JPH02303482A - 日本悩炎ウイルスｎｓ１遺伝子組み換えワクチニアウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は組み換えワクチニアウィルスにｌし、さらに詳
しくは、ワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノムＤ
ＮＡ領域に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードす
るｃＤＮＡが組み込まれた組み換えワクチニアウィルス
に関する。

〈従来の技術） 日本脳炎に対するワクチンとしては、従来、不活化日本
脳炎ウィルスを有効成分どするワクチンが用いられてお
り、Ｄ康なマウス脳内に日本脳炎ウィルス中山予研株を
接種し、発症したマウスから脳を無菌的に採取し、アル
コール・プロタミン法により緒製、不活化して不活化日
本脳炎ウィルスワクチン原液を得ている（国立予防衛生
研究所学友余線「日本のワクチンＪ改訂２版、１０和５
２年１月２０日丸善株式会社発行）。

このようなワクチンの製造法においては、大過の日本脳
炎ウィルスそのものを取り扱うわけで、ワクチン製造担
当者にとっては危険性が極めて高い上、製造コストも高
かった。

ワクチンとしては、ウィルスそのものでなく、ウィルス
の抗原性を有する抗原蛋白質を用いる事も出来、組み換
え［）ＮＡ反技術よって原核Ｓａ又は、真株ｓｅａで抗
原蛋白質を作らせる事が検討されるようになった。しか
しながら、先に述べた不活化ワクチンも同様であるが、
この組み換えＤＮＡ技術によって作らせた抗原蛋白質を
用いる成分ワクチンでは、免疫成立まで比較的長時間を
要し、また免疫の持続期間が短いことが欠点としてあげ
られている。

近年、種痘生ワクチンとして用いられているワクチニア
ウィルスに外来性ＤＮＡを組み込んだ組み換えワクチニ
アウィルスの構築法が考案され、外来性Ｄ’Ｎ　Ａとし
て、例えば感染症ウィルスの抗原コードＤＮＡを用いた
組み換えワクチニアウィルスを新しい生ワクチンとして
利用する方法が提案されるようになった（例えば特開昭
５８−１２９９７１号、特公表昭６０−５００５１８号
、特公表昭６１−５０１９５７号など）。

しかしながら、トガウィルス科ワラビウイルス属に属す
る日本脳炎ウィルスは、−末鎖ＲＮＡをゲノム（ウィル
スの遺伝情報を担う本体）とし、ウィルスの感染ａ脂肉
においてモノシストロニツタにゲノムから翻訳された一
本のポリペブタイドがコア蛋白質、マトリックス蛋白質
、表面抗原蛋白質、及び５種類の非構成蛋白質へとブ０
セツシング（一本のポリペブタイドが細廁内のプロテア
ーゼで切断されて各々の蛋白質ができる事をいう）され
るという特徴をもつため、日本脳炎ウィルス蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡをワクチニアウィルスに組み込んで発
現させる仁とは操作上困難である。

ワクチニアウィルスに日本脳炎ウィルス蛋白質をコード
するｃＤＮＡを組み込んで発現さじだ例は、本発明者ら
が、表面抗原蛋白質について成功した例があるのみであ
った（第３６回日本ウィルス学会演説抄録１）、３１０
　１９８８）。

一方、日本脳炎ウィルスと同席のウィルスである黄熱病
ウィルスやデングウィルスにおいては、ウィルス遺伝子
にコードされた蛋白質の投与によるウィルス感染防御に
ついては、非構成蛋白質−１（以下ＮＳ１と称すること
がある）の投与による感染防御の報告（Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｒ　ｉｌｌｕｎｏＩＯｇｙ　１３互、２８０５−２
８０９　（１９８５）；Ｊｏｕｒｎａｌｏｒ　Ｇｅｎｅ
ｒａｌ　Ｖｉｒｌｏｊｙ　６８．８５３−８５７　（１
９８７））がある。

表面抗原蛋白質が体液性免疫を誘起するのに対し、ＮＳ
Ｉは感染細胞の表面に認められることから細胞性免疫を
誘起すると考えられる。このことは、ＮＳＩ蛋白質を発
現する組み換えワクチニアウィルスを単独に、あるいは
表面抗原蛋白質を発現１６組み換えワクチニアウィルス
と０１用する事によって、より高いワクチン効果が期待
される。

しかしながら、先に述べた様に、日本脳炎ウィルス蛋白
質をコードするｃＤＮＡをワクチニアウィルスに組み込
んで発現させる事は操作、［困難であり、非構成蛋白質
を発現さけた例は、全く報告されていない。

（発明が解決しようとする課題） そこで本発明者らは、かかる従来技術の下で、感染細胞
において日本脳炎ウィルス罪構成蛋白質を発現可能な組
み換えワクチニアウィルスの構築を目指し、鋭意検討を
進めた結果、日本脳炎ウィルスのゲノムＲＮＡを鋳型と
し調整したｃＤＮＡより非構成蛋白質をコードする領域
を選択し、その前後にそれぞれ翻訳開始コドンと翻訳終
止コドンを付与し、ワクチニアウィルスのプロモーター
に連結し、ワクチニアウィルスの増殖に非必須なゲノム
領域に組み込めば、感染ｍ廁において日本脳炎ウィルス
非構成蛋白質を発現可能な組み換えワクチニアウィルス
が得られることを見い出し本発明を完成するに至った。

（課題を解決するための手段） かくして本発明によれば、日本脳炎ウィルスの非構成蛋
白質をコードするｃＤＮＡをワクチニアウィルスの増殖
に非必須なゲノムｔＩ４域に、好ましくはプロモーター
機能を有するＤＮＡ、人為的に付加された翻訳開始コド
ン及び翻訳停止コドンと共に、発現可能な形で組み込ま
れた組み換えワクチニアウィルスが提供される。

本発明において組み換えウィルスの作製に供されるウィ
ルスはワクチニアウィルスに分類きれるウィルスであれ
ばいかなるものでもよく、例えばＷＲ株（ジャーナル　
オブ　ヴイロロジ−４９，８５７、（１９８４））、リ
スター株、リスター株の一度感受性変異株（米国特許第
４．５６７゜１４７号、特開昭６２−４４１７８号参照
）、Ｈｅｗ　Ｙｏｒｋ　Ｂｏａｒｄ　ｏｒ　ｌｌｅａｌ
ｔｈ株、１０１６ｍ８株などの種痘ワクチン株（ワクチ
ン抗原用ベクターとしてのワクチニアウィルス１ゝＶａ
ｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓｅｓａｓ　　ｖｅｃｔｏｒｓ
　　「ｏｒ　　Ｖａｃｃｉｎｅ　　Ａｎｔｔａｅｎｓ　
　”　　ｐｐ、　　　８　７　−１００、ジエイ、キン
ナン（Ｊ、Ｑｕｉｎｎａｎ、　）編アムステルダム、ニ
ューヨークおよびオツクスフＪ−ド：エルセバー社（Ｅ
ｌｓｅｖｉｅｒ）版）などが例示される。

これらのウィルスのなかでも釘化鶏卵漿尿膜上でのボッ
クスサイズが３Ｉｍ以Ｆで、かつウサギ腎臓ｌｌＩ胞で
の増殖不能温度が４１℃以下のものが好適であり、その
具体例としては前記特開昭６２−４４１７８号記載の弱
毒痘そう株ＬＡ及びＬＢ（ＣＮＴＭ−１−４２３）、前
記１０１６ｍ８株などが例示される。

これらの株はきわめて弱毒性であり、本発明の組み換え
ウィルスを生ワクチンとして利用しようとする場合には
安全性の而で有利である。

また、日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするｃ
ＤＮＡは、例えば前記中白ｐＮ株やＪａＯＡｒ株（エー
ル大学アーボヴイラス研究ゼンタ−）　、Ｓａｇａｙａ
ｍａ株（同所）を用いて調製することができる。

例えば上記ｓａｇａｙａｓａ株からＸ１１１ＭされたＮ
Ｓ１蛋白質をコードするｃＤＮＡＧ、を第３図に示すご
とき全部で１２３６塩基対から構成されているが、本発
明においては上記ｃＤＮＡと実質的に同一の機能を′１
ｉする範囲において、修鶏されたｃＤＮＡ（［！］ち、
塩基配列が置換、挿入、欠失したもの）であってもよい
。もちろん、実質的に同一の機能を有するかぎり、アミ
ノ酸配列が異なる程度に修簿されたものであってもよい
。

本発明を実施するに当たっては、まずワクチニアウィル
スの増殖に非必須なりＮＡｔ１Ｊ域を組み込んだ第一の
組み換えベクターが作製される。この場合、前記ｆ！４
域にワクチニアウィルス内で機能するプロモーターを挿
入し、さらにプロモーターの下流に翻訳開始コドン、翻
訳終止コドン及びその両者間に適当な制限Ｍ床切断配列
を有する合成リンカ−を挿入することが好ましい。

ここで言う増殖に非必須なりＮＡ領領域は、例えばワク
チニアウィルスのチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子、血
球凝集素（）ＩＡ）遺伝子、ワクチニアウィルスＶＩＩ
ｉＤＮＡのＨｉｎｄｌ［［切断Ｆフラグメント、Ｍフラ
グメント、Ｎフラグメント（ウィルス３６　ｆｉｌ、２
３−３３　（１９８６））など、外来性ＤＮＡの挿入に
よる変異を受けても実質上ウィルスの増殖に影響を及ぼ
さない領域を言う。

また、ワクチニアウィルス内で機能するプロモーターと
は、合成・天然を問わずワクチニアウィルスが保有する
転写の系でプロモーターとして有効に機能しえるものな
らいがなる塩基配列のものでも良く、その具体例として
は例えばジャーノ°ルオブ　ヴイロロジー呈ユ、６６２
−６６９　（１９８４）に示されるようなワクチニアウ
ィルスのプロモーター、具体的には７．５にポリペプチ
ドをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモータ
ー、１９にポリペプチドをコードするワクチニアウィル
ス遺伝子のプロモーター、４２にポリペプチドをコード
するワクチニアウィルス遺伝子のプロモーター、チミジ
ンキナーゼをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプ
ロモーター、２８にポリペプチドをコードする、ワクチ
ニアウィルス遺伝子のプロモーター、１１にポリペプチ
ドをコードするワクチニアウィルス遺伝子のプロモータ
ーなどが例示される。

第一の組み換えベクターの作ｗＪは常法（例えば特開昭
５８−１２９９７１Ｍ、特公表昭６０−５００５１８号
、特開昭６２−４４１７８号など）に従って行うことが
できる。例えばワクチニアウィルスの増殖に非必須なり
ＮＡ断片を過当なベクターに組み込んだ後、必要に応じ
て該断片中に存在するｔ、ｌＪ　ｌ酵素切断点を利用し
、１１限醇索切断配列を付加したプロモーターを組み込
めば良い。

ところで日本脳炎ウィルスの蛋白質は先に述べたように
モノジストロニックに合成された後、プロセッシングさ
れて表面抗原蛋白質、非構成蛋白質等にわかれる。従っ
て、全ウィルスゲノムに対するｃＤＮＡを挿入すれば人
為的に翻訳１７ｉ１始コドン及び翻訳終止コドンを挿入
する必要はないが１、Ｉｌ：Ｍ４成蛋白質をコードする
ｃＤＮＡのみを組み込もうとするときは先に挿入したプ
ロモーターの下流に存在するＲ１１限Ｍ素ＦＪＪ所点を
利用し、翻訳開始コドン、翻訳終止コドン及び内省間に
ｔｌＪ限Ｍ素切所配列を有する合成リンカ−を組み込む
ことが必要である。

挿入する翻訳終止コドンは、非構成蛋白質をコードする
ｃＤＮＡの読みＩ＆り枠がいずれであっても合致するよ
うに読み取り枠をずらせて３ケ所に設けることが望まし
い。

挿入するｃＤＮＡは非構成蛋白質をコードする領域を含
むものであればその他に他の蛋白質をコードする領域を
含むものであってもよい。ワラビウイルス属に属するウ
ィルスについては、非構成蛋白質をコードする領域の上
流に表面抗原蛋白質（以下Ｅ蛋白質と称するン、マトリ
ックス蛋白質（以下Ｍ蛋白質と称する）、プレマトリッ
クス蛋白質（以下ｐｒｅｖ蛋白質と称する）、コア蛋白
質（以下Ｃ蛋白質と称する）をコードする領域が存在し
ているが、本発明においてはこれらの蛋白質をコードす
るｃＤＮＡの全部又は一部が非構成蛋白質をコードする
ｃＤＮＡの上流に結合したものを用いてもよい。

用いられるベクターの具体例としては、例えばｐＢＲ３
２２、ｐＢＲ３２５、Ｉ）ＢＲ３２７、ｐＢＲ３２８、
ｐＵｃ７、ｐＵｃ８、ｐＵｃ９、ｐＵＣ１９などのごと
きプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどのごと
きファージ、ｐ　Ｈ０７９（ジーン、１１．２９１．１
９８０年）などのごとぎコスミドが例示される。

本発明においては、次いで、第一の組み換えベクターの
プロモーターの下流に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質
をコードする領域を挿入して第二の組み換えベクターが
作製される。挿入方法もまた常法（例えば前記各公報参
照）に従えば良く、例えば第１のベクターのプロモータ
ーの下流で、かつ人為的に付与された翻訳開始コドンと
Ｉｌ訳終止コドンの間に予め設けられた制限酵素切断点
を利用して日本脳炎ウィルス由来のｃＤＮＡ断片を挿入
すれば良い。

これら第−及び第二の組み換えベクターの構築に当たっ
ては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用いれば良く、使
用するプラスミドベクターも目的に相応しいものである
限り特に限定されるものではない。

本発明においては、次に、予めワクチニアウィルスを感
染させた動物培養細胞に第二の組み換えベクターを移入
し、ベクターＤＮＡとウィルスゲノムＤＮＡの間に相同
組み換えを起こさＵ゛、組み換えワクチニアウィルスを
構築する。

ここで用いられる動物培！ｌ１１１胞はワクチニアウィ
ルスが増殖可能なものであればよく、その具体例として
、例えばＴＫ−１４３（ヒト骨肉腫由来）、ＦＬ（ヒト
羊膜由来）、ｌ−１ｅｌａ（ｔニド子宮頚部癌由来）、
ＫＢ（ヒト鼻咽喉路由来）、ＣＶ−１（サル腎由来）　
、Ｂ１０−１　（丈／Ｌ、Ｗ山来）、ＲＫ１３（ウサギ
腎由来）、Ｌ９２９（マウス結合１１ＪＩ由来）、ＣＥ
（鶏胚）細胞、ＣＥＦ（鶏胎児！ｌＨ芽細胞）などが例
示される。

組み換えワクチニアウィルスの構築に当たっては常法に
従えば良く、例えば、ＤＮＡクローニング第２巻（Ｄ　
Ｎ　Ａ　　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌｕｍｅ　　ＩＩ　）
　、実際的なアブローヂ（ａ　ｐｒａｃｔｉｇａｌ　ａ
ｐｐｒｏａｃｈ）　Ｄｐ、　　１９１−２１１、ディ・
エム・グローバー（０，Ｈ。

Ｇｌｏｖｅｒ）　ＩＱ、（ＩＲＬブレス、オックスフォ
ード。

ワシントン）の記述に準じてワクチニアウィルスを感染
さびたＲＫ１３細胞にリン酸カルシウム共沈法により処
理した第二の組み換えベクターを移入させ、得られる組
み換えウィルスを含むウィルス集団をＥａｇｌｅ　Ｍ　
Ｅ　Ｍ上に培養されたＴＫ陰性細胞に感染させＢＵｄＲ
存在下生育してくるプラークを選択し、組み換えウィル
ス候補株とすれば良い。これら候補株の内から日本脳炎
ウィルスのＮＳ１蛋白質をフードするＤＮＡＫ片が組み
込まれたウィルスを選択する方法は、ＨＤＮＡをプロー
ブとするパイプリダイゼーション法を利用してプラーク
純化するか、あるいは、日本脳炎ウィルスに対する抗血
清又はモノクローナル抗体を用いるイムノアッセイを利
用すれば良い。

かくして本発明によれば、ワクチニアウィルスの増殖に
非必須なゲノムｆＲ域に日本脳炎ウィルス由来の非構成
蛋白質をコードするｃＤＮＡがプロモーターｉｒｉを打
するＤＮＡと共に発現可能な形で組み込まれた、生ワク
チンとして利用可能な、組み換えワクチニアウィルスが
得られる。

（実施例） 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
。

実施例１ （１）　　日本脳炎ウィルスからのＲＮＡゲノムの抽出
蚊由来株化細胞　Ｃ６／３６　（Ｊ、Ｇｃｎ、ν１ｒｏ
１．４０５３１−５４４　（１９７８））に日本脳炎ウ
ィルス５ａＱａｙａｌａ株を感染させ、ウィルスを増殖
さゼた摂、培養上清とポリエチレングリコールとを混合
し遠心分離により日本脳炎ウィルスをＮ製した。

ウィルスゲノムＲＮＡ　（約ｌ　１ＫｂＯ）は緒製ウィ
ルスからフェノール抽出侵、エタノールを加えて沈澱さ
せ分離した。

（２）　　日本脳炎ウィルスのｃＤＮＡのクローニング
（第１図参照ン （１）でＩＩしたウィルスゲノムＲＮＡにポリ（Ａ＞ポ
リメラーゼ（宝酒造）を使って、ポリ（Ａ）を付加し、
それを＃！Ｉ型とし、オリゴｄ　（Ｔ）をプライマーに
用いて、４種（Ａ−Ｇ−Ｃ−Ｔ）のデオキシリボヌクレ
オシド三リン酸と、逆転写酢木を働かせて、ファースト
ストランドｃＤＮＡを合成した。次に大１１ＡｍＲＮａ
ｓｅｌ−４と、４ｆ！！（Ａ−Ｇ・Ｃ・丁）のデオキシ
リボヌクレオシド三リン酸と大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
を使って二本鎖ｃＤＮＡを作成しくＭｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　［ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇｔｌａｒ
ｂｏｒ　ｔａｂ、　（１９８２）　］　Ｄｐ　２１１〜
２４６）、ターミナルトランスフェラーゼでｄｃｌｌｌ
ｍを付加した。一方、プラスミドｐＵｃ９　（ファルマ
シア製）を−Ｊｗｉ静素ＰＳｔＩで消化後、ターミナル
トランスフェラーゼでｄＧｌを付加し、これと、前記ｃ
ＤＮＡｔｒ混合し、ライゲーション反応を行ない環状化
した。この組換えプラスミドを大嶋菌ＨＢ１０１コンピ
テントセルに導入し、形質転換菌を得た。形質転換菌か
らプラスミドをとり出し、インサートｃＤＮＡの長さを
７ガＯ−スゲルで比較し、もつとも長いインサートｃＤ
ＮＡについて５′側の配列分析（Ｇｅｎｅ　　１９　　
Ｌ２６９（１９８２）　）をおこなった。その配列分析
の結果より、２Ｏ−ｒｎｅｒの合成オリゴヌクレオチド
（５’　−ｄ＾ＴＴＣＣＧＴＡＣＣＡＴＧＣＡＧＴＣＣ
Ａ−３”）をブライマーとして、ウィルスゲノムＲＡＮ
を鋳型にして、再度上記の方法でｃＤＮＡを作成し、プ
ラスミドｐｕｃｃ＋にライゲーションし、多数の形質転
換菌を得た。得られた形質転換菌の中から目的の非構成
蛋白質をコードするｃＤＮＡを含む組み換えプラスミド
を含む形質転換菌を以下に述べる方法で選択した。

尚、日本脳炎ウィルスのｃＤＮＡクローンの作成方法に
ついては、日本脳炎ウィルスＪａＯＡｒＳ　　９８２株
を使い、同様な方法で作成した例がａｅｎｅ土８　　ｐ
、１９５−２０１　（１９８６）に記載されている。

（３）　　日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードす
るｃＤＮＡ　（４１１８，１１３７）を含む組み換えプ
ラスミドｐＪＥ４１１８、ｐＪＥ１１３７のスクリーニ
ング（第１図及び第２図参照）（２）で得られた形質転
換菌を寒天プレートで生育させ、ニトロセルロースフィ
ルターにレプリカする。レプリカしたフィルターを０．
２％ＮＰ−４０（界面活性剤、半片化学）でゆるやかに
洗浄した後、抗ＪＥｌｌｌＩｈｌでイムノスクリーニン
グしたところ、弱いながらもポジティブに反応する形質
転換菌を１採得て、その株が保有するプラスミドをｐＪ
Ｅ４１１８とした。次いでプラスミドｐＪＥ４１１８を
常法（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ、　７
５〜９５（前述））に従い調整し、制御Ｉｉ！酵素ｐｓ
ｔ■でｐＵＣ９に挿入されたｃＤＮＡを切り出し、これ
をＤＮＡプローブとして、（２）で得た各種形質転換菌
をコロニーパイプリダイゼーション法（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｐ、３８２−３８７　（前記）
）によってスクリーニングし、ｐＪＥ４１１８のインサ
ートｃＤＮＡ　（４１１８）と重なりあうｃＤＮＡをも
つプラスミドを選び出した。そうやって選び出した２つ
のｃＤＮＡ　（２−２０，１１３７）をプラスミドより
回収し、υ１限酵素でその位置間係を決定した（第３図
参照）ところ、ｃＤＮＡ　（２−２０）はｃＤＮＡ（４
１１８）の５′末端と部分的に重なり合っていること及
びｃＤＮＡ　（１１３７）はｃＤＮＡ（４１１８）の３
′末端と部分的に重なり合っていることが判明した。

（４）　　非構成蛋白質をコードするｃＤＮＡの塩基配
列の解明（第３図参照）。

組み換えたプラスミドｐＪＥ４１１８、ｐＪＥ２−２０
、Ｉ）ＪＥ１１３７をａｌｉｌ＋限酵素、ＰｓｔＩで１
，１ＪｌｉＬ、、それぞれ約２．５Ｋｂｐ、約１．０Ｋ
ｂｐ、約０．９ＫｂｐのＤＮＡ断片を得た。これらの断
片についてＭ１３ファージを用いるメツシングらの方法
（ジーン、１旦、ｐ、２６９　（１９８２）：サイエン
ス、２４Ｌ　ｏｌ　２０５　（１９８１））により配列
分析を行った。

その結果、ｃＤＮＡ　（２−２０）とｃＤＮＡ（４１１
８）が重なり合う部分のｃＤＮＡ配列は第３図中の第一
４９６番アミノ酸の第３コドンから第一３８５１！アミ
ノ酸までの３３４塩基であることが判明した。またｃＤ
ＮＡ　（４１１８）とｃＤＮＡ　（１１３７）が重なり
合う部分のｃＤＮＡ配列は、第３図中の第１２１番アミ
ノ酸の第３コドンから第３３２番アミノ酸の第２コドン
までの６３３塩基であることが判明した。この塩基配列
から推定されるアミノ酸配列と、すでに公知（Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ　２２９　７２９−７３３　（１９８５））であ
る黄熱病ウィルス（日本脳炎ウィルスと同席近縁）の非
構成蛋白質のアミノ酸配列の比較から、日本脳炎ウィル
スのＮＳＩ蛋白質は第３図中に示す＋１番目から第４１
２１目のアミノ酸までであると判断された。

同様に、日本脳炎ウィルスのＥ蛋白質は第３図に示す第
一５００番目から第一１番目のアミノ酸まで、またＭ蛋
白質は第３図に示す第一５７５１目から第一５０１番目
のアミノ酸まで、またＰｒｅＭ蛋白質は第一６６７１目
から第一５７６番目までと判断された。さらに、ｐ　ｒ
ｅＭ？Ｊ白質の５′側は日本脳炎ウィルスのＣ蛋白質の
一部をコードしていると判断された。

（５）　　日本脳炎ウィルスＮＳＩ蛋白質をコードする
ｃＤＮＡの作製（第２図及び第３図参照）。

ｃＤＮＡ　（４１１８ンはＥ蛋白質のＮ末端の５アミノ
酸が欠けている。そこでｃＤＮＡ　（２−２０）を用い
て、ＡａｔＩＩサイトの位置でつなぎ合わせて、Ｅ蛋白
質を完全にカバーするｃＤＮＡ（２０３）を作製した。

またｃＤＮＡ　（４１１８）はＮＳ１蛋白質のＣ末端の
８０アミノ酸が欠１ノでいる。そこでｃＤＮＡ　（１１
３７）を用いてＡＣＣｍサイトの位置でつなぎ合わ「て
ＮＳＩ蛋白質を完全にカバーするｃｌ）ＮＡ　（２０３
７＞を作製した。

■　ｃＤＮＡｉｌｉ片ＬＪＮＳＩ　）：　ｃＤＮＡ　（
２０３７）をＳａｃ　Ｉで処理した３′末端側約１．９
にｂｐのｃＤＮＡ断片。この断片はＮＳ１蛋白質をコー
ドする領域に加えてＥ？ＪＸ白質及びＮ５２ａ蛋白質を
コードする領域を含んでいる。

■　ｃＤＮＡｒｌｆｔ片（Ｊ　１１　）　：　ｃＤＮＡ
　（２０３７）をＨａｅｌＩで処理した約３．８にｂＤ
の断片。

この断片は、ＮＳＩ蛋白質をコードする領域に加えて５
′側にＥ蛋白質、Ｍ蛋白質、ＰｒｅＭ蛋白質及びＣ蛋白
質、更に３′側にＮ５２ａ蛋白質をコードする！￥域を
含んでいや。

（６ン　　ポリリンカー及びワクチニアウィルス７．５
にプロモーターが挿入されたワクチニアウィルスＴＫ遺
伝子を含む第一の組み操えベクターｐＡＫ８の作製（第
４図参照） ｐｔＪｃ９をＥＣ０ＲＩ及びＰｓｔＩで消化後、ポリメ
ラーゼで処理し、１ｉ７Ｊ　ｌｉ端を平滑末端したのち
、連結し、ＥＣｏＲＩ部位の欠損したｐＬＩＣ９を作製
した。このＥｃｏＲ１部位欠損ＤＵＣ９をＨｉｎｄｆｆ
ｌで切断後、ワクチニアウィルスＴＫｉ！伝子を含むワ
クチニアウィルスＷＲ株のｌ−１ｉ　ｎ　ｄｌ［ＩＪ断
片に連結し、組み換えベクターｐＬＩＮＫを得た。

次いでワクチニアウィルスＷＲ株の７．５プロモーター
（モスら、セル１２５．ｐ、８０５〜８１３．１９８１
年）をｐＵＣ１９（ファルマシア社製）のト１ｉｎｃ１
［部位に挿入したのら、Ｉ−１ｉ　ｎ　ｄ■のＥｃｏＲ
Ｉで順次切断して７．５にプロモーターの前模にポリリ
ンカ一部位を有するＤＮＡ断片（約３５０ｂ１））を得
た。

このＤＮＡ断片（第４図参照ンとｙＩ記プラスミドｐｌ
ＪＨＫのＥｃｏＲＩ消化物とをポリメラーゼで処理した
のち、連結し、得られた組み換えプラスミドをｐＮＺ６
８に２と命名した。

次いで翻訳開始コドン、ｉ訳終止コドン及び両者間に１
１限醇素切断配列（ＢＱ７ｎ、ＮＣ０Ｉ）を有する両末
端がＢ　ａ　ｍ　ｌ−Ｉ　Ｉサイトの合成リンカ・−を
合成しく第４図参照）、１）ＮＺ６８に２のＢａｍ）Ｉ
Ｉサイトに挿入して、目的の第一の組み換えプラスミド
ｐＡＫ８を作製した。

１７１７．５にプロモーターの下流に１］本脳炎ウィル
スの表面抗原蛋白質をコードするＤＮＡを挿入した第二
の組み換えプラスミドの作製（第４図参照） ■　ｃＤＮＡ　（ＪＮＳ　１　）を挿入した第二の組み
換えプラスミド（ｐＡＫＪＮｓｌ　）の作成（５）で得
たｃＤＮＡ（ＪＮＳｌ）をポリメラーゼ（クレノーフラ
グメント）により処理後、（６）で得たプラスミドｐＡ
Ｋ８をＢａｎ　Ｉｔで消化後、ポリメラーゼ処理した開
裂プラスミドに連結し、７．５にプロモーターの下流で
、かつ翻訳開始コドンと翻訳終止コドンの間にｃＤＮＡ
　ＬＪＮＳｌ　）を挿入した組み換えプラスミドｐＡＫ
ＪＮｓ１を得た。

このプラスミドは制限酵素Ｎｃｏ　ＩとＥＣ０Ｒｖで二
重切断した時に　約０．５にｂｐのＤＮＡ断片を生ずる
ものとして選択される。因みにｃＤＮＡ　（ＪＮＳｌ　
）が逆方向に挿入された組み換えプラスミドの場合には
、同様に処理したときに、約１．３にｂｐのＤＮＡｌｉ
片を生ずる。

■　ｃＤＮＡＬｌｌｌ）を挿入した第二の組み換えプラ
スミド（ｐＡＫＪｌｌ）の作成（５）で得たｃＤＮＡ　
（Ｊｌ　１　）をポリメラーゼ処理後、（６）で得たプ
ラスミドｐＡＫ８のＢａｔ　Ｉ消化物と連結し、７．５
にプロモーターの下流で、かつ翻訳開始コドンと翻訳終
止コドンの間にｃＤＮＡＬｌｌｌ）を挿入した組み換え
プラスミドＤＡＫＪ１１を得た。

このプラスミドは制限酵素Ｎｃａｌで切断したとき約０
．４にｂｏのＤＮＡ断片および約０．８ＫｂｐのＤＮＡ
ｌ１片を生ずるものとして選択された。

（８）組み換えワクチニアウィルスの作出２５ｃＩＡ２
のカルチャーボトルに１８ｍされたＲＫ−１３細胞に弱
毒痘そうウィルス株（特開＋ＫＩ　６２−４４１７８号
記載の弱毒痘そう株ＬＡ、ウサギ腎細胞における増殖不
能温度４１℃、釘化鶏卵漿尿膜上でのポックサイズ２〜
３　ａｍ　）を０．１ｐｒｕ／細胞の割合で接種し、４
５分模、（７）で得た各種の組み換えプラスミド（ｐＡ
ＫＪＮｓｌ、ｐＡＫＪｌｌ）１０μりを２．２ｍの滅菌
水に溶解し、樋高ら（蛋白質・ｉｓｍ−酵素、２７，３
４０−１９８５）の方法によってＤＮＡ−リン酸カルシ
ウム共沈物をつくり、その０．５７を感染ＲＫ−１３Ｉ
ｌｌ胞上に滴下した。３０分間、３７℃、７％ＣＯ２イ
ンキ、ユベーターに静置し、５％牛脂児血清を含むイー
グル（Ｅａｇｌｅ　）　ＭＥＭ４．５−を加えた。その
３時間後、培養液を交換し、４８時間、３７℃、７％Ｃ
Ｏ２インキュベーター中で培養し、培！細胞ごと３度凍
結融解した。

組み換え体の選択のため、１０ｃＭベトリ皿に培養され
たＴＫ”１４３細胞に上記のウィルス液を接種し、３０
分後、１％アｊｊＯ−ス、５％牛脂児血清、２５μｇ／
ｍＢＵｄＲ加　Ｅａｏｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍを積層し、３日
間培養後感染Ｉ［ｌ胞を０．０１％中性紅で染色した。

出現したプラークからパスツールピペットでウィルスを
広きとり、これを２％ゼラチンを含むＰＢＳに懸濁し、
一部はドツトハイブリダイビージョンをするために、ナ
イロン又はニトロセルロースメンブレンにスポットし、
残りは一２０℃で保存した。スポットしたメンブレンは
０．５８　ＮａＯＨで１０分間、１Ｈトリス塩Ｉ！緩衝
液で５分のｊＩＵｆＩｌを３回繰返した後、１．５ＨＮ
ａＣ１０，５８トリスｍ＊ａ衝′液で５分処理した。２
倍ＳＳＧ　（１倍５ＳＣ１０，１５８ＮａＣ！、０，０
１５Ｍ　　クエン酸ナトリウム）で飽和させ、８０℃、
２時間焼きつけた。４倍ＳＥＴ　　（０，６１４ＮａＣ
１，０，０８ＨＴｒ　　ｉ　　５−ＣＩ、４ｍＨＥＤＴ
Ａ　　（ρ１１７．８））−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ−
Ｑ、　１％ＳＤＳで６８℃、２時間処理した。４倍５Ｅ
Ｔ−１０倍Ｄｅｎｈａｒｄｔ　−０、１％５ＤＳ−０．
１％Ｎａ４ｐ、、ｏ７−５０μ’、ｉ／ｄ変性サケ***
ＤＮＡとニックトランスレーションによって３２ＰでＩ
ａ識した日本脳炎ウィルスのＮＳ１蛋白質のｃＤＮＡを
入れて６８℃、１４時間ハイブリダイゼーションした。

洗浄後、メンブレンとＸ線フィルムを重ね、オートラジ
オグラフィーを行い、フィルムが黒化するスポットを選
択した。

黒化したスポットに対応するウィルス液を再ＩＡＴＫ−
１４３の細胞に接種し、３０分後、１％アガロース、５
％牛脂児面清、２５μｇ／１ｄＢＩＪｄＲ加Ｅａｇｌｅ
　Ｍ　Ｅ　Ｍをｆ［し、３日間培ｆＩ後感染細胞を０．
０１％中性紅で染色した。出現したプラークについて、
上記と同様な操作をおこない、出現するプラークが全て
、ドツトハイプリダイぜ一ジョンで黒化するまで純化の
操作をくり返した。

こうして得られたウィルスは、目的の組み換えワクチニ
アウィルスであり、使用した組み換えプラスミドに対応
してそれぞれＬＡＪＮＳＩ、ＬＡＪｌｌと命名した。

（９）　　組み換えワクチニアウィルスの感染細胞での
発現 組Ｊｌ培養用チャンパース２イドに培養したＲＫ１３細
胞にｔｏ、　ｉ、　１又は０．１の本発明組み換えウィ
ルス株を接種し、３７℃、１ｖｔ間感染後ウィルス液を
後きとり、［Ｉ胞をＥａｏｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍで洗浄し、
５％牛脂児血清、Ｅａｇｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍを加えた。１
６時間後、Ｅａｏｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍを除き、軽＜ＰＢＳ
　（’）ンｍ！ｌｉＩ生理食塩水）で洗い、風乾した後
、室温でアセトン中５分間処理し細胞を固定した。一時
抗体として抗ＪＥＶ抗体（１！染性のある日本脳炎ウィ
ルスをウサギに接種して作成した抗血清）、二次抗体と
してイソチアン酸フルオレセイン結合抗ウサギＩ　ａＧ
Ｋ体を使用する間接蛍光杭体法でチェックした。その結
果、２種類の組み換えワクチニアウィルスはいずれも日
本脳炎ウィルスのＮＳ１蛋白質生産能を持つことを確認
した。その結果をまとめて第２表に示す。

なおこの抗ＪＥＶ抗体ｔよ生物学的活性のある日本脳炎
ウィルスをもとに作成したので、抗ＪＥＶ抗体と反応す
る蛋白質は、日本脳炎ウィルス由来の生物学的活性のあ
る蛋白質と類似の活性を持つと判断される。

また発現した蛋白質の分子階は、本発明和み換えワクチ
ニアウィルスを感染させたＲＫ１３綱胞の蛋白質をウェ
スタンプロット法（バーネット、−０Ｎ、＾ｎａｌｙｔ
、Ｂｉｏｃｈｅｍ１１１２巻（１９８１）１９５−２０
３頁）でニトロセルロース膜に移して、抗血清を使って
確認した。その結果、ＬＡＪＮＳ１＠染細胞では分子細
胞４６０００ダルトンのＮＳ１蛋白質を、またＬＡＪＩ
Ｉ感染細胞では分子量約５３０００ダルトンのＥ蛋白質
と、分子量約４６０００ダルトンのＮＳ１蛋白質を発現
していた。尚、ＬＡＪＮＳｌやＬＡＪＩＩのかわりに親
株ワクチニアウィルスＬＡを感染させたａ胞では、抗血
清と反応する蛋白は認められなかった。

第　　２　　表 ｍ：反応せず　　　　　　妊：強い反応（１Ｆ：きわめ
て強い反応

【図面の簡単な説明】

第１図は日本脳炎ウィルスのｃＤＮＡのクローニング手
順、第２図はｃＤＮＡの制限酵素サイトの位置関係、第
３図はＮＳＩ蛋白質をコードする領域を含むｃＤＮＡの
塩基配列及びアミノ酸配列、第４図はＮＳＩ蛋白質をコ
ードするｃＤＮＡを含む組み換えプラスミドｐＡＫＪＮ
ｓ１、ρＡＫＪ１１の構築手順をそれぞれ示す。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ワクチニアウイルスの増殖に非必須なゲノム領域
   に日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするｃＤＮ
   Ａの全部又は一部を組み込んだ組み換えワクチニアウイ
   ルス。
2. （２）非構成蛋白質をコードするｃＤＮＡの全部又は一
   部が日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質−１である請求項
   （１）記載の組み換えワクチニアウイルス。
3. （３）非構成蛋白質−１をコードするｃＤＮＡの全部又
   は一部が日本脳炎ウィルスの表面抗原蛋白質及び非構成
   蛋白質−２をコードするｃＤＮＡの全部又は一部ととも
   に組み込まれている請求項（２）記載の組み換えワクチ
   ニアウイルス。
4. （４）非構成蛋白質−１をコードするｃＤＮＡの全部又
   は一部が日本脳炎ウィルスの構成蛋白質であるコア蛋白
   質・マトリックス蛋白質・表面抗原蛋白質と及び非構成
   蛋白質−２をコードするｃＤＮＡの全部又は一部ととも
   に組み込まれている請求項（２）記載の組み換えワクチ
   ニアウイルス。
5. （５）組み込まれたｃＤＮＡがプロモーターの支配下に
   ある請求項（１）〜（４）記載の組み換えワクチニアウ
   イルス。
6. （６）組み込まれたｃＤＮＡが合成された翻訳開始コド
   ンと翻訳停止コドンの間に挿入されている請求項（１）
   〜（５）記載の組み換えワクチニアウイルス。
7. （７）日本脳炎ウィルスの非構成蛋白質をコードするｃ
   ＤＮＡが第３図にＮＳ１として示すアミノ酸配列又はそ
   れと実質的に同一機能を有するポリペプチドをコードす
   るものである請求項（１）〜（６）記載の組み換えワク
   チニアウイルス。