WO2005042737A1 - 遺伝子導入された樹状細胞の製造方法 - Google Patents

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Yoshikazu Yonemitsu
Katsuo Sueishi
Satoko Shibata
Mamoru Hasegawa
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    • C12N2760/18843—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the present invention relates to a method for introducing a gene into dendritic cells.
  • the method of the present invention can be used for the production of vaccines against cancer and infectious diseases.
  • DCs Dendritic cells
  • APCs antigen-presenting cells
  • Dendritic cells have strong antigen-presenting ability and express antigen peptides in class I and class II on dendritic cells, and activate CD4 and CD8 T cells, respectively. This induces an in vivo immune response to specific antigens (eg, antigens of pathogenic microorganisms, tumor-associated antigens, and transplanted antigens).
  • interleukin Gene Therapy 2000; 7,2113-2121
  • interleukin ID-12 gene
  • antigen-specific T cells by introducing Fas ligand gene.
  • tumor immunotherapy it is possible to induce immunity against tumors by introducing tumor antigens into dendritic cells. Can be expected.
  • Non-Patent Document 1 Steinman, R.M., 1991, Ann. Rev. Immunol. 9: 271
  • Non-Patent Document 2 Banchereau, JB and RM Steinman, 1998, Nature 392: 245
  • Non-patent document 3 Akiyama, Y. et al, 2000, Gene Therapy, 7: 2113-2121
  • Non-patent document 4 Min, WP, 2000, J. Immunol, 164: 161-167
  • Non-Patent Document 5 Hsu, F.J. et al "1996, Nat. Med. 2, 52-58
  • Non-Patent Document 6 Nestle, F.O., et al "1998, Nat. Med. 4, 328-332
  • Non-Patent Document 7 Camporeale, A., et al., 2003, Cancer.Res. 63, 3688-3694
  • Non-Patent Document 8 Bon, L.A., et al., 2003, Nat. Immunol. 4, 1009-1015
  • Non-Patent Document 9 Xia, D.J., et al., 2002, Gene therapy, 9, 592-601
  • Non-patent document 10 Mullins, D.W. et al "2003, J. Exp.Med. 198, 1023-1034
  • Non-patent document 11 Okada, T. et al” 2003, Gene therapy 10, 1891-1902
  • Non-Patent Document 12 Nakahara, S. et al., 2003, Cancer Res. 63, 4112-4118
  • Non-patent document 13 Teitz-Tennenbaum, S. et al "2003, Cancer Res. 63, 8466-8475
  • Non-patent document 14 Imboden, M. et al., 2001, Cancer Res. 61, 1500-1507
  • Non-patent document 15 Goldszmid, R.S. et al., 2003, J. Immunol. 171, 5940-5947
  • Non-patent document 16 Strome, S.E. et al "2002, Cancer Res. 62, 1884-1889
  • the present invention provides a method for introducing a gene into a dendritic cell.
  • the present invention also provides a method for producing a dendritic cell into which a gene has been introduced.
  • the present invention also provides the use of dendritic cells transfected by the method of the present invention.
  • the present invention also provides a dendritic cell into which a gene has been introduced by the method of the present invention.
  • the present invention provides a viral vector for gene transfer into dendritic cells.
  • the present invention also provides a method for activating dendritic cells.
  • a minus-strand RNA virus vector is a very excellent vector for gene transfer into dendritic cells.
  • the gene transfer efficiency was as simple as contacting the minus-strand RNA virus vector with the dendritic cells for a short time, and the expression was detectable over a long period of time.
  • Gene transfer into dendritic cells is expected to be applied to various immunotherapies, but gene transfer techniques into dendritic cells have been cumbersome and transfer efficiency has been insufficient until now.
  • a foreign gene can be introduced into dendritic cells by a very simple procedure using a minus-strand RNA virus vector.
  • the present invention relates to a method for introducing a gene into dendritic cells and the like, and more specifically, to the invention described in each claim. It is to be noted that one or more combinations of the inventions recited in the claims reciting the same claim are already intended for expression in the claims. That is, the present invention
  • a method for producing a dendritic cell into which a gene has been introduced comprising a step of contacting the dendritic cell or its precursor cells with a minus-strand RNA virus vector,
  • the contacting step is a step of contacting the immature ⁇ cells with the minus-strand RNA virus vector
  • the contacting step is a step of contacting the CD34 + cell with a minus-strand RNA virus vector
  • minus-strand RNA virus vector is a paramyxovirus vector
  • (13) a method for suppressing tumor growth, comprising the step of administering the dendritic cells according to (11) or (12) to a tumor site,
  • dendritic cells have high immunity-inducing ability, by introducing a desired antigen gene or immunoreactive gene into dendritic cells by the method of the present invention, they can be used for immunotherapy of cancer and infectious diseases. It is possible to produce a useful dendritic cell (DC) vaccine.
  • DC dendritic cell
  • a method of mixing tumor cell lysate (cell lysate) to present tumor antigens to tumor cells, peptide pulsing, and tumor antigen gene Can be used.
  • the method of transducing tumor antigens into dendritic cells can be expected to extend the presentation time of tumor antigens in vivo more than tumor lysate and peptide pulse, and further restricts HLA (in the case of peptides; However, due to the binding to HLA, if the type of HLA changes, the site of the peptide used in the antigen will change).
  • the retroviral vector ii) can be introduced only into cells in the growth phase.
  • Ma transfection co-factors such as cytotoxic polypropylene are required, and the transfection takes time. For this reason, there is a disadvantage that the viability (survivability) of the cells is easily reduced.
  • a method is generally used in which a vector is introduced into CD34-positive cells, followed by differentiation induction into dendritic cells. At this time, bone marrow cells, umbilical cord blood, and peripheral blood immobilized with G-CSF are required, which is very invasive to patients.
  • retroviral vectors In addition, introduction of a retroviral vector into dendritic cells cannot raise the activity of dendritic cells.
  • retroviral vectors integrate virus nucleic acids into the genome of cells, which may cause genomic damage.
  • the lentivirus vector of iii which generally requires selection of cells into which the vector has been introduced by sorting or the like having a low efficiency of introduction, requires a long time to introduce the vector, similarly to the retrovirus vector. Therefore, the viability of the cells may be reduced.
  • Lentiviruses are known to introduce genes into cells in the stationary phase, but the efficiency of dendritic cells to some extent and loss of proliferative activity depends on postentry restriction (J.
  • the selection efficiency is generally low because the introduction efficiency is low. Requires a high concentration of titer for introduction, making it difficult to apply to clinical applications.
  • auxiliary operations such as centrifugation or auxiliary factors such as polyblen are required, which makes the introduction procedure complicated and requires a long time.
  • adenovirus 0 is expected to be a vector for dendritic cell gene transfer because of its transduction efficiency (about 80%) and direct gene transfer into differentiated dendritic cells. It is time-dependent and requires about 72 hours to obtain maximum transduction efficiency (J. Immnotherapy 2002; 25; 445-454). In addition, a 10-fold to 100-fold titer is required compared to negative-strand RNA viruses. More importantly, MOI that enhances gene transfer efficiency has an immunosuppressive effect that reduces the mixed lymphocyte reaction (MLR) of a T cell (Gene Therapy 2000; 7; 249-254). ) Is a problem (especially at high DC: T ratios). Also, the method of differentiating dendritic cells after gene transfer into stem cells such as CD34-positive cells may be difficult due to dilution of episome.
  • MLR mixed lymphocyte reaction
  • the vector satisfies.
  • the gene transfer does not change the activated state of fibroblasts. Can induce the activation of dendritic cells, so that the step of activation after the introduction can be omitted, such as maintaining the viability of the cells, reducing costs, and further ex vivo operation time. It is thought that this will contribute to the reduction of emissions.
  • dendritic cells transfected with a minus-strand RNA virus vector allows efficient activation of exogenous T cells, especially tumor-specific cytotoxic T cells, necessary for T cell transfer therapy in a short-term ex vivo manner. While it is easy to guide It has been certified. Furthermore, the transfection efficiency in the case where the dendritic cells were differentiated after introducing the gene into the stem cells reached about 70%, which was comparable to that of the lentivirus vector.
  • FIG. 1 is a view showing a phenotype of dendritic cells derived from mononuclear cells of peripheral blood monocyte-enriched cells.
  • the live cells identified by PI are gated, and CDllc and HLA-class II (DR, DP, DP, DQ) using an anti-CD11c-PE binding antibody and an anti-HLA-class II (DR, DP, DQ) FITC-binding antibody. DQ) expression was observed (left matrix).
  • CDllc and HLA-class II select both positive gates for both S, 1) anti-CD14-APC binding antibody, 2) anti-CDla-APC binding antibody, 3) anti-CD80-biotin binding antibody (Stained secondarily with streptavidin-APC) using dot plots with CDllc (right three matrices).
  • “Class” refers to the results using antibodies that recognize all HLA-DR, DQ, and DP
  • “HLA-DR ⁇ refers to results using antibodies that specifically recognize HLA-DR. Represents
  • FIG. 2 is a view showing expression of GFP and costimulatory molecules in DC into which SeV-GFP has been introduced.
  • FIG. 3 is a graph showing the efficiency of introduction of SeV-GFP into human monocyte-derived dendritic cells and the activity of dendritic cells (2 days after infection).
  • FIG. 4 is a graph showing the efficiency of introducing SeV-GFP into human monocyte-derived dendritic cells and the activity of dendritic cells (4 days after infection).
  • FIG. 5 is a graph showing the efficiency of introducing SeV-GFP into human monocyte-derived dendritic cells and the activity of dendritic cells (day 8 after infection).
  • FIG. 6 is a view showing a change in the number of DCs after introduction of SeV-GFP.
  • FIG. 7 is a view showing a GFP expression period after introduction of SeV-GFP.
  • FIG. 8 is a graph showing the effect of LPS stimulation on the efficiency of introducing SeV-GFP into human DC.
  • FIG. 9 is a graph showing the effect of LPS stimulation on the efficiency of introducing SeV-GFP into human DC.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of an examination of incubation time in gene transfer into DC.
  • FIG. 11 is a diagram showing gene transfer into DC derived from cord blood.
  • FIG. 12 is a view showing gene transfer into DC derived from cord blood.
  • FIG. 13 is a view showing the expression of costimulatory molecules after gene transfer (comparison with LPS stimulation).
  • FIG. 14 is a view showing expression of costimulatory molecules after gene transfer (comparison with LPS stimulation).
  • FIG. 15 is a view showing expression of costimulatory molecules after gene transfer (comparison with LPS stimulation).
  • FIG. 16 is a view showing the phagocytic ability after gene transfer.
  • FIG. 17 is a view showing the phagocytic ability after gene transfer.
  • FIG. 18 is a view showing cytoin production of monocyte-derived DC after introduction of a minus-strand RNA virus vector.
  • FIG. 19 is a view showing expression of a marker protein on dendritic cells after introduction of a minus-strand RNA virus vector.
  • FIG. 20 is a view showing expression of a marker protein on dendritic cells after introduction of a minus-strand RNA virus vector.
  • FIG. 21 shows the ability of DCs transfected with SeV-GFP to stimulate T-cells.
  • FIG. 22 is a view showing a result of inducing MART-1-specific CTL in an in vivo mouth by introducing a minus-strand RNA virus vector.
  • FIG. 23 is a view showing a growth curve of B16 melanoma cells inoculated subcutaneously.
  • FIG. 24 is a view showing a result of 51 Cr-releasing assay of YAC-1 target cells.
  • FIG. 25 shows the results of a 51 Cr-releasing assay of TRP2 peptide + EL-4.
  • the present invention provides a method for producing a dendritic cell into which a gene has been introduced using a minus-strand RNA virus vector.
  • This method comprises a step of contacting a minus-strand RNA virus vector carrying a desired gene to be introduced with a dendritic cell or its precursor cells.
  • the present inventors have found that a minus-strand RNA virus vector can introduce a gene into dendritic cells with extremely high efficiency. Moreover, the introduction of the vector activated the dendritic cells and allowed them to differentiate into mature dendritic cells without stimulating with cytoplasm. Obtained Mature dendritic cells retained the ability to activate ⁇ cells.
  • the method of the present invention is useful for presenting desired antigens to dendritic cells, or for expressing desired cytokins or other bioactive factors in dendritic cells.
  • the dendritic cells that have been genetically modified by the method of the present invention have a high ability to activate the immune system, and can be used for infectious diseases, cancers, and other diseases in which a beneficial effect can be expected by immunity induction. It can be suitably used in prevention and treatment.
  • the contact between the vector and the dendritic cells can be performed in vivo or in vitro, for example, in a desired physiological aqueous solution such as a culture solution, physiological saline, blood, plasma, serum, or body fluid.
  • the efficiency of transfection of the minus-strand RNA virus vector is significantly higher when the dendritic cells are in the inactivated state (immature state) than for mature dendritic cells. Therefore, it is preferable that the minus-strand RNA virus vector is brought into contact with immature dendritic cells or mixed with a cell fraction containing immature dendritic cells. Such a method is also included in the method of the present invention for introducing a gene into dendritic cells. Dendritic cells are activated by contact with bacteria or lipopolysaccharide (LPS), double-stranded RNA, and the like.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the capillaries may be introduced after activation, but the introduction efficiency of the vector is not reduced. Therefore, it is preferable to perform the activation operation after introducing the gene with the minus-strand RNA virus vector before the introduction of the vector (or simultaneously with contacting the minus-strand RNA virus vector with the dendritic cells).
  • RNA virus vectors The high efficiency of gene delivery by simple techniques is one of the important advantages of gene delivery to dendritic cells via minus-strand RNA virus vectors.
  • Gene delivery to dendritic cells via retrovirus vectors or the like is inefficient and may require toxic agents such as polypropylene during gene transfer.
  • a minus-strand RNA virus vector superior gene delivery could be achieved by simply adding the vector to a solution containing dendritic cells without requiring a special drug.
  • gene delivery to dendritic cells via minus-strand RNA viral vectors was able to achieve optimal efficiency with very short exposures (less than 30 minutes).
  • the MOI multiple infectivity; the number of infectious viruses per cell
  • the MOI is preferably between 1 and 500, more preferably 2 to 300, and even more preferably 2 to 300. It is preferably 3-200, more preferably 5-100, and even more preferably 7-70.
  • a short time is sufficient for contacting the vector with the filamentous cell, for example, 1 minute or more, preferably 3 minutes or more, 5 minutes or more, 10 minutes or more, or 20 minutes or more. It may be about 60 minutes, or more specifically, about 5 minutes to 30 minutes.
  • the contact may be carried out for a longer time, for example, for several days or more.
  • Contacting can be performed inside or outside the body.
  • the method of the present invention can be suitably used in ex vivo gene transfer in which a filamentous cell or its precursor cell removed from the body is contacted with a minus-strand RNA virus vector outside the body, and the vector is returned to the body after the transfer.
  • One of the features of the method of the present invention is that the expression of the transgene is maintained for a long period of time after the gene is introduced into the dendritic cells.
  • the vector is infected with dendritic cells for 2 days or more, for example, for 3 days or more, 5 days or more, 10 days or more, 14 days or more, 30 days or more, 50 days or more, and more than 60 days or more. Then, the expression of the transgene is detected in the transfected cells.
  • the present invention also relates to a method for selectively introducing a gene into an immature dendritic cell, wherein the negative-strand RNA virus vector carrying the gene is used for immature dendritic cells and mature dendritic cells. And coexisting in a cell population comprising: Selective for immature dendritic cells means that genes are introduced into immature dendritic cells at a significantly higher rate than mature dendritic cells, and at a higher rate. In other words, the percentage of immature dendritic cells into which the vector was introduced in all immature dendritic cells was significantly greater than the percentage of adult dendritic cells into which the vector had been introduced in all mature dendritic cells. high.
  • the present invention provides a method comprising the step of adding a minus-strand RNA virus vector carrying a gene to be introduced into a cell population containing immature and mature dendritic cells. Since a minus-strand RNA virus vector preferentially introduces a gene into an immature dendritic cell as compared to a mature dendritic cell, this method can selectively introduce a gene into an immature dendritic cell. These methods are also included in the method of the present invention for introducing a gene into dendritic cells.
  • Dendritic cells are denatured cells! A cell that has the ability to present and activate T cells.
  • the dendritic cells are separated from a group of cells having a dendritic form derived from bone marrow cells distributed in various tissue organs in vivo and stem cells derived from bone marrow or blood using cytodynamics or the like in vitro. It includes a group of cells equivalent to dendritic cells distributed in tissue organs in a living body subjected to a dani induction.
  • the dendritic cells include, for example, lymphoid dendritic cells (which may induce Th2 induction or immune tolerance), myeloid dendritic cells (generally used dendritic cells).
  • Dendritic cells including immature and mature dendritic cells), Langerhans cells (important dendritic cells in skin antigen presenting cells), interconnected cells (lymphocyte, spleen, T cell area It is thought to work in antigen presentation! / Pull cells), follicular cells (important as antigen-presenting cells to B cells, antigen-antibody complex, antigen-complement complex as antibody Presents antigens to B cells by presenting them on dendritic cells by receptors and complement receptors.), And preferably, highly expresses MHC class I and class II. And more preferably, cells expressing CD1 lc.
  • the dendritic cells have a dendritic morphology and are selected from the group consisting of CDllc, HLA-class II (HLA-DR, -DP, or -DQ), CD40, and CDla. Cells with two or more of the surface markers may be positive. In the present invention, the ⁇ cells are more preferably
  • HLA-class 11+ and CDllc + cells more preferably CDla +, HLA-class II + and CDllc + cells, and T cell markers (CD3), B cell markers (CD19, CD20), NK cell markers (CD56), These cells do not express the neutrophil marker (CD15) or monocyte marker (CD14).
  • the ratio of CD14 + in the dendritic cell population used for introducing the vector is, for example, 10% or less, preferably 5% or less, and more preferably 1% or less.
  • the dendritic cells include mature dendritic cells and immature dendritic cells.
  • Immature dendritic cells refer to dendritic cells with low T cell activation ability.
  • immature dendritic cells have an antigen-presenting ability of less than 1/2, preferably less than those of dendritic cells induced to mature by adding LPS (1 micro-g / ml) and culturing for 2 days. It may be less than 1/4.
  • the antigen-presenting ability may be determined, for example, by the ability to activate T-cells (mixed lymphocyte test; mixed culture of T-cells and dendritic cells; the ratio of T cells to dendritic cells is 1:10, preferably Is a culture obtained by changing the ratio, and 8 hours before the end of the culture, 3 H-thymidine was added to Quantification of T cell proliferative ability based on the amount of vesicles incorporated into DNA: see FIG. 21; Literature Gene Therapy 2000; 7; 249-254), or specific cytotoxic T cells (CTL) using peptides.
  • T-cells mixed lymphocyte test; mixed culture of T-cells and dendritic cells; the ratio of T cells to dendritic cells is 1:10, preferably Is a culture obtained by changing the ratio, and 8 hours before the end of the culture, 3 H-thymidine was added to Quantification of T cell proliferative ability based on the amount of vesicles incorporated into DNA: see FIG
  • IL-2 was obtained at 25 U / ml, preferably 100 U / ml) (preferably stimulated with dendritic cells three times for 21 days, more preferably stimulated twice with dendritic cells for 14 days).
  • Effector cells were used to target 51 Cr-labeled target cells (peptide-restricted Class I-positive tumor cells) to 20: 1, 10: 1, 5: 1, 2.5: 1, preferably 100: 1, 50: 1, 25: 1, 12.5: 1 with those that have been quantified in for 4 hours cocultures 51 Cr liberating amount of the target cells; see FIG. 22; Document Arch Dermatol Res 2000; 292; 325-332 ) by a constant It can be.
  • immature dendritic cells preferably have antigen phagocytic activity, and more preferably have low expression of a receptor that induces costimulation for T cell activation (for example, mature DCs induced by LPS as described above). Some ⁇ are negative).
  • mature dendritic cells refer to dendritic cells that have high antigen-presenting ability for T cell activation and the like. Specifically, mature dendritic cells should have at least half, preferably equal to or more than the antigen-presenting ability of dendritic cells induced to mature by adding LPS (1 micro-g / ml) and culturing for two days. May be a cell having the ability to present antigen.
  • the mature dendritic cells preferably have low or no antigen phagocytic ability, and more preferably have high expression of a receptor that induces a costimulation for T cell activation.
  • Activation of dendritic cells refers to the transition from immature dendritic cells to mature dendritic cells, and activated dendritic cells include mature dendritic cells and activated dendritic cells. Mid-cell dendritic cells that increase the expression of CD80 and CD86 that induce costimulation are included in this category. Among CDllc-positive dendritic cells, CD83-positive is an indicator of mature dendritic cells.
  • the mature dendritic cells may be cells that are strongly positive for the expression of CD40, CD80, CD86 and HLA-class II. More preferably, mature dendritic cells express CD83.
  • immature and mature dendritic cells can be distinguished based on a marker selected from the group consisting of CD80, CD83, and CD86. These markers are weak, or preferably negative, in immature dendritic cells and positive in mature dendritic cells.
  • immature dendritic cells usually maintain high phagocytic activity!
  • LPS 1 micro-g / ml
  • dendritic cells are activated and phagocytic ability is reduced.
  • the phagocytic ability can be determined by measuring the amount of small molecules taken up into the dendritic cells or the ratio of the cells taken up.
  • the phagocytic ability is determined by the amount of the small molecule incorporated into the dendritic cells.
  • the incorporation of beads into dendritic cells can be measured using colored beads of about 1 micro-m. Quantify by subtracting the background that is positive at 4 ° C.
  • High phagocytosis means that the uptake of small molecules into dendritic cells is more than four times that of dendritic cells stimulated with LPS (1 micro-g / ml) for 2 days as described above.
  • the phagocytic ability is more preferably 5 times or more, more preferably 6 times or more.
  • the ratio of the small molecule-incorporating cells is 2 times or more, more preferably 3 times or more.
  • Low phagocytosis means that the uptake of small molecules into dendritic cells is less than 4 times, more preferably less than 2 times, more preferably less than that of dendritic cells stimulated with LPS (1 micro-g / ml) for 2 days. Is less than 1.5 times. Alternatively, it is less than 2-fold, more preferably less than 1.5-fold, as measured by the percentage of cells that take up the small molecule.
  • CDllc is an adhesion glycoprotein (pl50, integrin alpha chain) of about 150 kD. It has been reported that CDllc binds to CD18 to form a CDllc / CD18 complex, has binding ability to fibrinogen, and serves as a receptor for iC3b and ICAM-1. It has also been reported that CDllc / CD18 can act as an adhesion molecule that binds to receptors on stimulated epithelium (Knapp, W.
  • CDla is a polypeptide of about 49 kD and binds to beta 2 microglobulin. CDla is structurally similar to the MHC class I antigen and is considered to function in antigen presentation (Knapp, W. et al., Eas., 1989, Leucocyte Typing IV: White and ell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Scnlossman, S. et al., Eds., 199b, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens.Oxford University Press, New York; Hanau, D. et al., 1990, J. Investigative Dermatol. 95: 503 ; Calabi, F. and A. Bradbury., 1991., Tissue Antigens 37: 1).
  • CD14 is a 53-55 kD glycosylphosphatidylinositol (GPI) -anchored single-chain glycoprotein, which is expressed in reticulum cells and certain Langerhans cells.
  • CD14 was identified as a high affinity surface receptor for the complex of LPS and serum LPS binding protein (LPB) (McMichael, AJ et al., Eds., 1987, Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Knapp, W. et al., Eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al "eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Wright, SD et al "1990, Science 249: 1434) 0
  • CD40 is a 45-48 kD type I integral membrane glycoprotein, and an anti-CD40 antibody is often used as a cell marker (Schlossman, S. et al., Eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Galy, AHM; and H. Spits, 1992, J. Immunol. 149: 775; Clark, EA and JA Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4494; Itoh, H. et al "1991, Cell 66: 233; Barclay, NA et al” 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book., Academic Press).
  • CD80 is a transmembrane glycoprotein of about 60 kD and a member of the Ig supergene family.
  • CD80 is a ligand for CD28 and CD152 (CTLA-4) expressed on T cells (Schlossman, S. et al., Eas., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Schwarts , RH, 1992, Cell 71: 1065; Azuma, M. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 845; Koulova, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 759; Freeman, GJ et al "1998, J. Immunol.
  • CD83 is a transmembrane protein of about 45 kD and is a member of Ig superfamily. CD83 has a short-chain V-type Ig extracellular domain and a C-terminal cytoplasmic tail. CD83 is mainly interdigitating between follicular cells, circulating cells, and lymphoid tissue, and is produced in vitro. Expressed in dendritic cells and thymic dendritic cells (Zhou, LJ., And TF Tedder, 1995, J. Immunol. 154. 3821; Zhou, LJ. Et al., 1992, J. Immunol. 149: 735; Summers KL et al "1995, Clin Exp. Immunol. 100: 81; Weissman, D. et al" 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92: 826; Hart, DNJ, 1997, Blood 90: 3245).
  • CD86 (B70 / B7-2) is a cell surface protein of approximately 75 kD, a second ligand of CD28 and CTLA-4, which plays a key role in T cell costimulation in the early immune response (Azuma M. et al. al "1993, Nature 366: 76; Nozawa Y. et al., 1993, J. Pathology 169: 309; Engle, P. et al. 1994., Blood 84: 1402; Engel, P. et al" CD86 Workshop Report .
  • Azuma M. et al. al "1993, Nature 366: 76; Nozawa Y. et al., 1993, J. Pathology 169: 309; Engle, P. et al. 1994., Blood 84: 1402; Engel, P. et al" CD86 Workshop Report .
  • Azuma M. et al. al "1993, Nature 366: 76; Nozawa Y. et al., 1993
  • CCR7 is a seven-transmembrane G protein-coupled receptor, also called BLR-2, EBI-1, and CMKBR7, and CC chemokines MIP-3beta / Exodus 3 / ELC / CCL19 and
  • HLA-class II includes DR, DP, and DQ, and can be comprehensively detected by an antibody that binds to all of them (Pawelec, G. et al., 1985, Human Immunology 12: 165; Ziegler , A. et al., 1986, Immunobiol. 171: 77).
  • HLA-DR is a transmembrane glycoprotein that is one of the human class II antigens of MHC and also has alpha chain (36 kDa) and beta subunit (27 kDa). It is co-expressed with the CDla antigen in epidermal Langernoun cells. CDla plays a major role in cell interactions in antigen presentation (Barclay, NA et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book. P. 376. Academic Press).
  • dendritic cells can be identified using homologous gene products of the above marker genes as indices.
  • Antibodies to these markers can be obtained from, for example, BD Biosciences (BD PharMingen), and details thereof can be found on the website of the company or a distributor.
  • a positive rate is determined to be 1% or less as a boundary, more than that is positive, and less than that is negative.
  • the dendritic cells or their precursor cells can be prepared according to a known method or in accordance therewith.
  • blood eg, peripheral or umbilical cord blood
  • bone marrow e.g., lymph nodes, other lymphoid organs, spleen, skin, etc.
  • dendritic cells are obtained from blood or bone marrow for use in the present invention.
  • the dendritic cells used in the present invention are, for example, Langer's nonsense cells of skin, veil cells of imported lymphatic vessels, follicular dendritic cells, dendritic cells of spleen, and finger-like cells of lymphoid organs. Is also good.
  • the dendritic cells used in the present invention include CD34 + -derived dendritic cells, bone marrow-derived dendritic cells, monocyte-derived dendritic cells, splenocyte-derived dendritic cells, skin-derived dendritic cells, follicular dendritic cells, And germinal center ⁇ -shaped cells.
  • CD34 + -derived dendritic cells are derived from hematopoietic stem cells or hematopoietic progenitors obtained from cord blood or bone marrow.
  • G-CSF Severe factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating factor
  • TNF tumor necrosis factor
  • IL-4 tumor necrosis factor
  • IL-13 stem self-actor
  • Flt-3 ligand Flt-3 ligand
  • peripheral blood monocytes can be differentiated into immature dendritic cells by GM-CSF and IL-4, and then stimulated with TNF-alpha to be converted into mature dendritic cells. .
  • dendritic cells can be enriched by removing these cells using an antibody specific to T cells, NK cells, B cells, and the like. Specifically, for example, it is preferable to obtain cells in which the expression of a surface marker selected from CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, CD66b or any combination thereof is low or negative. More preferably, all of CD2, CD3, CD8, CD19, CD56, and CD66b are low or negative cells. For this purpose, cells expressing these markers may be removed using antibodies against these markers (Hsu et al. (1996) Nature Med. 2:52). The negative selection can be performed using a multivalent antibody as described in this example, or using beads or the like for magnetic cell separation (MACS).
  • MCS magnetic cell separation
  • cells are adjusted to a large amount, for example, by collecting mononuclear cells using blood cell separation or the like, it is preferable to use beads.
  • cell-shaped cells obtained from a living body are enriched with monocytes, and negative cells are subjected to negative selection to prepare these cells, which can be suitably used in the present invention.
  • the efficiency of vector introduction may decrease.
  • the dendritic cells used in the present invention are not limited to these, but immature dendritic cells.
  • Cell culture prior to contact with the minus-strand RNA virus vector involves the step of selecting cells attached to a solid support (eg, a culture dish or a culture vessel such as a bottle) so as not to reduce the proportion of cells. Preferably not. That is, the present invention provides such a method that does not include a step of selecting cells adhered to a solid support within 24 hours before contact between the minus-strand RNA virus vector and the dendritic cells. More preferably, the method does not include the step of selecting cells attached to the solid support within 2, 3, 5, or 7 days prior to contacting the minus-strand RNA virus vector with the dendritic cells. I'll do it.
  • the method does not include a step of selecting CD14 + cells before contacting the minus-strand RNA virus vector. That is, the present invention provides a method that does not include the step of selecting CD14 + cells within 24 hours before the contact of the minus-strand RNA virus vector with the dendritic cells. More preferably, the method does not include the step of selecting CD14 + cells within 2, 3, 5, or 7 days prior to the implantation of the minus-strand RNA inores vector and the fibrous itoidum. Then,
  • CD34 + cells and mononuclear cells derived from peripheral blood can be obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood May be performed using the method described in Van Tendeloo et al., 1998, Gene Ther. 5: 700-707.
  • dendritic cells or their precursor cells eg, CD1 lc + cells or
  • a minus-strand RNA virus vector with a cell fraction containing CD34 + cells at a high concentration.
  • Progenitor cells are defined as appropriate cytokins (ie, G-CSF, GM-CSF, TNF-alpha, IL-4, IL-13, SCF, Fit-3 ligand, c-kit ligand, or a combination thereof).
  • cytokins ie, G-CSF, GM-CSF, TNF-alpha, IL-4, IL-13, SCF, Fit-3 ligand, c-kit ligand, or a combination thereof.
  • cells preferably within 4 weeks, more preferably within 20 days, more preferably within 18 days, more preferably within 16 days. It is a cell that can be divided into cells.
  • Such cells include CD34 + stem cells.
  • Differentiation into dendritic cells can be performed, for example, by culturing for about 3 days in the presence of SCF (50 ng / ml), GM-CSF (500 U / ml), and TNF-alpha (50 ng / ml).
  • SCF 50 ng / ml
  • GM-CSF 500 U / ml
  • TNF-alpha 50 ng / ml
  • / ml GM-CSF
  • IL-4 250 U / ml
  • TNF-alpha 50 ng / ml
  • the cell fraction is a cell population obtained by separating (or fractionating) cells.
  • the cell fraction may be a composition comprising the cells and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the carrier examples include a desired solution in which living cells can be suspended, such as physiological saline, phosphate buffered saline (PBS), culture solution, and serum.
  • the cell fraction used for contacting the vector may be a percentage of dendritic cells and Z or its precursor in all living cells, for example, 30% or more, preferably 40% or more, preferably 50% or more, It is preferably at least 60%, preferably at least 70%.
  • the immature cells contacted with the minus-strand RNA virus vector include immature i-cells.
  • the cell fraction containing dendritic cells mixed with the vector is the percentage of immature dendritic cells in all living cells, for example, 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 30% or more, and more preferably 40%. It is at least 50%, more preferably at least 60%, more preferably at least 70%.
  • the method of the present invention using a minus-strand RNA virus has various advantages. For example, if a minus-strand RNA virus is used, activated dendritic cells can be obtained only by infection with the vector, and the subsequent step for obtaining mature dendritic cells can be omitted. In order to use dendritic cells for immunostimulation, activation is necessary. There are benefits. Also, by utilizing this property, activated T cells necessary for T cell transfer therapy, particularly cytotoxic T cells, etc., can be efficiently induced in a short period of time in vitro.
  • minus-strand RNA virus vector When a minus-strand RNA virus was introduced, CTLs could not be induced in dendritic cells, and CTLs were induced in vitro only by gene transfer of other vectors due to the properties reported in other vectors. It is difficult. Therefore, the minus-strand RNA virus vector has an advantage that T cells can be activated (CTL induction) only by introducing one vector (see FIG. 22).
  • minus-strand RNA virus vectors are all vectors that combine high transfection efficiency, stability of gene transfer, simplicity, safety, and retention of T cell activation ability of dendritic cells. Are better.
  • the minus-strand RNA virus vector is also useful when the fibrous cells are divided after the gene is introduced into stem cells.
  • the minus-strand RNA virus vector is transduced into stem cells and then induced to differentiate into dendritic cells, the gene transfer efficiency approaches 70%. This is comparable to modified versions of retroviral and lentiviral vectors. Since the expression of adenovirus vector decreases due to dilution of episome after introduction, it is difficult to introduce the gene from stem cells.
  • Negative-strand RNA virus can be applied to both a method of performing dendritic cell differentiation after introduction into stem cells and a method of introducing a gene into dendritic cells differentiated from peripheral blood mononuclear cells.
  • the minus-strand RNA virus vector has a high MOI (for example, 10 or more, preferably 20 or more, more preferably 30 or more, for example, 40 or more, and even 50 or more). It is possible to stably transfect cells with almost 100% transfection efficiency without influence. Furthermore, since a minus-strand RNA virus does not integrate a gene into the host genome, it has the advantage of reducing the risk of tumor development and the like.
  • a minus-strand RNA virus is a virus containing, as a genome, minus-strand (antisense strand to sense strand encoding a viral protein) RNA.
  • Minus strand RNA is also called negative strand RNA.
  • the minus-strand RNA virus used in particular is a single-strand minus-strand RNA virus (non-segmented (
  • Single-stranded negative-strand RNA virus refers to single-stranded negative-strand (ie, negative-strand) RNA in the genome.
  • Such viruses include Paramyxoviridae (including Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbilnvirus, Rubulavirus, and Pneumovirus J3 ⁇ 4), Hubuto Winores (including Rhabdovindae; Vesiculovirus, Lyssavirus, and Epnemerovirus spp.), Filouiroe (Filoviridae) Oronomyxoviridae (including Orthomyxoviridae; Inluluenza virus A, B, C, and Thogoto-like viruses, etc.)
  • Bunyavindae including Bunyavirus, Hantavirus, Nairo virus, and Phlebovirus genus? Includes viruses belonging to families such as Arenaviridae.
  • a minus-strand RNA virus vector is a virus particle having infectivity based on a minus-strand RNA virus, and is a carrier for introducing a gene into cells.
  • the term "infectivity” refers to the ability of a minus-strand RNA virus vector to maintain its ability to adhere to cells and to introduce the gene contained in the vector into the adhered cells.
  • the minus-strand RNA virus vector of the present invention is incorporated into genomic RNA of one vector so that the foreign gene can be expressed.
  • the minus-strand RNA virus vector of the present invention may be a transmissible or non-transmissible defective vector. "Transmissible" means that when a viral vector infects a host cell, the virus is replicated in the cell and infectious virus particles are produced.
  • the recombinant virus refers to a virus produced via a recombinant polynucleotide or an amplification product of the virus.
  • a recombinant polynucleotide is a polynucleotide that is not linked at both or one end in the same manner as in its natural state.
  • a recombinant polynucleotide is a polynucleotide in which the binding of a polynucleotide chain has been modified (cleaved and / or bound) by a human hand.
  • the recombinant polynucleotide can be produced by a known gene recombination method by combining polynucleotide synthesis, nuclease treatment, ligase treatment and the like.
  • a recombinant virus can be produced by expressing a polynucleotide encoding a viral genome constructed by genetic engineering and reconstructing the virus. For example, a method for reconstituting a virus from cDNA encoding a viral genome is known (Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol, 43, 613-624 (1999)).
  • a gene refers to genetic material, and refers to a nucleic acid containing a transcribed sequence in sense or antisense.
  • the gene may be RNA or DNA.
  • a nucleic acid encoding a protein is called a gene of the protein.
  • the gene may not encode a protein.
  • the gene may encode a functional RNA such as ribozyme or antisense RNA.
  • the gene may be a naturally occurring or artificially designed sequence.
  • “DNA” includes single-stranded DNA and double-stranded DNA.
  • encoding a protein means that the polynucleotide contains, in sense or antisense, an ORF encoding the amino acid sequence of the protein so that the polynucleotide can express the protein under appropriate conditions.
  • the minus-strand RNA virus preferably used in the present invention includes, for example, Sendai Winores of Paramyxoviridae (Paramyxoviridae) Winores, Newcastle disease virus, Newcastle disease virus, (Mumps virus), Macheles virus , 2,3 type, orthomyxoviridae
  • Sendai virus SeV
  • HPIV-1 human parainfluenza virus-1
  • HPIV-3 human parainfluenza virus-3
  • PDV canine dis
  • Sendai virus SeV
  • human parainfluenza virus-1 HPIV-1
  • human parainfluenza virus-3 HPIV-3
  • phocine distemper virus PDV
  • canine distemper virus CDV
  • dolphin molbillivirus DMV
  • PDPR ruminants virus
  • MV measles virus
  • RPV rinderpest virus
  • Hendra virus Hendra
  • Nipah virus Nipah virus
  • a virus belonging to the subfamily Paramyxoviridae including the genera Respirovirus, Rubravirus, and Morbillivirus
  • a virus belonging to the genus Respirovirus genus
  • Respirovirus also called Paramyxovirus
  • Derivatives include viruses in which the virus gene has been modified so as not to impair the gene transfer ability by the virus, and viruses in which the gene has been chemically modified.
  • respirovirus of the genus to which the present invention can be applied examples include human parainfluenza virus type 1 (HPIV-1), human parainfluenza virus type 3 (HPIV-3), and paraparainfluenza virus type 3 (BPIV- 3), Sendai virus (also referred to as mouse parainfluenza virus type 1), and salparainfluenza virus type 10 (SPIV-10).
  • paramyxovirus is most preferably a Sendai virus. These viruses may be derived from natural strains, wild strains, mutant strains, laboratory passages, artificially constructed strains, and the like.
  • the minus-strand RNA virus vector encodes a borne RNA as an antisense gene.
  • Genomic RNA is RNA that has the function of forming ribonucleoprotein (RNP) with viral proteins of minus-strand RNA virus, which expresses a gene in the genome and replicates this RNA to form daughter RNP. It is.
  • RNP ribonucleoprotein
  • the genome of a minus-strand RNA virus has a structure in which viral genes are arranged as an antisense sequence between a 3 'leader region and a 5' trailer region.
  • RNA encoding the ORF of each gene is separated into separate cistrons. Is transcribed as
  • the genes encoding the viral proteins of the minus-strand RNA virus include NP, P, M, F, HN, and L genes.
  • NP, P, M, F, HN, and L genes refer to genes encoding nucleocapsid, phospho, matrix, fusion, hemagglutin-neuraminidase, and large proteins, respectively.
  • Each gene in each virus belonging to the subfamily Noramyxovirus is generally represented as follows. In general The NP gene is sometimes described as “N gene”.
  • accession number of the database of the base sequence of each gene of Sendai virus is M29343, M30202, M30203, M30204, M51331,
  • MCT65, M69046, X17218, P gene M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008,
  • M gene D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056, F gene D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131, HN gene D26475, M12397, M30202, M30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131, L gene D00053 , M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886.
  • viral genes encoded by other viruses include CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV-1, D01070; HPIV-2, M55320; HPIV-3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR,
  • the ORFs encoding these viral proteins and the ORF of the foreign gene are placed in genomic RNA in an antisense manner via the EIS sequence described above.
  • the ORF closest to the genomic RNA! Only requires the S sequence between the 3 'leader region and the ORF, and does not require the E and I sequences.
  • the ORF closest to 5 ′ requires only the E sequence between the 5 ′ trailer region and the ORF, and does not require the I and S sequences.
  • the two ORFs can also be transcribed as the same cistron using a sequence such as IRES. In such cases, there is no need for an E-to-S sequence between these two ORFs.
  • RNA genome has a 3 'leader region followed by six ORFs encoding N, P, M, F, HN, and L proteins in antisense order.
  • ORFs encoding the N, P, M, F, HN, and L proteins in antisense order.
  • the arrangement of the viral genes is not limited to this, but it is preferable that the N, P, M, F, HN , And the ORFs encoding the L proteins are preferably arranged in order, followed by a 5 ′ trailer region.
  • the power of different viral genes Even in such a case, it is preferable to arrange the respective viral genes in the same manner as in the wild type as described above.
  • vectors carrying the N, P, and L genes autonomously express genes from the RNA genome in cells, and genomic RNA is replicated.
  • the functions of the genes encoding the envelope proteins such as the F and HN genes and the M gene form infectious virus particles that are released outside the cells. Therefore, such a vector is a virus vector having a transmitting ability.
  • a foreign gene to be introduced into a dendritic cell may be inserted into a non-protein coding region in the genome, as described later.
  • the minus-strand RNA virus vector of the present invention may be one lacking any of the genes of the wild-type virus.
  • viral vectors containing the M, F, or HN genes, or a combination thereof can also be suitably used in the present invention.
  • Reconstitution of such a viral vector can be performed, for example, by exogenously supplying a defective gene product.
  • the virus vector thus produced adheres to the host cell and causes cell fusion similarly to the wild-type virus.However, the vector genome introduced into the cell has a defect in the viral gene. No daughter virus particles with the same infectivity are formed. For this reason, it is useful as a safe virus vector having a one-time gene transfer capability.
  • the gene to be deleted from the genome include the F gene and the Z or HN gene.
  • a plasmid expressing a recombinant minus-strand RNA virus vector genome deficient in the F gene is transfected into host cells together with an F protein expression vector and NP, P, and L protein expression vectors. Vectors can be reconstructed (WO00 / 70055 and WO00 / 70070; Li, H. — 0. et al., J. Virol. 74 (14)
  • a virus can be produced using a host cell in which the F gene has been integrated into the chromosome. Even if the amino acid sequence of these proteins is not a virus-derived sequence, if the activity in nucleic acid introduction is equal to or higher than that of the natural type, mutations or homologous genes of other viruses can be introduced. Substitute with a little.
  • a vector containing a protein different from the envelope protein of the virus from which the vector genome is derived can be prepared.
  • a viral vector having a desired envelope protein can be produced by expressing in a cell an envelope protein other than the envelope protein encoded by the viral genome as the base of the vector.
  • a desired protein that can infect cells is used.
  • envelope proteins of other viruses for example, G protein (VSV-G) of vesicular stomatitis virus (VSV) can be mentioned.
  • the VSV-G protein may be from any VSV strain.
  • the vector of the present invention can contain any combination of envelope proteins derived from other viruses.
  • an envelope protein derived from a virus that infects human cells is suitable as such a protein.
  • a protein is not particularly limited, and examples thereof include a retrovirus amphoteric picken envelope protein.
  • an envelope protein derived from mouse leukemia virus (MuLV) 4070A strain can be used.
  • MuMLV 10A1 for example, pCL-10Al (Imgenex) (Naviaux, RK et al., J. Virol.
  • the proteins of the family include, for example, gB, gD, gH, and gp85 proteins of the simple herpes virus, the gp350 and gp220 proteins of the EB virus, and the proteins of the hepadnavirus family include the S virus of the hepatitis B virus. These proteins may be used as a fusion protein in which the extracellular domain is linked to the intracellular domain of the F protein or the HN protein, and thus used in the present invention.
  • Viral vectors include pseudotyped viral vectors that contain an envelope protein derived from a virus other than the virus from which the genome is derived, such as the VSV-G protein. If these envelope proteins are designed in RNA so that they are not encoded in the genome, the viral vector will not be expressed after viral particles infect cells.
  • the viral vector used in the present invention may be, for example, a protein such as an adhesion factor, a ligand, or a receptor capable of adhering to a specific cell on the surface of an envelope, an antibody or a fragment thereof, or a cell containing these proteins. It may contain a chimeric protein or the like having a polypeptide derived from a virus envelope in an intracellular region, which is contained in an outer region. Thereby, the specificity of the vector for dendritic cells can be controlled. These may be encoded in the viral genome or may be supplied during expression of the viral vector by expression of a gene other than the viral genome (eg, another expression vector or a gene located on the host chromosome). Is also good.
  • a protein such as an adhesion factor, a ligand, or a receptor capable of adhering to a specific cell on the surface of an envelope, an antibody or a fragment thereof, or a cell containing these proteins. It may contain a chimeric protein or the like having a
  • viral vectors are used, for example, to reduce immunogenicity caused by viral proteins.
  • any viral gene contained in the vector may be modified from a wild-type gene in order to increase the efficiency of transcription or replication of RNA.
  • HN protein one of the envelope proteins, has both hemagglutinin and neuraminidase activities, which are hemagglutinins. If the activity of the former can be reduced, for example, It will be possible to improve the stability of the virus in it, and it is also possible to modulate infectivity, for example by modifying the activity of the latter.
  • the membrane fusion ability can be regulated by modifying the F protein. Also, for example, by analyzing antigen presentation epitopes of F protein and / or HN protein that can be an antigen molecule on the cell surface, and using this to produce a virus vector with reduced antigen presentation ability for these proteins.
  • the minus-strand RNA virus vector may be one in which an accessory gene is deleted.
  • knocking out the V gene, one of the accessory genes for SeV significantly reduces the virulence of SeV to hosts such as mice without impairing gene expression and replication in cultured cells (Kato, A. et al., 1997, J. Virol.
  • Attenuated vectors are particularly useful as non-toxic viral vectors for gene transfer in vivo or ex vivo.
  • Negative-strand RNA virus is an excellent gene transfer vector, transcribes and replicates only in the cytoplasm of the host cell, and has no DNA phase. Therefore, integration into the chromosome (integration) does not occur.
  • minus-strand RNA virus greatly contributes to the safety when vectorized.
  • Sendai virus Sendai virus
  • a transmissible SeV vector can introduce a foreign gene up to at least 4 kb, and can simultaneously express two or more genes by adding a transcription unit.
  • the Sendai virus is not pathogenic to rodents, which are pathogenic to rodents and known to cause pneumonia. This has also been supported by previous reports that nasal administration of wild-type Sendai virus has no serious adverse effects in non-human primates (Hurwitz, JL et al., Vaccine 15 : 533-540, 1997). These characteristics of Sendai virus suggest that Sendai virus vector is applicable to human therapy and conclude that Sendai virus vector is one of the promising options for gene therapy targeting human dendritic cells. is there.
  • a viral vector may encode a foreign gene in genomic RNA.
  • a recombinant virus vector containing a foreign gene can be obtained by inserting the foreign gene into the genome of the above-mentioned virus vector.
  • a desired gene to be expressed in a target ⁇ cells can be used.
  • the foreign gene may be a gene encoding a native protein, or may be a gene encoding a protein obtained by modifying a native protein by deletion, substitution or insertion.
  • the insertion position of the foreign gene can be selected, for example, at a desired site in the protein non-coding region of the viral genome.For example, each position between the 3 ′ leader region of the genomic RNA and the viral protein ORF closest to the 3 ′ end can be selected.
  • a nucleic acid encoding a foreign gene can be inserted into the deleted region.
  • a foreign gene is introduced into Noramixovirus, it is desirable to insert the foreign gene into the genome in a multiple of the chain length ⁇ of the polynucleotide of the inserted fragment (Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 4822). -4830, 1993).
  • An EIS sequence is constructed between the inserted foreign gene and the viral ORF. Be done. Two or more genes can be inserted in tandem via the E-S sequence.
  • the expression level of a foreign gene carried on a vector can be regulated by the type of transcription initiation sequence added upstream of the gene (3 'side of the negative strand) (
  • the expression level can be controlled by the insertion position of the foreign gene on the genome, and the expression level increases as the insertion position is closer to 3 'of the negative strand. Becomes lower.
  • the insertion position of the foreign gene can be appropriately adjusted in order to obtain a desired expression level of the gene and to optimize the combination with the gene encoding the preceding and succeeding viral proteins.
  • the foreign gene it is preferable that the foreign gene be linked to a highly efficient transcription initiation sequence and inserted near the 3 ′ end of the negative strand genome. Specifically, it is inserted between the 3 ′ leader region and the viral protein ORF closest to 3 ′.
  • the viral protein gene closest to the 3 ′ is the N gene and the second gene is the P gene.
  • the insertion position of the foreign gene in the vector should be set to the 5 'side of the negative strand, or the transcription initiation sequence should be less efficient.
  • a mammalian genomic RNA is prepared in mammalian cells in the presence of viral proteins necessary for reconstitution of RNP, a component of the virus, ie, N, P, and L proteins. Transcribe the encoding cDNA.
  • the viral RNP can be reconstituted whether transcription produces a negative strand genome (ie, the same antisense strand as the viral genome) or a positive strand (the sense strand encoding the viral protein).
  • a positive strand is preferably generated. It is preferred that the RNA ends reflect the ends of the 3 'leader sequence and the 5' trailer sequence exactly as well as the natural viral genome.
  • RNA polymerase may be used to express the RNA polymerase in cells.
  • a self-cleaving ribozyme can be encoded at the 3 ′ end of the transcript so that the 3 ′ end can be cut out accurately by this ribozyme ( Hasan, MK et al, J.
  • the DNA sample can be identified as a single plasmid by electrophoresis at a concentration of 25 ng / micro-L or more.
  • the Notl recognition site is included in the target cDNA base sequence, the base sequence is modified by using a site-directed mutagenesis method, etc., so that the encoded amino acid sequence is not changed, and the Notl site is changed. It is preferable to remove them in advance. From this sample, the target gene fragment is amplified by PCR and collected.
  • both ends of the amplified fragment are used as Notl sites.
  • Notl sites include the E-to-S sequence in the primer so that the E-to-S sequence is located between the ORF of the foreign gene after insertion into the viral genome and the ORF of the viral gene on both sides. design.
  • the forward synthetic DNA sequence does not include any 2 or more nucleotides (preferably a sequence derived from a Notl recognition site such as GCG and GCC) on the 5 'side to ensure cleavage by Notl. (4 bases, more preferably ACTT), a Notl recognition site gcggccgc is added to its 3 'side, and any 9 bases or a multiple of 6 is added to 9 as a spacer sequence on its 3' side. And a sequence corresponding to about 25 bases of the ORF, including the initiation codon ATG of the desired cDNA, is added to the 3 'side.
  • a sequence corresponding to about 25 bases of the ORF, including the initiation codon ATG of the desired cDNA is added to the 3 'side.
  • any two or more nucleotides are selected from the 5 'side, A Notl recognition site gcggccgc is added to the 3 ′ side, and an oligo DNA of an inserted fragment for adjusting the length is added to the 3 ′ side.
  • the length of this oligo DNA is designed so that the base length of the Notl fragment of the final PCR amplification product is a multiple of 6 (see the so-called “rule of six” J; Kolakofski, D. et al, J. Virol. 72: 891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993.
  • EIS sequence is added to this primer, the complementary strand of the S, I, and E sequences of Sendai virus is added to the 3 'end of the oligo DNA of the inserted fragment.
  • Sequences preferably 5'-CTTTCACCCT-3 '(SEQ ID NO: 1), 5'-AAG-3', and 5'-TTTTTCTTACTACGG-3, respectively (SEQ ID NO: 2) Codon force at the 3 'end of the desired cDNA sequence Select the length so that the last base of the complementary strand corresponding to about 25 bases, counted in reverse, is G or C, add the sequence, and add the reverse side synthetic DNA. 3 'end of
  • PCR For PCR, an ordinary method using Taq polymerase or another DNA polymerase can be used.
  • the amplified target fragment is digested with Notl and inserted into the Notl site of a plasmid vector such as pBluescript. Confirm the nucleotide sequence of the obtained PCR product with a sequencer and select a plasmid with the correct sequence.
  • the insert is excised from this plasmid with Notl and cloned into the Notl site of the plasmid containing the genomic cDNA. It is also possible to obtain a recombinant Sendai virus cDNA by inserting it directly into the Notl site of the genomic cDNA without using a plasmid vector.
  • a recombinant Sendai virus genomic cDNA can be constructed according to the method described in the literature (Yu, D. et al "Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, MK et al”). J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997).
  • an 18 bp spacer sequence (5 ′-(G) -CGGCCGCAGATCTTCACG-3 ′) having a Notl restriction site (SEQ ID NO: 3) can be used as a leader for a closed Sendai virus genomic cDNA (pSeV (+)).
  • a plasmid pSeV18 + b (+) containing a self-cleaving ribozyme site derived from the hepatitis delta virus antigenomic strand is inserted between the sequence and the ORF of the N protein (Hasan, MK et al. al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820).
  • a foreign gene fragment into the Notl site of pSeV18 + b (+)
  • a recombinant Sendai virus cDNA having the desired foreign gene integrated therein can be obtained.
  • the DNA encoding the genomic RNA of the recombinant virus thus prepared is transcribed in the cell in the presence of the above-mentioned viral proteins (L, P, and N), whereby the virus vector can be reconstituted. it can.
  • the present invention provides a minus-strand RNA virus vector for introduction into dendritic cells.
  • the present invention also relates to the use of a minus-strand RNA virus vector in the production of a dendritic cell into which a gene has been introduced, and the use of a minus-strand RNA virus vector in the production of a mature astrocyte.
  • the present invention provides a DNA encoding a viral genomic RNA of a minus-strand RNA virus vector for producing a minus-strand RNA virus vector for introducing a dendritic cell.
  • the present invention also relates to the use of a DNA encoding a genomic RNA of the vector of the present invention for application to the production of the vector. Reconstitution of the recombinant virus can be performed using a known method (
  • RNA viruses including parainfluenza, vesicular stomatitis virus, rabies virus, measles virus, Linda pest virus, Sendai virus, etc. can be reconstituted from DNA.
  • the vector of the present invention can be reconstituted according to these methods.
  • the virus does not form an infectious virus particle as it is, but these deleted genes and / or Infectious virus particles can be formed by separately introducing and expressing genes encoding the envelope protein of another virus into cells.
  • the specific procedure is as follows: (a) cDNA encoding negative-strand RNA virus genomic RNA (negative-strand RNA) or its complementary strand (positive-strand) is transformed into cells expressing N, P, and L proteins. Transcription, and (b) collecting the culture supernatant containing the generated minus-strand RNA virus. For transcription, DNA encoding genomic RNA is ligated downstream of a suitable promoter.
  • Transcribed genomic RNA is replicated in the presence of N, L, and P proteins to form an RNP complex. Then, in the presence of the M, HN, and F proteins, enveloped virus particles are formed.
  • DNA encoding genomic RNA is ligated, for example, downstream of the T7 promoter, and transcribed into RNA by T7 RNA polymerase.
  • T7 RNA polymerase any desired promoter can be used other than those containing a recognition sequence for T7 polymerase.
  • RNA transcribed in vitro may be transfused into cells.
  • Enzymes such as T7 RNA polymerase, required for the initial transcription of genomic RNA from DNA can be supplied by the introduction of a plasmid or viral vector expressing it, or, for example, the RNA
  • the polymerase gene may be incorporated so that expression can be induced, and supplied by inducing expression at the time of virus reconstitution.
  • Genomic RNA and viral proteins required for vector reconstitution are supplied, for example, by introducing a plasmid that expresses them.
  • helper viruses such as wild-type or certain mutant minus-strand RNA viruses, to supply these viral proteins is an advantage.
  • Methods for introducing genomic RNA-expressing DNA into cells include, for example, the following methods: (0 a method for preparing a DNA precipitate that can be taken up by a target cell, a method for GO uptake by a target cell) Suitable and low cytotoxicity! / ⁇ A method to create a complex containing DNA with positive charge characteristics. (Iii) Instantaneous electrical pulse through the target cell membrane with enough holes to allow DNA molecules to pass through. There is a way to open.
  • transfusion reagents can be used.
  • DOTMA Roche
  • Superfect QIAGEN # 301305
  • DOTAP @ DOPE DOSPER (Roche # 1811169) and the like
  • the transfection method using calcium phosphate is mentioned, and DNA that has entered the cells by this method is a force that is taken up by phagocytic vesicles. Is also known to contain sufficient amounts of DNA (Graham, FL and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S "1977, Cell 11: 223). 0 Chen and Okayama studied the optimization of transfer technology. 1) Incubation conditions of cells and coprecipitate were 2-4% CO, 35 ° C, 15-24 hours. Ring shaped
  • the method (iii) is a method called electroporation, which has high cell selectivity and is more versatile than the 0 or GO method.
  • the efficiency is the pulse current duration, pulse It is said that it is good under the optimal conditions of shape, strength of electric field (gap between electrodes, voltage), conductivity of buffer, DNA concentration and cell density.
  • the method (ii) is simple in operation and allows the use of a large number of cells to examine a large number of specimens.
  • the transfusion reagent is suitable.
  • Superfect Transfection Ragent QIAGEN, Cat No. 301305
  • DOSPER Liposomal Transfection Reagent Roche, Cat No. 1811169
  • Reconstitution of a virus from cDNA can be specifically performed, for example, as follows.
  • the ratio of expression vectors encoding N, P, and L is preferably, for example, 2: 1: 2.
  • the amount of plasmid is preferably, for example, 114 micro-g pGEM-N, 0.5-12 micron. — Adjust appropriately with pGEM-P of 1 g and 4 micro-g of pGEM-L.
  • the cells subjected to the transfection are, if desired, 100 micro-g / ml of rifampicin (Sigma) and cytosine arabinoside (AraC), more preferably 40 micro-g / ml of cytosine ara pinoside (AraC) (Sigma).
  • rifampicin Sigma
  • AraC cytosine arabinoside
  • DOTMA (Roche), Superfect (QIAGEN # 301305), DOTAP, DOPE, DOSPER (Roche # 1811169) and the like can be mentioned.
  • cloquins can be added (Calos, MP, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015).
  • the process of virus gene expression from RNP and RNP replication proceeds, and the vector is amplified.
  • Vaccinia virus VTF7-3 can be completely removed by diluting the obtained virus solution (for example, 10 6 times) and repeating re-amplification. Re-amplification is repeated, for example, three times or more.
  • the resulting vector can be stored at -80 ° C.
  • a defective viral vector can be amplified by overlaying and culturing LLC-MK2 cells expressing the envelope protein on cells subjected to transfection (see International Publication No.
  • the titer of the recovered virus can be determined, for example, by measuring CIU (Cell-Infected Unit) or measuring hemagglutination activity (HA) (WOOO / 70070; Kato, A. et al. , 199, Genes Cells 1: 569-579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan— liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. By Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999).
  • CIU Cell-Infected Unit
  • HA hemagglutination activity
  • the titer can be quantified by directly counting infected cells using the marker as an index (for example, as GFP-CIU).
  • the titer measured in this way can be treated as equivalent to CIU (WOOO / 70070).
  • the host cell used for reconstitution is not particularly limited.
  • the host cell used for reconstitution is not particularly limited.
  • monkey kidney-derived kidney-derived virus vector etc.
  • Cultured cells such as LLC-MK2 cells and CV-1 cells, hamster kidney-derived BHK cells, and human-derived cells can be used. By expressing an appropriate envelope protein in these cells, infectious virus particles having the protein in the envelope can also be obtained.
  • the virus vector obtained from the above host can be infected to embryonated chicken eggs to amplify the vector.
  • a method for producing a viral vector using chicken eggs has already been developed (Nakanishi et al., Eds. (1993), "Advanced Technology Protocol for Neuroscience III, Molecular Neuronal Physiology", Kouseisha, Osaka, pp. L53-).
  • a fertilized egg is placed in an incubator and cultured at 37-38 ° C for 9-12 days to grow an embryo.
  • the viral vector is inoculated into the allantoic cavity, and the eggs are cultured for several days (eg, 3 days) to propagate the viral vector. Conditions such as the culture period may vary depending on the recombinant Sendai virus used.
  • the urine fluid containing the virus is collected. Separation and purification of Sendai virus vector from urine fluid can be performed according to a conventional method (Masato Tashiro, "Virus Experiment Protocol", Nagai and Ishihama, Medical View, pp.68-73, (1995)) 0
  • construction and preparation of a Sendai virus vector from which the F gene has been deleted can be performed as follows (see WO00 / 70055 and WO00 / 70070).
  • the gene is ligated with, for example, atgcatgccggcagatga (SEQ ID NO: 4), and the F gene is deleted.
  • a type SeV genomic cDNA (pSeV18 + / AF) is constructed.
  • upstream of F [forward: 5-gttgagtactgcaagagc / Rooster column number: 5, reverse:
  • the PCR product using the primer pair of 5'-tgggtgaatgagagaatcagcZ SEQ ID NO: 8] is ligated with EcoT22I.
  • the thus obtained plasmid is digested with Sad and Sail, and a fragment (493 lbp) containing the F gene deletion site is recovered and cloned into pUC18 to obtain pUC18 / dFSS.
  • This pUC18 / dFSS is digested with Dralll, the fragment is recovered, replaced with the Dralll fragment in the region containing the F gene of pSeV18 +, and ligated to obtain plasmid pSeV18 + / AF.
  • the foreign gene is inserted, for example, into the restriction enzyme Nsil and NgoMIV sites at the F gene deletion site of pUC18 / dFSS.
  • a foreign gene fragment may be amplified with an Nsil-tailed primer and an NgoMIV-tailed primer.
  • a Cre / loxP-inducible expression plasmid that expresses the Sendai virus F gene (SeV-F)
  • the SeV-F gene is amplified by PCR, and the gene product is amplified by Cre DNA recombinase.
  • the plasmid pCALNdLw / F is constructed by inserting it into the unique site Swal site of the plasmid pCALNdlw (Arai, T. et al., J. Virology 72, 1998, plll5-11121) designed to be inducibly expressed.
  • a helper cell line expressing SeV-F protein is established.
  • the cells for example, monkey kidney-derived cell line LLC-MK2 cells, which are often used for the growth of SeV, can be used. LLC-MK2 cells were incubated at 37 ° C in MEM supplemented with 10% heat-treated immobilized fetal serum (FBS), penicillin G sodium 50 units / ml, and streptomycin 50 micro-g / ml. Incubate with 5% CO. SeV-F remains
  • the above plasmid pCALNdLw / F designed to induce the expression of the F gene product by Cre DNA recombinase was used for the calcium phosphate method (.mammalian transfection kit (btratagene)). Introduce into LLC-MK2 cells.
  • the plasmid into which the foreign gene of pSeV18 + / AF has been inserted is transfected into LLC-MK2 cells as follows. 5x10 LLC-MK2 cells. cells / dish Seed in a 100 mm petri dish. When genomic RNA is transcribed by T7 RNA polymerase, recombinant vaccinia virus expressing T7 RNA polymerase treated with psoralen and long-wave ultraviolet light (365 nm) for 20 minutes after cell culture for 24 hours (
  • PLWUV-VacT7 Fuerst, T.R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122-8126 (1986)) and infect at about MOI 2 for 1 hour at room temperature.
  • UV irradiation of vaccinia virus for example, UV Stratalinker 2400 (catalog number 400676 (100V), Stratagene, La Jolla, CA, USA) equipped with five 15-watt bulbs can be used.
  • the plasmids expressing genomic RNA and the expression plasmids expressing N-, P-, L-, F-, and HN-proteins of minus-strand RNA virus, respectively were purified using appropriate lipofection reagents. Transfect the cells.
  • the amount ratio of the plasmid is not limited to this, but may be preferably 6: 2: 1: 2: 2: 2 in order.
  • plasmids expressing genomic RNA and expression plasmids expressing N, P, L, and F plus HN proteins pGEM / NP, pGEM / P, pGEM / L and pGEM / F-HN;
  • WO00 / 70070 Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579 (1996) were compared with 12 micro-g, 4 micro-g, 2 micro-g, 4 micro-g and 4 micro-gZ, respectively. Remove the transfer ratio of the dish. After culturing for several hours, wash the cells twice with serum-free MEM and add 40 micro-g / mL of ytosine ⁇ -D-arabinoluranoside (AraC: bigma, St. Louis, MO and 7.5).
  • a viral gene-deficient vector for example, when two or more vectors having different viral genes on the viral genome contained in the vector are introduced into the same cell, the viral protein deficiency in each of them is reduced.
  • Another vector Since they are supplied by their expression, virus particles that are complementary to each other and infectious are formed and undergo a replication cycle to amplify the viral vector. That is, when two or more vectors of the present invention are inoculated in a combination that complements the viral proteins, a mixture of the respective viral gene-deficient virus vectors can be produced in large quantities at low cost. Since these viruses lack the viral gene, the virus gene must be deleted, and the genome size is smaller than that of the virus and the foreign gene can be retained. In addition, V is not proliferative due to viral gene deficiency. These viruses are diluted extracellularly and are difficult to maintain co-infection.
  • the foreign gene introduced by the minus-strand RNA virus is not particularly limited.
  • natural proteins include hormones, cytokins, growth factors, receptors, intracellular signal molecules, enzymes, and peptides. Is mentioned.
  • the protein can be a secreted protein, a membrane protein, a cytoplasmic protein, a nuclear protein, and the like.
  • Artificial proteins include, for example, fusion proteins such as chimeric toxins, dominant negative proteins (including soluble receptor molecules or membrane-bound dominant negative receptors), deletion type cell adhesion molecules and cell surface components. And the like. It may also be a protein to which a secretion signal, a membrane localization signal, a nuclear localization signal, or the like has been added.
  • the function of a specific gene can be suppressed by expressing an antisense RNA molecule or an RNA-cleavable ribozyme as a transgene.
  • a viral vector is prepared using a gene for treating a disease as a foreign gene, gene therapy can be performed by administering this vector.
  • the application of the virus vector of the present invention to gene therapy includes gene expression by direct administration and gene expression by indirect (ex vivo) administration. Thus, it is possible to express endogenous genes and the like, whose supply is insufficient, in dendritic cells.
  • the method of the present invention can also be used as a gene therapy vector in regenerative medicine.
  • viral vectors of the present invention example if 1 X 10 5 CIU / mL or more, preferably 1 X 10 6 CIU / mL or more, more preferably 5 X 10 6 CIU / mL or more, more preferably 1 X 10 7 CIU / mL or more, more preferably 5 X 10 7 CIU / mL or less
  • the virus can be released into the extracellular fluid of virus-producing cells at a titer of more preferably 1 ⁇ 10 8 CIU / mL or more, more preferably 5 ⁇ 10 8 CIU / mL or more.
  • the titer of the virus can be determined by the methods described herein and elsewhere (Kiyotani, K. et al, Virology 177 (1), 65-74 (1990); WO00 / 70070).
  • the recovered virus vector can be purified to be substantially pure.
  • the purification method can be performed by a known purification / separation method including filtration, centrifugation, adsorption, and column purification, or any combination thereof.
  • substantially pure refers to the predominant proportion of the components of a vector in a solution containing the vector.
  • the ratio of the protein contained as a component of the virus vector to the total protein contained in the solution is 10%.
  • % (Weight / weight) or more preferably 20% or more, more preferably 50% or more, preferably 70% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 90% or more. .
  • a paramyxovirus vector as a specific purification method, a method using cellulose sulfate or a crosslinked polysaccharide sulfate (Japanese Patent Publication No. 62-30752, Japanese Patent Publication No. 62-33879, and No. 62-30753), and a method of adsorbing to a sulfated-fucose-containing polysaccharide and / or a decomposition product thereof (WO97 / 32010).
  • the vector in the production of a composition containing a vector, can be combined with a desired pharmacologically acceptable carrier or medium, if necessary.
  • a “pharmaceutically acceptable carrier or vehicle” is a material that can be administered with a vector and does not significantly inhibit gene transfer by the vector.
  • Such carriers or vehicles include, for example, deionized water, sterile water, sodium chloride solution, dextrose solution, dextrose and sodium salt, lactate-containing Ringer's solution, culture solution, serum, phosphate buffered saline. (PBS), etc., and these may be appropriately combined with a vector to form a pharmaceutical preparation. It may also contain a ribosome membrane stabilizer (for example, sterols such as cholesterol).
  • compositions of the present invention may be in the form of an aqueous solution, capsule, suspension, syrup, and the like.
  • the vector composition of the present invention may be a composition in the form of a solution, a lyophilized product, or an aerosol. In the case of a freeze-dried product, it may contain sorbitol, sucrose, amino acid, various proteins and the like as a stabilizer.
  • the composition containing the vector of the present invention is useful as a reagent for introducing a gene into dendritic cells and as a drug used for gene therapy targeting dendritic cells.
  • Vector solutions are also useful as vaccines (JI Mayordomo et al., Nature Med. 1 (12), 1279-1302, (1995)).
  • the antigen peptide is expressed in dendritic cells by the vector of the present invention, the cells presenting this peptide can be used as a vaccine.
  • the vaccine composition may also include an immunostimulant such as cytotoxic, cholera toxin, salmonella toxin, etc., to enhance immunogenicity.
  • Vaccines include adjuvants such as myo-kun, incomplete Freund's adjuvant, MF59 (oil emulsion), MTP-PE (muramyl tripeptide from mycobacterial cell wall), and QS-21 (from soapbark tree Ouilaia saponaria). They can be combined.
  • cytodynamic compounds that enhance the adjuvant effect.
  • genes include, for example, i) a combination of IL-2 and single-stranded IL-12 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999), ii) IL-2 and interferon- ⁇ (US Pat. No. 5,798,100), iii) Granulocyte colony stimulating factor (GM-CSF) used alone, iv) Combination of GM-CSF and IL-4 (J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999)).
  • the antigen to be presented to the dendritic cells may be encoded by a minus-strand RNA virus vector, added to the dendritic cells into which the vector has been introduced (ie, pulsed), or expressed in another desired vector. Can be done.
  • Antigens include desired antigens associated with infectious microorganisms, viruses, parasites, pathogens, cancer, and the like. These may be structural proteins or non-structural proteins. Such antigens (or their processed peptides) bind to MHC molecules on the surface of dendritic cells and are presented on the cell surface to induce an immune response.
  • pathogen-derived antigens include hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, hepatitis delta virus, papilloma virus antigen, simple herpes virus (HSV), varicella-zoster virus (VZV) , Epstein-Barr virus, cytomegalovirus (CMV), HIV, and proteins or partial peptides of malaria.
  • Minus-strand RNA viruses encoding these antigenic proteins can be used prophylactically and therapeutically.
  • the envelope of the virulent strain H5N1 or the like and in the case of Japanese encephalitis, for example, the envelope protein of the Japanese encephalitis virus (Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882 ( In AIDS, for example, HIV gag or SIV gag protein (J. Immunology (2000) vol. 164,
  • HIV envelope protein HIV envelope protein
  • Nef protein HIV envelope protein
  • other viral proteins HIV envelope protein
  • cholera for example, the cholera toxin B subunit (CTB) (Arakawa T, et al, Nature Biotechnology (1998) 16 (10): 934-8, Arakawa T, et al, Nature Biotechnology (1998) 16 (3)
  • CTB cholera toxin B subunit
  • rabies for example, the rabies virus glycoprotein (Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4 (8): 949-52), and in cervical cancer, human papillomavirus type 6 Capsid protein LI (J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000)).
  • antigenic proteins of other pathogenic viruses can be expressed from vectors.
  • JE-E antigen protein of Japanese encephalitis JP-A 64-74982, JP-A 1-2854978
  • gD2 protein of human simple herpes virus JP-A 5-252965
  • polypeptide derived from hepatitis C virus Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 5-192160
  • polypeptides derived from pseudorabies virus Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-502173
  • cells from patients infected with these pathogenic microorganisms may be analyzed to identify the epitope of the antigenic protein presented in antigen presenting cells (APC) and use this.
  • APC antigen presenting cells
  • a minus-strand RNA virus vector expressing one or more tumor antigens is introduced into dendritic cells, or a tumor antigen is added to dendritic cells activated with the minus-strand RNA virus vector.
  • Pulse Tumor antigens on tumor cells It may be specific (ie, present in tumor cells but not present in non-tumor cells) or may be present at higher levels in tumor cells than non-tumor cells of the same type . The administration of these dendritic cells stimulates the immune system.
  • CTL functions as a main effector, a desired tumor antigen expressed inside and outside a cell can be used as an antigen.
  • tumor antigens expressed on the cell surface are preferred.
  • cell surface receptors or cell adhesion proteins can be used.
  • tumor antigens include Muc-1 or Muc-1-like mucin tandem repeat peptide (U.S. Pat. No. 5,744,144) that causes ovarian cancer, etc .; human papillomavirus proteins E6 and E7 that cause cervical cancer; melanoma antigens MART-1, MAGE-1, -2, -3, gplOO and tyrosinase, prostate cancer antigen PSA, CEA (Kim, C. et al., Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 90-9 ), And Her2neu
  • the dendritic cells prepared according to the present invention are useful in effective immunotherapy against cancer and infectious diseases, and can be used for dendritic cells into which genes of tumor antigens or infectious diseases-related antigens have been introduced or their dendritic cells Immunization with the stimulated T cells is an effective method for inducing antitumor or antiinfective immunity in patients.
  • the present invention also relates to the use of dendritic cells obtained by the method of the present invention in inducing an immune response. That is, the present invention relates to the use of dendritic cells obtained by the method of the present invention in immunotherapy, specifically, for example, in the treatment of tumors or infectious diseases.
  • the present invention also relates to the use of dendritic cells obtained by the method of the present invention for producing an immunostimulatory agent. That is, the present invention relates to the use of dendritic cells obtained by the method of the present invention in the production of an immunotherapeutic agent, specifically, for example, the production of an antitumor agent (tumor growth inhibitor) or an infectious disease therapeutic agent.
  • an immunotherapeutic agent specifically, for example, the production of an antitumor agent (tumor growth inhibitor) or an infectious disease therapeutic agent.
  • dendritic cell force also expresses cytodynamics, it stimulates the immune system, and Since it enhances an immune response to a substance or cancer, dendritic cells into which a gene encoding cytodynamic force is introduced are also useful for treating cancer and other diseases for which cytodynamic treatment is considered to be effective.
  • Dendritic cells transfected with a minus-strand RNA virus vector carrying a gene encoding an immunostimulatory site force-in can be an effective immunity-inducing agent.
  • interleukin eg, IL-lalpha, IL-lbeta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL- 9, IL-10, IL-12, IL-15, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-23, IL-27
  • interferon eg, IFN-alpha, IFN-beta) , IFN-gamma
  • TGF tumor necrosis factor
  • TGF transforming growth factor
  • TGF transforming growth factor
  • G-CSF granulocyte colony stimulating factor
  • M-CSF macrophage colony stimulating factor
  • GM-CSF granulocyte macrophage colony stimulating Factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • IGF insulin-like growth factor
  • IL-4 for example, Arai et al. (1989), J. Immunol. 142 (1) 274-282
  • IL-6 For example, Yasukawa et al. (1987), EMBO, 6 (10): 2939-2945
  • IL-12 is, for example, Wolfe (1991), J. Immunol. 146 (9): 3074-3081
  • IFN-alpha See, for example, Gren et al. (1984) J. Interferon Res. 4 (4): 609-617, and Weismann et al. (1982) Princess Takamatsu Symp.
  • TNF refers to, for example, Pennica et al. (1984) Nature 312: 724-729
  • G-CSF is, for example, Hirano et al. (1986) Nature 324: 73-76
  • GM-CSF is, for example, Cantrell et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82 ( 18): 6250-6254.
  • examples of the nucleic acid sequence encoding GM-CSF include a sequence containing the sequence 84-461 of Accession number NM_000758 (the amino acid sequence is positions 18-144 of NP_000749).
  • nucleic acid sequence encoding IL-4 examples include a sequence containing the 443-829 sequence of Accession number NM_000589 (the amino acid sequence is 25-153 of NP_000580). Designing a vector containing a mutant gene that still encodes a functional site force-in by utilizing the natural gene encoding these site force-ins or the degeneracy of the genetic code, and introducing it into dendritic cells It comes out.
  • genetic modification may be carried out so as to express these cytodynamic variants.
  • cytodynamic variants For example, for cytokins that have two forms, precursor and mature (for example, those that generate an active fragment by cleaving a signal peptide or those that generate an active fragment by limited degradation of a protein) It may be genetically modified to express either the body or the mature form.
  • Other variants eg, fusion proteins between the cytokin activity fragment and a heterologous sequence (eg, a heterologous signal peptide) may be used.
  • dendritic cells into which a minus-strand RNA virus vector carrying the IFN-beta gene has been introduced activate cytotoxic T lymphocytes very strongly and are antigens. Significantly inhibits tumor growth. Since dendritic cells are activated by the introduction of the vector, there is no need to stimulate dendritic cells with toxic LPS or the like. Thus, dendritic cells transfected with the minus-strand RNA virus vector carrying the IFN-beta gene are promising therapeutic agents for anti-tumor immunotherapy.
  • the IFN-beta gene is well known in many primates and mammals, including humans and mice.
  • the human IFN-beta gene is SEQ ID NO: 12 (the mature polypeptide is SEQ ID NO: 21—187 of SEQ ID NO: 13).
  • mouse IFN-beta include SEQ ID NO: 14 (the mature polypeptide is SEQ ID NO: 15 at positions 21-182) (Derynck, R. et al., Nature 285, 542-547 (1980); Higashi, Y. et al, J. Biol. Chem. 258, 9522-9529 (1983); Kuga, T. et al., Nucleic Acids Res. 17, 3291 (1989)).
  • the signal peptide may be appropriately replaced with a signal sequence of another protein.
  • the IFN-beta gene can be searched for by a homology search or the like based on the above-mentioned known IFN-beta cDNA and protein sequences (for example, BLAST; Altschul, SF et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410). Alternatively, it can be obtained by RT-PCR using primers designed based on the known IFN-beta cDNA base sequence, or by hybridization under stringent conditions using IFN-beta cDNA as a probe. It is also easily obtained by screening human, mouse, rat, and other mammalian cDNA libraries.
  • Hybridization conditions are based on the ability to prepare a probe from the nucleic acid containing the coding region of IFN-beta cDNA or the nucleic acid to be hybridized, and to detect whether it will hybridize to the other nucleic acid. Can be identified.
  • the probe is usually a fragment of the nucleic acid and its length is usually 20 bases or more, Preferably it is 30 bases or more, more preferably 50 bases or more.
  • Stringent hybridization conditions include, for example, 5X SSC (1X SSC contains 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate), 7% (W / V) SDS, 100 micro-g / ml denatured salmon sperm DNA, In a solution containing 5X Denhardt's solution (1X Denhardt's solution contains 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% bovine serum albumin, and 0.2% ficoll) at 48 ° C, preferably 50 ° C, more preferably 52 ° C And then at the same temperature as the hybridization, more preferably at 60 ° C, even more preferably at 65 ° C, most preferably at 68 ° C in 2X SSC, preferably IX SSC Medium, more preferably in 0.5 X SSC (eg, in 0.1 X SSC) for 2 hours with shaking.
  • 5X SSC contains 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate), 7% (W / V) SDS, 100 micro-g
  • the nucleotide sequence or amino acid sequence of mammalian IFN-beta includes a sequence having a high homology with a known sequence of IFN-beta (for example, a sequence corresponding to the mature protein of SEQ ID NOS: 12 to 15).
  • a high homology refers to an identity (identity) of 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 95% or more. ).
  • Sequence identity can be determined, for example, by the BLAST program (Altschul, S.F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:
  • the blastn program is used to determine the identity of the nucleotide sequence
  • the blastp program is used to determine the identity of the amino acid sequence.
  • the blastn program is used to determine the identity of the nucleotide sequence
  • the blastp program is used to determine the identity of the amino acid sequence.
  • o Parameter settings are, for example, open gap cost is 5 for nucleotides and protein is 11 for open gap, extend gap cost is 2 for nucleotides and 1 for protein, penemority for nucleotide mismatch is -3, nucleotide match Reward is 1, expect value is 10, wordsize is nucleotide 11 and protein is 2, Dropoff (X) for blast extensions in bits is 20 for blastn and 7 for other programs, X dropoff value for gapped alignment ( in Dits) i other than blastn, 15; final X dropoff value for gapped alignment (in bits) i blastn, 50 25 for In comparing amino acid sequences, BLOSUM62 can be used as a matrix for scoring.
  • a blast2sequences program (Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250) that compares two sequences to create an alignment of the two sequences and determine sequence identity Can be. Gaps are treated in the same way as mismatches, ignoring gaps outside the IFN-beta mature protein coding sequence (CDS), and leaving the entire CDS of the IFN-beta mature protein (eg, SEQ ID NO: 12 at positions 64-561 or An identity value is calculated for the 14-64-546) or the entire amino acid sequence (eg, 22-187 of SEQ ID NO: 13 or 22-182 of SEQ ID NO: 15).
  • CDS IFN-beta mature protein coding sequence
  • IFN-beta There are polymorphisms and variants in IFN-beta.
  • a variant in which activity equivalent to that of wild-type IFN-beta is maintained can be appropriately used.
  • the activity equivalent to that of wild-type IFN-beta includes an antiviral activity, and can be measured by, for example, an activity of inhibiting the cytotoxicity caused by vesicular stomatitis virus.
  • WISH cells C and L—25; AT and then.
  • the cell death by virus is detected and the protection by IFN-beta is measured (measurement conditions are according to Knezic, Z., et al. (1993) Antiviral Res. 25, 215-221).
  • The% inhibitory concentration is defined as 1 international unit (IU)
  • the polypeptide having an antiviral activity equivalent to that of wild-type IFN-beta is preferably 1 ⁇ 10 6 IU / mg protein or more, more preferably 5 ⁇ 10 IU / mg protein or more.
  • It shows a specific activity of 10 6 IU / mg protein or more, more preferably 1 ⁇ 10 7 IU / mg protein or more, and a polypeptide having an antiviral activity equivalent to that of wild-type IFN-beta is preferably wild-type IFN-beta. -Shows antiviral activity with specific activity of 1/10 or more of beta.
  • Polymorphisms and variants of IFN-beta are generally obtained by substituting or deleting one or more residues in the nucleotide sequence or amino acid sequence of a certain IFN-beta molecular species (for example, SEQ ID NO: 12 to 15). , And / or inserted sequences.
  • the difference from the known IFN-beta sequence is usually within 30 residues, preferably within 20 residues, preferably within 10 residues, more preferably within 5 residues, more preferably within 3 residues, more preferably Is within 2 residues.
  • Amino acid substitutions may be conservative substitutions. Conservatively substituted proteins tend to maintain their activity.
  • Conservative substitutions include, for example, basic amino acids (eg, lysine, arginine, histidine), Acidic amino acids (eg, aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar amino acids (eg, glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine), non-polar amino acids (eg, alanine, norin, leucine, isoleucine, proline, phen- Substitutions between amino acids in each group such as lanalanine, methionine, tryptophan), ⁇ -branched amino acids (eg, threonine, palin, isoleucine), and aromatic amino acids (eg, tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine).
  • Basic amino acids eg, lysine, arginine, histidine
  • Acidic amino acids eg, aspartic acid, glutamic acid
  • examples of the IFN-beta gene include the nucleic acids described below.
  • SEQ ID NO: 12 at positions 64 to 561, SEQ ID NO: 14 at positions 64 to 546, or a sequence comprising a complementary sequence thereof, and SEQ ID NO: 13 to 22 to 187 or SEQ ID NO: 15 to 22 to 182 A nucleic acid that encodes a polypeptide comprising the sequence of the second aspect.
  • nucleic acid that hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid fragment of SEQ ID NO: 12 at positions 64 to 561 or SEQ ID NO: 14 at positions 64 to 546, or a wild type IFN.
  • nucleic acid comprising a sequence having a high homology with SEQ ID NO: 12 at positions 64 to 561, SEQ ID NO: 14 at positions 64 to 546, or a wild-type IFN-beta; A nucleic acid encoding a polypeptide having equivalent activity.
  • nucleic acid comprising a sequence having a high homology to positions 22 to 187 of SEQ ID NO: 13 or positions 22 to 182 of SEQ ID NO: 15, and encoding a polypeptide having activity equivalent to that of wild-type IFN-beta.
  • the dendritic cells genetically modified with the minus-strand RNA virus vector are useful for stimulating the patient's own T cells in vivo, or the genetically modified dendritic cells can transform the T cells in vitro. It is also useful for stimulating. Sensitized T cells can also be administered to a patient to stimulate the patient's immune system via Etas Vivo immunotherapy.
  • the present invention relates to a method for producing T cells stimulated by dendritic cells, wherein (a) contacting a minus-strand RNA virus vector with dendritic cells or their precursor cells, (b) the cells And (c) contacting the mature dendritic cell with a T cell.
  • the antigen to be presented by the dendritic cells may be a protein expressed from a vector (or a processed product thereof), or may be pulsed from outside to the dendritic cells.
  • the dendritic cells into which the minus-strand RNA virus vector has been introduced activate T cells and induce CTLs.
  • the present invention also relates to a method for stimulating an immune system using dendritic cells produced by the method of the present invention.
  • a treatment for stimulating the immune system can be performed on a patient suffering from an infectious disease or cancer.
  • This method comprises a step of administering dendritic cells or T cells. Specifically, (a) a step of administering to a patient a therapeutically effective amount of a dendritic cell into which a minus-strand RNA virus vector has been introduced, or (b) a step in which a minus-strand RNA virus vector has been introduced. Administering to the patient a therapeutically effective amount of T cells stimulated by the cells.
  • the minus-strand RNA virus vector may be free of foreign genes or may have a gene encoding one or more of disease-associated antigens or cytokines.
  • Negative-strand RNA virus vector activates dendritic cells by infecting dendritic cells, so that even dendritic cells that have no foreign gene and have been infected with a vector can activate the patient's immune system. It can be converted. A more effective dendritic cell can be obtained by pulsing the dendritic cell with an antigen peptide to present a desired antigen.
  • T cells and dendritic cells are brought into contact in vitro, it is preferable to collect T cells and administer etas vivo to patients.
  • the dose of the vector in vivo varies depending on the disease, the patient's body weight, age, sex, symptoms, administration purpose, form of administration composition, administration method, transgene, and the like. It is possible to decide.
  • the administration route can be appropriately selected, and for example, may be percutaneous, intranasal, transbronchial, intramuscular, intraperitoneal, intravenous, intraarticular, or subcutaneous. Administration can be local or systemic.
  • Vector administered is preferably about 10 5 CIU / ml to about 10 u CIU / ml, more preferably about 10 7 CIU / ml to about 10 9 CIU / ml, most Preferably it is preferable to administer an amount in the range of about 1 X 10 8 ClU / ml force about 5 X 10 8 CIU / ml in a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the preferred dose per dose is 2 x 10 5 CIU-1 x 2 x 10 11 CIU, with a single dose or multiple doses within the range of clinically acceptable The same applies to the number of administrations of.
  • the above doses can be administered in terms of the weight ratio of the target animal to humans or the volume ratio of the target site for administration (for example, the average value).
  • an RNA-dependent RNA polymerase inhibitor can be administered. Another advantage is that it specifically inhibits the propagation of the viral vector without damaging the host.
  • the vector is brought into contact with the dendritic cell outside the body (for example, in a test tube or a petri dish).
  • the MOI is preferably between 1 and 500, more preferably between 2 and 300, even more preferably between 3 and 200, even more preferably between 5 and 100, even more preferably between 7 and 70.
  • the vector administration targets for example, birds, including birds, mammals, and mammals, such as birds, birds, mice, rats, dogs, pigs, cats, birds, birds, birds, egos, sheep, sheep, goats, monkeys, and humans Animals (human and non-human mammals), and other vertebrates.
  • the dendritic cells into which the vector has been introduced are administered, they can be generally injected intramuscularly, intraperitoneally, subcutaneously or intravenously, or by direct injection into the lymph nodes. It is preferably administered to patients by subcutaneous, intraperitoneal injection or direct infusion into lymph nodes.
  • the transduced dendritic cells can generally administer 10 5 to 10 9 cells, preferably 10 6 to 10 8 cells, more preferably about 10 7 cells to the patient.
  • Dendritic cells into which the minus-strand RNA virus vector has been introduced are useful as antitumor agents.
  • tumor growth can be suppressed by administering a vector-introduced filamentous cell to a tumor site.
  • the tumor site refers to a tumor or an area around the tumor (for example, within 5 mm, preferably within 3 mm from the tumor).
  • Vectors can be expected to have antitumor effects even if they do not carry foreign genes, but higher effects can be obtained by carrying IFN-beta genes in vectors. A higher effect can be obtained by contacting the dendritic cells with a tumor antigen before administering the dendritic cells to the tumor.
  • Antitumor effects can also be obtained by injecting IFN-beta or a vector carrying the IFN-beta gene directly into a tumor.
  • a minus-strand RNA virus vector carrying the IFN-beta gene is excellent as an antitumor agent.
  • the T cells When administering T cells activated by dendritic cells, for example, the T cells are about 10 5 to 10 9 cells, preferably 10 6 to 10 9 cells per 1 m 2 of body surface area, It can be administered by intravenous infusion, more preferably at a dose of 10 8 -10 9 cells (see Ridell et al., 1992, Science 257: 238-241). Infusion can be repeated at desired intervals (eg, monthly). Post-administration recipes may be monitored during or after T-cell infusion for any side effects as needed. At this time, it is preferable that the T cells have the same patient strength as the patient who obtained the ⁇ cells.
  • the T cells can also be harvested from the patient and the dendritic cells used to stimulate the T cells can be from a healthy HLA-compatible donor.
  • dendritic cells may be collected from patients and T cells may be derived from HLA-compatible healthy donors!
  • Cells containing ⁇ cells which are the active ingredients of the vaccine produced according to the present invention, are inoculated as a therapeutic vaccine into the human body, and thus it is safer if the cell proliferation is eliminated.
  • ⁇ cells which are the active ingredients of the vaccine produced according to the present invention
  • the proliferative capacity of cord blood-derived monocytes is extremely reduced by induction, but heat treatment, radiation treatment, or mitomycin C is necessary for safe use as a cell vaccine. It is possible to eliminate the proliferation property by treating it with a treatment, etc., while retaining the function as a vaccine.
  • irradiation can be performed at a total radiation dose of 1000-3300 Rad.
  • dendritic cells can be supplemented with 25-50 micro-g / ml mitomycin C and incubated at 37 ° C for 30-60 minutes.
  • heat treatment can be performed at 50 to 65 ° C for 20 minutes.
  • Monocytes were enriched by negative selection from healthy subjects.
  • GM-CSF 500 U / ml
  • IL-4 250 U / ml
  • DCs were prepared.
  • half of the culture supernatant was replaced with a new culture solution having the same composition.
  • CDl lc, HLA-class II (DR, DP, DQ) was positive, and that other lineage markers (CD3, CD56, CD19, CD15 and It was also confirmed that CD14) was not expressed (Fig. 1 and data not shown).
  • the efficiency of vector introduction was examined. At this time, 90-98% of the living cells expressed DC markers (CDllc, HLA-class II (DR, DP, DQ)).
  • the selection in this example can be carried out in the same manner by using magnetic beads coated with a force antibody using the above kit.
  • a large number of cells such as by collecting mononuclear cells using blood cell separation or the like, it is preferable to use beads.
  • GFP green fluorescent protein
  • Sendai virus vector (SeV-GFP) (propagation type, WO00 / 70070) was infected with MOI, and changes in cell number, GFP expression, and costimulatory molecules expression over time were examined.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • the MFI of GFP can be further increased by increasing the MOI to 100 (data not shown).
  • the costimulatory molecules CD80 and CD86
  • the maximum was observed at an overall MOI of 20 or more.
  • the MOI did not change much between 1 and 20, but the MOI 50 tended to decrease slightly, but there was no significant difference (Fig. 6).
  • DCs were infected with SeV-GFP at MOI 20 and GFP expression was examined over time using FACS. As a result, expression decreased (the number of cells also decreased) after 2 weeks, but expressed cells could be confirmed up to 2 months (Fig. 7).
  • DCs are activated by infection with a minus-strand RNA virus vector. Therefore, gene transfer into DC using a minus-strand RNA virus vector can be applied to vaccines as clinical application. Administration can be performed in vivo or in vivo, but, for example, it is possible to maintain gene expression in the body for a long period of time by frequently administering DCs infected with the vector by in vivo administration.
  • CD34-positive stem cells were isolated from human umbilical cord blood using CD34 microbeads (CD34> 90%), infected at MOIs 0, 10, and 100, and washed well. After adding SCF (50 ng / ml), GM-CSF (500 U / ml) and TNF-alpha (50 ng / ml) to RPMI + 10% FCS, and culturing for 3 days, SCF (50 ng / ml) was added. ml), GM-CSF (500 U / ml), IL-4 (250 U / ml), and TNF-alpha (50 ng / ml).
  • DCs were infected with SeV-GFP at MOI 30 (3 days after infection, 1 day after infection, one group was stimulated with LPS), and the same group as in Experiment 1 was examined for phagocytic ability (1 micron -m Use PCV-RED latex-microspheres, bar graph minus background that is positive at 4 ° C).
  • Monocyte-derived monocytes obtained by culturing for 7 days were cultured in a 12-well plate for 48 hours in order to examine the ability of the dendritic cells to generate force associated with the activation of dendritic cells by SeV. (8xl0 5 / 2ml / well: medium is X- vivol5 TM + 2% autologous serum + GM-CSF (500 U / ml) + IL- 4 (250 U / ml)), on cultured under the conditions of the following groups The values of TNF-alpha, IL-lbeta, IL-6 and IL-8 in Kiyonaka were measured by Luminex TM system. SeV infection was cultured at MOI 30 for 2 days.
  • Allantoic fluid group Chicken egg serum (seV is not included), a suspension of SeV, with 60 micro-L added
  • UV-SeV-GFP group A solution obtained by irradiating SeV-GFP solution with ultraviolet light and removing replication ability.
  • SeV-GFP A group prepared by adding 60 micro-L to a SeV-GFP solution (replication-competent SeV) Result: Only dendritic cells transfected with GFP by replication-competent SeV It produced TNF-alpha, IL-1beta, and IL-6, and increased the production of IL-8 (FIG. 18). At this time, increased expression of CD40, CD80, CD83, CD86 and HLA-DR on dendritic cells
  • the DCs were irradiated with 3000 rad, and then examined for their ability to activate T cells. (Dose-filled DCs and co-cultured with purified (CD3 +> 95%) aro or syngenic T cells for 3 days). Syngenic T cells were used as an indicator of the response to SeV-GFP.
  • CD14 + cells were enriched from human peripheral blood (healthy donor of HLA-A0201) by the method described in A, and GM-CSF (500U) was prepared using X- vivo 15 TM (manufactured by Cambrex) + 2% autologous serum as a medium. / ml) and IL-4 (250 U / ml), and immature dendritic cells were prepared by adding casket (exchanging a half amount of medium once every 3-4 days). Divide the prepared immature ⁇ cells into the following 3 groups
  • the cells were cultured in the presence of GM-CSF (500 U / ml) and IL-4 (250 U / ml).
  • cytokinin cocktail (IL-1 ⁇ 50ng / ml, IL-6 500ng / ml, IFN-a 2500U / ml, TNF-alOOng / mU PGE2 20 micro-M)
  • the dendritic cells were collected and pulsed with MART-1 peptide (EAAGIGILTV (SEQ ID NO: 9) (50 micro-g / ml; 3 hours), and the same peripheral cells as those from which healthy cells were collected were collected.
  • Blood T The cells were concentrated by negative selection (CD3 +> 97%) and cultured for 7 days with peptide-pulsed three groups of dendritic cells (X- vivo 15 TM + 2% autologous serum). (Every half of the medium was replaced every 3-4 days or when the medium yellowed.
  • T cells and ⁇ cells were mixed and cultured without IL-2, and IL-2 was removed from day 3) This was repeated twice, and cells were collected from each mixed culture and used as effector cells for the CTL assay.
  • T2 cells T cell-B cell hybridoma obtained from HLA-A2 + human and TAP deficient cell line
  • TAP transporter to class I
  • these cells lack TAP (transporter to class I)
  • they cannot induce peptides produced by degradation of cytoplasmic proteins into class I. Loaded, Class I expression occurs.
  • This target was pulsed with a mutated MART-1 peptide (ELAGIGILTV (SEQ ID NO: 10)) (a T cell receptor recognition site that has no change with respect to the peptide used in the above stimulus has increased HLA-A2 binding)
  • ELAGIGILTV a mutated MART-1 peptide
  • GILGFVFTL a peptide as a third party
  • CTL activity was determined by mixing and culturing at 20: 1, 10: 1, 5: 1 and 2.5: 1 for 4 hours.
  • MART-1 was stimulated with DC (MARTI peptide +) and stimulated with T cells by DC of the above 3 groups. Although specific CTL cannot be induced, MART-1-specific CTLs could be induced by stimulating T cells in dendritic cells activated by force-in (currently the most potent method of dendritic cell therapy for tumor immunity) (pulse to target) Similar results were obtained when the MART-1 peptide used for stimulation was used instead of the mutant MART-1 peptide). When the dendritic cells transfected with SeV were used, the same level of CTL activity as the positive control was obtained (FIG. 22).
  • dendritic cells when determined by CTL assay, dendritic cells were activated only by infection with SeV, and CTLs could be induced in vitro to the same level as dendritic cells activated by cytodynamics. . If SeV is used as a T cell activator, activation can occur along with the introduction of the target gene, eliminating the need to add an activation factor such as cytokines, thereby reducing cost, time, and cell viability. Contributes to the retention of
  • bone marrow was collected from the femur of C57BL / 6 mice, and SpinSep TM, murine hematopoetic progenitor enrichmentcocktail (anti-CD5 antibody, anti-CD45R antibody, iHiCDllb antibody, iHiGr-1 antibody, anti-TER119 antibody, anti 7/4 After removing T cells using an antibody and StemCell technology), IL-4 and GM-CSF were added, and cultured for 1 week. Mice were inoculated subcutaneously (sc) in the abdomen on day 0 with 1 x lOVlOO micro-L of B16 melanoma cells.
  • sc subcutaneously
  • dendritic cells without activation stimulation, dendritic cells activated with LPS (LPS DC), or SeV-IFN ⁇ expressing SeV-GFP or mouse interferon 13
  • LPS LPS
  • the activated dendritic cells (SeV GFP DC or SeV IFN
  • ⁇ cells were pulsed with a tumor antigen (tumor lysate by freeze and thaw of B16) to administer a force.
  • a tumor antigen tumor lysate by freeze and thaw of B16
  • dendritic cells cultured for 1 week as described above were infected with SeV-IFN ⁇ at ⁇ 40 and cultured for 8 hours.
  • SeV-IFN j8 was infected at MOI 40 and cultured for 8 hours. Thereafter, these dendritic cells were collected, and 5xl0 5 to 5 cells were administered around the mouse tumor.
  • NK NK
  • spleens were excised from mice 7 days after the completion of three DC treatments for each of the above treatment groups, and effector cells were prepared. Using Yac-1 as a target, a 51 Cr release assay was performed.
  • the remaining spleen cells used for the NK cell activation assay were used, and the cells cultured for 5 days together with the TRP-2 peptide, a B16 tumor antigen, were used as an effector.
  • the cells were used as cells, co-cultured with mTRP-2 peptide-pulsed EL-4 target cells, and subjected to 51 Cr release assays. The percentage of specific 51 Cr release was calculated as follows.
  • the vector of the present invention is suitably used for inducing protective immunity against infectious diseases such as viruses and bacteria, and for immunotherapy against cancer. Since dendritic cells have a high immunity-inducing effect, antigen-specific cellular immunity is induced by introducing a desired antigen gene or immunoreactive gene into dendritic cells by the method of the present invention. It will be possible to produce DC vaccines.

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Abstract

　本発明は、マイナス鎖RNAウイルスを樹状細胞を接触させる工程を含む、樹状細胞に遺伝子を導入する方法を提供する。また本発明は、遺伝子が導入された樹状細胞の製造方法であって、マイナス鎖RNAウイルスと樹状細胞とを接触させる工程を含む方法を提供する。また本発明は、この方法により製造された、遺伝子が導入され樹状細胞を提供する。さらに本発明は、マイナス鎖RNAウイルスと樹状細胞とを接触させる工程を含む、樹状細胞を活性化させる方法を提供する。本発明により、樹状細胞への効率的な遺伝子送達が可能となった。抗原遺伝子またはサイトカイン遺伝子を導入された樹状細胞はワクチンとして有用である。

Description

遺伝子導入された樹状細胞の製造方法
技術分野
[0001] 本発明は榭状細胞に遺伝子を導入する方法に関する。本発明の方法は、癌およ び感染症などに対するワクチンの製造のために利用できる。
背景技術
[0002] 榭状細胞（dendritic cell; DC)は末梢血液、皮膚、リンパ器官及び胸腺などに存在 する抗原提示細胞（APC)の 1つであり、リンパ組織及び非リンパ組織に広く分布して いる (Steinman, R. M. 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:271; Banchereau, J.B.および R.M. Steinman, 1998, Nature 392:245参照）。榭状細胞は強力な抗原提示能を有し 、榭状細胞上のクラス I、クラス IIに抗原ペプチドを発現させ、それぞれ、 CD4、 CD8 T 細胞を活性化する。これにより特定の抗原 (病原微生物の抗原、腫瘍関連抗原、移 植抗原など）に対する生体内の免疫応答を誘導する。
[0003] 榭状細胞の遺伝子改変は、臨床上の様々な有益な効果をもたらす。例えば、 T細 胞応答に必要な副刺激を誘導する分子 (CD80、 CD86など)を発現する成熟榭状細 胞を作製すれば、この榭状細胞を用いて抗原に対する強力な適応免疫の賦活化 ( 例えば、ウィルスや腫瘍に対するワクチンなど）が可能であるし、副刺激を誘導する分 子のない、あるいは、抑制性の刺激を与える分子を発現する榭状細胞を使用すれば 、抗原に対する免疫寛容 (例えば、移植抗原や自己免疫性疾患の原因となる抗原に 対する不応答性の獲得など)を誘導することができる。これらの適用例として、例えば 榭状細胞へのインターロイキン（ID- 12遺伝子の導入による免疫賦活ィ匕（Gene Therapy 2000; 7,2113-2121)、および Fasリガンド遺伝子の導入による抗原特異的 T 細胞の除去 (J Immunol. 200: 164; 161-167)などが報告されている。また腫瘍免疫治 療に関しては、榭状細胞に腫瘍抗原を遺伝子導入することによって、腫瘍に対する 免疫を誘導することが期待できる。
非特許文献 1 : Steinman, R. M., 1991, Ann. Rev. Immunol. 9:271
非特許文献 2 : Banchereau, J.B.および R.M. Steinman, 1998, Nature 392:245 非特許文献 3 :Akiyama, Y. et al, 2000, Gene Therapy, 7: 2113-2121 非特許文献 4 : Min, W.P., 2000, J. Immunol, 164: 161-167
非特許文献 5 : Hsu, F.J. et al" 1996, Nat. Med. 2, 52-58
非特許文献 6 : Nestle, F.O., et al" 1998, Nat. Med. 4, 328-332
非特許文献 7 : Camporeale, A., et al., 2003, Cancer. Res. 63, 3688-3694 非特許文献 8 : Bon, L. A., et al., 2003, Nat. Immunol. 4, 1009-1015
非特許文献 9 : Xia, D.J., et al., 2002, Gene therapy , 9, 592-601
非特許文献 10 : Mullins, D.W. et al" 2003, J. Exp. Med. 198, 1023-1034 非特許文献 l l : Okada, T. et al" 2003, Gene therapy 10, 1891-1902
非特許文献 12 : Nakahara, S. et al., 2003, Cancer Res. 63, 4112-4118
非特許文献 13 : Teitz- Tennenbaum, S. et al" 2003, Cancer Res. 63, 8466-8475 非特許文献 14 : Imboden, M. et al., 2001, Cancer Res. 61, 1500—1507
非特許文献 15 : Goldszmid, R. S. et al., 2003, J. Immunol. 171, 5940-5947 非特許文献 16 : Strome, S.E. et al" 2002, Cancer Res. 62, 1884-1889
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] 本発明は、榭状細胞に遺伝子を導入する方法を提供する。また本発明は、遺伝子 が導入された榭状細胞の製造方法を提供する。また本発明は、本発明の方法により 遺伝子導入された榭状細胞の利用を提供する。また本発明は、本発明の方法により 遺伝子が導入された榭状細胞を提供する。さらに本発明は、榭状細胞への遺伝子導 入のためのウィルスベクターを提供する。また本発明は、榭状細胞を活性化する方 法を提供する。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは榭状細胞への遺伝子導入のた めの非常に優れたベクターであることを見出した。遺伝子導入効率は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを短時間榭状細胞に接触させるだけでよぐ発現は長期にわた つて検出可能であった。また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを榭状細胞に感染さ せるだけで、榭状細胞を活性化させることができた。 榭状細胞への遺伝子導入は様々な免疫療法への適用が期待されているが、これま で榭状細胞への遺伝子導入手法は煩雑であったり、導入効率が十分ではな力つた。 本発明により、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いて、非常に単純な手順で、榭 状細胞に外来遺伝子を導入することができることが実証された。本発明の方法を用 いれば、榭状細胞への遺伝子送達を効率的に実施することが可能となり、免疫療法 における榭状細胞の遺伝子改変への適用が期待される。
すなわち本発明は、榭状細胞に遺伝子を導入する方法等に関し、より具体的には 、請求項の各項に記載の発明に関する。なお同一の請求項を引用する請求項に記 載の発明の 1つまたは複数の組み合わせ力 なる発明は、それらの請求項に記載の 発現に既に意図されている。すなわち本発明は、
〔1〕遺伝子導入された榭状細胞の製造方法であって、榭状細胞またはその前駆細 胞にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させる工程を含む方法、
〔2〕成熟榭状細胞の製造方法であって、榭状細胞またはその前駆細胞にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させる工程を含む方法、
〔3〕接触工程が、未成熟榭状細胞にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させるェ 程である、〔1〕または〔2〕に記載の方法、
〔4〕接触工程が、 CD34+細胞にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させる工程で ある、〔1〕から〔3〕のいずれかに記載の方法、
〔5〕接触前または後の細胞を GM-CSFおよび IL-4存在下で培養する工程さらに含む 、〔1〕から〔4〕のいずれかに記載の方法、
〔6〕該ベクターがサイト力イン遺伝子を有する、〔1〕から〔5〕の ヽずれかに記載の方法
〔7〕サイト力インがインターフェロン βである、〔6〕に記載の方法、
〔8〕マイナス鎖 RNAウィルスベクターがパラミクソウィルスベクターである、〔1〕から〔7〕 のいずれかに記載の方法、
〔9〕パラミクソウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、〔8〕に記載の方法
〔10〕細胞がヒト細胞である、〔1〕から〔9〕の 、ずれかに記載の方法、 〔11〕〔1〕から〔10〕のいずれかに記載の方法により製造された、該ベクターを保持す る細胞、
〔12〕成熟榭状細胞である、〔11〕に記載の細胞、
〔13〕〔11〕または〔12〕に記載の榭状細胞を腫瘍部位に投与する工程を含む、腫瘍 増殖を抑制する方法、
〔14〕榭状細胞に腫瘍抗原を接触および/または発現させる工程をさらに含む、〔13〕 に記載の方法、に関する。
発明の効果
[0007] 榭状細胞は高い免疫誘導能を有するため、本発明の方法により所望の抗原遺伝 子または免疫活性ィ匕遺伝子を榭状細胞に導入することにより、癌および感染症など の免疫治療に有用な榭状細胞 (DC)ワクチンを製造することが可能となる。例えば、 腫瘍免疫治療に関しては、榭状細胞に腫瘍抗原を提示をさせるために、腫瘍細胞の cell lysate (細胞溶解物）と混合する方法、ペプチドパルスする方法、および榭状細 胞に腫瘍抗原遺伝子を導入する方法などを用いることができる。これらの中でも榭状 細胞に腫瘍抗原を遺伝子導入する方法は、腫瘍ライセートおよびペプチドパルスより も in vivoでの腫瘍抗原提示時間の延長が期待でき、さらに HLAの制限 (ペプチドの 場合；ペプチドは抗原由来のあるペプチドを使用するが、 HLAとの結合の関係上、 HLAの種類が変われば、その抗原の中の使用するペプチドの部位が変化する）など を受けなくなる利点を有する。
[0008] 榭状細胞に遺伝子を導入するベクターとして、プラスミドを導入するリボソーム法、 electroporationなどある力 導入効率が低ぐ非実用的とみなされている（Cancer gene Ther 1997, 4, 17-25s)。実用的なベクターとして、以下の 3種類のベクターがあ る。 0アデノウイルスベクター（J. Immnotherapy 2002; 25; 445-454, Gene therapy 2000; 7; 249- 254)、 ii)レトロウイノレスベクター（J. Leuko. Biol, 1999; 263-267., Br. J. Haematol. 2000; 108; 817- 824)、 m)レンチウィルスベクター（J. Gene Med. 2001; 3; 311-320, J. Immunol. Meth. 2002; 153-165, Mol. Ther., 2002; 283-290, Cancer Gene Therapy 2002; 9: 715—724)。
[0009] これらのうち、 ii)のレトロウイルスベクターは増殖期の細胞にしか導入できない。ま た、細胞傷害性のあるポリプレンなどの導入補助因子が必要で、導入に時間がかか る。そのため、細胞の viability (生存性）が低下しやすいという欠点がある。また、末梢 血より誘導された榭状細胞へは導入効率がさらに悪いため、一般に、 CD34陽性の細 胞にベクターを導入した後に、榭状細胞へ分化誘導するという方法が使用される。こ のとき、骨髄細胞や臍帯血や G-CSFで immobilizationした末梢血が必要となるので、 非常に患者に侵襲的である。また、榭状細胞へのレトロウイルスベクターの導入は、 榭状細胞の活性ィ匕状態を上げることができない。また、レトロウイルスベクターは、ウイ ルス核酸を細胞のゲノムに組み込むため、ゲノム損傷が懸念される。また、一般に導 入効率が低ぐソーティングなどによりベクター導入細胞のセレクションが必要である iii)のレンチウィルスベクターも、レトロウイルスベクターと同様、ベクターの導入に時 間がかかる。そのため、細胞の viabilityが低下する可能性がある。レンチウィルスは静 止期の細胞にも遺伝子を導入することで知られているが、榭状細胞がある程度分ィ匕 し、増殖活性を失った時の効率は、 postentry restriction (J. Virol.; 75; 5448-5456) のため概して非常に悪い (数％)。また、末梢血より誘導された榭状細胞へは導入効 率がさらに悪いため、 CD34陽性の幹細胞に導入した後に in vitroで榭状細胞を得る t 、う方法でし力使用できな 、（この際、骨髄細胞や臍帯血や G-CSFで immo bilizationした末梢血が必要となり、患者に侵襲的である)。この問題は、近年のベクタ 一改変技術によって克服されつつあり、 SIVの場合、 helper constructにおいて vpx( proviral DNAの核内移行を促進する）を残すことによって、あるいは、 HIVで DNA-flap シーケンスの挿入（これも proviral DNAの核内移行を促進する）することによって、末 梢血由来単球及び分ィ匕した榭状細胞への遺伝子導入が可能となった (Mol. Ther. 2002; 283-290) oしかし、尚も、単球より榭状細胞を分化させる早期の段階で感染さ せる必要があるので、榭状細胞の分化が挿入遺伝子によって、障害を受ける可能性 がある。また、導入効率がドナー間でばらつきがある。また、ベクターの導入は榭状細 胞の活性ィ匕状態を上げることができない。また、上記のレトロウイルスベクターと同様 、ゲノム損傷、悪性腫瘍発生の危険性があり、現時点での実用化の障壁となっている 。また、導入効率が低ぐ一般にセレクションが必要であったり、導入効率の改善のた めに導入に高い濃度のタイターが必要で、臨床応用に適用しにくい。また、遠心など の補助操作または polyblenなどの補助因子が必要となり、導入手技が煩雑で、長時 間必要となる。また、ベクターの精製にコストがかかる問題もある。
[0011] 一方、 0のアデノウイルスに関しては、その導入効率 (約 80%)と分化した榭状細胞 へ直接遺伝子導入できることから、榭状細胞遺伝子導入用ベクターとして期待されて いるが、導入所要時間は時間依存性で最大導入効率を得るために 72時間程度必要 (J. Immnotherapy 2002; 25; 445- 454)である。さらに、マイナス鎖 RNAウィルスと比較 し、 10倍一 100倍のタイターが必要である。さらに決定的なことには、遺伝子導入効率 を高くする MOIではァロ T細胞の混合リンパ球反応（mixed lymphocyte reaction; MLR )を低下させる免疫抑制作用がある（Gene Therapy 2000; 7; 249-254)ことが問題とな つている（特に高い DC:Tの比率で）。また、 episomeの希釈のため、 CD34陽性細胞な どの幹細胞に遺伝子導入後に榭状細胞を分化させる方法が困難になることがある。
[0012] 榭状細胞への遺伝子導入のために必要な条件としては、高！ヽ導入効率、遺伝子導 入の手技的安定性、簡便性、臨床的安全性、榭状細胞の T細胞活性化能力保持な どが挙げられる力 これまで、これらの条件を全て兼ね備えたベクターが存在すると は言いがたかった。これに対してマイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いた場合、遺 伝子導入は非常に短期間の接触で終了し、 100%近い導入効率を得ることができ、し 力もァロ T細胞応答の抑制程度は比較的軽度であり、 T細胞の刺激性が保持された。 マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、細胞質内で蛋白発現能力を所持し、核内への 移行やゲノムへの遺伝子挿入の必要性がなく安全であることを考慮に入れると、上記 のすベての条件を満たしたベクターであるといえる。また、免疫賦活 (腫瘍免疫など） に使用するにあたって、上記の 0から iii)のベクターでは遺伝子導入によって榭状細 胞の活性ィ匕状態が変化しな ヽが、マイナス鎖 RNAウィルスベクターの遺伝子導入は 榭状細胞の活性ィ匕を惹起するため、導入後のサイト力インなどでの活性ィ匕処理のェ 程が省略可能で、細胞の viabilityの維持やコスト削減、さらなる ex vivoでの操作時間 の削減に寄与するものと考えられる。また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターで遺伝子 導入された榭状細胞を用いて、 T細胞移入療法に必要な活性化 T細胞、特に腫瘍特 異的細胞傷害性 T細胞などを ex vivoで効率良ぐ短期間、簡単に誘導できることも確 認された。更には、ベクターを幹細胞に遺伝子導入後に榭状細胞を分化させた場合 の導入効率も約 70%近くに達し、レンチウィルスベクターに匹敵した。これらの特徴は 、臨床応用におけるマイナス鎖 RNAウィルスベクターの適応範囲を拡大させる。 図面の簡単な説明
[図 1]末梢血単球濃縮細胞の単核細胞に由来する榭状細胞の表現型を示す図であ る。 PIで判別できた生細胞にゲートをかけ、抗 CD 11c- PE結合抗体及び抗 HLA- class II(DR,DP,DQ) FITC結合抗体を用いて、 CDllcおよび HLA- class II(DR,DP,DQ)の 発現を観察した（左のマトリックス）。更に CDllcおよび HLA- class II(DR,DP,DQ)力 S 共に陽性のゲートを選択し、 1)抗 CD14-APC結合抗体、 2)抗 CDla-APC結合抗体、 3)抗 CD80-biotin結合抗体（2次的にストレプトアビジン- APCで染色）を使用して、そ れぞれの発現レベルを CDllcとのドットプロットで示した（右の 3つのマトリックス）。な お、実施例中の〃 Class Π〃は HLA- DR、 DQ、 DPを全て認識する抗体を使用した結果 を、 "HLA-DR〃は HLA-DRを特異的に認識する抗体を使用した結果を表す。
[図 2]SeV- GFPを導入した DCにおける GFPおよび costimulatory moleculesの発現を 示す図である。
[図 3]ヒト単球由来榭状細胞への SeV-GFPの導入効率と榭状細胞の活性ィ匕を示す図 である (感染後 2日目）。
[図 4]ヒト単球由来榭状細胞への SeV-GFPの導入効率と榭状細胞の活性ィ匕を示す図 である (感染後 4日目）。
[図 5]ヒト単球由来榭状細胞への SeV-GFPの導入効率と榭状細胞の活性ィ匕を示す図 である (感染後 8日目）。
[図 6]SeV-GFP導入後の DC数の変化を示す図である。
[図 7]SeV- GFP導入後の GFP発現期間を示す図である。
[図 8]ヒト DCへの SeV-GFP導入導入効率における LPS刺激の効果を示す図である。
[図 9]ヒト DCへの SeV-GFP導入導入効率における LPS刺激の効果を示す図である。
[図 10]DCへの遺伝子導入におけるインキュベーション時間の検討結果を示す図で ある。
[図 11]臍帯血由来の DCへの遺伝子導入を示す図である。 [図 12]臍帯血由来の DCへの遺伝子導入を示す図である。
[図 13]遺伝子導入後の costimulatory moleculesの発現を示す図である（LPS刺激との 比較)。
[図 14]遺伝子導入後の costimulatory moleculesの発現を示す図である（LPS刺激との 比較)。
[図 15]遺伝子導入後の costimulatory moleculesの発現を示す図である（LPS刺激との 比較)。
[図 16]遺伝子導入後の貪食能を示す図である。
[図 17]遺伝子導入後の貪食能を示す図である。
[図 18]マイナス鎖 RNAウィルスベクターの導入後の単球由来 DCのサイト力イン産生を 示す図である。
[図 19]マイナス鎖 RNAウィルスベクターの導入後の榭状細胞上のマーカー蛋白質の 発現を示す図である。
[図 20]マイナス鎖 RNAウィルスベクターの導入後の榭状細胞上のマーカー蛋白質の 発現を示す図である。
[図 21]SeV-GFPを導入した DCのァロ T細胞刺激能を示す図である。
[図 22]マイナス鎖 RNAウィルスベクターの導入により、 MART-1特異的 CTLをインビト 口で誘導した結果を示す図である。
[図 23]皮下接種された B16メラノーマ細胞の増殖曲線を示す図である。
[図 24]YAC-1ターゲット細胞の51 Cr放出アツセィの結果を示す図である。
[図 25]TRP2ペプチド +EL- 4の51 Cr放出アツセィの結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
本発明は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用いて遺伝子導入された榭状細胞を 製造する方法を提供する。この方法は、導入したい所望の遺伝子を保持するマイナ ス鎖 RNAウィルスベクターを、榭状細胞またはその前駆細胞に接触させる工程を含 む方法である。本発明者等は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターが極めて高い効率で 榭状細胞へ遺伝子を導入できることを見出した。しかもベクターの導入は榭状細胞を 活性化させ、サイト力インで刺激することなしに成熟榭状細胞に分化させた。得られ た成熟榭状細胞は、 τ細胞を活性ィ匕する能力を保持していた。本発明の方法は、榭 状細胞に所望の抗原を提示させたり、あるいは榭状細胞で所望のサイト力インまたは その他の生理活性因子を発現させるために有用である。本発明の方法により遺伝子 改変された榭状細胞は免疫系を活性ィヒする高い能力を有しており、感染症、癌、そ の他、免疫誘導により有益な効果を期待できる所望の疾患の予防および治療におい て好適に用いられ得る。ベクターと榭状細胞との接触は、 in vivoまたは in vitroで行う ことができ、例えば培養液、生理食塩水、血液、血漿、血清、体液など所望の生理的 水溶液中で実施すればょ ヽ。
[0015] マイナス鎖 RNAウィルスベクターの導入効率は、榭状細胞が非活性化状態 (未成 熟状態)の方が、成熟榭状細胞に対するものよりも有意に高い。従って、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、未成熟榭状細胞に接触、または未成熟榭状細胞を含む細 胞画分と混合することが好ましい。そのような方法も、本発明における榭状細胞に遺 伝子を導入する方法に含まれる。榭状細胞は、細菌またはリポポリサッカライド (LPS) 、二本鎖 RNAなどとの接触により活性化される。遺伝子導入する榭状細胞をこのよう な方法で別途活性化させる場合は、活性ィ匕してカゝらベクターを導入してもよいが、ベ クタ一の導入効率が低下しな ヽようにするため、活性化の操作をベクターの導入前で はなぐマイナス鎖 RNAウィルスベクターにより遺伝子を導入した後（またはマイナス 鎖 RNAウィルスベクターを榭状細胞に接触させるのと同時）に行うことが好ま 、。
[0016] 単純な技術により高い効率で遺伝子送達が起こることは、マイナス鎖 RNAウィルス ベクターを介した榭状細胞への遺伝子送達の重要な優位性の 1つである。レトロウイ ルスベクターなどを介した榭状細胞への遺伝子送達は効率が低ぐさらに遺伝子導 入の際にポリプレンなどの毒性のある薬剤を必要とする場合がある。一方でマイナス 鎖 RNAウィルスベクターは特別な薬剤を必要とすることなぐ単に榭状細胞を含む溶 液中にベクターを添加するだけでより優れた遺伝子送達を達成することができた。さ らに、榭状細胞へのマイナス鎖 RNAウィルスベクターを介する遺伝子送達は、非常に 短い暴露 (30分以下)で最適効率を達成することができた。臨床場面を考えると、これ らの特徴は、榭状細胞の ex vivoおよび in vivoなどにおける遺伝的改変を単純ィ匕し、 操作に依存した細胞生存性の喪失などの悪影響を最小化し得るものである。 [0017] ベクターと榭状細胞との接触においては、 MOI (多重感染度；細胞 1つあたりの感染 ウィルス数）は 1一 500の間にすることが好ましぐより好ましくは 2— 300、さらに好ましく は 3— 200、さらに好ましくは 5— 100、さらに好ましくは 7— 70である。ベクターと榭状細 胞との接触は短い時間でも十分であり、例えば 1分以上、好ましくは 3分以上、 5分以 上、 10分以上、または 20分以上接触させればよぐ例えば 1一 60分程度、より特定す れば 5分一 30分程度であってよい。もちろん、それ以上の時間接触させてもよぐ例え ば数日間またはそれ以上接触させてもよい。接触は体内でも体外でも実施し得る。 例えば、体内から取り出した榭状細胞またはその前駆細胞を体外でマイナス鎖 RNA ウィルスベクターと接触させ、ベクターを導入後に体内に戻す ex vivo遺伝子導入に おいて、本発明の方法は好適に用いられる。
[0018] また、本発明の方法の特徴の 1つは、榭状細胞へ遺伝子を導入した後、長期間に わたって導入遺伝子の発現が持続することである。本発明の方法により、ベクターを 榭状細胞に感染させてから 2日間以上、例えば 3日間以上、 5日以上、 10日以上、 14 日以上、 30日以上、 50日以上、さらに 60日以上にわたって、導入細胞において導入 遺伝子の発現が検出される。
[0019] また本発明は、未成熟榭状細胞に選択的に遺伝子を導入する方法であって、該遺 伝子を保持するマイナス鎖 RNAウィルスベクターを、未成熟榭状細胞および成熟榭 状細胞を含む細胞集団中に共存させる工程を含む方法を提供する。未成熟榭状細 胞に選択的とは、成熟榭状細胞に比べ未成熟榭状細胞へ有意に高!、割合で遺伝 子が導入されることを言う。すなわち、全成熟榭状細胞中でベクターが導入された成 熟榭状細胞の割合よりも、全未成熟榭状細胞中でベクターが導入された未成熟榭状 細胞の割合の方が、有意に高い。例えば本発明は、導入したい遺伝子を保持するマ イナス鎖 RNAウィルスベクターを、未成熟榭状細胞および成熟榭状細胞を含む細胞 集団中に添加する工程を含む方法を提供する。マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、 成熟榭状細胞に比べ未成熟榭状細胞へ優先的に遺伝子を導入するので、この方法 により未成熟榭状細胞に選択的に遺伝子を導入することができる。これらの方法も、 本発明における榭状細胞に遺伝子を導入する方法に含まれる。
[0020] 榭状細胞 (Dendritic cell; DC)とは、成熟状態にお!、て樹枝状形態をとり、抗原を 提示して T細胞を活性ィ匕する能力を持つ細胞である。榭状細胞には、生体内各種組 織器官に分布する骨髄細胞由来の榭枝状形態をとる細胞群、および骨髄または血 液由来の幹細胞から、 in vitroでサイト力イン等を利用して分ィ匕誘導をかけた生体内 組織器官に分布する樹枝状形態をとる細胞と同等の細胞群が含まれる。具体的には 、榭状細胞には、例えばリンパ球系榭状細胞 (Th2への誘導または免疫寛容を誘導 するものであってもよい）、骨髄球系榭状細胞（一般的に用いられる榭状細胞。未熟 榭状細胞および成熟榭状細胞を含む)、ランゲルハンス細胞 (皮膚の抗原提示細胞 で重要な榭状細胞）、相互連結細胞（リンパ節、脾臓の T細胞領域にあり、 T細胞への 抗原提示に働 ヽて ヽると考えられて！/ヽる細胞）、ろ胞榭状細胞 (B細胞への抗原提示 細胞として重要、抗原と抗体複合体、抗原と補体複合体を抗体レセプター、補体レセ プターにより、榭状細胞上に提示することで、 B細胞に抗原提示している。）などを含 むものであり、好ましくは、 MHCクラス Iおよびクラス IIを高発現しており、さらに好ましく は CD1 lcを発現して!/、る細胞である。
[0021] また、榭状細胞は、榭枝状形態を有し、 CDllc、 HLA-class II (HLA-DR、 - DP、ま たは - DQ)、 CD40、および CDlaからなる群より選択される表面マーカーの 2つ以上 が陽性の細胞であってよい。本発明において榭状細胞は、より好ましくは、
HLA-class 11+および CDllc+の細胞、より好ましくは CDla+、 HLA-class II+、および CDllc+の細胞で、かつ T細胞マーカー（CD3)、 B細胞マーカー（CD19、 CD20)、 NK 細胞マーカー（CD56)、好中球マーカー（CD15)、単球マーカー（CD14)を発現して ない細胞である。ベクターの導入に使用される榭状細胞集団の CD14+の割合は、例 えば 10%以下、好ましくは 5%以下、更に好ましくは 1%以下がよい。
[0022] また、本発明にお 、て榭状細胞には成熟榭状細胞および未成熟榭状細胞が含ま れる。未成熟榭状細胞とは、 T細胞活性化能力が低い榭状細胞を言う。具体的には 、未成熟榭状細胞は、 LPS (1 micro-g/ml)を添加し 2日間培養して成熟を誘導した 榭状細胞に比べ、抗原提示能が 1/2未満、好ましくは 1/4未満のものであってよい。 抗原提示能は、例えばァロ T細胞活性化能 (混合リンパ球試験;ァロ T細胞と榭状細 胞の混合培養で、 T細胞対榭状細胞の割り合いは 1： 10で培養、好ましくはその比率 を変化させて培養したもので、培養終了 8時間前に3 H- thymidineを添カロし、その T細 胞の DNA内の取込み量によって、 T細胞増殖能力を定量したもの:図 21参照；文献 Gene Therapy 2000; 7; 249-254)、あるいはペプチドを用いた特異的細胞傷害性 T 細胞 (CTL)の誘導能試験 (榭状細胞に、ある抗原のある Class I拘束性の既知のぺ プチドを添加して、榭状細胞を採取したのと同じ健常人末梢血の T細胞を共培養 (3 日目以降は IL-2を 25U/ml、好ましくは 100U/ml) (好ましくは 21日間 3回の榭状細胞に よる刺激、更に好ましくは 14日間 2回の榭状細胞の刺激)し、得られたエフェクター細 胞を51 Crでラベルされたターゲット細胞 (ペプチドの拘束性の Class I陽性の腫瘍細胞 )を 20:1、 10:1、 5:1、 2.5:1、好ましくは 100:1、 50:1、 25:1、 12.5:1で 4時間混合培養し てターゲット細胞の51 Cr遊出量で定量したもの；図 22参照；文献 Arch Dermatol Res 2000; 292; 325-332)により定量することができる。また未成熟榭状細胞は、好ましく は抗原貪食能を持ち、更に好ましくは T細胞活性ィ匕のための副刺激を誘導する受容 体の発現が低発現 (例えば上記のように LPS誘導した成熟 DCに比べ有意に）ある ヽ は陰性である。一方で、成熟榭状細胞とは T細胞活性化などの為の抗原提示能力が 高い榭状細胞を言う。具体的には、成熟榭状細胞は、 LPS (1 micro-g/ml)を添加し 2 日間培養して成熟を誘導した榭状細胞の抗原提示能の 1/2以上、好ましくは同等以 上の抗原提示能を持つ細胞であってよい。また成熟榭状細胞は、好ましくは抗原貪 食能が低いか、または持たず、更に好ましくは T細胞活性ィ匕のための副刺激を誘導 する受容体の発現が高いものをいう。また、榭状細胞の活性化とは、未成熟榭状細 胞から成熟榭状細胞への移行を言い、活性化榭状細胞には、成熟榭状細胞、およ び、活性ィ匕刺激により副刺激を誘導する CD80、 CD86の発現を上昇させている途中 経過の榭状細胞が、その範疇に含まれる。 CDllc陽性の榭状細胞においては、 CD83陽性が成熟榭状細胞の指標とされる。
[0023] 例えば成熟榭状細胞は、好ましくは CD40、 CD80、 CD86および HLA-class IIの発 現が強陽性の細胞であってよい。更に好ましくは、成熟榭状細胞は CD83を発現する 。例えば、 CD80、 CD83、および CD86からなる群より選択されるマーカーを基に、未 成熟榭状細胞と成熟榭状細胞を見分けることができる。未成熟榭状細胞ではこれら のマーカーは弱いか、好ましくは陰性である力 成熟榭状細胞では陽性である。
[0024] 上記のように、未成熟榭状細胞は、通常、高 、貪食能を保持して!/、る。榭状細胞に LPS (1 micro-g/ml)を添加し 2日間培養すると、榭状細胞は活性ィ匕され貪食能は低 下する。貪食能は、榭状細胞内への小分子の取り込み量または取り込み細胞の割合 を測定して知ることができる。好ましくは、貪食能は、榭状細胞内への小分子の取り 込み量で決定される。例えば、 1 micro-m程度の着色ビーズを用いて、榭状細胞内 へのビーズの取り込みを測定することができる。 4°Cで陽性となるバックグランドを差し 引いて定量する。高い貪食能とは、榭状細胞内への小分子の取り込み量が、榭状細 胞を上記のように LPS (1 micro-g/ml)で 2日間刺激した榭状細胞の 4倍以上、より好 ましくは 5倍以上、より好ましくは 6倍以上の貪食能を言う。あるいは、小分子の取り込 み細胞の割合力 ¾倍以上、より好ましくは 3倍以上である。低い貪食能とは、榭状細胞 内への小分子の取り込み量が、 LPS (1 micro-g/ml)で 2日間刺激した榭状細胞の 4 倍未満、より好ましくは 2倍未満、より好ましくは 1.5倍未満である。あるいは、小分子の 取り込み細胞の割合で測定した場合に、 2倍未満、より好ましくは 1.5倍未満である。
[0025] 成熟榭状細胞の判別は当業者が通常行っており、上記の各マーカーおよびその 発現の測定方法も当業者に周知である。例えば CDl lcは約 150 kDの接着糖蛋白 (pl50,インテグリン alpha鎖）である。 CDl lcは CD18と結合して CDl lc/CD18複合体 を形成し、フイブリノ一ゲンへの結合力を有し、また、 iC3bおよび ICAM-1の受容体と なることが報告されている。また、 CDl lc/CD18は刺激を受けた上皮の受容体に結合 する接着分子として働きうることが報告されている（Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Barclay, N.A. et al., eds., 1993, The Leucocyte Antigen FactsBook, CD11 Section, Academic Press Inc., San Diego, California, p. 124; Stacker, S.A. and T.A. Springer, 1991, J. Immunol. 146:648) 0
[0026] CDlaは約 49 kDのポリペプチドで beta 2ミクログロブリンと結合する。 CDlaは MHC class I抗原と構造的に類似しており、抗原提示に機能するとみなされる（Knapp, W. et al., eas., 1989, Leucocyte Typing IV: White し ell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Scnlossman, S. et al., eds., 199b, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Hanau, D. et al., 1990, J. Investigative Dermatol. 95: 503; Calabi, F. and A. Bradbury., 1991., Tissue Antigens 37: 1)。
[0027] CD14は 53- 55 kDのグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI)アンカー型単鎖糖 蛋白で、細網榭状細胞およびある種のランゲルハンス細胞で発現する。 CD14は LPS と血清 LPS結合蛋白質（LPB)の複合体に対する高親和性の表面受容体として同定 された（McMichael, A.J. et al., eds., 1987, Leucocyte Typing III: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Knapp, W. et al., eds., 1989, Leucocyte Typing IV: White Cell Differentiation Antigens, Oxford University Press, New York; Schlossman, S. et al" eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Wright , S.D. et al" 1990, Science 249: 1434) 0
[0028] CD40は 45- 48 kDの I型膜嵌入型蛋白質（type I integral membrane glycoprotein)で あり、抗 CD40抗体は細胞マーカーとしてよく使用されている（Schlossman, S. et al., eds., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Galy, A.H.M.; and H. Spits, 1992, J. Immunol. 149: 775; Clark, E.A. and J.A. Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 4494; Itoh, H. et al" 1991, Cell 66: 233; Barclay, N.A. et al" 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book., Academic Press)。
CD80は約 60 kDの膜貫通型糖蛋白であり Ig supergene familyの一員である。 CD80 は T細胞で発現する CD28および CD152 (CTLA-4)のリガンドである（Schlossman, S. et al., eas., 1995, Leucocyte Typing V: White Cell Differentiation Antigens. Oxford University Press, New York; Schwarts, R.H., 1992, Cell 71: 1065; Azuma, M. et al., 1993, J. Exp. Med. 177: 845; Koulova, L. et al., 1991, J. Exp. Med. 173: 759; Freeman, G.J. et al" 1998, J. Immunol. 161: 2708; Behrens, L. et al" 1998, J. Immunol., 161(11):5943; Guesdon, J.-L. et al., 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131-1139)。
[0029] CD83は約 45 kDの膜貫通蛋白質で Ig superfamilyの一員である。 CD83は短鎖の V 型 Igの細胞外ドメインと C末の細胞質 tailを持つ。 CD83は主にろ胞榭状細胞、循環榭 状細胞、リンパ組織の相互連結（interdigitating)榭状細胞、 in vitroで生成させた榭 状細胞、および胸腺榭状細胞に発現する（Zhou, L-J., and T.F. Tedder, 1995, J. Immunol. 154. 3821; Zhou, L-J. et al., 1992, J. Immunol. 149: 735; Summers, K.L. et al" 1995, Clin Exp. Immunol. 100:81; Weissman, D. et al" 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92: 826; Hart, D.N.J. , 1997, Blood 90: 3245)。
CD86 (B70/B7-2)は約 75 kDの細胞表面蛋白質で CD28および CTLA-4の第 2のリ ガンドであり初期免疫応答における T細胞の副刺激に重要な役割を持つ (Azuma M. et al" 1993, Nature 366: 76; Nozawa Y. et al., 1993, J. Pathology 169: 309; Engle, P. et al. 1994., Blood 84: 1402; Engel, P. et al" CD86 Workshop Report. In:
Leukocyte Typing V. Schlossman, S.F. et al. eds., 1994, Oxford University Press; Yang, X.F. et al., 1994, Upregulation of CD86 antigen on TPAstimulated U937 cells, 1994, (abstract). American Society of Hematology, Nashville, TN; uesdon, J.-し et al" 1979, J. Histochem. Cytochem. 27: 1131—1139)。
[0030] CCR7は BLR-2、 EBI- 1、および CMKBR7とも呼ばれる 7回膜貫通型 G蛋白質結合受 容体であり、 CCケモカインである MIP- 3beta/Exodus 3/ELC/CCL19および
6Ckine/Exodus 2/SLC/TCA4/CCL21の受容体である（Sallusto, F. et al., 1999, Nature 401:708-12; Lipp, M. et al., 2000, Curr. Top. Microbiol. Immunol.
251: 173-9; Birkenbach, M.et al., 1993, J. Virol. 67:2209—20; Schweickart, V. L. et al., 1994, Genomics 23:643-50; Burgstahler, R. et al., 1995, Biochem. Biophys. Res. Commun. 215:737—43; Yoshida, R. et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 13803—9; Yoshida, R. et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:7118-22; Yoshida, R. et al., 1998, Int. Immunol. 10:901-10; Kim, C. H. et al" 1998, J. Immunol. 161:2580-5; Yanagihara, S. et al" 1998, J. Immunol. 161:3096-102)。
[0031] HLA-class IIは DR, DP,および DQがあり、その全てに結合する抗体により網羅的に 検出することができる（Pawelec, G. et al., 1985, Human Immunology 12:165; Ziegler, A. et al., 1986, Immunobiol. 171:77)。 HLA- DRは MHCのヒト class II抗原の 1つで alpha鎖（36 kDa)と betaサブユニット（27 kDa)力もなる膜貫通糖蛋白質である。表皮 のランゲルノヽンス細胞では CDla抗原と共発現する。 CDlaは抗原提示にぉ ヽて細胞 の相互作用に主要な役割を果たす（Barclay, N.A. et al., 1993, The Leucocyte Antigen Facts Book. p. 376. Academic Press)。
[0032] またヒト以外の哺乳動物に関しても、上記のマーカー遺伝子の相同遺伝子産物を 指標に榭状細胞を特定することができる。これらのマーカーに対する抗体は、例えば BD Biosciences社（BD PharMingen)より入手することができ、その詳細は同社または 販売代理店のウェブサイトで知ることができる。
[0033] また、榭状細胞マーカーに関しては、以下の Kiertscherらおよび Oehlerらの文献も 参照のこと（Kiertscher SM, Roth MD, Human CD14+ leukocytes acquire the phenotype and function of antigen— presenting dendritic cells when cultured in GM-CSF and IL— 4, J. Leukoc. Biol., 1996, 59(2):208— 18; Oehler, L. et al.， Neutrophil granulocyte— committed cells can be driven to acquire dendritic cell characteristics., J. Exp. Med., 1998, 187(7):1019- 28)。また、フローサイトメトリーに 関しては、 Okanoら、および Stitesらの文献を参照することができる（Okano, S. et al.， Recombinant Senaai virus vectors ror activated Γ lymphocytes., ene Ther., 2003, 10(lb 1381- 91; Stites, D. et al., Flow cytometric analysis of lymphocyte phenotypes in AIDS using monoclonal antibodies and simultaneous dual
immunofluorescence . , Clin. Immunol. Immunopathol., 1986, 38:161-177)。各マ ~~力 一の発現については、例えば、 isotype control antibodyで染色した時に、陽性率が 1 %以下の蛍光強度を境界として、それ以上は陽性、それ未満は陰性と判断される。
[0034] 榭状細胞またはその前駆細胞の調製は、公知の方法に従ってまたは準じて行うこと ができる。例えば、血液 (例えば末梢血または臍帯血）、骨髄、リンパ節、他のリンパ 器官、脾臓、皮膚など力も分離することができる。好ましくは、榭状細胞は、本発明に 使用するために血液または骨髄力 得られる。また、本発明で用いられる榭状細胞 は、皮膚のランゲルノヽンス細胞、輸入リンパ管のベール細胞、ろ胞榭状細胞、脾臓 の榭状細胞、およびリンパ器官の指状突起細胞などであってもよい。また本発明で用 いられる榭状細胞は、 CD34+由来榭状細胞、骨髄由来榭状細胞、単球由来榭状細 胞、脾細胞由来榭状細胞、皮膚由来榭状細胞、濾胞榭状細胞、および胚中心榭状 細胞からなる群から選択される榭状細胞が含まれる。 CD34+由来榭状細胞は、臍帯 血または骨髄等力 得た造血幹細胞または造血始原細胞等から、顆粒球コロニー刺 激因子（G- CSF)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM- CSF)、腫瘍ネクロー シスファクター（TNF)- alpha、 IL-4、 IL-13、ステムセルフアクター（SCF)、 Flt-3リガンド 、 c-kitリガンド、またはその組み合わせなどにより分ィ匕させることができる。例えば、末 梢血の単球を GM-CSFおよび IL-4により未成熟榭状細胞に分化させ、さら〖こ TNF-alphaで刺激することにより成熟榭状細胞へと分ィ匕させることができる。
[0035] 榭状細胞およびそれ以外の細胞を含む組成物から榭状細胞を選択 (または濃縮） する場合は、榭状細胞以外の細胞を取り除くいわゆるネガティブ選択を実施すること が好ましい。ネガティブ選択を用いることにより、 DC- granulocytesの precursor (J. Exp. Med., 1998, 187: 1019-1028; Blood, 1996, 87: 4520-4530)が除去されずに残 り、接着性の CD 14細胞カゝら分ィ匕した DCだけでなぐそれらの precursorから分化した DCをあわせて回収することが可能と考えられる。これにより、ベクター導入による細胞 障害性を軽減することが期待できる。
[0036] 例えば、 T細胞、 NK細胞、 B細胞などに特異的な抗体を用いて、これらの細胞を取 り除くことにより、榭状細胞を濃縮することが可能である。具体的には、例えば、 CD2、 CD3、 CD8、 CD19、 CD56、 CD66bから選択される表面マーカーまたはその任意の組 み合わせの発現が lowまたは negativeの細胞を得ることが好まし 、。より好ましくは、 CD2、 CD3、 CD8、 CD19、 CD56、および CD66bの全てが lowまたは negativeの細胞で ある。そのために、これらのマーカーに対する抗体を用いて、これらのマーカーを発 現する細胞を除去するとよい（Hsuら（1996) Nature Med. 2: 52)。なお、ネガティブ選 択にお 、ては、本実施例に示されて 、るような多価抗体を用いて行うことができるし、 あるいは磁気細胞分離（MACS)のためにビーズ等を用いても、同様のセレクションを 実施することが可能である。血球分離等をもちいて単核球を採取するなど、細胞を大 量に調整する場合は、ビーズを用いることが好ましい。例えば生体から得た細胞溶液 力 単球をエンリッチし、これに対してネガティブ選択を行って調製した榭状細胞を 本発明にお 、て好適に用いることができる。
[0037] また、マイナス鎖 RNAウィルスを導入する前に接着細胞により得られた末梢血単球 を榭状細胞へ分化させたものを選択すると、ベクターの導入効率が低下することがあ る。本発明で用いられる榭状細胞はこれに限られるものではないが、未成熟榭状細 胞の比率を低下させな ヽように、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させる前の 細胞培養は、固体支持体 (例えば培養ディッシュまたはボトルなどの培養容器）に接 着した細胞を選択する工程を含まないことが好ましい。すなわち本発明は、マイナス 鎖 RNAウィルスベクターと榭状細胞との接触の前 24時間以内に、固体支持体に付着 した細胞を選択する工程を含まないような方法を提供する。より好ましくは、マイナス 鎖 RNAウィルスベクターと榭状細胞との接触の前の 2日、 3日、 5日、または 7日以内に 、固体支持体に付着した細胞を選択する工程を含まな 、ようにするとよ 、。
[0038] また、これに限られるものではないが、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させ る前に、 CD14+細胞を選択する工程を含まないことが好ましい。すなわち本発明は、 マイナス鎖 RNAウィルスベクターと榭状細胞との接触の前 24時間以内に、 CD14+細胞 を選択する工程を含まないような方法を提供する。より好ましくは、マイナス鎖 RNAゥ イノレスベクターと榭状糸田胞との接虫の前の 2日、 3日、 5日、または 7日以内に、 CD14+ 細胞を選択する工程を含まな 、ようにするとよ 、。
[0039] 榭状細胞の具体的な単離方法は、例えば Cameron et al.， 1992, Science 257: 383 、し anghoff et al, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7998、 Chehimi et al, 1993J. Gen. Viol. 74: 1277、 Cameron et al" 1992, Clin. Exp. Immunol. 88: 226、 Thomas et al., 1993, J. Immunol. 150: 821、 Karhumaki et al., 1993, Clin. Exp. Immunol. 91: 482などに記載されている。また、フローサイトメトリーによる榭状細胞の 単離については、例えば、 Thomas et al., 1994, J. Immunol. 153: 4016、 Ferbas et al" 1994, J. Immunol. 152: 4649、および O'Dohelrty et al" 1994, Immunology 82: 487に記載されている。また、磁気細胞選別については、例えば Miltenyi et al, 1990, Cytometry 11: 231-238に記述されている。
[0040] また、例えばヒト榭状細胞の単離および増殖に関しては、 Macatonia et al., 1991, Immunol. 74: 399—406、 O'Doherty et al., 1993, J. Exp. Med. 178: 1067—1078、 Markowicz et al., 1990, J. Clin. Invest. 85: 955—961、 Romani et al" 1994, J. Exp. Med. 180: 83—93、 Sallusto et al" 1994, J. Exp. Med. 179: 1109—1118、 Berhard et al., 1995, J. Exp. Med. 55: 1099-1104などに記載の方法を用いてもよい。また、骨 髄、臍帯血、または末梢血等力も得られる CD34+細胞および末梢血由来の単核細胞 からの榭状細胞形成については Van Tendeloo et al.， 1998, Gene Ther. 5: 700-707 に記載の方法を用いて実施してもよ ヽ。
[0041] 本発明にお 、ては、榭状細胞またはその前駆細胞 (例えば CD1 lc+細胞または
CD34+細胞）を高濃度で含む細胞画分にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを混合する ことが好ましい。前駆細胞とは、適当なサイト力イン（すなわち G- CSF、 GM-CSF、 TNF- alpha、 IL- 4、 IL- 13、 SCF、 Fit- 3リガンド、 c- kitリガンド、またはそれらの組み合 わせ)の存在下で榭状細胞に分ィ匕することができる細胞を言い、好ましくは 4週間以 内、より好ましくは 20日以内、より好ましくは 18日以内、より好ましくは 16日以内に榭状 細胞に分ィ匕できる細胞である。このような細胞には、 CD34+幹細胞が挙げられる。榭 状細胞への分化は、例えば SCF (50 ng/ml)、 GM-CSF (500 U/ml)、 TNF-alpha (50 ng/ml)の存在下で 3日間程度培養後、 SCF (50 ng/ml)、 GM-CSF (500 U/ml)、 IL- 4 (250 U/ml)、 TNF-alpha (50ng/ml)の存在下で培養することで実施することであって よい。また細胞画分とは、細胞の分離 (または分画）により得られた細胞集団である。 細胞画分は、細胞および薬学的に許容される担体を含む組成物であってよい。担体 としては、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS)、培養液、血清など、生細胞を 懸濁することができる所望の溶液が挙げられる。本発明の方法においてベクターの 接触に用いられる細胞画分は、全生細胞中の榭状細胞および Zまたはその前駆体 の割合力 例えば 30%以上、好ましくは 40%以上、好ましくは 50%以上、好ましくは 60%以上、好ましくは 70%以上である。
[0042] また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターに接触させる榭状細胞中には、未成熟榭状 細胞が含まれることが好ましい。ベクターを混合する榭状細胞を含む細胞画分は、全 生細胞中の未成熟榭状細胞の割合力 例えば 10%以上、好ましくは 20%以上、より 好ましくは 30%以上、より好ましくは 40%以上、より好ましくは 50%以上、より好ましく は 60%以上、より好ましくは 70%以上である。
[0043] マイナス鎖 RNAウィルスを用いる本発明の方法は、様々な利点を有して 、る。例え ばマイナス鎖 RNAウィルスを用いれば、ベクターの感染のみで、活性化榭状細胞が 得られ、後の成熟榭状細胞を得るための工程が省略できる。榭状細胞を免疫賦活に 用いるためには活性ィ匕が必要であるので、ベクターの感染だけで活性ィ匕を起こせる ことには利点がある。また、この性質を利用し、 in vitroで T細胞移入療法に必要な活 性化 T細胞、特に細胞傷害性 T細胞などを効率良く短期間で誘導することができる。 マイナス鎖 RNAウィルスを導入して 、な 、榭状細胞では CTLを誘導できず、他のベタ ターでこれまで報告されて 、る性質から、他のベクターの遺伝子導入のみでは in vitroでの CTL誘導は困難である。従って、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、ベクタ 一の導入のみで T細胞を活性ィ匕 (CTL誘導）が可能という利点を有している（図 22参 照)。また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、高い導入効率、遺伝子導入の安定 性、簡便性、安全性、榭状細胞の T細胞活性化能力保持を全て兼ね備えたベクター である点で、他のベクターに比べ優れている。
[0044] また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、幹細胞に遺伝子導入した後に、榭状細 胞を分ィ匕させる場合にも有用である。マイナス鎖 RNAウィルスベクターを幹細胞に遺 伝子導入した後に、榭状細胞への分化を誘導した場合、遺伝子導入効率は 70%近 くに達する。これは、レトロウイルスおよびレンチウィルスベクターの改変型に匹敵す る。アデノウイルスベクターは、導入後の episomeの希釈により発現が低下するため、 幹細胞から遺伝子導入することは困難である。マイナス鎖 RNAウィルスは、幹細胞に 導入後に榭状細胞分化を行う方法、および、末梢血単核球より分化させた榭状細胞 に遺伝子を導入する方法、の両者に適用が可能である。
[0045] また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、 MOIを高く（例えば 10以上、好ましくは 20 以上、より好ましくは 30以上、例えば 40以上、さらには 50以上)すれば、細胞傷害性 に有為な影響なぐ安定してほぼ 100%の導入効率で細胞に導入することが可能で ある。さらに、マイナス鎖 RNAウィルスは宿主ゲノムに遺伝子を組み込まないため、腫 瘍発生などのリスクが低 、と 、う利点も有して 、る。
[0046] 本発明にお 、てマイナス鎖 RNAウィルスとは、マイナス鎖（ウィルス蛋白質をコード するセンス鎖に対するアンチセンス鎖）の RNAをゲノムとして含むウィルスである。マイ ナス鎖 RNAはネガティブ鎖 RNAとも呼ばれる。本発明にお 、て用いられるマイナス鎖 RNAウィルスとしては、特に一本鎖マイナス鎖 RNAウィルス（非分節型（
non- segmented)マイナス鎖 RNAウィルスとも言う）が挙げられる。「一本鎖ネガティブ 鎖 RNAウィルス」とは、一本鎖ネガティブ鎖 [すなわちマイナス鎖] RNAをゲノムに有 するウィルスを言う。このようなウィルスとしては、パラミクソウィルス（Paramyxoviridae; Paramyxovirus, Morbilnvirus, Rubulavirus,および PneumovirusJ¾等を む)、フブト ウイノレス (Rhabdovindae; Vesiculovirus, Lyssavirus,および Epnemerovirus属等を含 む）、フィロウイノレス (Filoviridae)、ォノレトミクソゥイノレス (Orthomyxoviridae; Inluluenza virus A, B, C,および Thogoto- like viruses等を含む）、ブ-ャウィルス（
Bunyavindae; Bunyavirus, Hantavirus, Nairo virus,および Phlebovirus属等を含？ _?リ、 ァレナウィルス (Arenaviridae)などの科に属するウィルスが含まれる。
[0047] また、マイナス鎖 RNAウィルスベクターとは、マイナス鎖 RNAウィルスをベースとする 感染力を持つウィルス粒子であって、遺伝子を細胞に導入するための担体である。こ こで「感染力」とは、マイナス鎖 RNAウィルスベクターが細胞への接着能を保持してお り、接着した細胞の内部にベクターに含まれる遺伝子を導入することのできる能力の ことを言う。好ましい態様では、本発明のマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、ベクタ 一のゲノム RNA中に外来遺伝子が発現できるように組み込まれて ヽる。本発明のマイ ナス鎖 RNAウィルスベクターは、伝播能を有していてもよぐ伝播能を有さない欠損 型ベクターであってもよい。「伝播能を有する」とは、ウィルスベクターが宿主細胞に 感染した場合、該細胞においてウィルスが複製され、感染性ウィルス粒子が産生され ることを旨す。
[0048] 組み換えウィルスとは、組み換えポリヌクレオチドを介して生成したウィルス、または そのウィルスの増幅産物を言う。組み換えポリヌクレオチドとは、両端または片端が自 然の状態と同じようには結合していないポリヌクレオチドを言う。具体的には、組み換 えポリヌクレオチドは、人の手によってポリヌクレオチド鎖の結合が改変 (切断および/ または結合)されたポリヌクレオチドである。組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオ チド合成、ヌクレアーゼ処理、リガーゼ処理等を組み合わせて、公知の遺伝子組み 換え方法により生成させることができる。組み換えウィルスは、遺伝子操作により構築 されたウィルスゲノムをコードするポリヌクレオチドを発現させ、ウィルスを再構築する ことによって生成することができる。例えば、ウィルスゲノムをコードする cDNAから、ゥ ィルス再構成する方法が知られている（Y. Nagai, A. Kato, Microbiol. Immunol, 43, 613-624 (1999))。 [0049] 本発明にお ヽて遺伝子とは遺伝物質を指し、転写される配列をセンスまたはアンチ センスに含む核酸を言う。遺伝子は RNAであっても DNAであってもよい。本発明にお いて蛋白質をコードする核酸は、該蛋白質の遺伝子と呼ぶ。また遺伝子は蛋白質を コードして ヽなくてもよぐ例えば遺伝子はリボザィムまたはアンチセンス RNAなどの 機能的 RNAをコードするものであってもよい。遺伝子は天然由来または人為的に設 計された配列であり得る。また、本発明において「DNA」とは、一本鎖 DNAおよび二本 鎖 DNAを含む。また蛋白質をコードするとは、ポリヌクレオチドが該蛋白質を適当な 条件下で発現できるように、該蛋白質のアミノ酸配列をコードする ORFをセンスまたは アンチセンスに含むことを言う。
[0050] 本発明にお!/、て好適に用いられるマイナス鎖 RNAウィルスとしては、例えばパラミク ソゥイノレス科 (Paramyxoviridae)ウイノレスのセンダイウイノレス (Sendai virus),ニューカツ スノレ病ウイノレス (Newcastle disease virus),おたふくかぜウイノレス (Mumps virus),麻疼 ウイノレス (Measles virus八 RSウイノレス (Respiratory syncytial virus八牛疫ウイノレス (rinderpest virus)ゝジステンノ ーウイノレス (distemper virus)ゝサノレノ《ラインフノレエンザゥ ィルス（SV5)、ヒトパラインフルエンザウイルス 1,2,3型、オルトミクソウィルス科
(Orthomyxoviridae)のインフノレエンザゥイノレス (Influenza virus),ラブドウイノレス科 (Rhabdoviridae)の水抱'性口内炎ウイノレス (Vesicular stomatitis virus),狂犬病ウイノレス (Rabies virus)等が挙げられる。
[0051] 本発明において用いることができるウィルスをさらに例示すれば、例えば Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)、 human parainfluenza virus- 3 (HPIV- 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、 Nipah virus (Nipah)、 human parainfluenza virus- 2 (HPIV- 2)、 simian parainfluenza virus 5 (SV5)、 human parainfluenza virus- 4a (HPIV- 4a)、 human parainfluenza virus- 4b (HPIV- 4b)、 mumps virus (Mumps),および Newcastle disease virus (NDV)などが含まれる。より好ましく は、 Sendai virus (SeV)、 human parainfluenza virus- 1 (HPIV- 1)、 human parainfluenza virus— 3 (HPIV— 3)、 phocine distemper virus (PDV)、 canine distemper virus (CDV)、 dolphin molbillivirus (DMV)、 peste—des—petits— ruminants virus (PDPR)、 measles virus (MV)、 rinderpest virus (RPV)、 Hendra virus (Hendra)、および Nipah virus (Nipah)カゝらなる群より選択されるウィルスが挙げられる。
[0052] より好ましくは、パラミクソウィルス亜科（レスピロウィルス属、ルブラウィルス属、およ びモルビリウィルス属を含む）に属するウィルスまたはその誘導体であり、より好ましく はレスピロウイノレス属 (genus Respirovirus) (パラミクソウイノレス属 (Paramyxovirus)とも 言う）に属するウィルスまたはその誘導体である。誘導体には、ウィルスによる遺伝子 導入能を損なわないように、ウィルス遺伝子が改変されたウィルス、および化学修飾 されたウィルス等が含まれる。本発明を適用可能なレスピロウィルス属ウィルスとして は、例えばヒトパラインフルエンザウイルス 1型（HPIV-1)、ヒトパラインフルエンザウイ ルス 3型 (HPIV-3)、ゥシパラインフルエンザウイルス 3型（BPIV-3)、センダイウィルス (Sendai virus;マウスパラインフルエンザウイルス 1型とも呼ばれる)、およびサルパライ ンフルェンザウィルス 10型（SPIV-10)などが含まれる。本発明にお!/、てパラミクソウイ ルスは、最も好ましくはセンダイウィルスである。これらのウィルスは、天然株、野生株 、変異株、ラボ継代株、および人為的に構築された株などに由来してもよい。
[0053] マイナス鎖 RNAウィルスベクターはゲノム RNAに搭載遺伝子をアンチセンスにコー ドしている。ゲノム RNAとは、マイナス鎖 RNAウィルスのウィルス蛋白質と共にリボヌク レオプロテイン (RNP)を形成し、該蛋白質によりゲノム中の遺伝子が発現し、この RNAが複製されて娘 RNPが形成される機能を持つ RNAである。一般にマイナス鎖 RNAウィルスのゲノムは、 3'リーダー領域と 5'トレイラ一領域の間に、ウィルス遺伝子 がアンチセンス配列として並んだ構成をしている。各遺伝子の ORFの間には、転写終 結配列 (E配列） -介在配列 (I配列） -転写開始配列 (S配列）が存在し、これにより各 遺伝子の ORFをコードする RNAが別々のシストロンとして転写される。
[0054] マイナス鎖 RNAウィルスのウィルスタンパク質をコードする遺伝子としては、 NP、 P、 M、 F、 HN、および L遺伝子が含まれる。「NP、 P、 M、 F、 HN、および L遺伝子」とは、そ れぞれヌクレオキヤプシド、ホスホ、マトリックス、フュージョン、へマグルチュン-ノイラ ミニダーゼ、およびラージ蛋白質をコードする遺伝子のことを指す。ノ ラミクソウィルス 亜科に属する各ウィルスにおける各遺伝子は、一般に次のように表記される。一般に 、 NP遺伝子は「N遺伝子」と表記されることもある。
レスピロウィルス属 NP P/C/V M F HN - L
ルブラウィルス属 NP P/V M F HN (SH) L
モービリウィルス属 NP P/C/V M F H - L
例えばセンダイウィルスの各遺伝子の塩基配列のデータベースのァクセッション番 号は、 NP遺伝子については M29343、 M30202, M30203, M30204, M51331,
M55565, M69046, X17218, P遺伝子については M30202, M30203, M30204, M55565, M69046, X00583, X17007, X17008, M遺伝子については D11446, K02742, M30202, M30203, M30204, M69046, U31956, X00584, X53056、 F遺伝子 については D00152, D11446, D17334, D17335, M30202, M30203, M30204, M69046, X00152, X02131、 HN遺伝子については D26475, M12397, M30202, M 30203, M30204, M69046, X00586, X02808, X56131、 L遺伝子については D00053, M30202, M30203, M30204, M69040, X00587, X58886を参照のこと。またその他のゥ ィルスがコードするウィルス遺伝子を例示すれば、 N遺伝子については、 CDV, AF014953; DMV, X75961; HPIV— 1, D01070; HPIV— 2, M55320; HPIV— 3, D10025; Mapuera, X85128; Mumps, D86172; MV, K01711; NDV, AF064091; PDPR,
X74443; PDV, X75717; RPV, X68311; SeV, X00087; SV5, M81442;および Tupaia, AF079780, P遺伝子については、 CDV, X51869; DMV, Z47758; HPIV- 1, M74081; HPIV— 3, X04721; HPIV— 4a, M55975; HPIV— 4b, M55976; Mumps, D86173; MV, M89920; NDV, M20302; PDV, X75960; RPV, X68311; SeV, M30202; SV5,
AF052755;および Tupaia, AF079780, C遺伝子については CDV, AF014953;
DMV, Z47758; HPIV- 1. M74081; HPIV- 3, D00047; MV, AB016162; RPV, X68311; SeV, AB005796;および Tupaia, AF079780, M遺伝子については CDV, M12669; DMV Z30087; HPIV— 1, S38067; HPIV— 2, M62734; HPIV— 3, D00130; HPIV— 4a, D10241; HPIV- 4b, D10242; Mumps, D86171; MV, AB012948; NDV, AF089819; PDPR, Z47977; PDV, X75717; RPV, M34018; SeV, U31956;および SV5, M32248, F遺伝子については CDV, M21849; DMV, AJ224704; HPN- 1. M22347; HPIV- 2, M60182; HPIV— 3. X05303, HPIV— 4a, D49821; HPIV— 4b, D49822; Mumps, D86169; MV, AB003178; NDV, AF048763; PDPR, Z37017; PDV, AJ224706; RPV, M21514; SeV, D17334;および SV5, AB021962, HN (Hまたは G)遺伝子については CDV, AF112189; DMV, AJ224705; HPIV- 1, U709498; HPIV- 2. D000865; HPIV- 3, AB012132; HPIV-4A, M34033; HPIV-4B, AB006954; Mumps, X99040; MV, K01711; NDV, AF204872; PDPR, Z81358; PDV, Z36979; RPV, AF132934; SeV, U06433;および SV-5, S76876が例示できる。但し、各ウィルスは複数の株が知られ ており、株の違いにより上記に例示した以外の配列力もなる遺伝子も存在する。
これらのウィルス蛋白質をコードする ORFおよび外来遺伝子の ORFは、ゲノム RNA にお 、て上記の E-I-S配列を介してアンチセンスに配置される。ゲノム RNAにお!/、て 最も 3'に近い ORFは、 3'リーダー領域と該 ORFとの間に S配列のみが必要であり、 Eお よび I配列は必要ない。またゲノム RNAにおいて最も 5'に近い ORFは、 5'トレイラー領 域と該 ORFとの間に E配列のみが必要であり、 Iおよび S配列は必要ない。また 2つの ORFは、例えば IRES等の配列を用いて同一シストロンとして転写させることも可能で ある。このような場合は、これら 2つの ORFの間には E-ト S配列は必要ない。例えば、 野生型のパラミクソウィルスの場合、典型的な RNAゲノムは、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN、および L蛋白質をアンチセンスにコードする 6つの ORFが順に並ん でおり、それに続いて 5'トレイラ一領域を他端に有する。本発明のゲノム RNAにおい ては、ウィルス遺伝子の配置はこれに限定されるものではないが、好ましくは、野生 型ウィルスと同様に、 3'リーダー領域に続き、 N、 P、 M、 F、 HN、および L蛋白質をコー ドする ORFが順に並び、それに続いて 5'トレイラ一領域が配置されることが好ましい。 ある種のウィルスにおいては、ウィルス遺伝子が異なっている力 そのような場合でも 上記と同様に各ウィルス遺伝子を野生型と同様の配置とすることが好ましい。一般に N、 P、および L遺伝子を保持しているベクターは、細胞内で自律的に RNAゲノムから 遺伝子が発現し、ゲノム RNAが複製される。さらに Fおよび HN遺伝子等のェンベロー プ蛋白質をコードする遺伝子、および M遺伝子の働きにより、感染性のウィルス粒子 が形成され、細胞外に放出される。従って、このようなベクターは伝播能を有するウイ ルスベクターとなる。榭状細胞に導入したい外来遺伝子は、後述するように、このゲノ ム中の蛋白質非コード領域に挿入すればよい。 [0056] また、本発明のマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、野生型ウィルスが持つ遺伝子 のいずれかを欠損したものであってよい。例えば、 M、 F、または HN遺伝子、あるいは それらの組み合わせが含まれて 、な 、ウィルスベクターも、本発明にお 、て好適に 用いることができる。このようなウィルスベクターの再構成は、例えば、欠損している遺 伝子産物を外来的に供給することにより行うことができる。このようにして製造されたゥ ィルスべクタ一は、野生型ウィルスと同様に宿主細胞に接着して細胞融合を起こすが 、細胞に導入されたベクターゲノムはウィルス遺伝子に欠損を有するため、最初と同 じょうな感染力を持つ娘ウィルス粒子は形成されない。このため、一回限りの遺伝子 導入力を持つ安全なウィルスベクターとして有用である。ゲノムカゝら欠損させる遺伝 子としては、例えば F遺伝子および Zまたは HN遺伝子が挙げられる。例えば、 F遺伝 子が欠損した組み換えマイナス鎖 RNAウィルスベクターゲノムを発現するプラスミドを 、 F蛋白質の発現ベクターならびに NP、 P、および L蛋白質の発現ベクターと共に宿 主細胞にトランスフエクシヨンすることにより、ウィルスベクターの再構成を行うことがで きる（WO00/70055および WO00/70070; Li, H.— 0. et al., J. Virol. 74(14)
6564-6569 (2000))。また、例えば、 F遺伝子が染色体に組み込まれた宿主細胞を用 いてウィルスを製造することもできる。これらの蛋白質群は、そのアミノ酸配列はウィル ス由来の配列そのままでなくとも、核酸の導入における活性が天然型のそれと同等か それ以上ならば、変異を導入したり、あるいは他のウィルスの相同遺伝子で代用して ちょい。
[0057] また、本発明において用いられるウィルスベクターとして、ベクターゲノムが由来す るウィルスのエンベロープ蛋白質とは異なる蛋白質をエンベロープに含むベクターを 作製することもできる。例えば、ウィルス再構成の際に、ベクターのベースとなるウィル スのゲノムがコードするエンベロープ蛋白質以外のエンベロープ蛋白質を細胞で発 現させることにより、所望のエンベロープ蛋白質を有するウィルスベクターを製造する ことができる。このような蛋白質に特に制限はない。細胞への感染能を与える所望の 蛋白質が用いられる。例えば、他のウィルスのエンベロープ蛋白質、例えば水疱性 口内炎ウィルス (Vesicular stomatitis virus; VSV)の G蛋白質（VSV— G)を挙げること ができる。 VSV-G蛋白質は、任意の VSV株に由来するものであってよい。例えば Indiana血清型株（J. Virology 39: 519-528 (1981))由来の VSV- G蛋白を用いることが できるが、これに限定されない。また本発明のベクターは、他のウィルス由来のェン ベロープ蛋白質を任意に組み合わせて含むことができる。例えば、このような蛋白質 として、ヒト細胞に感染するウィルスに由来するエンベロープ蛋白質が好適である。こ のような蛋白質としては、特に制限はないが、レトロウイルスのアンフォト口ピックェン ベロープ蛋白質などが挙げられる。レトロウイルスのアンフォト口ピックエンベロープ蛋 白質としては、例えばマウス白血病ウィルス (MuLV) 4070A株由来のエンベロープ蛋 白質を用い得る。また、 MuMLV 10A1由来のエンベロープ蛋白質を用いることもでき る（例えば pCL— 10Al(Imgenex) (Naviaux, R. K. et al., J. Virol. 70: 5701—5705 (1996) )。また、ヘルぺスウィルス科の蛋白質としては、例えば単純へルぺスウィルスの gB、 gD、 gH、 gp85蛋白質、 EBウィルスの gp350、 gp220蛋白質などが挙げられる。へパド ナウィルス科の蛋白質としては、 B型肝炎ウィルスの S蛋白質などが挙げられる。これ らの蛋白質は、細胞外ドメインを F蛋白質または HN蛋白質の細胞内ドメインと結合さ せた融合蛋白質として用いてもょ 、。このように本発明にお 、て用いられるウィルス ベクターには、 VSV-G蛋白質などのように、ゲノムが由来するウィルス以外のウィルス に由来するエンベロープ蛋白質を含むシユードタイプウィルスベクターが含まれる。ゥ ィルスのゲノム RNAにはこれらのエンベロープ蛋白質をゲノムにコードされないように 設計すれば、ウィルス粒子が細胞に感染した後は、ウィルスベクター力 この蛋白質 が発現されることはない。
[0058] また、本発明において用いられるウィルスベクターは、例えば、エンベロープ表面に 特定の細胞に接着しうるような接着因子、リガンド、受容体等の蛋白質、抗体または その断片、あるいはこれらの蛋白質を細胞外領域に有し、ウィルスエンベロープ由来 のポリペプチドを細胞内領域に有するキメラ蛋白質などを含むものであってもよい。こ れにより、ベクターの榭状細胞への特異性を制御し得る。これらはウィルスゲノムにコ ードされていてもよいし、ウィルスベクターの再構成時に、ウィルスゲノム以外の遺伝 子 (例えば別の発現ベクターまたは宿主染色体上などにある遺伝子）の発現により供 給されてもよい。
[0059] またウィルスベクターは、例えばウィルス蛋白質による免疫原性を低下させるために 、または RNAの転写効率または複製効率を高めるために、ベクターに含まれる任意 のウィルス遺伝子が野生型遺伝子から改変されていてよい。具体的には、例えば複 製因子である N、 P、および L遺伝子の中の少なくとも一つを改変し、転写または複製 の機能を高めることが考えられる。また、エンベロープ蛋白質の 1つである HN蛋白質 は、赤血球凝集素であるへマダルチュン (hemagglutinin)活性とノイラミニダーゼ（ neuraminidase)活性との両者の活性を有するが、例えば前者の活性を弱めることが できれば、血液中でのウィルスの安定性を向上させることが可能であろうし、例えば 後者の活性を改変することにより、感染能を調節することも可能である。また、 F蛋白 質を改変することにより膜融合能を調節することもできる。また、例えば、細胞表面の 抗原分子となりうる F蛋白質および/または HN蛋白質の抗原提示ェピトープ等を解析 し、これを利用してこれらの蛋白質に関する抗原提示能を弱めたウィルスベクターを 作製することちでさる。
[0060] またマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、アクセサリー遺伝子が欠損したものであつ てよい。例えば SeVのアクセサリー遺伝子の 1つである V遺伝子をノックアウトすること により、培養細胞における遺伝子発現および複製は障害されることなぐマウス等の 宿主に対する SeVの病原性が顕著に減少する（Kato, A. et al.， 1997, J. Virol.
71:7266-7272; Kato, A. et al, 1997, EMBO J. 16:578-587; Curran, J. et al.，
WO01/04272, EP1067179) oこのような弱毒化ベクターは、 in vivoまたは ex vivoにお ける毒性のない遺伝子導入用ウィルスベクターとして特に有用である。
[0061] マイナス鎖 RNAウィルスは遺伝子導入べクタ一として優れており、宿主細胞の細胞 質でのみ転写 ·複製を行 、、 DNAフェーズを持たな 、ため染色体への組み込み（ integration) ί¾起こらな ヽ (Lamb, R.A. and Kolakofsky, D., Paramyxoviriaae： Tne viruses and their replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds). Fields of virology. Vol. 2. Lippincott - Raven Publishers: Philadelphia, 199b, pp. 11 / 7-1204) 。このため染色体異常による癌化および不死化などの安全面における問題が生じな い。マイナス鎖 RNAウィルスのこの特徴は、ベクター化した時の安全性に大きく寄与 している。異種遺伝子発現の結果では、例えばセンダイウィルス (SeV)を連続多代継 代しても殆ど塩基の変異が認められず、ゲノムの安定性が高ぐ挿入異種遺伝子を 長期間に渡って安定に発現する事が示されている（Yu, D. et al., Genes Cells 2, 457-466 (1997)) oまた、力プシド構造蛋白質を持たないことによる導入遺伝子のサイ ズまたはパッケージングの柔軟性 (flexibility)など性質上のメリットがある。このように、 マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、ヒトの遺伝子治療のための高効率ベクターの新 しいクラスとなることが示唆される。伝播能を有する SeVベクターは、外来遺伝子を少 なくとも 4kbまで導入可能であり、転写ユニットを付加することによって 2種類以上の遺 伝子を同時に発現する事も可能である。
[0062] またセンダイウィルスは、齧歯類にとっては病原性で肺炎を生じることが知られてい る力 人に対しては病原性がない。これはまた、野生型センダイウィルスの経鼻的投 与によって非ヒト霊長類において重篤な有害作用を示さないというこれまでの報告に よっても支持されている（Hurwitz, J.L. et al., Vaccine 15: 533-540, 1997)。センダイ ウィルスのこれらの特徴は、センダイウィルスベクター力 ヒトの治療へ応用できること を示唆し、センダイウィルスベクターが、ヒト榭状細胞を標的とした遺伝子治療の有望 な選択肢の一つとなることを結論づけるものである。
[0063] ウィルスベクターは、ゲノム RNA中に外来遺伝子をコードし得る。外来遺伝子を含 む組換えウィルスベクターは、上記のウィルスベクターのゲノムに外来遺伝子を挿入 することによって得られる。外来遺伝子としては、標的とする榭状細胞において発現 させたい所望の遺伝子を用いることができる。外来遺伝子は天然型蛋白質をコード する遺伝子であってもよぐあるいは欠失、置換または挿入により天然型蛋白質を改 変した蛋白質をコードする遺伝子であってもよい。外来遺伝子の挿入位置は、例え ばウィルスゲノムの蛋白質非コード領域の所望の部位を選択することができ、例えば ゲノム RNAの 3'リーダー領域と 3'端に最も近いウィルス蛋白質 ORFとの間、各ウィルス 蛋白質 ORFの間、および/または 5'端に最も近いウィルス蛋白質 ORFと 5'トレイラー領 域の間に挿入することができる。また、 Fまたは HN遺伝子などを欠失するゲノムでは、 その欠失領域に外来遺伝子をコードする核酸を挿入することができる。ノ ラミクソウイ ルスに外来遺伝子を導入する場合は、ゲノムへの挿入断片のポリヌクレオチドの鎖長 力 ¾の倍数となるように挿入することが望ましい（Journal of Virology, Vol. 67, No. 8, 4822-4830, 1993)。挿入した外来遺伝子とウィルス ORFとの間には、 E-I-S配列が構 成されるようにする。 E-卜 S配列を介して 2またはそれ以上の遺伝子をタンデムに並べ て挿人することができる。
[0064] ベクターに搭載する外来遺伝子の発現レベルは、その遺伝子の上流 (ネガティブ 鎖の 3'側）に付加する転写開始配列の種類により調節することができる（
WO01/18223) oまた、ゲノム上の外来遺伝子の挿入位置によって制御することがで き、ネガティブ鎖の 3'の近くに挿入するほど発現レベルが高ぐ 5'の近くに挿入するほ ど発現レベルが低くなる。このように、外来遺伝子の挿入位置は、該遺伝子の所望の 発現量を得るために、また前後のウィルス蛋白質をコードする遺伝子との組み合わせ が最適となる様に適宜調節することができる。一般に、外来遺伝子の高い発現が得ら れることが有利と考えられるため、外来遺伝子は、効率の高い転写開始配列に連結 し、ネガティブ鎖ゲノムの 3'端近くに挿入することが好ましい。具体的には、 3'リーダ 一領域と 3'に最も近いウィルス蛋白質 ORFとの間に挿入される。あるいは、 3'に一番 近いウィルス遺伝子の ORFと 2番目の遺伝子の ORFの間に挿入してもよい。野生型 パラミクソウィルスにおいては、ゲノムの 3'に最も近いウィルス蛋白質遺伝子は N遺伝 子であり、 2番目の遺伝子は P遺伝子である。逆に、導入遺伝子の高発現が望ましく な ヽ場合は、例えばベクターにおける外来遺伝子の挿入位置をネガティブ鎖のなる ベく 5'側に設定したり、転写開始配列を効率の低いものにするなどして、ウィルスべク ター力 の発現レベルを低く抑えることで適切な効果が得られるようにすることも可能 である。
[0065] マイナス鎖ウィルスベクターを製造するには、哺乳動物細胞において、ウィルスの 成分である RNPの再構成に必要なウィルス蛋白質、すなわち N、 P、および L蛋白質の 存在下、ウィルスのゲノム RNAをコードする cDNAを転写させる。転写によりネガティブ 鎖ゲノム (すなわちウィルスゲノムと同じアンチセンス鎖）を生成させてもよぐあるいは ポジティブ鎖（ウィルス蛋白質をコードするセンス鎖）を生成させても、ウィルス RNPを 再構成することができる。ベクターの再構成効率を高めるには、好ましくはポジティブ 鎖を生成させる。 RNA末端は、天然のウィルスゲノムと同様に 3'リーダー配列と 5'トレ イラ一配列の末端をなるベく正確に反映させることが好まし、。転写産物の 5'端を正 確に制御するためには、例えば転写開始部位として T7 RNAポリメラーゼ認識配列を 利用し、該 RNAポリメラーゼを細胞内で発現させればよい。転写産物の 3'端を制御す るには、例えば転写産物の 3'端に自己切断型リボザィムをコードさせておき、このリボ ザィムにより正確に 3'端が切り出されるようにすることができる（Hasan, M. K. et al, J.
Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、 Kato, A. et al., 1997, EMBO J. 16: 578-587及 び Yu, D. et al., 1997, Genes Cells 2: 457-466)。
[0066] 例えば外来遺伝子を有する組み換えセンダイウィルスベクターは、 Hasan, M. K. et al., J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997、 Kato, A. et al" 1997, EMBO J. 16:
578-587及び Yu, D. et al" 1997, Genes Cells 2: 457- 466の記載等に準じて、次の ようにして構築することができる。
まず、目的の外来遺伝子の cDNA塩基配列を含む DNA試料を用意する。 DNA試料 は、 25ng/micro-L以上の濃度で電気泳動的に単一のプラスミドと確認できることが 好ましい。以下、 Notl部位を利用してウィルスゲノム RNAをコードする DNAに外来遺 伝子を挿入する場合を例にとって説明する。目的とする cDNA塩基配列の中に Notl 認識部位が含まれる場合は、部位特異的変異導入法などを用いて、コードするァミノ 酸配列を変化させな 、ように塩基配列を改変し、 Notl部位を予め除去しておくことが 好ましい。この試料から目的の遺伝子断片を PCRにより増幅し回収する。 2つのプライ マーの 5'部分に Notl部位を付加しておくことにより、増幅された断片の両端を Notl部 位とする。ウィルスゲノム上に挿入された後の外来遺伝子の ORFとその両側のウィル ス遺伝子の ORFとの間に E-卜 S配列が配置されるように、プライマー中に E-ト S配列を 含めるように設計する。
[0067] 例えば、フォワード側合成 DNA配列は、 Notlによる切断を保証するために 5'側に任 意の 2以上のヌクレオチド (好ましくは GCGおよび GCCなどの Notl認識部位由来の配 列が含まれない 4塩基、更に好ましくは ACTT)を選択し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側にスぺーサー配列として任意の 9塩基または 9に 6 の倍数を加えた数の塩基を付加し、さらにその 3 '側に所望の cDNAの開始コドン ATG 力もこれを含めて ORFの約 25塩基相当の配列を付加した形態とする。最後の塩基は Gまたは Cとなるように該所望の cDNAから約 25塩基を選択してフォワード側合成オリ ゴ DNAの 3'の末端とすることが好まし 、。 [0068] リバース側合成 DNA配列は 5'側から任意の 2以上のヌクレオチド (好ましくは GCGお よび GCCなどの Notl認識部位由来の配列が含まれない 4塩基、更に好ましくは ACTT)を選択し、その 3'側に Notl認識部位 gcggccgcを付加し、さらにその 3'側に長さ を調節するための挿入断片のオリゴ DNAを付加する。このオリゴ DNAの長さは、最終 的な PCR増幅産物の Notl断片の鎖長が 6の倍数になるように塩基数を設計する（ ヽ わゆる「6のルール（rule of six) J； Kolakofski, D. et al, J. Virol. 72:891-899, 1998; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67:4822-4830, 1993; Calain, P. and Roux, L., J. Virol. 67: 4822-4830, 1993)。このプライマーに E-I-S配列を付加する場合には、揷 入断片のオリゴ DNAの 3'側にセンダイウィルスの S配列、 I配列、および E配列の相補 鎖配列、好ましくはそれぞれ 5'- CTTTCACCCT-3' (配列番号： 1)、 5'-AAG-3'、お よび 5'-TTTTTCTTACTACGG-3，（配列番号： 2)を付カ卩し、さらにその 3'側に所望 の cDNA配列の終始コドン力 逆に数えて約 25塩基相当の相補鎖の最後の塩基が G または Cになるように長さを選択して配列を付加し、リバース側合成 DNAの 3'の末端と する。
[0069] PCRは、 Taqポリメラーゼまたはその他の DNAポリメラーゼを用いる通常の方法を用 いることができる。増幅した目的断片は Notlで消化した後、 pBluescript等のプラスミド ベクターの Notl部位に挿入する。得られた PCR産物の塩基配列をシークェンサ一で 確認し、正しい配列のプラスミドを選択する。このプラスミドから挿入断片を Notlで切り 出し、ゲノム cDNAを含むプラスミドの Notl部位にクローユングする。またプラスミドべク ターを介さずにゲノム cDNAの Notl部位に直接挿入し、組み換えセンダイウィルス cDNAを得ることも可能である。
[0070] 例えば、組み換えセンダイウィルスゲノム cDNAであれば、文献記載の方法に準じ て構築することができる（Yu, D. et al" Genes Cells 2: 457-466, 1997; Hasan, M. K. et al" J. Gen. Virol. 78: 2813-2820, 1997)。例えば、 Notl制限部位を有する 18bpの スぺーサー配列（5'- (G)- CGGCCGCAGATCTTCACG- 3') (配列番号： 3)を、クロー ユングされたセンダイウィルスゲノム cDNA(pSeV(+))のリーダー配列と N蛋白質の ORFとの間に挿入し、デルタ肝炎ウィルスのアンチゲノム鎖（antigenomic strand)由 来の自己開裂リボザィム部位を含むプラスミド pSeV18+b(+)を得る（Hasan, M. K. et al., 1997, J. General Virology 78: 2813-2820)。 pSeV18+b(+)の Notl部位に外来遺伝 子断片を挿入し、所望の外来遺伝子が組み込まれた組み換えセンダイウィルス cDNAを得ることができる。
このようにして作製した組み換えウィルスのゲノム RNAをコードする DNAを、上記の ウィルス蛋白質 (L、 P、および N)存在下で細胞内で転写させることにより、ウィルスべ クタ一を再構成することができる。本発明は、榭状細胞導入用マイナス鎖 RNAウィル スベクターを提供する。また本発明は、遺伝子が導入された榭状細胞の製造におけ る、マイナス鎖 RNAウィルスベクターの使用、および成熟榭状細胞の製造における、 マイナス鎖 RNAウィルスベクターの使用に関する。また本発明は、榭状細胞導入用 マイナス鎖 RNAウィルスベクターの製造のための、マイナス鎖 RNAウィルスベクター のウィルスゲノム RNAをコードする DNAを提供する。また本発明は、本発明のベクタ 一の製造に適用するための、該ベクターのゲノム RNAをコードする DNAの使用に関 する。組み換えウィルスの再構成は公知の方法を利用して行うことができる（
W097/16539; W097/16538; Durbin, A. P. et al., 1997, Virology 235: 323-332; Whelan, S. P. et al" 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 8388—8392; Schnell. M. J. et al., 1994, EMBO J. 13: 4195—4203; Radecke, F. et al., 1995, EMBO J. 14: 5773-5784; Lawson, N. D. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4477-4481;
Garcin, D. et al" 1995, EMBO J. 14: 6087-6094; Kato, A. et al" 1996, Genes Cells 1: 569-579; Baron, M. D. and Barrett, T., 1997, J. Virol. 71: 1265-1271; Bridgen, A. and Elliott, R. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 15400-15404)。これらの 方法により、パラインフルエンザ、水疱性口内炎ウィルス、狂犬病ウィルス、麻疹ウイ ルス、リンダ一ペストウィルス、センダイウィルスなどを含むマイナス鎖 RNAウィルスを DNAから再構成させることができる。これらの方法に準じて、本発明のベクターを再構 成させることができる。ウィルスベクター DNAにおいて、 F遺伝子、 HN遺伝子、および /または M遺伝子を欠失させた場合には、そのままでは感染性のウィルス粒子を形成 しないが、宿主細胞に、これら欠失させた遺伝子および/または他のウィルスのェン ベロープ蛋白質をコードする遺伝子などを別途、細胞に導入し発現させることにより、 感染性のウィルス粒子を形成させることが可能である。 [0072] 具体的な手順は、（a)マイナス鎖 RNAウィルスゲノム RNA (ネガティブ鎖 RNA)または その相補鎖 (ポジティブ鎖）をコードする cDNAを、 N、 P、および L蛋白質を発現する細 胞で転写させる工程、 (b)生成したマイナス鎖 RNAウィルスを含む培養上清を回収す る工程、により製造することができる。転写のために、ゲノム RNAをコードする DNAは 適当なプロモーターの下流に連結される。転写されたゲノム RNAは N、 L、および P蛋 白質の存在下で複製され RNP複合体を形成する。そして M、 HN、および F蛋白質の 存在下でエンベロープに包まれたウィルス粒子が形成される。ゲノム RNAをコードす る DNAは、例えば T7プロモーターの下流に連結させ、 T7 RNAポリメラーゼにより RNAに転写させる。プロモーターとしては、 T7ポリメラーゼの認識配列を含むもの以 外にも所望のプロモーターを利用することができる。あるいは、インビトロで転写させ た RNAを細胞にトランスフエタトしてもよい。
[0073] DNAからのゲノム RNAの最初の転写に必要な T7 RNAポリメラーゼ等の酵素は、こ れを発現するプラスミドまたはウィルスベクターの導入によって供給することができる し、または、例えば細胞の染色体に RNAポリメラーゼ遺伝子を、発現を誘導できるよう に組み込んでおき、ウィルス再構成時に発現を誘導することにより供給することもでき る。またゲノム RNA、およびベクター再構成に必要なウィルス蛋白質は、例えばこれら を発現するプラスミドの導入によって供給する。これらのウィルス蛋白質の供給にお V、て、野生型またはある種の変異マイナス鎖 RNAウィルスなどのヘルパーウィルスを 用いることちでさる。
[0074] ゲノム RNAを発現する DNAを細胞内に導入する方法には、例えば次のような方法、 (0 目的の細胞が取り込めるような DNA沈殿物を作る方法、 GO 目的の細胞による取り こみに適し、かつ細胞毒性の少な!/ヽ陽電荷特性を持つ DNAを含む複合体を作る方 法、（iii) 目的の細胞膜に、 DNA分子が通り抜けられるだけに十分な穴を電気パルス によって瞬間的に開ける方法などがある。
[0075] (ii)としては、種々のトランスフエクシヨン試薬が利用できる。例えば、 DOTMA (Roche ) , Superfect (QIAGEN #301305)、 DOTAPゝ DOPE, DOSPER (Roche #1811169)など が挙げられる。（i)としては例えばリン酸カルシウムを用いたトランスフエクシヨン法が挙 げられ、この方法によって細胞内に入った DNAは貪食小胞に取り込まれる力 核内 にも十分な量の DNAが入ることが知られている（Graham, F. L. and Van Der Eb, J., 1973, Virology 52: 456; Wigler, M. and Silverstein, S" 1977, Cell 11: 223) 0 Chenお よび Okayamaはトランスファー技術の最適化を検討し、 1)細胞と共沈殿物のインキュ ベーシヨン条件を 2— 4% CO 、 35°C、 15— 24時間、 2) DNAは直鎖状より環状のも
2
のが活性が高ぐ 3)沈殿混液中の DNA濃度が 20— 30 micro-g/mlのとき最適な沈殿 が得られると報告している（Chen, C. and Okayama, H.， 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 2745) o (ii)の方法は、一過的なトランスフエクシヨンに適している。古くは DEAE-デキス トラン（Sigma #D-9885 M.W. 5 X 105 )混液を所望の DNA濃度比で調製し、トランスフ ェクシヨンを行う方法が知られている。複合体の多くはエンドノームの中で分解されて しまうため、効果を高めるためにクロ口キンをカ卩えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。（iii)の方法は電気穿孔法と呼ばれる方法で、 細胞選択性がな ヽと 、う点で (0または GOの方法に比べて汎用性が高 、。効率はパル ス電流の持続時間、パルスの形、電界（電極間のギャップ、電圧）の強さ、バッファー の導電率、 DNA濃度、細胞密度の最適条件下で良いとされている。
[0076] 以上、 3つのカテゴリーの中で (ii)の方法は操作が簡便で多量の細胞を用いて多数 の検体を検討することができるので、ベクター再構成のための DNAの細胞への導入 には、トランスフエクシヨン試薬が適している。好適には Superfect Transfection Ragent (QIAGEN, Cat No. 301305)、または DOSPER Liposomal Transfection Reagent (Roche, Cat No. 1811169)が用いられるが、これらに制限されない。
[0077] cDNAからのウィルスの再構成は具体的には例えば以下のようにして行うことができ る。
24穴から 6穴程度のプラスチックプレートまたは 100mmペトリ皿等で、 10%ゥシ胎児 血清 (FCS)および抗生物質（100 units/mlペニシリン Gおよび 100 micro-g/mlストレ プトマイシン)を含む最少必須培地 (MEM)を用いてサル腎臓由来細胞株 LLC-MK2 ( ATCC CCL- 7)をほぼ 100%コンフルェントになるまで培養し、例えば 1 micro- g/ml psoralen (ソラレン)存在下、紫外線 (UV)照射処理を 20分処理で不活化した、 T7 RNAポリメラーゼを発現する組換えワクシニアウィルス vTF7- 3 (Fuerst, T. R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8122—8126,1986、 Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)を 2 PFU/細胞で感染させる。ソラレンの添加量および UV照射時間 は適宜調整することができる。感染 1時間後、 2— 60 micro-g,より好ましくは 3— 20 micro- gの組換えセンダイウィルスのゲノム RNAをコードする DNAを、ウィルス RNPの 生成に必須なトランスに作用するウィルス蛋白質を発現するプラスミド (0.5— 24 micro— gの pGEM— N、 0.25一 12 micro— gの pGEM— P、および 0.5一 24 micro— gの pGEM-L) (Kato, A. et al., Genes Cells 1: 569-579, 1996)と共に Superfect (QIAGEN 社）を用いたリポフエクシヨン法等によりトランスフエクシヨンする。 N、 P、および Lをコー ドする発現ベクターの量比は例えば 2 : 1 : 2とすることが好ましぐプラスミド量は、例 えば 1一 4 micro— gの pGEM— N、 0.5一 2 micro— gの pGEM— P、および 1一 4 micro— gの pGEM-L程度で適宜調整する。
トランスフエクシヨンを行った細胞は、所望により 100 micro-g/mlのリファンピシン（ Sigma)及びシトシンァラビノシド (AraC)、より好ましくは 40 micro- g/mlのシトシンァラ ピノシド (AraC) (Sigma)のみを含む血清不含の MEMで培養し、ワクシニアウィルスに よる細胞毒性を最少にとどめ、ウィルスの回収率を最大にするように薬剤の最適濃度 を設定する（Kato, A. et al., 1996, Genes Cells 1: 569-579) 0トランスフエクシヨンから 48— 72時間程度培養後、細胞を回収し、凍結融解を 3回繰り返して細胞を破砕した 後、 RNPを含む破砕物を LLC-MK2細胞に再度トランスフエクシヨンして培養する。ま たは、培養上清を回収し、 LLC- MK2細胞の培養液に添加して感染させ培養する。ト ランスフエクシヨンは、例えばリボフヱクトァミンまたはポリカチォニックリボソームなどと 共に複合体を形成させて細胞に導入することが可能である。具体的には、種々のトラ ンスフエクシヨン試薬が利用できる。例えば、 DOTMA (Roche) , Superfect (QIAGEN #301305)、 DOTAP、 DOPE, DOSPER (Roche #1811169)などが挙げられる。エンドソ ーム中での分解を防ぐため、クロ口キンを加えることもできる（Calos, M. P., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3015)。 RNPが導入された細胞では、 RNPからのウイ ルス遺伝子の発現および RNPの複製の過程が進行しベクターが増幅する。得られた ウィルス溶液を希釈 (例えば 106倍)して再増幅を繰り返すことにより、ワクシニアウイ ルス VTF7-3は完全に除去することができる。再増幅は、例えば 3回以上繰り返す。得 られたベクターは- 80°Cで保存することができる。エンベロープ蛋白質をコードする遺 伝子を欠損した伝播能を持たな ヽウィルスベクターを再構成させるには、ェンベロー プ蛋白質を発現する LLC-MK2細胞をトランスフエクシヨンに使用する力、またはェン ベロープ発現プラスミドを共にトランスフエクシヨンすればよい。また、トランスフエクショ ンを行った細胞にエンベロープ蛋白質を発現する LLC-MK2細胞を重層して培養す ることによって欠損型ウィルスベクターを増幅することもできる（国際公開番号
WO00/70055および WO00/70070参照）。
[0079] 回収されたウィルスの力価は、例えば CIU (Cell-Infected Unit)測定または赤血球 凝集活性 (HA)の測定することにより決定することができる (WOOO/70070; Kato, A. et al., 199り, Genes Cells 1: 569—579; Yonemitsu, Y. & Kaneda, Y., Hemaggulutinating virus of Japan— liposome— mediated gene delivery to vascular cells. Ed. by Baker AH. Molecular Biology of Vascular Diseases. Method in Molecular Medicine: Humana Press: pp. 295-306, 1999)。また、 GFP (緑色蛍光蛋白質）などのマーカー遺伝子を 搭載したベクターについては、マーカーを指標に直接的に感染細胞をカウントするこ とにより力価を定量することができる（例えば GFP-CIUとして)。このようにして測定し た力価は、 CIUと同等に扱うことができる（WOOO/70070)。
[0080] ウィルスベクターが再構成する限り、再構成に用いる宿主細胞は特に制限されない 。例えば、センダイウィルスベクター等の再構成においては、サル腎由来の
LLC- MK2細胞および CV-1細胞、ハムスター腎由来の BHK細胞などの培養細胞、ヒ ト由来細胞等を使うことができる。これらの細胞に適当なエンベロープ蛋白質を発現 させることで、その蛋白質をエンベロープに有する感染性ウィルス粒子を得ることもで きる。また、大量にセンダイウィルスベクターを得るために、上記の宿主から得られた ウィルスベクターを発育鶏卵に感染させ、該ベクターを増幅することができる。鶏卵を 使ったウィルスベクターの製造方法は既に開発されている（中西ら編, (1993),「神経科 学研究の先端技術プロトコール III,分子神経細胞生理学」，厚生社，大阪， pp. l53-172) 0具体的には、例えば、受精卵を培養器に入れ 9一 12日間 37— 38°Cで 培養し、胚を成長させる。ウィルスベクターを尿膜腔へ接種し、数日間（例えば 3日間 )卵を培養してウィルスベクターを増殖させる。培養期間等の条件は、使用する組み 換えセンダイウィルスにより変わり得る。その後、ウィルスを含んだ尿液を回収する。 尿液からのセンダイウィルスベクターの分離 ·精製は常法に従って行うことができる（ 田代眞人,「ウィルス実験プロトコール」，永井、石浜監修，メジカルビユー社， pp.68-73,(1995)) 0
[0081] 例えば、 F遺伝子を欠失したセンダイウィルスベクターの構築と調製は、以下のよう に行うことができる（WO00/70055および WO00/70070参照）。
く 1〉 F遺伝子欠失型センダイウィルスゲノム cDNAおよび F発現プラスミドの構築 センダイウィルス（SeV)全長ゲノム cDNA、 pSeV18+ b (+) (Hasan, M. K. et al.， 1997, J. General Virology 78: 2813—2820) (「pSeV18+ b(+)」は「pSeV18+」ともいう）の cDNAを Sphl/Kpnlで消化してフラグメント (14673bp)を回収し、 pUC18にクローユングしてプラ スミド PUC18/KSとする。 F遺伝子欠損部位の構築はこの pUC18/KS上で行う。 F遺伝 子の欠損は、 PCR-ライゲーシヨン方法の組み合わせで行い、結果として F遺伝子の ORF (ATG-TGA=1698bp)を除!、て例えば atgcatgccggcagatga (配列番号： 4)で連結 し、 F遺伝子欠失型 SeVゲノム cDNA(pSeV18+/ A F)を構築する。 PCRは、 Fの上流に は [forward: 5 - gttgagtactgcaagagc/酉己列番号： 5, reverse:
5— tttgccggcatgcatgtttcccaaggggagagttttgcaaccZ酉己歹1 J¾" ： 6]、 F¾fcナの下流に ~ . [forward:
Figure imgf000039_0001
reverse:
5'-tgggtgaatgagagaatcagcZ配列番号： 8]のプライマー対を用いた PCRの産物を EcoT22Iで連結する。このように得られたプラスミドを Sadと Sailで消化して、 F遺伝子 欠損部位を含む領域の断片 (493 lbp)を回収して pUC18にクローユングし、 pUC18/dFSSとする。この pUC18/dFSSを Dralllで消化して、断片を回収して pSeV18+ の F遺伝子を含む領域の Dralll断片と置き換え、ライゲーシヨンしてプラスミド pSeV18+ / A Fを得る。
外来遺伝子は、例えば pUC18/dFSSの F遺伝子欠失部位にある制限酵素 Nsilおよ び NgoMIV部位に挿入する。このためには、例えば外来遺伝子断片を、 Nsil-tailed プライマーおよび NgoMIV- tailedプライマーで増幅すればよい。
[0082] く 2〉 SeV-F蛋白を誘導発現するヘルパー細胞の作製
センダイウィルスの F遺伝子（SeV-F)を発現する Cre/loxP誘導型発現プラスミドの 構築は SeV-F遺伝子を PCRで増幅し、 Cre DNAリコンビナーゼにより遺伝子産物が 誘導発現されるように設計されたプラスミド pCALNdlw(Arai, T. et al.， J. Virology 72, 1998, plll5- 1121)のユニークサイト Swal部位に挿入し、プラスミド pCALNdLw/Fを 構築する。
F遺伝子欠損ゲノムから感染ウィルス粒子を回収するため、 SeV-F蛋白を発現する ヘルパー細胞株を榭立する。細胞は、例えば SeVの増殖によく用いられているサル 腎臓由来細胞株 LLC- MK2細胞を用いることができる。 LLC- MK2細胞は、 10%の熱 処理した不動化ゥシ胎児血清 (FBS)、ペニシリン Gナトリウム 50単位/ ml、およびストレ プトマイシン 50 micro- g/mlを添カ卩した MEMで 37°C、 5% COで培養する。 SeV- F遺
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伝子産物は細胞傷害性を有するため、 Cre DNAリコンビナーゼにより F遺伝子産物を 誘導発現されるように設計された上記プラスミド pCALNdLw/Fを、リン酸カルシウム法 (.mammalian transfection kit (btratagene))【こより、周知のプロトコ ~~ノレ【こ つて LLC- MK2細胞に導入する。
10cmプレートを用い、 40%コンフルェントまで生育した LLC- MK2細胞に 10 micro-g のプラスミド pCALNdLw/Fを導入後、 10mlの 10% FBSを含む MEM培地にて、 37°Cの 5 %CO インキュベータ一中で 24時間培養する。 24時間後に細胞をはがし、 10ml培地
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に懸濁後、 10cmシャーレ 5枚を用い、 5ml 1枚、 2ml 2枚、 0.2ml 2枚に蒔き、 G418 (GIBCO- BRL)を 1200 micro- g/mlを含む 10mlの 10%FBSを含む MEM培地にて培養を 行い、 2日毎に培地交換しながら、 14日間培養し、遺伝子の安定導入株の選択を行 う。該培地により生育してきた G418に耐性を示す細胞はクローユングリングを用いて 回収する。回収した各クローンは 10cmプレートでコンフルェントになるまで拡大培養 を続ける。
F蛋白質の発現誘導は、細胞を 6cmシャーレにてコンフルェントまで生育させた後、 アデノウイルス AxCANCreを斉藤らの方法（Saito et al.， Nucl. Acids Res. 23:
3816-3821 (1995); Arai, T.et al, J. Virol 72,1115-1121 (1998))により例えば moi=3 で感染させて行うことができる。
く 3〉 F遺伝子欠失 SeVウィルスの再構築及び増幅
上記 pSeV18+/ A Fの外来遺伝子が挿入されたプラスミドを以下のようにして LLC- MK2細胞にトランスフエクシヨンする。 LLC- MK2細胞を 5 X 10。 cells/dishで 100mmのシャーレに播く。 T7 RNAポリメラーゼによりゲノム RNAの転写を行わせる場 合には、細胞培養 24時間後、ソラレン (psoralen)と長波長紫外線 (365nm)で 20分間 処理した T7 RNAポリメラーゼを発現するリコンビナントワクシニアウィルス (
PLWUV-VacT7 : Fuerst, T.R. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 8122—8126 (1986))を MOI 2程度で室温で 1時間感染させる。ワクシニアウィルスへの紫外線照射 には、例えば 15ワットバルブを 5本が装備された UV Stratalinker 2400 (カタログ番号 400676 (100V),ストラタジーン社， La Jolla, CA, USA)を用いることができる。細胞を 無血清の MEMで洗浄した後、ゲノム RNAを発現するプラスミド、およびマイナス鎖 RNAウィルスのそれぞれ N、 P、 L、 F、および HN蛋白質を発現する発現プラスミドを、 適当なリポフエクシヨン試薬を用いてこの細胞にトランスフエタトする。プラスミドの量比 は、これに限定されないが、好適には順に 6 : 2 : 1 : 2 : 2 : 2とすることができる。例えば 、ゲノム RNAを発現するプラスミド、並びに N、 P、 L、および Fプラス HN蛋白質を発現 する発現プラスミド（pGEM/NP, pGEM/P, pGEM/L及び pGEM/F-HN;
WO00/70070, Kato, A. et al., Genes Cells 1, 569-579 (1996))を、それぞれ 12 micro- g, 4 micro- g, 2 micro- g, 4 micro- g及び 4 micro- gZ dishの量比トランスフエ外 する。数時間培養後、血清を含まない MEMで細胞を 2回洗浄し、 40 micro-g/mLの し ytosine β -D-arabinoluranoside (AraC： bigma, St. Louis, MOノ及び 7.5
micro- g/mLの Trypsin (Gibco-BRL, Rockville, MD)を含む MEMで培養する。これら の細胞を回収し、ペレットを OptiMEMに懸濁する（107 cells/ml) o凍結融解を 3回繰 り返して lipofection reagent DOSPER (Boehringer mannheim)と混合し（106cells/25 micro-L DOSPER)室温で 15分放置した後、上記でクローユングした F発現ヘルパー 細胞にトランスフエクシヨン（106cells /well 12-weU-plate)し、血清を含まない MEM (40 micro- g/ml AraC, 7.5 micro- g/mlトリプシンを含む)で培養し、上清を回収する。 F 以外の遺伝子、例えば HNまたは M遺伝子を欠損したウィルスも、これと同様の方法 で調製することができる。
ウィルス遺伝子欠損型ベクターを調製する場合、例えば、ベクターに含まれるウイ ルスゲノム上で欠損しているウィルス遺伝子が異なる 2種またはそれ以上のベクター を同じ細胞に導入すれば、それぞれで欠損するウィルス蛋白質力 他のベクターか らの発現により供給されるため、互いに相補しあって感染力のあるウィルス粒子が形 成され、複製サイクルがまわりウィルスベクターが増幅される。すなわち、 2種またはそ れ以上の本発明のベクターを、ウィルス蛋白質を相補する組み合わせで接種すれば 、それぞれのウィルス遺伝子欠損型ウィルスベクターの混合物を大量かつ低コストで 生産することができる。これらのウィルスは、ウィルス遺伝子が欠損しているため、ウイ ルス遺伝子を欠損して ヽな 、ウィルスに比べゲノムサイズが小さくなりサイズの大き ヽ 外来遺伝子を保持することができる。また、ウィルス遺伝子の欠損により増殖性がな V、これらのウィルスは細胞外で希釈され共感染の維持が困難であることから、不稔ィ匕 するため、環境放出管理上の利点がある。
[0085] マイナス鎖 RNAウィルスにより導入する外来遺伝子としては、特に制限はないが、 天然の蛋白質としては、例えばホルモン、サイト力イン、増殖因子、受容体、細胞内シ グナル分子、酵素、ペプチドなどが挙げられる。蛋白質は分泌蛋白質、膜蛋白質、細 胞質蛋白質、核蛋白質などであり得る。人工的な蛋白質としては、例えば、キメラ毒 素などの融合蛋白質、ドミナントネガティブ蛋白質 (受容体の可溶性分子または膜結 合型ドミナントネガティブ受容体を含む）、欠失型の細胞接着分子および細胞表面分 子などが挙げられる。また、分泌シグナル、膜局在化シグナル、または核移行シグナ ル等を付加した蛋白質であってもよい。導入遺伝子としてアンチセンス RNA分子また は RNA切断型リボザィムなどを発現させて、特定の遺伝子の機能を抑制することもで きる。外来遺伝子として疾患の治療用遺伝子を用いてウィルスベクターを調製すれ ば、このベクターを投与して遺伝子治療を行うことが可能となる。本発明のウィルスべ クタ一の遺伝子治療への応用としては、直接投与による遺伝子発現、間接 (ex vivo) 投与による遺伝子発現のいずれの方法によっても、治療効果を期待できる外来遺伝 子もしくは患者の体内で供給が不足している内在遺伝子等を榭状細胞力 発現させ ることが可能である。また本発明の方法は、再生医療における遺伝子治療ベクターと しても利用できる。
[0086] 本明細書に記載したウィルス製造方法に従えば、本発明のウィルスベクターは、例 えば 1 X 105 CIU/mL以上、好ましくは 1 X 106 CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 106 CIU/mL以上、より好ましくは 1 X 107 CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 107 CIU/mL以 上、より好ましくは 1 X 108 CIU/mL以上、より好ましくは 5 X 108 CIU/mL以上の力価 でウィルス産生細胞の細胞外液中に放出させることが可能である。ウィルスの力価は 、本明細書および他に記載の方法により測定することができる（Kiyotani, K. et al, Virology 177(1), 65-74 (1990); WO00/70070)。
[0087] 回収したウィルスベクターは実質的に純粋になるよう精製することができる。精製方 法はフィルトレーシヨン (濾過）、遠心分離、吸着、およびカラム精製等を含む公知の 精製 ·分離方法またはその任意の組み合わせにより行うことができる。「実質的に純 粋」とは、ベクターを含む溶液中でベクターの成分が主要な割合を占めることを言う。 例えば実質的に純粋なウィルスベクター組成物は、溶液中に含まれる全蛋白質 (伹 しキャリアーや安定剤としてカ卩えた蛋白質は除く）のうち、ウィルスベクターの成分とし て含まれる蛋白質の割合が 10% (重量/重量）以上、好ましくは 20%以上、より好ましく は 50%以上、好ましくは 70%以上、より好ましくは 80%以上、さらに好ましくは 90%以 上を占めることにより確認することができる。例えばパラミクソウィルスベクターであれ ば、具体的な精製方法としては、セルロース硫酸エステルまたは架橋ポリサッカライド 硫酸エステルを用いる方法 (特公昭 62-30752号公報、特公昭 62-33879号公報、およ び特公昭 62-30753号公報）、およびフコース硫酸含有多糖および/またはその分解 物に吸着させる方法 (WO97/32010)等を例示することができる力 これらに制限され ない。
[0088] ベクターを含む組成物の製造においては、ベクターは必要に応じて薬理学的に許 容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。「薬学的に許容される 担体または媒体」とは、ベクターと共に投与することが可能であり、ベクターによる遺 伝子導入を有意に阻害しない材料である。このような担体または媒体としては、例え ば脱イオン水、滅菌水、塩化ナトリウム溶液、デキストロース溶液、デキストロースおよ び塩ィ匕ナトリウム、乳酸含有リンゲル溶液、培養液、血清、リン酸緩衝生理食塩水（ PBS)などが挙げられ、これらとベクターを適宜組み合わせて製剤化することが考えら れる。また、リボソームの膜安定化剤（例えばコレステロール等のステロール類)を含 んでいてもよい。また、抗酸化剤（例えばトコフエロールまたはビタミン Eなど）を含んで いてもよい。さらに、その他にも、植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤 等が含有されて ヽてもよ ヽ。また保存剤やその他の添加剤を添加することができる。 本発明の組成物は、水溶液、カプセル、懸濁液、シロップなどの形態であり得る。ま た本発明のベクター組成物は溶液、凍結乾燥物、またはエアロゾルの形態の組成物 であってよい。凍結乾燥物の場合は安定化剤としてソルビトール、シユークロース、ァ ミノ酸及び各種蛋白質等を含んで ヽてもよ ヽ。本発明のベクターを含む組成物は榭 状細胞に遺伝子を導入するための試薬として、さらに榭状細胞を標的とする遺伝子 治療に用いる医薬として有用である。またベクター溶液はワクチンとして有用である（ J.I. Mayordomo et al.， Nature Med. 1(12), 1279-1302, (1995) )。また、本発明のベタ ターにより榭状細胞で抗原ペプチドを発現させれば、このペプチドを提示する細胞は ワクチンとして使用できる。ワクチン組成物は、免疫原性を高めるために、サイト力イン 、コレラ毒素、サルモネラ毒素等の免疫促進剤を添加することもできる。またワクチン には、ミヨウノくン、不完全 Freund'sアジュバント、 MF59 (オイルェマルジヨン)、 MTP-PE (マイコバクテリア細胞壁由来の muramyl tripeptide)、および QS- 21 (soapbark tree Ouilaia saponaria由来）などのアジュバントを組み合わせることもできる。
[0089] また、組成物の投与に際しては、アジュバント効果を高めるサイト力イン類を組み合 わせることも有効である。このような遺伝子としては、例えば i) IL-2と一本鎖 IL-12と の糸且み合わせ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (15): 8591-8596, 1999)、 ii) IL- 2とイン ターフェロン- γ (米国特許第 5,798,100号）、 iii)単独で用いられる顆粒球コロニー刺 激因子（GM- CSF)、 iv) GM- CSFと IL- 4の組み合わせ（J. Neurosurgery 90 (6), 1115-1124 (1999))などが挙げられる。
[0090] 榭状細胞に提示させる抗原は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターにコードさせたり、 あるいはベクターを導入した榭状細胞に添カ卩（すなわちパルス）したり、または別の所 望のベクターで発現させることができる。抗原としては、感染微生物、ウィルス、寄生 虫、病原体、および癌などに関連する所望の抗原が挙げられる。これらは、構造タン ノ ク質または非構造タンパク質であってょ 、。このような抗原 (またはそのプロセスさ れたペプチド）は、榭状細胞表面の MHC分子に結合して細胞表面に提示され、免疫 応答が誘導される。
[0091] ワクチンとして用いる場合、例えば腫瘍、感染症、およびその他の一般的な疾患に 対して適用することができる。感染症の治療としては、例えば感染性微生物の抗原蛋 白のェピトープを解析し、これを榭状細胞で発現または提示させることができる。 例えば病原体由来の抗原としては、 A型肝炎ウィルス、 B型肝炎ウィルス、 C型肝炎 ウィルス、デルタ型肝炎ウィルス、乳頭腫ウィルス抗原、単純へルぺスウィルス（HSV) 、水痘 帯状疱疹ウィルス (VZV)、ェプスタイン バーウィルス、サイトメガロウィルス（ CMV)、 HIV、およびマラリアなどが有する蛋白質またはその部分ペプチドが挙げら れる。これらの抗原蛋白質をコードするマイナス鎖 RNAウィルスは、予防的および治 療的に用いることができる。具体的には、例えばインフルエンザにおいては、強毒株 H5N1型等のエンベロープ、日本脳炎においては、例えば日本脳炎ウィルスのェン ベロープ蛋白質（Vaccine, vol. 17, No. 15-16, 1869-1882 (1999))、エイズにおいて は、例えば HIV gagまたは SIV gag蛋白質 (J. Immunology (2000) vol. 164,
4968-4978)、 HIVエンベロープ蛋白質、 Nef蛋白質、その他のウィルス蛋白質などが 挙げられる。コレラにおいては、例えばコレラ毒素の Bサブユニット（CTB) (Arakawa T, et al, Nature Biotechnology (1998) 16(10): 934—8、 Arakawa T, et al, Nature Biotechnology (1998) 16(3): 292- 7)、狂犬病においては、例えば狂犬病ウィルスの 糖タンパク（Lodmell DL et al., 1998, Nature Medicine 4(8):949- 52)、子宮頸癌にお いては、ヒトパピローマウィルス 6型のカプシドタンパク LI (J. Med. Virol, 60, 200-204 (2000))などが挙げられる。また、その他の病原性ウィルスの抗原蛋白質をベクターか ら発現させることもできる。また、日本脳炎の JE-E抗原タンパク質 (特開昭 64-74982、 特開平 1-285498)、ヒト単純へルぺスウィルスの gD2タンパク質（特開平 5-252965)、 C型肝炎ウィルス由来ポリペプチド (特開平 5-192160)、偽狂犬病ウィルス由来ポリべ プチド (特表平 7-502173)などを用いることもできる。例えば、これらの病原性微生物 に感染した患者由来の細胞を解析して、抗原提示細胞 (APC)において提示された 抗原蛋白のェピトープを同定し、これを用いてもよい。 HLA型を適宜選択すること〖こ より、所望の HLA型に対するェピトープを同定して用いることも好ま 、。
腫瘍に対する免疫応答を特異的に促進させるには、 1以上の腫瘍抗原を発現する マイナス鎖 RNAウィルスベクターを榭状細胞に導入、またはマイナス鎖 RNAウィルス ベクターで活性ィ匕した榭状細胞に腫瘍抗原をパルスする。腫瘍抗原は腫瘍細胞に 特異的なもの（すなわち、腫瘍細胞に存在するが、非腫瘍細胞には存在しないもの） であっても、同じタイプの非腫瘍細胞よりも腫瘍細胞に高レベルで存在するものであ つてもよい。この榭状細胞を投与することにより免疫系が刺激される。 CTLが主なエフ ヱクタ一として働く場合は、抗原としては細胞内外に発現する所望の腫瘍抗原を用い ることができる。榭状細胞を用いて、 CD4 T細胞の活性化から引き続く B細胞の活性 化による抗体産生を惹起し、抗体をエフェクターとして作用させる場合には、抗原とし ては細胞表面に表出するものが好ましぐ例えば、細胞表面受容体または細胞接着 蛋白質を用いることができる。腫瘍抗原の例としては、卵巣癌等にする Muc-1または Muc-1様ムチンタンデムリピートペプチド (米国特許第 5,744,144号）、子宮頸癌を引 き起こすヒト乳頭腫ウィルス蛋白質 E6および E7、メラノーマ抗原 MART- 1、 MAGE-1、 -2、 -3、 gplOOおよびチロシナーゼ、前立腺癌抗原 PSA、その他にも、 CEA (Kim, C. et al., Cancer Immunol. Immunother. 47 (1998) 90- 9り)、および Her2neu
HER2p63-71、 p780-788; Eur. J. Immunol. 2000; 30: 3338-3346)などが挙げられる。
[0093] 本発明によって調製される榭状細胞は、癌および感染症に対する有効な免疫療法 において有用であり、腫瘍抗原もしくは感染症関連抗原の遺伝子が導入された榭状 細胞またはその榭状細胞で刺激された T細胞による免疫感作は、患者にぉ 、て抗腫 瘍または抗感染症免疫を誘導する有効な方法となる。本発明は、本発明の方法によ り得られた榭状細胞の免疫反応の誘導における使用にも関する。すなわち本発明は 、本発明の方法により得られた榭状細胞の、免疫療法における使用、具体的には、 例えば腫瘍または感染症の治療における使用に関する。また本発明は、本発明の方 法により得られた榭状細胞の、免疫活性化剤の製造における使用に関する。すなわ ち本発明は、本発明の方法により得られた榭状細胞の、免疫治療剤の製造における 使用、具体的には、例えば抗腫瘍剤 (腫瘍増殖抑制剤)または感染症治療薬の製造 における使用に関する。
[0094] また、一般病への適用も考えられる。糖尿病にぉ 、ては、例えば I型糖尿病モデル 動物において、インシュリン断片のペプチドをェピトープとして利用することが考えら れる（Coon, B. et al., J. Clin. Invest., 1999, 104(2) :189— 94)。
[0095] また、榭状細胞力もサイト力イン類を発現させれば、免疫系を刺激して、感染微生 物または癌に対する免疫応答を高めることから、サイト力インをコードする遺伝子を導 入した榭状細胞でも、癌その他のサイト力イン治療が有効と考えられる疾患の治療に ぉ 、て有用である。免疫刺激性サイト力インをコードする遺伝子を搭載するマイナス 鎖 RNAウィルスベクターが導入された榭状細胞は効果的な免疫誘導剤となる。例え ば、免疫刺激性サイト力インとして、インターロイキン（例えば、 IL-lalpha, IL- lbeta、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-12、 IL-15、 IL-18、 IL-19、 IL- 20、 IL- 21、 IL- 23、 IL- 27)、インターフェロン（例えば、 IFN- alpha、 IFN- beta、 IFN-gamma)、腫瘍壊死因子（TNF)、トランスフォーミング増殖因子 (TGF)-beta、顆 粒球コロニー刺激因子（G- CSF)、マクロファージコロニー刺激因子（M- CSF)、顆粒 球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF)、インスリン様増殖因子（IGF)- 1、 IGF-2、 Flt-3リガンド、 Fasリガンド、および c-kitリガンド、ならびに他の免疫調節タン ノ ク質 (ケモカインおよびコスティミュラトリー分子など）が含まれる。
[0096] これらのサイト力インのアミノ酸配列は当業者には周知であり、 IL-4については、例 えば、 Araiら（1989)、 J. Immunol. 142(1) 274-282、 IL- 6については、例えば、 Yasukawaら（1987)、 EMBO 、 6(10): 2939-2945、 IL- 12は、例えば、 Wolfe (1991)、 J. Immunol. 146(9): 3074-3081、 IFN- alphaは、例えば、 Grenら（1984) J. Interferon Res. 4(4): 609—617、および Weismannら（1982) Princess Takamatsu Symp. 12: 1—22、 TNFは、例えば、 Pennicaら（1984) Nature 312: 724—729、 G— CSFは、例えば、 Hirano ら（1986) Nature 324:73—76、 GM— CSFは、例えば、 Cantrellら（1985) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82(18): 6250-6254を参照することができる。より具体的には、 GM- CSFをコードする核酸配列としては Accession number NM_000758の 84— 461番 目の配列（アミノ酸配列は NP_000749の 18— 144番目）を含む配列が挙げられる。 IL-4 をコードする核酸配列としては、 Accession number NM_000589の 443— 829番目の配 列（アミノ酸配列は NP_000580の 25— 153番目）を含む配列が挙げられる。これらのサ イト力インをコードする天然の遺伝子または遺伝子暗号の縮重を利用して、機能的サ イト力インをなおコードする変異遺伝子を含むベクターを設計し、榭状細胞に導入す ることがでさる。
[0097] また、これらのサイト力インの改変体を発現するように遺伝子改変してもよ 、。例え ば、前駆体および成熟体の 2つの形態を持つサイト力イン (例えば、シグナルぺプチ ドの切断により活性フラグメントを生成するもの、または蛋白質の限定分解により活性 フラグメントを生成するものなど） について、前駆体または成熟体のいずれかを発現 するように遺伝子改変してもよい。その他の改変体 (例えば、サイト力インの活性フラ グメントと異種配列（例えば、異種シグナルペプチド）との間の融合タンパク質)を用い てもよい。
[0098] 例えば実施例に示すように、 IFN- beta遺伝子を搭載したマイナス鎖 RNAウィルスべ クタ一を導入した榭状細胞は、細胞傷害性 Tリンパ球を非常に強く活性化させ、抗原 である腫瘍の増殖を有意に抑制する。榭状細胞はベクターの導入により活性化され るので、毒性のある LPS等で榭状細胞を刺激する必要もない。このように、 IFN-beta 遺伝子を搭載したマイナス鎖 RNAウィルスベクターを導入した榭状細胞は、抗腫瘍 免疫治療のための有望な治療薬となる。 IFN-beta遺伝子はヒトおよびマウスを含む多 くの霊長類、哺乳類で周知であり、例ぇばヒトIFN-beta遺伝子は配列番号：12 (成熟 型ポリペプチドは配列番号： 13の 21— 187番目）、マウス IFN-betaは配列番号： 14 (成 熟型ポリペプチドは配列番号： 15の 21— 182番目）が挙げられる（Derynck, R. et al.， Nature 285, 542-547 (1980); Higashi, Y. et al, J. Biol. Chem. 258, 9522-9529 (1983); Kuga, T. et al., Nucleic Acids Res. 17, 3291 (1989))。シグナルペプチドは、 適宜他の蛋白質のシグナル配列に置換してもよ 、。
[0099] IFN- beta遺伝子は、上記の既知の IFN- beta cDNAおよび蛋白質の配列を基にホ モロジ一検索等により探し出すことができる（例えば BLAST; Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-410)。あるいは、既知の IFN- beta cDNA塩基配列を基 に設計したプライマーを用いた RT-PCRにより得ることもできるし、または IFN-beta cDNAをプローブにしてストリンジェントな条件におけるハイブリダィゼーシヨンにより、 ヒト、マウス、ラット、およびその他の哺乳動物 cDNAライブラリーをスクリーニングする ことにより得ることも容易である。ハイブリダィゼーシヨンの条件は、 IFN- beta cDNAの コード領域を含む核酸、またはハイブリダィズの対象とする核酸のどちら力からプロ一 ブを調製し、それが他方の核酸にハイブリダィズするかを検出することにより同定する ことができる。プローブは該核酸の断片であってよぐその長さは通常 20塩基以上、 好ましくは 30塩基以上、より好ましくは 50塩基以上である。ストリンジェントなハイブリダ ィゼーシヨンの条件は、例えば 5 X SSC (1 X SSCは 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrateを含む)、 7%(W/V) SDS、 100 micro- g/ml変性サケ*** DNA、 5 Xデンハルト 液（1 Xデンハルト溶液は 0.2%ポリビニールピロリドン、 0.2%牛血清アルブミン、および 0.2%フイコールを含む）を含む溶液中、 48°C、好ましくは 50°C、より好ましくは 52°Cで ハイブリダィゼーシヨンを行い、その後ハイブリダィゼーシヨンと同じ温度、より好ましく は 60°C、さらにこの好ましくは 65°C、最も好ましくは 68°Cで 2 X SSC中、好ましくは I X SSC中、より好ましくは 0.5 X SSC中（例えば 0.1 X SSC中）で、振蘯しながら 2時間洗浄 する条件である。
哺乳動物 IFN- betaの塩基配列またはアミノ酸配列は、一般に既知の IFN-betaの配 列（例えば配列番号： 12— 15の成熟蛋白質に対応する配列）と高いホモロジ一を有 する配列を含んでいる。高いホモロジ一とは、 70%以上、好ましくは 75%以上、より好 ましくは 80%以上、より好ましくは 85%以上、より好ましくは 90%以上、より好ましくは 95%以上の同一性 (identity)を有する配列である。配列の同一性は、例えば BLAST プログラムにより決定することができる (Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:
403-410)。具体的には、塩基配列の同一性を決定するには blastnプログラム、ァミノ 酸配列の同一性を決定するには blastpプログラムを用い、例えば NCBI (National Center for Biothchnology Information)の BLASTのウェブページにおいて「Low complexity]などのフィルターの設定は全て OFFにして、デフォルトのパラメータを用 いて計算を行う（Altschul, S.F. et al. (1993) Nature Genet. 3:266-272; Madden, T.L. et al. (1996) Meth. Enzymol. 266:131-141; Altschul, S.F. et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Zhang, J. & Madden, T.L. (1997) Genome Res.
7:649-656) oパラメータの設定は、例えば open gapのコストはヌクレオチドは 5で蛋白 質は 11、 extend gapのコストはヌクレオチドは 2で蛋白質は 1、 nucleotide mismatchの ペナノレティーは- 3、 nucleotide matchの報酬は 1、 expect valueは 10、 wordsizeはヌクレ ォチドは 11で蛋白質は 2、 Dropoff (X) for blast extensions in bitsは blastnでは 20で他 のプログフムで ίま 7、 X dropoff value for gapped alignment (in Dits)iま blastn以外で ίま 15、 final X dropoff value for gapped alignment (in bits)iま blastnで ίま 50で他のプロクフ ムでは 25にする。アミノ酸配列の比較においては、スコアのためのマトリックスとして BLOSUM62を用いることができる。 2つの配列の比較を行う blast2sequencesプログラ ム（Tatiana A et al. (1999) FEMS Microbiol Lett. 174:247-250)〖こより、 2配列のァラ ィメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。ギャップはミスマッチと同様 に扱い、 IFN- betaの成熟蛋白質のコード配列（CDS)の外側のギャップは無視して、 IFN- betaの成熟蛋白質の CDS全体（例えば配列番号： 12の 64— 561番目または 14の 64— 546番目 )またはアミノ酸配列全体（例えば配列番号： 13の 22— 187番目または配 列番号： 15の 22— 182番目）に対する同一性の値を計算する。
[0101] また、 IFN- betaには多型およびバリアントが存在する。野生型 IFN- betaと同等の活 性が維持されたバリアントを適宜使用することができる。野生型 IFN-betaと同等の活 性とは、抗ウィルス活性が挙げられ、例えば vesicular stomatitis virusによる細胞毒性 を阻害する活性のアツセィにより測定することができる。具体的には、 WISH cells (Cし L— 25; A.T.し.し. (American Type culture Collection;, Manassas, VA, U.S.A.;【こ vesicular stomatitis-Indiana-virus [VR— 1238AF; A.T.C.C.]を接種し、ウィルスによる 細胞死を検出し、 IFN-betaによる防御を測定する（測定条件は、 Knezic, Z., et al. (1993) Antiviral Res. 25, 215-221に従う)。ウィルスによる細胞死の 50%抑制濃度は 、 1 international unit (IU)と定義される。野生型 IFN- betaと同等の抗ウィルス活性を 持つポリペプチドは、好ましくは 1 X 106 IU/mg protein以上、より好ましくは 5 X 106 IU/mg protein以上、より好ましくは 1 X 107 IU/mg protein以上の比活性を示す。また 、野生型 IFN-betaと同等の抗ウィルス活性を持つポリペプチドは、好ましくは野生型 IFN- betaの 1/10以上の比活性で抗ウィルス活性を示す。
[0102] IFN- betaの多型およびバリアントは、一般にある 1つの IFN- beta分子種（例えば配 列番号： 12— 15)の塩基配列またはアミノ酸配列において 1または複数の残基が置換 、欠失、および/または挿入された配列を含み得る。公知の IFN-betaの配列との違い は、通常 30残基以内、好ましくは 20残基以内、好ましくは 10残基以内、より好ましくは 5残基以内、より好ましくは 3残基以内、より好ましくは 2残基以内である。アミノ酸の置 換は、保存的置換であってもよい。保存的に置換した蛋白質は活性が維持されやす い。保存的置換は、例えば塩基性アミノ酸 (例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、 酸性アミノ酸（例えばァスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性アミノ酸（例えばグ リシン、ァスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システィン）、非極性 アミノ酸（例えばァラニン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエ-ルァラニン、 メチォニン、トリプトファン）、 β分岐アミノ酸（例えばスレオニン、パリン、イソロイシン） 、および芳香族アミノ酸（例えばチロシン、フエ二ルァラニン、トリプトファン、ヒスチジ ン）などの各グループ内のアミノ酸間の置換などが挙げられる。
[0103] すなわち IFN-beta遺伝子としては、以下に記載の核酸が挙げられる。
(a)配列番号： 13の 22— 187番目または配列番号： 15の 22— 182番目に記載のァミノ 酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸。
(b)配列番号： 12の 64— 561番目、配列番号： 14の 64— 546番目、またはそれらの相 補配列を含み、配列番号： 13の 22— 187番目または配列番号： 15の 22— 182番目に 記載の配列を含むポリペプチドをコードする核酸。
(c)配列番号： 12の 64— 561番目、配列番号： 14の 64— 546番目、またはそれらの相 補配列の核酸断片とストリンジェントな条件下でハイブリダィズする核酸であって、野 生型 IFN-betaと同等の活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
(d)配列番号： 13の 22— 187番目または配列番号： 15の 22— 182番目に記載のァミノ 酸配列において 1または複数のアミノ酸が置換、欠失、および/または挿入された配 列を含み、野生型 IFN-betaと同等の活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
(e)配列番号： 12の 64— 561番目、配列番号： 14の 64— 546番目、またはそれらの相 補配列と高 、ホモロジ一を有する配列を含む核酸であって、野生型 IFN-betaと同等 の活性を有するポリペプチドをコードする核酸。
(f)配列番号： 13の 22— 187番目または配列番号： 15の 22— 182番目と高いホモロジ 一を有する配列を含み、野生型 IFN-betaと同等の活性を有するポリペプチドをコード する核酸。
[0104] マイナス鎖 RNAウィルスベクターにより遺伝子改変された榭状細胞は、患者自身の T細胞を in vivoで刺激するのに有用であり、あるいはこの遺伝子改変榭状細胞は T細 胞を in vitroで刺激するのにも有用である。感作した T細胞を患者に投与し、エタスビ ボ免疫療法を介して患者の免疫系を刺激することもできる。 [0105] 本発明は、榭状細胞により刺激された T細胞の製造方法であって、（a)マイナス鎖 RNAウィルスベクターを榭状細胞またはその前駆細胞に接触させる工程、 (b)該細 胞を成熟榭状細胞に分化させる工程、（c)該成熟榭状細胞を T細胞に接触させるェ 程、を含む方法に関する。榭状細胞で提示させる抗原は、ベクターから発現させた蛋 白質 (またはそのプロセスされた産物）であってもよいし、外から榭状細胞にパルスし てもよ ヽ。マイナス鎖 RNAウィルスベクターを導入した榭状細胞は T細胞を活性ィ匕し、 CTLを誘導する。
[0106] また本発明は、本発明の方法により製造した榭状細胞を用いて、免疫系を刺激す る方法に関する。例えば感染症または癌などに罹患した患者にぉ 、て免疫系を刺激 する治療を行うことができる。この方法は、榭状細胞または T細胞を投与する工程を 含む方法である。具体的には、（a)マイナス鎖 RNAウィルスベクターが導入された榭 状細胞の治療上有効量を、患者に投与する工程、あるいは、（b)マイナス鎖 RNAウイ ルスベクターが導入された榭状細胞によって刺激された、治療上有効量の T細胞を 患者に投与する工程、を含む方法である。マイナス鎖 RNAウィルスベクターは、外来 遺伝子を持たないものであってもよぐあるいは疾患に関連する抗原またはサイトカイ ンの 1つまたは複数をコードする遺伝子を持つものであってもよい。マイナス鎖 RNAゥ ィルスべクタ一は、榭状細胞に感染することにより榭状細胞を活性ィ匕するので、外来 遺伝子を持たな 、ベクターを感染させた榭状細胞でも、患者の免疫系を活性化させ ることができる。この榭状細胞に、抗原ペプチドをパルスして、所望の抗原を提示させ ることで、より効果の高い榭状細胞をうることができる。また、インビトロで T細胞と榭状 細胞を接触させる場合、患者力も T細胞を採取して、エタスビボ投与を行うことが好ま しい。
[0107] ベクターのインビボでの投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目 的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、当業者であれば 適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができるが、例えば経 皮的、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、腹腔内、静脈内、関節内、または皮下等に 行われうる。投与は局所あるいは全身であってよい。投与されるベクターは好ましくは 約 105 CIU/mlから約 10u CIU/ml、より好ましくは約 107 CIU/mlから約 109 CIU/ml、最も 好ましくは約 1 X 108 ClU/ml力 約 5 X 108 CIU/mlの範囲内の量を薬学上容認可能な 担体中で投与することが好ましい。ヒトにおいては 1回当たりの投与量は 2 X 105 CIU 一 2 X 1011 CIUが好ましぐ投与回数は、 1回または臨床上容認可能な副作用の範 囲で複数回可能であり、 1日の投与回数についても同様である。ヒト以外の動物につ いても、例えば目的の動物とヒトとの体重比または投与標的部位の容積比（例えば平 均値)で上記の投与量を換算した量を投与することができる。なお、伝播性のマイナ ス鎖 RNAウィルスベクターを個体または細胞に投与後、治療が完了するなどウィルス ベクターの増殖を抑止する必要が生じた際には、 RNA依存性 RNAポリメラーゼ阻害 剤を投与すれば、宿主に障害を与えずにウィルスベクターの増殖だけを特異的に抑 止することちでさる。
[0108] エタスビボ投与の場合は、体外 (例えば試験管またはシャーレ内）で榭状細胞にベ クタ一を接触させる。 MOIは 1一 500の間で投与することが好ましぐより好ましくは 2— 300、さらに好ましくは 3— 200、さらに好ましくは 5— 100、さらに好ましくは 7— 70である 。ベクターの投与対象としては特に制限はないが、例えば、 -ヮトリ、ゥズラ、マウス、 ラット、ィヌ、ブタ、ネコ、ゥシ、ゥサギ、ヒッジ、ャギ、サル、およびヒトなどを含む鳥類、 哺乳動物 (ヒトおよび非ヒト哺乳動物）、およびその他の脊椎動物が挙げられる。
[0109] ベクターを導入した榭状細胞を投与する場合は、一般的には、筋肉内、腹腔内、皮 下もしくは静脈内注射、あるいは、リンパ節への直接注入によって注入することができ る。好ましくは皮下、腹腔内注射またはリンパ節への直接注入により、患者に投与す る。形質導入された榭状細胞は、一般的には 105— 109細胞、好ましくは 106— 108細胞 、より好ましくは約 107細胞を患者に投与することができる。
[0110] マイナス鎖 RNAウィルスベクターが導入された榭状細胞は、抗腫瘍剤として有用で ある。例えばベクターを導入した榭状細胞を腫瘍部位に投与することによって、腫瘍 の増殖を抑制することができる。腫瘍部位とは、腫瘍またはその周囲 (例えば腫瘍か ら 5 mm以内、好ましくは 3 mm以内）の領域を言う。ベクターは外来遺伝子を搭載して いなくても抗腫瘍効果が期待できるが、 IFN-beta遺伝子をベクターに搭載させること でより高い効果が得られる。榭状細胞を腫瘍に投与する前に、榭状細胞に腫瘍抗原 を接触させるとより高い効果を得ることができる。榭状細胞への腫瘍抗原の接触は、 榭状細胞と腫瘍細胞の cell lysate (細胞溶解物）とを混合する方法、腫瘍抗原べプチ ドを榭状細胞にパルスする方法、ある ヽは榭状細胞に腫瘍抗原遺伝子を導入して発 現させる方法などを用いることができる。また、 IFN- betaまたは IFN-beta遺伝子を搭 載するベクターを腫瘍に直接注入することによっても抗腫瘍効果が得られる。例えば IFN-beta遺伝子を搭載するマイナス鎖 RNAウィルスベクターは、抗腫瘍剤として優れ ている。マイナス鎖 RNAウィルスベクターを導入した榭状細胞の投与と、 IFN-beta遺 伝子を搭載するベクターの腫瘍部位への注入を組み合わせれば、より高 ヽ抗腫瘍効 果が発揮される。
[Oil 1] 榭状細胞により活性ィ匕した T細胞を投与する場合は、例えば T細胞は、 1 m2の体表 面積あたり約 105— 109細胞、好ましくは 106— 109細胞、より好ましくは 108— 109細胞の 用量で、静脈内注入によって投与され得る（Ridellら、 1992、 Science 257: 238-241を 参照)。注入は、所望の間隔 (例えば、毎月）で繰り返され得る。投与後のレシピエン トは、必要に応じて任意の副作用について、 T細胞注入の間または注入後にモニタ 一されてよい。このとき、 T細胞は榭状細胞を得た患者と同じ患者力も得ることが好ま しい。あるいは、 T細胞を患者力も採取し、 T細胞を刺激するために用いる榭状細胞 は、 HLA適合性の健常なドナーに由来してもよい。または逆に、榭状細胞を患者から 採取し、 T細胞は HLA適合性の健常なドナーに由来してもよ!、。
[0112] 本発明により製造されるワクチンの有効成分である榭状細胞を含む細胞は、ヒト体 内に治療用のワクチンとして接種することから、細胞増殖性を無くしておくとより安全 である。例えば、臍帯血由来の単球は分ィ匕誘導することにより増殖能が極度に低下 することが知られているが、細胞ワクチンとしてより安全に利用するため、加熱処理、 放射線処理、あるいはマイトマイシン C処理などで処理し、ワクチンとしての機能を残 したまま、増殖性をなくすことができる。例えば、 X線照射を利用する場合、総放射線 量 1000— 3300 Radで照射することができる。マイトマイシン C処理法は、例えば、榭状 細胞に 25— 50 micro-g/mlのマイトマイシン Cを添カ卩し、 37°C、 30— 60分間保温処理 することができる。熱による細胞処理方法は、例えば、 50— 65°Cで 20分間加熱処理を 行うことができる。
実施例 [0113] 以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に制 限されるものではない。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の 一部として組み込まれる。
[0114] A.導入効率の検討
(実験 1)
健常者より単球をネガティブセレクションで濃縮（enrichment)した。単球の濃縮の 7こめのネカァイブセレクション【ま、 RosetteSep -human monocyte enrichment cocktail
(Stem Cell Technology Inc.)を用いた。すなわち、 tetrameric antibody (抗体 2分子が 結合している抗体で、一方は赤血球を認識する抗 glycophorin A抗体、他方が単核 球の表面抗原を認識する抗体でできて 、る）を用い、除去した!/、細胞を赤血球に結 合させ、 Ficoll Paque™ Plus (Pharmacia Biotech Inc.)で除去することにより実施した 。このネガティブセレクションにより、 CD2、 CD3、 CD8、 CD19、 CD56、 CD66bを発現し ている細胞が除去され、残った細胞を単球濃縮細胞として、次の DCの分化誘導に用 いた。この時の CD14+細胞は 65-80%であった。単球濃縮細胞に GM-CSF (500 U/ml)と IL— 4 (250 U/ml)を添加し、 endotoxin free RPMI + 10%FCSで培養後、 DCの 作成を行った。 3-4日目に半分の培養上清を同じ組成の新しい培養液で培養液交換 を行った。副刺激分子（Costimulatory molecule)、ならびに CDl lc、 HLA- class II (DR, DP, DQ)、および CDlaの発現が陽性であることを確認し、その他の lineage marker (CD3、 CD56、 CD19、 CD15および CD14)を表出していないことも確認した（図 1および非提示データ)。この細胞を用いて、ベクターの導入効率を検討した。この時 点で、生細胞の 90- 98%が DCマーカー（CDl lc、 HLA- class II(DR,DP,DQ》を発現 していた。
なお、本実施例におけるセレクションは上記キットを用いた力 抗体でコートされた 磁気ビーズを用いても、同様のセレクションを実施することが可能である。血球分離 等をもちいて単核球を採取するなど、細胞を大量に調製する場合は、ビーズを用い ることが好ましい。
[0115] (実験 2)
実験 1より得られた DC (分化誘導後 7日目）に、緑色蛍光蛋白質（GFP)を発現する センダイウィルスベクター（SeV-GFP) (伝播型、 WO00/70070)を MOIをふって感染さ せ、経時的に細胞数の変化、 GFPの発現、 costimulatory moleculesの発現程度につ いて検討した。その結果、 MOIについては、 MOI 20以上で％GFPは最大となった（図 2 一 5)。 GFPの平均蛍光強度（mean fluorescence intensity; MFI)については、 MOI 100まで上げることにより更に上昇させることが可能である（非提示データ)。また、 8日 目まで GFPの MFIは上昇した。 costimulatory molecules (CD80および CD86)につい ては、全体的に MOI 20以上で最大となった。細胞数の減少については、 MOIで 1一 20の間はあまり変化ないが、 MOI 50ではやや減少する傾向が見られたが有意差は なかった（図 6)。
[0116] (実験 3)
MOI 20で DCに SeV-GFPを感染させ、経時的に FACSを用いて、 GFPの発現を検討 した。その結果、 2週以後は発現が低下する（細胞数も減少)ものの、 2箇月までは発 現細胞を確認できた（図 7)。以下の実施例で示すように、マイナス鎖 RNAウィルスべ クタ一の感染で DCは活性ィ匕される。従って、マイナス鎖 RNAウィルスベクターを用い た DCへの遺伝子導入は臨床応用として、ワクチンへの応用が可能である。投与はィ ンビボでもエタスビボでも可能であるが、例えばエタスビボ投与によりベクターを感染 させた DCを頻回投与することにより、長期にわたって体内における遺伝子発現を持 続させることが可會である。
[0117] (実験 4)
活性化と感染効率を検討した。活性化の有無でベクターの感染効率が変化するか どうか検討を行った。 7日間培養後の DCに 2日間 LPS (1 micro-g/ml)で刺激した後、 SeV- GFPを MOI 30で感染、 2日後に FACSで GFPを解析した。逆に SeV- GFP感染 2 日後に LPS刺激 (2日間）を同じ条件で施行した。（図 8および 9)
結果;ヒトでは、 LPSで活性ィ匕した後に、％GFPにおいて 60%近くの陽性を認めた。こ れに対してマウス DCでは陽性率は極めて低力つた（非提示データ)。しかしヒトにお いても MFIは非常に低ぐ活性ィ匕した後の DCには遺伝子導入効率の極端な低下を 認めた。これに対して、ベクターを導入後に LPSで刺激しても、遺伝子導入効率は変 化しなかった。この結果は、マイナス鎖 RNAウィルスベクターで DCに遺伝子導入する 場合は、未成熟 DC、すなわち活性ィ匕を受けていない DCを使用することが好ましいこ とを示している。
[0118] (実験 5)
感染に必要な接触時間の検討を行った（図 10)。その結果、約 30分以下で遺伝子 導入が可能であることが判明した。
[0119] (実験 6)
他のウィルスベクターでの報告で CD34細胞に遺伝子導入し、 DC分化誘導で遺伝 子導入 DC作製に成功した報告がある（J. Immunol. Meth. 2002; 153-165)。
SeV-GFPでも同様の方法を試みた。ヒト臍帯血より、 CD34マイクロビーズを用いて、 CD34陽性幹細胞を分離 (CD34〉90%)し、 MOI 0、 10、 100で感染させた後、良く洗 浄した。その細胞を RPMI + 10%FCSに SCF (50 ng/ml)、 GM-CSF (500 U/ml)、 TNF— alpha (50 ng/ml)を添加し、 3日間培養後、 SCF (50 ng/ml)、 GM-CSF (500 U/ml)、 IL-4 (250 U/ml)、 TNF-alpha (50ng/ml)を添カ卩したメヂゥムで継代（半量のメ ディウムを 3— 4日に交換）したものをベクターの感染より 13日目に GFPの発現を検討 した。その結果、遺伝子導入効率は 65— 70%に達し、他のベクター以上に GFPの発 現効率の良い DCが作製された。感染後の DCは副刺激分子の発現の解析より、感染 させていないものと比べて活性ィ匕を受けているものが回収された。（図 11および 12) 以上の実施例から、マイナス鎖 RNAウィルスはレンチウィルス、レトロウイルスに比 較して、導入効率は格段に優れており、アデノウイルスに劣らない導入効率を極めて 簡便に迅速に得ることができることが実証された。また、他のベクターでは活性ィ匕マ 一力一は変動しな 、が、マイナス鎖 RNAウィルスの感染により DCを活性ィ匕を誘導で きることが判明した。
[0120] B.導入後の DC機能の評価
(実験 1)
DCに SeV- GFPを MOI 30-50で感染させ、 1日後に LPSで刺激（2日間）し、その後、 costimulatory moleculesの発現を検討した。コントロールとして、 LPS刺激のみ、 SeV-GFP感染のみ、および LPS刺激も SeV-GFP感染もなし、の条件について比較検 B、Jした。 結果;得られた結果から、 SeV感染のみでも DCの活性ィ匕が起こることが示された。 LPSと匹敵するもの； CD80 (+) HLA-DR (-) CD83 (-)
LPSより強!、もの； CD86 (+) CCR7 (-)
LPSより弱いもの； CD40 (- )
(+)は LPS+SeVで相乗効果のあるものを表す。（図 13-15)
[0121] (実験 2)
MOI 30で DCに SeV- GFPを感染 (感染後 3日目、感染後 1日目に、あるグループは LPSで刺激)させ、実験 1と同様の群について、食細胞能力を検討した（1 micro-m PCV-RED latex- microspheresを使用。棒グラフは 4°Cで陽性となるバックグランドを 差し引いたもの)。
結果;活性ィ匕マーカーでも見たように、 SeVで感染したものは、活性ィ匕のため、貪食 能の低下が見られた。特に、 GFPの発現が高いもの程、貪食能が低力つた。従って、 例えば DCで腫瘍抗原を提示させるために腫瘍の lysateを使用する場合は、マイナス 鎖 RNAウィルスベクターを DCに導入する前に lysateと DCを共培養することが好ましい 。 (図 16—17)
[0122] (実験 3)
SeVによる榭状細胞の活性ィ匕に伴う榭状細胞サイト力イン産生能を検討するために 、 7日間の培養で得られた単球由来榭状細胞（MoDC)を 12穴のプレートで 48時間（ 8xl05/2ml/well:メディウムは X- vivol5™+2%自己血清 + GM-CSF (500 U/ml)+IL- 4 (250 U/ml))、以下の群の条件で培養した上清中の TNF- alpha、 IL- lbeta、 IL- 6、 IL- 8 の値を Luminex™ systemで測定した。 SeVの感染は MOI 30で 2日間培養した。
Unstimulated群：メディウムのみの群
Allantoic fluid群： SeVの浮遊液である鶏卵しょう尿液（SeVは含まない） 60 micro-L添 加した群
UV-SeV-GFP群： SeV-GFP溶液を紫外線照射し、 replication能力を除去した溶液 60 micro— L添カ卩した群
SeV- GFP: SeV- GFP溶液を 60 micro- L添カ卩した群（replication- competent SeV) 結果： replication-competent SeVで GFPを遺伝子導入した榭状細胞のみ TNF- alpha、 IL- lbeta、 IL- 6を産生、 IL- 8の産生を増大した（図 18)。この時の、榭状 細胞上の CD40、 CD80、 CD83、 CD86、 HLA- DRの発現上昇は
replication-competent SeVのみに誘導された（図 19および 20)。このことは、 SeVを榭 状細胞に遺伝子導入するのみで、免疫応答時に重要な炎症性サイト力イン（ proinflammatory cytokine)の榭状細胞による産生を惹起することができることを意味 している。また、榭状細胞遺伝子導入時における榭状細胞の膜上のレセプターと SeV の接触による榭状細胞の活性ィ匕というよりも、 SeVの感染後におこる SeVの RNAの増 幅過程が、榭状細胞の活性ィ匕に重要であることも示唆して 、る。
[0123] (実験 4)
同様の実験群について、それらの DCを 3000 radの放射線を照射した後、 T細胞の 活性化能力につ 、て検討した。（doseをふった DCと純化（CD3+〉95%)のァロあるいは syngenic T細胞と 3日間共培養した)。 SeV- GFPに対する反応の指標として、 syngenic T細胞を用いた。
結果; DC比と T細胞の量が少なく差が比較的顕著でないが、 SeV感染単独で、 LPS に匹敵するァロ T細胞刺激性を持っていることが示された（図 21)。なお、 DCは放射 線照射しな 、で用いることも可能である。
[0124] C.癌抗原特異的 CTLの誘導
Aに記載の方法でヒト末梢血（HLA-A 0201の健常ドナー）より、 CD14+細胞を濃縮し 、 X— vivo 15™ (Cambrex社製） + 2% autologous serumをメディウムとして、 GM— CSF (500U/ml)、 IL-4 (250U/ml)を添カ卩 (3-4日に一度、半量のメディウムを交換）、未熟 榭状細胞を作製した。作製した未熟榭状細胞を次の 3群に分け、更に 48時間
GM-CSF (500U/ml)、 IL-4 (250U/ml)の存在下に培養した。
1群 何も加えない
2群 SeV- GFPの感染（MOI 30)
3群 サイト力インのカクテル (IL-1 β 50ng/ml、 IL- 6 500ng/ml、 IFN- a 2500U/ml 、 TNF- a lOOng/mU PGE2 20 micro- M)による刺激
その後、榭状細胞を回収して、 MART-1ペプチド（EAAGIGILTV (配列番号： 9》を パルス（50 micro-g/ml ; 3時間）して、榭状細胞を採取したのと同じ健常人末梢血の T 細胞をネガティブセレクションで濃縮（CD3+〉97%)して、ペプチドパルスした上記 3群 の榭状細胞と 7日間培養した (X- vivo 15™ + 2%autologous serum)。（3-4日毎、ある いはメディウムの黄変時に半量のメディウムを交換した。最初の刺激時は IL-2なしで T細胞と榭状細胞を混合培養し、 3日目から IL-2を 100 U/ml添カ卩開始した。）これを 2 回繰り替えし、それぞれの混合培養から、細胞を回収し、 CTL assayのエフェクター細 胞として使用した。
ターゲット細胞は、 T2細胞（HLA-A2+の人から得られた T細胞- B細胞ハイプリドーマ で TAP欠損細胞株）を使用した。この細胞は、 TAP (class Iへのトランスポーター）がな いため、細胞質内の蛋白の分解により産生されたペプチドを Class Iに誘導できない こと力ら、ペプチドを外来から添加するとそのペプチドが Class Iに loadされて、 Class I の発現が起こる。このターゲットを変異 MART-1ペプチド（ELAGIGILTV (配列番号： 10)) (上記の刺激で使用したペプチドに対して T細胞レセプター認識部は変化なぐ HLA-A2の結合を強めたもの）をパルスしたもの、 Infoluenzaのペプチド（Flu; third partyとしてのペプチド； GILGFVFTL (配列番号： 11))をパルスしたものを作製し、 Cr で細胞をラベルし、上記 3群のエフェクター T細胞とこの 2種類の targetを 20:1、 10:1、 5:1、 2.5:1で 4時間混合培養して CTL活性を調べた。
以下に実験の組み合わせをまとめた。 エフヱクタ一細胞 ターゲット細胞 図のシンボル
1群のエフェクター T細胞 変異 MART1ペプチド + T2細胞 実線の黒四角
2群のエフェクター T細胞 変異 MART1ペプチド + T2細胞 実線の黒三角
3群のエフェクター T細胞 変異 MART1ペプチド + T2細胞 実線の黒逆三角
1群のエフェクター T細胞 Fluペプチド + T2細胞 点線の黒菱形
2群のエフェクター T細胞 Fluペプチド + T2細胞 点線の黒丸
3群のエフェクター T細胞 Fluペプチド + T2細胞 点線の白四角 結果；上記 3群の DCで活性ィ匕をして 、な 、DC (MARTIペプチド + )で T細胞を刺激 しても、 MART-1特異的 CTLは誘導できないが、ポジティブコントロールとして、サイト 力インで活性ィ匕 (現在腫瘍免疫の榭状細胞療法で最も強く活性化できる方法)した榭 状細胞で、 T細胞を刺激すると MART-1特異的 CTLが誘導できた (ターゲットにパル スする変異 MART-1ペプチドに替えて、刺激に用いた MART-1ペプチドを用いても同 様の結果が得られた)。 SeVで遺伝子導入した榭状細胞を使用した場合、ポジティブ コントロールと同程度の CTL活性が得られた（図 22)。つまり、 CTLアツセィで判定し た場合、 SeVを感染させるだけで榭状細胞は活性化され、サイト力インで活性ィ匕した 榭状細胞と同じレベルに in vitroで CTLを誘導できることが示された。 T細胞賦活化と して SeVを使用すれば、標的遺伝子の導入とともに活性ィ匕が起こせるので、サイトカイ ンなどの活性ィ匕因子を添加する必要がなくなり、コスト節減、時間節減、細胞の viabilityの保持に寄与する。
D.免疫刺激性サイト力イン遺伝子の導入効果
SeVにより活性ィ匕した榭状細胞が抗腫瘍免疫を発揮することができるかをインビボ で検討した。腫瘍モデルとして、 MHC Class Iを非常に低いレベルでしカゝ発現せず免 疫原性に乏しい B16メラノーマの移植モデルを採用した。腫瘍モデルマウスには、 C57BL/6マウス（6— 8週齢、メス）（日本チャールズ 'リバ一）を用い、榭状細胞は C57BL/6マウス (8週齢、メス）（日本チャールズ 'リバ一）より採取した。榭状細胞は、 C57BL/6マウスの大腿骨より骨髄を採取し、 SpinSep™, murine hematopoetic progenitor enrichmentcocktail (抗 CD5抗体,抗 CD45R抗体, iHiCDllb抗体, iHiGr- 1 抗体,抗 TER119抗体，抗 7/4抗体、 StemCell technology)を使用し、 T cellを除去した 後、 IL- 4および GM- CSFを添カ卩し 1週間培養して得た。 1 x lOVlOO micro- Lの B16メ ラノーマ細胞を day 0にマウスの腹部皮下（s.c.)接種した。 Day 10、 17、および 24に、 活性化刺激を加えない榭状細胞、 LPSで活性化させた榭状細胞（LPS DC)、あるい は SeV-GFPまたはマウスインターフェロン 13を発現する SeV-IFN βを導入して活性 化させた榭状細胞（それぞれ SeV GFP DCまたは SeV IFN |8 DC)を腫瘍周囲に投与 した。このとき、榭状細胞に腫瘍抗原（B 16の freeze and thawによる腫瘍ライセート）を パルスして力も投与する実験も行った。これらとは別に、腫瘍接種後 10日目（day 10) に SeV- IFN j8を直接、腫瘍内注入 (intratumoral injection)して抗腫瘍効果を調べる 実験も行った。 榭状細胞への SeVの導入では、上記のように 1週間培養した榭状細胞に SeV-IFN β を ΜΟΙ 40で感染させ、 8時間培養した。腫瘍抗原をパルスする場合は、上記のよう〖こ 1週間培養した榭状細胞を回収し、腫瘍抗原となる tumor lysateをパルス (DC： tumor lysate= 1： 3)し、 18時間培養した後、 SeV- IFN j8を MOI 40で感染させ、 8時間 培養した。その後、これらの榭状細胞を回収し、 5xl05から ΙΟχΙΟ5細胞数をマウスの 腫瘍周囲に投与した。
[0126] 図 23に示すように、 SeV-IFN βの直接腫瘍内注入では、注入後 2週間は腫瘍増殖 を抑制した力 その後の再増殖が明確であった。 DC/SeV-GFPを用いた場合、有意 な抗腫瘍効果が認められ、 DC/LPSで処理したマウス、および DC/SeV-IFN |8で処理 したマウスにぉ 、て、最も強!、腫瘍抑制が観察された。
[0127] 上記の各治療群における抗腫瘍効果をより詳細に検討した。ナチュラルキラー
(NK)細胞活性をアツセィするために、上記の各治療群について、 3回の DC療法終了 7日後のマウスより脾臓を摘出し、エフェクター細胞を作成した。ターゲットとして Yac-1を使用し、 51Cr放出アツセィを行った。また、 Tリンパ球の細胞傷害性をアツセィ するため、上記の NK細胞活性アツセィに使用した脾臓細胞の残りを用いて、 B16の 腫瘍抗原である TRP-2ペプチドとともに、 5日間培養した細胞をエフェクター細胞とし て用い、 mTRP-2ペプチドをパルスした EL-4ターゲット細胞と共培養し、 51Cr放出アツ セィを行った。特異的51 Cr放出の割合は以下のように計算した。
[(試料の cpm -自発放出の cpm) / (最大放出の cpm -自発放出の cpm)] x 100 ここで、最大放出は 1% triton Xと共にインキュベートしたターゲット細胞、自発放出 は培養液のみでインキュベートしたターゲット細胞を用いた。
[0128] ナチュラルキラー (NK)細胞の活性ィ匕は、直接ベクターを注入したマウスにのみ見 られ、榭状細胞投与群では検出されな力つた（図 24)。これに対して、細胞傷害性 Tリ ンパ球（cytotoxic T- lymphocytes, CTL)の活性化は、 DC/LPS処理群および DC/SeV-IFN βで処理したマウスで最も強ぐ DC/SeV-GFP処理群ではそれよりも若 干弱ぐ SeV-IFN |8の直接注入群では検出されなカゝつた（図 25)。腫瘍ライセートの パルスは、腫瘍増殖にも CTL応答にも有意に影響しな力つた。このように、 SeVにより 免疫刺激性サイト力イン遺伝子を導入した榭状細胞を用いた腫瘍免疫治療は、抗腫 瘍治療効果を発揮することが示された。 DC/LPS処理群と DC/SeV-IFN |8処理群の 間で CTL活性に若干の違いがあるにも関わらず、同程度の抗腫瘍効果が見られた。
IFN β発現ベクターの直接注入と、榭状細胞を介した IFN βの発現により誘導される 抗腫瘍機構には違いがあることから、これらを組み合わせた治療はより効果を発揮す ることが期待される。
産業上の利用可能性
本発明により、榭状細胞に効率的に遺伝子を導入することが可能となった。本発明 のベクターは、ウィルスやバクテリア等の感染症に対する防御免疫の誘導、および癌 に対する免疫療法などに好適に用いられる。榭状細胞は高 、免疫誘導作用を有す るため、本発明の方法により所望の抗原遺伝子または免疫活性ィ匕遺伝子を榭状細 胞に導入することにより、抗原特異的細胞性免疫を誘導する DCワクチンを製造する ことが可能となる。

Claims

請求の範囲
[I] 遺伝子導入された榭状細胞の製造方法であって、榭状細胞またはその前駆細胞 にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させる工程を含む方法。
[2] 成熟榭状細胞の製造方法であって、榭状細胞またはその前駆細胞にマイナス鎖
RNAウィルスベクターを接触させる工程を含む方法。
[3] 接触工程が、未成熟榭状細胞にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させるェ 程である、請求項 1または 2に記載の方法。
[4] 接触工程が、 CD34+細胞にマイナス鎖 RNAウィルスベクターを接触させる工程であ る、請求項 1または 2に記載の方法。
[5] 接触前または後の細胞を GM-CSFおよび IL-4存在下で培養する工程さらに含む、 請求項 3または 4に記載の方法。
[6] 該ベクターがサイト力イン遺伝子を有する、請求項 1または 2に記載の方法。
[7] サイト力インがインターフェロン βである、請求項 6に記載の方法。
[8] マイナス鎖 RNAウィルスベクターがパラミクソウィルスベクターである、請求項 1また は 2に記載の方法。
[9] パラミクソウィルスベクターがセンダイウィルスベクターである、請求項 8に記載の方 法。
[10] 細胞がヒト細胞である、請求項 1または 2に記載の方法。
[II] 請求項 1から 10のいずれかに記載の方法により製造された、該ベクターを保持する 細胞。
[12] 成熟榭状細胞である、請求項 11に記載の細胞。
[13] 請求項 11に記載の榭状細胞を腫瘍部位に投与する工程を含む、腫瘍増殖を抑制 する方法。
[14] 榭状細胞に腫瘍抗原を接触および/または発現させる工程をさらに含む、請求項 1 3に記載の方法。
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