JPH0930983A - アポトーシス抑制剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】アポトーシスを抑制する作用を有し、例えば、
ウイルス性肝炎、肝硬変等の肝疾患や、ストレス時の免
疫機能低下のようなアポトーシスが関与する疾患の治療
および症状の緩和に有用なアポトーシス抑制剤を提供す
る。 【解決手段】本発明のアポトーシス抑制剤は、黄連や茵
ちん蒿の含有成分である、ベルベリン、パルマチン、キ
ャピラリシン、７−メチルキャピラリシン、６，７−ジ
メチルエスクレチン、アルキャピリン、カピリン、カピ
レンおよびカピラリンからなる群から選択される少なく
とも１種を含有する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、免疫調節剤、肝炎
治療剤等の医薬として利用可能なアポトーシス抑制剤に
関する。

【０００２】

【従来の技術】近年、細胞組織の死に関し、アポトーシ
ス（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、アプポトーシスともいう；自
爆死あるいは細胞自滅）という様式が見出だされ、注目
されている。

【０００３】このアポトーシスは、病理的細胞死である
壊死と異なり、細胞自身の遺伝子に最初から組み込まれ
ている死であると考えられている。すなわち、何らかの
外部的または内部的要因が引き金になってアポトーシス
をプログラムする遺伝子が活性化され、この遺伝子を元
にプログラム死タンパク質が生合成され、生成したプロ
グラム死タンパク質により細胞自体が分解され、死に至
ると考えられている。

【０００４】このようなアポトーシスの性質から、アポ
トーシスを所望の組織、細胞で発現させることができれ
ば、不要な細胞または病原細胞を自然に生体から排除す
ることが可能となる。従って、従来より、アポトーシス
誘起作用を有する化合物の探索および開発がさかんに行
われている。例えば、本出願人は、これまでに幾つかの
アポトーシス誘起剤を提案している（特開平５−３３１
０６１号公報、特開平６−２５００２号公報、特開平６
−７２８８８号公報）。

【０００５】しかしながら、近年、アポトーシスを抑制
することが有用である場合も報告されている。例えば、
以下に示すようなものである。アルツハイマー等の患者
において、神経細胞が脱落するのを防止すること、ＨＩ
Ｖに感染していないＴ細胞がアポトーシスで死滅して行
くのを防止すること、および、抗癌剤等の副作用により
ダメージを受けやすい正常細胞の細胞死を防止するこ
と。

【０００６】しかしながら、従来、アポトーシスを抑制
することができる化合物として知られているものは少な
く、より優れたアポトーシス抑制作用を有する化合物の
開発が求められている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、かかる点に
鑑みてなされたものであり、アポトーシスを抑制する作
用を有し、例えば、ウイルス性肝炎、肝硬変等の肝疾患
や、ストレス時の免疫機能低下のようなアポトーシスが
関与する疾患の治療および症状の緩和に有用なアポトー
シス抑制剤を提供する。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明は、第１に、ベル
ベリン、パルマチン、キャピラリシン、７−メチルキャ
ピラリシン、６，７−ジメチルエスクレチン、アルキャ
ピリン、カピリン、カピレンおよびカピラリンからなる
群から選択される少なくとも１種を有効成分として含有
するアポトーシス抑制剤を提供する。

【０００９】本発明は、第２に、黄連、黄柏、蘇木、紅
秦きゅう、桜皮、樸そく、莪述、馬蘭子、路々通、耆
草、巻柏、麻黄、茯苓、乳香、前胡、虎杖根および茵ち
ん蒿からなる群から選択される少なくとも１種の生薬を
含有するアポトーシス抑制剤を提供する。

【００１０】本発明は、第３に、黄連解毒湯、三黄瀉心
湯、桂枝茯苓丸、桂枝加芍薬大黄湯、大承気湯、茵ちん
蒿湯、六味丸、木防已湯、麻子仁丸、胃苓湯、当帰建中
湯、川きゅう茶調散、桂枝加竜骨牡蛎湯、呉茱萸湯、防
風通聖散、桃核承気湯、治打撲一方、大黄牡丹皮湯、柴
朴湯、麻黄湯、麻黄附子細辛湯および茵ちん五苓散から
なる群から選択される１種の漢方薬を含有するアポトー
シス抑制剤を提供する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本願の第１発明は、ベルベリン
（ｂｅｒｂｅｒｉｎｅ）、パルマチン（ｐａｌｍａｔｉ
ｎｅ）、キャピラリシン（ｃａｐｉｌｌａｒｉｓｉ
ｎ）、７−メチルキャピラリシン（７−ｍｅｔｈｙｌｃ
ａｐｉｌｌａｒｉｓｉｎ）、６，７−ジメチルエスクレ
チン（６，７−ｄｉｍｅｔｈｙｌｅｓｃｕｒｅｔｉ
ｎ）、アルキャピリン（ａｒｃａｐｉｌｌｉｎ）、カピ
リン（ｃａｐｉｌｌｉｎ）、カピレン（ｃａｐｉｌｌｅ
ｎｅ）およびカピラリン（ｃａｐｉｒａｌｌｉｎ）から
なる群から選択される少なくとも１種の化合物を有効成
分として含有するアポトーシス抑制剤である。

【００１２】これらの有効化合物は、いずれも、茵ちん
蒿、黄連、黄柏等の生薬の含有成分である。例えば、ベ
ルベリンおよびパルマチンは黄連の含有成分である。こ
れらのうち、キャピラリシン、７−メチルキャピラリシ
ン、６，７−ジメチルエスクレチン、アルキャピリン、
カピリン、カピレンおよびカピラリンは、いずれも茵ち
ん蒿の含有成分である。また、６，７−ジメチルエスク
レチンは、花椒根の含有成分でもある。

【００１３】本願の第１発明のアポトーシス抑制剤の有
効化合物は、当該有効化合物を含有する生薬から抽出お
よび分離して用いることができる。また、人工的に合成
されたものを使用することもできる。

【００１４】また、本願の第１発明のアポトーシス抑制
剤は、上記有効化合物を含有する生薬および当該生薬の
抽出物を含有するものであっても良い。具体的には、例
えば、黄連、黄柏および茵ちん蒿からなる群から選択さ
れる少なくとも１種の生薬並びに生薬の抽出物を用いる
ことができる。

【００１５】さらに、本願の第１発明のアポトーシス抑
制剤は、上記有効化合物を含有する漢方薬も包含する。
具体的には、例えば、黄連解毒湯、三黄瀉心湯、茵ちん
蒿湯、胃苓湯、防風通聖散、柴朴湯、柴苓湯、黄連湯ま
たは茵ちん五苓散である。また、本願の第１発明のアポ
トーシス抑制剤は、上述の漢方薬の抽出物を含有する組
成物も包含する。さらに、本願の第１の発明のアポトー
シス抑制剤は、上記有効化合物を含有する植物等の天然
物からの抽出物を含有する組成物であっても良い。本願
の第２発明は、黄連、黄柏、蘇木、紅秦きゅう、桜皮、
樸そく、莪述、馬蘭子、路々通、耆草、巻柏、麻黄、茯
苓、乳香、前胡、虎杖根および茵ちん蒿からなる群から
選択される少なくとも１種を含有するアポトーシス抑制
剤である。

【００１６】本願の第２発明のアポトーシス抑制剤に用
いられる上記有効生薬は、そのままで用いても良いし、
これらの抽出物を用いても良い。

【００１７】また、本願の第２発明のアポトーシス抑制
剤は、上記生薬を含有する漢方薬または上記漢方薬の抽
出物を含有する組成物であっても良い。具体的には、例
えば、黄連解毒湯、三黄瀉心湯、桂枝茯苓丸、茵ちん蒿
湯、六味丸、胃苓湯、防風通聖散、柴朴湯、麻黄湯、麻
黄附子細辛湯および茵ちん五苓散である。

【００１８】本願の第３発明のアポトーシス抑制剤は、
黄連解毒湯、三黄瀉心湯、桂枝茯苓丸、桂枝加芍薬大黄
湯、大承気湯、茵ちん蒿湯、六味丸、木防已湯、麻子仁
丸、胃苓湯、当帰建中湯、川きゅう茶調散、桂枝加竜骨
牡蛎湯、呉茱萸湯、防風通聖散、桃核承気湯、治打撲一
方、大黄牡丹皮湯、柴朴湯、麻黄湯、麻黄附子細辛湯お
よび茵ちん五苓散からなる群から選択される１種の漢方
薬またはその抽出物である。

【００１９】本発明で用いられる漢方薬の配合割合は、
一般的に以下の通りである。 （１）黄連解毒湯 黄連 １．５〜２ 黄柏 １．５〜３ 黄ごん ３．０ 山梔子 ２〜３

【００２０】（２）三黄瀉心湯 大黄 １〜２ 黄ごん １〜１．５ 黄連 １〜１．５

【００２１】（３）桂枝茯苓丸 桂枝 ４．０ 茯苓 ４．０ 牡丹皮 ４．０ 桃仁 ４．０ 芍薬 ４．０

【００２２】（４）桂枝加芍薬大黄湯 桂枝 ４．０ 芍薬 ６．０ 大棗 ４．０ 生姜 ３〜４（乾生姜１〜２） 甘草 ２．０ 大黄 １〜２

【００２３】（５）大承気湯 厚朴 ５．０ｇ 枳実 ３．０ｇ 大黄 ２．０ｇ 無水芒硝 １．３ｇ

【００２４】（６）茵ちん蒿湯 茵ちん蒿 ４〜６ 山梔子 ２〜３ 大黄 ０．８〜２

【００２５】

【００２６】（８）木防已湯 石膏 １０．０ｇ 防巳 ４．０ｇ 桂皮 ３．０ｇ 人参 ３．０ｇ

【００２７】（９）麻子仁丸 麻子仁 ４〜５ 芍薬 ２．０ 枳実 ２．０ 厚朴 ２．０ 大黄 ３．５〜４ 杏仁 ２〜２．５

【００２８】（１０）胃苓湯 蒼朮 ２．５〜３ 厚朴 ２．５〜３ 陳皮 ２．５〜３ 猪苓 ２．５〜３ 沢瀉 ２．５〜３ 芍薬 ２．５〜３ 白朮 ２．５〜３ 茯苓 ２．５〜３ 桂枝 ２〜２．５ 大棗 １．５〜２ 乾生姜 １．５〜２ 甘草 １〜２ 縮砂 ２．０ 黄連 ２．０ 芍薬、縮砂、黄連のない場合も可

【００２９】（１１）当帰建中湯 当帰 ４．０ 桂枝 ４．０ 生姜 ４．０ 大棗 ４．０ 芍薬 ５〜６ 甘草 ２．０ 膠飴 ２０．０（なくても可）

【００３０】（１２）川きゅう茶調散 びゃくし ２．０ きょうかつ ２．０ 荊芥 ２．０ 防風 ２．０ 薄荷葉 ２．０ 甘草 １．５ 茶葉 １．５ 川きゅう ３．０ 香附子 ４．０

【００３１】（１３）桂枝加竜骨牡蛎湯 桂枝 ３〜４ 芍薬 ３〜４ 大棗 ３〜４ 生姜 ３〜４ 甘草 ２．０ 竜骨 ２．０ 牡蛎 ３．０

【００３２】（１４）呉茱萸湯 呉茱萸 ３〜４ 人参 ２〜３ 大棗 ３〜４ 生姜 ４〜６

【００３３】（１５）防風通聖散 当帰 １．２ 芍薬 １．２ 川きゅう １．２ 山梔子 １．２ 連翹 １．２ 薄荷葉 １．２ 生姜 １．２ 荊芥 １．２ 防風 １．２ 麻黄 １．２ 大黄 １．２ 芒硝 １．５ 白朮 ２．０ 桔梗 ２．０ 黄ごん ２．０ 甘草 ２．０ 石膏 ２〜３ 滑石 ３〜５

【００３４】（１６）桃核承気湯 桃仁 ５．０ 桂枝 ４．０ 大黄 １〜３ 芒硝 １〜２ 甘草 １．５

【００３５】（１７）治打撲一方 川きゅう ３．０ 樸そく ３．０ 川骨 ３．０ 桂枝 ３．０ 甘草 １．５ 丁香 １〜１．５ 大黄 １〜１．５

【００３６】（１８）大黄牡丹皮湯 大黄 １〜２ 牡丹皮 ４．０ 桃仁 ４．０ 芒硝 ４．０ 冬瓜子 ４〜６

【００３７】（１９）柴朴湯 柴胡 ４〜７ 半夏 ５〜６ 生姜 ３．０ 黄ごん ３．０ 大棗 ２〜３ 人参 ２．０ 甘草 ２．０ 茯苓 ５．０ 厚朴 ３．０ 紫蘇葉 ２．０

【００３８】（２０）麻黄湯 麻黄 ４．０〜５．０ 杏仁 ４．０〜５．０ 桂枝 ３．０〜４．０ 甘草 １．５〜２．０

【００３９】（２１）麻黄附子細辛湯 麻黄 ４．０ｇ 細辛 ３．０ｇ 修治附子末 １．０ｇ

【００４０】（２２）茵ちん五苓散 沢瀉 ４．５〜６ 茯苓 ３〜４．５ 猪苓 ３〜４．５ 桂枝 ２〜３ 茵ちん蒿 ３〜４

【００４１】上述の有効漢方薬は、そのままで使用して
も良いし、またはその抽出物を用いることができる。生
薬または漢方薬の抽出物は、例えば、水、エタノール、
アセトン、エーテルまたはこれらの混合物のような各種
溶剤による抽出物が好ましく、水抽出物（水エキス）を
用いることが特に好ましい。具体的な抽出方法として
は、生薬または漢方薬を８〜２０倍量の熱水で抽出し、
得られた抽出液を瀘過する方法が挙げられる。抽出物は
必要に応じて乾燥させ、乾燥粉末とすることもできる。

【００４２】本願の第１〜第３発明のアポトーシス抑制
剤は、経口剤、または、注射剤、点滴用剤等の非経口剤
のいずれの剤形によっても投与することができる。

【００４３】本願の第１〜第３発明のアポトーシス抑制
剤は、有効化合物、有効生薬および有効漢方薬と、選択
された剤形に応じて適宜選ばれた薬学的に許容可能な担
体と混合して調製することができる。

【００４４】経口剤の場合は、薬学的に許容可能な担体
として、例えば、デンプン、乳糖、白糖、マンニット、
カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩
等が使用される。また、経口剤の調製にあたっては、さ
らに結合剤、崩壌剤、界面活性剤、滑沢剤、流動性促進
剤、矯味剤、着色剤、香料等を配合することができる。
これらの具体例としては、以下に示すものが挙げられ
る。

【００４５】（結合剤）デンプン、デキストリン、アラ
ビアゴム末、ゼラチン、ヒドロキシプロピルスターチ、
メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリ
ウム、ヒドロキシプロピルセルコース、結晶セルロー
ス、エチルセルロース、ポリビニルピロリドン、マクロ
ゴール。

【００４６】（崩壊剤）デンプン、ヒドロキシプロピル
スターチ、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カ
ルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチ
ルセルロース、低置換ヒドロキシプロピルセルロース。

【００４７】（界面活性剤）ラウリル硫酸ナトリウム、
大豆レシチン、ショ糖脂肪酸エステル、ポリソルベート
８０−１ （滑沢剤）タルク、ロウ類、水素添加植物油、ショ糖脂
肪酸エステル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン
酸カルシウム、ステアリン酸アルミニウム、ポリエチレ
ングリコール。

【００４８】（流動性促進剤）軽質無水ケイ酸、乾燥水
酸化アルミニウムゲル、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ
酸マグネシウム。

【００４９】また、経口用の液剤としては、懸濁液、エ
マルジョン剤、シロップ剤およびエリキシル剤を例示で
きる。これらの各種剤形には、矯味、矯臭剤および着色
剤を配合しても良い。

【００５０】一方、非経口剤の場合は、常法に従い、本
発明の有効化合物並びに有効生薬および有効漢方薬の抽
出物を溶剤に溶解または懸濁させることにより調製する
ことができる。溶剤としては、例えば、注射用蒸留水、
生理食塩水．ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、
ラッカセイ油、ダイズ油、トウモロコシ油、プロピレン
グリコーノレ、ポリエチレングリコール等を用いること
ができる。また、必要に応じて、殺菌剤、防腐剤、安定
剤、等張化剤、無痛化剤等を加えることもできる。

【００５１】本願の第１〜第３発明のアポトーシス抑制
剤は、肝炎等の肝疾患や、ストレス時の免疫機能低下に
よる疾患のような、アポトーシスの亢進に起因する疾患
の治療に有用である。また、アルツハイマー等の患者に
おいて、神経細胞が脱落するのを防止するため、ＨＩＶ
に感染していないＴ細胞がアポトーシスで死滅して行く
のを防止するため、抗癌剤等の副作用によりダメージを
受けやすい正常細胞の細胞死を防止するため等に使用す
ることができる。

【００５２】

【実施例】以下、本発明の効果を確認するために行った
各種薬理効果試験について説明する。

【００５３】試験例１ ラット高分化型肝癌細胞株ＭｃＡ−ＲＨ８９９４におけ
るＴＧＦβ誘導性アポトーシスの阻害作用を、各種生薬
水エキスおよび市販の漢方製剤について調べた。なお、
ＴＧＦβは、肝細胞障害および肝細胞死の主要な因子で
あることが知られている。

【００５４】ＭｃＡ−ＲＨ８９９４細胞を、ウシ胎児血
清（ＦＢＳ）１０％添加ダルベッコ改変培地（ＤＭＥ
Ｍ）に２０万ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で分散させ、
最終濃度０．５μＣｉ／ｍｌとなるように［３Ｈ］チミ
ジンを加え、９６ウエルプレートにまいた。１６時間培
養後、表１に示す生薬の水エキスおよび表２に示す漢方
製剤［（株）ツムラ製］の水けんだく液を、表１および
表２に示す最終濃度（μｇ／ｍｌ）になるように添加し
た。１時間後、ヒトリコンビナントＴＧＦβ１（キング
醸造）を０．５ｎｇ／ｍｌになるように添加した。さら
に３６時間培養後、１／１０量の２００ｍＭ ＥＤＴ
Ａ、５％ＴｒｉｒｏｎＸ−１００、５０ｍＭトリス緩衝
液（ｐＨ８）を添加し、撹拌した。この後、ガラスフィ
ルターとＤＥＡＥフィルターを重ね合わせてハーヴェス
ターにセットし、このハーヴェスターに培養液を通し、
断片化されたＤＮＡをＤＥＡＥフィルターに、断片化さ
れていないＤＮＡをガラスフィルターに回収した。βシ
ンチレーションカウンタによって各フィルター上のカウ
ントを測定し、断片化したＤＮＡ量／｛断片化したＤＮ
Ａ量＋断片化していないＤＮＡ量｝×１００（％）をＤ
ＮＡ断片化率として求めた。

【００５５】以上の操作により一つのサンプルについ
て、ＴＧＦβ１を未添加のもの（−ＴＧＦ）、サンプル
添加１時間後にＴＧＦβ１を添加したもの（＋ＴＧＦ）
の２つのタイプの試験を行った。この結果を、表１およ
び表２に示す。また、サンプルを添加しなかった以外は
同様の手順に従ってＤＮＡ断片化率を測定したものをコ
ントロールとして表１および表２に示す。

【００５６】

【表１】

【００５７】

【表２】

【００５８】表１および表２から明らかなように、コン
トロールは、ＴＧＦβ１未添加の場合にはＤＮＡ断片化
が３２．４％であったのに対して、 ＴＧＦβ１添加の
場合には６９．３％に増加した。

【００５９】これに対して、いずれの生薬および漢方薬
についても、ＴＧＦβ１添加によって誘起されるＤＮＡ
断片化の増加が抑制された。この結果、上記生薬および
漢方薬がラット肝癌細胞株ＭｃＡ−ＲＨ８９９４におけ
るＴＧＦβ１により誘導されたアポトーシスを抑制でき
ることが確認された。

【００６０】試験例２ コラーゲン潅流法により調製したラット正常肝実質細胞
（初代培養肝細胞）を、ＦＢＳ１０％添加ＤＭＥＭ培地
に１５万ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で分散し、これを
９６ウエルプレートにまいた。１６時間培養後、表３に
示す生薬の水エキスおよび表４に示す漢方製剤［（株）
ツムラ製］の水けんだく液を、表３および表４に示す最
終濃度（μｇ／ｍｌ）になるように添加した。１時間
後、ヒトリコンビナントＴＧＦβ１（キング醸造）を
０．５ｎｇ／ｍｌになるように添加した。さらに４８時
間培養後、培地交換を行い、ＭＴＴ（３−［４，５−ジ
メチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテ
トラゾリウム ブロミド）水溶液を最終濃度１ｍｇ／ｍ
ｌとなるように加えた。４時間培養後、１０％ドデシル
硫酸ナトリウム／０．０１Ｎ塩酸を１００μｌ添加し、
１６時間インキュベーションした後、培養液の５６０ｎ
ｍの吸光度を測定し、生存細胞数を検量線より算出し
た。死細胞率（％）は、次式により求めた。 死細胞率（％）＝［｛コントロールの生存細胞数｝−
｛サンプルウエルの生存細胞数｝］／［コントロールの
生存細胞数］×１００ この結果を、表３および表４に示す。また、サンプルを
添加しなかった以外は同様の手順に従って死細胞率を測
定したものをコントロールとして表３および表４に示
す。

【００６１】

【表３】

【００６２】

【表４】

【００６３】表３および表４から明らかなように、コン
トロールの場合の死細胞率は、２３．８％であった。こ
れに対して、いずれの生薬および漢方薬についても、Ｔ
ＧＦβ１添加の場合の死細胞率はコントロールの場合に
比べて低かった。この結果、上記生薬および漢方薬が正
常ラット肝実質細胞におけるＴＧＦβ１により誘導され
るアポトーシスを抑制できることが確認された。

【００６４】試験例３ 次に、茵ちん蒿（インチンコウ）由来の化合物、キャピ
ラリシン、７−メチルキャピラリシン、６，７−ジメチ
ルエスクレチン、アルキャピリン、カピリン、カピレン
およびカピラリンについて、各種濃度を変更して、正常
ラット肝実質細胞（初代培養肝細胞）および肝癌細胞株
ＭｃＡ−ＲＨ８９９４におけるＴＧＦ誘導アポトーシス
の抑制作用について、試験例１および２で説明した手順
に従って試験を行った。

【００６５】この際の最大有効濃度およびこの濃度にお
けるＤＮＡ断片化および死細胞率を表５に示す。なお、
この結果は、コントロールによるＤＮＡ断片化および死
細胞率を１００％とした場合の割合として評価した。

【００６６】

【表５】

【００６７】この結果から明らかなように、茵ちん蒿由
来の化合物がＴＧＦβ１により誘導されたアポトーシス
を抑制する作用を有することがわかった。

【００６８】以上に説明したように、表１〜表５に示す
生薬、漢方薬および化合物が、ＴＧＦ誘導性の肝細胞ア
ポトーシスを抑制し、ひいてはウイルス肝炎、肝硬変等
の肝疾患の治療に有効であるが期待される。

【００６９】試験例４ 次に、副腎皮質ホルモン誘導性アポトーシスに対する抑
制作用を各種化合物、生薬および漢方薬について調べた
結果について説明する。

【００７０】ストレス時の免疫機能の低下は、一つに
は、副腎皮質ホルモンの分泌亢進による胸腺およびリン
パ系組織の委縮が原因であると推察されている。その際
の胸腺細胞の委縮は、副腎皮質ホルモン（グルココルチ
コイド）で誘導されるアポトーシスによると推察されて
いる。

【００７１】そこで、マウス胸腺細胞を用いて合成グル
ココルチコイドであるデキサメタゾンによって誘導され
るアポトーシスの阻害活性を各種生薬、漢方薬、およ
び、生薬に含有される化合物について調べた。

【００７２】まず、マウスＣ３Ｈ／ＨｅＮより胸腺細胞
を調製し、ＦＢＳ１０％添加ＲＰＭ１６４０培地に、６
×１０⁶ ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度で分散し、この培
地を９６ウエルプレートにまいた。

【００７３】表６に示す生薬の熱水抽出エキス、漢方薬
の水けんだく液、および、生薬に含有される化合物を表
６に示す濃度になるように添加し、３時間培養した後、
デキサメタゾンを濃度１０^-7Ｍとなるように添加した。

【００７４】サンプル添加後１５〜２４時間培養後、１
／１０量の２００ｍＭ ＥＤＴＡ、５％ＴｒｉｒｏｎＸ
−１００、５０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８）を添加し、
撹拌した。この後、６７０ｇで３０分〜１６時間遠心
し、沈殿を得た。この沈殿に１００μｌの０．４ｇ／ｌ
ＤＡＢＡ（３，５−ジアミノ安息香酸二塩酸塩）を添加
し、５５℃、２時間反応させた。励起波長４０７ｎｍ、
測定波長５００ｎｍで蛍光を測定し、ＤＮＡ標準液によ
って測定した検量線に基づいて断片化していないＤＮＡ
量を算出した。断片化したＤＮＡ量は、細胞播種時の全
ＤＮＡ量から断片化していないＤＮＡ量を減じて数値を
得た。ＤＮＡ断片化率は、［｛細胞播種時の全ＤＮＡ
量｝−｛断片化していないＤＮＡ量｝］／［細胞播種時
の全ＤＮＡ量］×１００として算出した。

【００７５】以上の操作により、１つのサンプルについ
て、デキサメタゾンを未添加のもの（−）、サンプル添
加３時間後にデキサメタゾンを添加したもの（＋）の２
つのタイプの試験を行った。この結果を、表６に示す。
また、サンプルを添加しなかった以外は同様の手順に従
ってＤＮＡ断片化率を測定したものをコントロールとし
て表６に示す。

【００７６】

【表６】

【００７７】表６から明らかなように、コントロールで
は、デキサメタゾン未添加の場合のＤＮＡ断片化は２
３．６％であり、デキサメタゾンを添加した場合には、
７８．８％に増加した。

【００７８】これに対して、表６に示す生薬、漢方薬お
よび生薬に含有される化合物を添加した場合には、いず
れも、デキサメタゾンにより誘導されたＤＮＡ断片化率
は、コントロールの場合に比べて低かった。この結果、
表６に示す生薬、漢方薬および生薬に含有される化合物
は、デキサメタゾンにより誘導されたアポトーシスを抑
制する作用を有し、ストレス時の免疫機能低下を改善す
ると共に、種々の病態における免疫調節作用を発揮する
ことが期待される。

【００７９】なお、本発明のアポトーシス抑制剤の有効
成分である化合物の急性毒性試験をＩＣＲ系雄性マウス
を用いて行ったところ、全ての化合物について、１ｇ／
ｋｇの経口投与で死亡例はなかった。従って、本発明の
アポトーシス抑制剤の有効成分である化合物は、安全性
が高いことが確認された。

【００８０】また、本発明で用いる各有効生薬はすでに
漢方薬の原料として長い歴史を有し、安全性が確認され
たものであり、副作用等の心配なく使用することができ
る。例えぱ、黄連は、マウスおよびラットに対し、投与
限界である１５ｇ／ｋｇの経口投与で死亡例が認められ
ないことから明らかなように、極めて安全性の高いもの
である。

【００８１】また、本発明のアポトーシス抑制剤で用い
られる漢方薬はすでに漢方治療において長い歴史を有
し、安全性が確認されたものであり、副作用等の心配な
く使用することができる。例えば、柴朴湯は、マウスお
よびラットに対し、投与限界である１５ｇ／ｋｇの経口
投与で死亡例が認められないことから明らかなように、
極めて安全性の高いものである。

【００８２】以下、本発明の有効化合物を使用したアポ
トーシス抑制剤の製剤例を挙げる。

【００８３】［製剤例１］ （１）コーンスターチ ４４ ｇ （２）結晶セルロース ４０ ｇ （３）カルボキシメチル セルロースカルシウム ５ ｇ （４）軽質無水ケイ酸 ０．５ｇ （５）ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ （６）パルマチン １０ ｇ 計 １００ ｇ 上記の処方に従って（１）〜（６）を均一に混合し、打
錠機にて圧縮成型して一錠２００ｍｇの錠剤を得た。

【００８４】この錠剤一錠には、パルマチン２０ｍｇが
含有されており、成人1 日３〜１０錠を数回にわけて服
用する。

【００８５】［製剤例２］ （１）結晶セルロース ８４．５ｇ （２）ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ （３）カルボキシメチル セルロースカルシウム ５ ｇ （４）ベルベリン １０ ｇ 計 １００ ｇ 上記の処方に従って（１）、（４）および（２）の一部
を均一に混合し、圧縮成型した後、粉砕し、（３）およ
び（２）の残量を加えて混合し、打錠機にて圧縮成型し
て一錠２００ｍｇの錠剤を得た。

【００８６】この錠剤一錠には、ベルベリン２０ｍｇが
含有されており、成人１日３〜１０錠を数回にわけて服
用する。

【００８７】［製剤例３］ （１）結晶セルロース ７９．５ｇ （２）１０％ヒドロキシプロピル セルロースエタノール溶液 ５０ ｇ （３）カルボキシメチル セルロースカルシウム ５ ｇ （４）ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ （５）パルマチン １０ ｇ 計 １４５ ｇ 上記の処方に従って（１）、（２）および（５）を均一
に混合し、常法によりねつ和し、押し出し造粒機により
造粒し、乾燥・解砕した後、（３）および（４）を混合
し、打錠機にて圧縮成型して一錠２００ｍｇの錠剤を得
た。

【００８８】この錠剤一錠には、パルマチン２０ｍｇが
含有されており、成人１日３〜１０錠を数回にわけて服
用する。

【００８９】［製剤例４］ （１）コーンスターチ ８４ ｇ （２）ステアリン酸マグネシウム ０．５ｇ （３）カルボキシメチル セルロースカルシウム ５ ｇ （４）軽質無水ケイ酸 ０．５ｇ （５）キャピラリシ １０ ｇ 計 １００ ｇ 上記の処方に従って（１）〜（５）を均一に混合し、圧
縮成型機にて圧縮成型後、破砕機により粉砕し、篩別し
て顆粒剤を得た。

【００９０】この顆粒剤１ｇには、キャピラリシン１０
０ｍｇが含有されており、成人１日０．６〜２ｇを数回
にわけて服用する。

【００９１】［製剤例５］ （１）結晶セルロース ８６・５ｇ （２）１０％ヒドロキシプロピル セルロースエタノール溶液 ３５ ｇ （３）７−メチルキャピラリシン １０ ｇ 計 １３１．５ｇ 上記の処方に従って（１）〜（３）を均一に混合し、ね
つ和した。押し出し造粒機により造粒後、乾燥し、篩別
して顆粒剤を得た。

【００９２】この顆粒剤１ｇには、７−メチルキャピラ
リシン１００ｍｇが含有されており、成人１日０．６〜
２ｇを数回にわけて服用する。

【００９３】［製剤例６］ （１）コーンスターチ ８９．５ｇ （２）軽質無水ケイ酸 ０．５ｇ （３）アルキャピリン １０ ｇ 計 １００ ｇ 上記の処方に従って（１）〜（３）を均一に混合し、２
００ｍｇを２号カプセルに充填した。

【００９４】このカプセル剤１カプセルには、アルキャ
ピリン２０ｍｇが含有されており、成人１日３〜１０カ
プセルを数回にわけて服用する。

【００９５】［製剤例７］ （１）注射用蒸留水 ８９．５ｇ （２）大豆油 ５ ｇ （３）大豆リン脂質 ２．５ｇ （４）グリセリン ２ ｇ （５）カピラリン １ ｇ 全量 １００ ｇ 上記の処方に従って（５）を（２）および（３）に溶解
し、これに（１）と（４）の溶液を加えて乳化し、注射
剤を得た。

【００９６】［製剤例８］ （１）注射用蒸留水 適量 （２）ブドウ糖 ２００ ｍｇ （３）パルマチン １０ ｇ 全量 １５ ｍｌ （１）注射用蒸留水に（２）および（３）を溶解させた
後、５ｍｌのアンプルに注入し、１２１℃で１５分間加
圧滅菌を行って注射剤を得た。

【００９７】次に、本発明の有効生薬を用いたアポトー
シス抑制剤の製造および製剤の例を挙げる。 ［製剤例９］ 黄連の抽出物の製造 黄連２５ｇに２．５リットルの精製水を加え、ほぽ半量
になるまで煎出を行い、濾過により生薬残渣を除去し、
濾液を得た。濾液を室温まで冷却した後、７，０００ｒ
ｐｍで３０分間遠心分離を行い、得られた上清を凍結乾
燥して熱水抽出エキスとした。

【００９８】［製剤例１０］ 黄柏の抽出物の製造 黄柏１０ｋｇに精製水１００リットルを加え、１００℃
で１時間加熱抽出した。得られた抽出液を濾過後、スプ
レードライして１５００ｇの乾燥エキス粉末を得た。

【００９９】［製剤例１１］ 蘇木の抽出物の製造 蘇木３０ｋｇに精製水３６０リットルを加え、１００℃
で６０分間抽出した。得られた抽出液を遠心分離により
固液分離し、得られた分離液を１５０℃でスプレードラ
イして乾燥エキス粉末を得た。

【０１００】［製剤例１２］ 紅蓁きゆうの抽出物の製
造 紅蓁きゆう１０ｋｇに精製水１００リットルを加え、加
熱し、１００℃になってから１時間拙出した。得られた
抽出液を遠心分離にかけ、残澄を分離して溶液８０リッ
トルを得る。

【０１０１】この溶液２０リットルを０．３μｍのメン
ブランフィルター（東洋濾紙社製）により無菌精澄濾過
する。得られた濾液をダイアフィルターＧ‐１０Ｔ（バ
イオエンジニアリング社製；分画分子量１０，０００）
を用いて限外濾過する。この限外濾過は、内容積２．０
リットルの容器の下面に直径１５２ｍｍの膜をセット
し、圧力３ｋｇ／ｃｍ² で行い、容器内の液が濃縮され
るにつれ精製水約２リットル添加する方法で実施した。
この結果、限外濾過液２０リットルを得た。

【０１０２】［製剤例１３］ 桜皮の抽出物の製造 桜皮５０ｇに５リットルの精製水を加え、ほほ半量にな
るまで煎出を行い、濾過により生薬残渣を除去し、濾液
を得た。濾液を室温まで冷却した後７，０００ｒｐｍで
３０分間遠心分離を行い、得られた上清を凍結乾燥して
熱水抽出エキスとした。

【０１０３】［製剤例１４］ 樸そくの抽出物の製造 樸そく１０ｋｇに精製水１００リットルを加え、１００
℃で１時間加熱抽出した。得られた抽出液を濾過後、ス
プレードライして１５００ｇの乾燥エキス粉末を得た。

【０１０４】［製剤例１５］ 莪述の抽出物の製造 莪述３０ｋｇに精製水３６０リットルを加え、１００℃
で６０分間抽出した。得られた抽出液を遠心分離により
固液分離し、得られた分離液を１５０℃でスプレードラ
イして乾燥エキス粉末を得た。

【０１０５】［製剤例１６］ 馬蘭子の抽出物の製造 馬蘭子１０ｋｇに精製水１００リットルを加え、加熱
し、１００℃になってから１時間抽出した。得られた抽
出液を遠心分離にかけ、残渣を分離して溶液８０リット
ルを得た。

【０１０６】この溶液２０リットルを０．３μｍのメン
ブランフィルター（東洋濾紙社製）により無菌精澄濾過
する。得られた濾液をダイアフィルターＧ−１０Ｔ（バ
イオエンジニアリング社製；分画分子量１０，０００）
を用いて限外濾過する。この限外濾過は、内容積２．０
リットルの容器の下面に直径１５２ｍｍの膜をセット
し、圧力３ｋｇ／ｃｍ² で行い、容器内の液が濃縮され
るにつれ精製水約２リットル添加する方法で実施した。
この結果、限外濾過液２０リットルを得た。

【０１０７】［製剤例１７］ 蘇木の顆粒剤の調製 実施例１６により得た蘇木の乾燥エキス粉末１０００ｇ
を乳糖９８０ｇおよびステアリン酸マグネシウム２０ｇ
と混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠し、直径
２０ｍｍ、重量２．３ｇのスラッグ錠をオシレーターで
粉砕し、整粒後篩別し、粒径２０〜５０メッシュの顆粒
剤を得た。

【０１０８】［製剤例１８］ 黄柏の錠剤の調製 実施例１２により得た黄柏の乾燥エキス粉末２５０ｇを
結晶セルロース４７ｇおよびステアリン酸マグネシウム
３ｇと混合し、この混合物を単発式打錠機にて打錠し、
直径９ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を製造した。本錠剤
１錠中には、黄柏の乾燥エキス粉末を２５０ｍｇ含有す
る。

【０１０９】［製剤例１９］ 黄連のカプセル剤の調製 実施例９により得た黄連の乾燥エキス粉末５００ｍｇを
硬カプセルに充填し、カプセル剤を調製した。

【０１１０】［製剤例２０］ 紅蓁きゅうの注射剤の調
製 実施例１２で得た紅蓁きゅうの限外濾過液２０リットル
にアラントイン（発熱物質不含）３００ｇを添加、溶解
した。これを９００本のバイアル瓶に分注した後、凍結
乾燥し、粉末注射剤を得た。この注射剤１バイアルに
は、凍結乾燥物４０６ｍｇが含まれており、１０ｍｌの
精製水に容易に溶解した。また、溶解後の注射液は、９
２％（５５０ｎｍ）の透過度を有しており、日本薬局方
の発熱性物質試験法に適合していた。

【０１１１】以下、本発明の漢方薬を用いたアポトーシ
ス抑制剤の製造および製剤の例を挙げる。

【０１１２】［製剤例２１］ 黄連解毒湯の抽出物の製
造 黄連解毒湯１７ｇ（黄連４．０ｇ、黄柏３．０ｇ、黄ご
ん６．０ｇおよび山梔子４．０ｇ）に１７０ｍｌの精製
水を加え、ほぼ半量になるまで（３０〜４０分）煎出を
行い、濾過により生薬残渣を除去し、濾液を得た。濾液
を室温まで冷却した後、７，０００ｒｐｍで３０分間遠
心分離を行い、得られた上清を凍結乾燥して熱水抽出エ
キスとした。

【０１１３】［製剤例２２］ 桂枝加竜骨牡蛎湯の製造 桂枝加竜骨牡蛎湯（桂枝３部、芍薬３部、大棗３部、生
姜３部、甘草２部、竜骨２部、牡蛎０．３部）の処方生
薬１０ｋｇに精製水１２０リットルを加え、１００℃で
１時間加熱抽出した。得られた抽出液を濾過後、スプレ
ードライして乾燥エキス粉末を得た。

【０１１４】［製剤例２３］ 菌ちん五苓散の抽出物の
製造 菌ちん五苓散（沢瀉５部、茯苓３部、猪苓３部、朮３
部、桂枝２部、茵ちん蒿３部）の処方生薬３０ｋｇに精
製水３６０リットルを加え、１００℃で６０分間抽出し
た。得られた抽出液を遠心分離により固液分離し、得ら
れた分離液を１５０℃でスプレードライして乾燥エキス
粉末を得た。

【０１１５】［製剤例２４］ 柴朴湯の抽出物の製造 柴朴湯（柴胡４部、半夏６部、生姜３部、黄ごん３部、
大棗２部、人参２部、甘草２部、茯苓５部、厚朴３部、
紫蘇葉２部）の処方生薬１０ｋｇに精製水１００リット
ルを加え、加熱し、１００℃になってから１時間抽出し
た。得られた抽出液を遠心分離にかけ、残渣を分離して
溶液８０リットルを得た。

【０１１６】この溶液２０リットルを０．３μｍのメン
プランフィルター（東洋濾紙社製）により無菌精澄濾過
する。得られた濾液をダイアフィルターＧ‐１０Ｔ（バ
イオエンジニアリング社製；分画分子量１０，０００）
を用いて限外濾過する。この限外濾過は、内容積２．０
リットルの容器の下面に直径１５２ｍｍの膜をセット
し、圧力３ｋｇ／ｃｍ² で行い、容器内の液が濃縮され
るにつれ精製水約２リットル添加する方法で実施した。
この結果、限外濾過液２０リットルを得た。

【０１１７】［製剤例２５］ 防風通聖散の抽出物の製
造 防風通聖散２８ｇ（当帰１．２ｇ、芍薬１．２ｇ、川き
ゅう１．２ｇ、山梔子１．２ｇ、連翹１．２ｇ、薄荷葉
１．２ｇ、生姜１．２ｇ、荊芥１．２ｇ、防風１．２
ｇ、麻黄１．２ｇ、大黄１．５ｇ、芒硝１．５ｇ、白朮
２．０ｇ、桔梗２．０ｇ、黄ごん２・０ｇ、甘草２．０
ｇ、石膏２．０ｇ、滑石３．０ｇ）に２８０ｍ１の精製
水を加え、ほぼ半量になるまで（３０〜４０分）煎出を
行い、濾過により生薬残渣を除去し、濾液を得た。濾液
を室温まで冷却した後、７，０００ｒｐｍで３０分間遠
心分離を行い、得られた上清を凍結乾燥して熱水抽出エ
キスとした。

【０１１８】［製剤例２６］ 菌ちん蒿湯の製造 菌ちん蒿湯（菌ちん蒿４部、山梔子２部、大黄１部）の
処方生薬１０ｋｇに精製水１２０リットルを加え、１０
０℃で１時間加熱抽出した。得られた抽出液を濾過後、
スプレードライして乾燥エキス粉末を得た。

【０１１９】［製剤例２７］ 三黄瀉心湯の抽出物の製
造 三黄瀉心湯（大黄１部、黄ごん１部、黄連１部）の処方
生薬３０ｋｇに精製水３６０リットルを加え、１００℃
で６０分間抽出した。得られた抽出液を遠心分離により
固液分離し、得られた分離液を１５０℃でスプレードラ
イして乾燥エキス粉末を得た。

【０１２０】［製剤例２８］ 呉茱萸湯の抽出物の製造 呉茱萸湯（呉茱萸４部、生姜４部、大棗３部、人参２
部）の処方生薬１０ｋｇに精製水１００リットルを加
え、加熱し、１００℃になってから１時間抽出した。得
られた抽出液を遠心分離にかけ、残渣を分離して溶液８
０リットルを得る。

【０１２１】この溶液２０リットルを０．３μｍのメン
プランフィルター（東洋濾紙社製）により無菌精澄濾過
する。得られた濾液をダイアフィルターＧ−１０Ｔ（バ
イオエンジニアリング社製；分画分子量１０，０００）
を用いて限外濾過する。この限外濾過は、内容積２．０
リットルの容器の下面に直径１５２ｍｍの膜をセット
し、圧力３ｋｇ／ｃｍ² で行い、容器内の液が濃縮され
るにつれ精製水約２リットル添加する方法で実施した。
この結果、限外濾過液２０リットルを得た。

【０１２２】［製剤例２９］ 当帰建中湯の抽出物の製
造 当帰建中湯（当帰４部、桂枝４部、生姜４部、大棗４
部、芍薬５部、甘草２部）の処方生薬１０ｋｇに精製水
１００リットルを加え、ほば半量になるまで（３０〜４
０分）煎出を行い、濾過により生薬残渣を除去し、濾液
を得た。濾液を室温まで冷却した後、７，０００ｒｐｍ
で３０分間遠心分離を行い、得られた上清を凍結乾燥し
て熱水抽出エキスとした。

【０１２３】［製剤例３０］ 桂枝茯苓丸の製造 桂枝茯苓丸（桂枝４部、茯苓４部、牡丹皮４部、桃仁４
部、芍薬４部）の処方生葉１０ｋｇに精製水１２０リッ
トルを加え、１００℃で１時間加熱抽出した。得られた
抽出液を濾過後、スプレードライして乾燥エキス粉末を
得た。

【０１２４】［製剤例３１］ 茵ちん五苓散の顆粒剤の
製造 実施例２３により調製した茵ちん五苓散の乾燥エキス粉
末１０００ｇを乳糖９８０ｇおよびステアリン酸マグネ
シウム２０ｇと混合し、この混合物を単発式打錠機にて
打錠し、直径２０ｍｍ、重量２．３ｇのスラッグ錠をオ
シレーターで粉砕し、整粒後篩別し、粒径２０〜５０メ
ッシュの顆粒剤を得た。

【０１２５】［製剤例３２］ 桂枝加竜骨牡蛎湯の錠剤
の調製 実施例２２により調製した桂枝加竜骨牡蛎湯の乾燥エキ
ス粉末２５０ｇを結晶セルロース４７ｇおよびステアリ
ン酸マグネシウム３ｇと混合し、この混合物を単発式打
錠機にて打錠し、直径９ｍｍ、重量３００ｍｇの錠剤を
製造した。本錠剤１錠中には、桂枝加竜骨牡蛎湯の乾燥
エキス粉末を２５０ｍｇ含有する。

【０１２６】［製剤例３３］ カプセル剤の調製 実施例２１により調製した黄連解毒湯の乾燥エキス粉末
５００ｍｇを硬カプセルに充填し、カプセル剤を調製し
た。

【０１２７】［製剤例３４］実施例２４で得た柴朴湯の
限外濾過液２０リットルにアラントイン（発熱物質不
含）３００ｇを添加、溶解した。これを９００本のバイ
アル瓶に分注した後、凍結乾燥し、粉末注射剤を得た。
この注射剤１バイアルには、凍結乾燥物４０６ｍｇが含
まれており、１０ｍｌの精製水に容易に洛解した。ま
た、溶解後の注射液は、９２％（５５０ｎｍ）の透過度
を有しており、日本薬局方の発熱性物質試験法に適合し
ていた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/78 Ａ６１Ｋ 35/78 Ｔ ＡＣＳ ＡＣＳＫ 31/01 31/01 31/32 31/32 31/435 31/435 35/84 35/84 Ａ Ｚ // Ｃ０７Ｄ 311/16 １０１ Ｃ０７Ｄ 311/16 １０１ 455/03 455/03 (72)発明者 小川 和生 茨城県稲敷郡阿見町吉原3586 株式会社ツ ムラ内 (72)発明者 福田 一典 茨城県稲敷郡阿見町吉原3586 株式会社ツ ムラ内

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ベルベリン、パルマチン、キャピラリシ
   ン、７−メチルキャピラリシン、６，７−ジメチルエス
   クレチン、アルキャピリン、カピリン、カピレンおよび
   カピラリンからなる群から選択される少なくとも１種を
   有効成分として含有するアポトーシス抑制剤。
2. 【請求項２】 黄連、黄柏、蘇木、紅秦きゅう、桜皮、
   樸そく、莪述、馬蘭子、路々通、耆草、巻柏、麻黄、茯
   苓、乳香、前胡、虎杖根および茵ちん蒿からなる群から
   選択される少なくとも１種の生薬を含有するアポトーシ
   ス抑制剤。
3. 【請求項３】 黄連解毒湯、三黄瀉心湯、桂枝茯苓丸、
   桂枝加芍薬大黄湯、大承気湯、茵ちん蒿湯、六味丸、木
   防已湯、麻子仁丸、胃苓湯、当帰建中湯、川きゅう茶調
   散、桂枝加竜骨牡蛎湯、呉茱萸湯、防風通聖散、桃核承
   気湯、治打撲一方、大黄牡丹皮湯、柴朴湯、麻黄湯、麻
   黄附子細辛湯および茵ちん五苓散からなる群から選択さ
   れる１種の漢方薬を含有するアポトーシス抑制剤。