JPH02303482A - 日本悩炎ウイルスns1遺伝子組み換えワクチニアウイルス - Google Patents
日本悩炎ウイルスns1遺伝子組み換えワクチニアウイルスInfo
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- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は組み換えワクチニアウィルスにlし、さらに詳
しくは、ワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノムD
NA領域に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードす
るcDNAが組み込まれた組み換えワクチニアウィルス
に関する。
しくは、ワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノムD
NA領域に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードす
るcDNAが組み込まれた組み換えワクチニアウィルス
に関する。
〈従来の技術)
日本脳炎に対するワクチンとしては、従来、不活化日本
脳炎ウィルスを有効成分どするワクチンが用いられてお
り、D康なマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予研株を
接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し、アル
コール・プロタミン法により緒製、不活化して不活化日
本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている(国立予防衛生
研究所学友余線「日本のワクチンJ改訂2版、10和5
2年1月20日丸善株式会社発行)。
脳炎ウィルスを有効成分どするワクチンが用いられてお
り、D康なマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予研株を
接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し、アル
コール・プロタミン法により緒製、不活化して不活化日
本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている(国立予防衛生
研究所学友余線「日本のワクチンJ改訂2版、10和5
2年1月20日丸善株式会社発行)。
このようなワクチンの製造法においては、大過の日本脳
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造担
当者にとっては危険性が極めて高い上、製造コストも高
かった。
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造担
当者にとっては危険性が極めて高い上、製造コストも高
かった。
ワクチンとしては、ウィルスそのものでなく、ウィルス
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
え[)NA反技術よって原核Sa又は、真株seaで抗
原蛋白質を作らせる事が検討されるようになった。しか
しながら、先に述べた不活化ワクチンも同様であるが、
この組み換えDNA技術によって作らせた抗原蛋白質を
用いる成分ワクチンでは、免疫成立まで比較的長時間を
要し、また免疫の持続期間が短いことが欠点としてあげ
られている。
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
え[)NA反技術よって原核Sa又は、真株seaで抗
原蛋白質を作らせる事が検討されるようになった。しか
しながら、先に述べた不活化ワクチンも同様であるが、
この組み換えDNA技術によって作らせた抗原蛋白質を
用いる成分ワクチンでは、免疫成立まで比較的長時間を
要し、また免疫の持続期間が短いことが欠点としてあげ
られている。
近年、種痘生ワクチンとして用いられているワクチニア
ウィルスに外来性DNAを組み込んだ組み換えワクチニ
アウィルスの構築法が考案され、外来性D’N Aとし
て、例えば感染症ウィルスの抗原コードDNAを用いた
組み換えワクチニアウィルスを新しい生ワクチンとして
利用する方法が提案されるようになった(例えば特開昭
58−129971号、特公表昭60−500518号
、特公表昭61−501957号など)。
ウィルスに外来性DNAを組み込んだ組み換えワクチニ
アウィルスの構築法が考案され、外来性D’N Aとし
て、例えば感染症ウィルスの抗原コードDNAを用いた
組み換えワクチニアウィルスを新しい生ワクチンとして
利用する方法が提案されるようになった(例えば特開昭
58−129971号、特公表昭60−500518号
、特公表昭61−501957号など)。
しかしながら、トガウィルス科ワラビウイルス属に属す
る日本脳炎ウィルスは、−末鎖RNAをゲノム(ウィル
スの遺伝情報を担う本体)とし、ウィルスの感染a脂肉
においてモノシストロニツタにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、表面抗原蛋白質、及び5種類の非構成蛋白質へとブ0
セツシング(一本のポリペブタイドが細廁内のプロテア
ーゼで切断されて各々の蛋白質ができる事をいう)され
るという特徴をもつため、日本脳炎ウィルス蛋白質をコ
ードするcDNAをワクチニアウィルスに組み込んで発
現させる仁とは操作上困難である。
る日本脳炎ウィルスは、−末鎖RNAをゲノム(ウィル
スの遺伝情報を担う本体)とし、ウィルスの感染a脂肉
においてモノシストロニツタにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、表面抗原蛋白質、及び5種類の非構成蛋白質へとブ0
セツシング(一本のポリペブタイドが細廁内のプロテア
ーゼで切断されて各々の蛋白質ができる事をいう)され
るという特徴をもつため、日本脳炎ウィルス蛋白質をコ
ードするcDNAをワクチニアウィルスに組み込んで発
現させる仁とは操作上困難である。
ワクチニアウィルスに日本脳炎ウィルス蛋白質をコード
するcDNAを組み込んで発現さじだ例は、本発明者ら
が、表面抗原蛋白質について成功した例があるのみであ
った(第36回日本ウィルス学会演説抄録1)、310
1988)。
するcDNAを組み込んで発現さじだ例は、本発明者ら
が、表面抗原蛋白質について成功した例があるのみであ
った(第36回日本ウィルス学会演説抄録1)、310
1988)。
一方、日本脳炎ウィルスと同席のウィルスである黄熱病
ウィルスやデングウィルスにおいては、ウィルス遺伝子
にコードされた蛋白質の投与によるウィルス感染防御に
ついては、非構成蛋白質−1(以下NS1と称すること
がある)の投与による感染防御の報告(Journal
or illunoIOgy 13互、2805−2
809 (1985);Journalor Gene
ral Virlojy 68.853−857 (1
987))がある。
ウィルスやデングウィルスにおいては、ウィルス遺伝子
にコードされた蛋白質の投与によるウィルス感染防御に
ついては、非構成蛋白質−1(以下NS1と称すること
がある)の投与による感染防御の報告(Journal
or illunoIOgy 13互、2805−2
809 (1985);Journalor Gene
ral Virlojy 68.853−857 (1
987))がある。
表面抗原蛋白質が体液性免疫を誘起するのに対し、NS
Iは感染細胞の表面に認められることから細胞性免疫を
誘起すると考えられる。このことは、NSI蛋白質を発
現する組み換えワクチニアウィルスを単独に、あるいは
表面抗原蛋白質を発現16組み換えワクチニアウィルス
と01用する事によって、より高いワクチン効果が期待
される。
Iは感染細胞の表面に認められることから細胞性免疫を
誘起すると考えられる。このことは、NSI蛋白質を発
現する組み換えワクチニアウィルスを単独に、あるいは
表面抗原蛋白質を発現16組み換えワクチニアウィルス
と01用する事によって、より高いワクチン効果が期待
される。
しかしながら、先に述べた様に、日本脳炎ウィルス蛋白
質をコードするcDNAをワクチニアウィルスに組み込
んで発現させる事は操作、[困難であり、非構成蛋白質
を発現さけた例は、全く報告されていない。
質をコードするcDNAをワクチニアウィルスに組み込
んで発現させる事は操作、[困難であり、非構成蛋白質
を発現さけた例は、全く報告されていない。
(発明が解決しようとする課題)
そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で、感染細胞
において日本脳炎ウィルス罪構成蛋白質を発現可能な組
み換えワクチニアウィルスの構築を目指し、鋭意検討を
進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲノムRNAを鋳型と
し調整したcDNAより非構成蛋白質をコードする領域
を選択し、その前後にそれぞれ翻訳開始コドンと翻訳終
止コドンを付与し、ワクチニアウィルスのプロモーター
に連結し、ワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノム
領域に組み込めば、感染m廁において日本脳炎ウィルス
非構成蛋白質を発現可能な組み換えワクチニアウィルス
が得られることを見い出し本発明を完成するに至った。
において日本脳炎ウィルス罪構成蛋白質を発現可能な組
み換えワクチニアウィルスの構築を目指し、鋭意検討を
進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲノムRNAを鋳型と
し調整したcDNAより非構成蛋白質をコードする領域
を選択し、その前後にそれぞれ翻訳開始コドンと翻訳終
止コドンを付与し、ワクチニアウィルスのプロモーター
に連結し、ワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノム
領域に組み込めば、感染m廁において日本脳炎ウィルス
非構成蛋白質を発現可能な組み換えワクチニアウィルス
が得られることを見い出し本発明を完成するに至った。
(課題を解決するための手段)
かくして本発明によれば、日本脳炎ウィルスの非構成蛋
白質をコードするcDNAをワクチニアウィルスの増殖
に非必須なゲノムtI4域に、好ましくはプロモーター
機能を有するDNA、人為的に付加された翻訳開始コド
ン及び翻訳停止コドンと共に、発現可能な形で組み込ま
れた組み換えワクチニアウィルスが提供される。
白質をコードするcDNAをワクチニアウィルスの増殖
に非必須なゲノムtI4域に、好ましくはプロモーター
機能を有するDNA、人為的に付加された翻訳開始コド
ン及び翻訳停止コドンと共に、発現可能な形で組み込ま
れた組み換えワクチニアウィルスが提供される。
本発明において組み換えウィルスの作製に供されるウィ
ルスはワクチニアウィルスに分類きれるウィルスであれ
ばいかなるものでもよく、例えばWR株(ジャーナル
オブ ヴイロロジ−49,857、(1984))、リ
スター株、リスター株の一度感受性変異株(米国特許第
4.567゜147号、特開昭62−44178号参照
)、Hew York Board or lleal
th株、1016m8株などの種痘ワクチン株(ワクチ
ン抗原用ベクターとしてのワクチニアウィルス1ゝVa
ccinia virusesas vectors
「or Vaccine Anttaens
” pp、 8 7 −100、ジエイ、キン
ナン(J、Quinnan、 )編アムステルダム、ニ
ューヨークおよびオツクスフJ−ド:エルセバー社(E
lsevier)版)などが例示される。
ルスはワクチニアウィルスに分類きれるウィルスであれ
ばいかなるものでもよく、例えばWR株(ジャーナル
オブ ヴイロロジ−49,857、(1984))、リ
スター株、リスター株の一度感受性変異株(米国特許第
4.567゜147号、特開昭62−44178号参照
)、Hew York Board or lleal
th株、1016m8株などの種痘ワクチン株(ワクチ
ン抗原用ベクターとしてのワクチニアウィルス1ゝVa
ccinia virusesas vectors
「or Vaccine Anttaens
” pp、 8 7 −100、ジエイ、キン
ナン(J、Quinnan、 )編アムステルダム、ニ
ューヨークおよびオツクスフJ−ド:エルセバー社(E
lsevier)版)などが例示される。
これらのウィルスのなかでも釘化鶏卵漿尿膜上でのボッ
クスサイズが3Im以Fで、かつウサギ腎臓llI胞で
の増殖不能温度が41℃以下のものが好適であり、その
具体例としては前記特開昭62−44178号記載の弱
毒痘そう株LA及びLB(CNTM−1−423)、前
記1016m8株などが例示される。
クスサイズが3Im以Fで、かつウサギ腎臓llI胞で
の増殖不能温度が41℃以下のものが好適であり、その
具体例としては前記特開昭62−44178号記載の弱
毒痘そう株LA及びLB(CNTM−1−423)、前
記1016m8株などが例示される。
これらの株はきわめて弱毒性であり、本発明の組み換え
ウィルスを生ワクチンとして利用しようとする場合には
安全性の而で有利である。
ウィルスを生ワクチンとして利用しようとする場合には
安全性の而で有利である。
また、日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするc
DNAは、例えば前記中白pN株やJaOAr株(エー
ル大学アーボヴイラス研究ゼンタ−) 、Sagaya
ma株(同所)を用いて調製することができる。
DNAは、例えば前記中白pN株やJaOAr株(エー
ル大学アーボヴイラス研究ゼンタ−) 、Sagaya
ma株(同所)を用いて調製することができる。
例えば上記sagayasa株からX111MされたN
S1蛋白質をコードするcDNAG、を第3図に示すご
とき全部で1236塩基対から構成されているが、本発
明においては上記cDNAと実質的に同一の機能を′1
iする範囲において、修鶏されたcDNA([!]ち、
塩基配列が置換、挿入、欠失したもの)であってもよい
。もちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミ
ノ酸配列が異なる程度に修簿されたものであってもよい
。
S1蛋白質をコードするcDNAG、を第3図に示すご
とき全部で1236塩基対から構成されているが、本発
明においては上記cDNAと実質的に同一の機能を′1
iする範囲において、修鶏されたcDNA([!]ち、
塩基配列が置換、挿入、欠失したもの)であってもよい
。もちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミ
ノ酸配列が異なる程度に修簿されたものであってもよい
。
本発明を実施するに当たっては、まずワクチニアウィル
スの増殖に非必須なりNAt1J域を組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。この場合、前記f!4
域にワクチニアウィルス内で機能するプロモーターを挿
入し、さらにプロモーターの下流に翻訳開始コドン、翻
訳終止コドン及びその両者間に適当な制限M床切断配列
を有する合成リンカ−を挿入することが好ましい。
スの増殖に非必須なりNAt1J域を組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。この場合、前記f!4
域にワクチニアウィルス内で機能するプロモーターを挿
入し、さらにプロモーターの下流に翻訳開始コドン、翻
訳終止コドン及びその両者間に適当な制限M床切断配列
を有する合成リンカ−を挿入することが好ましい。
ここで言う増殖に非必須なりNA領領域は、例えばワク
チニアウィルスのチミジンキナーゼ(TK)遺伝子、血
球凝集素()IA)遺伝子、ワクチニアウィルスVII
iDNAのHindl[[切断Fフラグメント、Mフラ
グメント、Nフラグメント(ウィルス36 fil、2
3−33 (1986))など、外来性DNAの挿入に
よる変異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼ
さない領域を言う。
チニアウィルスのチミジンキナーゼ(TK)遺伝子、血
球凝集素()IA)遺伝子、ワクチニアウィルスVII
iDNAのHindl[[切断Fフラグメント、Mフラ
グメント、Nフラグメント(ウィルス36 fil、2
3−33 (1986))など、外来性DNAの挿入に
よる変異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼ
さない領域を言う。
また、ワクチニアウィルス内で機能するプロモーターと
は、合成・天然を問わずワクチニアウィルスが保有する
転写の系でプロモーターとして有効に機能しえるものな
らいがなる塩基配列のものでも良く、その具体例として
は例えばジャーノ°ルオブ ヴイロロジー呈ユ、662
−669 (1984)に示されるようなワクチニアウ
ィルスのプロモーター、具体的には7.5にポリペプチ
ドをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモータ
ー、19にポリペプチドをコードするワクチニアウィル
ス遺伝子のプロモーター、42にポリペプチドをコード
するワクチニアウィルス遺伝子のプロモーター、チミジ
ンキナーゼをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプ
ロモーター、28にポリペプチドをコードする、ワクチ
ニアウィルス遺伝子のプロモーター、11にポリペプチ
ドをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモータ
ーなどが例示される。
は、合成・天然を問わずワクチニアウィルスが保有する
転写の系でプロモーターとして有効に機能しえるものな
らいがなる塩基配列のものでも良く、その具体例として
は例えばジャーノ°ルオブ ヴイロロジー呈ユ、662
−669 (1984)に示されるようなワクチニアウ
ィルスのプロモーター、具体的には7.5にポリペプチ
ドをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモータ
ー、19にポリペプチドをコードするワクチニアウィル
ス遺伝子のプロモーター、42にポリペプチドをコード
するワクチニアウィルス遺伝子のプロモーター、チミジ
ンキナーゼをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプ
ロモーター、28にポリペプチドをコードする、ワクチ
ニアウィルス遺伝子のプロモーター、11にポリペプチ
ドをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモータ
ーなどが例示される。
第一の組み換えベクターの作wJは常法(例えば特開昭
58−129971M、特公表昭60−500518号
、特開昭62−44178号など)に従って行うことが
できる。例えばワクチニアウィルスの増殖に非必須なり
NA断片を過当なベクターに組み込んだ後、必要に応じ
て該断片中に存在するt、lJ l酵素切断点を利用し
、11限醇索切断配列を付加したプロモーターを組み込
めば良い。
58−129971M、特公表昭60−500518号
、特開昭62−44178号など)に従って行うことが
できる。例えばワクチニアウィルスの増殖に非必須なり
NA断片を過当なベクターに組み込んだ後、必要に応じ
て該断片中に存在するt、lJ l酵素切断点を利用し
、11限醇索切断配列を付加したプロモーターを組み込
めば良い。
ところで日本脳炎ウィルスの蛋白質は先に述べたように
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質、非構成蛋白質等にわかれる。従っ
て、全ウィルスゲノムに対するcDNAを挿入すれば人
為的に翻訳17i1始コドン及び翻訳終止コドンを挿入
する必要はないが1、Il:M4成蛋白質をコードする
cDNAのみを組み込もうとするときは先に挿入したプ
ロモーターの下流に存在するR11限M素FJJ所点を
利用し、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び内省間に
tlJ限M素切所配列を有する合成リンカ−を組み込む
ことが必要である。
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質、非構成蛋白質等にわかれる。従っ
て、全ウィルスゲノムに対するcDNAを挿入すれば人
為的に翻訳17i1始コドン及び翻訳終止コドンを挿入
する必要はないが1、Il:M4成蛋白質をコードする
cDNAのみを組み込もうとするときは先に挿入したプ
ロモーターの下流に存在するR11限M素FJJ所点を
利用し、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び内省間に
tlJ限M素切所配列を有する合成リンカ−を組み込む
ことが必要である。
挿入する翻訳終止コドンは、非構成蛋白質をコードする
cDNAの読みI&り枠がいずれであっても合致するよ
うに読み取り枠をずらせて3ケ所に設けることが望まし
い。
cDNAの読みI&り枠がいずれであっても合致するよ
うに読み取り枠をずらせて3ケ所に設けることが望まし
い。
挿入するcDNAは非構成蛋白質をコードする領域を含
むものであればその他に他の蛋白質をコードする領域を
含むものであってもよい。ワラビウイルス属に属するウ
ィルスについては、非構成蛋白質をコードする領域の上
流に表面抗原蛋白質(以下E蛋白質と称するン、マトリ
ックス蛋白質(以下M蛋白質と称する)、プレマトリッ
クス蛋白質(以下prev蛋白質と称する)、コア蛋白
質(以下C蛋白質と称する)をコードする領域が存在し
ているが、本発明においてはこれらの蛋白質をコードす
るcDNAの全部又は一部が非構成蛋白質をコードする
cDNAの上流に結合したものを用いてもよい。
むものであればその他に他の蛋白質をコードする領域を
含むものであってもよい。ワラビウイルス属に属するウ
ィルスについては、非構成蛋白質をコードする領域の上
流に表面抗原蛋白質(以下E蛋白質と称するン、マトリ
ックス蛋白質(以下M蛋白質と称する)、プレマトリッ
クス蛋白質(以下prev蛋白質と称する)、コア蛋白
質(以下C蛋白質と称する)をコードする領域が存在し
ているが、本発明においてはこれらの蛋白質をコードす
るcDNAの全部又は一部が非構成蛋白質をコードする
cDNAの上流に結合したものを用いてもよい。
用いられるベクターの具体例としては、例えばpBR3
22、pBR325、I)BR327、pBR328、
pUc7、pUc8、pUc9、pUC19などのごと
きプラスミド、λファージ、M13ファージなどのごと
きファージ、p H079(ジーン、11.291.1
980年)などのごとぎコスミドが例示される。
22、pBR325、I)BR327、pBR328、
pUc7、pUc8、pUc9、pUC19などのごと
きプラスミド、λファージ、M13ファージなどのごと
きファージ、p H079(ジーン、11.291.1
980年)などのごとぎコスミドが例示される。
本発明においては、次いで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質
をコードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが
作製される。挿入方法もまた常法(例えば前記各公報参
照)に従えば良く、例えば第1のベクターのプロモータ
ーの下流で、かつ人為的に付与された翻訳開始コドンと
Il訳終止コドンの間に予め設けられた制限酵素切断点
を利用して日本脳炎ウィルス由来のcDNA断片を挿入
すれば良い。
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質
をコードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが
作製される。挿入方法もまた常法(例えば前記各公報参
照)に従えば良く、例えば第1のベクターのプロモータ
ーの下流で、かつ人為的に付与された翻訳開始コドンと
Il訳終止コドンの間に予め設けられた制限酵素切断点
を利用して日本脳炎ウィルス由来のcDNA断片を挿入
すれば良い。
これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、使
用するプラスミドベクターも目的に相応しいものである
限り特に限定されるものではない。
ては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、使
用するプラスミドベクターも目的に相応しいものである
限り特に限定されるものではない。
本発明においては、次に、予めワクチニアウィルスを感
染させた動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入
し、ベクターDNAとウィルスゲノムDNAの間に相同
組み換えを起こさU゛、組み換えワクチニアウィルスを
構築する。
染させた動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入
し、ベクターDNAとウィルスゲノムDNAの間に相同
組み換えを起こさU゛、組み換えワクチニアウィルスを
構築する。
ここで用いられる動物培!l111胞はワクチニアウィ
ルスが増殖可能なものであればよく、その具体例として
、例えばTK−143(ヒト骨肉腫由来)、FL(ヒト
羊膜由来)、l−1ela(tニド子宮頚部癌由来)、
KB(ヒト鼻咽喉路由来)、CV−1(サル腎由来)
、B10−1 (丈/L、W山来)、RK13(ウサギ
腎由来)、L929(マウス結合11JI由来)、CE
(鶏胚)細胞、CEF(鶏胎児!lH芽細胞)などが例
示される。
ルスが増殖可能なものであればよく、その具体例として
、例えばTK−143(ヒト骨肉腫由来)、FL(ヒト
羊膜由来)、l−1ela(tニド子宮頚部癌由来)、
KB(ヒト鼻咽喉路由来)、CV−1(サル腎由来)
、B10−1 (丈/L、W山来)、RK13(ウサギ
腎由来)、L929(マウス結合11JI由来)、CE
(鶏胚)細胞、CEF(鶏胎児!lH芽細胞)などが例
示される。
組み換えワクチニアウィルスの構築に当たっては常法に
従えば良く、例えば、DNAクローニング第2巻(D
N A cloning Volume II )
、実際的なアブローヂ(a practigal a
pproach) Dp、 191−211、ディ・
エム・グローバー(0,H。
従えば良く、例えば、DNAクローニング第2巻(D
N A cloning Volume II )
、実際的なアブローヂ(a practigal a
pproach) Dp、 191−211、ディ・
エム・グローバー(0,H。
Glover) IQ、(IRLブレス、オックスフォ
ード。
ード。
ワシントン)の記述に準じてワクチニアウィルスを感染
さびたRK13細胞にリン酸カルシウム共沈法により処
理した第二の組み換えベクターを移入させ、得られる組
み換えウィルスを含むウィルス集団をEagle M
E M上に培養されたTK陰性細胞に感染させBUdR
存在下生育してくるプラークを選択し、組み換えウィル
ス候補株とすれば良い。これら候補株の内から日本脳炎
ウィルスのNS1蛋白質をフードするDNAK片が組み
込まれたウィルスを選択する方法は、HDNAをプロー
ブとするパイプリダイゼーション法を利用してプラーク
純化するか、あるいは、日本脳炎ウィルスに対する抗血
清又はモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイを利
用すれば良い。
さびたRK13細胞にリン酸カルシウム共沈法により処
理した第二の組み換えベクターを移入させ、得られる組
み換えウィルスを含むウィルス集団をEagle M
E M上に培養されたTK陰性細胞に感染させBUdR
存在下生育してくるプラークを選択し、組み換えウィル
ス候補株とすれば良い。これら候補株の内から日本脳炎
ウィルスのNS1蛋白質をフードするDNAK片が組み
込まれたウィルスを選択する方法は、HDNAをプロー
ブとするパイプリダイゼーション法を利用してプラーク
純化するか、あるいは、日本脳炎ウィルスに対する抗血
清又はモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイを利
用すれば良い。
かくして本発明によれば、ワクチニアウィルスの増殖に
非必須なゲノムfR域に日本脳炎ウィルス由来の非構成
蛋白質をコードするcDNAがプロモーターiriを打
するDNAと共に発現可能な形で組み込まれた、生ワク
チンとして利用可能な、組み換えワクチニアウィルスが
得られる。
非必須なゲノムfR域に日本脳炎ウィルス由来の非構成
蛋白質をコードするcDNAがプロモーターiriを打
するDNAと共に発現可能な形で組み込まれた、生ワク
チンとして利用可能な、組み換えワクチニアウィルスが
得られる。
(実施例)
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。
。
実施例1
(1) 日本脳炎ウィルスからのRNAゲノムの抽出
蚊由来株化細胞 C6/36 (J、Gcn、ν1ro
1.40531−544 (1978))に日本脳炎ウ
ィルス5aQayala株を感染させ、ウィルスを増殖
さゼた摂、培養上清とポリエチレングリコールとを混合
し遠心分離により日本脳炎ウィルスをN製した。
蚊由来株化細胞 C6/36 (J、Gcn、ν1ro
1.40531−544 (1978))に日本脳炎ウ
ィルス5aQayala株を感染させ、ウィルスを増殖
さゼた摂、培養上清とポリエチレングリコールとを混合
し遠心分離により日本脳炎ウィルスをN製した。
ウィルスゲノムRNA (約l 1KbO)は緒製ウィ
ルスからフェノール抽出侵、エタノールを加えて沈澱さ
せ分離した。
ルスからフェノール抽出侵、エタノールを加えて沈澱さ
せ分離した。
(2) 日本脳炎ウィルスのcDNAのクローニング
(第1図参照ン (1)でIIしたウィルスゲノムRNAにポリ(A>ポ
リメラーゼ(宝酒造)を使って、ポリ(A)を付加し、
それを#!I型とし、オリゴd (T)をプライマーに
用いて、4種(A−G−C−T)のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸と、逆転写酢木を働かせて、ファースト
ストランドcDNAを合成した。次に大11AmRNa
sel−4と、4f!!(A−G・C・丁)のデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸と大腸菌DNAポリメラーゼ
を使って二本鎖cDNAを作成しくMo1ecular
Cloning [ColdSpringtlar
bor tab、 (1982) ] Dp 211〜
246)、ターミナルトランスフェラーゼでdclll
mを付加した。一方、プラスミドpUc9 (ファルマ
シア製)を−Jwi静素PStIで消化後、ターミナル
トランスフェラーゼでdGlを付加し、これと、前記c
DNAtr混合し、ライゲーション反応を行ない環状化
した。この組換えプラスミドを大嶋菌HB101コンピ
テントセルに導入し、形質転換菌を得た。形質転換菌か
らプラスミドをとり出し、インサートcDNAの長さを
7ガO−スゲルで比較し、もつとも長いインサートcD
NAについて5′側の配列分析(Gene 19
L269(1982) )をおこなった。その配列分析
の結果より、2O−rnerの合成オリゴヌクレオチド
(5’ −d^TTCCGTACCATGCAGTCC
A−3”)をブライマーとして、ウィルスゲノムRAN
を鋳型にして、再度上記の方法でcDNAを作成し、プ
ラスミドpucc+にライゲーションし、多数の形質転
換菌を得た。得られた形質転換菌の中から目的の非構成
蛋白質をコードするcDNAを含む組み換えプラスミド
を含む形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。
(第1図参照ン (1)でIIしたウィルスゲノムRNAにポリ(A>ポ
リメラーゼ(宝酒造)を使って、ポリ(A)を付加し、
それを#!I型とし、オリゴd (T)をプライマーに
用いて、4種(A−G−C−T)のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸と、逆転写酢木を働かせて、ファースト
ストランドcDNAを合成した。次に大11AmRNa
sel−4と、4f!!(A−G・C・丁)のデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸と大腸菌DNAポリメラーゼ
を使って二本鎖cDNAを作成しくMo1ecular
Cloning [ColdSpringtlar
bor tab、 (1982) ] Dp 211〜
246)、ターミナルトランスフェラーゼでdclll
mを付加した。一方、プラスミドpUc9 (ファルマ
シア製)を−Jwi静素PStIで消化後、ターミナル
トランスフェラーゼでdGlを付加し、これと、前記c
DNAtr混合し、ライゲーション反応を行ない環状化
した。この組換えプラスミドを大嶋菌HB101コンピ
テントセルに導入し、形質転換菌を得た。形質転換菌か
らプラスミドをとり出し、インサートcDNAの長さを
7ガO−スゲルで比較し、もつとも長いインサートcD
NAについて5′側の配列分析(Gene 19
L269(1982) )をおこなった。その配列分析
の結果より、2O−rnerの合成オリゴヌクレオチド
(5’ −d^TTCCGTACCATGCAGTCC
A−3”)をブライマーとして、ウィルスゲノムRAN
を鋳型にして、再度上記の方法でcDNAを作成し、プ
ラスミドpucc+にライゲーションし、多数の形質転
換菌を得た。得られた形質転換菌の中から目的の非構成
蛋白質をコードするcDNAを含む組み換えプラスミド
を含む形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。
尚、日本脳炎ウィルスのcDNAクローンの作成方法に
ついては、日本脳炎ウィルスJaOArS 982株
を使い、同様な方法で作成した例がaene土8 p
、195−201 (1986)に記載されている。
ついては、日本脳炎ウィルスJaOArS 982株
を使い、同様な方法で作成した例がaene土8 p
、195−201 (1986)に記載されている。
(3) 日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードす
るcDNA (4118,1137)を含む組み換えプ
ラスミドpJE4118、pJE1137のスクリーニ
ング(第1図及び第2図参照)(2)で得られた形質転
換菌を寒天プレートで生育させ、ニトロセルロースフィ
ルターにレプリカする。レプリカしたフィルターを0.
2%NP−40(界面活性剤、半片化学)でゆるやかに
洗浄した後、抗JElllIhlでイムノスクリーニン
グしたところ、弱いながらもポジティブに反応する形質
転換菌を1採得て、その株が保有するプラスミドをpJ
E4118とした。次いでプラスミドpJE4118を
常法(Mo1ecular Cloning p、 7
5〜95(前述))に従い調整し、制御Ii!酵素ps
t■でpUC9に挿入されたcDNAを切り出し、これ
をDNAプローブとして、(2)で得た各種形質転換菌
をコロニーパイプリダイゼーション法(Molecul
ar Cloning p、382−387 (前記)
)によってスクリーニングし、pJE4118のインサ
ートcDNA (4118)と重なりあうcDNAをも
つプラスミドを選び出した。そうやって選び出した2つ
のcDNA (2−20,1137)をプラスミドより
回収し、υ1限酵素でその位置間係を決定した(第3図
参照)ところ、cDNA (2−20)はcDNA(4
118)の5′末端と部分的に重なり合っていること及
びcDNA (1137)はcDNA(4118)の3
′末端と部分的に重なり合っていることが判明した。
るcDNA (4118,1137)を含む組み換えプ
ラスミドpJE4118、pJE1137のスクリーニ
ング(第1図及び第2図参照)(2)で得られた形質転
換菌を寒天プレートで生育させ、ニトロセルロースフィ
ルターにレプリカする。レプリカしたフィルターを0.
2%NP−40(界面活性剤、半片化学)でゆるやかに
洗浄した後、抗JElllIhlでイムノスクリーニン
グしたところ、弱いながらもポジティブに反応する形質
転換菌を1採得て、その株が保有するプラスミドをpJ
E4118とした。次いでプラスミドpJE4118を
常法(Mo1ecular Cloning p、 7
5〜95(前述))に従い調整し、制御Ii!酵素ps
t■でpUC9に挿入されたcDNAを切り出し、これ
をDNAプローブとして、(2)で得た各種形質転換菌
をコロニーパイプリダイゼーション法(Molecul
ar Cloning p、382−387 (前記)
)によってスクリーニングし、pJE4118のインサ
ートcDNA (4118)と重なりあうcDNAをも
つプラスミドを選び出した。そうやって選び出した2つ
のcDNA (2−20,1137)をプラスミドより
回収し、υ1限酵素でその位置間係を決定した(第3図
参照)ところ、cDNA (2−20)はcDNA(4
118)の5′末端と部分的に重なり合っていること及
びcDNA (1137)はcDNA(4118)の3
′末端と部分的に重なり合っていることが判明した。
(4) 非構成蛋白質をコードするcDNAの塩基配
列の解明(第3図参照)。
列の解明(第3図参照)。
組み換えたプラスミドpJE4118、pJE2−20
、I)JE1137をalil+限酵素、PstIで1
,1JliL、、それぞれ約2.5Kbp、約1.0K
bp、約0.9KbpのDNA断片を得た。これらの断
片についてM13ファージを用いるメツシングらの方法
(ジーン、1旦、p、269 (1982):サイエン
ス、24L ol 205 (1981))により配列
分析を行った。
、I)JE1137をalil+限酵素、PstIで1
,1JliL、、それぞれ約2.5Kbp、約1.0K
bp、約0.9KbpのDNA断片を得た。これらの断
片についてM13ファージを用いるメツシングらの方法
(ジーン、1旦、p、269 (1982):サイエン
ス、24L ol 205 (1981))により配列
分析を行った。
その結果、cDNA (2−20)とcDNA(411
8)が重なり合う部分のcDNA配列は第3図中の第一
496番アミノ酸の第3コドンから第一3851!アミ
ノ酸までの334塩基であることが判明した。またcD
NA (4118)とcDNA (1137)が重なり
合う部分のcDNA配列は、第3図中の第121番アミ
ノ酸の第3コドンから第332番アミノ酸の第2コドン
までの633塩基であることが判明した。この塩基配列
から推定されるアミノ酸配列と、すでに公知(Scie
nce 229 729−733 (1985))であ
る黄熱病ウィルス(日本脳炎ウィルスと同席近縁)の非
構成蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳炎ウィル
スのNSI蛋白質は第3図中に示す+1番目から第41
21目のアミノ酸までであると判断された。
8)が重なり合う部分のcDNA配列は第3図中の第一
496番アミノ酸の第3コドンから第一3851!アミ
ノ酸までの334塩基であることが判明した。またcD
NA (4118)とcDNA (1137)が重なり
合う部分のcDNA配列は、第3図中の第121番アミ
ノ酸の第3コドンから第332番アミノ酸の第2コドン
までの633塩基であることが判明した。この塩基配列
から推定されるアミノ酸配列と、すでに公知(Scie
nce 229 729−733 (1985))であ
る黄熱病ウィルス(日本脳炎ウィルスと同席近縁)の非
構成蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳炎ウィル
スのNSI蛋白質は第3図中に示す+1番目から第41
21目のアミノ酸までであると判断された。
同様に、日本脳炎ウィルスのE蛋白質は第3図に示す第
一500番目から第一1番目のアミノ酸まで、またM蛋
白質は第3図に示す第一5751目から第一501番目
のアミノ酸まで、またPreM蛋白質は第一6671目
から第一576番目までと判断された。さらに、p r
eM?J白質の5′側は日本脳炎ウィルスのC蛋白質の
一部をコードしていると判断された。
一500番目から第一1番目のアミノ酸まで、またM蛋
白質は第3図に示す第一5751目から第一501番目
のアミノ酸まで、またPreM蛋白質は第一6671目
から第一576番目までと判断された。さらに、p r
eM?J白質の5′側は日本脳炎ウィルスのC蛋白質の
一部をコードしていると判断された。
(5) 日本脳炎ウィルスNSI蛋白質をコードする
cDNAの作製(第2図及び第3図参照)。
cDNAの作製(第2図及び第3図参照)。
cDNA (4118ンはE蛋白質のN末端の5アミノ
酸が欠けている。そこでcDNA (2−20)を用い
て、AatIIサイトの位置でつなぎ合わせて、E蛋白
質を完全にカバーするcDNA(203)を作製した。
酸が欠けている。そこでcDNA (2−20)を用い
て、AatIIサイトの位置でつなぎ合わせて、E蛋白
質を完全にカバーするcDNA(203)を作製した。
またcDNA (4118)はNS1蛋白質のC末端の
80アミノ酸が欠1ノでいる。そこでcDNA (11
37)を用いてACCmサイトの位置でつなぎ合わ「て
NSI蛋白質を完全にカバーするcl)NA (203
7>を作製した。
80アミノ酸が欠1ノでいる。そこでcDNA (11
37)を用いてACCmサイトの位置でつなぎ合わ「て
NSI蛋白質を完全にカバーするcl)NA (203
7>を作製した。
■ cDNAili片LJNSI ): cDNA (
2037)をSac Iで処理した3′末端側約1.9
にbpのcDNA断片。この断片はNS1蛋白質をコー
ドする領域に加えてE?JX白質及びN52a蛋白質を
コードする領域を含んでいる。
2037)をSac Iで処理した3′末端側約1.9
にbpのcDNA断片。この断片はNS1蛋白質をコー
ドする領域に加えてE?JX白質及びN52a蛋白質を
コードする領域を含んでいる。
■ cDNArlft片(J 11 ) : cDNA
(2037)をHaelIで処理した約3.8にbD
の断片。
(2037)をHaelIで処理した約3.8にbD
の断片。
この断片は、NSI蛋白質をコードする領域に加えて5
′側にE蛋白質、M蛋白質、PreM蛋白質及びC蛋白
質、更に3′側にN52a蛋白質をコードする!¥域を
含んでいや。
′側にE蛋白質、M蛋白質、PreM蛋白質及びC蛋白
質、更に3′側にN52a蛋白質をコードする!¥域を
含んでいや。
(6ン ポリリンカー及びワクチニアウィルス7.5
にプロモーターが挿入されたワクチニアウィルスTK遺
伝子を含む第一の組み操えベクターpAK8の作製(第
4図参照) ptJc9をEC0RI及びPstIで消化後、ポリメ
ラーゼで処理し、1i7J li端を平滑末端したのち
、連結し、ECoRI部位の欠損したpLIC9を作製
した。このEcoR1部位欠損DUC9をHindff
lで切断後、ワクチニアウィルスTKi!伝子を含むワ
クチニアウィルスWR株のl−1i n dl[IJ断
片に連結し、組み換えベクターpLINKを得た。
にプロモーターが挿入されたワクチニアウィルスTK遺
伝子を含む第一の組み操えベクターpAK8の作製(第
4図参照) ptJc9をEC0RI及びPstIで消化後、ポリメ
ラーゼで処理し、1i7J li端を平滑末端したのち
、連結し、ECoRI部位の欠損したpLIC9を作製
した。このEcoR1部位欠損DUC9をHindff
lで切断後、ワクチニアウィルスTKi!伝子を含むワ
クチニアウィルスWR株のl−1i n dl[IJ断
片に連結し、組み換えベクターpLINKを得た。
次いでワクチニアウィルスWR株の7.5プロモーター
(モスら、セル125.p、805〜813.1981
年)をpUC19(ファルマシア社製)のト1inc1
[部位に挿入したのら、I−1i n d■のEcoR
Iで順次切断して7.5にプロモーターの前模にポリリ
ンカ一部位を有するDNA断片(約350b1))を得
た。
(モスら、セル125.p、805〜813.1981
年)をpUC19(ファルマシア社製)のト1inc1
[部位に挿入したのら、I−1i n d■のEcoR
Iで順次切断して7.5にプロモーターの前模にポリリ
ンカ一部位を有するDNA断片(約350b1))を得
た。
このDNA断片(第4図参照ンとyI記プラスミドpl
JHKのEcoRI消化物とをポリメラーゼで処理した
のち、連結し、得られた組み換えプラスミドをpNZ6
8に2と命名した。
JHKのEcoRI消化物とをポリメラーゼで処理した
のち、連結し、得られた組み換えプラスミドをpNZ6
8に2と命名した。
次いで翻訳開始コドン、i訳終止コドン及び両者間に1
1限醇素切断配列(BQ7n、NC0I)を有する両末
端がB a m l−I Iサイトの合成リンカ・−を
合成しく第4図参照)、1)NZ68に2のBam)I
Iサイトに挿入して、目的の第一の組み換えプラスミド
pAK8を作製した。
1限醇素切断配列(BQ7n、NC0I)を有する両末
端がB a m l−I Iサイトの合成リンカ・−を
合成しく第4図参照)、1)NZ68に2のBam)I
Iサイトに挿入して、目的の第一の組み換えプラスミド
pAK8を作製した。
1717.5にプロモーターの下流に1]本脳炎ウィル
スの表面抗原蛋白質をコードするDNAを挿入した第二
の組み換えプラスミドの作製(第4図参照) ■ cDNA (JNS 1 )を挿入した第二の組み
換えプラスミド(pAKJNsl )の作成(5)で得
たcDNA(JNSl)をポリメラーゼ(クレノーフラ
グメント)により処理後、(6)で得たプラスミドpA
K8をBan Itで消化後、ポリメラーゼ処理した開
裂プラスミドに連結し、7.5にプロモーターの下流で
、かつ翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間にcDNA
LJNSl )を挿入した組み換えプラスミドpAK
JNs1を得た。
スの表面抗原蛋白質をコードするDNAを挿入した第二
の組み換えプラスミドの作製(第4図参照) ■ cDNA (JNS 1 )を挿入した第二の組み
換えプラスミド(pAKJNsl )の作成(5)で得
たcDNA(JNSl)をポリメラーゼ(クレノーフラ
グメント)により処理後、(6)で得たプラスミドpA
K8をBan Itで消化後、ポリメラーゼ処理した開
裂プラスミドに連結し、7.5にプロモーターの下流で
、かつ翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間にcDNA
LJNSl )を挿入した組み換えプラスミドpAK
JNs1を得た。
このプラスミドは制限酵素Nco IとEC0Rvで二
重切断した時に 約0.5にbpのDNA断片を生ずる
ものとして選択される。因みにcDNA (JNSl
)が逆方向に挿入された組み換えプラスミドの場合には
、同様に処理したときに、約1.3にbpのDNAli
片を生ずる。
重切断した時に 約0.5にbpのDNA断片を生ずる
ものとして選択される。因みにcDNA (JNSl
)が逆方向に挿入された組み換えプラスミドの場合には
、同様に処理したときに、約1.3にbpのDNAli
片を生ずる。
■ cDNALlll)を挿入した第二の組み換えプラ
スミド(pAKJll)の作成(5)で得たcDNA
(Jl 1 )をポリメラーゼ処理後、(6)で得たプ
ラスミドpAK8のBat I消化物と連結し、7.5
にプロモーターの下流で、かつ翻訳開始コドンと翻訳終
止コドンの間にcDNALlll)を挿入した組み換え
プラスミドDAKJ11を得た。
スミド(pAKJll)の作成(5)で得たcDNA
(Jl 1 )をポリメラーゼ処理後、(6)で得たプ
ラスミドpAK8のBat I消化物と連結し、7.5
にプロモーターの下流で、かつ翻訳開始コドンと翻訳終
止コドンの間にcDNALlll)を挿入した組み換え
プラスミドDAKJ11を得た。
このプラスミドは制限酵素Ncalで切断したとき約0
.4にboのDNA断片および約0.8KbpのDNA
l1片を生ずるものとして選択された。
.4にboのDNA断片および約0.8KbpのDNA
l1片を生ずるものとして選択された。
(8)組み換えワクチニアウィルスの作出25cIA2
のカルチャーボトルに18mされたRK−13細胞に弱
毒痘そうウィルス株(特開+KI 62−44178号
記載の弱毒痘そう株LA、ウサギ腎細胞における増殖不
能温度41℃、釘化鶏卵漿尿膜上でのポックサイズ2〜
3 am )を0.1pru/細胞の割合で接種し、4
5分模、(7)で得た各種の組み換えプラスミド(pA
KJNsl、pAKJll)10μりを2.2mの滅菌
水に溶解し、樋高ら(蛋白質・ism−酵素、27,3
40−1985)の方法によってDNA−リン酸カルシ
ウム共沈物をつくり、その0.57を感染RK−13I
ll胞上に滴下した。30分間、37℃、7%CO2イ
ンキ、ユベーターに静置し、5%牛脂児血清を含むイー
グル(Eagle ) MEM4.5−を加えた。その
3時間後、培養液を交換し、48時間、37℃、7%C
O2インキュベーター中で培養し、培!細胞ごと3度凍
結融解した。
のカルチャーボトルに18mされたRK−13細胞に弱
毒痘そうウィルス株(特開+KI 62−44178号
記載の弱毒痘そう株LA、ウサギ腎細胞における増殖不
能温度41℃、釘化鶏卵漿尿膜上でのポックサイズ2〜
3 am )を0.1pru/細胞の割合で接種し、4
5分模、(7)で得た各種の組み換えプラスミド(pA
KJNsl、pAKJll)10μりを2.2mの滅菌
水に溶解し、樋高ら(蛋白質・ism−酵素、27,3
40−1985)の方法によってDNA−リン酸カルシ
ウム共沈物をつくり、その0.57を感染RK−13I
ll胞上に滴下した。30分間、37℃、7%CO2イ
ンキ、ユベーターに静置し、5%牛脂児血清を含むイー
グル(Eagle ) MEM4.5−を加えた。その
3時間後、培養液を交換し、48時間、37℃、7%C
O2インキュベーター中で培養し、培!細胞ごと3度凍
結融解した。
組み換え体の選択のため、10cMベトリ皿に培養され
たTK”143細胞に上記のウィルス液を接種し、30
分後、1%アjjO−ス、5%牛脂児血清、25μg/
mBUdR加 Eaole M E Mを積層し、3日
間培養後感染I[l胞を0.01%中性紅で染色した。
たTK”143細胞に上記のウィルス液を接種し、30
分後、1%アjjO−ス、5%牛脂児血清、25μg/
mBUdR加 Eaole M E Mを積層し、3日
間培養後感染I[l胞を0.01%中性紅で染色した。
出現したプラークからパスツールピペットでウィルスを
広きとり、これを2%ゼラチンを含むPBSに懸濁し、
一部はドツトハイブリダイビージョンをするために、ナ
イロン又はニトロセルロースメンブレンにスポットし、
残りは一20℃で保存した。スポットしたメンブレンは
0.58 NaOHで10分間、1Hトリス塩I!緩衝
液で5分のjIUfIlを3回繰返した後、1.5HN
aC10,58トリスm*a衝′液で5分処理した。2
倍SSG (1倍5SC10,158NaC!、0,0
15M クエン酸ナトリウム)で飽和させ、80℃、
2時間焼きつけた。4倍SET (0,614NaC
1,0,08HTr i 5−CI、4mHEDT
A (ρ117.8))−10倍Denhardt−
Q、 1%SDSで68℃、2時間処理した。4倍5E
T−10倍Denhardt −0、1%5DS−0.
1%Na4p、、o7−50μ’、i/d変性サケ***
DNAとニックトランスレーションによって32PでI
a識した日本脳炎ウィルスのNS1蛋白質のcDNAを
入れて68℃、14時間ハイブリダイゼーションした。
広きとり、これを2%ゼラチンを含むPBSに懸濁し、
一部はドツトハイブリダイビージョンをするために、ナ
イロン又はニトロセルロースメンブレンにスポットし、
残りは一20℃で保存した。スポットしたメンブレンは
0.58 NaOHで10分間、1Hトリス塩I!緩衝
液で5分のjIUfIlを3回繰返した後、1.5HN
aC10,58トリスm*a衝′液で5分処理した。2
倍SSG (1倍5SC10,158NaC!、0,0
15M クエン酸ナトリウム)で飽和させ、80℃、
2時間焼きつけた。4倍SET (0,614NaC
1,0,08HTr i 5−CI、4mHEDT
A (ρ117.8))−10倍Denhardt−
Q、 1%SDSで68℃、2時間処理した。4倍5E
T−10倍Denhardt −0、1%5DS−0.
1%Na4p、、o7−50μ’、i/d変性サケ***
DNAとニックトランスレーションによって32PでI
a識した日本脳炎ウィルスのNS1蛋白質のcDNAを
入れて68℃、14時間ハイブリダイゼーションした。
洗浄後、メンブレンとX線フィルムを重ね、オートラジ
オグラフィーを行い、フィルムが黒化するスポットを選
択した。
オグラフィーを行い、フィルムが黒化するスポットを選
択した。
黒化したスポットに対応するウィルス液を再IATK−
143の細胞に接種し、30分後、1%アガロース、5
%牛脂児面清、25μg/1dBIJdR加Eagle
M E Mをf[し、3日間培fI後感染細胞を0.
01%中性紅で染色した。出現したプラークについて、
上記と同様な操作をおこない、出現するプラークが全て
、ドツトハイプリダイぜ一ジョンで黒化するまで純化の
操作をくり返した。
143の細胞に接種し、30分後、1%アガロース、5
%牛脂児面清、25μg/1dBIJdR加Eagle
M E Mをf[し、3日間培fI後感染細胞を0.
01%中性紅で染色した。出現したプラークについて、
上記と同様な操作をおこない、出現するプラークが全て
、ドツトハイプリダイぜ一ジョンで黒化するまで純化の
操作をくり返した。
こうして得られたウィルスは、目的の組み換えワクチニ
アウィルスであり、使用した組み換えプラスミドに対応
してそれぞれLAJNSI、LAJllと命名した。
アウィルスであり、使用した組み換えプラスミドに対応
してそれぞれLAJNSI、LAJllと命名した。
(9) 組み換えワクチニアウィルスの感染細胞での
発現 組Jl培養用チャンパース2イドに培養したRK13細
胞にto、 i、 1又は0.1の本発明組み換えウィ
ルス株を接種し、37℃、1vt間感染後ウィルス液を
後きとり、[I胞をEaole M E Mで洗浄し、
5%牛脂児血清、Eagle M E Mを加えた。1
6時間後、Eaole M E Mを除き、軽<PBS
(’)ンm!liI生理食塩水)で洗い、風乾した後
、室温でアセトン中5分間処理し細胞を固定した。一時
抗体として抗JEV抗体(1!染性のある日本脳炎ウィ
ルスをウサギに接種して作成した抗血清)、二次抗体と
してイソチアン酸フルオレセイン結合抗ウサギI aG
K体を使用する間接蛍光杭体法でチェックした。その結
果、2種類の組み換えワクチニアウィルスはいずれも日
本脳炎ウィルスのNS1蛋白質生産能を持つことを確認
した。その結果をまとめて第2表に示す。
発現 組Jl培養用チャンパース2イドに培養したRK13細
胞にto、 i、 1又は0.1の本発明組み換えウィ
ルス株を接種し、37℃、1vt間感染後ウィルス液を
後きとり、[I胞をEaole M E Mで洗浄し、
5%牛脂児血清、Eagle M E Mを加えた。1
6時間後、Eaole M E Mを除き、軽<PBS
(’)ンm!liI生理食塩水)で洗い、風乾した後
、室温でアセトン中5分間処理し細胞を固定した。一時
抗体として抗JEV抗体(1!染性のある日本脳炎ウィ
ルスをウサギに接種して作成した抗血清)、二次抗体と
してイソチアン酸フルオレセイン結合抗ウサギI aG
K体を使用する間接蛍光杭体法でチェックした。その結
果、2種類の組み換えワクチニアウィルスはいずれも日
本脳炎ウィルスのNS1蛋白質生産能を持つことを確認
した。その結果をまとめて第2表に示す。
なおこの抗JEV抗体tよ生物学的活性のある日本脳炎
ウィルスをもとに作成したので、抗JEV抗体と反応す
る蛋白質は、日本脳炎ウィルス由来の生物学的活性のあ
る蛋白質と類似の活性を持つと判断される。
ウィルスをもとに作成したので、抗JEV抗体と反応す
る蛋白質は、日本脳炎ウィルス由来の生物学的活性のあ
る蛋白質と類似の活性を持つと判断される。
また発現した蛋白質の分子階は、本発明和み換えワクチ
ニアウィルスを感染させたRK13綱胞の蛋白質をウェ
スタンプロット法(バーネット、−0N、^nalyt
、Biochem1112巻(1981)195−20
3頁)でニトロセルロース膜に移して、抗血清を使って
確認した。その結果、LAJNS1@染細胞では分子細
胞46000ダルトンのNS1蛋白質を、またLAJI
I感染細胞では分子量約53000ダルトンのE蛋白質
と、分子量約46000ダルトンのNS1蛋白質を発現
していた。尚、LAJNSlやLAJIIのかわりに親
株ワクチニアウィルスLAを感染させたa胞では、抗血
清と反応する蛋白は認められなかった。
ニアウィルスを感染させたRK13綱胞の蛋白質をウェ
スタンプロット法(バーネット、−0N、^nalyt
、Biochem1112巻(1981)195−20
3頁)でニトロセルロース膜に移して、抗血清を使って
確認した。その結果、LAJNS1@染細胞では分子細
胞46000ダルトンのNS1蛋白質を、またLAJI
I感染細胞では分子量約53000ダルトンのE蛋白質
と、分子量約46000ダルトンのNS1蛋白質を発現
していた。尚、LAJNSlやLAJIIのかわりに親
株ワクチニアウィルスLAを感染させたa胞では、抗血
清と反応する蛋白は認められなかった。
第 2 表
m:反応せず 妊:強い反応(1F:きわめ
て強い反応
て強い反応
第1図は日本脳炎ウィルスのcDNAのクローニング手
順、第2図はcDNAの制限酵素サイトの位置関係、第
3図はNSI蛋白質をコードする領域を含むcDNAの
塩基配列及びアミノ酸配列、第4図はNSI蛋白質をコ
ードするcDNAを含む組み換えプラスミドpAKJN
s1、ρAKJ11の構築手順をそれぞれ示す。
順、第2図はcDNAの制限酵素サイトの位置関係、第
3図はNSI蛋白質をコードする領域を含むcDNAの
塩基配列及びアミノ酸配列、第4図はNSI蛋白質をコ
ードするcDNAを含む組み換えプラスミドpAKJN
s1、ρAKJ11の構築手順をそれぞれ示す。
Claims (7)
- (1)ワクチニアウイルスの増殖に非必須なゲノム領域
に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするcDN
Aの全部又は一部を組み込んだ組み換えワクチニアウイ
ルス。 - (2)非構成蛋白質をコードするcDNAの全部又は一
部が日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質−1である請求項
(1)記載の組み換えワクチニアウイルス。 - (3)非構成蛋白質−1をコードするcDNAの全部又
は一部が日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質及び非構成
蛋白質−2をコードするcDNAの全部又は一部ととも
に組み込まれている請求項(2)記載の組み換えワクチ
ニアウイルス。 - (4)非構成蛋白質−1をコードするcDNAの全部又
は一部が日本脳炎ウィルスの構成蛋白質であるコア蛋白
質・マトリックス蛋白質・表面抗原蛋白質と及び非構成
蛋白質−2をコードするcDNAの全部又は一部ととも
に組み込まれている請求項(2)記載の組み換えワクチ
ニアウイルス。 - (5)組み込まれたcDNAがプロモーターの支配下に
ある請求項(1)〜(4)記載の組み換えワクチニアウ
イルス。 - (6)組み込まれたcDNAが合成された翻訳開始コド
ンと翻訳停止コドンの間に挿入されている請求項(1)
〜(5)記載の組み換えワクチニアウイルス。 - (7)日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするc
DNAが第3図にNS1として示すアミノ酸配列又はそ
れと実質的に同一機能を有するポリペプチドをコードす
るものである請求項(1)〜(6)記載の組み換えワク
チニアウイルス。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1125894A JPH02303482A (ja) | 1989-05-19 | 1989-05-19 | 日本悩炎ウイルスns1遺伝子組み換えワクチニアウイルス |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1125894A JPH02303482A (ja) | 1989-05-19 | 1989-05-19 | 日本悩炎ウイルスns1遺伝子組み換えワクチニアウイルス |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02303482A true JPH02303482A (ja) | 1990-12-17 |
Family
ID=14921543
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1125894A Pending JPH02303482A (ja) | 1989-05-19 | 1989-05-19 | 日本悩炎ウイルスns1遺伝子組み換えワクチニアウイルス |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02303482A (ja) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01501203A (ja) * | 1986-10-27 | 1989-04-27 | フォーニアー,モーリル・ジェイ | 日本脳炎ウイルス及び類似ウイルスの診断及びワクチン |
JPH01117780A (ja) * | 1987-10-31 | 1989-05-10 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | 組み換えワクチニアウイルス |
-
1989
- 1989-05-19 JP JP1125894A patent/JPH02303482A/ja active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH01501203A (ja) * | 1986-10-27 | 1989-04-27 | フォーニアー,モーリル・ジェイ | 日本脳炎ウイルス及び類似ウイルスの診断及びワクチン |
JPH01117780A (ja) * | 1987-10-31 | 1989-05-10 | Nippon Zoki Pharmaceut Co Ltd | 組み換えワクチニアウイルス |
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