JPH084508B2 - 組み換えワクチニアウイルス - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組み換えワクチニアウイルスに関し、さらに
詳しくは、ワクチニアウイルスの増殖に非必須なゲノム
DNA領域に日本脳炎ウイルスの表面抗原蛋白質をコード
するcDNAが組み込まれた組み換えワクチニアウイルスに
関する。

（従来の技術） 日本脳炎に対するワクチンとしては、従来、不活化日
本脳炎ウイルスを有効成分とするワクチンが用いられて
おり、健康なマウス脳内に日本脳炎ウイスル中山予研株
を接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し、ア
ルコール・プロタミン法により精製、不活化して不活化
日本脳炎ウイルスワクチン原液を得ている［国立予防衛
生研究所学友会編「日本のワクチン」改訂２版（昭和52
年１月20日丸善株式会社発行）］。この不活化ワクチン
は、安全性は高いものの免疫成立まで比較的長時間を要
し、また免疫の持続期間が短いことが欠点としてあげら
れている。

また日本脳炎ウイルスの表面抗原蛋白質（以下、Ｅ蛋
白質と称することがある）を酵母を宿主とする遺伝子操
作によつて発現させようとする試みもなされている（第
34回日本ウイルス学会予稿集第91頁昭和61年10月）が、
未だ本来のＥ蛋白質の産生に成功した例はなく、このま
までは仮りに成功したとしても長期間の免疫持続性が期
待される生ワクチンとはなりえない。

近年、種痘生ワクチンとして用いられているワクチニ
アウイルスに外来性DNAを組み込んだ組み換えワクチニ
アウイルスの構築法が考案され、外来性DNAとして、例
えば感染症ウイルスの抗原コードDNAを用いた組み換え
ワクチニアウイルスを新しい生ワクチンとして利用する
方法が提案されるようになつた（例えば特開昭58−1299
71号、特公表昭60−500518号、特公表昭61−501957号な
ど）。

しかしながら、トガウイルス科フラビウイルス属に属
する日本脳炎ウイルスは、一本鎖RNAをゲノム（ウイル
スの遺伝情報を担う本体）とし、ウイルスの感染細胞内
においてモノシストロニツクにゲノムから翻訳された一
本のポリペプタイドがコア蛋白質、マトリツクス蛋白
質、Ｅ蛋白質、及び５種類の非構成蛋白質へとプロセツ
シング（一本のポリペプタイドが細胞内のプロテアーゼ
で切断されて各々の蛋白質ができる事をいう）されると
いう特徴をもつため、Ｅ蛋白質をコードするcDNAをワク
チニアウイルスに組み込んで発現させることは操作上困
難であり、従つてこれまでにその発現例については全く
報告されていない。

（発明が解決しようとする問題点） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で、感染細
胞において日本脳炎ウイルスＥ蛋白質を発現可能な組み
換えワクチニアウイルスの構築を目指し、鋭意検討を進
めた結果、日本脳炎ウイルスのゲノムRNAを鋳型とし調
整したcDNAよりＥ蛋白質、マトリックス蛋白質及びプレ
マトリックス蛋白質をコードする領域を選択し、その前
後にそれぞれ翻訳開始コドンと翻訳終止コドンを付与
し、ワクチニアウイルスのプロモーターに連結し、ワク
チニアウイルスの増殖に非必須なゲノム領域に組み込め
ば、感染細胞において日本脳炎ウイルスＥ蛋白質を発現
可能な組み換えワクチニアウイルスが得られることを見
い出し本発明を完成するに至つた。

（問題点を解決するための手段） かくして本発明によれば、日本脳炎ウイルスのＥ蛋白
質、マトリックス蛋白質及びプレマトリックス蛋白質を
コードするcDNAをワクチニアウイルスの増殖に非必須な
ゲノム領域に、好ましくはプロモーター機能を有するDN
A、人為的に付加された翻訳開始コドン及び翻訳停止コ
ドンと共に、発現可能な形で組み込まれた組み換えワク
チニアウイルスが提供される。

本発明において組み換えウイルスの作製に供されるウ
イルスはワクチニアウイルスに分類されるウイルスであ
ればいかなるものでもよく、例えばWR株（ジヤーナル
オブ ヴイロロジー49、857、（1984）、リスター株、
リスター株の温度感受性変異株（米国特許第4,567,147
号、特開昭62−44178号参照））、New York Board of H
ealth株、LC16m8株などの種痘ワクチン株（ワクチン抗
原用ベクターとしてのワクチニアウイルス“Vaccinia v
iruses as vectors for Vaccine Antigens"pp.87−100.
ジエイ．キンナン（J.Quinnan,）編アムステルダム，ニ
ユーヨークおよびオツクスフオード：エルセバー社）
（Eisevier）版）などが例示される。

これらのウイルスのなかでも孵化鶏卵漿尿膜上でのポ
ツクスサイズが3mm以下で、かつウサギ腎臓細胞での増
殖不能温度が41℃以下のものが好適であり、その具体例
としては前記特開昭62−44178号記載の弱毒痘そう株LA
及びLB（CNTM−Ｉ−423）、前記LC16m8株などが例示さ
れる。

これらの株はきわめて弱毒性であり、本発明の組み換
えウイルスを生ワクチンとして利用しようとする場合に
は安全性の面で有利である。

また、日本脳炎ウイルスの表面抗原蛋白質をコードす
るcDNAは、例えば前記中山予研株やJaOAr株（エール大
学アーボヴイラス研究センター）、Sagayama株（同所）
を用いて調製することができる。

例えば上記Sagayama株から調製されたＥ蛋白質、マト
リックス蛋白質及びプレマトリックス蛋白質をコードす
るcDNAは第３図に示すごとき全部で2001の塩基対から構
成されているが、本発明においては上記cDNAと実質的に
同一の機能を有する範囲において、修飾されたcDNA（即
ち、塩基配列が置換、挿入、欠失したもの）であつても
よい。もちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、
アミノ酸配列が異なる程度に修飾されたものであっても
よい。例えば日本脳炎ウイルスの株間ではその塩基配列
が一部異なっている事がActa Virologica Vol 30,（198
6）353−359で示されている。また、Virology Vol 161
（1987）497−510に記載の日本脳炎ウイルスJaOArS982
株のＥ蛋白質をコードするcDNAは、本願の第３図に示す
塩基配列と比較し24塩基が置換されており、アミノ酸配
列も13個異なるが、両者のcDNAは実質的に同一機能を有
する。また、Nucleic Acid Research Vol 10（1982）64
75−6485に記載された方法で93bpまでの欠損や挿入を人
工的に起こす事も可能であるが、この場合にはアミノ酸
の読み枠がずれないために、挿入又は欠失の塩基枢は３
の整数倍にしなければならないがこの場合も同一の機能
を示しうる。いずれにしろ、これら実質的に同一の機能
を示すものも使用可能であることは言うまでもない。同
様に、日本脳炎ウイルスのプレマトリックス蛋白質とマ
トリックス蛋白質をコードするcDNAについても修飾、欠
失や挿入を有するものであっても実質的に同一の機能を
示すものであれば使用できる。

本発明を実施するに当たつては、まずワクチニアウイ
ルスの増殖に非必須なDNA領域を組み込んだ第一の組み
換えベクターが作製される。この場合、前記領域にワク
チニアウイルス内で機能するプロモーターを挿入し、さ
らにプロモーターの下流に翻訳開始コドン、翻訳終止コ
ドン及びその両者間に適当な制限酵素切断配列を有する
合成リンカーを挿入することが好ましい。

ここで言う増殖に非必須なDNA領域とは、例えばワク
チニアウイルスのチミジンキナーゼ（TK）遺伝子、血球
凝集素（HA）遺伝子、ワクチニアウイルスWR株DNAのHin
dIII切断Ｆフラグメント、Ｍフラグメント、Ｎフラグメ
ント（ウイルス36（１）、23−33（1986））など、外来
性DNAの挿入による変異を受けても実質上ウイルスの増
殖に影響を及ぼさない領域を言う。

また、ワクチニアウイルス内で機能するプロモーター
とは、合成・天然を問わずワクチニアウイルスが保有す
る転写の系でプロモーターとして有効に機能しえるもの
ならいかなる塩基配列のものでも良く、その具体例とし
ては例えばジヤーナル オブ ヴイロロジー662−669
（1984）に示されるようなワクチニアウイルスのプロモ
ーター、具体的には7.5Kポリペプチドをコードするワク
チニアウイルス遺伝子のプロモーター、19Kポリペプチ
ドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモータ
ー、42Kポリペプチドをコードするワクチニアウイルス
遺伝子のプロモーター、チミジンキナーゼをコードする
ワクチニアウイルス遺伝子のプロモーター、28Kポリペ
プチドをコードするワクチニアウイルス遺伝子のプロモ
ーター、11Kポリペプチドをコードするワクチニアウイ
ルス遺伝子のプロモーターなどが例示される。

第一の組み換えベクター作製は常法（例えば特開昭58
−129971号、特公表昭60−500518号、特開昭62−44178
号など）に従つて行うことができる。例えばワクチニア
ウイルスの増殖に非必須なDNA断片を適当なベクターに
組み込んだ後、必要に応じて該断片中に存在する制限酵
素切断点を利用し、制限酵素切断配列を付加したプロモ
ーターを組み込めば良い。

ところで日本脳炎ウイルスの蛋白質は先に述べたよう
にモノシストロニツクに合成された後、プロセツシング
されて表面抗原蛋白質等にわかれる。従つて、全ウイル
スゲノムに対するcDNAを挿入すれば人為的に翻訳開始コ
ドン及び翻訳終止コドンを挿入する必要はないが、Ｅ蛋
白質、マトリックス蛋白質及びプレマトリックス蛋白質
をコードするcDNAのみを組み込もうとするときは先に挿
入したプロモーターの下流に存在する制限酵素切断点を
利用し、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び両者間に
制限酵素切断配列を有する合成リンカーを組み込むこと
が必要である。

挿入する翻訳終止コドンは、Ｅ蛋白質、マトリックス
蛋白質及びプレマトリックス蛋白質をコードするcDNAの
読み取り枠がいずれであつても合致するように読み取り
枠をずらせて３ケ所に設けることが望ましい。

挿入するcDNAはＥ蛋白質、マトリックス蛋白質及びプ
レマトリックス蛋白質をコードする領域を含むものであ
ればその他に他の蛋白質をコードする領域を含むもので
あつてもよい。フラビウイルス属に属するウイルスにつ
いては、Ｅ蛋白質、マトリックス蛋白質（以下Ｍ蛋白質
と称する）、プレマトリックス蛋白質（以下PreM蛋白質
と称する）をコードする上流にコア蛋白質（以下Ｃ蛋白
質と称する）をコードする領域が存在しているが、この
Ｃ蛋白質をコードするcDNAの全部又は一部をＥ蛋白質、
Ｍ蛋白質及びPreM蛋白質をコードするcDNAの上流に結合
したものを用いてもよい。

用いられるベクターの具体例としては、例えばpBR32
2、pBR325、pBR327、pBR328、pUC7、pUC8、pUC9、pUC19
などのごときプラスミド、λフアージ、M13フアージな
どのごときフアージ、pHC79（ジーン、11、291、1980
年）などのごときコスミドが例示される。

本発明においては、次いで、第一の組み換えベクター
のプロモーターの下流に日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質を
コードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが作
製される。挿入方法もまた常法（例えば前記各公報参
照）に従えば良く、例えば第１のベクターのプロモータ
ーの下流で、かつ人為的に付与された翻訳開始コドンと
翻訳終止コドンの間に予め設けられた制限酵素切断点を
利用して日本脳炎ウイルス由来のcDNA断片を挿入すれば
良い。

これら第一及び第二の組み換えベクターの構築に当た
つては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、
使用するプラスミドベクターも目的に相応しいものであ
る限り特に限定されるものではない。

本発明においては、次に、予めワクチニアウイルスを
感染させた動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移
入し、ベクターDNAとウイルスゲノムDNAの間に相同組み
換えを起こさせ、組み換えワクチニアウイルスを構築す
る。

ここで用いられる動物培養細胞はワクチニアウイルス
が増殖可能なものであればよく、その具体例として、例
えばTK^-143（ヒト骨肉腫由来）、FL（ヒト羊膜由来）、
Hela（ヒト子宮頸部癌由来）、KB（ヒト鼻咽喉癌由
来）、CV−１（サル腎由来）、BSC−１（サル腎由
来）、RK13（ウサギ腎由来）、L929（マウス結合組織由
来）、CE（鶏胚）細胞、CEF（鶏胎児繊維芽細胞）など
が例示される。

組み換えワクチニアウイルスの構築に当たつては常法
に従えば良く、例えば、DNAクーロニング第２巻（DNA c
loning Volume II）、実際的なアプローチ（a practica
l approach）pp.191−211、デイ．エム．グローバー（D
M Glover）編、（IRLプレス，オツクスフオード，ワシ
ントン）の記述に準じてワクチニアウイルスを感染させ
たRK13細胞にリン酸カルシユウム共沈法により処理した
第二の組み換えベクターを移入させ、得られる組み換え
ウイルスを含むウイルス集団をEagle MEM上に培養され
たTK陰性細胞に感染させBUdR存在下生育してくるプラー
クを選択し、組み換えウイルス候補株とすれば良い。こ
れら候補株の内から日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質をコー
ドするDNA断片が組み込まれたウイルスを選択する方法
は、該DNAをプローブとするハイブリダイゼーシヨン法
を利用してプラーク純化するか、あるいは、日本脳炎ウ
イルスに対する抗血清又はモノクローナル抗体を用いる
イムノアツセイを利用すれば良い。

（発明の効果） かくして本発明によれば、ワクチニアウイルスの増殖
に非必須なゲノム領域に日本脳炎ウイルス由来のＥ蛋白
質、Ｍ蛋白質及びPreM蛋白質をコードするcDNAがプロモ
ーター機能を有するDNAと共に発現可能な形で組み込ま
れた、生ワクチンとして利用可能な、組み換えワクチニ
アウイルスが得られる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明す
る。

実施例１ （１）日本脳炎ウイルスからのRNAゲノムの抽出蚊由来
株化細胞C6/36（J.Gen.Virol.40 531−544（1978））に
日本脳炎ウイルスSagayama株を感染させ、ウイルスを増
殖させた後、培養上清とポリエチレングリコールとを混
合し遠心分離により日本脳炎ウイルスを精製した。ウイ
ルスゲノムRNA（約11Kbp）は精製ウイルスからフエノー
ル抽出後、エタノールを加えて沈澱させ分離した。

（２）日本脳炎ウイルスのcDNAのクローニング（第１図
参照） （１）で調製したウイルスゲノムRNAにポリ（Ａ）ポ
リメラーゼ（宝酒造）を使つて、ポリ（Ａ）を付加し、
それを鋳型とし、オリゴｄ（Ｔ）をプライマーに用い
て、４種（Ａ・Ｇ・Ｃ・Ｔ）のデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸と、逆転写酵素を働かせて、フアーストスト
ランドcDNAを合成した。次に大腸菌RNaseHと、４種（Ａ
・Ｇ・Ｃ・Ｔ）のデオキシリボヌクレオシド三リン酸と
大腸菌DNAポリメラーゼを使つて二本鎖cDNAを作成し、
（Molecular Cloning［Cold Spring Harbor Lab,（198
2）〕p.211〜246）、ターミナルトランスフエラーゼでd
C鎖を付加した。一方、プラスミドpUC9（フアルマシア
製）を制限酵素PstIで消化後、ターミナルトランスフエ
ラーゼでdG鎖を付加し、これと、前記cDNAを混合し、ラ
イゲーシヨン反応を行ない環状化した。この組換えプラ
スミドを大腸菌HB101コンピテントセルに導入し、形質
転換菌を得た。形質転換菌からプラスミドをとり出し、
インサートcDNAの長さをアガロースゲルで比較し、もつ
とも長いインサートcDNAについて５′側の配列分析（Ge
ne19p.269（1982））をおこなつた。その配列分析の結
果より、20−merの合成オリゴヌクレオチド（５′−dAT
TCCGTACCATGCAGTCCA−３′）をプライマーとし、ウイル
スゲノムRNAを鋳型にして、再度上記の方法でcDNAを作
成し、プラスミドpUC9にライゲーシヨンし、多数の形質
転換菌を得た。得られた形質転換菌の中から目的の表面
抗原蛋白質をコードするcDNAを含む組み換えプラスミド
を含む形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。

尚、日本脳炎ウイルスのcDNAクローンの作成方法につ
いては、日本脳炎ウイルスJaOArS982株を使い、同様な
方法で作成した例がGene48p.195−201（1986）に記載さ
れている。

（３）日本脳炎ウイルス表面抗原蛋白質をコードするcD
NA（4118）を含む組み換えプラスミドpJE4118のスクリ
ーニング（第１図及び第２図参照） （２）で得られた形質転換菌を寒天プレートで生育さ
せ、ニトロセルロースフイルターにレプリカする。レプ
リカしたフイルターを0.2％NP−40（界面活性剤、半井
化学）でゆるやかに洗浄した後、抗JE血清でイムノスク
リーニングしたところ、弱いながらもポジテイブに反応
する形質転換菌を１株得て、その株が保育するプラスミ
ドをpJE4118とした。次いでプラスミドpJE4118を常法
（Molecular Cloning p75〜95［前記］）に従い調製
し、制限酵素PstIでpUC9に挿入されたcDNAを切り出し、
これをDNAプローブとして、（２）で得た各種形質転換
菌をコロニーハイブリダイゼーシヨン法（Molecular Cl
oning p382〜387［前記］）によつてスクリーニング
し、pJE4118のインサートのcDNA（4118）と重なりあうc
DNAをもつプラスミドを選び出した。そうやつて選び出
したcDNA（２−20）をプラスミドより回収し、制限酵素
でその位置関係を決定した（第２図参照）ところ、cDNA
（２−20）はcDNA（4118）のＮ末端と部分的に重なり合
つていることが判明した。

（４）表面抗原蛋白質をコードするcDNAの塩基配列の解
明（第３図参照）。

組み換えプラスミドpJE4118と、pJE2−20を制限酵
素、PstIで切断し、それぞれ約2.5Kbp、約1.0KbpのDNA
断片を得た。これらの断片についてM13フアージを用い
るメツシングらの方法（ジーン19、p269（1982）、サイ
エンス241p1205（1981））により、cDNA（4118）の場合
は５′側から、cDNA（２−20）の場合は３′側から配列
分析を行なつた。

その結果、両者が重なり合う部分のcDNA配列は第３図
中の第５番アミノ酸の第３コドンから第116番アミノ酸
までの334塩基である事が判明した。この塩基配列から
推定されるアミノ酸配列と、すでに公知（Science229
726−733（1985））である黄熱病ウイルス（日本脳炎ウ
イルスと同属近縁）のＥ蛋白質のアミノ酸配列の比較か
ら、日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質は第３図に示す＋１番
目から第500番目のアミノ酸までであると判断された。

同様に、日本脳炎ウイルスのＭ蛋白質は第３図に示す
第−75番目から第−１番目のアミノ酸まで、またPreM蛋
白質は第−167番目から第−76番目までと判断された。
さらに、PreM蛋白質の５′側は日本脳炎ウイルスのＣ蛋
白質の一部をコードしていると判断された。

（５）日本脳炎ウイルス構造蛋白質をコードするcDNAの
作製（第２図及び第３図参照） cDNA（4118）はＥ蛋白質のＮ末端の５アミノ酸が欠け
ている。そこでcDNA（２−20）を用いて、AatIIサイト
の位置でつなぎ合わせて、Ｅ蛋白質を完全にカバーする
cDNA（203）を得た。

cDNA断片（J7）:cDNA（203）からHpaII−HpI断片
（約810bp）とHpaI−BglII断片（約800bp）を調製し、
これを連結した約1.6Kbpの断片。この断片はＥ蛋白質を
コードする領域の上流に存在するＭ蛋白質をコードする
領域を殆ど含んでいない。なお、第２図中のNS1は非構
成蛋白質をコードする領域を意味している。

cDNA断片（J4）:cDNA（203）をXhoIIとBglIIで処理
した約2.1Kbpの断片。この断片はＥ蛋白質をコードする
領域に加えてＭ蛋白質をコードする領域を含んでいる。

cDNA断片（J6）:cDNA（203）をHaeIIで処理した約
2.4Kbpの断片。この断片はＥ蛋白質、Ｍ蛋白質、PreM蛋
白質及びＣ蛋白質の一部を含んでいる。

（６）ポリリンカー及びワクチニアウイルス7.5Kプロモ
ーターが挿入されたワクチニアウイルスTK遺伝子を含む
第一の組み換えベクターpAK8の作製（第４図参照） pUC9をEcoRI及びPstIで消化後、ポリメラーゼで処理
し、切断端を平滑末端したのち、連結し、EcoRI部位の
欠損したpUC9を作製した。このEcoRI部位欠損pUC9をHin
dIIIで切断後、ワクチニアウイルスTK遺伝子を含むワク
チニアウイルスWR株のHindIIIJ断片に連結し、組み換え
ベクターpUHKを得た。

次いでワクチニアウイルスWR株の7.5プロモーター
（モスら、セル125,p.805〜813,1981年）をpUC19（フア
ルマシア社製）のHincII部位に挿入したのち、HindIII
とEcoRIで順次切断して7.5Kプロモーターの前後にポリ
リンカー部位を有するDNA断片（約350bp）を得た。

このDNA断片（第４図参照）と前記プラスミドpUHKのE
coRI消化物とをポリメラーゼで処理したのち、連結し、
得られた組み換えプラスミドをpNZ68K2と命名した。

次いで翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び両者間に
制限酵素切断配列（BglII、NcoI）を有する両末端がBam
HIサイトの合成リンカーを合成し（第４図参照）、pNZ6
8K2のBamHIサイトに挿入して、目的の第一の組み換えプ
ラスミドpAK8を作製した。

（７）7.5Kプロモーターの下流に日本脳炎ウイルスの表
面抗原蛋白質をコードするDNAを挿入した第二の組み換
えプラスミドの作製（第４図参照） cDNA（J7）を挿入した第二の組み換えプラスミド
（pAKJ7）の作成 （５）で得たcDNA（J7）をヌクレアーゼS1処理後、
（６）で得たプラスミドpAK8をNcoIで消化後、ポリメラ
ーゼ処理した開裂プラスミドに連結し、7.5Kプロモータ
ーの下流で、かつ翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間
にcDNA（J7）を挿入した組み換えプラスミドpAKJ7を得
た。

このプラスミドは制限酵素NcoIで切断したときに約0.
4KbpのDNA断片を生ずるものとして選択される。因みにc
DNA（J7）が逆方向に挿入された組み換えプラスミドの
場合には、同様に処理したときに約1.2KbpのDNA断片を
生ずる。

cDNA（J4）を挿入した第二の組み換えプラスミド
（pAKJ4）の作成 （５）で得たcDNA（J4）を（６）で得たプラスミドpA
K8のBglII消化物に連結し、7.5Kプロモーターの下流で
かつ翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間にcDNA（J4）
を挿入した組み換えプラスミドpAICJ4を得た。

このプラスミドは制限酵素NcoIで切断したとき約0.74
KbpのDNA断片を生ずるものとして選択された。

cDNA（J6）を挿入した第二の組み換えプラスミド
（pAKJ6）の作成 （５）で得たcDNA（J6）ポリメラーゼ処理後、（６）
で得たプラスミドpAK8のBalI消化物と連結し、7.5Kプロ
モーターの下流で、かつ翻訳開始コドンと翻訳終止コド
ンの間にcDNA（J6）を挿入した組み換えプラスミドpAKJ
6を得た。

このプラスミドは制限酵素NcoIで切断したとき約0.4K
bpのDNA断片および約0.7KbpのDNA断片を生ずるものとし
て選択された。

（８）組み換えワクチニアウイルスの作出 25cm²のカルチヤーボトルに培養されたRK−13細胞に
弱毒痘そうウイルス株（特開昭62−44178号記載の弱毒
痘そう株LA、ウサギ腎細胞における増殖不能温度41℃、
孵化鶏卵漿尿膜上でのポツクサイズ２〜3mm）を0.1pfu/
細胞の割合で接種し、45分後、（７）で得た各種の組み
換えプラスミド（pAKJ7、pAKJ4、pAKJ6）10μｇを2.2ml
の滅菌水に溶解し、樋高ら（蛋白質・核酸・酵素、27、
340−1985）の方法によつてDNA−リン酸カルシウム共沈
物をつくり、その0.5mlを感染RK−13細胞上に滴下し
た。30分間、37℃、７％CO₂インキユベーターに静置
し、５％牛胎児血清を含むイーグル（Eagle）MEM4.5ml
を加えた。その３時間後、培養液を交換し、48時間、37
℃、７％CO₂インキユベーター中で培養し、培養細胞ご
と３度凍結融解した。

組み換え体の選択のため、10cmペトリ皿に培養された
TK^-143細胞に上記のウイルス液を接種し、30分後、１％
アガロース、５％牛胎児血清、25μg/mlBUdR加 Eagle M
EMを積層し、３日間培養後感染細胞を0.01％中性紅で染
色した。出現したプラークからパスツールピペツトでウ
イルスを抜きとり、これを２％ゼラチンを含むPBSに懸
濁し、一部はドツトハイブリダイゼーシヨンをするた
め、ナイロン又はニトロセルロースメンブレンにスポツ
トし、残りは−20℃で保存した。スポツトしたメンブレ
ンは0.5N NaOHで10分間、1Mトリス塩酸緩衝液で５分の
処理を３回繰返した後、1.5M NaCl 0.5Mトリス塩酸緩衝
液で５分処理した。２倍SSC（１倍SSC、0.15M NaCl、0.
015M クエン酸ナトリウム）で飽和させ、80℃、２時間
焼きつけた。４倍SET（0.6M NaCl、0.08M Tris−Cl、4m
M EDTA（pH7.8））−10倍Denhardt−0.1％SDSで68℃、
２時間処理した。４倍SET−10倍Denhardt−0.1％SDS−
0.1％Na₄P₂O₇−50μg/ml変性サケ***DNAとニツクトラ
ンスレーシヨンによつて³²Pで標識した日本脳炎ウイル
スのＥ蛋白質のcDNAを入れて68℃、14時間ハイブリダイ
ゼーシヨンした。洗浄後、メンブレンとＸ線フイルムを
重ね、オートラジオグラフイーを行い、フイルムが黒化
するスポツトを選択した。黒化したスポツトに対応する
ウイルス液を再度TK^-143の細胞に接種し、30分後、１％
アガロース、５％牛胎児血清、25μg/mlBUdR加Eagle ME
Mを積層し、３日間培養後感染細胞を0.01％中性紅で染
色した。出現したプラークについて、上記と同様な操作
をおこない、出現するプラークが全て、ドツトハイブリ
ダイゼーシヨンで黒化するまで純化の操作をくり返し
た。こうして得られたウイルスは、目的の組み換えワク
チニアウイルスであり、使用した組み換えプラスミドに
対応してそれぞれLAJ7、LAJ4、LAJ6と命名した。

（９）組み換えワクチニアウイルスの感染細胞での発現 抗V3抗体による判定 組織培養用チヤンバ〜スライドに培養したRK13細胞に
m.o.i.1又は0.1の本発明組み換えウイルス株を接種し、
37℃、１時間感染後ウイルス液を抜きとり、細胞をEagl
e MEMで洗浄し、５％牛胎児血清、Eagle MEMを加えた。
16時間後、Eagle MEMを除き、軽くPBS（リン酸緩衝生理
食塩水）で洗い、風乾した後、室温でアセトン中５分間
処理し細胞を固定した。一次抗体として抗V3抗体、二次
抗体としてイソチアン酸フルオレセイン結合抗ウサギIg
G抗体を使用する間接螢光抗体法でチエツクした。その
結果、３種類の組み換えワクチニアウイルスはいずれも
日本脳炎ウイルスのＥ蛋白質生産能を持つことを確認し
た。尚、抗V3抗体の作成法は以下のとおりである。

日本脳炎ウイルスをSDS1％、２−メルカプトエタノー
ル0.1％を含むPBS中で分解し、10％ポリアクリル・アミ
ドゲル電気泳動によりＥ蛋白質を分解し、ゲルを切り出
してＥ蛋白質を回収した。こうして得たＥ蛋白質をウサ
ギに接種し、抗V3血清を回収した。このようにして得た
抗V3抗体は変性されたＥ蛋白質、すなわち蛋白質の一次
構造を認識して反応する。

抗JEV抗体による判定 一次抗体として抗JEV抗体（日本脳炎ウイルスそのも
のを接種して作成した抗血清）を用いること以外は上記
と同様にして、生物学的活性のあるＥ蛋白質産生の有
無をチエツクした。

なおこの抗JEV抗体は生物学的活性のある日本脳炎ウ
イルスをもとに作成したので、抗JEV抗体と反応する蛋
白質は、日本脳炎ウイルスの表面上に存在する。生物学
的活性のある蛋白質と類似の活性を持つと判断される。

結果をまとめて第２表に示す。この結果から、いずれ
の組み換えウイルスもＥ蛋白質を産生しており、とくに
LAJ6が産生したＥ蛋白質は日本脳炎ウイルスの表面上に
あるＥ蛋白質と同様の生物学的活性を有することが示さ
れた。

実施例２ （１）組み換えワクチニアウイルスによる動物免疫試験 ３×10⁸PFUの力価のLAJ6をウサギの背中の皮内に接種
して、血液中の日本脳炎ウイルスに対する中和抗体力価
を「ウイルス検査のための組織培養技術」（北村敬著、
近代出版、p.250〜p.255）記載の方法に基づき測定し
た。その結果を第３表に示す。

この結果から明らかなように、組み換えワクチニアウイ
ルスLAJ6の接種により、動物の血液中の日本脳炎ウイル
スに対する中和抗体価が上昇する。このことはワクチン
としての有効性を示している。

実施例３ （１）組み換えワクチニアウイルスの作出 前記実施例１の（８）で述べた弱毒痘そうウイルス株
の代わりに強毒痘そうウイルスWR株を用いることを除い
て実施例１とまつたく同様な方法で、組み換えワクチニ
アウイルスを作出することができる。前記pAKJ6を使用
してWR株から組み換えワクチニア株を作出、純化して、
それをWRJ6と命名した。

（２）組み換えワクチニアウイルスによる日本脳炎ウイ
ルス攻撃試験 ４週齢の雄C3H/Heマウス（静岡実験動物共同組合より
入手）に、ワクチニアウイルスの親株WR株と（１）で得
られたWRJ6株をそれぞれ3.4×10⁷PEUずつ皮下接種し
た。２週間後、免疫したマウスを日本脳炎ウイルス（３
×10²PFU）で尾静脈注射により攻撃した。攻撃３週間後
のマウスの生存率を第４表に示す。この結果から、組み
換えワクチニアウイルスによる免疫によつて、日本脳炎
ウイルスの感染、発症に対して実際に有効に防御できる
事が示され、組み換えワクチニアウイルスがワクチンと
して利用可能な事が明らかとなつた。

【図面の簡単な説明】

第１図は日本脳炎ウイルスのcDNAのクローニング手順、
第２図はcDNAの制限酵素サイトの位置関係、第３図はＥ
蛋白質、Ｍ蛋白質及びPreM蛋白質をコードする領域を含
むcDNAの塩基配列及びアミノ酸配列、第４図はＥ蛋白質
をコードするcDNAを含む組み換えプラスミドpAKJ4の構
築手順をそれぞれ示す。

フロントページの続き (72)発明者 安田 斡司 神奈川県鎌倉市七里ケ浜東４―25―６ (72)発明者 佐藤 隆則 神奈川県横浜市港北区太尾町873 (56)参考文献 特開 昭62−286930（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500518（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−501203（ＪＰ，Ａ) Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｗｏ ｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａ ｔｉｏｎ，65［３］（1987）Ｐ．303−308

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ワクチニアウイルスの増殖に非必須なゲノ
   ム領域に日本脳炎ウイルスの表面抗原蛋白質をコードす
   るcDNAまたはそれと実質的に同一の機能を有するcDNAと
   日本脳炎ウイルスのプレマトリックス蛋白質とマトリッ
   クス蛋白質とをコードするcDNAまたはそれと実質的に同
   一の機能を有するcDNAをともに組み込んだ組み換えワク
   チニアウイルス。
2. 【請求項２】組み込まれたcDNAがプロモーターの支配下
   にある特許請求の範囲第１項記載の組み換えワクチニア
   ウイルス。
3. 【請求項３】組み込まれたcDNAが合成された翻訳開始コ
   ドンと翻訳停止コドンの間に挿入されている特許請求の
   範囲第１項又は第２項に記載の組み換えワクチニアウイ
   ルス。
4. 【請求項４】日本脳炎ウイルスの表面抗原蛋白質をコー
   ドするcDNAが下記のアミノ酸配列を有するポリペプチド
   をコードするものである特許請求の範囲第１〜３項のい
   ずれか１項に記載の組み換えワクチニアウイルス。