JP2000503686A

JP2000503686A - 黄栢皮とオミナエシ植物の混合抽出物を含有するｃ型肝炎治療用製薬組成物

Info

Publication number: JP2000503686A
Application number: JP11511993A
Authority: JP
Inventors: ヨンボクハン; ウンキョンホン; ヨンシンジョン; ボーイムリュウ; サンゴンキム; キョンヨンリー
Original assignee: キムヨンヒー; ヨンボクハン
Priority date: 1997-08-07
Filing date: 1998-07-15
Publication date: 2000-03-28
Also published as: US6113909A; WO1999007399A1; AU8464198A; EP0929309A1; KR19990015612A; BR9806083A; CN1236319A

Abstract

(57)【要約】本発明は黄栢皮（Phellodendron amurense ＲＵＰＲＥＣＨＴ Cortex）とオミナエシ（Patrinia scabiosaefolia ＦＩＳＣＨ.）植物の混合抽出物、特に混合水抽出物あるいはアルコール抽出物を有効成分で含有するＣ型肝炎治療用製薬組成物に関するものである。本発明による混合抽出物はＣ型肝炎患者、あるいはＣ肝炎由来の肝硬変に対して抗ウイルス効果を表すのみならず、免疫活性機能を増強させてＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制し、Ｔヘルパー細胞（Ｔ helpercells）の増殖を促進して人体のウイルスに対する免疫力を増加させることにより肝炎及び肝硬変に対する改善効果を表す。また本発明の混合抽出物は副作用を示さず、薬物の耐性も生じないのみならず、長時間使用しても活性効果が持続される特徴を有する植物混合抽出物である。

Description

【発明の詳細な説明】［発明の名称］黄栢皮とオミナエシ植物の混合抽出物を含有するＣ型肝炎治療用製薬組成物［技術分野］本発明は黄栢皮とオミナエシ植物（敗醤）の混合抽出物を有効成分として含有するＣ型肝炎治療用製薬組成物に関するものである。さらに具体的には、本発明は黄栢皮(Phellodendron amurense ＲＵＰＲＥＣＨＴ cortex)とオミナエシ(Pat riniascabiosaefolia ＦＩＳＣＨ.)の混合物を水あるいはアルコールで抽出して収得される混合抽出物を有効成分として含有し、Ｃ型肝炎ウイルスに対して抗 −ウイルス活性を有すると同時に損傷されたＴヘルパー（helper）細胞を回復させ宿株免疫システムを強化させることにより、Ｃ型肝炎及びＣ型肝炎由来の肝硬変症まで効果的に治療することのできる医薬組成物に関するものである。［背景技術］慢性Ｃ型肝炎はＣ型肝炎ウイルス(ＨＣＶ)によって門脈域を中心に肝臓内で持続的な炎症を引起す疾病であり、これを放置すると肝硬変や原発性肝細胞がんを発症する例が多い。Ｃ型肝炎はＡ型またはＢ型肝炎とは違って初期感染の場合にも約90％にＧＰＴ（glutamic-pyruvic transaminase）の異常が表れて慢性化する。最近、Ｃ型肝炎ウイルスが肝臓がんの誘発に直接関与することもあるという論文が発表された[参照：Sakamuro，Furukawa and Takegami，J．Virol．69:389 3-3896，1995; Ray，Logging，Meyer and Ray，J．Virol．70: 4438-4443,1996] 。さらに、欧米諸国の肝細胞がん（hepatocellular carcinoma）患者の３０％にＣ型肝炎ウイルスが見つかると報告されている［参照：Mangia，Vallari andBi sceglie，J．Med．Virol．43; 125-128，1994］。 1988年に米国カイロン社（Chiron Inc.）が開発したＨＣＶ抗体（Ｃ100-3抗体）測定計が登場することにより、非Ａ非Ｂ型肝炎の大部分がＣ型肝炎ウイルスの感染によるものであることが明らかになった。日本では、抗体測定計を用いた検索方法によって非Ａ非Ｂ型肝炎患者の70％からＣ型肝炎ウイルス抗体が検出され、Ｂ型肝炎ウイルス感染のない肝臓がん患者の90％以上からＣ型ウイルス抗体が検出されているという。 1989 年に非Ａ非Ｂ型肝炎を引起したチンパンジー血清から原因ウイルス遺伝子の一部が分離され、Ｃ型肝炎ウイルスの実体が初めて明らかになった。つまり、Ｃ型肝炎ウイルスはフラビビリダエ（Flaviviridae）に属し、9.5kbの陽性(+) 鎖のＲＮＡを遺伝子として有するウイルスであって、宿主細胞の中でポリペプチド前駆体を合成する。この前駆体蛋白質は宿主のシグナルペプチダーゼ（sign al peptidase）とＣ型肝炎ウイルスによって生成されるメタロプロテアーゼ（me talloprotease）及びセリンプロテアーゼ（serine proteasc）によってウイルス構造形成に直接的に関与する構造蛋白質（core，Ｅ１，Ｅ2）とウイルス増殖及び後翻訳修飾後、酵素的な機能を有する非構造蛋白質（ＮＳ２，ＮＳ３，ＮＳ４Ａ，ＮＳ４Ｂ，ＮＳ５Ａ，ＮＳ５Ｂ）に変換される。特にＥ２遺伝子の５'末端側に２個の超可変領域(ＨＶＲ１及びＨＶＲ２)が存在し、状況によって多様な変種が作られ得る。慢性Ｃ型肝炎から肝臓がんへの転換メカニズムは未だ明らかになっていないが、慢性炎症及び炎症の強度が密接に関与していると考えられる。即ち、宿主免疫系はＣ型肝炎ウイルスに対する中和抗体を生成するが、この中和抗体は制限された種類のウイルスにのみ作用し非常に速い速度で中和抗体に耐性を有する変種（速い速度の遺伝的突然変異）らが出現する。中和抗体が存在するにもかかわらず、変種らは宿主で持続的に炎症を引起し得る（免疫脱出；immuneescape）。さらに、持続的な感染による損傷に対処しようとする宿主肝細胞の再生能力はがん発生を招き得る。最近の報告によると宿主細胞の２本鎖のＲＮＡー依存性蛋白質キナーゼＲ（ＰＫＲ）が elＦ-2a をりん酸化させ、ウイルスのアポトーシス（apoptosis）を促進させることができる。しかし、Ｃ型肝炎ウイルスはＰＫＲを不活性化させ得る蛋白質を生産する。たとえばインターフェロンの投与によるＣ型肝炎ウイルスの耐性はＣ型肝炎ウイルスの変種によるＰＫＲの不活性化に起因し得る。したがって、かかる変種らの存在はＣ型肝炎ウイルスに対するワクチン製造に大きい障害となる。このようなＣ型肝炎ウイルスの特徴のため、現在Ｃ型肝炎治療剤として使用されている多くの薬剤は、Ｃ型肝炎に対して充分な治療効果を提供していない。インターフェロンの効果もＣ型肝炎ウイルスを実質的に減少させるよりは肝硬変やその原発性肝細胞がん発症を予防するに過ぎない。さらに実際臨床においてインターフェロンの副作用が多数報告されている。したがって、最近Ｃ型肝炎の治療剤としてＣ型肝炎ウイルスプロテアーゼの阻害剤を開発しようとする努力が試みられている。そこで本発明者らは既に使用されてきているインターフェロンのようなＣ型肝炎治療剤の問題点を解消し、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス効果を有するのみならず、免疫増強機能を有し、Ｃ型肝炎を効果的に治療できる物質を見出すための研究を持続的に遂行し、特に多様な天然薬用植物らを対象に研究を行った。その結果、種々の天然植物の中から黄栢皮とオミナエシ植物を混合して抽出した混合抽出物が上記のような目的を達成し得ることを確認し本発明を完成するに至った。［発明の開示］したがって、本発明の目的は有効成分として黄栢皮とオミナエシ植物の混合抽出物を含有するＣ型肝炎治療剤用製薬組成物に関するものである。さらに具体的には、本発明は黄栢皮とオミナエシ植物の混合水抽出物あるいはアルコール抽出物を有効成分として含有するＣ型肝炎治療用製薬組成物に関するものである。［図面の簡単な説明］本発明の本質及び目的の完全な理解のため、以後発明の詳細な説明は添付の図面を参考しなければならない。図１は、オミナエシ（Patrinia scabiosaefolia ＦＩＳＣＨ.）から得た水抽出物のＵＶ走査（scanning）プロフィールのグラフである。図２は、黄栢皮（Phellodendron amurense ＲＵＰＲＥＣＨＴ Cortex）から得た水抽出物のＵＶ走査（scanning）プロフィールのグラフである。図３は、本発明の混合水抽出物のＵＶ走査（scanning）プロフィールのグラフである。図４は、オミナエシ（Patrinia scabiosaefolia ＦＩＳＣＨ.）から得た水抽出物のＨＰＬＣプロフィールのグラフである。図５は、黄栢皮（Phellodendron amurense ＲＵＰＲＥＣＨＴ Cortex）から得た水抽出物のＨＰＬＣプロフィールのグラフである。図６は、本発明の混合水抽出物のＨＰＬＣプロフィールのグラフである。図７は、標準糖、即ちスクロース、ラクトース、グルコース、キシロース、マンノース及びフラクトースのＨＰＬＣプロフィールのグラフである。図８、標準糖、即ちマルトース及びガラクトースのＨＰＬＣプロフィールのグラフである。図９は、本発明の混合水抽出物中の糖のＨＰＬＣプロフィールのグラフである。図１０は・オミナエシ（Patrinia scabiosaefolia FISCH.）から得た水抽出物のアミノ酸分析クロマトグラムである。図１１は、黄栢皮（Phellodendron amurense ＲＵＰＲＥＣＨＴ Cortex）から得た水抽出物のアミノ酸分析クロマトグラムである。図１２は、本発明の混合水抽出物のアミノ酸分析クロマトグラムである。図１３は、臨床実験結果を表すグラフである。実験例１によって本発明の混合水抽出物をＣ型肝炎患者に経口投与した後、抗ウイルス効果を抗体力価値及びRN Aコピー数で表した[図13Ａ：増例１、図13Ｂ：増例２、図13Ｃ：増例３、図13Ｄ：増例４、図13Ｅ：増例５、図13Ｆ：増例６]。図１４は、生体内におけるＴ細胞依存性抗体生成反応に対する本発明によるそれぞれの黄栢皮とオミナエシあるいはこれらの混合水抽出物の効果を表したグラフである。図１５は、生体内におけるＴ細胞依存性抗体生成反応に対する本発明の黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物とアルコール抽出物の効果を比較して表したグラフである。図１６は、本発明の黄栢皮とオミナエシ植物の混合水抽出物がＴ細胞の増殖に及ぼす影響を表したグラフである。図１７は、本発明の黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物が免疫細胞の増殖に及ぼす影響を表したグラフである。図１８は、本発明の黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物が免疫細胞マイトジェン（mitogen）、レクチン（ＰＨＡ）によって誘発された免疫細胞の増殖に及ぼす影響を表すグラフである。図１９は、本発明の黄栢皮とオミナエシ植物の混合水抽出物がマウスの肝臓、腎臓及び心臓（組織形態学）に及ぼす影響を表した写真である[投与量15g/kg、Ｈ＆Ｅ染色、図19Ａ：肝臓 400倍、図19Ｂ：腎臓 200倍、図19Ｃ：心臓 200 倍]。図２０は、本発明の混合抽出物の抗酸化剤活性を表す。［発明を実施するための最良の形態］以下、本発明をさらに具体的に説明する。本発明は黄栢皮とオミナエシの混合抽出物、具体的には黄栢皮とオミナエシの混合物を水あるいはアルコールで抽出して得られる混合水抽出物あるいはアルコール抽出物を有効成分として含有するＣ型肝炎治療用製薬組成物に関するものである。特に、本発明の組成物はＣ型肝炎ウイルス感染による肝炎や肝硬変初期に直接的な抗ウイルス効果を表すと同時に、炎症を減少させ、宿主の免疫系中Ｔヘルパー細胞の活性を強化させることにより、攻撃及び防御メカニズム全てによってＣ型肝炎やそれによる肝硬変を効果的に治療することができる。さらに、本発明の混合出物は以下の実験例で具体的に立証されるようにＣ型肝炎に対する治療効果が高いながらも毒性は非常に低いため、人体に対し副作用を表さず、薬物の耐性も生じない。したがって本発明の組成物は安全性及び長期治療における使用の面で理想的な薬物である。本発明による抽出物の製造に使用される植物であるオミナエシ（Patriniascab iosaefolia ＦＩＳＣＨ.）（オミナエシ科（Valerianaceae））は白花敗醤（Pa triniavillosa ＪＵＳＳ.）、岩敗醤（Patrinia sibirica JＵＳＳ.）などと同類に属する。オミナエシは韓国を始めとして世界各地の温帯地方の山野で自生する多年生の草本植物である。漢方では眼疾患、化膿連鎖球菌感染症、浮腫、帯下症などに消炎剤として古くから用いられている。さらにオミナエシは次の作用を有するものとして報告されている。 a）熱水抽出物の抗腫瘍効果（たとえば子宮がん、食道がん、胃がん、腸がん、肺がんなど）； b）黄色ぶどう状球菌、連鎖状球菌などに対する抗菌効果； c）損傷された肝細胞の再生能を有しているためその変性を防止する作用； d）門脈の循環を改善して肝細胞の再生を促進する効果； e）中枢神経系を安定化させる効果； f）強力な鎮痛効果； g）血圧降下効果及び抗利尿（antidiuretic）効果。オミナエシの根には精油、多様なサポニン成分、炭水化物及びキューマリン（ cumarin）のような微量のアルカロイドが入っている。根の真皮層には酢酸、ホルム酸、吉草酸などがあり、カチニン（chatinine）及びバレリアニン（valeria nine）などのアルカロイドが含有されている。この中で吉草酸（valericacid）は非常に強力な鎮痛効果を有するものとして知られている。乾燥された種子には 19.4〜19.9％の蛋白質と30〜34.4％の脂肪が含有されている。しかし未だオミナエシの活性成分やそれによる薬理効果に対する具体的な研究がなされておらず、しかもオミナエシのいかなる抽出物もＣ型肝炎ウイルスに対する抑制効果を表すという研究結果は報告されたことがない。本発明の抽出物製造に使用されるさらに異なる植物である黄栢皮（Phellodend ron amurense ＲＵＰＲＥＣＨＴ cortex）は韓国、日本、中国などで自生する黄栢木（Phellodendron amurense ＲＵＰＲＥＣＨＴ）（Rutaceae）の幹（ste m）の皮（cortex layer）である。黄栢木の変種としてはラチホリオラトムナカイ（var．latifoliolatum ＮＡＫＡＩ）、ジャポニカムオイ（var．japonicum ＯＨＷＩ）、フェロデンドロンインシュラルナカイ(Ｐ．insulare ＮＡＫＡＩ）、フェロデンドロンモレナカイ(Ｐ．molle ＮＡＫＡＩ）、フェロデンドロンサカリネンスサルジエント（Ｐ．sachalinense Sarg.）などがある。黄栢皮には黄色あるいは黄褐色の色素物質と数種のアルカロイド成分が1.5〜4.5％含まれている。アルカロイドの主成分はベルベリン（berberine）である。その他にパルマチン（palmatine）、マグノフロリン（magnoflorine）、グアニジン（guani dine）、ジャテオリジン（jateorrizine）、フェロデンドリン（phellodendrine ）、カンジシン（candicine）、メニスペリン（menisperine）などが含まれており、苦味質（bitter component ）としてはオウバクノン（obakunone）及びオウバクラクトン（obakulactone）、β−シトステロール（β-sitosterol）などが含まれているものとして知られている。これら成分は強い抗菌作用、血圧降下作用、中枢神経抑制作用、アセチルコリン増強作用及び抗炎症作用があって、漢方では骨疾患及び黄疸に使用された。さらに黄栢皮には腸チフス、コレラに効果的な成分が含まれており、胃腸管疾患にも効果的な治療剤である。一方、これらの樹皮は苦味健胃剤（bitterstom achic）、整腸剤（agent for intestinal flora）、消炎性収斂薬（anti-inf lammatoryastringent）として胃腸炎、腹痛、黄疸などにも使用されてきた。しかし黄栢皮がＣ型肝炎ウイルスの増殖を抑制したり、免疫機能を増強あるいは復活させたりするなどの報告は今までなかった。本発明では黄栢皮とオミナエシの混合物を水あるいはアルコールで抽出して収得した混合抽出物が、Ｃ型肝炎ウイルスに対する抗ウイルス効果と免疫系のＴヘルパー細胞の増殖を促進させて免疫機能を強化させる効果を有しており、また混合抽出物は黄栢皮とオミナエシそれぞれの抽出物を単独で使用した場合に比して極めて優秀な相乗的作用効果を表すことを実験的に確認して本発明を完成したのである。本発明で有効成分として使用される黄栢皮とオミナエシの混合抽出物は次のような方法によって収得される。即ち、黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物を製造しようとする場合には、両植物の混合物を水で抽出し、該抽出液を高圧下で濾過し、遠心分離して固められた蛋白質の沈殿物を取り除き、上清液から水層を凍結乾燥させることにより粉末状の残留物（混合水抽出物）を得ることができる。さらに、黄栢皮とオミナエシの混合アルコール抽出物を製造しようとする場合には、両植物の混合物をアルコール、好ましくはメタノール、エタノールなどのような炭素数１ないし４の低級アルコールで抽出し、溶媒を蒸発させ、残留物に水を加え加熱して水溶化させた後、混合物を濾過し、濾液に有機溶媒を加えて有機溶媒−可溶性物質を溶出させて除去した後、水層を分離し凍結乾燥させることにより混合アルコール抽出物を収得することができる。この時黄栢皮とオミナエシは重量基準で１:0.1〜５、好ましくは１：１〜２の重量比で配合して使用する。特に、本発明では黄栢皮とオミナエシを１：１の重量比で配合して抽出することが好ましい。以下、本発明によるそれぞれの混合抽出物の製造方法をさらに具体的に説明する。本発明の方法によると混合水抽出物は第１段階で、乾燥させた黄栢皮とオミナエシの混合物を粉砕して上水（tap water）あるいは蒸留水のような水を溶媒として飽和蒸気圧（121℃、15pound/in a²）下で加熱抽出する。第１段階で水を混合物１重量部に対して 10〜45 重量部の比、特に好ましくは 25〜35 重量部の比で使用する。次に、第２段階で抽出物を遠心分離して沈殿物を除去し、抽出物をさらに高圧下で飽和させ、たとえばオートクレーブ内で蒸気圧（121℃、15pound/in a²）下で沸騰させ残存する蛋白質を凝固させた後、遠心分離などにより濾過して除去する。第３段階では分離された濾液をクロロホルム、ヘキサン、ジクロロメタン、シクロヘキサンなどの有機溶媒、好ましくはクロロホルムあるいはヘキサンを使用して抽出することによって樹脂、繊維質などの不純物を除去する。次いで水層をさらにタルクなどを用いて精製した後に凍結乾燥させることにより目的とする混合水抽出物を収得する。本発明の混合アルコール抽出物を製造しようとする場合には、まず第１段階で乾燥させた黄栢皮とオミナエシの混合物を粉砕し、アルコール、好ましくはメタノール、エタノールなどのような炭素数１ないし４の低級アルコールで抽出する。第１段階でアルコールは混合物１重量部に対して５〜40 重量部の比、特に好ましくは 10〜20 重量部の比で使用する。次に、第２段階ではアルコール抽出物を冷却し、回転蒸発機を使用し蒸発させてアルコールを除去する。残留アルコール抽出物は水を加え加熱して水溶化させた後、濾過する。この段階で水の量は原料物質として使用された黄栢皮とオミナエシの混合物１重量部に対して５〜30 重量部、特に５〜15 重量部の比で使用するのが好ましい。蒸発によって得られたアルコール抽出物に上記のような量の水を加えて短時間、一般的に５ないし10分間加熱してアルコール抽出物を溶解させた後、濾過する。第３段階では分離された濾液をクロロホルム、ヘキサン、ジクロロメタン、シクロヘキサンなどの有機溶媒、好ましくはクロロホルムあるいはヘキサンを使用して抽出することによって樹脂、繊維質などの不純物を除去し、水層をさらにタルクなどを用いて精製した後に凍結乾燥させることにより目的とする混合アルコール抽出物を収得する。上記のような方法によって得られる黄栢皮とオミナエシの混合抽出物は、上述したように薬物学的に有用なアンチ−ＨＣＶ効果及びＴヘルパー細胞と関連される免疫体系に対する強化効果を表し、Ｃ型肝炎治療用製薬組成物として有用に使用することができる。本発明による黄栢皮とオミナエシの混合抽出物はＣ型肝炎を治療するための臨床的目的のため、治療学的有効量を単独であるいは薬剤学的に許容される担体といっしよに薬剤学的分野で通常的な方法によって適合した薬剤学的組成物の形態に剤形化し、薬剤学的分野で通常的な方式で、好ましくは経口で投与することができる。一般的に、本発明の組成物は経口投与に適合した錠剤、カプセル剤、溶液剤、懸濁剤あるいはシロップ剤の形態に剤形化させることができ、さらに飲料の形態に製造することもできる。本発明による混合抽出物の投与用量は抽出物のタイプ（水抽出物またはアルコール抽出物）、肝炎の重症度、患者の性別、年齢、体重、及び目的とする効果がいかなるものであるかによって違ってくるが、一般的には成人に経口投与する場合、体重１kg当り１日５ないし 50mg、好ましくは 10 ないし 40mgの用量で投与することができる。さらに本発明による混合抽出物は必要によって他の肝炎治療剤、抗炎症剤、抗ウイルス剤などのような薬剤と配合あるいは併用することができる。本発明による組成物と配合あるいは併用して使用できる薬剤としてはたとえばＤＤＢ（diph enyl dimethyl dicarboxylate）、にんにく油（galic oil）などがある。本発明は以下の実施例及び実験例によりさらに具体的に説明するが、これらは単に本発明を説明するため提供されるものであり、本発明がこれらによって何ら制限されるものではない。実施例１：混合水抽出物の製造乾燥した黄栢皮（Phellodcndron amurense ＲＵＰＲＥＣＨＴ cortcx）とオミナエシ（Patrinia scabiosacfolia ＦＩＳＣＨ.）を重量基準で1:1に混合して粉砕機で粉砕した。この混合粉末から 100g を分取し、ここに蒸留水 3000ml を加えて蒸気圧 121℃、15pound/in a²下で 40〜60 分間抽出した後、水不溶性残渣を除去して抽出液を得た。抽出液を遠心分離して沈殿物を除去し、濾液の全量が 1500mlになるように加熱濃縮して濾過した。濾液をさらに蒸気圧 121℃、15p ound/in a²下で 15 分間飽和させ生成された凝固蛋白質を含めた沈殿物を遠心分離して除去した後に濾過した。濾液を分液漏斗（separatory funnel）に入れ、クロロホルム400mlを加えて樹脂及び繊維質などを溶出させてクロロホルム層を分離除去した。同じ操作を２回繰返し行った後、水層に再びｎ−ヘキサン 200ml を加えて残存する蛋白質、樹脂、繊維質及びｎ−ヘキサン可溶性物質などを溶出させた。水層を分離回収して 60〜80℃で加温した後にタルク 500g を加えて攪拌した後、減圧化で濾過しタルクを除去し、この濾液を再び徐々に濾過し、該濾液を凍結乾燥させて粉末化した。この方法によって黄栢皮とオミナエシの混合物より約 1 5％の収率（乾燥重量基準）で目的とする混合水抽出物約 15g を収得した。実施例２：混合アルコール抽出物の製造乾燥した黄栢皮とオミナエシを重量基準で 1:1 に混合して粉砕機で粉砕した粉末 100g を分取し、ここに70％エタノール 1500ml を加えて度々攪拌しながら 48〜72時間放置した後、これを減圧濾過し、残差を除去してアルコール抽出物を得た。収得されたアルコール抽出物より還流冷却装置を用いてアルコールを回収し、残留するアルコール抽出物に蒸留水 1000ml を加えて混合し、５分間加熱して水溶化させた。得られた溶液にタルク 500g を加えて攪拌した後、減圧濾過し１次精製した。精製された濾液を分液漏斗に入れ、クロロホルム400mlを加えて樹脂及び繊維質などを溶出させクロロホルム層を分離除去した。同じ操作を２回繰り返し行った。次いで、水層にｎ−ヘキサン 200ml を加えて残存する蛋白質、樹脂、繊維質及びｎ−ヘキサン可溶性物質などを溶出させた。水層を回収して 60〜80℃で加温した後に再びタルク 500g を加えて攪拌した後、減圧下で濾過してタルクを除去し、濾液を再び徐々に濾過した後、該濾液を凍結S乾燥させ粉末化した。この方法によって黄栢皮とオミナエシの混合物より約10％の収率（乾燥重量基準）で目的とする混合アルコール抽出物約 10g を収得した。植物材料の抽出物の特性を決定するため次の実施例において全ての抽出物は実施例１と同じ方法によって得た。実施例３：本発明の混合水抽出物のＵＶ及びＨＰＬＣ特性本発明の抽出物、即ちオミナエシ及び黄栢皮並びにこれらの混合植物をＵＶ走査機（Shimazu社製，日本）及びＨＰＬＣ（Watcrs社製）によって分析した。図１はオミナエシから得た水抽出物のＵＶ走査プロフィールである。図２は黄栢皮から得た水抽出物のＵＶ走査プロフィールである。図３は本発明の混合水抽出物のＵＶ走査プロフィールである。ＨＰＬＣ分析のため、各植物からの抽出物及び本発明の抽出物を 50％メタノール中に１mg/mlの濃度で溶解させた。10μlの溶液をＨＰＬＣ（Waters社製 5 10）に注入させた。Incrtsil ＯＤＳ 3Ｖ（4.6mm i.d.×250mmＬ）逆相カラムを使用し、移動相は 50％ＭeＯＨ定組成溶出液であった。流速は 1.2ml/min であった。ピークはＵＶ検出器によって 254nm で検出された。各植物の特徴的なピークがＨＰＬＣ側面図で観察された。図４はオミナエシからの抽出物のＨＰＬＣプロフィールであり、オミナエシからの抽出物の特徴的なピークは 18分の滞留時間に現れた。図５は黄栢皮からの抽出物のＨＰＬＣプロフィールであり、黄栢皮の抽出物の特徴的なピークは２５分に現れた。図６は本発明の混合水抽出物のＨＰＬＣプロフィールを表し、特徴的なピークは19分及び25分に観察された。 19 分での特徴的なピークはオミナエシの抽出物のピークとして確認され、25分での特徴的なピークは黄栢皮の抽出物のピークとして確認された。19分及び25分でのこれら特徴的なピークを再現することができたので、これらは各植物の標準物質であると思われる。19分でのピーク強度は144.3±15.5（平均±Ｓ.Ｅ.：標準エラー）及びピーク高さは49.98±0.39であった。25 分でのピーク強度は233. 6±14.6であってピーク高さは97.8±0.79であった。ＵＶ走査及びＨＰＬＣ分析の結果から本発明者らは本発明の抽出物の品質管理のための標準化法を設定した。実施例４：本発明の混合水抽出物の元素分析本発明の混合水抽出物の元素を元素分析機（Carlo Erba/Ｅ.Ａ. 1108）で分析した。表１は炭素、水素、窒素及び硫黄が本発明の混合水抽出物に含有されていることを表す。＜表１＞本発明の抽出物の元素実施例５：本発明の混合水抽出物の粗蛋白質、脂肪及び灰分の分析（１）粗蛋白質及び窒素含有化台物の分析窒素含有化合物の含量はケルダール窒素分析法を使用して調査した。この方法は次のように簡単に説明する。窒素を含有する有機化合物は、沸騰したＨ₂ＳＯ₄中で分解され生成物としてアンモニウムを生成した。得られたアンモニウムの量は酸で適定して定量化し窒素の含量を計算した。本発明の抽出物で粗蛋白質の含量はケルダール法によって測定したところ約 59.98％であった。（２）粗脂肪の分析本発明の抽出物から粗脂肪をエーテルで抽出した。エーテルを回転蒸発機上で蒸発させ、乾燥された抽出物を粗脂肪として評価した。粗脂肪の含量はエーテル抽出物の約 2.29％であった。（３）粗灰の分析本発明の抽出物の試料を 500-500℃で燃焼させた。粗鉱物分画を表す灰分が非揮発されたまま残った。粗灰分の含量は約9.68％であった。実施例６：本発明の混合水抽出物の無機イオンの分析無機イオンの組成はＩＣＰ/ＡＥＳ（Shimazu ＩＣＰＳ-1000III）及びＩＣＰ/ ＭＡＳＳ（FisonsＰＱ3 ＳＴＥＩ）によって調査した。その結果を下記の表２に表した。ＩＣＰ/ＡＥＳ（Shimazu ICPS-1000III）動作条件 forward power/Ｗ 1200 冷却ガスフロー/分 14 Ａuxガスフロー/分 0.4 Ｎebガスフロー/分 0.8 試料取込速度/分 0.6 噴霧チャンバ：ガラス、水冷却、０℃ ネブライザ：Meinhard concentric 主元素（100ppm以上の元素）ＩＣＰ/ＭＡＳＳ（Fisons ＳＴＥＩ）の動作条件 forward power/Ｗ 1200 冷却ガスフロー/分 14 Ａuxガスフロー/分 0.4 Ｎebガスフロー/分 0.8 試料取込速度/分 0.6 噴霧チャンバ：ガラス、水冷却、０℃ ネブライザ：Meinhard concentric ピークジャンピング獲得変数ピーク当りポイント：３滞留時間/ms：10.24 検出モードＰＣ微量元素（100ppm未満の元素）＜表２＞本発明の抽出物及び各植物の抽出物の無機イオン表２に表しているように本発明の抽出物の重金属量は非常に低かったため、本発明の抽出物は実験動物及びヒトに害のないものであることが明らかになった。実施例７：本発明の混合水抽出物の遊離糖の分析本発明の抽出物の遊離糖の量はＨＰＬＣ（Waters 510）によって調査した。標準物質（Sigma社製）及び本発明の抽出物を水中に 10mg/ml の濃度で溶解させシリンジフィルター（0.45μm）で濾過した。各試料20μlをＨＰＬＣに注入した。ＨＰＬＣ条件 −カラム：Micro-guard Carbo-ＰのあるAmincx ＨＰＸ（300×7.8mm）（Bio-Rad Laboratories） −検出器：Ｒ401 Waters（Attenuation 32） −オーブン温度：80℃ −移動相：Ｈ₂Ｏ −流速：0.6ml/分図７及び８は標準糖、即ちスクロース、ラクトース、グルコース、キシロース、マンノース、フラクトース、マルトース及びガラクトースのＨＰＬＣプロフィールである。図９は本発明の混合水抽出物中のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。本発明の混合水抽出物の糖量はmg/g抽出物として計算した（表３）。＜表３＞本発明の混合水抽出物の糖量実施例８：本発明の混合水抽出物のアミノ酸分析本発明の抽出物及び各植物の抽出物（オミナエシ及び黄栢皮）のアミノ酸組成をＨＰＬＣ（Pharmacia社製）を使用して分析した。各試料 100μg をピコータグ（pico-tag）法を用いて６ＮＨＣＩで加水分解させた。遊離アミノ酸をＰＩＴＣ（イソチオシアン酸フェニル）でラベルした。試料を逆相ＯＤＳカラムによるＨＰＬＣに注入し、ピークをＵＶ検出器を使用して 254nm で検出した。図１０はオミナエシから得た水抽出物のアミノ酸分析クロマトグラムであり、図１１は黄栢皮の抽出物のアミノ酸分析クロマトグラムを表す。図１２は本発明の混合抽出物のアミノ酸分析クロマトグラムを表す。表４に表しているように、酸性及び塩基性アミノ酸を含有する極性アミノ酸の量は本発明の混合抽出物で高かった。＜表４＞オミナエシあるいは黄栢皮の抽出物及び本発明の混合抽出物のアミノ酸の量実施例９：本発明の混合水抽出物のアルカロイド及び有機酸の分析オミナエシ及び黄栢皮のそれぞれの抽出物及び本発明によるこれらの混合物はジクロロメタン、酢酸エチル、ｎ−ブタノール及び水を用い溶媒抽出によって次の工程図に表している方法により分画化した。上記の方法においてそれぞれの溶媒は分画に対し充分量を使用して次の溶媒の使用はＴＬＣによって決定した。各分画をカラムクロマトグラフィーにより再び分離した。ジクロロメタン層の分離のためシリカゲルカラムを用いた。シリカゲルカラム（３cm×130cm）の移動相はジクロロメタン及びメタノールの勾配系であった（流速 1.5ml/分）。セファデックスＬＨ20カラム（３cm×130cm）を酢酸エチル及びブタノール層に使用し、水及びメタノールの勾配系を移動相に用いた（流速 1.5ml/分）。カラムクロマトグラフィーから大規模の各分画を予備ＨＰＬＣ（Pharmacia 社製）によって再び製造した。予備ＨＰＬＣのため逆相カラムを使用し、メタノール及び水の混合物を移動相に用いた。流速は 4.0ml/分であった。ピークはUV 検出器によって254nmで検出した。予備ＨＰＬＣによって単離された単一化合物の構造は¹ＨＮＭＲ（¹Ｈ nuclear magnetic resonancc spectroscopy: ＡＱＭＳ-500/Bruker)及びＭＡＳＳ（ＨＰ5988Ａ Quardropolc Mass Spectr ometer）によって解明した。¹ＨＮＭＲスペクトルは標準物質と比較した（Sig ma Chemical Co.,St. Louis，Mo，Ｕ.Ｓ.Ａ.）。本発明の抽出物の組成は表５に表した。＜表５＞本発明の混合水抽出物の組成投与形態本発明の抗−ＨＣＶ剤の投与形態は特に制限されず、必要に応じて適切に選ばれる。投与形態の例としては錠剤、カプセル剤、顆粒剤、粉剤及び液剤剤形が含まれる。以下、本発明による黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物の投与形態を具体的に説明する。また混合アルコール抽出物も同じ方式で剤形化され得ることを理解しなければならない。投与形実施例１：錠剤実施例１で製造された黄栢皮とオミナエシの凍結乾燥された粉末状の混合水抽出物250mg を賦形剤であるラクトース260mg及びアビセル（微細結晶性セルロース）35 mg、崩解補助剤であるナトリウム澱粉グリコネート 15 mg、結合剤であるＬ−ＨＰＣ（Low−hydroxypropylcellulose）80 mgを混合し、Ｕ型混合機に入れて約 20 分間混合した。混合が完了された後に滑沢剤としてマグネシウムステアレート 10 mgを追加に加えて約３分間混合した後に、通常の方法により錠剤に打錠してフィルムコーティングし、１錠当り混合水抽出物250mgを含有する錠剤を製造した。投与形実施例２：シロップ剤一定量の水に適当量の白糖を溶解させ、そこに保存剤としてパラオキシベンゾエート 80 mg及びパラオキシプロピルベンゾエート 16 mgを加えて実施例１で製造された黄栢皮とオミナエシの凍結乾燥された粉末状の混合水抽出物4.5gを加え、60℃で維持させ完全に溶解させた後に冷却させ、蒸留水を加えて総量が 150ml になるように１ml 当り混合水抽出物 30 mgを含有するシロップ剤を製造した。投与形実施例３：カプセル剤実施例１で製造された黄栢皮とオミナエシの凍結乾燥された粉末状の混合水抽出物300mgを担体としてラクトース200mgと混合して軽質ゼラチンカプセルに充填し、１カプセル当り混合水抽出物300mgを含有するカプセル剤を製造した。投与形実施例４：飲料組成物実施例１で製造された黄栢皮とオミナエシの凍結乾燥された粉末状の混合水抽出物500mgを適当量の水に溶解させた後、補助成分としてビタミンＣ、苦味剤としてクエン酸、クエン酸ナトリウム、高果糖を適当量加え、保存剤として適当量の安息香酸ナトリウムを加えた後に、水を加え全量を100mlに作って飲料用組成物を製造した。実験例１：混合水抽出物のＣ型肝炎ウイルス焼失成績本発明による黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物を６名のＣ型肝炎患者に直接投与し臨床実験を行った。床例１から３までではアンチ−ＨＣＶ抗体をＲＩＡ（放射性同位元素分析）方法で調査して得た抗原力価（antigen titer）値で結果を表し、床例４から６までではＲＴ−ＰＣＲを用いて調査したＨＣＶのＲＮＡコピー（copy）数で結果を表した。床例１（図 13Ａ）はＣ型慢性肝炎と診断された患者であるが、この場合本発明の混合水抽出物を１日に 2000 mgずつ５ヶ月間投与した結果、抗原力価値が０に近くに落ちたことが確認できた。床例２の場合は76歳の老人でＣ型慢性肝炎治療前の抗原力価値が７程度で高かったが、本発明の混合水抽出物を１日に2000mgずつ持続的に投与した結果、徐々に減少し始めて24ヶ月後には抗原力価値が０近くに落ちた。床例３は慢性Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎患者の場合である。図13Cに表したように、本発明の混合水抽出物を５ヶ月間１日に2000mgずつ投与した結果、ＨＣＶに対する抗原力価値が０近く落ちたことに測定された。床例４（図13Ｄ）はＣ型慢性肝炎患者で治療前ＲＴ−ＰＣＲ方法によるＲＮＡコピー数が１ml 当り１×10⁷であったのが本発明の混合水抽出物を１日に2000m gずつ投与して治療してから１ヶ月後にはＲＮＡコピー数が１×10⁶に落ち、６ヶ月後には検査基準値（cut-off value）の１×10³以下に落ちて検出されなかった。床例５及び６でもＲＴ−ＰＣＲ方法によって血液１mlのＲＮＡコピー数を測定しながら１日に 2000 mgずつ混合水抽出物を投与した。床例５（図 13Ｅ）は15 年間ＨＣＶを保有していた慢性肝炎患者で８ヶ月後に１×1０⁸個から１×1０⁵個にウイルス数の減少を示した。床例６（ 13Ｆ）は 20年間ＨＣＶを保有していた患者でＨＣＶＲＮＡコピー数が１ml当り１×1０⁹であったのが本発明の混合水抽出物の投薬７ヶ月後に１×10⁴個に落ちた。上記のような臨床実験結果より、本発明の混合水抽出物はＣ型肝炎に卓越な効果のあることがわかる。実験例２：生体内でのＴ細胞−依存性抗体生成反応に対する混合水抽出物の効果体重17−20g程度のBalb/cマウス65匹を５匹ずつ13個群に分け各群にＳＲＢＣ（羊赤血球）2.4×1０⁸細胞を腹腔内に移植し、実施例１で収得した本発明による混合水抽出物と、その原料生薬の黄栢皮とオミナエシそれぞれの水抽出物を、それぞれ移植初日から３日間、１日に体重１ｋｇ当り、３、10、30、100mgの量を経口投与した（０、１、２日）。対照群には実験動物当り、生理食塩水だけを経口投与した。４日後各実験動物を犠牲させて無菌的に脾臓を摘出した後、組織を細かく切った後、メッシュ(mesh)を使用して脾臓細胞を分離し、ＥＢＳＳ（Ea rle'sBalanced Salt Solution）３ml が入っているペトリ皿で注射器のプランジャ（plunger）を利用して細胞を遊離させた。収得した細胞懸濁液を 15ml のコニカルチューブに移して５分間放置した後、上澄液２ml を取り、1200rpm で 10分間遠心分離した。上澄液を捨て残留物を再びＥＢＳＳ2ml に懸濁させた後、 EBSSで 30 倍希釈し、この脾臓細胞希釈液を一回にプラーク形成細胞分析に 100 μlずつ使用した。かくして収得した脾臓細胞希釈液 100μl をＥＢＳＳで洗浄したＳＲＢＣ（25μl、標的細胞）、ＥＢＳＳで２倍希釈したギニアブタ補体（guinca pigcomplement、25μl）及びアガロース（ＥＢＳＳ中 0.85％、350μ l）と混合した後、ペトリ皿に注ぎ固化させて 37℃のＣＯ₂培養機で約１時間放置した。その後、抗体生成細胞（antibody forming cclls）の数は変形されたジャニプラーク分析方法（Modified Jerne Plaque Assay）［参照：Hwan M. Kim, et al., J.Toxicological Sciences 21:41-45, 1996］でプラーク数及び細胞数を計数し、結果を10⁶細胞当り抗体生成細胞の数で表した。測定された結果の平均値は下記の表６及び図１４に表した。＜表６＞本発明の混合水抽出物の生体内におけるＴ−細胞依存性抗体生成反応に対する効果＊：実施例１で得た黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物これらの結果よりわかるように、本発明による混合水抽出物を投与した場合には抗体生成細胞の数が薬物の濃度によって比例的に増加し、100mg/kg投与群は対照群に比して抗体生成細胞の数において 307％の増加を表した。また、黄栢皮やオミナエシの水抽出物をそれぞれ単独に 100 mg/kgの量で投与した場合に比して、２種の生薬の混合水抽出物をその1/10に該当する 10mg/kgの量で投与した場合にも抗体生成細胞数が大分増加し、このことからそれぞれの生薬の水抽出物を単独に投与した場合に比して、２種の生薬の混合水抽出物を投与した場合に、かなり優秀な相乗的効果が表れることがわかる。したがって本発明による黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物は卓越な相乗的免疫増強効果を表すことがわかる。さらに、本発明によって実施例１で製造された混合水抽出物と実施例２で製造されたアルコール抽出物の免疫増強効果を比較してみた。即ち、混合水抽出物とアルコール抽出物それぞれ 100 mg/kgずつを使用して上記と同じ方法により実験を行い、抗体生成細胞の数を測定した。測定された結果を下記の表７及び添付の図１５に表した。＜表７＞本発明の混合水抽出物及び混合アルコール抽出物の生体内Ｔ−細胞依存性抗体生成反応に対する効果上記の表７及び図１５に図示されている結果より、本発明の混合水抽出物と混合アルコール抽出物はいずれも抗体生成細胞の数を増加させ、特に混合アルコール抽出物が混合水抽出物に比して抗体生成細胞の数を更に51％増加させたことがわかる。実験例３：Ｔ細胞活性化反応に対する混合水抽出物の効果本発明による黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物のＴ細胞活性化反応に対する効果を混合免疫細胞反応法で測定した。主組織適合性遺伝子複合体［ＭＨＣ：major histocompatibility complex］抗原が相互異なるＢ6Ｃ3Ｆ1（Ｈ-2k）とＢＤＦＩ（Ｈ-2d）の二種類のマウスより脾臓を無菌的に摘出し、細かく切った後、メッシュを使用して脾臓細胞を遊離させた。遊離された脾臓細胞をそれぞれ2.5×10⁶細胞/mlになるように調節した後に 96ウェルプレートにＢ6Ｃ3Ｆ1（Ｈ-2k）とＢＤＦＩ（Ｈ-2d）脾臓細胞をそれぞれウェル当り100μlずつ入れ最終的に200μlにつくった。脾臓細胞を実施例１で得た混合水抽出物を 0.01 ないし 100μg/ml の濃度で処理した後、37℃、ＣＯ₂培養機で３日間培養した。培養が終わる 18 時間前に各ウェル当り１μＣiの［³Ｈ］チミジンを添加した。自動細胞回収機（automati c cellharvestor）を用いて細胞を収去した後に、［³Ｈ］チミジンの吸収程度をベタカウンター（Beta Countcr， Beckman ＬＳＣ）で測定することにより免疫細胞の増殖度を測定した。測定された結果は下記の表８及び図１６に表した。＜表８＞本発明の混合水抽出物のＴ細胞の増殖に対する影響上記の表８及び図１６記載の結果より、本発明の混合水抽出物は使用された濃度に比例してＴ細胞の増殖を増加させることがわかる。実験例４：免疫細胞増殖に対する混合水抽出物の効果マウスを頚椎脱骨させた後、脾臓を摘出して緩衝液（ＥＢＳＳ）で洗浄した。注射器のプランジャを用いて脾臓細胞を遊離させた。かくして収得した脾臓細胞を含有する懸濁液をチューブに移し約5-10分間放置した後、上澄液を取り遠心分離(1200rpm,10分間)した。上澄液は捨て、沈殿物をＲＰＭＩ1640培養液［10％ＦＣＳ（fetal calf serum），2-メルカプトエタノール（2-ＭＥ）］に再懸濁させた後、細胞数と細胞生存率を測定した。分離した脾臓細胞を 10⁶細胞/ml の濃度にして 96-ウェルプレートのウェル当り 200μl ずつ分注し、本発によって実施例１で収得した混合水抽出物を0.01ないし100μg/mlの濃度で処理した後に、5psiの混合ガス（7％Ｏ₂， 10％ＣＯ₂，83％Ｎ₂）が詰められた培養機でロッキングプレート（rocking plate）を用いて３日間培養した。培養が完了した後に、［³Ｈ］-チミジンを 5μＣi/ml の濃度で加えて吸収程度をベタカウンターで測定することにより免疫細胞の増殖度を測定した。測定された結果は下記の表９及び図１７に表した。＜表９＞本発明の混合水抽出物の免疫細胞増殖に対する影響上記の表９及び添付の図１７に示しているように、本発明の混合水抽出物は適用された濃度に比例して免疫細胞の増殖を増加させることがわかる。実験例５：レクチンフィトアグルチニンと併用した混合水抽出物の免疫細胞に対する影響本発明の混合水抽出物がＴヘルパー細胞の増殖に及ぼす影響をより確実に観察するため、本発明の混合水抽出物をＣＤ４Ｔ−細胞を剌激して増殖を誘導する標準類似***誘導物質であるレクチン類のフィトアグルチニン（ＰＨＡ）と併用して使用し、その効果を測定してみた。即ち、実験例２と同じ方法でマウスより無菌的に分離した脾臓細胞を 0.5×10⁷細胞/ml となるように調節した後に96- ウェルプレートにウェル当り 200μl ずつ分注した後、250μg/ml濃度のＰＨＡを４μl/ウェルずつ添加して最終濃度が５μg/mlとなるようにし、そこに本発明の混合水抽出物を0.01ないし 100μg/ml の濃度で処理した後、37℃のＣＯ₂培養機で３日間培養した後、ＣＤ４Ｔ−細胞の増殖程度を［³Ｈ］を用いて実験例３と同じ方法によって測定した。対照群には本発明の混合水抽出物を添加しなかった。測定された結果は下記の表１０及び図１８に表した。＜表１０＞レクチンと併用した本発明の混合水抽出物の免疫細胞増殖に対する影響上記の表１０及び添付の図１８に表しているように、ＰＨＡと併用処理した本発明の混合水抽出物は適用された濃度に比例して免疫細胞の増殖を著しく増加させることがわかる。実験例６：混合水抽出物の生体内による脾臓、胸腺、骨髄の免疫細胞構成比率の変化本発明のよって実施例１で製造された黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物を 100 及び 300mg/kgの濃度でマウスに３日間経口投与した後、マウスを犠牲させ脾臓、胸腺及び骨髄を分離した。これら臓器より免疫細胞を実験例２で脾臓細胞を分離させる方法と同じ方法で分離した後、遠心分離した。上澄液を捨てた後、細胞沈殿物を赤血球溶血用緩衝液（ＡＣＫ buffer，0.15ＭＮＨ₄Ｃl，0.01 ＭＫＨＣＯ₃，0.1mＭＮa₂ＥＤＴＡ，pＨ 7.2）を臓器当り 1ml ずつ使用して２ないし３分間処理した。免疫細胞を培地で洗浄した後、細胞濃度を 107 細胞/ ml に調節した後、チューブ当り100μlずつ分注した。Ｂ細胞を測定するためマウスＢ細胞抗原に対するラットモノクロナル抗体Ｂ220 にピコエリトリン（ＰＥ）が結合されたものを使用しており、Ｔ細胞の場合にはＴhy-1-ＰＥ(Caltag L aboratories)を使用し、ＣＤ４Ｔ細胞の場合にはＣＤ４-ＦＩＴＣ（Caltag La boratorics）、ＣＤ８Ｔ細胞の場合にはＬy2-ＦＩＴＣ（Caltag Laboratorci s）を使用した。これた抗体をそれぞれのチューブに加えた後、40分程度氷上で反応させた。反応が完了した後にりん酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）を使用して洗浄し、ＦＡＣＳcan（Becton Dickenson,San Jose，ＣＡ）を用いて各免疫細胞の構成比率を測定した。測定された結果は次の表１１に表した。＜表１１＞本発明の混合水抽出物による免疫細胞構成比率の変化（単位％） 10,000個の細胞を測定した結果、上記の表１１に記載されているように脾臓の場合にはＢ細胞、Ｔ細胞及びＣＤ４Ｔ細胞の構成比率が増加しており、胸腺の場合にはＴhy-1抗体が付いたＴ細胞の構成比率が増加し、ＣＤ４抗体が付いたＣＤ４Ｔ細胞も増加した。骨髄の場合にはＢ220抗体が付くＢ細胞の構成比率が増加した。このような結果より、本発明による黄栢皮とオミナエシの混合抽出物は免疫系の中から特にＴヘルパー細胞を増強させてＣ型肝炎ウイルスに対する抵抗性を増加させるものと判断することができる。実験例７：本発明の混合水抽出物の抗酸化剤作用抗酸化剤作用を有する化合物がさらにＣ型肝炎を含める抗−ウイルス活性を有するものとして知られている。本発明の混合水抽出物の抗酸化剤作用はchemilum inescence assay を用いて決定した。ＡＢＥＩ-ミクロペルオキシダーゼーＨ₂ Ｏ₂システムを用いて本発明の抽出物の抗-酸化剤作用を分析した。ミクロペルオキシダーゼ、アミノブチルエチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びＨ₂Ｏ₂は米国ＭＯ，St．Louis所在のシグマ社から購入した。ＡＢＥＩは0.18μＭの濃度で使用した。分析される抽出物は最大濃度として 1 0mg/ml及び10倍順次希釈で使用した。ＡＢＥＩ 200μｌ及び抽出物200μｌをバースオルド（Berthold）9502 ルミノメターに使用するのに適合したポリスチレンチューブ中に入れた。過酸化水素（0.35％）及びミクロペルオキシダーゼ（0. 01mg/ml）をチューブ内に自動注入させ酸化反応を開始した。ルミネセンスはバースオルドルミノメター9502を用いて２秒間測定した。蒸留水をコントロールとして使用した。一般に、抗−酸化剤は酸化反応を防止し、この分析システムで光の強度を減少させる。したがって、抗酸化剤活性は光の強度で減少程度によって評価することができる。図２０によると、本発明の抽出物は優れた抗−酸化剤作用を表す。このような結果は本発明の抽出物が強力な抗−酸化剤を含有することを表す。本発明の抽出物は各植物の抽出物よりさらに高い抗−酸化剤活性を有するため、本発明の混合水抽出物は各植物抽出物の相乗的抗酸化剤効果を有する。実験例８：毒性実験本発明による黄栢皮とオミナエシの混合抽出物の安定性を確認するため薬物の急性毒性を表す指標となる重要な意味のある数値としてＬＤ₅₀(実験動物の50％を致死せしめられる量）値を次のような方法によって求めた。正常ＩＣＲマウス（♀，19±1g）30匹を１力群に６匹ずつＡないしＥの５群に分け、Ａ群には体重１kg当り本発明によって実施例１で製造された黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物 3g を投与することから等差的に量を増加させＢ群には6g 、Ｃ群には9g、Ｄ群には 12g及びＥ群には 15g ずつをそれぞれ経口投与してベーレンス−カルバー（Behrens-Kirber)法によって混合水抽出物の経口（p.o.）投与によるＬＤ₅₀値を測定した。結果を下記の表１２に記載した。＜表１２＞本発明の混合水抽出物の経口投与による致死量（ＬＤ₅₀）注)^*z：２個の連続される用量で死亡した動物数の1/2値 ^**d：２個の連続される用量の違い上記の表１２記載の結果からわかるように、本発明による黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物を体重１kg当り 15g の高用量で経口投与した群からも動物が１匹も死亡せず混合水抽出物の経口投与によるＬＤ₅₀値は15g/kg以上であり、したがって生体に非常に安全な物質であることがわかった。即ち、本発明による黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物は毒性の殆どない安全投与できるものであることが明らかに分かる。さらにＬＤ₅₀値の測定の際に使用した実験動物に対して剖検及び病理組織学的試験を次のような方法で行った。ＬＤ₅₀測定試験終了の際に全生存動物に対してエーテル麻酔後に放血致死させた後、臓器を摘出し肉眼的に臓器の異常を検査した。病理組織検査のため剖検した全臓器を 10％中性ホルマリン溶液に10日以上固定させた後、脱水過程を経てパラフィン包埋法（Fisher，HistomaticTissue Processor，166Ａ，Shadon，ＵＫ）により包埋した後、ロタリーミクロトーム（ＡＯ Rotary Microtomc，ＬＥＩＣＡ，Germany）で 5μｍ切片をつくりへマトキシリンとエオシン染色して観察した。各群の全ての動物を解剖し顕微鏡で調査した病理組織学的所見は添付の図１９に表した。即ち、本発明による黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物をマウス体重１ｋｇ当り 15g まで経口投与した場合にも肝臓組織で薬物投与による異常所見は観察されなかった（図19Ａ）。また腎臓においても薬物投与による異常所見は観察されず（図19Ｂ）、心臓の心筋細胞においても薬物投与による異常所見は全く観察されなかった（図19C)。その他の主要臓器である消化管、膵臓、肺、脾臓、副腎、脳、睾丸、卵巣、骨髄などにおいても薬物投与による異常所見は観察されなかった。したがって、本発明による黄栢皮とオミナエシの混合水抽出物は（マウスに投与できる最大用量）体重１kg当り15g投与の時にも全臓器に対して急性毒性による副作用がなく、またいかなる臓器損傷などの毒性も誘発しない安全な薬物であるものと判断された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ホンウンキョン大韓民国キョンキドグンポシサンボンドンモクリョンアパート 1222―102 (72)発明者ジョンヨンシン大韓民国ソウル市ソチョ−グソチョ −ドンシンドンアアパート１―716 (72)発明者リュウボーイム大韓民国ソウル市ソンパグシンチョンドンミソンアパート２―315 (72)発明者キムサンゴン大韓民国ソウル市ノウォングゴンルンイドンヒョンデアパート 18―201 (72)発明者リーキョンヨン大韓民国ソウル市ガンドングミョン１ドンゴドクヒョンデアパート 13― 1403

Claims

【特許請求の範囲】１．有効成分として黄栢皮とオミナエシの混合抽出物を含有するＣ型肝炎治療用製薬組成物。２．黄栢皮とオミナエシを重量基準で1:0.1ないし1:5の比で混合して抽出した混合抽出物を含有する請求項１記載のＣ型肝炎治療用製薬組成物。３．黄栢皮とオミナエシを重量基準で1:1ないし1:2の比で混合して抽出した混合抽出物を含有する請求項２記載のＣ型肝炎治療用製薬組成物。４．黄栢皮とオミナエシを重量基準で1:1の比で混合して抽出した混合抽出物を含有する請求項３記載のＣ型肝炎治療用製薬組成物。５．黄栢皮とオミナエシの混合抽出物が水あるいはアルコール抽出物である請求項１記載のＣ型肝炎治療用製薬組成物。６．黄栢皮とオミナエシの混合抽出物が炭素数１ないし４のアルコール抽出物である請求項５記載のＣ型肝炎治療用製薬組成物。７．追加に薬剤学的に許容される担体を使用して薬剤学的単位投与形に剤形化された請求項１記載のＣ型肝炎治療用製薬組成物。８．薬剤学的単位投与形が錠剤、カプセル剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤あるいは飲料の形態である請求項７記載のＣ型肝炎治療用製薬組成物。