JP3458880B2 - 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 - Google Patents
組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法Info
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Description
方法、及び当該プラスミドを用いて得られる多価組み換
え体(プラスミド、形質転換体、ウイルス等)に関す
る。
材料などとして、形質転換細菌や組み換えウイルスなど
の組み換え体は重要な役割を果たしている。例えば、病
原体由来の遺伝子を導入した形質転換細菌を用いて抗原
タンパク質を製造したり、病原体由来の遺伝子を組み込
んだ組み換えウイルスを生ワクチンとして投与したりす
ることができる。とくに、最近では複数の病原体由来の
遺伝子を導入または組み込んで、多価組み換え体を構築
し、安全性の高い生ワクチンを得ることが検討されてい
る。これは、組み換え体を用いたワクチンでは、組み換
え体が1種類の病原体由来の遺伝子しか発現しない場
合、複数の病原体への免疫を生体に付与する為には複数
の組み換え体を接種または投与する必要があるのに対し
て、複数の病原体由来の遺伝子を発現する多価組み換え
体を用いると、一つの組み換え体で複数の病原体への免
疫を付与することができ、生体に対する負担を軽くする
ことができるなどの利点によるものと考えられる。
プラスミドやファージなどいわゆるベクターが用いられ
ている。例えば、細菌に遺伝子を導入する場合は、導入
したい遺伝子を組み込んだプラスミドやファージを構築
し、これを細菌に導入する形質転換や形質導入する。ま
た、ウイルスに遺伝子を導入する場合は、ウイルスの増
殖に非必須な領域の間に導入したい遺伝子が挿入された
遺伝子を有する組み換えプラスミドを構築し、これを用
いてウイルスと相同組み換えを起こさせて、ウイルスに
遺伝子を導入する方法が一般的に知られている。
えプラスミドが、細菌やウイルスの組み換え体の作製に
重要な道具として用いられる。病原体由来の遺伝子を有
するプラスミドは、制限酵素によってプラスミドの一部
を切断し、ここに病原体由来の遺伝子を挿入して構築さ
れるのが一般的である。ここで用いられる制限酵素は、
特定の遺伝子の配列を認識し、当該配列内または配列か
ら一定の位置のヌクレオチドを切断するものであり、多
くの制限酵素は6〜8塩基を認識する制限酵素である。
中でも6塩基認識タイプの制限酵素がその種類の多さか
ら、広く組み換え体の構築に利用されている。
部位(切断部位)が、遺伝子上に存在する確率は、各塩
基が完全にランダムに連結していると仮定すると、4
(塩基の種類の数)の4〜8乗(認識する塩基の数)で
あることから、4塩基認識の制限酵素による切断部位の
存在確率が最も高く、これは多価組み換え体構築にあま
り適していない。同様に6塩基認識の制限酵素であって
も、プラスミドなどのサイズが大きくなるに従って、同
じ制限酵素により認識される部位が複数ある確率が高く
なる。一つのプラスミド中に、複数箇所の切断部位があ
る制限酵素を用いてプラスミドに病原体由来の遺伝子を
挿入する場合、部分分解などの技法が必要であり、操作
が煩雑となる。また、8塩基認識の制限酵素を用いる
と、プラスミド中の認識箇所は少ないため、上記問題は
解決する。しかし、一つの病原体由来の遺伝子を組み込
んだ後、第二の他の病原体由来の遺伝子を導入するに際
し、同じ制限酵素を用いると、先に組み込んだ病原体由
来の遺伝子の両端にある切断点も切断されてしまう。こ
の場合も、上記の同一制限酵素認識部位が複数あること
になり、6塩基認識制限酵素を用いた場合と同様、部分
分解などの技法が必要となる。さらに、挿入遺伝子の方
向のコントロールができないため、組み換えプラスミド
を得た後、目的の方向性を持ったプラスミドを得るのに
すクリーニングする必要がある。このような現象は、同
じ認識部位の制限酵素を用いる限り、当然、認識塩基数
に限らず起こることである。
メラーゼのクレノーフラグメント等を用いて末端修飾し
て、できたプラスミド上に元の制限酵素切断部位をなく
す方法が知られている。しかし、もとの制限酵素切断部
位がなくなるため、再度同じ部位に遺伝子を挿入するこ
とができなくなる。また、末端が平滑になるため、遺伝
子の挿入される方向が2通りとなる点も変わらない。挿
入方向が2通りあるということは、組み込む遺伝子の読
みの方向が正方向に連結されたプラスミドと、逆方向に
連結されたプラスミドとが得られる可能性を示すもので
あり、操作上、望ましくない。もちろん、制限酵素を別
のものにすれば、別の箇所に病原体由来の遺伝子を複数
挿入することは可能であるが、プラスミドが本来有する
制限酵素切断部位を考慮する必要があり、遺伝子の挿入
間隔やプロモーターの利用など、厳密な設計が必要な多
価組み換え体の構築には不向きである。このように、多
価組み換え体を得るための多価プラスミド(ひとつのプ
ラスミドに複数の遺伝子を連続して導入されたプラスミ
ド)は、挿入箇所や挿入された遺伝子の方向などの設計
が必要なため、その構築操作においてきわめて煩雑で、
かつ複雑な問題があった。
従来技術のなかで一般に困難である上記の操作上の問題
点を解決すべく鋭意検討を加えた結果、特異な制限酵素
切断部位を導入した2つのプラスミド(プラスミド対)
を利用すると、簡便に多数の遺伝子をプラスミド上の一
ヶ所に導入でき、さらに導入する遺伝子の方向も任意に
決定することができることを見いだし本発明を完成する
に至った。
制限酵素SfiI認識部位を有するプラスミド(以下、
アクセプタープラスミドということがある)のSfiI
認識部位に、一端は制限酵素SfiIによる切断面であ
り、もう一端は制限酵素SfiI以外の制限酵素Xによ
る切断面であるDNA断片(以下、挿入DNA断片とい
うことがある)が、挿入されることにより得られるただ
1つの制限酵素SfiI認識部位を有する組み換えプラ
スミドが提供され、SfiI以外の制限酵素XがBgl
I、AlwNI、DraIII、PflMI、Bsl
I、およびMwoIのいずれかひとつが好ましい実施態
様である。第二に本発明の組み換えプラスミドに、さら
に制限酵素SfiIによる切断面であり、もう一端は制
限酵素SfiI以外の制限酵素Xによる切断面であるD
NA断片をひとつ以上挿入して得られる多価組み換えプ
ラスミドが提供される。第三に、1つの制限酵素Sfi
I認識部位を有するプラスミドのSfiI認識部位に、
一端は制限酵素SfiI切断面であり、もう一端は制限
酵素SfiI以外の制限酵素X切断面であるDNA断片
を挿入することを特徴とする組み換えプラスミドの作製
方法が提供され、ここで得られた組み換えプラスミドは
アクセプタープラスミドとなりうるため、再び挿入DN
A断片をこのプラスミドに組み込み、多価組み換えプラ
スミドが得られる。もちろん、再び挿入DNA断片をア
クセプタープラスミドに組み込む操作は、繰り返しでき
るので、2以上の多数の外来DNAを挿入DNA断片と
して組み込むことができる。よって、本発明において提
供される組み換えプラスミドの作製方法は、多価組み換
えプラスミドの精製方法として有用である。さらに第四
に、本発明の多価組み換えプラスミドによって形質転換
した形質転換体と本発明の多価組み換えプラスミドを用
いて作製された組み換えウイルスが提供される。
てアクセプタープラスミドは、制限酵素SfiI認識部
位を一ヶ所有するプラスミドである。ここでいう制限酵
素SfiI認識部位とは、5’−GGCCN1N2N3N4
N5GGCC−3’(N1〜N5は、それぞれ独立にA、
C、G、Tいずれの塩基でも良い)という塩基配列であ
り、制限酵素SfiIはこの配列を認識し、その中央の
3塩基(N2N3N4)が3’末端側に突出した形でDN
Aを切断する。もちろん、制限酵素SfiI以外の制限
酵素、例えばHindIII、EcoRI、HincI
I、BamHIなどの一般的なプラスミドのマルチクロ
ーニングサイト中に多く含まれる制限酵素によって認識
される部位を、本発明で言うアクセプタープラスミドが
有していても良い。このようなプラスミドは、任意に作
製することができる。
セプタープラスミドに挿入するDNA断片は、その両端
がアクセプタープラスミドの制限酵素SfiIによって
与えられる切断面(即ち、前記SfiI認識配列のN2
N3N4が3’側に突出した断面と、N2cN3cN4cが3’
側に突出した断面)と連結できるように、一端はN2N3
N4が3’側に突出した断面であり、もう一端はN2cN
3cN4cが3’側に突出した断面を有するものである。さ
らにこの断面のうち一端のみが制限酵素SfiI切断面
と同じであり、もう一端は制限酵素SfiI切断面であ
ってはならず、制限酵素SfiI以外の制限酵素Xの切
断面である。本発明において、制限酵素Xは、その断面
がアクセプタープラスミドのSfiI切断面と連結する
必要があることから、SfiIと同じの方向に3塩基が
突出する切断面を与える制限酵素であればよい。組み換
え体構築の設計の便利さや認識部位の特異性などを考え
ると、制限酵素BglI、AlwNI、DraIII、
PflMI、BslI、MwoI、これらのisosc
hizomerなどが制限酵素Xとして好ましく、なか
でも制限酵素SfiI切断部位をも切断可能な制限酵素
BglIが最も好ましい。これらの制限酵素は、中央の
塩基が任意に設定できるものである。
読みの方向などは任意に選択することができる。また、
挿入DNA断片中には、抗原遺伝子やマーカー遺伝子な
ど発現させる目的の遺伝子(以下、目的遺伝子というこ
とがある)が含まれているが、このほか転写制御因子、
シグナル配列などのレギュレーター遺伝子も連結したハ
イブリッドDNAが一般的な組み換え技術では用いられ
る。このようなハイブリッドDNAを作製するため、プ
ラスミドなどのベクターを用いることがある。本発明に
おいては、このようなベクターをドナーと言うことがあ
る。ドナーとなるベクターは、通常マルチプルクローニ
ングサイトを有するプラスミドを用いる。
限酵素X切断部位]−[目的遺伝子等]−[制限酵素S
fiI切断部位]の順に連結されたものであり、ドナー
を用いて挿入DNA断片を得る場合の構造は、[制限酵
素X切断部位]−[クローニングサイト(目的遺伝子等
が挿入されている)]−[制限酵素SfiI切断部位]
の順に連結されたものである。目的遺伝子はドナー由来
のクローニングサイト中に挿入されるのが一般的であ
る。ここで挿入されてる各種遺伝子の由来は、ほ乳類、
鳥類、魚類、昆虫などの脊椎または無脊椎動物はもとよ
り、植物、原生生物、ウイルスなどいかなるものであっ
てもよい。
は、上述してきたアクセプタープラスミドと挿入DNA
断片とを用いて組み換え体(組み換えプラスミド)を構
築することができる。先にも触れたとおり本発明の組み
換え体は、また、アクセプタープラスミドとしても機能
するため、同じ操作を繰り返すことにより多価組み換え
体(多価組み換えプラスミド)を得ることができる。
次の方法が挙げられる。常法によりドナーとなるプラス
ミドを構築した後、制限酵素XおよびSfiIで切断し
て挿入DNA断片(遺伝子カートリッジ)を得て、これ
をアクセプタープラスミドのSfiI切断部位に挿入す
る。前記SfiI認識配列のN2N3N4は回文配列では
ないので挿入される遺伝子の方向は一義的に決まる。制
限酵素X切断部位が導入しようとする任意の遺伝子内部
にも存在する場合には、ドナーをSfiIで完全分解
後、制限酵素Xで部分分解すればよい。制限酵素Xの中
ではBglIを用いた場合、SfiI部位は自動的にB
glIでも切断されるため、単にBglIで切断するだ
けで遺伝子カートリッジを調製することができる。この
ようにして簡便に任意の遺伝子を単一方向にアクセプタ
ープラスミドのSfiIサイトに導入することができ
る。SfiIは8塩基認識であることから、全く同じ塩
基配列のSfiIサイトが生じる確率は殆どないと言え
るため、ここでできたプラスミドは挿入した任意の遺伝
子中にSfiI切断部位がない限りただひとつのSfi
I切断部位を持つことになる。
アクセプタープラスミドとして利用できる。即ち、得ら
れた組み換え体を制限酵素SfiIで分解し、別に作製
したドナーから新たな挿入DNA断片(遺伝子カートリ
ッジ)を同様の方法で切り出し、再び連結させる操作を
繰り返すことにより、複数の遺伝子(同一の遺伝子でも
良い)を連続してかつ簡便に任意の方向に導入すること
ができる。
法により得られた本発明の(多価)組み換え体は、常法
により大腸菌、枯草菌、セラチア菌、サルモネラ菌、放
線菌などの原核微生物を始め、糸状菌(カビ)、酵母な
どの真核微生物、鶏胚線繊芽細胞、ヒト骨髄細胞などの
高等真核細胞などの宿主細胞に移入して形質転換体を得
ることができる。
の(多価)組み換え体を用いて常法に従って構築するこ
とができる。もちろん用いるウイルスは、使用目的によ
り任意に選択することができ、例えばワクチニアウイル
スなどに代表されるオルソポックスウイルス;フォウル
ポックスウイルスなどに代表されるアビポックスウイル
スなどのポックスウイルス;単純ヘルペスウイルス、シ
ュードレービスウイルス、七面鳥ヘルペスウイルスなど
のヘルペスウイルス;ヒトアデノウイルス2型、ヒトア
デノウイルス5型などのアデノウイルス;などが例示さ
れる。
ンとして有用であり、本発明の方法によれば、この多価
ワクチンの原料となる組み換え体、組み換えウイルス、
形質転換体を簡便に得ることができる。
本発明はこれに限定されるものではない。
sおよびpGTP7.5の構築(図1参照) pUC18のHindIII−PstI部位に合成DN
A(5’−AGCTGCCCCCCCGGCAAGCT
TGCA−3’(配列番号1))を挿入し、次いで得ら
れたプラスミドのSalI−KpnI部位に合成DNA
(5’−TCGACATTTTTATGTAC−3’
(配列番号2))を挿入し、さらに、ここで得られたプ
ラスミドのSacI−EcoRI部位に2本の合成DN
A(5’−AATTCGGCCGGGGGGGCCAG
CT−3’(配列番号3))および(5’−GGCCC
CCCCGGCCG−3’(配列番号4))をアニール
させたものを挿入し、最後にこのプラスミドのHind
III−SalI部位にプラスミドpNZ1729R
(Yanagida et al.,J.Viro
l.、66、1402−1408、1992)をHin
dIIIとSalIで消化して得られた約140bpの
DNA断片を挿入して、プラスミドpGTPsを構築し
た。
I−PstI部位に合成DNA(5’−AGCTGCC
CCCCCGGCAAGCTTGCA−3’(配列番号
1))を挿入し、次いでここで得られたプラスミドのS
alI−KpnI部位に合成DNA(5’−TCGAC
ATTTTTATGTAC−3’(配列番号2))を挿
入し、さらにここで得られたプラスミドのSacI−E
coRI部位に2本の合成DNA(5’−AATTCG
GCCGGGGGGGCCAGCT−3’(配列番号
3)および5’−GGCCCCCCCGGCCG−3’
(配列番号4))をアニールさせたものを挿入し、最後
にこのプラスミドのHindIII−SalI部位にプ
ラスミドpNZ1037(Ogawa et al.,
Vaccine、8、486−490、1990)をH
indIIIとSalIで消化して得られた約270b
pのDNA断片を挿入して、プラスミドpGTP7.5
を構築した。
glI認識部位]−[ポックスウイルス合成プロモータ
ーPs]−[異種遺伝子導入のためのマルチプルクロー
ニングサイト]−[ポックスウイルス初期転写終結シグ
ナル]−[制限酵素SfiI認識部位]の順に連結され
た構造を有し、プラスミドpGTP7.5は、[制限酵
素BglI認識部位]−[ワクチニアウイルス7.5プ
ロモーター]−[異種遺伝子導入のためのマルチプルク
ローニングサイト]−[ポックスウイルス初期転写終結
シグナル]−[制限酵素SfiI認識部位]の順に連結
された構造を有している。これらのプラスミドのマルチ
プルクローニングサイトに挿入したい抗原遺伝子を挿入
し、BglIで切断することで簡単に挿入DNA断片
(遺伝子カートリッジ)が作製できる。
NZ1829Rの構築(図2参照) プラスミドpNZ1729R(Yanagida et
al.、J.Virol.、66、1402−140
8、1992)をEcoRIとSacIで消化し、この
部位に配列番号3と配列番号4に記載の2種類の合成D
NA(5’−AATTCGGCCGGGGGGGCCA
GCT−3’(配列番号3)および5’−GGCCCC
CCCGGCCG−3’(配列番号4))をアニーリン
グしたSfiI部位を含む合成アダプターを挿入し、プ
ラスミドpNZ1829Rを構築した。
NZ6929Sfiの構築(図3参照) プラスミドpNZ98(特開平3−27284号公報記
載のニューカッスル病ウイルス由来のF抗原遺伝子を有
するプラスミド)をSacIで部分消化後、さらにBa
mHIで部分消化し、約1.9kbpのDNA断片を回
収した。一方、プラスミドpNZ1829RをBamH
Iで消化後、さらにSacIで部分消化し、前述の約
1.9kbpのBamHI−SacIDNA断片を挿入
して目的のプラスミドpNZ5929を構築した。プラ
スミドpNZ87(特開昭63−239239号公報記
載のニューカッスル病ウイルス由来のHN抗原遺伝子を
有するプラスミド)をHindIIIで切断後AvaI
Iで部分消化して得た最も大きな断片と、プラスミドp
NZ1829RをHindIII、BamHIで消化し
て得た95bpの断片に、配列番号5と配列番号6に記
載の2種類の合成DNA(5’−GATCCAGCAT
G−3’(配列番号5)および5’−GTCCATGC
TG−3’(配列番号6))をアニールしたものを加え
てプラスミドpNZ2929Rを構築した。このプラス
ミドpNZ2929RをHindIIIで切断後Bam
HIで部分消化し、約1.9kbの断片を得る。この断
片をDNAポリメラーゼのクレノウフラグメントを用い
て平滑末端とした後、SmaIで消化したプラスミドp
NZ5929に挿入してアクセプタープラスミドpNZ
6929Sfiを得た。
V)gE,およびgI遺伝子のクローニング MDVのGA株が感染した鶏繊維芽細胞(CEF;chic
ken embrionic fibroblast)細胞をトリプシン処理でシ
ャーレより回収し、PBSで2回その細胞を洗った後、
プロテナーゼKバッファー(10mM トリス塩酸(p
H7.8)、5mM EDTA、0.5% SDS)で
縣濁し、ProteinaseK(Boehringe
r Mannheim社)を50μg/mlの濃度にな
るように加えた。55℃で2時間放置した後、フェノー
ル/クロロホルムで2回、タンパク質の除去を行い、2
倍量のエタノールを加えて−20℃で20分間放置した
後、遠心し、MDVのGA株のゲノムDNAを得た。
ノムDNAからクローニングするためにVelicer
らが発表したMDVのGA株のユニークショート領域の
塩基配列(米国特許5,252,716号)をもとに2
種のDNAプライマー(5’−CGGGAGATCTG
CGATGTATGTACTACAATTA−3’(配
列番号7)および5’−GGATCCCGCATCGA
CAATAAATT−3’ (配列番号8))を使用し
た。これらのプライマーを用いて先に得たMDVのGA
株ゲノムDNAを鋳型とするポリメラーゼ・チェーン・
リアクション(以下、PCRという)により、gI遺伝
子の全長及びgE遺伝子の一部を有するDNA断片の増
幅を行った。反応組成はMDVゲノムDNA20pgを
含む水溶液64.5μlに8μlの10倍濃縮PCR反
応バッファー(200mM トリス塩酸(pH8.
4)、500mM KCl、25mM MgCl2)、
4μlの2.5mMのdNTPs、0.5μlの5U/
μl タックポリメラーゼ及び1μlずつ20μMの各
プライマーを加えた。反応条件は、変性95℃1分間、
アニール55℃2分間、ポリメラーゼ反応72℃2分
間、30サイクルをパーキンエルマーシータス社製のサ
ーマルサイクラー480で行った。その結果、gI遺伝
子の全長とgE遺伝子の5’側の一部の塩基配列を含む
約1.5kbpのDNA断片を得た。
後、0.8%アガロースゲルで電気泳動を行い、ゲル中
のDNA断片をナイロンメンブレンにトランスファー
し、前述のPCR産物をプローブとしたサザンハイブリ
ダイゼーションを行った。その結果、gI遺伝子を含む
約1.1kbpのBamHI−KpnIDNA断片とg
E遺伝子を含む約6.0kbpのBglII−Hind
IIIDNA断片がハイブリダイズしていることを確認
した。これらのDNA断片は、pUC18のBamHI
−KpnI部位とBamHI−HindIII部位にク
ローニングし、それぞれpUC−gI−1とpUC−g
E−1を得た。pUC−gE−1にクローニングした約
6.0kbpのBglII−HindIIIDNA断片
を各種制限酵素で切断して、制限酵素地図を作製した。
これを利用して、gE遺伝子を含む約2.2kbpのK
pnI−HpaIDNA断片をpUC18のKpnI−
HincII部位にサブクローニングし、pUC−gE
−2を得た。サンガーのダイデオキシチェーンターミネ
ーション法(Sanger et al.、Proc.
Natl.Acad.Soc.USA、74、5463
−5467、1977)によって、pUC−gE−2の
一連の欠失変異体の配列を調べることにより、gE遺伝
子がこのプラスミドに挿入されていることを確認した。
MDgB、pGTPsMDgE、およびpGTP7.5
MDgIの構築(図4、5参照) プラスミドpNZ29RMDgB(Yanagida
et al.、J.Virol.、66、1402−1
408、1992)をSalIで消化後、BamHIで
部分消化して得た約2.9kbの断片をプラスミドpG
TPsをSalI,BamHI部位に挿入してpGTP
sMDgBを得た。実施例4で得たpUC−gE−1を
鋳型とし、配列番号9と10に示すプライマーを利用し
てPCRを行った。反応組成及び条件は、実施例4と同
様とした。得られたPCR産物をBglIIとSalI
で消化後、約1.5kbpのDNA断片を回収し、プラ
スミドpUC18のHindIII部位とPstI部位
の間にBglII部位を作るための合成DNA(5’−
AGCTAGATCTTGCA−3’(配列番号1
1))を組み込んで調製したプラスミドpUC18−X
GのBglII−SalI部位に挿入し、プラスミドp
UC−gE−PCRを構築した。挿入したDNA断片の
塩基配列を確認したが、PCR中に如何なる変異も見ら
れなかった。このプラスミドpUC18−gE−PCR
をBglIIとSalIで消化後、約1.5kbpのD
NA断片を回収し、pGTPsのBamHI−SalI
部位に挿入し、プラスミドpGTPs−gEを構築し
た。
製用プラスミドpNZ29RNDFHN−MDgB、p
NZ29RNDFHN−MDgBgE、およびpNZ2
9RNDFHN−MDgBgEgIの構築(図6参照) ドナープラスミドpGTPsMDgBをBglIで消化
して得た約3.0kbの断片を、アクセプタープラスミ
ドpNZ6929SfiのSfiI部位に挿入してプラ
スミドpNZ29RNDFHN−MDgBを得た。十分
量の挿入断片を使用することで末端フォスファターゼ処
理などをせずに高い組み込み効率を達成した。具体的に
はランダムに24個の形質転換体のプラスミドを調べ、
12個が挿入断片なし、6個がひとつの挿入があったも
の、残りの6つはMDgBが2つタンデムに挿入された
ものであった。
DFHN−MDgBを再びアクセプタープラスミドとし
て使用して次の遺伝子の挿入を試みた。ドナープラスミ
ドpGTPsMDgEをBglIで消化し、生じた約
1.7kbの断片をpNZ29RNDFHN−MDgB
のSfiI部位に挿入し、pNZ29RNDFHN−M
DgBgEを得た。全く同様にしてドナープラスミドp
GTP7.5MDgIをBglIで消化後、約1.4k
bpのDNA断片を回収した。このDNA断片を先に得
たpNZ29RNDFHN−MDgBgEのSfiI部
位に挿入し、プラスミドpNZ29RNDFHN−MD
gBgEgIを構築した。
製と純化 モノレイヤーになったCEFに鶏痘ウイルスのワクチン
から単離した大型プラーク形成を表現型としてもつウイ
ルス(Nazerian et al.、Avian
Dis.、33、458−465、1989)を0.1
の感染多重度で感染した。3時間後、これらの細胞をト
リプシン処理で剥がし、細胞縣濁液とした。この縣濁液
からの2×107個の細胞と10μgの組み換え鶏痘ウ
イルス作製用プラスミドpNZ29RNDFHN−MD
gB(実施例6)を混合した。この細胞と組み換え用プ
ラスミドの混合物をSaline G(0.14M N
aCl、0.5mM KCl、1.1mM Na2HP
O4、0.5mM MgCl2・6H2O、0.011%
グルコース)に懸濁し、室温において、ジーンパルサ
ー(Bio−Rad社)3.0KV/cm、0.4ms
ec条件下でエレクトロポレーションした。プラスミド
を導入した細胞を、その後37℃で72時間培養し、3
回の凍結融解によって細胞を溶解した。放出した組み換
えウイルスは次のように選別された。
れるが、その溶解液の10倍段階希釈液をCEFに感染
させ、生育培地を含んだ10mlの寒天溶液を重層し
た。室温中で寒天を固めた後、典型的な鶏痘ウイルスの
プラークが出現するまで37℃で培養した。さらにBl
uo−galを600μg/ml含んだ別の寒天10m
lをそれぞれの培養プレートに重層し、さらに24時間
37℃で培養した。すべての子孫ウイルスに対し、およ
そ1%の比率で青色プラークが出現した。これらの青色
プラークを単離し含まれているウイルスを回収し、形成
する全てのプラークがBluo−galで青く染まるま
で、同じ方法でさらに組み換えウイルスの純化を行っ
た。通常この過程は3〜4回で終了する。この純化され
たウイルスを、fNZ29RNDFHN−MDgBと名
付けた。このfNZ29RNDFHN−MDgBを、サ
ザンハイブリダイゼーション法により解析し、それぞれ
の遺伝子が予想通りの位置にあることを確認した。実施
例6で示した組み換え鶏痘ウイルス作製用プラスミドp
NZ6929Sfi、pNZ29RNDFHN−MDg
BgE、pNZ29RNDFHN−MDgBgEgIに
ついても、上記と同様の方法で鶏痘ウイルス感染細胞に
導入し、得られた組み換えウイルスを、それぞれfNZ
6929Sfi、fNZ29RNDFHN−MDgBg
E、NZ29RNDFHN−MDgBgEgIと名付け
た。
た鶏の抗NDV抗体価および抗MDV抗体価 表1に示す組み換え鶏痘ウイルス104PFUを、穿刺
用針で7日齢SPF鶏の右側翼膜に接種した。接種3週
後に血清を採取し、ニューキャッスル病の赤血球凝集抑
制(以下、HIという)に代用される抗NDV抗体価お
よび抗MDV抗体価を測定した。抗NDV抗体価の基礎
となるニューキャッスル病のHI反応は、被検血清の2
倍段階希釈液25μlに、4赤血球凝集単位を含むND
V抗原を等量加えて混和し10分間静置感作後、0.5
%鶏赤血球液50μlを加えて室温に45分置き、赤血
球凝集を観察した。HI価は血球凝集抑制が認められた
血清の最高希釈倍率で表現した(表中ではHI価)。
た。MDVのgB遺伝子を制限酵素EcoRVとBam
HIで消化して得られた断片をpATH−11のSma
I−BamHI断片に挿入し、MDVのgB遺伝子抗原
タンパク質の一部のポリペプチド(353アミノ酸分)
を発現させた。このポリペプチド75μlに10%SD
Sを750μl、水6.675mlを加え、10分間沸
騰させる。これに0.1M重炭酸緩衝液(pH9.6)
を292.5ml加え、100μl/ウエルづつNun
c社製の96穴U底プレートMaxi−sorbに分注
し、4℃で一夜おいて、MDVのgB抗原プレートとし
た。このプレートを2倍に希釈したBlock Ace
(大日本製薬社製)で4℃で一夜おいてブロッキング
し、このそれぞれのWellに被検血清を10倍希釈の
Block Aceにて2倍段階希釈をした液を37℃
にて1時間反応させる。0.05%Tween20を含
有したPBS(以下、PBS−Tという)で3度洗浄
し、2000倍希釈のBethyl社HRP結合ウサギ
抗鶏IgG(H+L)を37℃、1時間反応させた。P
BS−Tで3度洗浄した後、PBSで1度洗浄し、住友
ベークライト社の発色液(ABTS)にて反色させた。
30分間暗所にて反応させた後、Bio−Rad社Mo
del3550にて490nmの吸光度を対照として4
15nmの吸光度を測定し、その値をMDV抗体価とし
た。
スル病ウイルスのFおよびHN遺伝子に加えマレック病
のgB遺伝子を持つ組み換え鶏痘ウイルスfNZ29R
NDFHN−MDgBを接種した鶏血清中にはそれぞれ
単独の組み換え鶏痘ウイルスfNZ6929Sfi(ニ
ューキャッスル病ウイルスのFおよびHN遺伝子を発
現)あるいはfNZ29RMDgB−S(マレック病の
gB遺伝子を発現;特開平6−78764号公報、欧州
特許公開公報第520753号の実施例にて作製された
組み換えウイルスである。)を免疫したのと同等の免疫
応答が得られた。
た鶏の強毒NDVに対する感染防御効果 組み換え鶏痘ウイルスは、穿刺用針で104PFUを7
日齢のSPF鶏の右側翼膜に接種した。接種後4週に1
04PFUの強毒NDV佐藤株をモモの筋肉中に接種し
た。その後、2週間ニューキャッスル病による死亡を記
録した。この結果は、表2に示す。ワクチン未接種、非
組み換え鶏痘ウイルス接種群の鶏は、強毒NDVの攻撃
試験に対し、すべてニューカッスル病で死亡したが、ニ
ューカッスル病のFおよびHN両遺伝子を含むfNZ2
9RNDFHN−MDgBおよびfNZ6929Sfi
はともに完全な防御を示した。このように複数の抗原遺
伝子を本発明の方法で組み込むことにより多価組み換え
ウイルスワクチンを簡便に作ることができる。
7.5の構築法を説明した図面である。
築法を説明した図面である。
の構築法を説明した図面である。
を説明した図面である。
GTP7.5MDgIの構築法を説明した図面である。
NZ29RNDFHN−MDgB、pNZ29RNDF
HN−MDgBgE、およびpNZ29RNDFHN−
MDgBgEgIの構築法を説明した図面である。
Claims (6)
- 【請求項1】 1つの制限酵素SfiI認識部位を有す
るプラスミドのSfiI認識部位に、一端は制限酵素S
fiIによる切断面であり、もう一端は制限酵素Sfi
I以外の制限酵素Xによる切断面であるDNA断片が、
挿入されることにより得られるただ1つの制限酵素Sf
iI認識部位を有する組み換えプラスミド。 - 【請求項2】 SfiI以外の制限酵素XがBglI、
AlwNI、DraIII、PflMI、BslI、お
よびMwoIのいずれかひとつである請求項1記載の組
み換えプラスミド。 - 【請求項3】 請求項1または2記載の組み換えプラス
ミドに、さらに一端は制限酵素SfiIによる切断面で
あり、もう一端は制限酵素SfiI以外の制限酵素Xに
よる切断面であるDNA断片をひとつ以上挿入して得ら
れる多価組み換えプラスミド。 - 【請求項4】 1つの制限酵素SfiI認識部位を有す
るプラスミドのSfiI認識部位に、一端は制限酵素S
fiI切断面であり、もう一端は制限酵素SfiI以外
の制限酵素X切断面であるDNA断片を挿入することを
特徴とする組み換えプラスミドの作製方法。 - 【請求項5】 請求項3記載の多価組み換えプラスミド
によって形質転換した形質転換体。 - 【請求項6】 請求項3記載の多価組み換えプラスミド
を用いて作製された組み換えウイルス。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP13108596A JP3458880B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP12952395 | 1995-04-28 | ||
JP7-129523 | 1995-04-28 | ||
JP13108596A JP3458880B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH099979A JPH099979A (ja) | 1997-01-14 |
JP3458880B2 true JP3458880B2 (ja) | 2003-10-20 |
Family
ID=26464879
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP13108596A Expired - Lifetime JP3458880B2 (ja) | 1995-04-28 | 1996-04-26 | 組み換え体、多価組み換え体、及びその作製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3458880B2 (ja) |
-
1996
- 1996-04-26 JP JP13108596A patent/JP3458880B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Gene,Vol.57,No.2−3(1987),p.193−201 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH099979A (ja) | 1997-01-14 |
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