII部位(下線部) に隣接する、pIC２０ＲにサブクローニングするためのXhoＩ部位を持っている。 生成したＰＣＲ生成物はClaＩ＋XhoＩで切断し、ついで、同じ酵素で消化された pIC２０Ｒに結合させ、中間体pIChγ４.１を生じさせた。 pGγ２.３はBamHＩおよびHindIIIで消化され、ひとγ２遺伝子座を含む６.１K bフラグメントがQiaex(商品名)ゲル抽出キット(Qiagen，Chatworth，CA)の精製 による１.４％アガロースゲルから分離された。２.９Kb pIChγ４.１プラスミド を同じ方法で処理し、２個のフラグメントを一緒に結合させ、中間体ベクターpI Chγ２.１を形成させた。スクリーニングのために、EcoRＩ消化物から６.３Kbお よび２.６Kbの適当な大きさのフラグメントが得られた。 pIChγ２.１はひとγ２／γ４ＣＨ１エクソンの５'部分の複製物を含む。この 複製領域を除去するために、BstEIIで消化すると、４.０Kb、１.８Kb、１.６、 １.１Kbおよび０.４Kbの大きさのフラグメントを得た。４.０Kbフラグメントは １.４％アガロースゲルから分離され、１.６Kbフラグメントが、４％Nu Sieve( 商品名)ＧＴＧ(ＦＭＣ Bioproducts，Rockland，ME)アガロース中の１.８Kbフラ グメントから分離され、単離された。両方のフラグメントはQiagenゲル抽出によ って精製された後、一緒に結合され、pIChγ２.２が調製された。２個のフラグ メントの適正方向を確認するために、下記のプライマーが使用され、ひとγ４Ｃ Ｈ１のエクソンのBstEII粘着末端の３'部分がひとγ４ＣＨ１エクソンの５'末端 に結合されたことが判明した(すなわち、pIC２０Ｒ中に隣接γ２遺伝子座が形成 されている)： センスプライマー： およびアンチセンスプライマー： センスプライマーは、ClaＩ部位に隣接する、pIC２０ＲEcoRＩ部位の５'配列 に相同である。アンチセンスプライマーはセンス鎖プライマーの下流の５００bp であるように選択され、ひとγ２ＣＨ１−ＣＨ２イントロン内の配列に相同であ る。すなわち、１.４％アガロースゲルの５００bpＰＣＲ生成物の可視化によっ て、ハイブリッドひとγ４−γ２ＣＨ１エクソンが生成し、隣接して遺伝子座の 残部に向けられていることが確認された。pIChγ２.２をEcoRＩで消化 し、予定の２.６Kbおよび１.９Kbフラグメントを得た。全ひとγ２ＣＨ１エクソ ンがＤＮＡ配列決定によって確認された。 NheＩ＋HindIIIによって切開されたプラスミドpD２０に結合させるために、ひ とγ２遺伝子座を含む１.８Kb NheＩ＋HindIIIフラグメントがpIChγ２.２から 取り出された。得られたベクターは発現カセットpD２０hγ2aである。 キメラおよびひと化抗体の両方の可変領域(Ｖ)遺伝子がノンテンプレート特異 的ＰＣＲ法(Prodromou C.，and Perl L.H.，Protein Eng．5:827-829(1992))の 変法によって合成された。ＰＣＲ生成物は、シグナルペプチドおよび適正な可変 領域の両方をコードするＤＮＡおよびベクターおよび正しいスプライシングの挿 入を容易にするフランキング配列を含む(軽鎖のみ)。 下記のプライマーが用いられた： Table３はノンーテンプレートＰＣＲ法における上記プライマーの使用をまと めたものである。 要約すれば、合成軽鎖または重鎖Ｖ遺伝子を示す８個の隣接オリゴヌクレオチ ドが合成された(Tab1e３のＶ１−Ｖ８)。４個のセンス鎖オリゴヌクレオチドは 長さ７８−８１ntの４個の重複アンチセンス鎖オリゴヌクレオチドと交互になっ ている。これらのＰＣＲプライマーは互いに２４−２７ntだけ重複している。オ リゴヌクレオチドプライマーＶ１およびＶ８(Table３)について、それらの５'末 端はベクター配列の１５−３０ntで重なるように設計されているが、３'末端は シグナルペプチド(Ｖ１)またはＶ遺伝子配列(Ｖ８)の４８−６５ntと重なってい ることに注目すべきである。８個のオリゴヌクレオチドプライマーはすべて同 じ最初のラウンドのＰＣＲに含まれていた。この第１ラウンドＰＣＲの反応条件 は１００μｌ反応容中、各プライマー０.１２５ピコモル、１０ＸPfu緩衝液（St ratagene Inc.，San Diego，CA）１０μｌ、dNTP's(Boehringer Mannheim，Indi anapolis，IN)の１０ナノモル、１０％ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、クロ ーニングPfuＤＮＡポリメラーゼＩ(Stratagene Inc.，San Diego，CA)の２.５単 位であった。反応試剤は最初に９５℃にて５分間変成され、４５℃にて５分間ア ニーリングされ、７２℃にて１分間伸長され、ついで変成９４℃にて３０秒、ア ニーリング５５℃にて３０秒、伸長７２℃にて３０秒を２５サイクル行った。２ ５サイクルの後、Perkin-Elmer ＤＮＡ Thermal Cycler(Norwalk，CT)にて７２ ℃にて７分間最終伸長を行った。 増幅されたＰＣＲ生成物は１.４％アガロースゲルで電気泳動し、約３５０bp −５００bpのＤＮＡランニングのスメアを切り出し、Qiaex(商品名)IIゲル抽出 キット(Qiagen，Chatworth，CA)によって精製した。この精製ノンテンプレート 特異的ＰＣＲ生成物は第２ラウンドのＰＣＲのテンプレートに用いられた。第２ ラウンドのＰＣＲを完成するために、２個の追加のアウタープライマーを用いた 。これらのアウタープライマーは哺乳動物発現カセットベクター内の直線化クロ ーニング部位の５'(センスプライマー)または３'(アンチセンスプライマー)のい ずれかであるベクター配列の２９−３０ntと相同である。これによって、増幅Ｐ ＣＲ生成物が細菌の相同性組換(Jones，D.H．およびHoward，B.H.，BioTechniqu es 10:62-66(1991))によるベクターへのサブクローニングが可能になった。すな わち、第２ラウンドＰＣＲの反応条件は、各アウターセンスプライマーおよびア ンチセンスプライマー０.１２５ピコモル、１０ＸPfu緩衝液１０μｌ、dNTP's １０ナノモル、１０％ＤＭＳＯ、PfuＤＮＡポリメラーゼＩの２.５単位および第 １ラウンドＰＣＲテンプレートＤＮＡ１００gであった。反応試剤は上記と同様 の熱サイクルプログラムにかけられた。ついで、この反応からの増幅物は１.４ ％アガロースゲルから取り出し、Qiagen(商品名)IIゲル抽出キットを用いて精製 された。 ＰＣＲ生成物は２００ng−１０００ngを等量の直線化ベクターと混合し、この 混合物を受容能力のあるE.coli ＤＨ５α細胞２００mlを形質転換するのに用い た(GIBCO BRL/Life Technologies，Gaithersburg，MD)。形質転換された細胞を ＬＢアガロース中１００μｇ/mlアンピシリンで選択した。具体的にはXhoＩで消 化されたpD１６−hCkaを軽鎖Ｖ遺伝子をサブクローニングするために用いた。Nh eＩで消化されたpD２０−hg2aは重鎖Ｖ遺伝子構築物のビヒクルとして用いた。 目的のＶ遺伝子が発現ベクター中に挿入されたことを確認するため、２つのス クリーニングを行った。第一のスクリーニングはＰＣＲによるもので、第二のス クリーニングは制限消化によるものであった。各細菌の個々のコロニーを１００ μｇ／ｍｌアンピシリンを含有する５ｍｌのＴブロス（GIBCO BRL/ライフ・テク ノロジーズ、ゲイサーズバーグ、メリーランド）中に植え込み（picked into） 、攪拌しながら３７℃で８〜１６時間増殖させた。ＰＣＲスクリーニングの条件 は、２０μｌの容量中に、０.１２５ピコモルの両アウタープライマー（表３） 、２ｍｌ １０×Ｍｇ⁺²緩衝液（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリ ス、インディアナ）、１０ナノモルのｄＮＴＰ（ベーリンガー・マンハイム、イ ンディアナポリス、インディアナ）、１単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＩ（ ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、インディアナ）、および１μ ｌの液体培養液（これは、菌体が高温度で溶解するのでＤＮＡ鋳型の供給源とし て意義があった）であった。反応液をまず９４℃で５分間変性させ、ついで９４ ℃で２５秒の変性、４５℃で２５秒のアニーリングおよび７２℃で１２秒の伸長 のサイクルを２５サイクル行った。これらサイクルの後、７２℃で７分間の最後 の伸長を行った。陽性の決定は、１.４％アガロースゲルで電気泳動した後にＤ ＮＡ標準マーカーとサイズを比較することにより行った。 第二のスクリーニングのため、ミニＤＮＡ調製物（キアゲン（Qiagen）、チャ ッツワース、カリフォルニア）を細菌ペレットから作成し、一部をＸｈｏＩ（Ｖ Ｌ遺伝子）またはＮｈｅＩ（ＶＨ遺伝子）のいずれかで消化した。再び１.４％ アガロースゲルで電気泳動した後、酵素消化により放出された断片のサイズを比 較することにより陽性の可能性のあるクローンを同定した。 上記手順を用いて正しく挿入されている可能性のあるものを確認した。しかし ながら、これらは配列中の小さな誤り（挿入、欠失および置換）を検出するほど 充分に特異的ではなかった。どのクローンが完全なＩｇ遺伝子をコードするＤＮ Ａを含有しているかを決定するため、陽性の可能性のある各重鎖クローンを陽性 の可能性のある各軽鎖クローンとともにＣＯＳ細胞中に同時トランスフェクショ ンした。培養上澄み液をＥＬＩＳＡによりヒトＩｇＧの存在についてスクリーニ ングし、っいでα２−抗プラスミンへのＩｇＧ結合の存在についてスクリーニン グした（下記参照）。 ＣＯＳトランスフェクションのためのＤＮＡは、上記ミニＤＮＡ調製物からの ものであった。ＣＯＳトランスフェクションは６０ｍｍの皿で行った。使用した ＤＥＡＥ−デキストラン法の詳細は記載されている（リンスリー（Linsley P.S. ）ら、J.Exp.Med.１７３：７２１〜７３０（１９９１））。一般に、小スケール のＣＯＳトランスフェクションから１.５μｇ〜６μｇの全抗体が得られる。 最終的な確認として、上記クローンからのＶ領域挿入物をジデオキシヌクレオ チド法により配列決定した。 Ｂ．ヒト化およびキメラ抗体の製造 所望の抗体の各重鎖および軽鎖をコードする重鎖ベクターおよび軽鎖ベクター が確認されたら、機能アッセイにおいて試験するために充分な量のキメラ抗体お よびヒト化抗体が必要であった。このことはまず、選択されたベクターを用いた ＣＯＳトランスフェクションのスケールアップとして行った。最後に高コピー数 のエレクトロポレーションにより安定な細胞株を調製した。各１００μｇの重鎖 ベクターおよび軽鎖ベクターを用い（ＢｓｓＨＩＩで消化後）、エレクトロポレ ーションをＰＦＣＨＯ培地（ＰＸ−ＣＥＬＬ ＰＦＣＨＯ培地、ＪＲＨバイオサ イエンシィーズ、ジェネクサ、カンサス）中で行った他は、バーソウム（Barsou m）のエレクトロポレーションプロトコール（バーソウム、DNA and Cell Biolog y ９：２９３〜３００（１９９０））に従った。 トランスフェクションされた細胞は２０ｎＭかまたは１００ｎＭのメトトレキ セート（ＭＴＸ）を含有する培地で選択した。培養上澄み液を非特異的なＩｇＧ ＥＬＩＳＡを用いて全抗体の存在についてアッセイした。上澄み液中に最大量の 抗体を含むマスターウエルからの細胞をより大きな容量に拡張した。幾つかの場 合には細胞株中のベクターを増幅するためにメトトレキセートの濃度も増加させ た。表４に示すベクターのペアをＤＧ４４ ＣＨＯ細胞中にエレクトロポレート した。 Ｃ．ヒト化抗体およびキメラ抗体の精製 抗体の精製は、まずプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて 行つた。ファルマシアカラム（１ｍｌの樹脂当たり５ｍｇの抗体を負荷できるサ イズにしたもの）にパーセプティブバイオシステムズポロス（Perseptive Biosy stems Poros）５０ＡプロテインＡ樹脂を充填した。ついで、樹脂の供給者の推 奨する方法に従ってカラムを消毒した。カラムを発熱物質不含１０ｍＭリン酸ナ トリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ７.０（ＰＢＳ）で平衡化した。細胞 培養上澄み液をｐＨ７.０〜７.５に調整し、２〜３カラム容量／分（ＣＶ／分） に等しい流速にてカラムに負荷した。ついでカラムを１５ＣＶの発熱物質不含Ｐ ＢＳで安定なベースラインが達成されるまで洗浄した。抗体を２０ｍＭグリシン ／ＨＣｌ ｐＨ３.０溶出緩衝液で溶出した。溶出のピークを１／２０ＣＶの１ Ｍトリス塩基溶液を含有する発熱物質不含容器中に回収した。溶出した抗体溶液 のｐＨを１Ｍトリス塩基を用いて直ちにｐＨ８.０に調整した。ついでカラムを ５ＣＶの１２ｍＭ ＨＣｌ溶液を用いて洗浄した。カラムを２０％エタノール／ 水中で４℃にて貯蔵した。 ついで抗体をアニオン交換クロマトグラフィーを用いて精製した。ファルマシ アカラム（１ｍｌの樹脂当たり５〜１０ｍｇの抗体を負荷できるサイズにしたも の）にパーセプティブバイオシステムズポロスＨＱ５０アニオン交換樹脂を充填 した。ついで、樹脂の供給者の推奨する方法に従ってカラムを消毒した。カラム を発熱物質不含５０ｍＭトリス／ＨＣｌ、５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ８.０で平衡 化した。ｐＨ８.０に調整したプロテインＡ精製抗体を１ＣＶ／分に等しい流速 にてカラムに負荷した。ついでカラムを５ＣＶの発熱物質不含５０ｍＭトリス／ ＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０で洗浄した。抗体は実施条件下ではカラムに は結合せず、フロースルーフラクション中に存在した。カラムを２０％エタノー ル／水中で４℃にて貯蔵した。ついで、抗体を濃縮し、３０Ｋカットオフ膜を用 いてＰＢＳに対してダイアフィルトレーションした。 Ｄ．抗体の存在を検出するための非特異的な１ｇＧ ＥＬＩＳＡ このＥＬＩＳＡは全抗体（重鎖および軽鎖をともに含む）を検出するものであ り、ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域に特異的な捕捉抗体およびヒトカッパ鎖に特異的なコ ンジュゲートに依存するものである。このアッセイにおいて、イムロンＩＩ平底 プレート（ダイナテック）を炭酸／重炭酸緩衝液ｐＨ９.６中の０５μｇのヤギ 抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ特異的、マウスＩｇＧ上に吸着）(カルタグ、カタログ＃Ｈ １００００)でコーティングし、ＰＴＢ（０.０５％トゥイーン２０および１.０ ％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）でブロックした。試料を加え（未希釈かまたはＰＴ Ｂもしくはジェネティックシステムズ試料希釈液で希釈）、プレートを４℃で一 夜、または室温で数時間インキュベートした。洗浄後、コンジュゲート（サザー ン・バイオテクからの西洋ワサビペルオキシダーゼをコンジュゲートしたヤギ抗 ヒトカッパ）をＰＴＢ中にて１：１００００にて加えた。室温で約１時間インキ ュベートした後、プレートを洗浄し、１００μｌの発色原／基質を加えた（ジェ ネティックシステムズ基質中に１：１００に希釈したジェネティックシステムズ 発色原）。充分に発色させた後、１００μｌの１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を加えて反応を停 止させた。光学密度を４５０および６３０ｎｍ波長に設定したバイオテクプレー トリーダーを用いて決定した。 小ＣＯＳトランスフェクションからのいずれの試料も全抗体の存在を示さない ような場合には、同様のＥＬＩＳＡを行って軽鎖が分泌されていないかどうかを 決定した。この場合にはプレートを１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトカッパ鎖でコーテ ィングした。アッセイのそれ以外の部分は上記と同じであった。 このアッセイは３つの目的のために用いた。第一に、種々の重鎖ベクターおよ び軽鎖ベクターを確認するために設定した小ＣＯＳトランスフェクションをスク リーニングすることであった。この場合には、シグナルの存在または不在で充分 であって、存在する抗体の定量を行う必要はなかった。第二に、ＣＨＯトランス フェクションからの多くのマスターウエルのいずれが最大の抗体を産生している かを決定することであった。この場合には、相対的なシグナルを比較でき、最大 の抗体を含有するマスターを区別でき、それゆえクローニングおよび拡張のため に選択できるように培養上澄み液を希釈した。第三に、培養上澄み液かまたはそ の後の精製のいずれかで抗体を定量することであった。この場合には、キメラも しくはヒトＩｇＧ１かまたはヒトミエローマＩｇＧ２のいずれかからなる標準を 用いた。標準および試料の両者をプレートで系列希釈し（２ｘ）、曲線上の位置 を比較することにより標準と比較した試料濃度を決定した。かくして決定した濃 度は、クローニングおよび増幅手順の間の抗体産生を追跡したり、抗原結合ＥＬ ＩＳＡおよび機能アッセイのいずれかで比活性を決定したりするのに用いた。 Ｅ．抗体が抗原に結合することができることを示すＥＬＩＳＡ このＥＬＩＳＡは抗原捕捉およびヒトカッパ鎖特異的コンジュゲートによるも のである。このアッセイは２つの目的のために用いた。まず、ベクターを確認す るため、ＣＯＳトランスフェクションからの上澄み液を抗体の抗原結合能力につ いてスクリーニングした。ついで、この試験を通したベクターをＤＮＡ配列決定 に供した。第二に、種々のキメラおよびヒト化抗体の相対的な抗原結合能力を決 定することであった。このＥＬＩＳＡはプレートを１μｇ／ｍｌのα２−抗プラ スミン（アメリカン・ダイアグノスティカより入手）でコーティングする他は上 記非特異的なＩｇＧ ＥＬＩＳＡと非常によく似ていた。 種々の抗体の相対的な抗原結合能を決定するため、Ｘ軸が対数抗体濃度でＹ軸 が光学密度のスキャッタープロットを用いた。抗原濃度は、非特異的なＥＬＩＳ Ａからまたは精製調製物の光学密度に基づいて決定した。３つのすべての形態の ヒト化抗体（ｈ７７Ａ３−１、−２および−３）がキメラ抗体と同様の抗原結合 性を示す。マウス抗体（ｍ７７Ａ３）は記載したアッセイでは検出できなかった ので（第二の工程で使用した抗体−コンジュゲートはヒト定常領域のみを認識す る）ｍ７７Ａ３との比較は行わなかった。 Ｆ．機能アッセイ ２つの機能アッセイを行った。第一の「発色原基質を用いたプラスミンアッセ イ」として知られるアッセイは、プラスミンがスペクトロザイム（Spectrozyme ）ＰＬ,Ｈ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＨＨＴ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ.２ＡｃＯＨをｐＮＡに変換す る能力に基づくものであり、この変換は４０５ｎｍで光を吸収する。もしもブロ ックされていないα２−抗プラスミンが存在すると、変換はほとんどまたは全く 起こらない。活性な抗体はα２−抗プラスミンの抑制活性をブロックすることが できる。第二のアッセイである血液凝固溶解アッセイは、ウロキナーゼといっし ょになって前もって生成した血液凝固を抗体が溶解する能力を測定するものであ る。 発色原基質を用いたプラスミンアッセイは、下記反応に従い、その発色原基質 に対するプラスミンの作用に基づいて設計されている。 プラスミン H-D-Nle-HHT-Lys-pNA.2AcOH → H-D-Nle-HHT-Lys-OH+pNA プラスミンの発色原基質 ｐＮＡの生成は、スペクトラマックス２５０分光光度計を用いて４０５ｎｍで の吸光度の上昇をモニターした。α２−抗プラスミンを添加するとプラスミン活 性が抑制され、４０５ｎｍにおける吸光度の上昇は観察されないであろう。α２ −抗プラスミンを機能性抗体と前もって混合しておくとα２−抗プラスミンがプ ラスミン活性を抑制する能力がブロックされる。プラスミン活性は発色の初期速 度として測定した。 アッセイは９６ウエルマイクロタイタープレート中で行う。発色原基質スペク トロザイムＰＬ,Ｈ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＨＨＴ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ.２ＡｃＯＨ、ヒトプ ラスミン、およびヒトα２−抗プラスミンはアメリカン・ダイアグノスティカか ら購入した。ストック溶液および操作溶液は以下のようにして調製する：スペク トロザイムＰＬストック溶液−Ｈ₂Ｏ中に１０ｍＭ；スペクトロザイムＰＬ操作 溶液−Ｈ₂Ｏ中のストック溶液の１：１２.５希釈液；ヒトプラスミンストック溶 液−５０％グリセリン、５０％２ｍＭ ＨＣｌ中に０.２ｍｇ／ｍｌ；ヒトプラス ミン操作溶液−０.１１ｍＭ ＨＣｌ中のストック溶液の１：１２.５希釈液（使 用直前に調製しなければならない）；ヒトα２−抗プラスミンストック溶液−Ｐ ＢＳ中に０.２ｍｇ／ｍｌ；およびヒトα２−抗プラスミン操作溶液−ＰＢ Ｓ中のストック溶液の１：１５希釈液。ストック溶液は−７０で貯蔵し、解凍後 は再凍結してはならない。 試薬は以下の順序で加え、各添加の後に撹拌する：８０μｌ抗体またはＰＢＳ 、４０μｌ α２−抗プラスミン操作溶液、４０μｌプラスミン操作溶液、およ び４０μｌスペクトロザイムＰＬ操作溶液。Ｒは発色速度である。Ｒｐは最大プ ラスミン活性を示し、抗体およびα２−抗プラスミンをともに欠くウエルで決定 する。Ｒｏは最小プラスミン活性を示し、抗体を欠くウエルで決定する。Ｒｓは 試料の発色速度である。抗体活性は（Ｒｓ−Ｒｏ）／（Ｒｐ−Ｒｏ）＊１００と して計算される。値は０％と１００％との間になければならない。抗体活性を抗 体量（対数スケール）に対してプロットした。被験抗体および標準（通常、マウ ス７７Ａ３）により作成された曲線を比較した。 マウス７７Ａ３、ｃ７７Ａ３、およびｈ７７Ａ３−１のデータを図２０に示す 。マウス７７Ａ３の曲線とキメラ７７Ａ３の曲線とは重ね合わせることができた 。ｈ７７Ａ３−２の曲線は活性がわずかに失われた可能性（２０〜３０％）を示 す。 血液凝固溶解アッセイは以下のようにして行った。３０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝 液、ｐＨ７.４０中で２５μＬの１６ｍＭ ＣａＣｌ₂、５０μＬのプールしたヒ ト血漿、および２５μＬの４ＮＩＨ単位／ｍｌのヒトα−トロンビン（シグマ） を混合することにより、９６−ウエルコーニング＃２５８０５マイクロタイター プレート中に被験血液凝固を生成させた。プレートを室温で一夜インキュベート して血液凝固の最大血液凝固濁度とした。ｐＨ７.４０にて１０μＬの抗体を加 えて５または１０μｇ／ウエルとし、および１０ＯｐＬのウロキナーゼを加えて １、３または５単位のウロキナーゼ／ウエル（アボット・ラボラトリーズ）とす ることにより血液凝固の溶解を開始した。４０５ｎｍでの最初の読み取りを行っ て０％溶解に対応する値を得る前に、机上マイクロプレートボーテクサーで３０ 秒間混合した。プレートをコーニング密封テープ＃４３０４５４で密封し、３７ ℃でインキュベートした。２４時間の間に濁度の減少が４０５ｎｍで測定され、 血液凝固の溶解の進行を定量した。 ヒト化７７Ａ３−１での血液凝固溶解実験の結果は、試験した各条件において ｈ７７Ａ３−１が緩衝液対照に比べて血液凝固溶解を劇的に促進することを示し ている。１または３単位のウロキナーゼの存在下での５μｇの抗体を含む血液凝 固においてヒト化７７Ａ３とマウス７７Ａ３との間には有意の分離がみられ、試 験した残りの４つの条件では溶解プロフィールは類似しているとはいえ、ヒト化 ７７Ａ３はマウス７７Ａ３よりも若干活性が低いことを示していた。マウス７７ Ａ３よりも１０倍親和性の低いモノクローナル抗体であるＲＷＲでは、１単位の ウロキナーゼの存在下での血液凝固当たり１０μｇで溶解を引き起こすことがで きず、緩衝液対照と同様の溶解プロフィールが得られることに注意すべきである 。 実施例５ 一本鎖Ｆｖフラグメントの調製および特徴付け Ａ．７７Ａ３のｓＦｖ形態の設計および発現 抗体のｓＦｖフラグメントは、抗体重鎖の可変領域を抗体軽鎖の可変領域とと もに１５〜２０アミノ酸のリンカーの隔たりを介してタンデム発現することによ り最も一般的に得られる。ｓＦｖフラグメントは親抗体よりも血液凝固への付着 が優れていることが期待される。ｓＦｖ７７Ａ３−１用のリンカ−１としてＹＰ ＲＳＩＹＩＲＲＲＨＰＳＰＳＬＴＴ（配列番号７３）およびｓＦｖ７７Ａ３−２ 用のリンカー２としてＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳＧＧＳＧＳ（配列番号７４）を用い 、ＶＨ−(リンカー)−ＶＬ極性(polarity)を有するマウス可変領域を用いて２つ の構築物、ｐ５３−６およびｐ５２−１２を調製した。両構築物をｐＥＴ−２２ ｂベクター（ノバゲンから）中にクローニングし、最小Ｍ９培地中で増殖させた 大腸菌のＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。Ｈｉｓ−タグ生成物の大部分が 封入体中に認められたが、菌体溶解液の上澄み液には充分な量の可溶性ｓＦｖフ ラグメントがニッケル−カラム精製で含まれていた。 ニッケル−カラムから回収した画分７〜１１中に存在するｓＦｖ７７Ａ３−２ からはＭＷ約３０,０００の単一のクマシーブルー染色が得られ、これは計算し たＭＷ値２９,９８６とよく一致した。ｓＦｖ７７Ａ３−１についても同様の、 しかし一層弱い染色ゲルが得られた。 Ｂ．ｓＦｖ７７Ａ３−１およびｓＦｖ７７Ａ３−２の活性 ｓＦｖ７７Ａ３−１およびｓＦｖ７７Ａ３−２の両者の調製物のα２−抗プラ スミン結合活性を競合結合アッセイにおいて試験した。７７Ａ３をコーティング したマイクロプレートウエルを、ビオチン化ヒトα２−抗プラスミンとｓＦｖ７ ７Ａ３−１かもしくはｓＦｖ７７Ａ３−２のいずれかとの混合物、正の対照７７ Ａ３および負の対照ｍＡｂ−５９Ｄ８で処理した。増大量の７７Ａ３はビオチン 化ヒトα２−抗プラスミンの結合を妨害したが、負の対照５９Ｄ８は競合インヒ ビターとしてほとんど影響を及ぼさなかった。クマシー染色バンドの強度から推 定した被験試料の濃度にて、ｓＦｖ７７Ａ３−１およびｓＦｖ７７Ａ３−２はと もにビオチン化ヒトα２−抗プラスミンの結合を完全に抑制し、抑制のプロフィ ールは親の７７Ａ３のものとほぼ重なり合った。 ７７Ａ３上に存在するイディオタイプマーカーは、ヒト、マウス、ヒヒおよび カニクイザルからの免疫グロブリンを有するカラムを用いた複数の免疫吸着工程 により特異的としたビオチン化ポリクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩ ＳＡでプローブした（ステンゼルージョンソン＆イエルトン、シアトル）。マイ クロプレートウエルを対照としての７７Ａ３および５９Ｄ８およびｓＦｖ７７Ａ ３−１およびｓＦｖ７７Ａ３−２でコーティングした。７７Ａ３対照および両ｓ Ｆｖフラグメントは試験した各投与量でイディオタイプマーカーを有し、ｓＦｖ フラグメントが親の７７Ａ３と同様に「見える」ことを示していた。 本発明が上記および実施例で具体的に記載した以外の仕方で実施できることは 明らかであろう。 上記の教示に基づいて本発明の多くの改変および変更が可能であり、それゆえ かかる改変および変更は添付の特許請求の範囲の範囲内である。 本明細書中に引用したすべての文献、特許出願および特許の開示は、参照のた め本明細書中に引用される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年５月１２日（１９９８．５．１２） 【補正内容】 抗体も提供される。一本鎖抗体を作成する方法は当技術分野でよく知られている 。例えば米国特許第4,946,778号、米国特許第5,260,203号、米国特許第5,091,51 3号、米国特許第5,455,030号を参照されたい（これら特許はすべて参考文献とし て本明細書の一部を構成する）。 また上記モノクローナル抗体の変種も本発明の範囲に含まれるものとする。 本発明者らは、（１）ヒトおよびヒト以外の循環α２-抗プラスミン類と（２ ）ヒトおよびヒト以外のフィブリン架橋α２-抗プラスミン類の両方に結合でき る数種類の免疫分子のヌクレオチド配列とアミノ酸配列を決定した。したがって 本発明は、本発明の免疫分子またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含 んでなる核酸分子を提供する。 遺伝コードの縮重と遺伝コードが既知であるという事実から、本発明のヌクレ オチドと同じアミノ酸配列をコードする他のヌクレオチド配列はすべて決定でき 、それらは本発明の実施に使用できる。 次に挙げる抗体鎖をコードするヌクレオチド配列を含有するDNAクローンは199 7年９月19日にアメリカンタイプカルチャーコレクション（20862メリーランド州 ロックビル・パークローンドライブ12301）に寄託された：77A3の軽鎖（77A3LC ），ATCC受託番号209290；49C9の軽鎖（49C9LC），ATCC受託番号209291；70B11 の軽鎖（70B11LC），ATCC受託番号209292；77A3の重鎖（77A3HC），ATCC受託番 号209287；49C9の重鎖（49C9HC），ATCC受託番号209289；70B11の重鎖（70B11HC ），ATCC受託番号209288。 本発明の核酸分子には次に挙げるものが含まれる：配列番号９に示すまたはAT CC受託番号209290に含まれるクローンによってコードされる77A3の成熟軽鎖をコ ードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子；配列番号５に示すまたはATCC受 託番号209291に含まれるクローンによつてコードされる49C9の成熟軽鎖をコード するヌクレオチド配列を含有する核酸分子；配列番号７に示すまたはATCC受託番 号209292に含まれるクローンによってコードされる70B11の成熟軽鎖をコードす るヌクレオチド配列を含有する核酸分子。 また抗体重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子、例えば配列 番号15に示すまたはATCC受託番号209287に含まれるクローンによってコー ドされる77A3の成熟重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子、配 列番号11に示すまたはATCC受託番号209289に含まれるクローンによってコードさ れる49C9の成熟重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子、配列番 号13に示すまたはATCC受託番号209288に含まれるクローンによってコードされる 70B11の成熟重鎖をコードするヌクレオチド配列を含有する核酸分子なども本発 明に包含される。 またヒト化抗体をコードする核酸分子、例えば配列番号17のアミノ酸残基1〜1 07をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号19のアミノ酸 残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号21の アミノ酸残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子なども 包含される。 また抗体の重鎖および軽鎖の「コンセンサス（共通）」アミノ酸配列をコード する核酸分子、例えば配列番号75のアミノ酸残基1〜107をコードするヌクレオチ ド配列を含んでなる核酸分子、配列番号76のアミノ酸残基1〜107をコードするヌ クレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号77のアミノ酸残基1〜107をコー ドするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号78のアミノ酸残基1〜1 19をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号79のアミノ酸 残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列番号80の アミノ酸残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分子、配列 番号81のアミノ酸残基1〜119をコードするヌクレオチド配列を含んでなる核酸分 子なども本発明の範囲に含まれるものとする。 本発明の免疫分子をコードする核酸分子は組換えタンパク質を発現させるため に使用できる。本発明の免疫分子をコードする核酸分子は従来の技術に従ってベ クターに挿入できる。「ベクター」とは目的の配列を宿主内でクローニングまた は発現させるために使用される核酸伝達手段であると解釈すべきである。 一態様として、本組換えベクターは本発明の免疫分子を発現することができる 。あるベクターがあるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と共に、その ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された転写および 翻訳調節因子情報を含有する場合、そのベクターはそのポリペプチドを「発現す る

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ０７Ｋ 16/46 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 45/00 // Ａ６１Ｋ 45/00 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｌ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (71)出願人 ブリストル―マイヤーズ・スクイブ・カン パニー アメリカ合衆国10154ニューヨーク州 ニ ューヨーク、パーク・アベニュー345番 (72)発明者 リード，ガイ・エル アメリカ合衆国01890マサチューセッツ州 ウィンチェスター、バイン・ストリート 30番 (72)発明者 ハリス，リンダ アメリカ合衆国98112ワシントン州シアト ル、シックスティーンス・アベニュー・イ ースト1214番 (72)発明者 バヨラト，ユルゲン アメリカ合衆国98037ワシントン州リンウ ッド、サーティセブンス・アベニュー・ウ エスト17406番 (72)発明者 マツエダ，ゲイリー アメリカ合衆国08540ニュージャージー州 プリンストン、バルコート・ドライブ 137番 (72)発明者 シュ，メイ―イン アメリカ合衆国08876ニュージャージー州 ヒルズボロー、フィッシャー・ドライブ 18番 (72)発明者 ノボトニー，ジリ アメリカ合衆国08540ニュージャージー州 プリンストン、レッドヒル・ロード101 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＲＷＲと競合せず、（１）ヒトおよび非ヒト循環α２−抗プラスミンと （２）ヒトおよび非ヒトフィブリン架橋α２−抗プラスミンとの両者に結合およ び抑制することができ、 （ａ）ヒトＩｇＧ２定常領域を含むキメラ抗体；および （ｂ）一本鎖抗体 よりなる群から選ばれたものである免疫学的分子。 ２．ヒトＩｇＧ２定常領域を含むキメラ抗体である請求項１に記載の免疫学的分 子。 ３．該キメラ抗体がｃ７７Ａ３である請求項２に記載の免疫学的分子。 ４．一本鎖抗体である請求項１に記載の免疫学的分子。 ５．該一本鎖抗体が配列番号：７３のアミノ酸配列を有するリンカーを含む請求 項４に記載の一本鎖抗体。 ６．該一本鎖抗体が配列番号：７４のアミノ酸配列を有するリンカーを含む請求 項４に記載の一本鎖抗体。 ７．該一本鎖抗体がｓＦｖ抗体である請求項４に記載の一本鎖抗体。 ８．ＲＷＲと競合せず、（１）ヒトおよび非ヒト循環α２−抗プラスミンと （２）ヒトおよび非ヒトフィブリン架橋α２−抗プラスミンとの両者に結合およ び抑制することができ、 （ａ）軽鎖のＣＤＲ１領域が配列番号：７７のアミノ酸２６〜３２を含む免疫学 的分子； （ｂ）軽鎖のＣＤＲ２領域が配列番号：７７のアミノ酸５０〜５２を含む免疫学 的分子； （ｃ）軽鎖のＣＤＲ３領域が配列番号：７７のアミノ酸９１〜９６を含む免疫学 的分子； （ｄ）重鎖のＣＤＲ１領域が配列番号：８１のアミノ酸２６〜３２を含む免疫学 的分子； （ｅ）重鎖のＣＤＲ２領域が配列番号：８１のアミノ酸５３〜５６を含む免疫学 的分子；および （ｆ）重鎖のＣＤＲ３領域が配列番号：８１のアミノ酸１００〜１０７を含む免 疫学的分子 よりなる群から選ばれたものである免疫学的分子。 ９．配列番号：７７のアミノ酸１〜１０７および配列番号：８１のアミノ酸１〜 １１９を含む請求項８に記載の免疫学的分子。 １０．ＲＷＲと競合せず、（１）ヒトおよび非ヒト循環α２−抗プラスミンと （２）ヒトおよび非ヒトフィブリン架橋α２−抗プラスミンとの両者に結合およ び抑制することができ、 （ａ）軽鎖がヒト化抗体に由来し、重鎖が非ヒト化抗体に由来する免疫学的分子 、および （ｂ）軽鎖が非ヒト化抗体に由来し、重鎖がヒト化抗体に由来する免疫学的分子 よりなる群から選ばれたものである免疫学的分子。 １１．（１）ヒトおよび非ヒト循環α２−抗プラスミンと（２）ヒトおよび非ヒ トフィブリン架橋α２−抗プラスミンとの両者に結合することができ、 （ａ）軽鎖のＣＤＲ１領域が配列番号：１７のアミノ酸２６〜３２を含む免疫学 的分子； （ｂ）軽鎖のＣＤＲ２領域が配列番号：１７のアミノ酸５０〜５２を含む免疫学 的分子； （ｃ）軽鎖のＣＤＲ３領域が配列番号：１７のアミノ酸９１〜９６を含む免疫学 的分子； （ｄ）重鎖のＣＤＲ１領域が配列番号：７８のアミノ酸２６〜３２を含む免疫学 的分子； （ｅ）重鎖のＣＤＲ２領域が配列番号：７８のアミノ酸５３〜５６を含む免疫学 的分子；および （ｆ）重鎖のＣＤＲ３領域が配列番号：７８のアミノ酸１００〜１０７を含む免 疫学的分子 よりなる群から選ばれたものであるヒト化抗体。 １２．（１）ヒトおよび非ヒト循環α２−抗プラスミンと（２）ヒトおよび非ヒ トフィブリン架橋α２−抗プラスミンとの両者に結合することができ、 （ａ）配列番号：１７のアミノ酸残基１〜１０７および配列番号：１９のアミノ 酸残基１〜１１９のアミノ酸配列を含むヒト化抗体； （ｂ）配列番号：１７のアミノ酸残基１〜１０７および配列番号：２１のアミノ 酸残基１〜１１９のアミノ酸配列を含むヒト化抗体；および （ｃ）配列番号：１７のアミノ酸残基１〜１０７および配列番号：７８のアミノ 酸残基１〜１１９のアミノ酸配列を含むヒト化抗体 よりなる群から選ばれたものであるヒト化抗体。 １３．請求項１１に記載の免疫学的分子をコードするヌクレオチド配列を含む核 酸分子。 １４．（ａ）配列番号：１７のアミノ酸１〜１０７をコードするヌクレオチド配 列を含む核酸分子； （ｂ）配列番号：１９のアミノ酸１〜１１９をコードするヌクレオチド配列を含 む核酸分子； （ｃ）配列番号：２１のアミノ酸１〜１１９をコードするヌクレオチド配列を含 む核酸分子；および （ｄ）配列番号：７８のアミノ酸１〜１１９をコードするヌクレオチド配列を含 む核酸分子； よりなる群から選ばれた核酸分子。 １５．（ａ）配列番号：１７のアミノ酸１〜１０７をコードするヌクレオチド配 列を含む核酸分子をベクター中に挿入し、 （ｂ）配列番号：１９のアミノ酸１〜１１９または配列番号：２１のアミノ酸１ 〜１１９または配列番号：７８のアミノ酸１〜１１９のいずれかをコードするヌ クレオチド配列を含む核酸分子を同じまたは別のベクター中に挿入し、ついで（ ｂ）該ベクター（ａ）および（ｂ）を宿主細胞中に導入する ことを含む、組換え宿主細胞の製造方法。 １６．該宿主細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の方法。