JPH11180894A - 抗血栓治療又は予防のための薬剤 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 抗血栓治療又は予防のために有用な薬剤を提
供すること。 【解決手段】 糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対して
特異的な非ヒト起源の抗原結合領域とヒト不変領域を含
んで成り、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異
性を有するキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断
片を含有する薬剤は、抗血栓治療又は予防のために有用
である。
供すること。 【解決手段】 糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対して
特異的な非ヒト起源の抗原結合領域とヒト不変領域を含
んで成り、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異
性を有するキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断
片を含有する薬剤は、抗血栓治療又は予防のために有用
である。
Description
【０００１】発明の背景 血小板凝集は血液凝塊の形成に必須の事象である。普通
の情況下では、血液凝塊は、血管系から血液細胞が逃げ
るのを防止する作用をする。しかしながら、或る種の疾
患状態（例えば心筋硬塞）の間、凝塊は血流を制限する
か又は全く閉塞して、細胞の壊死をもたらす。
の情況下では、血液凝塊は、血管系から血液細胞が逃げ
るのを防止する作用をする。しかしながら、或る種の疾
患状態（例えば心筋硬塞）の間、凝塊は血流を制限する
か又は全く閉塞して、細胞の壊死をもたらす。
【０００２】心臓発作の患者は、典型的には、凝塊のフ
ィブリン成分を溶解する組織プラスミノーゲン活性化因
子又はストレプトキナーゼのような血栓溶解剤で処理さ
れる。フィブリン溶解と関連した主要な合併症は、血小
板凝集に基づく再閉塞であり、これは更に心臓の損傷を
もたらす。糖タンパク質（ｇｐ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容
体は、血小板凝集の原因であることが知られているの
で、これらの受容体をブロックする試薬は血栓溶解に続
く再閉塞を減少させるか又は防止しそして血栓溶解の速
度を促進すると予想される。
ィブリン成分を溶解する組織プラスミノーゲン活性化因
子又はストレプトキナーゼのような血栓溶解剤で処理さ
れる。フィブリン溶解と関連した主要な合併症は、血小
板凝集に基づく再閉塞であり、これは更に心臓の損傷を
もたらす。糖タンパク質（ｇｐ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ受容
体は、血小板凝集の原因であることが知られているの
で、これらの受容体をブロックする試薬は血栓溶解に続
く再閉塞を減少させるか又は防止しそして血栓溶解の速
度を促進すると予想される。
【０００３】血小板凝集を阻止するための１つの方法
は、ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対して特異的なモノ
クローナル抗体が関与する。血小板凝集を抑制しそして
ヒト血栓症の処置に有用であると思われる７Ｅ３と名付
けられたネズミモノクローナル抗体は、公開されたヨー
ロッパ特許出願第２０５,２７０号及び第２０６,５３２
号に記載されている。ネズミ抗体は、ヒトの治療に使用
する際には厳しい制限があることは当業界では知られて
いる。外来タンパク質として、ネズミ抗体は、その治療
効果を減少又は破壊する及び／又は患者にアレルギー反
応又は過敏症反応を誘発する免疫反応を引き起こすこと
がある。血栓塞栓症におけるこのような治療モダリティ
の再投与の必要は、これらのタイプの免疫反応の可能性
を増加させる。
は、ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体に対して特異的なモノ
クローナル抗体が関与する。血小板凝集を抑制しそして
ヒト血栓症の処置に有用であると思われる７Ｅ３と名付
けられたネズミモノクローナル抗体は、公開されたヨー
ロッパ特許出願第２０５,２７０号及び第２０６,５３２
号に記載されている。ネズミ抗体は、ヒトの治療に使用
する際には厳しい制限があることは当業界では知られて
いる。外来タンパク質として、ネズミ抗体は、その治療
効果を減少又は破壊する及び／又は患者にアレルギー反
応又は過敏症反応を誘発する免疫反応を引き起こすこと
がある。血栓塞栓症におけるこのような治療モダリティ
の再投与の必要は、これらのタイプの免疫反応の可能性
を増加させる。
【０００４】ヒト不変領域に結合した非ヒト結合領域か
ら成るキメラ抗体は、ネズミ抗体の免疫反応の問題を阻
止する手段として示唆された。ＰＮＡＳ、８１：６８５
１（１９８４）及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ８５００３
９２参照。不変領域は抗体分子の免疫反応性を大きく担
っているので、ヒト起源の不変領域を有するキメラ抗体
は、ヒトにおいて抗ネズミ応答を誘発する可能性がより
少ないであろう。しかしながら、所望の特異性のネズミ
結合領域へのヒト不変領域の連結が免疫反応性を減少さ
せ及び／又は得られるキメラ抗体の結合能力を変えるか
どうかは予想できない。
ら成るキメラ抗体は、ネズミ抗体の免疫反応の問題を阻
止する手段として示唆された。ＰＮＡＳ、８１：６８５
１（１９８４）及びＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ８５００３
９２参照。不変領域は抗体分子の免疫反応性を大きく担
っているので、ヒト起源の不変領域を有するキメラ抗体
は、ヒトにおいて抗ネズミ応答を誘発する可能性がより
少ないであろう。しかしながら、所望の特異性のネズミ
結合領域へのヒト不変領域の連結が免疫反応性を減少さ
せ及び／又は得られるキメラ抗体の結合能力を変えるか
どうかは予想できない。
【０００５】本発明の要約 本発明は、特異的な非ヒト起源の可変領域又は抗原結合
領域及びヒト起源の不変領域を含む血小板特異的キメラ
免疫グロブリンに関する。キメラ免疫グロブリンは、ｇ
ｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体又は他の血小板成分に対して
特異的であることができる。これらの抗体は、血小板に
結合しそして血小板凝集を阻止することができ、かくし
て抗血栓症剤として有用でありそして血栓溶解に続く再
閉塞を防止又は減少させるのに有用である。
領域及びヒト起源の不変領域を含む血小板特異的キメラ
免疫グロブリンに関する。キメラ免疫グロブリンは、ｇ
ｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体又は他の血小板成分に対して
特異的であることができる。これらの抗体は、血小板に
結合しそして血小板凝集を阻止することができ、かくし
て抗血栓症剤として有用でありそして血栓溶解に続く再
閉塞を防止又は減少させるのに有用である。
【０００６】本発明の詳細な記述 本発明のキメラ免疫グロブリンは、個々のキメラＨ免疫
グロブリン鎖及びＬ免疫グロブリン鎖を含んで成る。キ
メラＨ鎖は、ヒトＨ鎖不変領域に連結されたｇｐＩＩｂ
／ＩＩＩａ受容体に対して特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由
来の抗原結合領域を含んで成る。キメラＬ鎖は、ヒトＬ
鎖不変領域に連結された非ヒト抗体のＬ鎖由来の抗原結
合領域を含んで成る。
グロブリン鎖及びＬ免疫グロブリン鎖を含んで成る。キ
メラＨ鎖は、ヒトＨ鎖不変領域に連結されたｇｐＩＩｂ
／ＩＩＩａ受容体に対して特異的な非ヒト抗体のＨ鎖由
来の抗原結合領域を含んで成る。キメラＬ鎖は、ヒトＬ
鎖不変領域に連結された非ヒト抗体のＬ鎖由来の抗原結
合領域を含んで成る。
【０００７】本発明の免疫グロブリンは、一価、二価又
は多価であることができる。一価免疫グロブリンは、ジ
スルフイド橋を介してキメラＬ鎖と結合したキメラＨ鎖
から形成された二量体（ＨＬ）である。二価免疫グロブ
リンは、少なくとも１つのジスルフイド橋を介して結合
した２つの二量体から形成された四量体（Ｈ2Ｌ2）であ
る。多価免疫グロブリンは、例えば、凝集するＨ鎖不変
領域（例えばＩｇＭＨ鎖）を使用することにより製造す
ることができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2
のようなキメラ免疫グロブリン断片も製造することがで
きる。
は多価であることができる。一価免疫グロブリンは、ジ
スルフイド橋を介してキメラＬ鎖と結合したキメラＨ鎖
から形成された二量体（ＨＬ）である。二価免疫グロブ
リンは、少なくとも１つのジスルフイド橋を介して結合
した２つの二量体から形成された四量体（Ｈ2Ｌ2）であ
る。多価免疫グロブリンは、例えば、凝集するＨ鎖不変
領域（例えばＩｇＭＨ鎖）を使用することにより製造す
ることができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａｂ′）2
のようなキメラ免疫グロブリン断片も製造することがで
きる。
【０００８】キメラ免疫グロブリンの非ヒト抗原結合領
域は、血小板に対して特異的な免疫グロブリン由来のも
のである。好ましい免疫グロブリンは、血小板ｇｐＩＩ
ｂ／ＩＩＩａ受容体に対して特異的でありそして糖タン
パク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体複合体に結合するリ
ガンドをブロックする。適当な抗体の例には７Ｅ３及び
１０Ｅ５が含まれる。ヨーロッパ特許出願第２０５,２
７０号及び第２０６,５３２号参照。これらの教示は本
明細書に加入する。７Ｅ３抗体（又はそれと反応性の抗
体又は機能的に均等なエピトープ）は、ｇｐＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａ受容体の複合化形態に対して特異的であるので、
特に好ましい。ＩＩｂ又はＩＩＩａ成分のいずれかに対
して特異的な他の抗体も使用することができる。他の血
小板抗原に対して特異的な抗体を使用することができ
る。例えば、血小板と反応性の抗体である、Ｓ１２抗体
［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ)、２５９：９７９９−９８０４
（１９８４）］のような顆粒膜タンパク質ＧＭＰ−１４
０を使用することができる。
域は、血小板に対して特異的な免疫グロブリン由来のも
のである。好ましい免疫グロブリンは、血小板ｇｐＩＩ
ｂ／ＩＩＩａ受容体に対して特異的でありそして糖タン
パク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体複合体に結合するリ
ガンドをブロックする。適当な抗体の例には７Ｅ３及び
１０Ｅ５が含まれる。ヨーロッパ特許出願第２０５,２
７０号及び第２０６,５３２号参照。これらの教示は本
明細書に加入する。７Ｅ３抗体（又はそれと反応性の抗
体又は機能的に均等なエピトープ）は、ｇｐＩＩｂ／Ｉ
ＩＩａ受容体の複合化形態に対して特異的であるので、
特に好ましい。ＩＩｂ又はＩＩＩａ成分のいずれかに対
して特異的な他の抗体も使用することができる。他の血
小板抗原に対して特異的な抗体を使用することができ
る。例えば、血小板と反応性の抗体である、Ｓ１２抗体
［ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ.
Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ)、２５９：９７９９−９８０４
（１９８４）］のような顆粒膜タンパク質ＧＭＰ−１４
０を使用することができる。
【０００９】好ましくは、抗原結合領域はネズミ起源で
ある。その理由は、血小板に対する、特にｇｐＩＩｂ／
ＩＩＩａ受容体に対するネズミ抗体は入手可能であるか
又はネズミ系で生産することができるからである。他の
動物又は齧歯種は抗原結合領域の別のソースを提供す
る。
ある。その理由は、血小板に対する、特にｇｐＩＩｂ／
ＩＩＩａ受容体に対するネズミ抗体は入手可能であるか
又はネズミ系で生産することができるからである。他の
動物又は齧歯種は抗原結合領域の別のソースを提供す
る。
【００１０】キメラ抗体の不変領域は、ヒト免疫グロブ
リン由来のものである。Ｈ鎖不変領域は、５つのアイソ
タイプα、β、ε、γ又はｍｕのいずれかから選ぶこと
ができる。更に、種々のサブクラスのＨ鎖（Ｈ鎖のＩｇ
Ｇサブクラスの如き）は異なるエフェクター機能を受け
持ち、かくして所望のＨ鎖不変領域を選ぶことにより、
所望のエフェクター機能を有するキメラ抗体を生産する
ことができる。好ましい不変領域は、γ１（ＩｇＧ
１）、γ３（ＩｇＧ３）及びγ４（ＩｇＧ４）である。
Ｌ鎖不変領域はκ又はλタイプであることができる。
リン由来のものである。Ｈ鎖不変領域は、５つのアイソ
タイプα、β、ε、γ又はｍｕのいずれかから選ぶこと
ができる。更に、種々のサブクラスのＨ鎖（Ｈ鎖のＩｇ
Ｇサブクラスの如き）は異なるエフェクター機能を受け
持ち、かくして所望のＨ鎖不変領域を選ぶことにより、
所望のエフェクター機能を有するキメラ抗体を生産する
ことができる。好ましい不変領域は、γ１（ＩｇＧ
１）、γ３（ＩｇＧ３）及びγ４（ＩｇＧ４）である。
Ｌ鎖不変領域はκ又はλタイプであることができる。
【００１１】一般に、キメラ抗体は、キメラ免疫グロブ
リンのＬ鎖及びＨ鎖成分の各々のために、ヒト不変領域
の少なくとも一部をコード化している第２ＤＮＡセグメ
ントに連結された非ヒト起源の血小板特異的可変領域の
少なくとも機能的部分（例えば、連結セグメントを伴う
機能的に再配列された可変領域）をコード化している第
１ＤＮＡセグメントを含んで成る融合遺伝子を製造する
ことにより生産される。各融合した遺伝子は、発現ベク
ター中に組み込まれるか又は挿入される。受容細胞は、
遺伝子生産物を発現することができる受容細胞を、次い
で上記遺伝子でトランスフェクションする。トランスフ
ェクションされた受容細胞を導入された遺伝子の発現を
可能とする条件下に培養し、そして発現された免疫グロ
ブリンまたは免疫グロブリン鎖を回収する。
リンのＬ鎖及びＨ鎖成分の各々のために、ヒト不変領域
の少なくとも一部をコード化している第２ＤＮＡセグメ
ントに連結された非ヒト起源の血小板特異的可変領域の
少なくとも機能的部分（例えば、連結セグメントを伴う
機能的に再配列された可変領域）をコード化している第
１ＤＮＡセグメントを含んで成る融合遺伝子を製造する
ことにより生産される。各融合した遺伝子は、発現ベク
ター中に組み込まれるか又は挿入される。受容細胞は、
遺伝子生産物を発現することができる受容細胞を、次い
で上記遺伝子でトランスフェクションする。トランスフ
ェクションされた受容細胞を導入された遺伝子の発現を
可能とする条件下に培養し、そして発現された免疫グロ
ブリンまたは免疫グロブリン鎖を回収する。
【００１２】ＩｇＬ鎖及びＨ鎖の可変領域をコード化し
ている遺伝子は、血小板特異的抗体を生産するリンパ球
から得ることができる。例えば、ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ
受容体に対する抗体を生産するハイブリドーマ細胞系
は、本発明のキメラ抗体の免疫グロブリン可変領域のソ
ースを提供する。他の齧歯動物細胞系が入手可能であ
る。細胞系は、齧歯動物をヒト血小板又はｇｐＩＩｂ／
ＩＩＩａ受容体含有成分又は血小板の画分でチャレンジ
し、抗体生産細胞とミエローマ細胞系との融合したハイ
ブリッド細胞を形成し、このハイブリッドをクローニン
グしそして、血小板又は糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ受容体に対する抗体を生産するクローンを選択する
ことにより製造することができる。
ている遺伝子は、血小板特異的抗体を生産するリンパ球
から得ることができる。例えば、ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ
受容体に対する抗体を生産するハイブリドーマ細胞系
は、本発明のキメラ抗体の免疫グロブリン可変領域のソ
ースを提供する。他の齧歯動物細胞系が入手可能であ
る。細胞系は、齧歯動物をヒト血小板又はｇｐＩＩｂ／
ＩＩＩａ受容体含有成分又は血小板の画分でチャレンジ
し、抗体生産細胞とミエローマ細胞系との融合したハイ
ブリッド細胞を形成し、このハイブリッドをクローニン
グしそして、血小板又は糖タンパク質ｇｐＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ受容体に対する抗体を生産するクローンを選択する
ことにより製造することができる。
【００１３】不変領域は、標準クローン技術によりヒト
抗体生産細胞から得ることができる。別法として、２つ
のクラスのＬ鎖及び５つのクラスのＨ鎖を表現する遺伝
子がクローニングされているので、ヒト起源の不変領域
はこれらのクローンから容易に入手可能である。Ｆ（ａ
ｂ′）2及びＦａｂ断片のようなキメラ抗体結合断片
は、截頭形態（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）にキメ
ラＨ鎖遺伝子をデザインすることにより製造することが
できる。例えば、Ｆ（ａｂ′）2Ｈ鎖部分をコード化し
ているキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ1ドメイン及びヒン
ジ領域をコード化しているＤＮＡ配列を含むであろう。
抗体生産細胞から得ることができる。別法として、２つ
のクラスのＬ鎖及び５つのクラスのＨ鎖を表現する遺伝
子がクローニングされているので、ヒト起源の不変領域
はこれらのクローンから容易に入手可能である。Ｆ（ａ
ｂ′）2及びＦａｂ断片のようなキメラ抗体結合断片
は、截頭形態（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｆｏｒｍ）にキメ
ラＨ鎖遺伝子をデザインすることにより製造することが
できる。例えば、Ｆ（ａｂ′）2Ｈ鎖部分をコード化し
ているキメラ遺伝子は、Ｈ鎖のＣＨ1ドメイン及びヒン
ジ領域をコード化しているＤＮＡ配列を含むであろう。
【００１４】好ましくは、Ｌ及びＨキメラ鎖（又はその
一部）をコード化している融合した遺伝子は、受容細胞
をコトランスフェクションするのに使用することができ
る２つの異なる発現ベクター中に組み込まれる。各ベク
ターは２つの選択可能な遺伝子、−−１つはバクテリア
系における選択のため、１つは真核細胞系における選択
のため−−を含み、各ベクターは異なる遺伝子の対を有
している。これらのベクターはバクテリア系における融
合遺伝子の生産及び増幅、及び真核細胞のその後のコト
ランスフェクション及びコトランスフェクションされた
細胞の選択を可能とする。バクテリア系のための選択可
能な遺伝子の例は、アンピシリン耐性を付与する遺伝子
及びクロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子であ
る。真核細胞トランスフェクタントの選択のための２つ
の選択可能な遺伝子、（ｉ）キサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）及び
（ｉｉ）Ｔｎ５からのホスホトランスェゼ遺伝子（ｎｅ
ｏと名付ける）、が好ましい。ｇｐｔによる選択は、こ
の遺伝子によりコード化された酵素の、プリンヌクレオ
チド合成のための基質としてキサンチンを使用する能力
に基づいており、類似の内在酵素は選択できない。イノ
シンモノホスフェートのキサンチンモノホスフェートへ
の転換を阻止する、キサンチン及びマイコフェノール酸
を含む培地中で、ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞のみが生
き残ることができる。ｎｅｏの生産物は抗生物質Ｇ４１
８及びそのクラスの他の抗生物質により引き起こされる
真核細胞中でのタンパク質合成の抑制を阻止する。２つ
の選択方法を同時に又は順次に使用して、真核細胞中に
２つの異なるＤＮＡベクター上に導入された免疫グロブ
リン鎖遺伝子の発現について選択することができる。
一部）をコード化している融合した遺伝子は、受容細胞
をコトランスフェクションするのに使用することができ
る２つの異なる発現ベクター中に組み込まれる。各ベク
ターは２つの選択可能な遺伝子、−−１つはバクテリア
系における選択のため、１つは真核細胞系における選択
のため−−を含み、各ベクターは異なる遺伝子の対を有
している。これらのベクターはバクテリア系における融
合遺伝子の生産及び増幅、及び真核細胞のその後のコト
ランスフェクション及びコトランスフェクションされた
細胞の選択を可能とする。バクテリア系のための選択可
能な遺伝子の例は、アンピシリン耐性を付与する遺伝子
及びクロラムフェニコール耐性を付与する遺伝子であ
る。真核細胞トランスフェクタントの選択のための２つ
の選択可能な遺伝子、（ｉ）キサンチン−グアニンホス
ホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ）及び
（ｉｉ）Ｔｎ５からのホスホトランスェゼ遺伝子（ｎｅ
ｏと名付ける）、が好ましい。ｇｐｔによる選択は、こ
の遺伝子によりコード化された酵素の、プリンヌクレオ
チド合成のための基質としてキサンチンを使用する能力
に基づいており、類似の内在酵素は選択できない。イノ
シンモノホスフェートのキサンチンモノホスフェートへ
の転換を阻止する、キサンチン及びマイコフェノール酸
を含む培地中で、ｇｐｔ遺伝子を発現する細胞のみが生
き残ることができる。ｎｅｏの生産物は抗生物質Ｇ４１
８及びそのクラスの他の抗生物質により引き起こされる
真核細胞中でのタンパク質合成の抑制を阻止する。２つ
の選択方法を同時に又は順次に使用して、真核細胞中に
２つの異なるＤＮＡベクター上に導入された免疫グロブ
リン鎖遺伝子の発現について選択することができる。
【００１５】好ましい受容細胞系はミエローマ細胞であ
る。ミエローマ細胞は、トランスフェクションされたＩ
ｇ遺伝子によりコード化された免疫グロブリンを、合成
し、組立てそして分泌することができる。更に、それら
は免疫グロブリンのグリコシル化の機構を有する。特に
好ましい受容細胞はＩｇ非生産性ミエローマ細胞Ｓｐ２
／０である。この細胞は、トランスフェクションされた
免疫グロブリン遺伝子によりコード化された免疫グロブ
リンのみを生産する。ミエローマ細胞は培養物中で又は
マウスの腹膜内で増殖することができ、そこで分泌され
た免疫グロブリンを腹水から得ることができる。Ｂリン
パ球又はハイブリドーマ細胞の如き他のリンパ球は、適
当な受容細胞として働くことができる。
る。ミエローマ細胞は、トランスフェクションされたＩ
ｇ遺伝子によりコード化された免疫グロブリンを、合成
し、組立てそして分泌することができる。更に、それら
は免疫グロブリンのグリコシル化の機構を有する。特に
好ましい受容細胞はＩｇ非生産性ミエローマ細胞Ｓｐ２
／０である。この細胞は、トランスフェクションされた
免疫グロブリン遺伝子によりコード化された免疫グロブ
リンのみを生産する。ミエローマ細胞は培養物中で又は
マウスの腹膜内で増殖することができ、そこで分泌され
た免疫グロブリンを腹水から得ることができる。Ｂリン
パ球又はハイブリドーマ細胞の如き他のリンパ球は、適
当な受容細胞として働くことができる。
【００１６】免疫グロブリンコード化遺伝子を含むベク
ターでリンパ球をトランスフェクションするいくつかの
方法がある。リンパ球にＤＮＡを導入する好ましい方法
は、エレクトロポレーションによる。この方法では、受
容細胞は、導入されるべきＤＮＡの存在下に電気パルス
にさらされる。例えば、ポッター等、ＰＮＡＳ ８１：
７１６１（１９８４）参照。ＤＮＡを導入する他の方法
は原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）融合による。この
方法では、リゾチームを使用して、キメラＩｇ遺伝子を
含む組換えプラスミドを収容するバクテリアから細胞壁
をはがす。得られる原形質体をポリエチレングリコール
によりミエローマ細胞と融合させる。原形質体融合の
後、トランスフェクタントを選びそして単離する。多く
のタイプの細胞にＤＮＡを導入するのに使用することが
できる他の方法はリン酸カルシウム沈殿である。
ターでリンパ球をトランスフェクションするいくつかの
方法がある。リンパ球にＤＮＡを導入する好ましい方法
は、エレクトロポレーションによる。この方法では、受
容細胞は、導入されるべきＤＮＡの存在下に電気パルス
にさらされる。例えば、ポッター等、ＰＮＡＳ ８１：
７１６１（１９８４）参照。ＤＮＡを導入する他の方法
は原形質体（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔ）融合による。この
方法では、リゾチームを使用して、キメラＩｇ遺伝子を
含む組換えプラスミドを収容するバクテリアから細胞壁
をはがす。得られる原形質体をポリエチレングリコール
によりミエローマ細胞と融合させる。原形質体融合の
後、トランスフェクタントを選びそして単離する。多く
のタイプの細胞にＤＮＡを導入するのに使用することが
できる他の方法はリン酸カルシウム沈殿である。
【００１７】キメラ免疫グロブリン遺伝子は、バクテリ
ア又は酵母のような非リンパ球で発現させることができ
る。バクテリアで発現される場合には、免疫グロブリン
Ｈ鎖及びＬ鎖は封入体の一部となる。かくして、鎖は、
単離され、精製され、次いで機能化免疫グロブリン分子
に組み立てられなければならない。
ア又は酵母のような非リンパ球で発現させることができ
る。バクテリアで発現される場合には、免疫グロブリン
Ｈ鎖及びＬ鎖は封入体の一部となる。かくして、鎖は、
単離され、精製され、次いで機能化免疫グロブリン分子
に組み立てられなければならない。
【００１８】本発明のキメラ血小板特異的抗体は、抗血
栓症治療剤として有用である。キメラ抗体（又はその断
片）を使用して、血小板凝集及び血栓形成を抑制するこ
とができる。この抗体は、血栓形成又は再形成を防止す
べきいかなる情況においても使用することができる。例
えば、この抗体は、血管形成後の処理、肺塞栓症、深静
脈血栓症及び冠状バイパス手術における凝塊を防止する
のに単独で使用することができる。この抗体は、組織プ
ラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ又はストレプ
トキナーゼのような血栓溶解剤と共に投与して、血栓溶
解後に起こりうる再閉塞を防止又は減少させそして凝塊
溶解を促進させることができる。抗体又は断片は、再閉
塞を生じうる血小板凝集を防止するのに十分な量で、血
栓溶解剤の投与の前、投与と共に又は投与の後に投与す
ることができる。抗体は、無菌食塩水の如き製薬学的に
許容しうるビヒクル中で、非経口的に、好ましくは静脈
内に与えられる。抗体は、多数回投与するか又は制御さ
れた放出機構（例えばポリマー又はバッチ投与系によ
り）により与えることができる。
栓症治療剤として有用である。キメラ抗体（又はその断
片）を使用して、血小板凝集及び血栓形成を抑制するこ
とができる。この抗体は、血栓形成又は再形成を防止す
べきいかなる情況においても使用することができる。例
えば、この抗体は、血管形成後の処理、肺塞栓症、深静
脈血栓症及び冠状バイパス手術における凝塊を防止する
のに単独で使用することができる。この抗体は、組織プ
ラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ又はストレプ
トキナーゼのような血栓溶解剤と共に投与して、血栓溶
解後に起こりうる再閉塞を防止又は減少させそして凝塊
溶解を促進させることができる。抗体又は断片は、再閉
塞を生じうる血小板凝集を防止するのに十分な量で、血
栓溶解剤の投与の前、投与と共に又は投与の後に投与す
ることができる。抗体は、無菌食塩水の如き製薬学的に
許容しうるビヒクル中で、非経口的に、好ましくは静脈
内に与えられる。抗体は、多数回投与するか又は制御さ
れた放出機構（例えばポリマー又はバッチ投与系によ
り）により与えることができる。
【００１９】抗血小板抗体による繰り返し治療中に、薬
剤誘発の血小板血症が起こることがあり、これは、身体
が、抗体被覆血小板を、それらに対し抗体を生じる外来
タンパク質として認識し、次いでそれらを普通よりは迅
速に除去する結果であるかも知れない。キメラ抗血小板
（例えばｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ）抗体の使用は、この問
題を回避することができる。キメラ抗体のネズミ成分の
大部分は血小板（例えばｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体）
に結合され、かくして、キメラ抗体を、同じエピトープ
指向性ヒト抗体から機能的に識別可能とする免疫系に受
け入れられず、故に非免疫原性であると予想される。
剤誘発の血小板血症が起こることがあり、これは、身体
が、抗体被覆血小板を、それらに対し抗体を生じる外来
タンパク質として認識し、次いでそれらを普通よりは迅
速に除去する結果であるかも知れない。キメラ抗血小板
（例えばｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ）抗体の使用は、この問
題を回避することができる。キメラ抗体のネズミ成分の
大部分は血小板（例えばｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ受容体）
に結合され、かくして、キメラ抗体を、同じエピトープ
指向性ヒト抗体から機能的に識別可能とする免疫系に受
け入れられず、故に非免疫原性であると予想される。
【００２０】本発明の血小板特異的キメラ免疫原性グロ
ブリンは、血栓像形成にも有用である。この目的で、抗
体断片が一般に好ましい。上記のように、キメラＨ鎖遺
伝子は、トランケーテッド形態でデザインされて、免疫
原性シンチグラフィーの像形成のためのキメラ免疫原性
グロブリン断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａ
ｂ′）2）を生成することができる。これらの分子は、
直接又はＤＴＰＡの如きカップリングしたキレート化剤
を介して、131ヨウ素、125ヨウ素、99mテクネチウム又
は111インジウムのような放射性同位元素により標識し
て、放射免疫原性シンチグラフィー剤を生成することが
できる。別法として、放射金属結合（キレート化）ドメ
インを、キレート化抗体部位中に工学的につくって標識
部位を得ることができる。かくして、キレート化免疫原
性グロブリンは、非ヒト血小板特異的可変領域、ヒト不
変領域（好ましくはトランケーションされた）及びメタ
ロチオニンの如き金属結合タンパク質由来の金属結合ド
メインを有するタンパク質としてデザインすることがで
きる。
ブリンは、血栓像形成にも有用である。この目的で、抗
体断片が一般に好ましい。上記のように、キメラＨ鎖遺
伝子は、トランケーテッド形態でデザインされて、免疫
原性シンチグラフィーの像形成のためのキメラ免疫原性
グロブリン断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ′又はＦ（ａ
ｂ′）2）を生成することができる。これらの分子は、
直接又はＤＴＰＡの如きカップリングしたキレート化剤
を介して、131ヨウ素、125ヨウ素、99mテクネチウム又
は111インジウムのような放射性同位元素により標識し
て、放射免疫原性シンチグラフィー剤を生成することが
できる。別法として、放射金属結合（キレート化）ドメ
インを、キレート化抗体部位中に工学的につくって標識
部位を得ることができる。かくして、キレート化免疫原
性グロブリンは、非ヒト血小板特異的可変領域、ヒト不
変領域（好ましくはトランケーションされた）及びメタ
ロチオニンの如き金属結合タンパク質由来の金属結合ド
メインを有するタンパク質としてデザインすることがで
きる。
【００２１】血小板特異的キレート化免疫原性グロブリ
ンは、血栓を有する疑いのある患者に投与される。標識
された免疫原性グロブリンを血栓部位に局在させるのに
十分な時間の後、標識により発生した信号をγカメラの
如きフォトスキャン装置により検出される。検出された
信号は、次いで血栓の像に転換される。この像は、生体
内で血栓を突き止めそして適当な治療方法を案出するこ
ととを可能とする。
ンは、血栓を有する疑いのある患者に投与される。標識
された免疫原性グロブリンを血栓部位に局在させるのに
十分な時間の後、標識により発生した信号をγカメラの
如きフォトスキャン装置により検出される。検出された
信号は、次いで血栓の像に転換される。この像は、生体
内で血栓を突き止めそして適当な治療方法を案出するこ
ととを可能とする。
【００２２】本発明を、更に下記の実施例により説明す
る。特記しない限り、すべての部及び百分率は重量によ
るものであり、度は摂氏である。
る。特記しない限り、すべての部及び百分率は重量によ
るものであり、度は摂氏である。
【００２３】説明 実施例１ キメラ血小板特異的ＩｇＧ４の生産Ａ・一般的方法 ７Ｅ３ハイブリドーマからのＨ鎖及びＬ鎖遺伝子のため
の可変領域をクローニングする方法は、機能的に配列さ
れた（そして発現された）Ｉｇ遺伝子のための可変領域
と対応するＪ（連結）領域とのゲノムにおける連結に基
づいた。Ｊ領域ＤＮＡプローブを使用してゲノムライブ
ラリーをスクリーニングして、Ｊ領域に連結されたＤＮ
Ａを単離することができる。生殖系配置（ｇｅｒｍｌｉ
ｎｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）（再配列されてい
ない）中のＤＮＡも又Ｊプローブにハイブリダイゼーシ
ョンするが、可変領域配列には連結されず、そして単離
されたクローンの制限酵素分析により同定することがで
きる。
の可変領域をクローニングする方法は、機能的に配列さ
れた（そして発現された）Ｉｇ遺伝子のための可変領域
と対応するＪ（連結）領域とのゲノムにおける連結に基
づいた。Ｊ領域ＤＮＡプローブを使用してゲノムライブ
ラリーをスクリーニングして、Ｊ領域に連結されたＤＮ
Ａを単離することができる。生殖系配置（ｇｅｒｍｌｉ
ｎｅ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）（再配列されてい
ない）中のＤＮＡも又Ｊプローブにハイブリダイゼーシ
ョンするが、可変領域配列には連結されず、そして単離
されたクローンの制限酵素分析により同定することがで
きる。
【００２４】故に、このクローニング法は、ＪH及びＪK
プローブを使用して再配列されたＨ鎖及びＬ鎖遺伝子か
ら可変領域を単離することであった。これらのクローン
を、それらの配列が７Ｅ３ハイブリドーマ中で発現され
たかどうかを決定するためにノーザン分析により試験し
た。発現された配列を含んだこれらのクローンは、ヒト
不変領域を含む発現ベクターに入れそしてマウスミエロ
ーマ細胞にトランスフェクションして、抗体が生産され
たかどうかを決定した。次いで生産性細胞からの抗体を
７Ｅ３ネズミ抗体と比較して、結合特異性及び機能性に
ついて試験した。
プローブを使用して再配列されたＨ鎖及びＬ鎖遺伝子か
ら可変領域を単離することであった。これらのクローン
を、それらの配列が７Ｅ３ハイブリドーマ中で発現され
たかどうかを決定するためにノーザン分析により試験し
た。発現された配列を含んだこれらのクローンは、ヒト
不変領域を含む発現ベクターに入れそしてマウスミエロ
ーマ細胞にトランスフェクションして、抗体が生産され
たかどうかを決定した。次いで生産性細胞からの抗体を
７Ｅ３ネズミ抗体と比較して、結合特異性及び機能性に
ついて試験した。
【００２５】Ｂ・材料及び方法 Ｈ鎖ゲノムライブラリー構築 ７Ｅ３ハイブリドーマからＨ鎖可変領域遺伝子を単離す
るために、ファージλベクターｇｔ１０を使用してサイ
ズ選択ゲノムライブラリーを構築した。ＪHプローブを
使用するＥｃｏＲＩ消化７Ｅ３ＤＮＡのサザーン分析
は、再配列されたＨ鎖位置に相当する単一３．５ｋｂバ
ンドを示した。この断片は、７Ｅ３Ｈ鎖可変領域遺伝子
を含んでいるようであった。高分子量ＤＮＡを７Ｅ３ハ
イブリドーマ細胞から単離し、そして制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩで完全に消化した。次いでＤＮＡを
０．７％アガロースゲルで分別し、３−４ｋｂサイズ範
囲のＤＮＡをゲルから直接単離した。フェノール／クロ
ロホルム抽出及びセファデックスＧ−５０ゲル濾過の
後、３−４ｋｂ断片をλＧＴ１０アーム（プロメガ・バ
イオテック・インコーポレーテッド）と連結しそしてプ
ロメガ・バイオテックからパッケージェネを使用して生
体外でファージ粒子中にパッケージした。このライブラ
リーを32Ｐ標識ＪHプローブを使用して約３０,０００プ
ラーク／１５０ｍｍペトリ皿の密度で直接スクリーニン
グした。プラークハイブリダイゼーションは５×ＳＳ
Ｃ、５０％ホルムアミド、２×デンハートの試薬、２０
０μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡ中で４２℃で１８−２
０時間行った。最終洗浄は、０.５×ＳＳＣ、０.１％Ｓ
ＤＳ中で６５℃で行った。正のクローンをオートラジオ
グラフィーの後同定した。
るために、ファージλベクターｇｔ１０を使用してサイ
ズ選択ゲノムライブラリーを構築した。ＪHプローブを
使用するＥｃｏＲＩ消化７Ｅ３ＤＮＡのサザーン分析
は、再配列されたＨ鎖位置に相当する単一３．５ｋｂバ
ンドを示した。この断片は、７Ｅ３Ｈ鎖可変領域遺伝子
を含んでいるようであった。高分子量ＤＮＡを７Ｅ３ハ
イブリドーマ細胞から単離し、そして制限エンドヌクレ
アーゼＥｃｏＲＩで完全に消化した。次いでＤＮＡを
０．７％アガロースゲルで分別し、３−４ｋｂサイズ範
囲のＤＮＡをゲルから直接単離した。フェノール／クロ
ロホルム抽出及びセファデックスＧ−５０ゲル濾過の
後、３−４ｋｂ断片をλＧＴ１０アーム（プロメガ・バ
イオテック・インコーポレーテッド）と連結しそしてプ
ロメガ・バイオテックからパッケージェネを使用して生
体外でファージ粒子中にパッケージした。このライブラ
リーを32Ｐ標識ＪHプローブを使用して約３０,０００プ
ラーク／１５０ｍｍペトリ皿の密度で直接スクリーニン
グした。プラークハイブリダイゼーションは５×ＳＳ
Ｃ、５０％ホルムアミド、２×デンハートの試薬、２０
０μｇ／ｍｌ変性サケ***ＤＮＡ中で４２℃で１８−２
０時間行った。最終洗浄は、０.５×ＳＳＣ、０.１％Ｓ
ＤＳ中で６５℃で行った。正のクローンをオートラジオ
グラフィーの後同定した。
【００２６】Ｌ鎖ゲノムライブラリー構築 ７Ｅ３Ｌ鎖の可変領域遺伝子を単離するために、ゲノム
ライブラリーをλベクターＥＭＢＬ−３中に構築した。
高分子量ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａで
部分的に消化しそして１０−４０％スクロース密度勾配
でサイズ分別した。１８−２３ｋｂのＤＮＡ断片をＥＭ
ＢＬ−３アームと連結しそしてパッケージェネを使用し
て生体外でファージ粒子中にパッケージした。このライ
ブラリーを、ＪKプローブを使用して３０,０００プラー
ク／１５０ｍｍプレートの密度でスクリーニングした。
ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はＨ鎖ライブラリ
ーで使用したのと同じであった。
ライブラリーをλベクターＥＭＢＬ−３中に構築した。
高分子量ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａで
部分的に消化しそして１０−４０％スクロース密度勾配
でサイズ分別した。１８−２３ｋｂのＤＮＡ断片をＥＭ
ＢＬ−３アームと連結しそしてパッケージェネを使用し
て生体外でファージ粒子中にパッケージした。このライ
ブラリーを、ＪKプローブを使用して３０,０００プラー
ク／１５０ｍｍプレートの密度でスクリーニングした。
ハイブリダイゼーション及び洗浄条件はＨ鎖ライブラリ
ーで使用したのと同じであった。
【００２７】ＤＮＡプローブ マウスＨ鎖ＪHプローブは、Ｊ３及びＪ４セグメントの
両方を含む２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片であ
る。マウスＬ鎖ＪKプローブは、すべての５つのＪKセグ
メントを含む２.７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片である。
32Ｐ標識プローブは、アマーシャム社から得られるキッ
トを使用してニックトランスレーションにより製造し
た。遊離ヌクレオチドはセファデックスＧ−５０カラム
を通して遠心分離により除去された。プローブの特異的
活性は約１０9ｃｐｍ／μｇであった。
両方を含む２ｋｂのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ断片であ
る。マウスＬ鎖ＪKプローブは、すべての５つのＪKセグ
メントを含む２.７ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片である。
32Ｐ標識プローブは、アマーシャム社から得られるキッ
トを使用してニックトランスレーションにより製造し
た。遊離ヌクレオチドはセファデックスＧ−５０カラム
を通して遠心分離により除去された。プローブの特異的
活性は約１０9ｃｐｍ／μｇであった。
【００２８】ノザーン分析 １５μｇの全細胞ＤＮＡを、１％アガロース／ホルムア
ルデヒドゲル（マニアチス等、モレキュラー・クローニ
ング）での電気泳動に付しそしてニトロセルロースに移
した。ブロットを、５０％ホルムアミド、２×デンハー
トの試薬、５×ＳＳＣ及び２００μｇ／ｍｌ変性サケ精
子ＤＮＡ中でニックトランスレーションされたＤＮＡプ
ローブと、４２℃で１０時間ハイブリダイゼーションし
た。最終洗浄条件は、６５℃で０.５×ＳＳＣ０.１％Ｓ
ＤＳであった。
ルデヒドゲル（マニアチス等、モレキュラー・クローニ
ング）での電気泳動に付しそしてニトロセルロースに移
した。ブロットを、５０％ホルムアミド、２×デンハー
トの試薬、５×ＳＳＣ及び２００μｇ／ｍｌ変性サケ精
子ＤＮＡ中でニックトランスレーションされたＤＮＡプ
ローブと、４２℃で１０時間ハイブリダイゼーションし
た。最終洗浄条件は、６５℃で０.５×ＳＳＣ０.１％Ｓ
ＤＳであった。
【００２９】エレクトロポレーションを使用するＤＮＡ
トランスフェクション トランスフェクションされるべきプラスミドＤＮＡを、
エチジウムブロミド／塩化セシウム勾配中で平衡まで２
回遠心分離することにより精製した。１０−５０μｇの
プラスミドＤＮＡを氷上のＰＢＳ中の８×１０6ＳＰ２
／０細胞に加え、そして混合物をバイオラドのエレクト
ロポレーション装置に入れた。エレクトロポレーション
は、２００ボルトでありそして細胞を９６ウエルのマイ
クロタイタープレートに付着させた（ｐｌａｔｅ ｏｕ
ｔ）。適当な薬剤選択を４８時間後に適用しそして薬剤
耐性コロニーを１−２週間後に同定した。
トランスフェクション トランスフェクションされるべきプラスミドＤＮＡを、
エチジウムブロミド／塩化セシウム勾配中で平衡まで２
回遠心分離することにより精製した。１０−５０μｇの
プラスミドＤＮＡを氷上のＰＢＳ中の８×１０6ＳＰ２
／０細胞に加え、そして混合物をバイオラドのエレクト
ロポレーション装置に入れた。エレクトロポレーション
は、２００ボルトでありそして細胞を９６ウエルのマイ
クロタイタープレートに付着させた（ｐｌａｔｅ ｏｕ
ｔ）。適当な薬剤選択を４８時間後に適用しそして薬剤
耐性コロニーを１−２週間後に同定した。
【００３０】抗体生産の定量 精製したＩｇＧで得られ標準曲線を使用して、粒子濃度
蛍光イムノアッセイ（ジョリー・エム・イー等、ジャー
ナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、６７：２１）
により、組織培養上澄液のＩｇＧタンパク質含有率を分
析したヒト不変領域を有するキメラ７Ｅ３抗体の濃度
を、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体被覆ポリスチレンビーズ
及びフルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体を使
用して決定した。このアッセイは、自動化装置（パンデ
ックス・ラボラトリーズ社）で行った。
蛍光イムノアッセイ（ジョリー・エム・イー等、ジャー
ナル・オブ・イムノロジカル・メソッズ、６７：２１）
により、組織培養上澄液のＩｇＧタンパク質含有率を分
析したヒト不変領域を有するキメラ７Ｅ３抗体の濃度
を、ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体被覆ポリスチレンビーズ
及びフルオレセイン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体を使
用して決定した。このアッセイは、自動化装置（パンデ
ックス・ラボラトリーズ社）で行った。
【００３１】血小板特異的キメラＩｇＧ４抗体の精製 ダイアフロＹＭ１００限外濾過膜（アミコン）により組
織培養上澄液を濃縮し、そしてタンパク質Ａ−セファロ
ースカラムに加えた。ｐＨ６.５からｐＨ３.５までのク
エン酸ナトリウムｐＨ勾配によりキメラ抗体をタンパク
質Ａカラムから溶離した。精製した抗体をダイアフロＹ
Ｍ１００限外濾過膜を使用して濃縮した。抗体濃度は２
８０ｎｍでの吸光度を決定することにより測定した。
織培養上澄液を濃縮し、そしてタンパク質Ａ−セファロ
ースカラムに加えた。ｐＨ６.５からｐＨ３.５までのク
エン酸ナトリウムｐＨ勾配によりキメラ抗体をタンパク
質Ａカラムから溶離した。精製した抗体をダイアフロＹ
Ｍ１００限外濾過膜を使用して濃縮した。抗体濃度は２
８０ｎｍでの吸光度を決定することにより測定した。
【００３２】結合抑制アッセイ 精製した抗体（ネズミ７Ｅ３又はキメラ７Ｅ３）を使用
して、ヒト血小板に対する結合について放射ヨウ素化７
Ｅ３抗体と競合させた。血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）
を、１８７５ｒｐｍで３.５分クエン酸塩処理全ヒト血
液を遠心分離することにより製造した。125Ｉ標識７Ｅ
３抗体（１５０,０００ｃｐｍ）を精製した試験抗体の
適当な希釈物に加えそして反応を１５０ μ１ＰＲＰの
添加により開始した。室温でインキュベーションを１−
２時間行いそして結合した抗体を有する血小板を、遊離
抗体から、０.４ｍｌマイクロヒュージ管中で１２,００
０ｇで４分間３０％スクロースを通して遠心分離するこ
とにより分離した。血小板／抗体ペレットを含む管先端
を切り取り、そしてγ計数管で計数した。ヨウ素化７Ｅ
３とキメラ７Ｅ３の血小板に対する結合の競争を、ヨウ
素化７Ｅ３と非標識７Ｅ３ＩｇＧの競争に対して比較し
た。
して、ヒト血小板に対する結合について放射ヨウ素化７
Ｅ３抗体と競合させた。血小板に富んだ血漿（ＰＲＰ）
を、１８７５ｒｐｍで３.５分クエン酸塩処理全ヒト血
液を遠心分離することにより製造した。125Ｉ標識７Ｅ
３抗体（１５０,０００ｃｐｍ）を精製した試験抗体の
適当な希釈物に加えそして反応を１５０ μ１ＰＲＰの
添加により開始した。室温でインキュベーションを１−
２時間行いそして結合した抗体を有する血小板を、遊離
抗体から、０.４ｍｌマイクロヒュージ管中で１２,００
０ｇで４分間３０％スクロースを通して遠心分離するこ
とにより分離した。血小板／抗体ペレットを含む管先端
を切り取り、そしてγ計数管で計数した。ヨウ素化７Ｅ
３とキメラ７Ｅ３の血小板に対する結合の競争を、ヨウ
素化７Ｅ３と非標識７Ｅ３ＩｇＧの競争に対して比較し
た。
【００３３】血小板凝集の抑制 精製した７Ｅ３又はキメラ７Ｅ３抗体をクエン酸塩処理
全ヒト血液に加え、そして３７℃で１０分間インキュベ
ーションした。血小板凝集の速度を、全血液凝集検出計
（クロノログ社）を使用してコラーゲン又はＡＤＰによ
る活性化の後測定した。
全ヒト血液に加え、そして３７℃で１０分間インキュベ
ーションした。血小板凝集の速度を、全血液凝集検出計
（クロノログ社）を使用してコラーゲン又はＡＤＰによ
る活性化の後測定した。
【００３４】ｃ・結果 血小板特異的可変遺伝子領域のクローニング それぞれ、ＪH及びＪKプローブを使用して約１００万の
プラークをスクリーニングした後Ｈ鎖及びＬ鎖ライブラ
リーからいくつかの正のクローンを単離した。少なくと
も３ラウンドのプラーク精製の後、各正のクローンにつ
いてバクテリオファージＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ
（Ｈ鎖クローン）又はＨｉｎｄＩＩＩ（Ｌ鎖クローン）
で消化しそして１％アガロースゲルで分別した。ＤＮＡ
をニトロセルロースに移しそしてブロットをＪH（Ｈ
鎖）又はＪK 32Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイゼ
ーションさせた。ＪHプローブにハイブリダイゼーショ
ンした３.５ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を含んでいる２
つのクローンが得られた。３.０及び６.０ｋｂの２つの
サイズクラスのＨｉｎｄＩＩＩ断片がＪKプローブによ
り同定された。
プラークをスクリーニングした後Ｈ鎖及びＬ鎖ライブラ
リーからいくつかの正のクローンを単離した。少なくと
も３ラウンドのプラーク精製の後、各正のクローンにつ
いてバクテリオファージＤＮＡを単離し、ＥｃｏＲＩ
（Ｈ鎖クローン）又はＨｉｎｄＩＩＩ（Ｌ鎖クローン）
で消化しそして１％アガロースゲルで分別した。ＤＮＡ
をニトロセルロースに移しそしてブロットをＪH（Ｈ
鎖）又はＪK 32Ｐ標識ＤＮＡプローブとハイブリダイゼ
ーションさせた。ＪHプローブにハイブリダイゼーショ
ンした３.５ｋｂＥｃｏＲＩＤＮＡ断片を含んでいる２
つのクローンが得られた。３.０及び６.０ｋｂの２つの
サイズクラスのＨｉｎｄＩＩＩ断片がＪKプローブによ
り同定された。
【００３５】７Ｅ３ハイブリドーマからの真性のＨ及び
Ｌ鎖可変領域に対応するクローニングされたＤＮＡは、
ハイブリドーマから単離したｍＲＮＡにハイブリダイゼ
ーションするはずである。Ｈ又はＬ鎖位置における非機
能的ＤＮＡ再配列は発現されないはずである。図１は、
３.５ｋｂＥｃｏＲＩ推定Ｈ鎖断片及び６.０ｋｂＨｉｎ
ｄＩＩＩ推定Ｌ鎖断片は各々７Ｅ３ハイブリドーマから
の適当なサイズのｍＲＮＡにハイブリダイゼーションす
ることを示すノザーン分析を示す。サブクローニングさ
れた断片をニックトランスレーションにより32Ｐで標識
し、そしてＳＰ２／０（７Ｅ３ハイブリドーマの融合相
手）又は７Ｅ３由来の全ＲＮＡを含むノザーンブロット
にハイブリダイゼーションさせた。３.５ｋｂＥｃｏＲ
ＩＨ鎖断片は７Ｅ３ＲＮＡの２ｋｂｍＲＮＡとハイブリ
ダイゼーションするが、ＳＰ２／０ＲＮＡにおいてはし
ない。同様に、６.０ｋｂＬ鎖ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、
７Ｅ３ＲＮＡ中の１２５０ｂｐｍＲＮＡとハイブリダイ
ゼーションするが、ＳＰ２／０ＲＮＡにおいてはしな
い。これらは、それぞれＨ鎖及びＬ鎖ｍＲＮＡの正確な
サイズである。クローニングされたＤＮＡ断片は７Ｅ３
ハイブリドーマにおいて発現された配列を含んでいるの
で、これらのデータは、これらが７Ｅ３ハイブリドーマ
からの正確な可変領域配列であることを示唆する。しか
しながら、最終機能試験は、これらの配列は、適当な不
変領域配列と組み合わせられるとき、ネズミ７Ｅ３抗体
の特異性及びアフィニテイと同様な特異性及びアフィニ
テイを有する抗体の合成を指向することができるという
証明である。
Ｌ鎖可変領域に対応するクローニングされたＤＮＡは、
ハイブリドーマから単離したｍＲＮＡにハイブリダイゼ
ーションするはずである。Ｈ又はＬ鎖位置における非機
能的ＤＮＡ再配列は発現されないはずである。図１は、
３.５ｋｂＥｃｏＲＩ推定Ｈ鎖断片及び６.０ｋｂＨｉｎ
ｄＩＩＩ推定Ｌ鎖断片は各々７Ｅ３ハイブリドーマから
の適当なサイズのｍＲＮＡにハイブリダイゼーションす
ることを示すノザーン分析を示す。サブクローニングさ
れた断片をニックトランスレーションにより32Ｐで標識
し、そしてＳＰ２／０（７Ｅ３ハイブリドーマの融合相
手）又は７Ｅ３由来の全ＲＮＡを含むノザーンブロット
にハイブリダイゼーションさせた。３.５ｋｂＥｃｏＲ
ＩＨ鎖断片は７Ｅ３ＲＮＡの２ｋｂｍＲＮＡとハイブリ
ダイゼーションするが、ＳＰ２／０ＲＮＡにおいてはし
ない。同様に、６.０ｋｂＬ鎖ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、
７Ｅ３ＲＮＡ中の１２５０ｂｐｍＲＮＡとハイブリダイ
ゼーションするが、ＳＰ２／０ＲＮＡにおいてはしな
い。これらは、それぞれＨ鎖及びＬ鎖ｍＲＮＡの正確な
サイズである。クローニングされたＤＮＡ断片は７Ｅ３
ハイブリドーマにおいて発現された配列を含んでいるの
で、これらのデータは、これらが７Ｅ３ハイブリドーマ
からの正確な可変領域配列であることを示唆する。しか
しながら、最終機能試験は、これらの配列は、適当な不
変領域配列と組み合わせられるとき、ネズミ７Ｅ３抗体
の特異性及びアフィニテイと同様な特異性及びアフィニ
テイを有する抗体の合成を指向することができるという
証明である。
【００３６】ベクター及び発現系 ７Ｅ３ハイブリドーマからクローニングされた推定Ｌ及
びＨ鎖Ｖ遺伝子を、前記した（サン・エル等、ＰＮＡＳ
８４、２１４−２１８頁（１９８７））発現ベクター
においてヒトＫ及びＧ４不変領域遺伝子に連結させた。
ｐＳＶ１８４△Ｈｎｅｏ１７−１ＡＶKｈＣKの１７−１
ＡＶKＨｉｎｄＩＩＩ断片を、７Ｅ３からの推定Ｌ鎖可
変領域遺伝子に相当する６.０ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片
で置き換えた。同様に、ｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７−１Ａ
ＶH−ｈＣG4の１７−１ＡＶHＥｃｏＲＩ断片を、７Ｅ３
からの推定Ｈ鎖Ｖ領域遺伝子に相当する３.５ｋｂＥｃ
ｏＲＩ断片で置き換えた。ｐ７Ｅ３ＶKｈＣHK及びｐ７
Ｅ３ＶHｈＣG4と名付けられた得られるプラスミドの構
造を図２に示す。
びＨ鎖Ｖ遺伝子を、前記した（サン・エル等、ＰＮＡＳ
８４、２１４−２１８頁（１９８７））発現ベクター
においてヒトＫ及びＧ４不変領域遺伝子に連結させた。
ｐＳＶ１８４△Ｈｎｅｏ１７−１ＡＶKｈＣKの１７−１
ＡＶKＨｉｎｄＩＩＩ断片を、７Ｅ３からの推定Ｌ鎖可
変領域遺伝子に相当する６.０ｋｂＨｉｎｄＩＩＩ断片
で置き換えた。同様に、ｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７−１Ａ
ＶH−ｈＣG4の１７−１ＡＶHＥｃｏＲＩ断片を、７Ｅ３
からの推定Ｈ鎖Ｖ領域遺伝子に相当する３.５ｋｂＥｃ
ｏＲＩ断片で置き換えた。ｐ７Ｅ３ＶKｈＣHK及びｐ７
Ｅ３ＶHｈＣG4と名付けられた得られるプラスミドの構
造を図２に示す。
【００３７】キメラＨ及びＬ鎖遺伝子を発現させるため
に、２つのプラスミドを、非生産性マウスミエローマ細
胞系ＳＰ２／０にコトランスフェクションした。Ｌ鎖プ
ラスミドは、Ｇ４１８に対する耐性を与えそしてＨ鎖プ
ラスミドはマイコフェノール酸に対する耐性を与え、か
くして、各プラスミドからの遺伝子を有しそして発現す
るクローンを得るのに２重選択を使用することを可能と
する。Ｇ４１８及びマイコフェノール酸に対して耐性の
コロニーを安定な細胞系に拡大し、両薬剤の存在下に保
持した。これらの細胞系からの組織培養上澄液を、ヤギ
抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体及びフルオレセインで標識された
同じ抗体で被覆されたポリスチレンビーズによる粒子濃
度蛍光イムノアッセイを使用して抗体について試験し
た。チェックした最初の１０系統から、約２μｇ／ｍｌ
を生産した１つ（ｃ−７Ｅ３Ｆ６と名付ける）を更なる
検討のために選んだ。
に、２つのプラスミドを、非生産性マウスミエローマ細
胞系ＳＰ２／０にコトランスフェクションした。Ｌ鎖プ
ラスミドは、Ｇ４１８に対する耐性を与えそしてＨ鎖プ
ラスミドはマイコフェノール酸に対する耐性を与え、か
くして、各プラスミドからの遺伝子を有しそして発現す
るクローンを得るのに２重選択を使用することを可能と
する。Ｇ４１８及びマイコフェノール酸に対して耐性の
コロニーを安定な細胞系に拡大し、両薬剤の存在下に保
持した。これらの細胞系からの組織培養上澄液を、ヤギ
抗ヒトＩｇＧＦｃ抗体及びフルオレセインで標識された
同じ抗体で被覆されたポリスチレンビーズによる粒子濃
度蛍光イムノアッセイを使用して抗体について試験し
た。チェックした最初の１０系統から、約２μｇ／ｍｌ
を生産した１つ（ｃ−７Ｅ３Ｆ６と名付ける）を更なる
検討のために選んだ。
【００３８】血小板結合活性アッセイ タンパク質Ａ−セファロースカラムを使用してｃ−７Ｅ
３Ｆ６抗体の精製の後、抗体を濃縮し、そして血小板結
合活性アッセイにおいてネズミ７Ｅ３ＩｇＧと比較し
た。図３は、ネズミ７Ｅ３及びｃ−７Ｅ３Ｆ６（推定キ
メラ抗体）が血小板結合について同じ程度に放射標識７
Ｅ３と競争することを示す。結合曲線は重なることがで
き、これはネズミ及びキメラ７Ｅ３の結合特性が同じで
あることを示している。
３Ｆ６抗体の精製の後、抗体を濃縮し、そして血小板結
合活性アッセイにおいてネズミ７Ｅ３ＩｇＧと比較し
た。図３は、ネズミ７Ｅ３及びｃ−７Ｅ３Ｆ６（推定キ
メラ抗体）が血小板結合について同じ程度に放射標識７
Ｅ３と競争することを示す。結合曲線は重なることがで
き、これはネズミ及びキメラ７Ｅ３の結合特性が同じで
あることを示している。
【００３９】ｃ−７Ｅ３Ｆ６による血小板凝集の抑制 精製したｃ−７Ｅ３Ｆ６を、試験抗体のヒト血小板の凝
集を抑制する能力を測定する機能アッセイにおいてネズ
ミ７Ｅ３と比較した。図４に示された結果は、両抗体は
同じ抗体濃度で同じ程度にコラーゲン誘発血小板凝集を
抑制することを示す。ｃ−７Ｅ３Ｆ６は、同様な程度に
ＡＤＰ誘発血小板凝集も抑制する。
集を抑制する能力を測定する機能アッセイにおいてネズ
ミ７Ｅ３と比較した。図４に示された結果は、両抗体は
同じ抗体濃度で同じ程度にコラーゲン誘発血小板凝集を
抑制することを示す。ｃ−７Ｅ３Ｆ６は、同様な程度に
ＡＤＰ誘発血小板凝集も抑制する。
【００４０】血小板結合アッセイ及び血小板凝集の抑制
アッセイの結果は、１．）正確な可変領域遺伝子が実際
に７Ｅ３ハイブリドーマからクローニングされること、
２）マウス不変領域をヒト不変領域で替えることは、こ
れらのアッセイにより測定して７Ｅ３可変領域の結合又
は機能的特性に対して影響しないことを示す。
アッセイの結果は、１．）正確な可変領域遺伝子が実際
に７Ｅ３ハイブリドーマからクローニングされること、
２）マウス不変領域をヒト不変領域で替えることは、こ
れらのアッセイにより測定して７Ｅ３可変領域の結合又
は機能的特性に対して影響しないことを示す。
【００４１】フィブロゲン被覆ビーズアッセイ キメラｃ−７Ｅ３Ｆ６抗体は、抗体の血小板及びフィブ
リノーゲン被覆ビーズ間の凝集を抑制する能力を測定す
る定性的、機能アッセイにおいて正であることが見出さ
れた。カラー・ビー等、（１９８３）ジャーナル・オブ
・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ）、７３：３２５−３３８。
リノーゲン被覆ビーズ間の凝集を抑制する能力を測定す
る定性的、機能アッセイにおいて正であることが見出さ
れた。カラー・ビー等、（１９８３）ジャーナル・オブ
・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ．Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｎｖｅｓｔ）、７３：３２５−３３８。
【００４２】実施例２・キメラＩｇＧ１及びＩｇＧ３の
製造 ネズミ７Ｅ３抗体からのＨ鎖の可変領域をコード化して
いるＤＮＡセグメントを、１７−１Ａ可変領域断片を７
Ｅ３可変領域断片で置き換えることにより、発現ベクタ
ーｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７−１ＡＶH−ｈＣG1及びｐＳ
Ｖ２△Ｈｇｐｔ１７−１ＡＶH−ｈＣG3（サン等、ＰＮ
ＡＳ ８４、２１４−２１８頁、１９８７）上に存在す
るヒト１及び３不変領域に連結した。得られるキメラＨ
鎖遺伝子を、キメラＬ鎖遺伝子と共にＳＰ２／０細胞中
にコトランスフェクションして、γ１、Ｋ、及びγ３、
Ｋ抗体を分泌する安定な細胞系を発生させた。
製造 ネズミ７Ｅ３抗体からのＨ鎖の可変領域をコード化して
いるＤＮＡセグメントを、１７−１Ａ可変領域断片を７
Ｅ３可変領域断片で置き換えることにより、発現ベクタ
ーｐＳＶ２△Ｈｇｐｔ１７−１ＡＶH−ｈＣG1及びｐＳ
Ｖ２△Ｈｇｐｔ１７−１ＡＶH−ｈＣG3（サン等、ＰＮ
ＡＳ ８４、２１４−２１８頁、１９８７）上に存在す
るヒト１及び３不変領域に連結した。得られるキメラＨ
鎖遺伝子を、キメラＬ鎖遺伝子と共にＳＰ２／０細胞中
にコトランスフェクションして、γ１、Ｋ、及びγ３、
Ｋ抗体を分泌する安定な細胞系を発生させた。
【００４３】均等物 当業者は、本明細書に記載の本発明の態様に対する均等
物を、ルーチンな実験をするだけで認識し又は確認する
であろう。このような均等物は請求の範囲に包含される
ことを意図する。
物を、ルーチンな実験をするだけで認識し又は確認する
であろう。このような均等物は請求の範囲に包含される
ことを意図する。
【図１】プローブとしてクローン化された可変領域を使
用する７Ｅ３モノクローナル抗体のためのＨ鎖及びＬ鎖
ｍＲＮＡ′ｓのノザーン分析の結果を示す図である。
用する７Ｅ３モノクローナル抗体のためのＨ鎖及びＬ鎖
ｍＲＮＡ′ｓのノザーン分析の結果を示す図である。
【図２】それぞれ、キメラ７Ｅ３免疫グロブリンのＬ鎖
及びＨ鎖のキメラ遺伝子構築物を有するプラスミドｐ７
Ｅ３ＶKｈＣk及びｐ７Ｅ３ＶHｈＣG4の略図である。
及びＨ鎖のキメラ遺伝子構築物を有するプラスミドｐ７
Ｅ３ＶKｈＣk及びｐ７Ｅ３ＶHｈＣG4の略図である。
【図３】血小板に対するキメラ７Ｅ３免疫グロブリンの
結合を示すグラフである。
結合を示すグラフである。
【図４】キメラ７Ｅ３免疫グロブリンによる血小板凝集
の抑制を示すグラフである。
の抑制を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/02 Ａ６１Ｋ 37/54 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 バリイ・エス・コラー アメリカ合衆国ニユーヨーク州11746デイ クスヒルズ・ダラムドライブ２ (72)発明者 デビツト・エム・ナイト アメリカ合衆国ペンシルベニア州19301パ オリ・フエザントランドライブ208
Claims (21)
- 【請求項１】 糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対して
特異的な非ヒト起源の抗原結合領域とヒト不変領域を含
んで成るキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断片
を有効成分として含有し、該免疫グロブリン又は断片が
糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異性を有する
ことを特徴とする抗血栓治療又は予防剤。 - 【請求項２】 非ヒト起源の抗原結合領域がネズミ起源
のものである請求項１記載の薬剤。 - 【請求項３】 キメラ免疫グロブリン又はキメラ免疫グ
ロブリン断片がリガンドの糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩ
ａ受容体への結合を阻止することができる請求項１記載
の薬剤。 - 【請求項４】 抗原結合領域がモノクローナル抗体７Ｅ
３由来のものである請求項１記載の薬剤。 - 【請求項５】 免疫グロブリン断片がＦａｂ、Ｆａｂ′
又はＦ（ａｂ′）2断片である請求項４記載の薬剤。 - 【請求項６】 キメラ免疫グロブリン又はキメラ免疫グ
ロブリン断片がヒト血小板への結合に関して７Ｅ３モノ
クローナル抗体と競合しうるものである請求項１記載の
薬剤。 - 【請求項７】 （ｉ）血栓溶解剤、及び（ｉｉ）糖タン
パク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対して特異的な非ヒト起源の
抗原結合領域とヒト不変領域を含んで成るキメラ免疫グ
ロブリン又は免疫グロブリン断片を有効成分として含有
し、該免疫グロブリン又は断片が糖タンパク質ＩＩｂ／
ＩＩＩａに対する特異性を有することを特徴とする抗血
栓治療又は予防のための製薬学的組成物。 - 【請求項８】 非ヒト起源の抗原結合領域がネズミ起源
のものである請求項７記載の抗血栓治療又は予防のため
の製薬学的組成物。 - 【請求項９】 血栓溶解剤が組織プラスミノーゲン活性
化因子、ストレプトキナーゼ又はウロキサーゼである請
求項７記載の抗血栓治療又は予防のための製薬学的組成
物。 - 【請求項１０】 キメラ免疫グロブリン又はキメラ免疫
グロブリン断片がリガンドの糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ受容体への結合を阻止することができる請求項７記
載の抗血栓治療又は予防のための製薬学的組成物。 - 【請求項１１】 抗原結合領域がモノクローナル抗体７
Ｅ３由来のものである請求項７記載の抗血栓治療又は予
防のための製薬学的組成物。 - 【請求項１２】 免疫グロブリン断片がＦａｂ、Ｆａ
ｂ′又はＦ（ａｂ′）2断片である請求項１１記載の抗
血栓治療又は予防のための製薬学的組成物。 - 【請求項１３】 キメラ免疫グロブリン又はキメラ免疫
グロブリン断片がヒト血小板への結合に関して７Ｅ３モ
ノクローナル抗体と競合しうるものである請求項７記載
の抗血栓治療又は予防のための製薬学的組成物。 - 【請求項１４】 糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対し
て特異的な非ヒト起源の抗原結合領域とヒト不変領域を
含んで成るキメラ免疫グロブリン又は免疫グロブリン断
片を有効成分として含有し、該免疫グロブリン又は断片
が糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａに対する特異性を有す
ることを特徴とする、血栓を有する患者又は血栓形成の
危険性のある患者に血栓溶解剤と共に投与するための薬
剤。 - 【請求項１５】 非ヒト起源の抗原結合領域がネズミ起
源のものである請求項１４記載の薬剤。 - 【請求項１６】 該薬剤の投与が血栓溶解剤の投与の
前、同時又は後である請求項１４記載の薬剤。 - 【請求項１７】 血栓溶解剤が組織プラスミノーゲン活
性化因子、ストレプトキナーゼ又はウロキサーゼである
請求項１４記載の薬剤。 - 【請求項１８】 キメラ免疫グロブリン又はキメラ免疫
グロブリン断片がリガンドの糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩ
Ｉａ受容体への結合を阻止することができる請求項１４
記載の薬剤。 - 【請求項１９】 抗原結合領域がモノクローナル抗体７
Ｅ３由来のものである請求項１４記載の薬剤。 - 【請求項２０】 免疫グロブリン断片がＦａｂ、Ｆａ
ｂ′又はＦ（ａｂ′）2断片である請求項１９記載の薬
剤。 - 【請求項２１】 キメラ免疫グロブリン又はキメラ免疫
グロブリン断片がヒト血小板への結合に関して７Ｅ３モ
ノクローナル抗体と競合しうるものである請求項１４記
載の薬剤。
Applications Claiming Priority (2)
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