JP6605036B2

JP6605036B2 - 肝臓及び腎臓の損傷関連疾患を予防し又は治療する中医薬組成物の調製法

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Publication number: JP6605036B2
Application number: JP2017544807A
Authority: JP
Inventors: 周・▲ジェームズ▼
Original assignee: Guangxi Hebabiz Pharmaceutical Technology Co Ltd
Current assignee: Guangxi Hebabiz Pharmaceutical Technology Co Ltd
Priority date: 2014-11-15
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2019-11-13
Anticipated expiration: 2035-04-29
Also published as: CN107206042A; US11160842B2; AU2015345884C1; JP2017537150A; WO2016074333A8; AU2015345884B2; WO2016074333A1; AU2015345884A1; US20190167752A1; CN107206042B

Description

本発明は、中医薬の技術分野に属し、具体的には、肝臓及び腎臓の保護に用いる中医薬組成物の調製法に関する。

千年の発展を経て、中医薬の理論は、広く深く総体治療を主張し、薬物を配合して用いる。しかしながら、本発明者は、主に伝統中医薬の二大欠点を発見した。第一の欠点は、生薬の種類が非常に多く、薬品の品質は安定性を欠き、生産工程での生薬鑑定等の過程が極めて複雑なため、量産化への移行に不利であり、第二の欠点は、経験に基づく多くの治療効果は、統計学的データで立証されない不安定な場合が多い。

例えば、特許文献１は、紫睛を主薬とし、当帰、白芍、川きゅう、熟地黄、黒胡麻、麦門冬、木瓜、酸棗仁、枸杞子、菊花、防風、天門冬、懐山薬、茯苓、車前子、桔梗、柴胡、石斛、細辛、五味子、遠志、炒棗仁、甘草等２４味の生薬を配合した、紫睛を主とする組成物――紫睛補腎湯を開示する。

特許文献２は、処方に紅参、黄ぎ、党参、茯苓、玄参、生地黄、枸杞子、牡丹皮、北沙参、天冬、麦冬、鼈甲、山茱萸、何首烏、当帰、酒で調製した白芍、酸棗仁、柏子仁、丹参、柴胡、赭石、黄精、白朮、蓮子、竜眼肉、甘草、金銀花、連翹、三七、穿山甲、紅花、桃仁、乳香、没薬、朱砂、琥珀の計３６味の薬材を含む、肝癌治療に用いる薬物組成物を開示する。

特許文献３は、当帰、炒白朮、大黄、霊芝、郁金、麦冬、黄柏、熟地黄、炒山薬、山茱萸、川きゅう、茯苓、枸杞、炒鶏内金、巴戟天、牡丹皮、敗醤草、蒲公英、連翹、野生黄ごん、山査子、炙甘草、炒白芍、北五味子の２４味の中薬原料で作られ、Ｂ型肝炎の治療、Ｂ型肝炎ウィルスによる各種臨床疾患の患者の治療に用いる中医薬組成物を開示する。

特許文献４は、蒲公英、麦冬、地黄、車前子、茵陳、黄柏、枸杞、桔梗、当帰、生地、鶏内金、半支蓮、射干、玄参、白芍、茜草の１６味の生薬で作られる、慢性Ｂ型ウィルス性肝炎を治療する薬剤を開示する。

しかし、中医薬の伝統的理論と現代薬学、薬剤学等異なる分野での本発明者の長期間の研究と実践の結果、意外にも新しい中医薬処方が得られ、生薬の種類を減少すると共に、生薬配合比と君臣佐使（くんしんさし）の関係を大幅に変更できたが、肝臓及び／又は腎臓を保護する（例えば、肝臓の損傷及び／又は腎臓の損傷を予防又は治療に用いて）治療効果が良好で安定的であった。また、本発明者は、該薬剤の調製技術を研究し、直接拡大して大規模生産への応用法を基本的に実現した。これは、実験室で研究用に少量調製する場合も、製薬工場で量産する場合も有利である。

中国特許出願第２００５１００１２８５９号公報中国特許出願第２００９１０２１４０９２号公報中国特許出願第２０１０１０２５８１６５号公報中国特許出願第２０１２１００７５５６９号公報

本発明の目的は、肝臓及び腎臓の保護に用いる新規な中医薬組成物の調製法を提供することにある。

即ち、第一点では、本発明は、肝臓及び腎臓（特に肝臓）の保護に用いられる下記重量部の生薬から生成される中医薬組成物の調製法を提供する。

玉竹１００−２００重量部、枸杞子１００−２００重量部、麦冬８０−１６０重量部、当帰７０−１３０重量部、決明子７０−１３０重量部、白芍７０−１３０重量部、陳皮７０−１３０重量部、熟地黄７０−１３０重量部、菊花７０−１３０重量部、川きゅう３０−７０重量部、九節菖蒲２０−４０重量部及び柴胡。

本明細書に記載する玉竹(Polygonatum)、枸杞子(Lycium)、麦冬(Ophiopogon)、当帰(Angelica)、決明子(Cassia)、白芍(Paeonia)、陳皮(Citrus)、熟地黄(Rehmannia)、菊花(Chrysanthemum)、川きゅう(Ligusticum)、九節菖蒲(Anemone)及び柴胡(Bupleurum)は、何れも市販され、購入できる生薬（中医薬材原料）である。たとえ若干別名や異名で販売されても、当業者は、前記名称から相応の生薬を購入できよう。

優先的に選択する第一点の中医薬組成物は、下記重量部の生薬で作られる。

玉竹１２０−１８０重量部、枸杞子１２０−１８０重量部、麦冬１００−１５０重量部、当帰８０−１２０重量部、決明子８０−１２０重量部、白芍８０−１２０重量部、陳皮８０−１２０重量部、熟地黄８０−１２０重量部、菊花８０−１２０重量部、川きゅう４０−６０重量部、九節菖蒲２５−３５重量部及び柴胡１２−１８重量部。

更に、優先的に選択する第一点の中医薬組成物は、下記重量部の生薬で作られる。

玉竹１４０−１６０重量部、枸杞子１４０−１６０重量部、麦冬１１０−１３０重量部、当帰９０−１１０重量部、決明子９０−１１０重量部、白芍９０−１１０重量部、陳皮９０−１１０重量部、熟地黄９０−１１０重量部、菊花９０−１１０重量部、川きゅう４５−５５重量部、九節菖蒲２８−３３重量部及び柴胡１４−１６重量部。

実施例では、第一点の中医薬組成物は、下記重量部の生薬から生成される。

玉竹１５０重量部、枸杞子１５０重量部、麦冬１２０重量部、当帰１００重量部、決明子１００重量部、白芍１００重量部、陳皮１００重量部、熟地黄１００重量部、菊花１００重量部、川きゅう５０重量部、九節菖蒲３０重量部及び柴胡１５重量部。

優先的に選択する第一点の中医薬組成物は、更に下記重量部の生薬で構成される。

当帰、川きゅう、菊花、柴胡、九節菖蒲及び陳皮の揮発油と、
揮発油を除去した当帰、川きゅう、菊花、柴胡、九節菖蒲及び陳皮の水溶物の非アルコール沈殿物と、
揮発油を除去しかつ水溶液を除去した当帰、川きゅう、菊花、柴胡、九節菖蒲及び陳皮の水抽出物の非アルコール沈殿物と、
玉竹、枸杞子、麦冬、決明子、白芍及び熟地黄の水抽出物の非アルコール沈殿物。

更に、優先的に選択する第一点の中医薬組成物では、揮発油は、加水蒸留しかつ揮発した油状物を取り置いて調製される。

また、優先的選択の第一点の中医薬組成物では、水溶液は、加水蒸留しかつ水溶液を取り置いて調製される。

また、優先的選択の第一点の中医薬組成物では、水抽出物は、加水して煎じかつ水溶液を取り置いて調製される。

更に、優先的選択では、加水煎じ回数は１−３回であり、優先的選択は、２回、及び／又は毎回の煎じ時間は、０.５−３時間、優先的選択は、１−１.５時間である。

また、優先的選択の第一点の中医薬組成物では、非アルコール沈殿物は、アルコール濃度を高めかつアルコール溶物を取り置いて調製される。

また、優先的選択の本発明の第一点の中医薬組成物の調製法では、アルコールはエタノールであり、更に優先的選択は、６０%(V/V)エタノールである。

更に、本発明では、第一点の中医薬組成物は、下記工程を含む方法で調製される。

（１）当帰、川きゅう、菊花、柴胡、九節菖蒲及び陳皮を粉砕して混合し、加水蒸留し、揮発油、水溶液及び水不溶性の薬渣を取り置く工程と、
（２）工程（１）で得られた薬渣と玉竹、枸杞子、麦冬、決明子、白芍及び熟地黄とを混合しかつ加水して煎じ、濾液を工程（１）で得られた水溶液と混合し、濃縮し、アルコール濃度を高め、上澄液を取りアルコールを回収した後に、濾過かつ濃縮し、清膏を得る工程と、
（３）工程（２）で得られた清膏と工程（１）で得られた揮発油とを混合する工程。

第二点、本発明は、第一点の中医薬組成物の下記工程を含む調製法を提供する。

この調整法は、量産レベルに合わせて拡大できる。従って、優先的選択の本発明の第二点の調製方法では、生薬は、量産水準にあり、例えば、玉竹の重量は、１０kg超、優先的選択は、５０kg超、更に優先的選択は１００kg超である。このように他の生薬の重量も確定できる。

第三点、肝臓及び腎臓（特に、肝臓）の保護に用いる中医薬製剤を提供する。中医薬製剤は、第一点の中医薬組成物及び薬学上許容可能な担体を含む。

本明細書では、「薬学上許容可能な担体」は、無毒の固形状、半固形状又は液状の充填剤、希釈剤、補剤、包装材又はその他の製剤補助材料をいう。治療目的、投薬方式の必要に基づき、当業者は、第一点の中医薬組成物を各種剤形（製剤）に生成でき、この組成物の優先的選択は、単位用量方式であり、例えば、錠剤、丸剤、カプセル（放出持続又は放出遅延方式を含む）、粉剤、顆粒剤、チンキ剤、シロップ剤、乳液剤、溶液又は懸濁液、噴霧剤又は液体スプレー剤、滴下剤、注射剤、自動注射装置又は座薬等である。具体的な実施の形態では、薬学上許容可能な担体は、糖、蜂蜜及び／又はエチルパラベンを含む。

第三点の中医薬製剤の優先的選択は、内服液等の内服製剤である。

優先的選択の第三点の中医薬製剤は、下記工程を含む方法で調製される。

（１）当帰、川きゅう、菊花、柴胡、九節菖蒲及び陳皮を粉砕して混合し、加水蒸留し、揮発油、水溶液及び水不溶性の薬渣を取り置く工程と、
（２）工程（１）で得られた薬渣と玉竹、枸杞子、麦冬、決明子、白芍及び熟地黄とを混合しかつ加水して煎じ、濾液を工程（１）で得られた水溶液と混合し、濃縮し、アルコール濃度を高め、上澄液を取りアルコールを回収した後に、濾過かつ濃縮し、清膏を得る工程と、
（３）工程（２）で得られた清膏と、工程（１）で得られた揮発油及び薬学上許容可能な担体とを混合する工程。

第四点、第三点の中医薬組成物の下記工程を含む調製法を提供する。

量産レベルに適合して、この調整法を拡大できる。従って、優先的選択の第四点の調製方法では、生薬は、量産水準にあり、例えば、玉竹の重量は１０kg超、優先的選択は５０kg超、更に優先的選択は１００kg超である。このように、他の生薬の重量も確定できる。

第五点、第一点の中医薬組成物の肝臓及び／又は腎臓の保護に用いる薬物の応用法を提供する。

優先的選択の第五点の応用法での肝臓及び腎臓の保護は、肝臓の損傷及び／又は腎臓の損傷、特に肝臓の損傷を予防し又は治療することにある。そのうち優先的に選択する前記肝臓の損傷及び／又は腎臓の損傷は、肝臓及び／又は腎臓の毒性化学物質により誘発される肝臓の損傷及び／又は腎臓の損傷である。また、優先的に選択する肝臓及び／又は腎臓の毒性化学物質は、アルコール、シクロホスファミド、四塩化炭素。イソニコチン酸ヒドラジド及び／又はリファンピンである。

第六点、第一点の中医薬組成物のコレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質、クレアチニン、尿素窒素及び／又は尿酸のレベル低減用の薬物、高密度リポタンパク質のレベルアップ用の薬物及び／又は脂肪肝の症状軽減用薬物の調製応用法を提供する。

本発明により調製された中医薬組成物及び中医薬製剤は、肝臓及び腎臓を良好に保護する作用があり、肝臓及び／又は腎臓の毒性化学物質により誘発される肝臓の損傷及び／又は腎臓の損傷の広範囲な予防又は治療に適し、確実かつ安定的に治療効果が得られるから、本発明には有益で優れた効果がある。また、コレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質、クレアチニン、尿素窒素及び／又は尿酸の濃度（血中）低減、高密度リポタンパク質の濃度（血中）向上、脂肪肝の症状軽減を図ることができる。本発明の中医薬組成物の調製及び中医薬製剤の調製では、基準化と品質管理が容易であり、特に、拡大量産に適する。

理解を支援するため、本発明の具体的な実施例を図面について以下説明する。本明細書の説明は、例示に過ぎず、本発明の特許請求の範囲の解釈を制限するものではないことを特に指摘する。また、参考のため本明細書に引用する文献は、全て本明細書の一部とする。

本発明の代表的薬物のアルコール性肝損傷モデルラットの血清及び肝臓関連生化学指標への影響を示し、(A)は、アルコール性肝損傷ラットモデルの血清ALT活性への影響、(B)は、アルコール性肝損傷ラットモデルの血清AST活性への影響、(C)は、アルコール性肝損傷ラットモデルの血清TB含量への影響、(D)は、アルコール性肝損傷ラットモデルの血清TG含量への影響を示す。各群のアルコール性肝損傷モデルラットの肝組織HE染色写真(200×)を示し、(A)は、ブランク対照群、(B)は、モデル群、(C)は、シリマリン群、(D)は、本発明の低用量群、(E)は、本発明の中用量群、(F)は、本発明の高用量群を示す。本発明の代表的薬物のシクロホスファミド誘発肝損傷マウスモデルの血清及び肝臓関連生化学指標への影響を示し、(A)は、シクロホスファミド誘発肝損傷マウスモデルの血清ALT活性への影響、(B)は、シクロホスファミド誘発肝損傷マウスモデルの血清AST活性への影響、(C)は、シクロホスファミド誘発肝損傷マウスモデルの血清MDA含量への影響。(D)は、シクロホスファミド誘発肝損傷マウスモデルの血清TG含量への影響を示す。各群のシクロホスファミド誘発肝損傷マウスの肝組織HE染色写真(400×)を示し、(A)は、ブランク対照群、(B)は、モデル群、(C)は、シリマリン群、(D)は、本発明の低用量群、(E)は、本発明の中用量群、(F)は、本発明の高用量群を示す。本発明の代表的薬物の四塩化炭素誘発肝損傷ラットモデルの血清及び肝臓関連生化学指標への影響を示し、(A)は、四塩化炭素誘発肝損傷ラットモデルの血清ALT活性への影響、(B)は、四塩化炭素誘発肝損傷ラットモデルの血清AST活性への影響、(C)は、四塩化炭素誘発肝損傷ラットモデルの血清TB含量への影響、(D)は、四塩化誘発肝損傷ラットモデルの血清T-SOD含量への影響を示す。各群の四塩化炭素誘発肝損傷ラットの肝組織HE染色写真(200×)を示し、(A)は、ブランク対照群、(B)は、モデル群、(C)は、シリマリン群、(D)は、本発明の低用量群、(E)は、本発明の中用量群、(F)は、本発明の高用量群を示す。本発明の代表的薬物のイソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発肝損傷ラットモデルの血清及び肝臓関連生化学指標への影響を示し、(A)は、イソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発肝損傷ラットモデルの血清ALT活性への影響、(B)は、イソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発肝損傷ラットモデルの血清AST活性への影響、(C)は、イソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発肝損傷ラットモデルの血清TB含量への影響、(D)は、イソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発肝損傷ラットモデルの血清ALP活性への影響、(E)は、イソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発肝損傷ラットモデルの肝臓内MDA含量への影響、(F)は、イソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発肝損傷ラットモデルの肝臓内T-SOD活性への影響を示す。各群のイソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発肝損傷ラットの肝組織HE染色写真(200×)を示し、(A)は、ブランク対照群、(B)は、モデル群、(C)は、シリマリン群、(D)は、本発明の低用量群、(E)は、本発明の中用量群、(F)は、本発明の高用量群を示す。

図１、図３、図５、図７中、ブランク対照群に対して、^*p<0.05,^##p<0.01,^**#p<0.001、モデル群に対して、^*p<0.05,^##p<0.01,^**#p<0.001。

本発明の中医薬組成物の調製法及び応用法の実施例を更に説明する。但し、如何なる形態でも本発明の範囲を制限するものではない。

本発明の中医薬内服液の実験室調製

当帰１００g、川きゅう５０g、菊花１００g、柴胡１５g、九節菖蒲３０g及び陳皮１００gを準備し、粉砕した後、水２０００mLを加えて９５〜１００℃下で蒸留し、蒸留で出た揮発油を収集し、蒸留容器内の物質を濾過し、水溶液を取り置き、濾過で得られた薬渣を熟地黄１００g、白芍１００g、決明子１００g、玉竹１５０g、枸杞子１５０g及び麦冬１２０gと混合し、２回加水して煎じた。１回目は、６.７L加水して１.５時間煎じ、２回目は、５.７L加水して１時間煎じ、２回煎じて得られた煎出液を合わせ、濾過し、濾液を上記水溶液と合わせ、減圧濃縮して相対密度１.１５（６０℃）の清膏にし、エタノールを加えてアルコール含量(V/V)を６０%にし、４８時間放置し、上澄液を取り、減圧してアルコール臭がなくなるまでエタノールを回収し、２倍の水(V/V)を加えて攪拌し、４８時間放置し、濾過し、濾液を減圧濃縮して相対密度１.０７（６０℃）の清膏にし、蜂蜜３００g、エチルパラベン０.３g（必要に応じて少量のエタノールでエチルパラベンを溶解配合してもよい）及び上記揮発油を加え、１０%(W/W)の水酸化ナトリウム溶液でpHを６.０に調節し、１０００mLの総量に純水を加え、均一に攪拌し、濾過して中医薬内服液を得た。

本発明の中医薬内服液の大規模調製

本発明者が実施した実験室での調製法は、基本的に直接拡大して量産に適用でき、調製した薬物の治療効果は、実験室での調製法で得られた薬物に対し統計学上の差異はなかった。具体的には、当帰１００kg、川きゅう５０kg、菊花１００kg、柴胡１５kg、九節菖蒲３０kg及び陳皮１００kgを準備し、粉砕した後、５倍の水(V/V)を加えて９５〜１００℃下で蒸留し、蒸留で出た５００mLの揮発油を収集し、蒸留容器内の物質を濾過し、水溶液を取り置き、約１２００Lの水溶液が得られ、濾過で得られた薬渣を熟地黄１００kg、白芍１００kg、決明子１００kg、玉竹１５０kg、枸杞子１５０kg及び麦冬１２０kgと混合し、２回加水して煎じた。１回目は、６７００L加水して１.５時間煎じ、２回目は、５６６０L加水して１時間煎じ、２回煎じて得られた煎出液を合わせ、濾過し、濾液を上記水溶液と合わせ、減圧濃縮して相対密度１.１５（６０℃）の清膏にし、エタノールを加えてアルコール含量(V/V)を６０%にし、４８時間放置し、上澄液を取り、減圧して無アルコール臭までエタノールを回収し、２倍の水(V/V)を加えて攪拌し、４８時間放置し、濾過し、濾液を減圧濃縮して相対密度１.０７（６０℃）の清膏にし、約５００kgの清膏を得、蔗糖３００kg、蜂蜜１５kg、エチルパラベン０.３kg（必要に応じて少量のエタノールでエチルパラベンを配合溶解してよい）及び上記揮発油を加え、１０%(W/W)の水酸化ナトリウム溶液でpHを６.０に調節し、総量１０００Lまで純水を加え、均一に攪拌し、濾過して中医薬内服液を得た。

本発明で得られる中医薬内服液のアルコール性肝障害ラットに対する薬効試験

４６匹のSDラットを準備し、１週間環境適応をさせた後、ランダムに６群（ブランク対照群６匹、他の各群８匹ずつ）に分類し、ブランク対照群(Control)、モデル群(Model)、シリマリン（陽性薬対照）群(Silymarin)（ドイツ製薬会社マダウス社より購入可能）、本発明により得られる低用量群(GX001-1)、中用量群(GX001-2.5)及び高用量群(GX001-5)とした。シリマリン群は１日１００mg/kgの用量でシリマリンを胃に灌注し、本発明により得られる低用量群、中用量群及び高用量群は、それぞれ１日１ml/kg、２.５ml/kg、５ml/kgの用量で実施例２の方法で調製した中医薬内服液を胃に灌注し、ブランク対照群とモデル群には１日１０ml/kgの生理食塩水を胃に灌注した。１１日目より開始し、毎日上記プランで４時間投与後、ブランク対照群には生理食塩水１４ml/kgを経口投与し、他の各群は何れもアルコール度５６の紅星二鍋頭白酒１４ml/kgを経口投与し、これを４週続けた。最後に酒を与えた後、水のみ与えて食餌を与えず、４時間後に重量を計量し、頚椎脱臼にて絶命させ、心臓から血液を取り、血清を分離し、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)活性、総ビリルビン(TB)含量及び総トリグリセリド(TG)含量を測定した。一部肝臓組織を取り、１０%ホルマリン溶液に固定し、切片をパラフィン包埋し、HE染色後に光学顕微鏡下で肝細胞の壊死、肝細胞の水様変化、炎症性細胞の浸潤等の病理的変化を観察した。

図１と図２に活性効果を示す。図１に示すように、ブランク対照群に比べモデルラットの血清ALT、AST活性は、顕著に上昇し、TB、TG含量が格段に上昇した。モデル群に比べ、シリマリン群、本発明で得られる各用量群のラットの血清のALT/AST活性は、著しく低下し、TB、TG含量が明確に低減した。これは、長期間のアルコール摂取に起因する機能異常と肝臓脂質代謝の乱れを有効に改善できる本発明で得られる中医薬内服液の優れた効果を示すものである。

肝臓組織のHE染色後の光学顕微鏡下観察結果を図２に示す。ブランク対照群(A)は肝小葉の構造が明確化し、中央静脈が完全で、肝細胞索が整然と並び、肝細胞の大きさが均一、細胞核が中心にあり、細胞漿はピンク色である。モデル群(B)は、肝小葉の配列が乱れ、細胞核が細胞膜の下に押され、炎症細胞の浸潤が認められ、細胞核が融合して壊死し、肝細胞が水様変性する。本発明で得られる低用量群(D)と中用量群(E)は、肝小葉の細胞構造が完全で、細胞核が中心にあり、中央静脈に僅かな壊死細胞しか認められない。本発明で得られる高用量群(F)とシリマリン群(C)では、肝小葉の細胞が整然と並び、大きさが均一で、構造が正常で、壊死と変性がなく、モデル群に比べ大幅に改善された。

本発明で得られる中医薬内服液のシクロホスファミド誘発の急性肝損傷マウスに対する薬効試験

６０匹のBALB/cマウスをランダムに６群（各群１０匹ずつ）に分類し、ブランク対照群(Control)、モデル群(Model)、シリマリン（陽性薬対照）群(Silymarin)、本発明で得られる低用量群(GX001-2.5)、中用量群(GX001-5)及び高用量群(GX001-10)とした。ブランク対照群とモデル群には、０.２mL/１０gの生理食塩水を胃に灌注し、シリマリン群は、１日２００mg/kgの用量でシリマリンを胃に灌注し、本発明で得られる低用量群、中用量群及び高用量群は、それぞれ１日２.５ml/kg、５ml/kg、１０ml/kgの用量で実施例２の方法で調製した中医薬内服液を胃に灌注し、１日１回、７日間続けた。ブランク群を除く他の各群は１、３、５、７日目にシクロホスファミドを８０m/kgを腹腔内投与した。最後に投薬の２４時間後に重量を計量し、頚椎脱臼にて絶命させ、絶命前の１６時間は、水のみ与え食餌を与えなかった。眼球を摘出して血液を取り、血清を分離し、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)活性、総ビリルビン(TB)含量を測定した。肝臓を取り出し氷生理食塩水の中で血液を洗浄し、濾紙で水分を吸い取って重量を測定し、その肝臓の一部を取り、生理食塩水氷の上で擦り潰して１０%の肝臓ホモジネートを調製し、４℃、５０００rpmにて５min遠心にかけ、試薬箱の説明に従って、肝組織ホモジネートのマロンジアルデヒド(MDA)含量を測定した。別途一部肝組織を取り、１０%ホルマリン溶液に固定し、切片をパラフィン包埋し、HE染色後に光学顕微鏡下で肝細胞の壊死、血管の病変等の病理的変化を観察した。

図３と図４に活性効果を示す。図３に示すように、正常対照群に比べモデルラットの血清ALT、AST活性は、顕著に上昇し、TB含量も格段に上昇し、肝臓中のMDA含量も明確に上昇した。モデル群に比べシリマリン群、本発明で得られる各用量群のラット体内のALT/AST活性は、一際低下し、TB、MDA含量が顕著に低減した。これは、シクロホスファミド誘発の肝機能異常を有効に改善できる本発明で得られる中医薬内服液の優れた効果を示すものである。

肝臓組織のHE染色後の光学顕微鏡下観察結果を図４に示す。ブランク対照群(A)は、肝小葉の構造が完全で、肝細胞索が整然と並び、肝洞に顕著な拡張は、認められず、集管域に拡張と繊維化は見られず、界面炎症は見られず、肝細胞には、顕著な壊死、再生、変性等が認められない。モデル群(B)は、肝小葉中心にうっ血が観察され、血管の病変硬化が明らかであるが、肝索の構造は、完全である。シリマリン群(C)は、肝細胞索が整然と並び、肝小葉が完全である等、陽性薬のシリマリン薬物の有効性を示し、モデル群に比べて、大きな改善が認められた。本発明で得られる中用量群(E)、高用量群(F)は肝小葉の細胞構造が完全で、顕著な血管病変は認められなかった。本発明で得られる低用量群(D)は、肝小葉の縁に増殖が見られた。但し治療効果は中用量群(E)、高用量群(F)との比較ではさほど明確ではない。

本発明で得られる中医薬内服液の四塩化炭素誘発の急性肝損傷ラットに対する薬効試験

体重別に３６匹のSDラットをランダムに６群（各群６匹）に分類し、ブランク対照群(Control)、モデル群(Model)、シリマリン（陽性薬対照）群(Silymarin)、本発明で得られる低用量群(GX001-1)、中用量群(GX001-2.5)及び高用量群(GX001-5)とした。ブランク対照群とモデル群には、生理食塩水２mL/２００gを胃に灌注し、シリマリン群は、１日１００mg/kgの用量でシリマリンを胃に灌注し、本発明で得られる低用量群、中用量群及び高用量群は、それぞれ１日１ml/kg、２.５ml/kg、５ml/kgの用量で実施例２の方法で調製した中医薬内服液を胃に灌注し、５日間続けた。ブランク群を除く他の各群は、２日目と３日目にシクロホスファミド：オリーブ油１:１(V/V)溶液（２ml/kg）を腹腔注射した。ラットは６日目の重量を計量し、頚椎脱臼にて絶命させ、心臓を取り出し、血清を分離し、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)活性、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)活性、総ビリルビン(TB)含量を測定した。肝臓を取り出し氷生理食塩水の中で血液を洗浄し、濾紙で水分を吸い取って重量を測定し、その肝臓の一部を取り生理食塩水氷の上で擦り潰して、１０%の肝臓ホモジネートを調製し、４℃、５０００rpmにて５min遠心にかけ、試薬箱の説明に従い、肝組織ホモジネートの総スーパー・オキサイド・ディスムターゼ(T-SOD)活性を測定した。別途一部肝組織を取り、１０%ホルマリン溶液に固定し、切片をパラフィン包埋し、HE染色後に光学顕微鏡下で肝細胞の壊死、肝細胞の水様変化及び炎症性細胞浸潤等の病理的変化を観察した。

図５と図６に観察結果を示す。図５に示すように、正常対照群に比べモデルラットの血清ALT、AST活性は、顕著に上昇し、TB含量も顕著に上昇し、肝臓中T-SOD活性は、顕著に低下した。モデル群に比べて、シリマリン群、本発明で得られる各用量群のラットの血清のALT/AST活性は、顕著に低下し、TB含量も顕著に低減し、T-SOD活性は、著明に上昇した。これは、本発明で得られる中医薬内服液は四塩化炭素誘発の肝機能異常の有効改善効果を示す。

肝臓組織のHE染色後の光学顕微鏡下観察結果を図６に示す。ブランク対照群(A)では、肝小葉の構造が大体正常を維持し、肺板は、肝細胞索が整然と並び、肝洞に目立つ拡張は認められず、集管域への拡張と繊維化は認められず、界面炎症は見られず、肝細胞は、明らかな壊死、再生、変性等が見られない。モデル群(B)は、肝小葉細胞の構造に若干の乱れがあり、肝細胞が濁腫し、水様変性が観察された。シリマリン群(C)は、肝細胞に濁腫、水様変性等がなく、モデル群に比べ、格段に優れた改善が見られた。本発明で得られる低用量群(D)には、少量の水様変形が観察されたが、モデル群に比べ、若干好転している。本発明で得られる中用量群(E)と高用量群(F)は、肝板の構造が比較的良好で、脂肪変性の出現が少ない。

本発明で得られる中医薬内服液のイソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発の肝損傷ラットに対する薬効試験

体重に基づいて３８匹のSDラットをランダムに６群（各群６匹、モデル群８匹）に分類し、ブランク対照群(Control)、モデル群(Model)、シリマリン（陽性薬対照）群(Silymarin)、本発明の低用量群(GX001-1)、中用量群(GX001-2.5)、高用量群(GX001-5)とした。ブランク対照群には３日目までは２mL/２００g重量の用量で０.３%のCMCNaを投与し、４日目から１４日目の終了日まで毎日３mL/２００g重量の用量で０.３%のCMCNaを投与した。モデル群、シリマリン群、本発明の各群は３日目までは毎日１００mL/kgのイソニコチン酸ヒドラジド(INH)と１００mg/kgのリファンピン(RIF)を胃に灌注投与し、投与する体積は１mlINH＋１mlRIF/２００g体重である。４日目から１４日目の終了日までは、本発明の低用量群、中用量群及び高用量群は毎日それぞれ１ml/kg、２.５ml/kg、５ml/kgの用量を実施例２の方法で調製した中医薬内服液を胃に灌注投与し、シリマリン群は毎日１００mg/kgの用量でシリマリンを胃に灌注投与し、モデル群は毎日０.３%のCMCNaを胃に灌注投与し、胃灌注体積はすべて１mL/２００g体重である。投薬２時間後、すべてに１mlINH＋１mlRIF/２００g体重の用量で胃に灌注投与した。最後の投薬後は水のみ与えて食餌を与えず、１６時間後にラットの体重を量り、頚椎脱臼にて絶命させ、心臓を取り出し、血清を分離し、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(AST)、塩基性ホスファターゼ(ALP)の活性、総ビリルビン(TB)含量を測定した。肝臓を取り出し氷生理食塩水の中で血液を洗浄し、濾紙で水分を吸い取って重量を測定し、その肝臓の一部を取り生理食塩水氷上で擦り潰して１０%の肝臓ホモジネートを調製し、４℃、５０００rpmにて５min遠心にかけ、試薬箱の説明に従って肝組織ホモジネートの総スーパー・オキサイド・ディスムターゼ(T-SOD)活性及びマロンジアルデヒド(MDA)を測定した。別途一部肝組織を取り、１０%ホルマリン溶液に固定し、切片をパラフィン包埋し、HE染色後に光学顕微鏡下で肝細胞の壊死、肝細胞の水様変化及び炎症性細胞浸潤等の病理的変化を観察した。

図７と図８に観察結果を示す。図７に示すように、正常対照群に比べ、モデルラットの血清ALT、AST活性は、顕著に上昇し、TB含量も明らかに上昇し、肝臓T-SOD活性が顕著に低下し、MDA含量が著明に上昇した。モデル群に比べ、シリマリン群、本発明で得られる各用量群のラットの体内のALT/AST/ALP活性は、顕著に低下し、T-SOD活性は、各段に上昇し、TB、MDA含量は、明確に低減した。これは、イソニコチン酸ヒドラジド／リファンピン誘発の肝機能異常を有効に改善する本発明で得られる中医薬内服液の効果を示す。

肝臓組織のHE染色後の光学顕微鏡下観察結果を図８に示す。ブランク対照群(A)は、肝小葉の構造が大体正常を維持し、肺板は、整然と並び、肝洞に目立つ拡張は、認められず、細胞核が緻密で隙がなく、肝細胞には、明らかな壊死、再生、変性等が見られない。モデル群(B)は、肝小葉細胞の構造が乱れ、細胞が水腫し、炎症性細胞浸潤が見られ、斑片状肝洞がうっ血し、肝洞拡張を示す。本発明で得られる高用量群(F)の細胞核は、緻密な状態に回復し、肝洞の拡張現象はほぼ皆無となった。

本発明で得られる中医薬内服液のCCl₄誘発の急性腎損傷マウスに対する薬効試験

体重別の６０匹の昆明マウスをランダムに６群（各群１０匹ずつ）に分類し、ブランク対照群、モデル群、シリマリン群、本発明群(GX001群)とした。正常群とモデル群に１０ml/kgの生理食塩水を胃に灌注し、シリマリン群と本発明で得られた群にシリマリンと実施例２の方法で調製した中医薬内服液を胃に灌注し、これを１０日間続けた。最後の投薬から１時間後に、ブランク対照群を除き、他の各群のマウスに０.１%のCCl₄植物油溶液を２０ml/kg腹腔注射した。ブランク対照群に植物油２０ml/kgを腹腔注射した。CCl₄の注射後は、水のみ与え食餌を与えず、１６時間後にマウスの重量を測定し、眼球を摘出して血液を取り、血清を分離し、血清中のCRE（クレアチニン）、BUN（尿素窒素）、UA（尿酸）含量を測定した。

表１に測定結果を示す。対照群に比べ、モデルマウスの血清CRE、BUN、UA含量は、顕著に上昇した（p<0.01）。モデル群に比べ、本発明で得られた群のマウスの血清CRE、BUN、UA含量は、何れも顕著に低下した（p<0.05）。シリマリン群のマウスの血清は、BUNレベルのみ明らかに低下した（p<0.05）。

表１ GX001のCCl₄によるマウス急性腎損傷モデル群血清への影響(x±s、n=10）
ブランク対照群に対して^##p<0.01、モデル群に対して^*p<0.05

本発明で得られる中医薬内服液の臨床試験

インフォームドコンセント後に、志願した３名の被験者は、実施例２の方法で調製した中医薬内服液を１日３回、１回１０ml内服し、計６０日行い、初日と６０日目にTC（総コレステロール）、TG（トリグリセリド）、LDL（低密度リポタンパク質）、HDL（高密度リポタンパク質）、尿酸、脂肪肝症状等のパラメータを測定した。

表２に示す測定結果の通り、本発明で得られる中医薬内服液は、人体内のコレステロール、トリグリセリド、低密度リポタンパク質及び尿酸の含量を低減し、高密度リポタンパク質含量を上昇し、脂肪肝症状の有効な軽減又は消失を示す。臨床では、肝臓と腎臓の何れに対しても良好な保護効果を見込むことができる。

表２本発明で得られる中医薬内服液の投与前と投与後の対比
注：“+”軽度脂肪肝、“++”中度脂肪肝、“+++”重度脂肪肝、“-”無脂肪肝

Claims

玉竹１００−２００重量部と、枸杞子１００−２００重量部と、麦冬８０−１６０重量部と、当帰７０−１３０重量部と、決明子７０−１３０重量部と、白芍７０−１３０重量部と、陳皮７０−１３０重量部と、熟地黄７０−１３０重量部と、菊花７０−１３０重量部と、川きゅう３０−７０重量部と、九節菖蒲２０−４０重量部と、柴胡１０−２０重量部との生薬で生成される肝臓及び腎臓の保護に用いる中医薬組成物の調製法において、
（１）当帰、川きゅう、菊花、柴胡、九節菖蒲及び陳皮を粉砕して混合し、加水蒸留し、揮発油、水溶液及び水不溶性の薬渣を得る工程と、
（２）工程（１）で得られた薬渣と玉竹、枸杞子、麦冬、決明子、白芍及び熟地黄とを混合しかつ加水して煎じ、濾液を工程（１）で得られた水溶液と混合し、濃縮し、アルコール濃度を高め、上澄液を取りアルコールを回収した後に、濾過かつ濃縮し、清膏（エキス）を得る工程と、
（３）工程（２）で得られた清膏と工程（１）で得られた揮発油とを混合する工程とを含むことを特徴とする中医薬組成物の調製法。
加水して煎じる工程は、１回０.５〜３時間、１〜３回加水して煎じる工程を含み、
アルコール濃度を高める工程は、濾液と工程（１）で得られた水溶液とを混合し濃縮した後、アルコールとしてエタノールを加えて、６０%(V/V)エタノールとする工程を含む請求項１に記載の中医薬組成物の調製法。