JP3826055B2 - 組換えアビポックスウイルスによる免疫方法 - Google Patents
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Description
本出願は1988年4月25日出願の米国特許出願第186,054号のCIP出願であり、このCIP出願はさらに1987年10月20日出願の米国特許出願第110,335号のCIP出願であり、これはさらに1987年8月28日出願の米国特許出願第090,711号のCIP出願である。
【0002】
本発明は、合成組換えアビポックスウイルスを用いて、非鳥類脊椎動物を含む脊椎動物において免疫応答を誘起する方法に関する。さらに詳細に言えば、本発明は脊椎動物、特に哺乳類において、脊椎動物病原体の抗原決定基をコードしかつ発現させるDNAを含有する合成組換えアビポックスウイルスを脊椎動物に接種することによって、脊椎動物病原体に対する免疫学的応答を誘起する方法、及びかかる修飾アビポックスウイルスから成るワクチン類に関する。さらに、本発明は、修飾アビポックスウイルス、その製造及び使用方法、修飾アビポックスウイルスの製造において生産される、或いは中間体として関与するDNA配列、及びかかる配列の製造方法に関する。
【0003】
発明の背景
アビポックス、即ちアビポックスウイルスは、家禽に感染するポックスウイルスと近縁の属である。アビポックス属には、ファウルポックス(fowl pox)、カナリーポックス(canary pox)、ジュンコポックス(junco pox)、ピジョンポックス(pigeon pox)、クエイルポックス(quail pox)、スパロウポックス(sparrow pox)、スターリングポックス(starling pox)、及びターキーポックス(turkey pox)種が含まれる。ファウルポックス種はニワトリに感染するもので、水痘とよばれるヒトの病気と混同してはならない。アビポックス属は他のポックスウイルスと多くの特徴が共通しており、脊椎動物を宿主とするポックスウイルスとしてアビポックスと同じ亜科に属する。ワクシニアとアビポックスを含むポックスウイルス類は、宿主の真核細胞内で複製する。これらのウイルス類はそれらが大きいこと、複雑であること、及び細胞質内の部位で複製されることで特徴付けられる。しかし、ワクシニアとアビポックスは異なる属であり、ウイルス分類国際委員会(International Committee on Taxonomy of Viruses)の第4回報告書、Intervirology 17巻、42〜44頁(1982)に報告されているように、おのおのの分子量、抗原決定基、及び宿主となる種が異なっている。
【0004】
アビポックスウイルスは、ヒトを含む哺乳類などの非鳥類脊椎動物に増殖性の感染はしない。さらに、哺乳類(ヒトを含む)の培養細胞に接種してもアビポックスは増殖しない。アビポックスを接種した哺乳類の培養細胞において、細胞毒性作用のため細胞は死ぬが、ウイルスの増殖性感染の証拠は見られない。
【0005】
哺乳類などの非鳥類脊椎動物に生きたアビポックスを接種すると、接種部分にワクシニアの接種と類似した病巣が形成される。しかし、ウイルスの増殖性の感染は起こらない。にもかかわらず、このようにして接種を受けた哺乳類がアビポックスウイルスに対して免疫学的に応答することが今回判明した。これは予想外の結果である。
【0006】
死滅病原体又はかかる病原体の精製抗原成分から成るワクチンは、有効な免疫応答を誘起させるためには、ウイルス生ワクチンよりも大量に注入しなければならない。このことは、生ウイルス接種がはるかに効率的なワクチン接種法であることによる。比較的少量の接種でも、問題の抗原がウイルス複製時に増幅されることから、有効な免疫応答を誘起させることができる。医学的観点から見れば、ウイルス生ワクチンは死滅病原体又は精製抗原ワクチンを接種するよりも効果が大きく、しかもより長時間持続する免疫性を付与する。従って、死滅病原体又はかかる病原体の精製抗原成分より成るワクチンは、生ウイルスの時よりもワクチン物質を大量に製造する必要がある。
【0007】
既に述べてきたことから明らかなように、ウイルス生ワクチンを使用することは医学的にもまた経済的にも利点がある。かかるウイルス生ワクチンのひとつとして、ワクシニアウイルスから成るワクチンが挙げられる。このウイルスは、組換えDNA法を用いて哺乳類病原体の抗原の遺伝子配列を示すDNAを挿入するのに有用なウイルスのひとつであることが、従来技術において公知である。
【0008】
従って、病原性生物の抗原決定基をコードするDNA配列を含有する、任意の起源の(例えば、ウイルス、原核生物、真核生物、合成)DNAをワクシニアゲノムの非必須領域に挿入することによって、組換えワクシニアウイルスを作製することができる方法が従来技術において開発された。これらの方法で作製されるある種の組換えワクシニアウイルスは哺乳類に種々の哺乳類病原体に対する特異的免疫を誘起させるために用いられている。これらに関しては全て米国特許第4,603,112号に記載されており、本明細書中に引用してある。
【0009】
非修飾ワクシニアウイルスは、天然痘の予防接種に比較的安全でかつ有効なものとして使用されてきた長い歴史がある。しかし、天然痘根絶前の、非修飾ワクシニアウイルスが広く投与されていた時は、中程度の危険ではあるが、全身的ワクシニア感染という形で実際に合併症が起きる危険があり、特に湿疹又は免疫抑制に罹患している者では危険が伴っていた。ワクシニア接種により生じる可能性のある合併症として、稀ではあるが、ワクチン接種後の脳炎がある。これらの反応のほとんどは、湿疹のような皮膚疾患、又は免疫系不全の者、又は家族に湿疹又は免疫反応不全の者がいる人達に接種したことが原因であった。ワクシニアは生きたウイルスであり、通常、健常人に対しては無害である。しかし、接種後数週間にわたり個人間で伝染する。正常の免疫応答が不全である者が接種、又は最近接種を受けた者からの接触伝染により感染した場合、重大な結果をもたらすことがある。
【0010】
従って、当技術における生ウイルスの接種の利点を有しながら既に述べた問題を軽減又は消失させるような方法は、現行技術の状態をはるかに上回る望ましい利点を持つことがわかる。このことは、後天性免疫不全症候群(AIDS)として公知の疾患が発症している現在において、極めて重要となっている。本疾患の犠牲者は重大な免疫不全に罹患していて、他の者にとっては安全な生ウイルスと直接接触、又は生ウイルス製剤から成るワクチン接種を最近受けた人と接触することにより伝染した場合、かかるウイルス製剤により簡単に傷害を受ける。
【0011】
発明の目的
本発明の目的は、病原性生物に対して脊椎動物を免疫することができるワクチンにして、ウイルス生ワクチンの利点を有しつつ、特に非鳥類脊椎動物を免疫するために用いたとき、既に列挙したようなウイルス生ワクチンの欠点も死滅ウイルスワクチンの欠点もほとんど又は全く有さないワクチンを提供することである。
【0012】
本発明はさらに、かかるワクチンに使用する合成組換えアビポックスウイルスを提供することを目的とする。
【0013】
本発明はさらに、鳥類及び非鳥類脊椎動物において、哺乳類のような非鳥類脊椎動物の場合には動物体内において感染したウイルスの産生を伴った増殖性の複製を行うことのできない合成組換えアビポックスウイルスを脊椎動物に接種することによって、免疫応答を誘起させる方法を提供することを目的とする。哺乳類のような非鳥類脊椎動物に接種した場合、かかるウイルスは、非ワクチン接種宿主に広がる可能性を自己限定し低下させる。
【0014】
本発明はさらに、脊椎動物において抗原に対する免疫応答を誘起させる方法にして、該脊椎動物に対する病原体の抗原決定基を含有しかつ発現させる合成組換えアビポックスウイルスを含有するワクチンを脊椎動物に接種することを含む方法を提供することを目的とする。
【0015】
また、遺伝子産物をコードし、かつ脊椎動物中でウイルスが増殖的複製をすることなく遺伝子産物を発現させるDNAを含有する組換えウイルスを脊椎動物に接種することによって、脊椎動物中で遺伝子産物を発現させる方法を提供することも本発明の目的である。
【0016】
さらに、抗原をコードし、かつ脊椎動物中でウイルスが増殖的複製をすることなく抗原を発現させるDNAを含有する組換えウイルスを脊椎動物に接種することによって、抗原に対する免疫応答を脊椎動物に誘起させる方法を提供することも本発明の目的である。
【0017】
発明の説明
本発明の一つの態様は、アビポックスゲノムの非必須領域における病原体の抗原をコードしかつ発現させる任意の起源のDNAの存在によって、修飾された合成組換えアビポックスウイルスを脊椎動物に接種することによって、前記病原体に対する免疫応答を脊椎動物中に誘起させる方法に関する。
【0018】
別の態様においては、本発明は脊椎動物の細胞内では増殖的複製はしないがかかる細胞中で遺伝子産物又は抗原を発現する組換えウイルスを用いて、脊椎動物中で遺伝子産物を発現させる或いは脊椎動物に抗原に対する免疫応答を誘起させる方法に関する。
【0019】
もう一つの態様においては、本発明は任意の起源、特に非アビポックス起源のDNAをアビポックスゲノムの非必須領域に挿入することによって修飾した合成アビポックスウイルスに関する。
【0020】
抗原をコードしかつ発現させる外来(即ち、非アビポックス)遺伝子を有する人工的に修飾したアビポックスウイルス組換え体は、前記抗原に対する脊椎動物宿主の免疫応答の発生を誘起させて、外来病原体に対する免疫応答の発生を誘起させるが、かかる組換え体は、本発明においては、死滅或いは弱毒化させた生きた生物を用いている従来のワクチンの欠点を、特に非鳥類脊椎動物に接種して用いるときに、有さない新規なワクチンを作製するのに用いられる。
【0021】
アビポックスウイルス類は鳥類又は鳥類の細胞系においてのみ増殖的に複製でき、また継代することができることをここでもまた述べておく必要がある。鳥類宿主細胞から採取した組換えアビポックスウイルスは、ワクシニアウイルスによる哺乳類の接種と同様の方法で哺乳類のような非鳥類脊椎動物に接種すると、接種による病変が生じるが、アビポックスウイルスの増殖的複製は起こらない。このような接種を受けた非鳥類脊椎動物でアビポックスウイルスは増殖的複製を行わないにもかかわらず、ウイルスの発現は充分に起こり、その結果、接種された動物はこの組換えアビポックスウイルスの抗原決定基及び該ウイルスの外来遺伝子にコードされた抗原決定基に対して免疫学的に応答する。
【0022】
鳥類に接種すると、かかる合成組換えアビポックスウイルスはその中に存在する任意の起源の外来DNAによってコードされる抗原に対する免疫応答を誘起するばかりでなく、宿主内でこのウイルスの増殖的複製を起こしてアビポックスベクター自体に対する予想された免疫学的応答を引き起こす。
【0023】
数人の研究者らが、組換えファウルポックス、詳細には家禽を防護するための動物用ワクチンとして使用するためのウイルスを作製することを提案して来た。ボイル(Boyle)及びクーパー(Coupar)、J. Gen. Virol. 67、1591−1600(1986)及びビンズ(Binns)ら、Isr. J. Vet. Med.42、124−127(1986)。哺乳類に特異的免疫を誘起する方法として組換えアビポックスウイルスを使用することに関し、提言されたことも全くなかったし、また実際に報告されたこともなかった。
【0024】
スティックル(Stickl)とマイヤー(Mayer)はFortschr. Med.97(40)、1781−1788(1979)で、アビポックス、詳細にはファウルポックスウイルスのヒトヘの注射について記載している。しかし、これらの研究は、癌の化学療法の後遺症にかかっている患者における非特異性免疫を増強するために通常のファウルポックスを使用することだけに関している。組換えDNA技術は全く用いられていない。脊椎動物病原体の抗原をコードするDNAをアビポックス中に挿入することも、また脊椎動物に特異的免疫を誘起する方法についても全く示唆されていない。その代わり、この先行技術はヒト宿主の一般的かつ非特異的な強壮効果に基づいている。
【0025】
遺伝子組換えを基礎としたより完全な検討を加えることによって、本発明の修飾組換えウイルス類がいかに作製されるかの理解に役立つであろう。
【0026】
遺伝子組換えは、一般にデオキシリボ核酸(DNA)の相同性部分を二つのDNAらせん間で交換することである。(あるウイルスでは、リボ核酸(RNA)がDNAに置き代わることができる。)核酸の相同性部分は、ヌクレオチド塩基の同じ配列を持つ核酸(RNA又はDNA)の部分である。
【0027】
遺伝子組換えは、感染した宿主細胞内で新規ウイルスゲノムの複製或いは産生時に自然に起きることもある。従って、ウイルス遺伝子間の遺伝的組換えは、二種以上の異なるウイルス又は他の遺伝子構造体に同時に感染した宿主細胞内で起きるウイルス複製サイクル中にも起こりうる。第一のゲノムのDNA部分が、第一のウイルスゲノムDNAと相同のDNAを有する同時感染した第二のウイルスゲノムの部分を組み立てる際に交換して用いられる。
【0028】
しかし、組換えは、また、完全には相同とは言えない異なるゲノムにおけるDNA部分間でも起こり得る。例えば、このような部分がゲノムのある部分と相同な第一のゲノムに由来するが、ただし第一のゲノム内の相同DNA部分に遺伝子マーカー又は抗原決定基をコードする遺伝子が挿入されているような場合にも、組換えは起こり得るし、その組換えによる産物もその遺伝子マーカー又は抗原決定基の存在により検出できる。
【0029】
挿入DNA遺伝子配列が修飾感染性ウイルスによって良好に発現されるためには二つの条件が必要となる。
【0030】
まず第一に、修飾ウイルスが生存可能であり続けるためには、挿入は前記ウイルスの非必須領域内でなければならない。ファウルポックスもアビポックスウイルスもこれまで示唆されてきたところによると、ワクシニアウイルスに関して記述されて来た非必須領域と類似の領域を有していない。したがって、本発明のファウルポックスの非必須領域は、ファウルポックスゲノムを断片に切断しこの断片を大きさで分離しこれらの断片を増幅させるためのプラスミド構造体に挿入することによって発見された(プラスミドとは、大腸菌を含む多くの細菌で染色体外要素として見出された小さな環状DNA分子である。抗原決定基遺伝子又は他の遺伝子マーカーのようなDNA配列をプラスミドに挿入する方法は、当技術で周知であり、マニアチス(Maniatis)ら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)ニューヨーク[1982]に詳細に記載されている)。次に、遺伝マーカー及び/又は抗原をコードする遺伝子をクローン化されたファウルポックス断片に挿入した。所定の組換えに成功した断片は遺伝マーカー又は抗原の回収が良好であることによって実証でき、かかる断片はファウルポックスゲノムの非必須領域に挿入されたDNAより成る断片であった。
【0031】
挿入DNA発現のための第二の条件は、挿入されたDNAと適切な関係にあるプロモーターが存在することである。プロモーターは、発現させるDNA配列の上流に位置するように置かなければならない。アビポックスウイルスの性質は充分に解明されておらず、またアビポックスプロモーターについてもこれまで当技術で同定されていないので、本発明の一部では他のポックスウイルスの公知のプロモーターを発現させるDNAの上流に効果的に挿入する。ファウルポックスプロモーターはまた、本発明の方法を実施しかつ本発明の産物を作るために用いられ成功している。本発明によって、ファウルポックスプロモーター、ワクシニアプロモーター及びエントモポックスプロモーターが組換えポックスウイルスの転写を促進することが判明した。
【0032】
ボイル(Boyle)とクーパー(Coupar)はJ. Gen. Viro1. 67、1591(1986)で、ワクシニアプロモーターが「(ファウルポックス)ウイルスで作用することが予測される」という推測を発表した。この著者らは、ファウルポックスTK遺伝子の場所を確認しクローン化(ボイル(Boyle)ら、Virology 156、355−365[1987])して、これをワクシニアウイルスに挿入した。このTK遺伝子は発現したが、恐らくそれは、ワクシニアポリメラーゼの機能によってこのファウルポックスTKプロモーターの配列が認識されたことによるのだろう。しかし、彼らの推測にもかかわらず、この著者らはファウルポックスウイルスにワクシニアプロモーターを挿入することはしなかったし、またファウルポックスゲノム中で外来DNA配列が発現することも観察しなかった。他のポックスウイルス由来のプロモーター、例えばワクシニアプロモーターがアビポックスゲノム中で実際に遺伝子の転写を促進させることは本発明以前には公知でなかった。
【0033】
好ましい実施例の説明
ファウルポックス及びカナリーポックスウイルスが、本発明の外来DNAを取り込み組換えによって修飾される好ましいアビポックス種として特に用いられた。
【0034】
ファウルポックスは、特にニワトリに感染するアビポックスの一種であるが、哺乳類には感染しない。本明細書中でFP−5と呼ばれるファウルポックス株は、アメリカン・サイエンティフィック・ラボラトリーズ(American Scientific Laboratories)(シェーリング社(Schering Corp.)の一部門)、マディソン(Madison)、ワイオミング州、米国獣医免許番号165、通し番号30321、から入手可能なニワトリ胚由来の市販ファウルポックスウイルスワクチン株である。
【0035】
本明細書中でFP−1と呼ばれるファウルポックス株は、生後1日目のニワトリのワクチンに用いるための改良ドゥベット(Duvette)株である。この株はO DCEP25/CEP67/2309オクトーバー1980と呼ばれる市販ファウルポックスウイルスワクチン株であり、インスティチュート・メリークス社(lnstitute Merieux、Inc.)から入手可能である。
【0036】
カナリーポックスはアビポックスの一つの種である。ファウルポックスと同様に、カナリーポックスは特にカナリヤに感染するが、哺乳類には感染しない。本明細書中でCPと呼ばれるカナリーポックス株は、LF2 CEP524 2410 75と呼ばれる市販カナリーポックスワクチン株であり、インスティチュート・メリークス社から入手可能である。
【0037】
本発明の遺伝子組換えによってこれらのアピポックスウイルスに挿入されたDNA遺伝子配列には、原核生物由来のLac Z遺伝子、非鳥類(特に哺乳類)病原体のひとつの抗原である狂犬病糖タンパク(G)遺伝子、アビポックスウイルス以外の病原性鳥類ウイルスの抗原であるターキーインフルエンザ赤血球凝集素遺伝子、哺乳類ウイルスの一つであるウシ白血病ウイルスのgp51,30エンベロープ遺伝子、鳥類ウイルスの一つであるニューカッスル病ウイルス(テキサス(Texas)株)の融合タンパク質遺伝子、哺乳類ウイルスであるネコ白血病ウイルスのFeLVエンベロープ遺伝子、鳥類ウイルス/家禽の病気であるラウス関連ウイルスのRAV−1 env遺伝子、鳥類ウイルスであるチキン/ペンシルバニア(Chicken/Pennsylvania)/1/83インフルエンザウイルスの核タンパク質(NP)遺伝子、鳥類ウイルスである感染性気管支炎ウイルス(Mass 41株)のマトリックス遺伝子とペプロマー遺伝子、哺乳類ウイルスである単純ヘルペスウイルスの糖タンパクD遺伝子(gD)が含まれている。
【0038】
前記Lac Z遺伝子の単離は、カサダバン(Casadaban)らがMethods in Enzymology 100、293−308(1983)に記載している。狂犬病G遺伝子の構造は、例えば、アニリオニス(Anilionis)ら、Nature 294、275−278(1981)に開示されている。
【0039】
ワクシニアヘの組み込み及び本ベクター内での発現は、キーニィ(Kieny)ら、Nature 312、163−166(1984)によって検討されている。ターキーインフルエンザ赤血球凝集素遺伝子は、カワオカ(Kawaoka)ら、Virology 158、218−227(1987)によって述べられている。ウシ白血病ウイルスgp51,30 env遺伝子は、ライス(Rice)らがVirology 138、82−93(1984)に記載している。ニューカッスル病ウイルス(テキサス株)の融合遺伝子は、プラスミドpNDV108としてインスティチュート・メリークス社から入手可能である。ネコ白血病ウイルスenv遺伝子は、ギルホット(Guilhot)らがVirology 161、252−258(1987)に記載している。ラウス関連ウイルス1型は二つのクローン、pen VRVIPTとmp19env(190)としてインスティチュート・メリークス社から入手可能である。チキンインフルエンザNP遺伝子は、プラスミドpNP33としてセイント・ジュード小児研究病院(St.Jude Children’s Research Hospita1)のヨシヒロ・カワオカ(Yoshihiro Kawaoka)から入手できる。IBV Mass41マトリックス遺伝子及びペプロマー遺伝子の感染性気管支炎ウイルスのcDNAクローンは、プラスミドpIBVM63として、インスティチュート・メリークス社から入手できる。単純ヘルペスウイルスgD遺伝子は、ワトソン(Watson)らのScience 218、381−384(1982)に記載されている。
【0040】
以下に更に詳細に記載した組換えアビポックスウイルスには、ワクシニアプロモーター三種のうちのひとつを組み込む。ワクシニアのAva I H領域由来のPiプロモーターはワックスマン(Wachsman)らがJ. of Inf. Dis. 155、1188−1197(1987)に記載している。さらに詳細に言えぱ、このプロモーターはL変異WRワクシニア株のAva I H(Xho I G)断片に由来し、この中で前記プロモーターは右から左への転写を指示する。このプロモーターの地図上での位置はAva I Hの左端からおよそ1.3Kbp(キロベースペア)、ワクシニアゲノムの左端からおよそ12.5Kbpであり、Hind IIIC/N結合の約8.5Kbpにある。このプロモーターの配列は、
【化1】
であり、上記配列中カッコ内の記号はリンカー配列である。
【0041】
前記Hind III Hプロモーター(本明細書中で「HH」及び「H6」とも呼ばれる)は、標準的な転写マッピング法で明らかとなった。これは、下記の配列を有する。
【0042】
【化2】
この配列は、ローゼル(Rosel)ら、J. Viro1. 60、436−449(1986)によって読み取り枠の上流の配列として記載されたものと同一である。
【0043】
11Kプロモーターは、ウィテック(Wittek)、J. Virol. 49、371−378(1984)及びバーソレット(Bertholet,C)他、Proc. Natl. Acad. Sci.USA 82、2096−2100(1985)に記載のとおりである。
【0044】
本発明の組換えアビポックスウイルス類は、当技術で公知の合成アビポックスウイルス組換え体を作製する前述の米国特許第4,603,112号に開示の方法と同様に二段階で作製した。
【0045】
最初に、ウイルスに挿入すべきDNA遺伝子配列を、アビポックスウイルスの非必須領域と相同のDNAを挿入した大腸菌(E.co1i)プラスミド構造体に入れる。これとは別に、挿入すべきDNA遺伝子配列をプロモーターに結合させる。プロモーター・遺伝子結合物を次にプラスミド構造体中に入れ、アビポックスDNAの非必須領域と相同のDNAに対し両端で隣接させる。得られたプラスミド構造体を大腸菌内で増殖させて増幅させる。(プラスミドDNAは、外来遺伝物質を保有し増幅するために用いられるが、この方法は当技術で周知である。例えば、これらのプラスミド技術については、クレウェル(Clewell)がJ. Bacteriol.110、667−676(1972)に記載している。宿主大腸菌から増幅プラスミドを単離する技術は、これも当技術で周知であり、例えば、クレウェルらがProc. Natl. Acad. Sci.
USA 62、1159−1166(1969)に記載している。)
【0046】
大腸菌内で増殖後単離した増幅プラスミド物質を次に第二段階に用いる。即ち、挿入すべきDNA遺伝子配列を含有するプラスミドをアビポックスウイルス(ファウルポックス株FP−1又はFP−5等)と共に例えばニワトリ胚線維芽細胞(CEF)のような培養細胞にトランスフェクションさせる。プラスミド中の相同ファウルポックスDNAとウイルスゲノム間の組換えによって、このゲノムの非必須領域において非ファウルポックスDNA配列の存在によって修飾されたアビポックスウイルスが出来る。
【0047】
本発明及び本発明の多くの利点については例示した以下の実施例でより理解が深まることであろう。
【0048】
実施例1 ファウルポックスRNA転写因子によるワクシニアプロモーターの認識を示唆する過渡的発現のアッセイ
ワクシニアウイルスプロモーター配列に結合し、B型肝炎ウイルス表面抗原(HBsAg)をコードする配列を含有するいくつかのプラスミド構造体を作製した。各プラスミドの50μgを、細胞1個当たり10pfuのファウルポックスウイルス又はワクシニアウイルスに感染したCEF細胞にトランスフェクションさせた。感染を24時間進行させ、次に、凍結・融解を三回連続繰り返して溶解させた。
【0049】
この溶解質中のHBsAgの量を、アボット・ラボラトリーズ(AbbottLaboratories)の診断薬部(Diagnostic Division)から市販されているオースリア(AUSRIA)II−125Iキットを用いて評価した。HBsAgの有無を、製造者が事前に設定した陰性カットオフ値に対する未知検体の正味計数(バッググラウンド値を減じた検体値)の比として示す。これを、P/N(陽性/陰性)比として示す。この結果を表Iに示す。
【0050】
異なるワクシニアプロモーター配列3種、つまり、DNA複製前のワクシニア感染初期に見られるPiプロモーター、DNA複製開始後のワクシニア感染後期に見られるllKプロモーター、ワクシニア感染の初期及び後期の両期に見られるHind III H(HH)プロモーター、を用いた。これらのプロモーターについては、本明細書において既に記載してある。
【0051】
上記データから、感染細胞の溶解質中に産生されたHBsAgが、ファウルポックス又はワクシニア転写因子によってワクシニアプロモーターが認識された結果であることが示唆される。
【0052】
【表1】
【0053】
実施例2 LAC Z遺伝子含有組換えファウルポックスウイルスvFP−1の作製
ファウルポックスウイルスの非必須領域内のひとっの断片を以下のようにしてその位置を同定して単離した。
【0054】
ヌクレアーゼBal 31を用い、FP−5DNAの一本鎖末端のヘアピンループを除去した。DNAポリメラーゼのクレノウ(大)フラグメントを用いてブラントエンドを生じさせた。ループ除去後、Bgl IIによる制限酵素消化によって前記断片を作製した。この消化によって一連のFP−5断片ができたが、これらはアガロースゲル電気泳動で分離した。
【0055】
8.8KbpのBgl IIブラントエンドを有する断片を単離し、Bam HIとSma Iで切断してある市販のプラスミドpUC9と連結させた。生成したプラスミドをpRW698と命名した。
【0056】
ファウルポックス断片の大きさを小さくするため、このプラスミドをHind IIIで切断してさらに二つの断片を生じさせた。6.7Kbpの断片を捨て、残る4.7Kbpの断片を二つ連結し、新規プラスミドpRW699を作製した。
【0057】
このプラスミドに11Kプロモーターで転写促進されるLac Z遺伝子を組み込むため、pRW699をEcoRVで切断した。このEcoRVは前記プラスミドを1ヵ所でのみ切断する。この挿入座をF3と名付けた。この11Kプロモーターで転写促進されるLac ZセグメントをブラントエンドのPst I−Bam HI断片として挿入し、新規プラスミドpRW702を作製した。このLac Zクローンは、前記引用文献中でカサダバン(Casadaban)らが記載しているようにpMC1871由来である。前記11Kプロモーターは、Bam HIリンカーによりLac Z遺伝子の第8コドンに連結された。
【0058】
米国特許第4,603,112号記載のワクシニアに関する組換え技術を用い、このpRW702プラスミドを次にニワトリ胚線維芽細胞(CEF)で増殖させたファウルポックスウイルスFP−5に組換えた。この時、vFP−1を作製するため以下の操作を用いた。pRW702 DNA50μgを全ゲノムファウルポックスDNA0.5μgと混合し、最終容量を100μlとした。2.5MCaCl2を10μl、及び40mM Hepes、300mM NaCl、1.4mM Na2HPO4、10mM KCl、12mMデキストロースから調製した2×HEBS緩衝液(pH7)110μlをこれに添加した。室温に30分間置いた後、5pfu/細胞となるように希釈したファウルポックスウイルスプール200μlを添加した。その後、この混合物を、初代CEF単層を含む60mmディッシュ上に接種した。この時、2%ウシ胎児血清(FBS)含有イーグル(Eagles)培地0.7mlも添加した。このプレートを37℃で2時間インキュベートした後、2%FBS含有イーグル培地3mlを添加し、プレートを3日間インキュベートした。細胞を、凍結・融解を3回連続的に繰り返すことによって溶解させた後、新形成ウイルス粒子を組換え体存在下にアッセイした。
【0059】
11Kプロモーターで転写促進されるLac Z遺伝子をファウルポックスFP−5ゲノム中に組み換えたことによる挿入が成功したことの証拠は、Lac Z遺伝子の発現を試験することによって得られた。Lac Z遺伝子は酵素β−ガラクトシダーゼをコードし、この酵素はクロモゲンである5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−β−D−ガラクトシド(X−gal)を切断し青色のインドリル誘導体を放出させる。青色プラークを陽性組換え体として選択した。
【0060】
Lac ZのファウルポックスFP−5ゲノムヘの挿入とその発現の成功は、vFP−1感染CEF、BSC(サル腎細胞株−ATCC CCL26)、VERO(サル腎細胞株−ATCC CCL 81)、及びMRC−5(ヒト二倍体肺細胞株−ATCC CCL 171)を用いた標準法及び市販の抗血清とのβ−ガラクトシダーゼの免疫沈降によっても確認した。
【0061】
組換えウイルスvFP−1によるβ−ガラクトシダーゼの発現を、さらに、ウサギ及びマウスにこのウイルスを接種し、接種動物血清中のβ−ガラクトシダーゼタンパクに対して生じた抗体の力価の接種後の上昇を測定しそれが良好であることによって、インビボでも確認した。
【0062】
特に、前記組換えvFP−1を感染宿主細胞から精製し、ウサギ2匹の両側のそれぞれ2ヵ所に皮内注射した。各ウサギに総計で108pfuを接種した。
【0063】
一週間おきに動物から採血し、その血清を市販の精製β−ガラクトシダーゼ標品を抗原として用いたELISAアッセイで検出した。
【0064】
この組換えvFP−1を接種されたウサギとマウスの双方ともに、β−ガラクトシダーゼタンパクに対する免疫応答を生じていることがELISA法で検出された。両種において、接種一週後にこの応答が検出できた。
【0065】
実施例3 ファウルポックスウイルスFP−5からの狂犬病G遺伝子及びLA C Z含有組換えウイルスvFP−2の作製
0.9KbpのPvu II断片をFP−5から得、標準的手法によりpUC9の二つのPvu II部位間に挿入した。生成した構造物pRW688.2はHinc II部位を2ヵ所、およそ30bp離れた位置にPvu II断片内に非対称的に有しており、これによってこの断片から長腕と短腕を形成させる。
【0066】
オリゴヌクレオチドアダプターを、Pst I及びBam HI部位を導入するための公知の技術を用いて、これらのHinc II部位間に挿入し、プラスミドpRW694を作製した。これらの挿入座をF1と名付けた。
【0067】
次に、このプラスミドをPst IとBam HIで切断し、既に述べた連結11Kワクシニアプロモーターを有するLac Z遺伝子を挿入して新規プラスミドpRW700を作製した。
【0068】
Piプロモーターで転写促進される狂犬病G遺伝子を作製するため、狂犬病G遺伝子の5’末端に近接したBgl II部位(キーニイ(Kieny)ら、上記引用文献参照)をブラントエンドにし、既に述べたPiプロモーターの一本鎖部分を埋めたEco RI部位に連結した。
【0069】
この構造体をpRW700のPst I部位に挿入し、その中に外来遺伝子配列Pi−狂犬病GllK−Lac Zを有するpRW735.1プラスミドを作製した。この挿入は、FP−5ドナー配列のPvu II−Hinc II長腕がLac Z遺伝子に対して3’側になるように、プラスミド中で位置づける。
【0070】
得られた最終構造体は、既に述べた組換えファウルポックスウイルスvFP−2作製法によってニワトリ胚線維芽細胞に感染/トランスフェクションさせることによってファウルポックスウイルスFP−5と組み換えた。この組換えウイルスはX−gal染色によって選択した。
【0071】
前記Lac Z遺伝子と狂犬病G遺伝子の両者が適切に挿入されかつ発現されたことを、下記の様々な追加方法で確認した。
【0072】
特異抗体を用いた免疫蛍光法によって狂犬病抗原の位置を決定すると、vFP−2ウイルスに感染した鳥類細胞又は非鳥類細胞表面上で狂犬病ウイルスが良好に発現していることが示された。
【0073】
既に述べたように、vFP−2ウイルスに感染した鳥類又は非鳥類細胞による狂犬病抗原及びβ−ガラクトシダーゼの発現は、免疫沈降法で確認した。
【0074】
本発明のvFP−2に関する実施態様が狂犬病G遺伝子及びβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を保有する組換えウイルスの成功例であることのもうひとつの証拠は、ウサギ2匹にvFP−2ウイルスを接種することによって得られた。二匹のウサギに対して1匹当たり1×108pfuのvFP−2を皮内に接種した。1週間おきにウサギから採血して血清をELISAで試験し、狂犬病糖タンパク質及びβ−ガラクトシダーゼタンパク質の特異抗体の存在を検出した。
【0075】
下記の表IIに載せたように、ウサギ205は接種1週間後において抗β−ガラクトシダーゼ抗体をELISA試験で検出可能な量で示した。これは2週目には4000分の1の力価に上昇し、接種後5週まで持続した。抗原捕獲ELISAアッセイを用いるとウサギ205の血清は、接種後3週から10週まで検出可能量の抗狂犬病抗体を示した。
【0076】
【表2】
【0077】
実施例4A ファウルポックスウイルスFP−1からの転写促進される狂犬病G遺伝子含有組換えウイルスvFP−3の作製
本実施例は、前記狂犬病G遺伝子がFP−5以外のファウルポックス株、特にFP−1と呼ばれるファウルポックスウイルスの別の株によって完全に発現されることを示すものである。
【0078】
実施例3のように、FP−5におけるのと同様に0.9KbpのPvu II断片が非必須領域を含有するとの仮定のもとに、FP−1からこの断片を得た。
【0079】
この断片をpUC9の二つのPvu II部位に挿入し、pRW731.15Rと命名したプラスミドを作製した。
【0080】
このプラスミドは、Pvu II断片内に約30bp離れた非対称の位置に二つのHinc II部位を有し、これによって、本断片の長腕と短腕を形成する。
【0081】
市販のPstリンカー、(5’)−CCTGCAGG−(3’)を二つのHinc II部位に挿入してプラスミドpRW741を作製した。
【0082】
HHプロモーターで転写促進される狂犬病G遺伝子をPst I部位でこのプラスミドに挿入し、新規プラスミドpRW742Bを作製した。CEF細胞の感染/トランスフェクションによってこのプラスミドをFP−1と組み換えることによって、ウイルスvFP−3を得た。
【0083】
前記HHプロモーターによって転写促進される読み取り枠のATG翻訳開始コドンを、HHプロモーター内のEco RV部位と前記狂犬病G遺伝子内のHind III部位とをっなぐ合成オリゴヌクレオチドを用いて狂犬病G遺伝子の開始コドン上に重ねた。かかるHHプロモーターによって転写促進される狂犬病G遺伝子の5’末端を公知の技術を用いて修飾し、Pst I部位をひとつ含有させた後、この構造体をpRW741のPst I部位に連結させ、pRW742Bを作製した。このプラスミド中におけるこの構造体の位置は、実施例3で既に述べたpRW735.1におけるものと同じである。
【0084】
実施例2に述べたように、組換えを行った。生成した組換え体をvFP−3と呼ぶ。
【0085】
vFP−3ウイルスに感染した鳥類及び非鳥類細胞の両者による狂犬病抗原の発現は、既に述べた免疫沈降法及び免疫蛍光法で確認した。
【0086】
本発明のvFP−3に関する実施態様が狂犬病G遺伝子を発現する組換えウイルスの成功例であることのもうひとつの証拠が、組換えウイルスをウサギ2匹に皮内接種することによって得られた。ウサギ2匹を1匹当たり1×108pfuのvFP−3で皮内接種した。これらのウサギは双方ともに、典型的なポックス病巣を生じ、これは接種5〜6日後に最大の大きさに達した。ウサギから毎週採血して血清をELISAで試験し、前記狂犬病糖タンパクに特異的な抗体の存在を検出した。
【0087】
5匹のラットそれぞれにvFP−3を5×107pfu皮内接種した。全部の動物に病巣が残った。
【0088】
ウサギ及びラットともに、接種後2週間までに検出可能なレベルの狂犬病に特異的な抗体を産生した。親のFP−1ウイルスを皮内接種された対照のウサギ2匹は、検出可能なレベルの抗狂犬病抗体を全く示さなかった。この抗体の応答が実験に用いた動物体内における狂犬病抗原の組換えウイルスによるデノボ合成によって誘起されたのではなくて、接種ウイルスと共に持ち込まれたか又は組換えファウルポックスウイルス膜に組み込まれたかによって偶然に狂犬病抗原が導入されて起こった可能性を除外するために、このvFP−3ウイルスを化学的に不活化し、ウサギに接種した。
【0089】
精製ウイルスを4℃で一晩、0.001%のβ−プロピオラクトンの存在下に不活化した後、遠心分離によりペレットとした。ペレットにしたウイルスを10mMトリス緩衝液中に集めて超音波処理し、力価を検定して感染ウイルスが全く残っていないことを確めた。ウサギ2匹に不活化vFP−3を皮内接種し、同量の未処理の組換え体を別の2匹に皮内接種した。病巣の大きさをモニターした。
【0090】
未処理vFP−3を受けたウサギ2匹共、接種後5日で4−5+等級の典型的な病巣を生じた。不活化ウイルスを接種したウサギもまた病巣を生じたが、これらは接種後5日で2+等級であった。
【0091】
ウサギを一週おきに採血し、血清をELISAで試験し、狂犬病の特異抗体及びファウルポックスの特異抗体の存在を調べた。結果を以下の表IIIに示した。
【0092】
【表3】
【0093】
この試験においては、力価終末点(血清希釈の逆数として示す)を、抗原投与前の血清の吸収値を差引いた後、任意に0.2と定めた。ウサギ295と318は共に生きたウイルスを投与され、狂犬病糖タンパク及びファウルポックスウイルス抗原に対し免疫応答を生じた。ウサギ303と320もファウルポックスウイルス抗原に対しては免疫応答を生じたがその力価は低かった。このウサギはどちらも狂犬病糖タンパクに対して検出可能な応答を生じなかった。
【0094】
この知見から、ウサギに生じた免疫応答が組換えウイルスが保有する狂犬病糖タンパク遺伝子のデノボ発現に起因し、接種ウイルス内に偶然に持ち込まれた糖タンパクに対する反応ではないことが示唆される。
【0095】
実施例4B ファウルポックスウイルスFP−1からの転写能のない狂犬病G遺伝子含有組換えウイルスvFP−5の作製
組換えによってファウルポックスゲノム中に挿入された外来遺伝子の発現には、プロモーターの存在が必要である。HHプロモーターを欠いていること以外vFP−3と同一の組換え体vFP−5を作製してこのことを示した。この組換え体に狂犬病遺伝子が存在することを核酸のハイブリッド形成により確認した。しかし、このウイルスに感染したCEF細胞培地中に狂犬病抗原は全く検出されなかった。
【0096】
実施例5 ファウルポックスウイルスが非鳥類細胞で複製するか否かを決定するためのインビトロ継代実験
鳥類1種及び非鳥類2種の3種の細胞系に対しFP−1親株又は組換えvFP−3を接種して実験を行った。CEF、MRC−5、及びVEROのそれぞれ2枚の皿に、FP−1又はvFP−3を細胞1個当り10pfuの接種の多重度で接種した。
【0097】
3日後に、それぞれについて一枚の皿から細胞を採取した。凍結・融解を連続三回繰り返し、前記ウイルスを放出させた後、同細胞系統の新鮮単層に再接種した。これを、6回連続的に継代し、実験の最後に各継代の検体の力価を検定してCEF単層上におけるウイルス感染性を調べた。
【0098】
結果を表IVAに示した。この結果から、CEF細胞でFP−1及びvFP−3の双方の連続継代が可能であること、しかし、前記非鳥類細胞系統2種のいずれにおいても不可能であることが示唆された。感染性ウイルスは、VERO又はMCR−5細胞中において、3又は4継代後には検出できない。
【0099】
二番目の皿は直接滴定で検出不能のウイルスが増幅後に許容CEF細胞で検出できるかどうかを決めるために用いられた。
【0100】
3日後に、二番目の皿の細胞をかき取って採取し、この細胞の3分の1を溶解し新鮮CEF単層上に接種した。細胞変性効果(CPE)が最大となった時又は接種後7日目に、この細胞を溶解しウイルスの収率を滴定した。結果を表IVBに示す。CEF細胞中における継代を用いて存在するウイルスの全てを増幅した時、このウイルスは4又は5継代後には検出できなかった。
【0101】
絶えず感染している細胞を確立しようと試みたが失敗した。
【0102】
さらに、非鳥類細胞において連続してウイルスが発現する証拠を検出することを試みた。上記のウイルスの力価の検定に用いた検体を標準イムノドットアッセイに使用した。このアッセイでは、抗ファウルポックス抗体及び抗狂犬病抗体を用い、それぞれの抗原の存在を検出した。これらのアッセイの結果で力価検定の結果を確認した。
【0103】
【表4】
【0104】
【表5】
【0105】
実施例6 他のファウルポックスFP−1組換え体:vFP−6、vFP−7、vFP−8及びvFP−9
組換えウイルスvFP−6とvFP−7を以下の操作で作製した。
【0106】
FP−1の5.5Kbp Pvu II断片をpUC9の二つのPvu II部位間に挿入し、プラスミドPRW731.13を作製した。次に、このプラスミドをその唯一のHinc II部位で切断し、HH−プロモーターを有しかつブラントエンドとした狂犬病G遺伝子を挿入してプラスミドpRW748A及びpRW748Bを作製した。これらのプラスミドは、その挿入の向きが反対であることを示している。プラスミドpRW748AとBを次に別々に用いて、FP−1ウイルスと共にCEF細胞にトランスフェクションさせ、組換えによってそれぞれvFP−6及びvFP−7を作製した。この遺伝子座を座f7と名付けた。
【0107】
FP−1の10Kbp Pvu−II断片をpUC9の二つのPvu II部位間に挿入しpRW731.15を作製した。このプラスミドを次に唯一のBam HI部位で切断し、次に11Kプロモーターを有するLac Z遺伝子断片を挿入し、この挿入の向きが逆であるpRW749AとpRW749Bを作製した。これらのドナープラスミドをFP−1と組換えて、それぞれvFP−8及びvFP−9を得た。この遺伝子座を座f8と名付けた。
【0108】
vFP−8及びvFP−9は、X−galによって検出されるLac Z遺伝子を発現した。vFP−6とvFP−7は、狂犬病特異抗血清によって検出される狂犬病G遺伝子を発現した。
【0109】
実施例7 狂犬病生ウイルスによる攻撃から動物を保護するためのvFP−3による免疫
メスのSPFマウス(4−6週齢)20匹のグループを、マウス1匹当たり0.7乃至6.7 TCID50の範囲の投与量で足趾にvFP−3 50μlを接種した(TCID50、即ち組織培養感染量は、組織培養細胞の50%が細胞変性効果を受ける量である)。接種後14日目に各群のマウス10匹を屠殺し、血清検体をRFFI試験のアッセイ用に採取した。残りの10匹のマウスに対し、狂犬病CVS株を大脳に10LD50の量で接種して攻撃した後、14日目に生存数を数えた。
【0110】
結果を以下の表VAに示した。
【0111】
【表6】
【0112】
本実験を12.5LD50の量の狂犬病ウイルスで攻撃して繰り返した。結果を下記の表VBに示す。
【0113】
【表7】
【0114】
イヌ、ネコ各2匹に対して、組換えvFP−3の1og10TCID50の8倍量を一回静脈接種し免疫した。さらに、年齢及び体重が同等のイヌ2匹とネコ4匹を非ワクチン接種対照群とした。一週おきに全動物から採血した。94日目に、各イヌに対してインスティチュート・メリークス社から入手した狂犬病ウイルスNY株の唾液腺ホモジネート0.5mlを2回、側頭筋に接種して攻撃した。総投与量は大脳経路によるマウスLD50の1万倍に相当した。ネコ6匹を同様に、同ウイルスサスペンジョンの0.5mlを2回、首の筋肉に接種して攻撃した。ネコ1匹当たりの総投与量は、大脳経路のマウスLD50の4万倍に相当した。動物を毎日観察した。非ワクチン接種の動物は全て、狂犬病の症状を示して表VIに示した日に死亡した。ワクチン接種を受けた動物は攻撃に対して生き残り、対照動物の最後の1匹が死亡した3週間後まで観察した。結果を以下の表VIに示した。
【0115】
【表8】
【0116】
さらに、組換えウイルスvFP−2とvFP−3を幾つかの異なる経路でウシに接種する実験を行った。
【0117】
接種動物に対し、抗狂犬病抗体を6、14、21、28及び35日に試験した。以下の表VIIAに示に示すように、全動物が狂犬病抗原に対し血清学的反応を示した。
【0118】
【表9】
【0119】
ウシはすべて接種して55日目にlog10TCID50の8倍量を再接種され、この狂犬病抗原に対し既往反応を示した。1421番を除くウシ全てに対し、ワクチン再接種による追加免疫を行った。1421番のウシには再度筋注で接種した。RFFI力価を55、57、63、70、77及び86日後に測定した。
【0120】
結果を表VIIBに示した。
【0121】
【表10】
【0122】
1423番の動物のデータがvFP−2による以外、全てのデータはvFP−3である。
【0123】
ウシ、ネコ及びウサギも既知量のファウルポックスウイルスを皮内接種し、約1週後に動物からかさぶたを採取した。これらを破砕後生理的食塩水中に懸濁し、ウイルス量を測定するために力価を検定した。
【0124】
残存量の感染ウイルスしか回収できなかった。このことから、インビボでは全く増殖性感染が起こらないことが示唆される。
【0125】
実施例8 vFP−3によるニワトリの接種
組換えファウルポックスウイルスvFP−3をニワトリに接種し、このベクターの増殖的複製を許容する系における組換えファウルポックスウイルスによる外来DNAの発現を示した。
【0126】
白色レグホーンニワトリに対し、vFP−3をlog10TCID50の9倍量で筋肉から、又はvFP−3を1og10TClD50の3倍量で翼に貫通させて接種した。血液検体を採取し、ワクチン接種21日後に狂犬病抗体力価をRFFI試験で調べた。接種したニワトリの21日目の力価は、対照群の21日目の力価に比し非常に高かった。すなわち、非感染対照群の平均力価は0.6であったが、筋肉接種したニワトリの平均は1.9、貫通接種したニワトリの平均は1.2であった。
【0127】
実施例9 ターキーインフルエンザH5 HA抗原を発現する組換えファウルポックスvFP−11
本発明の組換えアビポックスウイルスを用いて鳥類病原体に対して鳥類を免疫することができる。
【0128】
したがって、Hind IIIプロモーターで転写促進されるA/ターキー/アイルランド/1378/83(TYHA)の赤血球凝集素遺伝子(H5)を含有する、ファウルポックスウイルスFP−1由来の新規プラスミドpRW759(下記に記載)を用いて、親ウイルスFP−1に同時に感染しているCEF細胞にトランスフェクトした。組換えファウルポックスウイルスvFP−11を本明細書中で既に述べた技術によって得た。
【0129】
vFP−11感染細胞による赤血球凝集素分子の合成は、特異的抗H5抗体と標準的手法を用い、代謝により放射性標識した感染細胞溶菌液からの免疫沈降で確認した。分子量約63Kd(キロダルトン)の赤血球凝集素前駆体の特異的免疫沈降と分子量44Kd及び23Kdの2つの分解生成物が明らかとなった。非感染CEF細胞又は親ウイルスFP−1感染細胞の溶菌液からはこのようなタンパクは全く沈降しなかった。
【0130】
組換えファウルポックスvFP−11に感染した細胞中で産生されるHA分子が細胞表面上で発現されることを調べるために、免疫蛍光による研究を行った。組換えファウルポックスウイルスvFP−11に感染したCEF細胞は表面を強く蛍光染色された。親ウイルスFP−1に感染した細胞では、全く蛍光が検出されなかった。
【0131】
プラスミドpRW759を以下のようにして作製した。pRW742B(実施例4参照)をPst Iによる部分消化で直線状とし、この断片をEco RVで再切断し、狂犬病G遺伝子を除去し、約3.4Kbpの残存断片上にHHプロモーターを残した。これをアルカリホスファターゼ処理して、ATGにおいてこのHHプロモーターとTYHAを結合するため合成オリゴヌクレオチドを挿入し、pRW744を作製した。
【0132】
このプラスミドをDra Iで部分消化し直線状となし、この直線状断片をSal Iで切断して大きい方の断片を再び単離しアルカリホスファターゼ処理した。
【0133】
最後に、カワオカらがVirology 158、218−227(1987)で開示したように、この単離されたTYHAのSal I−Dra Iコード配列をpRW744ベクターに挿入することによってpRW759を作製した。
【0134】
実施例10 インフルエンザ生ウイルスによる攻撃から鳥類を防御するためのvFP−11による免疫
組換えファウルポックスウイルスvFP−11の免疫原性を調べるため、ニワトリと七面鳥でワクチン接種と攻撃実験を行った。
【0135】
無菌白色レグホーンに対し、2日齢及び5週齢において、家禽にファウルポックスウイルスを商業的にワクチン接種する際に用いられる倍針(double needle)で翼網穿刺してワクチン接種を行った。vFP−11を6×105pfu含有する約2μlを各ニワトリに投与した。年長のニワトリはワクチン接種前に採血し、また、全てのニワトリに対し、攻撃前及び2週後に採血した。
【0136】
比較のため、もう一群のニワトリに不活性化H5N2株の油中水型エマルジョンから成る従来のH5ワクチンを接種した。
【0137】
不活性化H5N2ワクチンは、11日齢胚のニワトリ卵で増殖したA/マラード(Ma11ard)/NY/189/82(H5N2)から調製した。HA力価800/0.1ml及び感染力価108.5/0.1mlの感染した漿尿液を0.1%プロピオラクトンで不活性化し、ストーン(Stone)ら、Avian Dis.、22、666−674(1978)及びブルッグ(Brugh)ら、Proc. Second Inter. Sym. on Avian Influenza、283−292(1986)に記載の如く、油中水型エマルジョン中に懸濁した。0.2mlの容量のワクチンを静脈経路で2日齢、5週齢のSPF白色レグホーンニワトリの大腿筋肉内側皮膚に投与した。
【0138】
3群、4群のニワトリに対しては、親ウイルスFP−1を投与するか、全くワクチンを投与しなかった。
【0139】
各ニワトリの外鼻孔に0.1mlを投与し、病原性の高いA/ターキー/アイルランド/1378/83(H5N8)又はA/チック(Chick)/ペン(Pen)/1370/83(H5N2)インフルエンザウイルスをLD50の約103倍量でニワトリに攻撃した。2日齢ニワトリはワクチン接種後6週目に攻撃し、5週齢ニワトリはワクチン接種後5週目に攻撃した。ニワトリを、顔面及びトサカの膨潤及びチアノーゼ、さらに足の出血(こうしたニワトリはしばしば立つことができなかった)などによって示唆される病気の徴候、麻痺及び死亡について毎日観察した。死亡のほとんどが感染後4〜7日に起きた。感染後3日目に、各生存ニワトリの気管及び総排出腔から線捧で検体を取り、胚発生卵に接種してウイルスのスクリーニングを行った。野生型又は組換えファウルポックスウイルスを接種したニワトリは、翼網に典型的な病巣を発症した。針を刺した部位に3日目までに膿疱が形成され、細胞浸潤がかさぶた形成とともに続き、7日目までに回復した。二次的な病巣は形成されず、非ワクチン接種の接触したニワトリに伝染した証拠は全く見られなかった。攻撃実験の結果を表VIIIに示し、関連血清学的所見を表IXに示す。
【0140】
【表11】
【0141】
【表12】
【0142】
ファウルポックス−H5組換え体(vFP−11)又はアジュバント中不活化H5N2インフルエンザワクチンを接種したニワトリは、相同のTy/Ire(H5N8)インフルエンザウイルス及び関連してはいるが明らかに異なるCk/Penn(H5N2)インフルエンザウイルスによる攻撃から防御された。これとは対照的に、親FPVを接種されたニワトリの大半又はワクチンを全く投与されなかったニワトリの大半は、病原性の高いインフルエンザの臨床症状を示し、顔面及びとさかの膨潤及びチアノーゼ、足の出血及び麻痺が含まれていた。これらのニワトリの大部分は死亡した。ワクチン接種済のニワトリは検出可能な量のTy/Ireを示さなかったが、Ck/Pennの場合、検出可能であった。
【0143】
不活化及び組換えワクチンの双方ともにHI及びTy/Ireの中和抗体を誘起したが、攻撃前にファウルポックスーH5組換え体vFP−11で誘起した抗体のレベルではHAを阻害せず、また非相同Ck/Penn H5を中和しなかった。にもかかわらず、ニワトリは、Ty/Ire及びCk/Pennインフルエンザウイルスの双方による攻撃から防御された。
【0144】
vFP−11ワクチン接種によって誘発されたH5インフルエンザに対する免疫は少なくとも4から6週間持続し、かつ、交差反応性であった。さらにこの応答の持続と特異性を調べるために、4週齢のニワトリの一群に対して、既に述べたようにvFP−11を翼網に接種後、1月毎に交差反応性のCk/Pennウイルスで攻撃した。また、攻撃前にHI抗体は全く検出できなかった。にもかかわらず、4ヵ月以上もニワトリは防御された。
【0145】
vFP−11により発現されたH5は、また七面鳥において防御的免疫応答を誘起する。異系交配白色七面鳥を、2日齢、4週齢において、既に述べたように翼網接種によりワクチン接種した。結果を表Xに示した。
【0146】
【表13】
相同Ty/Ireウイルスによる攻撃に対し、有意の生存が双方の年齢群で見られた。非ワクチン接種の接触七面鳥をワクチン接種七面鳥と一緒に飼い、組換えウイルスの伝染を試験した。これらの七面鳥は攻撃に耐え生存することがなかった。
【0147】
実施例11 ニワトリインフルエンザ核タンパク質(NP)遺伝子発現ファウルポックスFP−1組換えvFP−12の作製
プラスミドpNP33は、インフルエンザウイルス チキン/ペンシルバニア/1/83核タンパク質遺伝子(NP)のcDNAクローンを含有する。およそ1.6KbpのNP遺伝子の5’と3’末端のみが決定されていた。NPをブラントエンドの5’Cla I−Xho I 3’断片として、pNP33からSma Iで消化しておいたpUC9に移して、上記断片の3’末端がpUC9のEco RI部位に連結するようにして、pRW714を作製した。NPの翻訳開始コドン(ATG)は下記のアンダーラインを付したAha II部位を有していた:ATGGCGTC。既に述べたワクシニアH6プロモーターを、二本鎖合成オリゴヌクレオチドでこのNPに結合した。この合成オリゴヌクレオチドは、Eco RV部位からそれのATGまでのH6配列を含有しており、Aha II部位でNPコード配列に入る。このオリゴヌクレオチドは、Bam HI末端とEco RI末端双方に適合できるように合成されており、これをpUC9に挿入してpRW755を作成した。Bam HI適合末端から始まる二本鎖合成オリゴヌクレオチドの配列(ATGはアンダーラインを引いた)は:
GATCCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGCGTCG
GCTATAGGCAATTCAAACATAGCATTACCGCAGCTTAA
であった。
【0148】
pRW755のAha IIによる直線型部分消化産物を単離し、Eco RIで切断した。かかるATG部位に一つのAha II切断部位を含有しEco RIで再切断したpRW755断片を単離してホスファターゼで処理した後、以下のpRW714消化産物のベクターとして用いた。
【0149】
pRW714のAha II直線部分消化産物をEco RIで再切断した。NPコード配列含有の約1.6Kbp Aha II−Eco RI単離断片を上記のpRW755ベクターに挿入してpRW757を作製した。完全H6プロモーターは、Eco RV部位の上流(3’側)の配列を添加することによって形成した。プラスミドpRW742B(実施例4に記載)は、pUC9’のNde I部位とともに切断されたEco RV部位の下流(3’側)のH6配列を有していた。pRW742 B Eco RV−Nde I断片をホスファターゼで処理し、下記のpRW757断片のベクターとして用いた。
【0150】
pRW757の直線部分Eco RV消化産物を単離後、Nde Iで消化し再び単離した。このpRW757断片をpRW742Bベクターに挿入しpRW758を形成した。pRW758のEco RI断片はH6プロモーターによる全NPを含み、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントでブラントエンドにした後、pRW731.13 Hinc II部位に挿入しpRW760を作製した。pRW731.3 Hinc II部位は、実施例6でvFP−6とvFP−7の作製に用いたFP−1座である。
【0151】
ファウルポックスFP−1を救援ウイルスとして用い、プラスミドpRW760をインビトロ組換え試験で使用した。子孫プラークをアッセイし、インシトゥプラークハイブリッド形成を用いてプラークを精製した。遺伝子の発現を、ヤギのポリクローナル抗NP抗血清を用いた免疫沈降実験で確認した。vFP−12に感染したCEF細胞の溶解液から特異的に沈降したこのタンパク質の大きさはおよそ55KDであり、報告されたインフルエンザウイルスの核タンパク質の範囲内であった。
【0152】
実施例12 エビアンインフルエンザ核タンパク質(NP)と赤血球凝集素(HA)遺伝子を発現するファウルポックスウイルス二重組換えvFP−15の産生
A/Tyr/Ire/1378/83からの血球凝集素(HA)遺伝子については、vFP−11(実施例9)の作製で既に述べた。二重組換え体を作製するのに際し、先ずHA遺伝子を、プラスミドpRW731.15を用いて、vFP−8の作製のところで定義した座f8に移した。
【0153】
vFP−11の作製に用いたプラスミドはpRW759であった。H6プロモーターに結合した赤血球凝集素遺伝子を、Pst I部分消化によってこのプラスミドから移した。この断片を次にDNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントでプラントエンドとし、pRW731.15ブラントエンドのBam HI部位に挿入してpRW771を作製した。
【0154】
プラスミドpRW771を次に、救援ウイルスとしてvFP−12を用いるインビトロ組換え試験に用いた。vFP−12組換えウイルスは、プラスミドpRW731.13において定義した座f7でH6プロモーターに連結した核タンパク質遺伝子を含有する。両方の挿入部を有する組換えプラークを選択し、インシトゥ ハイブリッド形成でプラークを精製して赤血球凝集素の表面発現をプロテインA−β−ガラクトシダーゼ結合イムノアッセイで確認した。両方の遺伝子の発現を二重組換えウイルスvFP−15と感染細胞溶解液からの免疫沈降によって確認した。
【0155】
実施例13 組換えカナリーポックスウイルスの作製
以下の実施例では、カナリーポックスゲノムの非必須挿入座4個の確認と組換えカナリーポックスウイルス4種vCP−16、vCP−17、vCP−19及びvCP−20の作製について示す。
【0156】
組換えカナリーポックスvCP−16を以下のように作製した。
【0157】
3.4KbpのPvu IIカナリーポックスDNA断片をpUC9にクローン化し、pRW764.2を生じさせた。Eco RI部位がこの断片内に非対称に1ヵ所だけ見出され、短腕700bp、長腕2.7Kbpが生じた。このプラスミドをEco RIで消化し、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントを用いてブラントエンドとした。ブラントエンドのH6/狂犬病G遺伝子を次にこの部位に連結し、大腸菌(E.coli)を形質転換するのに用いた。生成したプラスミドpRW775をインビトロ組換え試験に用いた。免疫スクリーニングで陽性の子孫プラークを選択し、プラークを精製した。生成した組換え体をvCP−16と命名し、挿入座をC3と名付けた。
【0158】
上記の作製に用いたプラスミドpRW764.2は、前記Eco RI部位からの約2.4Kbp離れた唯一のBgl II部位を含有していた。同一のクローニング方針を用いて、H6/狂犬病G遺伝子をこの部位でプラスミドpRW764.2に連結し、pRW774を作製した。このプラスミドを用いて、C4と命名した挿入座を持つ組換え体vCP−17を作製した。
【0159】
プラスミドpRW764.5は、カナリーポックスDNAの850bpのPvu II断片を有し、片方の末端から400bpの断片内に非対称な唯一のBgl II部位を有している。先に述べたクローニング手法と同一手法を用いて、H6プロモーターに連結した狂犬病G遺伝子をこの部位に挿入し、pRW777を作製した。作製された安定組換えウイルスをvCP−19と命名し、挿入座をC5と名付けた。
【0160】
プラスミドpRW764.7は、片方の末端から300塩基離れた唯一のBgl II部位を持つ1.2Kbp Pvu II断片を含有する。このプラスミドをBgl IIで消化し、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントでブラントエンドとした。ブラントエンドで11Kプロモーターで転写促進されるLac Z遺伝子を挿入してプラスミドpRW778を作製した。このプラスミドを用いて作製した安定組換えウイルスをvCP−20と命名し、挿入座をC6と名付けた。
【0161】
実施例14 ニューカッスル病ウイルスを発現するファウルポックスウイルス組換えvFP−29の作製
プラスミドpNDV108はNDVテキサス株の融合遺伝子ののcDNAクローンであり、約3.3KbpのHpa I cDNA断片から成り、融合タンパク質をコードする配列とpBR322のSca I部位にクローン化されるNDVをコードしたもう一っの配列を含有する。下記に、挿入プラスミドの作製段階を述べる。
【0162】
(1) プラスミドpCE11の作製
FPV挿入ベクターのpCE11は、pRW731.13のHinc II部位にポリリンカーを挿入することによって作製した(座f7と命名)。pRW731.13は、FP−1DNAの5.5Kbp Pvu II断片を含有する。非必須座は、既に実施例6で述べた安定組換え体vFP−6の作製においてHinc II部位で定義した。Hinc II部位に挿入したポリリンカーは以下の制限酵素部位を有している。つまり、Nru I、Eco RI、Sac I、Kpn I、Sma I、Bam HI、Xba I、Hinc II、Sal I、Acc I、Pst I、Sph I、Hind III及びHpa Iである。
【0163】
(2) プラスミドpCE19の作製
このプラスミドは、pCE11をさらに修飾したもので、ワクシニアウイルス転写終結信号ATTTTTNT(L.ユーエン(Yuen)及びB.モス(Moss)、J.Virol.60、320−323[1986])(この場合NはAである)がpCE11のSac IとEco RI部位間に挿入されており、その結果Eco RI部位が消失している。
【0164】
(3) NDVコード配列の挿入
融合タンパク質遺伝子の5’末端のヌクレオチド22個以外の全てを含有する1.8Kbpのゲルで精製したBam HI断片をpUC18のBam HI部位に挿入し、pCE13を形成した。このプラスミドを、コード配列の5’末端の上流の12塩基のところでベクターを切断するSal Iで消化した。クレノーフラグメントで末端を埋め、このプラスミドをさらに、Sal I部位の18塩基上流で切断するHind IIIで消化した。好ましい実施態様のところで既に述べたワクシニアウイルスH6プロモーター及び両端にポリリンカー配列を含有し、かつゲルで精製した146塩基のSma I-Hind III断片をこのベクターに連結し、大腸菌細胞に形質転換した。生成プラスミドをpCE16と命名した。
【0165】
NDV融合タンパク質遺伝子の開始ATGコドンをH6プロモーターの3’末端に配列させ、かつNDVの5’末端から欠けているヌクレオチド22個をpCE16に補うため、相補的合成オリゴヌクレオチドをEco RVとKpn I部位を末端とするよう設計した。このオリゴヌクレオチド配列は
5'ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-GGC-TCC-
AGA-TCT-TCT-ACC-AGG-ATC-CCG-GTA-C3'
であった。
【0166】
作製したpCE16を次にEco RVとKpn Iで消化した。Eco RV部位は、H6プロモーター内で開始ATGの24塩基上流に生じる。Kpn I部位は、NDVコード配列内で前記ATGの29塩基下流に生じる。
【0167】
オリゴヌクレオチドをアニールし、リン酸化し、前記の直線型プラスミドに連結させた。得られるDNAを大腸菌細胞を形質転換するのに用いた。このプラスミドをpCE18と命名した。
【0168】
このNDVコード配列をFPV挿入ベクターに挿入するために、pCE18(ポリリンカー領域で切断)のゲルで精製した1.9Kbp Sma I−Hind III断片を上述のpCE19の7.8Kbp Sma I−Hind III断片に連結した。転写終結信号は、Sma I部位の下流16塩基に生じる。得られたプラスミドをpCE20と命名した。
【0169】
プラスミドpCE20を、ファウルポックスウイルスFP−1を救援ウイルスとして用いるインビトロ組換え試験に使用した。得られた子孫をCEF単層に塗布し、このプラークを、ポリクローナル抗NDVニワトリ血清を用いたβガラクトシダーゼ連結プロテインAイムノスクリーンに供した。陽性染色プラークを選択し、プラークの精製を4回行った後、単一集団とした、この組換え体をvFP−29と命名した。
【0170】
実施例15 ネコ白血病ウイルス(FeLV)エンベロープ(env)糖タンパクを発現するアビポックスウイルスの作製
FeLV env遺伝子は、p70+P15Eポリプロテインをコードする配列を含有する。FeLV遺伝子はまず、この遺伝子の5’側にワクシニアH6プロモーターを並置させてプラスミドpSD467vCに挿入させた。プラスミドpSD467vCは、ワクシニア赤血球凝集素(HA)遺伝子を含有する1802bpのSal I/Hind III断片を最初にpUC18ベクターに挿入することによって誘導した。HA遺伝子の位置については既に明らかにされていた(シダ(Shida)、Virology 150、451−462、[1988])。HA遺伝子産物をコードする読み取り枠の大半は欠損しており(ヌクレオチド443からヌクレオチド1311)、Bgl II・Sma I・Pst I及びEga I制限酵素部位を含有する多重クローニング部位を挿入した。得られるpSD467vCプラスミドは、マルチクローニング部位の442bp上流及びこれらの制限部位の491bp下流にワクシニア隣接腕を含有している。これらの隣接腕は遺伝物質をマルチクローニング部位に挿入して、ワクシニアウイルスコペンハーゲン株のHA部位へ組換えることができる。得られた組換え子孫はHA陰性であった。
【0171】
H6プロモーターは好ましい実施態様で既に述べた完全配列より成る4つのオーバーラップオリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって合成した。得られた132塩基より成る断片は、5’末端にBgl II制限部位を有し、3’末端にSma I部位を持っていた。Bgl IIとSma I制限部位を介してこれをpSD467vCに挿入した。得られたプラスミドをpPT15と命名した。H6プロモーターのすぐ下流にあるpPT15の唯一のPst I部位にこのFeLV env遺伝子を挿入した。生成したプラスミドをpFeLVlAと命名した。
【0172】
FP−1組換え体の作製のため、2.4KbpのH6/FeLV env配列をBgl II消化とPst I部分消化でpFeLVlAから切り離した。
【0173】
Bgl II部位はH6プロモーター配列の5’境界にある。Pst I部位はエンベロープ糖タンパク質読み取り枠の翻訳終結信号の420bp下流にある。
【0174】
この2.4Kbp H6/FeLV env配列をBam HI及びPst I消化pCE11に挿入した。FP−1挿入ベクターpCE11は、マルチクローニング部位を非必須Hinc II部位に挿入することによりpRW731.13から得た。この挿入ベクターは、FP−1ゲノムの座f7で外来遺伝子を保有するFP−1組換え体を産生できる。組換えFP−1/FeLV挿入プラスミドをここでpFeLVFIと命名した。この構造体はATG置換に対して完全ATGを与えない。
【0175】
完全ATG:ATG構造体を作るため、約1.4KbpのNru I/Sst II断片1個をワクシニアウイルス挿入ベクターpFeLVICから誘導した。Nru I部位は、ATGから24bp上流の位置のH6プロモーターに生じる。Sst II部位は、ATGから1.4Kbp下流で翻訳終結信号の1Kbp上流に位置する。このNru I/Sst II断片を、Sst II消化とNru I部分消化で作製した9.9Kbp断片に連結した。この9.9Kbp断片は、pUCベクター配列である5.5KbpのFP−1隣接腕、env遺伝子の下流部分に当る1.4KbpのFeLV配列、及びH6プロモーターの5’側のほとんどの配列(約100bp)を含有している。得られたプラスミドをpFeFLVF2と命名した。ATG構築のためのこのATGをヌクレオチド配列分析で確認した。
【0176】
もうひとつのFP−1挿入ベクターpFeLVF3は、推定免疫抑制領域(シアンシオロ(Cianciolo)ら、Science 230、453−455[1985])(コード配列のヌクレオチド1548から1628まで)に相当するFeLV env配列を除去することによって、pFeLVF2から誘導した。これは、約1KbpのSst II/Pst I断片(上述の部位)をワクシニアウイルス挿入ベクターpFeLVlDから単離することによって完成した。このプラスミドpFeLVlDは、免疫抑制領域(ヌクレオチド1548から1628まで)に相当するenv配列がオリゴヌクレオチドによる突然変異誘発によって欠損していたことを除いては、pFeLVlGと同様であった(マンデッキ(Mandecki)、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、83、7177−7181[1987])。ヌクレオチド1548から1628までを欠損している1KbpのSst II/Pst I断片を、pFeLVF2から誘導した残りのH6:FeLV env遺伝子を含有する10.4KbpのSst II/Pst I断片へ挿入した。
【0177】
挿入プラスミドpFeLVF2とpFeLVF3は、救援ウイルスFP−1のインビトロ組換え試験に用いた。この組換え体の子孫をCEF単層に塗付し、組換えウイルスをCEF単層上のプラークハイブリッド形成によって選択した。ハイブリッド分析により同定した組換え子孫を選択し、プラーク精製を4回行い均質集団とした。全FeLV env遺伝子を保有するFP−1組換え体をvFP−25と命名し、免疫抑制領域の欠損した全遺伝子を含有するFP−1組換え体をvFP−32と命名した。この二つの組換え体は共にウシの抗FeLVポリクローナル血清(アンチボディーズ社(Antibodies、Inc.)、デービス(Davis)、カリフォルニア)を用いた免疫沈降によって、適切な遺伝子産物を発現していることが示された。これらのFP−1組換え体がCRFK細胞株(ATCC#CCL94)中で前記の外来FeLV env遺伝子を発現することも重要であり、この細胞株はネコ由来である。
【0178】
カナリーポックス(CP)組換え体の作製のため、前記のH6:FeLV env配列を含有する2.2Kbp断片を、Sma IとHpa I消化によってpFeLVF2から切り離した。このSma I部位は、H6プロモーター配列の5’境界にある。Hpa I部位は、エンベロープ糖タンパク質読み取り枠の翻訳終結信号の下流180bpに位置している。
【0179】
2.2KbpのH6/FeLV env配列を挿入プラスミドpRW764.2の非必須Eco RI部位に挿入し、続いてEco RI部位をブラントエンドにした。この挿入ベクターはCPゲノムの座C4中に外来遣伝子を保有するCP組換え体を産じさせる。この組換えCP挿入プラスミドをここでpFeLVCP2と命名した。この構造体は、ATG置換に対して完全ATGを1個提供する。
【0180】
挿入プラスミドpFeLVCP2を、救援ウイルスとしてCPを用いるインビトロ組換え試験に用いた。この組換え体の子孫をCEF単層に塗布した後、ウシ抗FeLV市販ポリクローナル血清(アンチボディーズ社、デービス、カリフォルニア)を用いたβガラクトシダーゼ結合プロテインAイムノスクリーン法により、組換えウイルスを選択した。染色陽性プラークを選別し、プラークの精製を4回行った後、均質集団とした。完全FeLV env遺伝子を発現する組換え体をvCP−36と命名した。
【0181】
実施例16 ラウス関連ウイルスタイプ1(RAV−1)エンベロープ(env)遺伝子を発現するファウルポックスウイルス組換え体vFP−22の作製
RAV−1エンベロープ遺伝子のクローンpenvRV1PTは、M13mp18中にKpn I-Sac I断片としてクローン化された配列をコードする1.1KbpのRAV−1 env DNAを含有している。この断片は5’末端はそのままであるが、3’側の配列一部を欠損しており、以下の操作に用いられた。ゲルで精製した1.1KbpのpenvRVIから誘導したEco RI−Pst I断片を、pUC9のEco RIとPst I部位に挿入し、pRW756を作製した。このプラスミドをKpn IとHind IIIで消化し、ベクター中のATGの59塩基上流で切断した。既に述べたワクシニアH6プロモーターを含有する146塩基対のKpn I−Hind III断片を挿入し、プラスミドpCE6を作製した。
【0182】
RAV env遺伝子の開始ATGが、外来配列の欠損したH6プロモーターの3’末端に隣接していることを確認するために、末端のEco RVとBan II部位で二つの相補的合成オリゴヌクレオチドを作製した。このオリゴヌクレオチド配列は、
ATC-CGT-TAA-GTT-TGT-ATC-GTA-ATG-AGG-CGA-GCC-3'
であった。
【0183】
プラスミドpCE6を、H6プロモーター内でATGの24塩基上流で切断するEco RV及びRAV envをコードする配列内でATGの7塩基下流で切断するBan IIで消化した。このDNA断片を連結し大腸菌細胞の形質転換に用いた。得られたプラスミドpCE7は、最終構築のためのH6プロモーターと正確な5’配列を与えた。
【0184】
クローンmp19env(190)は、制限酵素によるマッピングで全RAV−1 env遺伝子を含有することがわかった。全遺伝子を含有するmp19env(190)の1.9KbpのKpn I−Sac I断片をpUC18のKpn IとSac I部位に挿入し、pCE3を形成した。このプラスミドを、RAV−1をコードする配列内で開始ATGの132塩基下流で切断するHpa I及びこの遺伝子の3’末端で切断するSac Iで消化した。既に述べたFPV挿入ベクターpCE11をSma IとSac Iで消化し、このプラスミドをポリリンカー領域で切断した。pCE3のHpa I−Sac断片でpCE11で連結し、pCE14を作製した。
【0185】
プラスミドpCE7を次にXho IとHind IIIで消化し、H6プロモーターと正確な5’配列を含む332塩基対断片を生じさせた。プラスミドpCE14を、このベクターのポリリンカー領域で切断するHind III及びコード配列で切断するXho Iで消化した。このDNAをpCE7から得たHind III−Xho I断片と連結し、最終RAV−1エンベロープ遺伝子構造体のpCE15を形成した。
【0186】
このプラスミドを、ファウルポックスFP−1を救援ウイルスとするインビトロ組換え試験に用いた。組換え体子孫をCEF単層に塗付し、抗RAV−1ポリクローナル血清を用いたβ−ガラクトシダーゼ連結プロテインAイムノアッセイでプラークをスクリーニングした。染色陽性プラークを選別後4回プラークの精製を行い、単一集団を得た。産生された組換え体をvFP−22と命名した。vFP−22感染CEF溶解液を用いた免疫沈降実験から、エンベロープ遺伝子の遺伝子産物2個に対応する見掛けの分子量76.5Kdと30Kdを有する2つのタンパクが特異的に沈降していることが示された。前駆体遺伝子産物は全く見られなかった。
【0187】
予備試験で、vFP−22接種ニワトリでこのRAV−1エンベロープ遺伝子産物に対する免疫応答が誘起された。
【0188】
実施例17 ウシ白血病ウイルス(BLV)のgp51,30エンベロープ(env)遺伝子を発現するアビポックスウイルス組換え体の作製
(1) pBLVF1とpBLVF2の作製
プラスミドpBLVF1とpBLVF2はBLVのgp51,30env遺伝子を含有する。両プラスミドにおいて、BLV env遺伝子はワクシニアウイルスH6プロモーターの転写制御下にあり、ファウルポックス隣接腕(座f7)間でクローンされる。この二つのプラスミドのヌクレオチド配列は、コドン268位と269位を除いて等しい。(pBLVF1はこれらの二つの位置でアミノ酸Arg−Ser含有タンパクをコードし、一方、pBLVF2はアミノ酸Gln−Thr含有タンパクをコードする。)
【0189】
pBLVF1とpBLVF2を以下の手順で作製した。プラスミドpNS97−1は全BLV env遺伝子を含有するプラスミドであるが、これをBam HIで切断し、Mst IIで部分的に切断した。gp51,30遺伝子を全て含む2.3Kbp断片をアガロースゲル上で単離し、スティッキーエンドを大腸菌DNAポリメラーゼI(クレノーフラグメント)で埋めた。Pst Iリンカーを断片の末端に連結し、Pst I消化した後に、pTP15のPst I部位(実施例15)に連結した。これによって、BLV遺伝子がワクシニアプロモーターH6に隣接して配置される。(pTP15は、ワクシニアゲノムの非必須座でクローン化されたワクシニアH6プロモーターを含有する。)
【0190】
このプラスミドを次にEco RVで切断し、Ava IIで部分切断する。5.2Kbp断片を単離し、オリゴヌクレオチド5’−ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGCCCAAAGAACGACG−3’と5’−GACCGTCGTTCTTTGGGCATTACGATACAAACTTAACGGAT−3’を用いてこのプラスミドを再び環状とした。これによって、BLV遺伝子とH6プロモーター間の不要塩基を除去する。
【0191】
得られたプラスミドをPst Iで切断しBgl IIで部分切断し、プロモーターH6で転写促進されるBLV遺伝子を含有する1.7Kbp断片を、既に述べたファウルポックスウイルス挿入ベクターpCE11のBam HI−Pst I部位に座f7を用いてクローン化した。これによって、H6プロモーターを持つBLV遺伝子がファウルポックス隣接腕間に配置される。このプラスミドをpBLVF1と命名した。
【0192】
同一の手順を用いてpBLVF2を作製したが、H6プロモーターを有するBLV遺伝子をpCE11にクローニングする前にインビトロ変異導入操作をさらに行った。この変異導入は、下記の手順で行った。プラスミドpNS97−1をXma Iで切断しStu Iで部分切断した。5.2Kbp断片を単離し、オリゴヌクレオチド5’−CCGGGTCAGACAAACTCCCGTCGCAGCCCTGACCTTAGG−3’と5’−CCTAAGGTCAGGGCTGCGACGGGAGTTTGTCTGAC−3’を用いて、このプラスミドを再び環化した。これによって、コドン268と269のヌクレオチド配列がCGC−AGTからCAA−ACTに変化する。
【0193】
(2) 組換えウイルス類の作製
前記プラスミドpBLVF1とpBLVF2を、FP−1を救援ウイルスとして用いたインビトロ組換え試験に用いた。組換え子孫はインシトゥ プラークハイブリッド形成で選択し、この基準で集団が純粋であると判定されたら、プラークをBLVgp特異モノクローナル抗体調製物を用いたβガラクトシダーゼ・プロテインAイムノアッセイでスクリーニングした。プラスミドpBLVF1とpBLVF2からそれぞれ作られた組換え体vFP23とvFP24は共に、イムノスクリーンで染色陽性を示し、感染細胞表面上で免疫学的に認識可能な糖タンパクが発現されていることを示唆していた。
【0194】
プラスミドpBLVK4とpBLVK6は、それぞれ、前記のBLV envgp51,30遺伝子とBLV gp5l,30開裂マイナス遺伝子が含有している。両遺伝子ともに、pRW764.2の唯一のEco RI部位(座C3)(pRW764.2にっいては、実施例13に述べられている)にクローン化され、ワクシニアH6プロモーターの転写制御下にある。
【0195】
このプラスミドは以下の手順で誘導された。pBLVF1とpBLVF2を制限酵素Hind IIIで切断した。オリゴヌクレオチドBKL 1(AGCTTGAATTCA)をこの部位にクローン化し、BLV遺伝子の3’側にEco RI部位を作製する。このBLV遺伝子の5’側にもEco RI部位があるので、これらのプラスミド(pBLVK1とpBLVK2)をEco RIで切断し、H6プロモーターで転写促進されるBLV遺伝子を含有する断片をpRW764.2のEco RI部位にクローン化した。得られたプラスミドをそれぞれ、pBLVK4とpBLVK6と命名した。これらのプラスミドを、カナリーポックスを救援ウイルスとしたインビトロ組換え試験に用いた。組換え体を選別し、イムノアッセイで検出されたこの糖タンパクの表面における発現を基準として精製した。プラスミドpBLVK4とpBLVK6からのそれぞれの組換え体をvCP27とvCP28と名付けた。
【0196】
ファウルポックス組換え体vFP23とvFP24を、さまざまな経路でヒツジとウシに接種した。動物に二回接種し、二回目は一回目の45日後とした。血清検体を第一回接種の5週間後と第二回接種の2週後に採取した。gp51に対する抗体を競合的ELISA試験で測定し、力価は競合を50%阻害する血清希釈の逆数として表わした。結果を表XIに示した。
【0197】
検査したいずれの種も一回目の接種後には検出可能な免疫応答を示さなかった。ヒツジもウシも共に第二回接種後に大幅な抗体上昇を示した。
【0198】
【表14】
【0199】
実施例18 感染性気管支炎ウイルスMass 41マトリックス遺伝子を発現するファウルポックスウイルスFP−1紐換えvFP−26の作製
プラスミドpIBVB63は、Mass41株のマトリックス遺伝子の感染性気管支炎ウイルス(IBV)cDNAクローンを含有する。pIBVB63の8Kbp Eco RI断片は、上流(5’側)にペプロマー遺伝子を持つマトリックス遺伝子を含有し、さらにその上流にEco RV部位がある。プラスミドpRW715は、pUC9の二つのPvu II部位を結合するEco RIリンカーを有している。pIBVM63由来の8KbpのEco RI断片をpRW715のEco RI部位に挿入し、pRW763を作製した。プラスミドpRW763の5’側Eco RI部位を欠損したプラスミドpRW776を作製し、このマトリックス遺伝子下流(3’側)の唯一のEco RI部位を残した。単離したpRW763のEco RI部分消化直線型産物を、Eco RVで再び切断した。最大の断片を単離し、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントでブラントエンドとし、自己連結してpRW776を産生した。構造体pRW776は全IBVペプロマー遺伝子と全マトリックス遺伝子を持ち、このマトリックス遺伝子のあとに唯一のEco RI部位が続く。
【0200】
約0.9Kbpのマトリックス遺伝子の5’及び3’末端だけの配列が決定されていた。翻訳開始コドン(ATG)に始まるマトリックス遺伝子の5’配列には、以下のアンダーラインを付したRsa I部位を含有する。ATGTCCAACGAGACAAATTGTAC。
【0201】
既に述べたH6プロモーターを合成オリゴヌクレオチドでこのマトリックス遺伝子に結合した。この合成オリゴヌクレオチドはEco RV部位からATGまでのH6配列を含有しており、一番目のRsa I部位を介してマトリックスコード配列に挿入した。このオリゴヌクレオチドは、pUC9に挿入できるようにBam HIとEco RI端を持つように合成され、pRW772を作製した。Eco RI末端はRsa I部位の3’側となる。Bam HI適合末端から始まる、この二本鎖合成オリゴヌクレオチド(ATGはアンダーラインで示した)の配列は
【化3】
である。
【0202】
pRW772のRsa I部分消化直線型産物を単離し、Eco RIで再切断した。このRsa I部位で1回切断しEco RIで再切断した箇所を持つpRW772断片をホスファターゼ処理し、以下のpRW776消化産物のベクターとして用いた。
【0203】
単離したpRW776の直線状Rsa I部分消化産物をEco RIで再び切断した。Eco RI部位はマトリックス遺伝子の3’末端をすぐ越えたところにある。上記のRsa I部位からマトリックスをコードする配列を含有する約0.8KbpのRas I−Eco RI単離断片を上記のpRW772ベクターに挿入し、pRW783を作製した。完全なH6プロモーターは、Eco RV部位の5’に配列を添加することによって形成した。H6プロモーターの5’末端はブラントエンドにしてpUC9のSal I部位に挿入しEco RI部位を生じさせるHinf I部位であったが、このH6プロモーターの5’はpUC9のHind III部位である。この5’H6プロモーターを含有するHind III−Eco RV断片をpRW783 Hind IIIとEco RV部位の間に挿入し、pRW786を作製した。pRW786 Eco RI断片はH6プロモーターを持つ完全マトリックス遺伝子を含有しており、DNAポリメラーゼIのクレノウフラグメントでブラントエンドにし、pRW731.15のブラントエンドのBam HI部位(座f8)へ挿入してpRW789を作製した。このpRW731.15 Bam HI部位は、実施例6でvFP−8の作製に用いたFP−1座である。
【0204】
プラスミドpRW789をvFP−26の作製に用いた。組換えプラークを選別しインシトゥ プラークハイブリッド形成で処理した。
【0205】
予備試験において、vFP−26を接種したニワトリはIBVマトリックスタンパクに対する免疫応答が誘起された。
【0206】
実施例19 感染性気管支炎ウイルス(IBV)ペプロマーを発現するファウルポックスウイルスFP−1組換えvFP−31の作製
感染性気管支炎ウイルス(IBV)Mass41のcDNAクローンpIBVM63とそのサブクローンpRW776は、実施例18におけるvFP−26の作製に関して既に説明した。サブクローンpRW776は4Kbp IBVペプロマー遺伝子を含有し、この遺伝子のあとに、3’末端に唯一のEco RI部位を持つマトリックス遺伝子を持つ。約4KbpのIBVヘプロマー遺伝子の5’と3’末端の配列だけが決定されていた。唯一のXba I部位で二つの遺伝子に分離される。翻訳開始コドン(ATG)で始まるペプロマー遺伝子の5’末端は、以下のアンダーラインを付したRsa I部位を有する。ATGTTGGTAACACCTCTTTTACTAGTGACTCTTTTGTGTGTAC。
【0207】
既に述べたH6プロモーターを、合成オリゴヌクレオチドでぺプロマー遺伝子に結合した。この合成オリゴヌクレオチドは、Nru I部位からATGに至るH6プロモーター配列を含有しており、その第一番目のRsa I部位を介してペプロマーコード配列に挿入された。このオリゴヌクレオチドを、pUC9に挿入するためにBam HI及びEco RIに適合する末端を合成し、pRW768を作製した。Eco RI末端はRsa I部位の3’となる。Bam HI適合末端で始まる二本鎖合成オリゴヌクレオチドの配列(ATGはアンダーラインで示した)は
【化4】
である。単離されたpRW768の直線型Rsa I部分消化産物をEco RIで再び切断した。上記のRsa I部位で1ヵ所切断し、Eco RIにより再切断された部位を含むpRW768断片を単離し、ホスファターゼで処理し、以下のpRW776消化産物のベクターとして用いた。
【0208】
単離されたpRW776の直線型Rsa I部分消化産物をEco RIで再び切断した。上記のRsa I部位で1回切断しEco RI部位までを含有する5KbpのpRW776断片を単離した。この断片は、上記のペプロマーRsa I部位からマトリックス遺伝子の3’末端のEco RI部位に至るIBV配列を含有する。このpRW776断片を上記のpRW768ベクターに挿入し、pRW788を作製した。このマトリックス遺伝子を上述のXba I部位に移した。4KbpのpRW788 Nru I−Bam HIブラントエンド断片をpRW760 Nru I−Bam HIブラントエンドベクターに挿入することによって、5’H6プロモーターをNru I部位に付加し、pRW790を作製した。ベクターpRW760については実施例11で述べてあり、簡単に言えば、非必須FP−1座f7に隣接するH6プロモーターで転写促進されるワクシニアインフルエンザ核タンパク質である。このpRW760ベクターは、Nru I部位から核タンパク質末端のBam HIまでの3’H6配列を除去することによって作製された。pRW790は、pRW731.13 Hinc II部位中のH6プロモーター保有IBVペプロマーである。ドナープラスミドpRW790をFP−1と組み換え、vFP−31を生成した。vFP−31感染細胞から調製したCEF溶解液を用いて免疫沈降実験を行い、分子量約180Kdの前駆体タンパクが少量、及び90Kdの分解生成物が少量、特異的に沈降していることが示された。
【0209】
実施例20 単純ヘルペスウイルスgDを発現するファウルポックスウイルスFP−1組換えvFP−30の作製
単純ヘルペスウイルス(HSV)1型株KOS糖タンパクD遺伝子(gD)をpUC9のBam HI部位に、5’Bam HI連結Hpa IIから3’BamHI連結Nru Iまでの断片としてクローン化した。5’末端はpUC9 Pst I部位に隣接している。翻訳開始コドン(ATG)で始まるHSVgDの5’配列は、以下のアンダーラインを付したNco I部位を含有する。
【0210】
【化5】
【0211】
既に述べたワクシニアH6プロモーターを合成オリゴヌクレオチドでHSVgD遺伝子に結合させた。Nru IからATGに及びさらにgDコード配列のNco I部位に至るH6プロモーターの3’部分を含有する。このオリゴヌクレオチドは、Pst I適合5’末端を持つように合成した。pUC9のgDクローンをPst IとNco Iで切断し、5’HSV配列を除去し、合成オリゴヌクレオチドと置き換えることによって、pRW787を得た。この二本鎖合成オリゴヌクレオチドの配列は、
【化6】
である。pRW787をNru IとBam HIで消化すると、Nru I部位からHSVgDコード配列を通りBam HI部位に至る3’H6プロモーターを含有する約1.3Kbpの断片ができる。このpRW760ベクターをNru IとBam HIで切断することについては、実施例11で述べた。この1.3Kbp断片をpRW760ベクターに挿入しpRW791を作製した。このpRW791ベクターは、pRW731.13の非必須FP−1 Hinc II部位(座f7)に、完全ワクシニワプロモーターで転写促進されるHSVgD遺伝子を含有する。
【0212】
ドナープラスミドpRW791をFP−1と組み換えてvFP−30を得た。糖タンパクの表面発現が、プロテインA−β−ガラクトシダーゼ連結イムノアッセイ及びHSV−1特異血清を用いた組換えプラーク中で検出された。
【0213】
実施例21 ポックスウイルスベクター中における外来遺伝子の発現制御のためのエントモポックスプロモーターの使用
(a) 背景 昆虫のポックスウイルスは現在エントモポックスウイルス亜科(Entomopoxvirinae)に分類されており、甲虫類(Celeopteta)、鱗翅類(Lipidoptera)、直翅類(Orthoptera)の目に属する昆虫から単離されるエントモポックスウイルスにそれぞれ対応する三つの属(A、B、C)にさらに細く分類される。本来エントモポックスウイルスは宿主範囲が狭く、如何なる脊椎動物中でも複製しないことが知られている。
【0214】
本研究で用いたエントモポックスウイルスは、元々インド産の感染したアムサクタ・モーレイ(Amsacta moorei)(鱗翅類:アークチルダエ(arctildae))の幼生から単離したものである(ロバーツ(Roberts)とグラナドス(Granados)、J. Invertebr. Patho1. 12、141−143[1968])。このウイルスはAmEPVと命名されており、B属の種型である。
【0215】
野生型AmEPVをR.グラナドス(Granados)博士(ボイス・トンプソン・インスティチュート(Boyce Thompson lnstitute)、コーネル大学(Cornell University))から、感染したエスチグメヌ・アクレア(Estigmene acrea)の幼生由来感染血リンパとして入手した。このウイルスはリマントリア・ジスパー(Lymantria disper)(マイマイガ)の卵巣組織由来の無脊椎細胞系統であるIPLB−LD652Y中で複製することがわかった(グッドウィル(Goodwi11)ら、In Vitro 14、485−494[1978])。この細胞を、4%ウシ胎児血清及び4%ニワトリ血清を添加したIPL−528培地で28℃で増殖させた。
【0216】
野生型ウイルスをLD652Y細胞でプラークアッセイし、V1と命名したプラーク1個を以下の実験のため選択した。この単離物は、感染サイクル後期の感染細胞の細胞質において、数多くの封入体(occlusion bodies: OBs)を産生する。
【0217】
(b) プロモーター同定 AmEPVプロモーターの同定とマッピングを以下のようにして完了した。最近感染したLD652Y細胞(感染後48時間)の総RNAを単離し、32Pで標識される最初のcDNA鎖を作製するのに用いた。このcDNAを、AmEPVの制限消化物含有ブロットのプローブとして用いた。このサザンブロットで2.6KbのCla I断片上に強いシグナルが検出され、この断片が強く発現された遺伝子をコードすることを示していた。本断片をプラスミドベクターにクローン化し、そのDNA配列を決定した。
【0218】
配列データの分析により42Kdのポリペプチドをコードすることのできる読み取り枠が明らかになった。感染48時間後における総RNAのインビトロ翻訳とSDS−PAGEによる生成物の分離によって、約42Kdのポリペプチドが1個明らかとなった。
【0219】
(c) エントモポックスプロモーター制御下において外来遺伝子を発現する 組換えワクシニアウイルスの作製
エントモポックスプロモーターが脊椎動物ポックスウイルス系で機能するか否かを調べるため、以下のプラスミドを作製した。5’末端でBg1 II部位に隣接する42K遺伝子翻訳開始シグナル(以下でAmEPV42Kプロモーターと呼ぶ)の5’側の107塩基及びEco RI部位で終結するB型肝炎ウイルスプレS2のコード領域の3’末端の最初の14塩基を含有するオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。下記にこのAmEPV42Kプロモーター配列を述べる。
【0220】
【化7】
【0221】
このAmEPV42Kプロモーターを以下のようにしてB型肝炎ウイルス表面抗原(HBVsAg)に連結した。赤血球凝集素(HA)分子をコードするワクシニアウイルスゲノムの非必須領域におけるワクシニアウイルス腕(HA腕については、実施例15で記載;HA領域はシダ(Shida)がVirology150、451−462[1986]に記載)に隣接した、プレS2コード領域(タイプaywがガリバート(Galibert)らによって記載、Nature 281、646−650[1979])及びB型肝炎ウイルス表面抗原を含有するpUCプラスミドを作製した。前述のオリゴヌクレオチドを、HBVsAgのコード領域の唯一のEco RI部位及びHAワクシニア腕の唯一のBgl II部位を用いてこのプラスミド中に挿入した。得られた組換えワクシニアウイルスをvP547と命名した。
【0222】
エントモポックス42Kプロモーターの制御下における挿入HBVsAgのコード配列の発現を、イムノアッセイを用いて確認した。哺乳類細胞系統BSC−40の当量培養液を親ワクシニアウイルス又は組換えvP547で感染させた。感染後24時間で細胞を溶解させ、この溶解液を順次希釈してニトロセルロース膜にのせた。この膜を最初はヤギ抗HBV血清でインキュベートし、次いで、125IプロテインAとインキュベートした。洗浄後この膜をX線フィルムに露光させた。陽性シグナルがvP547感染培養液で検出されたが、親ウイルス感染培養液では検出されず、哺乳類細胞中のワクシニアウイルスによって、AmEPV42Kプロモーターが認識されることを示唆していた。
【0223】
上記の結果を、感染哺乳類細胞中でHBVsAgを検出するためのオースリアアッセイ(詳細については実施例1を参照)を用いて確認した。AmEPV42K又はワクシニアウイルスH6プロモーターに結合したHBsAg含有ワクシニアウイルス組換え体を用いてBSC−40細胞を感染させ、sAg発現レベルをオースリア試験でアッセイした。表XIIに示すように、42Kプロモーターを用いたHBsAg発現レベルが顕著であることがデータからわかる。
【0224】
【表15】
【0225】
さらに、脊椎動物ポックスウイルス環境下におけるAmEPV42Kプロモーター制御の一時的特性を確認するための実験を行った。後期ウイルス転写を阻害し、これによってDNA複製を阻害するシトシンアラビノシド40μg/mlの存在又は非存在下において、BSC−40細胞の当量培養液をvP547で感染させた。感染24時間後においての発現レベルをオースリア試験でアッセイした。この結果から、この42Kプロモーターがワクシニアウイルス複製系中の初期プロモーターとして認識されることが示唆された。
【0226】
哺乳類の系における外来遺伝子の発現にAmEPV42Kプロモーターを使用することが無脊椎動物の系における遺伝子発現にオートグラファ・カリホルニカ(Autographa calitornica)NPVポリヘドリンプロモーターを使用すること(ラッコウ(Luckow)とサマーズ(Summers)、Biotechnology 6、47−55[1988])とは明らかに異なることに注目すべきである。ポリヘドリンプロモーターは、哺乳類細胞中の転写機構によっては認識されない(ティラ(Tjla)、Virology 125、107−117[1983])。哺乳類細胞においてAmEPV42Kプロモーターを使用することが、昆虫以外のウイルスベクター中の外来遺伝子を非無脊椎細胞中で発現させるのに昆虫ウイルスプロモーターが利用された最初の例である。
【0227】
アビポックスウイルス類が同様に42Kエントモポックスプロモーターを認識するかどうかを調べるため、下記の実験を行った。CEF細胞の同一の培養液に対し、細胞1個当たり10pfuのファウルポックスウイルス、カナリーポックスウイルス、又はワクシニアウイルスを接種し、同時に1) 42Kプロモーターに連結したHBVプレーS2+sAgコード配列を含有するプラスミド42K.17、又は2) 既に述べたワクシニアウイルスH6プロモーターに連結したHBVsAgのコード配列を含有するプラスミドpMP15.spsPのどちらかのプラスミド25gで形質転換した。24時間後に培養液を凍結して細胞を溶解させ、オースリア試験を用いて溶解液におけるHBVsAgの存在を分析した。
【0228】
表XIIIに示した結果を定量的に検討すべきである。この結果、ファウルポックス及びカナリーポックス双方の転写機構が42Kプロモーターを認識でき、かつ、連結HBVsAgコード配列の転写を可能とすることが示唆される。発現レベルはワクシニアウイルスH6プロモーターで得られるよりも低いが、陰性対照で得られたバックグラウンドレベルよりも充分に高い。
【0229】
【表16】
【0230】
実施例22 生狂犬病ウイルス攻撃に対してマウスを防御するためのVCP−16による免疫処置
4〜6週齢マウス20匹の群の足蹠蹄に2つの組換え体(a) vFP−6(実施例6に記載したファウルポックス狂犬病組換え体)及び(b) vCP−16(実施例13に記載したカナリーポックス狂犬病組換え体)のどちらかの所定量希釈液50乃至100μlを接種した。
【0231】
14日に各群からマウス10匹を屠殺し血清を採取した。実施例7に記載したRFFI試験を用いて血清中の抗狂犬病力価を計算した。各群の残りのマウス10匹に対し、実施例7で用いた狂犬病ウイルスCVS株を脳内接種して攻撃した。各マウスは、マウスのLD50の16倍に相当する30μlを投与された。28日に生存マウスを調べ、50%防御量(PD50)を計算した。結果を表XIVに示す。
【0232】
vFP−6の接種から判明したマウスの防御レベルは、実施例7で検討したファウルポックス組換え体vFP−3の接種で示された結果を確認するものである。vCP−16の接種よってもたらされる防御レベルはかなり高い。算出PD50を基準とした時、狂犬病の攻撃に対する防御においては、ファウルポックス狂犬病組換え体よりもカナリーポツクス狂犬病組換え体の方が100倍有効である。
【0233】
【表17】
【0234】
実施例23 外来遺伝子発現のためのファウルポックスプロモーターエレメントの使用
I.25.8キロダルトン(KD)の遺伝子産物をコードするファウルポックス遺伝子の同定
SDSポリアクリルアミドゲルをクーマシーブルーで染色してファウルポックス(FP−1)感染CEF溶解液中に存在するタンパク質種を染色することによって、見掛けの分子量25.8KDの主要な分子種が明らかとなった。このタンパク質は非感染細胞溶解液中には存在しなかった。感染後特定の時期に合成されたタンパク質を35S−メチオニンで放射性標識するパルス実験から、FP−1誘発タンパクが豊富にあることが示され、かつ、このタンパクが感染後6時間から54時間までに合成されることが示唆された。ピークレベルでは、このFP−1 25.8KDのタンパク質は、細胞溶解液中に存在する総タンパクのおよそ5%から10%までを占める。
【0235】
FP−1誘発25.8KDタンパク質が多量に存在することから、この遺伝子産物をコードする遺伝子が強力なFP−1プロモーターエレメントによって制御されていることが示唆された。ポックスウイルス組換え体内における外来遺伝子発現への使用に関して、このプロモーターエレメントの位置を決定するために、感染54時間後にFP−1感染CEF細胞からポリゾーム調製物を得た。RNAをこのポリゾーム調製物から単離して、ウサギ網状赤血球のインビトロ翻訳系に用いたとき、主に25.8KDのFP−1タンパク質を産生した。
【0236】
このポリゾームRNAを、オリゴ(dT)12−18をプライマーとして用いる最初のcDNA鎖合成の鋳型として用いた。この最初のcDNA鎖を、FP−1ゲノム消化産物のサザンブロット分折におけるハイブリッド形成プローブとして用いた。これらのハイブリッド形成分析の結果から、前記25.8KDタンパク質をコードする遺伝子が10.5Kbp Hind III断片に含まれていることが示唆された。次にこのゲノムHind III断片を単離して市販ベクターpBS(ストラタジーン(Stratagene)、ラ・ホヤ(La Jo11a)、カリフォルニア)に連結し、このクローンをpFP23K−1と命名した。pFP23K−1の消化物のプローブとして最初のcDNA鎖を用いてハイブリッド形成分析を行ったところ、25.8KDタンパク質遺伝子が3.2KbpのEco RV小断片に位置することが判明した。この断片をpBS中でクローン化し、pFP23K−2と命名した。
【0237】
約2.4KbpのこのFP−1 Eco RV断片の塩基配列はサンガーのジデオキシチェインターミネーター法(サンガー(Sanger)等、Proc.Natl. Acad. USA、74、5463−5467[1977])で決定した。配列の分析から、分子量25.8KDの遺伝子産物をコードする読み取り枠(ORF)が明らかになった。このORFをpBSベクター中でバクテリオファージT7ポリメラーゼによりインビトロランオフ転写すると、ウサギ網状赤血球インビトロ翻訳系(プロメガ・バイオテック(Promega Biotec)、マジソン(Madison)、ウィスコンシン)に用いた場合見掛けの分子量25.8KDのポリペプチド種を産生するRNA種が得られた。このポリペプチドは、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で、FP−1感染CEFs溶解液中で観察される豊富な25.8KDのタンパク質と泳動度が同じである。これらの結果から、これが、FP−1が誘発した多量に存在する25.8KD遺伝子産物をコードする遺伝子であることが示唆される。
【0238】
II. FP−1及びワクシニア組換え体においてネコ白血病ウイルス(FeLV)env遺伝子を発現させるためのFP−1 25.8KD遺伝子の上流プロモーターエレメントの使用
FP−1 25.8KD遺伝子制御領域(FP 25.8Kプロモーター)及び21bpの25.8KD遺伝子コード配列を含有する270bp Eco RV/Eco RI断片をpFP23K−2から単離した。PFeLV 25.8F1とpFeLV 25.81Aを誘導するために用いたFP 25.8Kプロモーター領域のヌクレオチド配列を以下に示す。この270個のヌクレオチド配列は、25.8KD遺伝子産物の開始コドン(ATG)の上流の249個のヌクレオチドとコード配列の最初の21bpを示す。
【0239】
【化8】
【0240】
この断片をブラントエンドとしてFeLV env配列を含有するSma I消化FP−1挿入ベクター(pFeLVF1:実施例15参照)へ挿入した。この挿入ベクターは、FP−1ゲノムのf7座による組換えを可能とした。このFP 25.8Kプロモーター上流配列をFeLV env遺伝子の5’側に挿入しそれらが正しい配向であることを配列分析で確認した。この挿入は、ATG置換に対して完全ATGを付与することはないが、しかし、前記25.8KD遺伝子によって提供されたATGはこのFeLV env ATGの枠外にあるので、融合タンパクは形成されない。FeLV env遺伝子の上流にFP25.8KDプロモーターを含有するFP−1挿入プラスミドをpFeLV25.8F1と命名した。
【0241】
ワクシニアウイルス挿入ベクターpFeLV1AはFeLV遺伝子を保有しており(実施例15参照)、このベクターを用いて同様の構造体を調製した。このH6プロモーターを、Bgl IIとSma Iによる消化でpFeLVlAから切断した。Bgl II制限部位をブラントエンドとした後、FP25.8Kプロモーターを含有するブラントエンド化Eco RV/Eco RI断片(270塩基)をFeLV env遺伝子の5’側に隣接するように挿入した。この構造体を配列分析で確認した。この組換え体にもATG置換に対して完全なATGはないが、25.8KD遺伝子のATGはFeLV遺伝子のATGを持つ枠内にはない。ワクシニア(コペンハーゲン株)挿入ベクターはFeLV遺伝子の5’側に隣接する25.8KD遺伝子上流領域を保有しておりpFeLV25.81Aと命名した。
【0242】
この挿入プラスミドpFeLV25.8F1とpFeLV25.81Aを、救援ウイルスとしてのFP−1(pFeLV25.8F1)とワクシニアウイルスコペンハーゲン株(pFeLV25.81A)によるインビトロ組換えに用いた。この組換えの子孫を適当な細胞単層に塗付後、組換えウイルスをβガラクトシダーゼ連結プロテインAイムノスクリーンとウシ抗FeLV血清(アンチボディーズ社、デービス、カリフォルニア)によって選択した。予備的結果から、このFP25.8Kプロモーターがポックスウイルス組換え体中における外来遺伝子の発現を制御できることが示唆された。
【0243】
実施例24 家禽中におけるvFP−6とvCP−16の安全性及び有効性
アビポックス組換え体2種vFP−6とvCP−16(実施例6と実施例13に記載)を18日齢ニワトリ胚、1日齢ニワトリ及び28日齢ニワトリに接種し、これらのニワトリの反応を3つの基準、すなわち1) 孵化率、ワクチンに対する反応及び死亡率に及ぼすワクチンの影響、2) 狂犬病糖タンパク質で誘起された免疫応答、3) ファウルポックス抗原で誘起された免疫応答、に基づいて評価した。以下に実施した実験を記す。
【0244】
A. 安全性試験 18日齢20匹を1群とし、これらの漿膜腔にvFP−6又はvCP−16のいずれかのlog10TCID50の3.0又は4.0倍量を接種した。孵化後ニワトリを14日間観察し、血清を採取した。ニワトリ胚に接種した組換え体2種は卵の孵化率に全く影響を及ぼさず、またニワトリは14日の観察期間において健常のままであった。
【0245】
1日齢のSPFニワトリ10匹からなる群に対し、筋注で前記組換え体のいずれかのlog10TCID50の3.0倍量を接種した。ニワトリを28日間観察し、接種後14日と28日において血清検体を採取した。いずれの組換え体でも接種部位でワクチン反応は全く見られず、ニワトリは28日の観察期間中健常であった。
【0246】
28日齢ニワトリ10匹から成る群に対し、組換えウイルスのいずれかを接種した。投与量は、筋肉経路で3.0 log10TCID50又は皮膚(翼網)経路で3.0 log10TCID50のいずれかとした。ニワトリを28日間観察し、接種後14日と28日に血清検体を採取した。いずれの組換え体を筋注しても、反応は全く見られなかった。皮膚接種によりファウルポックスは極めて小さいワクチン反応が生じたが、病巣の大きさは異なっていた。カナリーポックス接種によって、接種部位に通常の皮膚病巣が生じた。病巣部は全て、実験終了時までに退縮した。
【0247】
B. 免疫反応 実施例7で先に述べたRFFI試験を用いて、狂犬病糖タンパクに対する抗体レベルを評価した。各群の結果を、23.4IUを含有する標準血清をもととし各血清の力価幾何平均を国際単位(International Units)(IU)に換算して表わした。最小陽性レベルを1 IUと定め、陽性ニワトリのパーセントを求めるに用いた。アビポックスウイルス類に対する抗体を、ファウルポックスウイルス株を抗原として用いたELISA法で検査した。各血清検体を20分の1及び80分の1に希釈した。陽性血清と陰性血清を用いて標準曲線を描いた。最小陽性レベルは、種々の値の陰性血清の平均プラス2標準偏差で算出した。
【0248】
血清学的検査結果を、vFP−6については表XVに、vCP−16については表XVIに示した。
【0249】
vFP−6又はvCP−16のいずれかを接種した胚で、狂犬病抗原又はファウルポックス抗原に対する限定された血清学的反応が観察された。前記ファウルポックスベクターは、カナリーポックスよりも多くのニワトリにおいて両方の抗原に対する血清学的反応を誘起したが、この反応もやはりさまざまであった。
【0250】
1日齢でvFP−6を接種されたニワトリは、良好な血清学的反応を示し、全てのニワトリが接種後28日までに狂犬病抗原及びファウルポックス抗原に対し血清陽性であった。vCP−16接種に対する反応ははるかに低く、28日目で狂犬病糖タンパクに対しニワトリの40%が血清陽性でありアビポックス抗原に対しニワトリの10%が血清陽性であった。
【0251】
28日齢で筋肉経路でvFP−6を接種したニワトリは、接種後14日までに両方の抗原に対して100%のセロコンバージョンをしていた。皮膚接種後ニワトリの大部分もセロコンバージョンしていたが、狂犬病抗原及びアビポックス抗原の双方に対し得られた力価は低かった。既に述べたように、筋肉及び皮膚経路の双方でvCP−16を接種されたニワトリはさまざまな反応を示し、筋肉内接種の狂犬病に対し、最大70%のセロコンバージョンを示した。カナリーポックス接種後のアビポックス抗原に対する低レベルのセロコンバージョンは、このウイルス類間の血清学的近縁性の程度を反映しているのかもしれない。
【0252】
前記の結果から、vFP−6及びvCP−16の両方ともにある年齢域のニワトリに接種しても安全であることが示唆された。ファウルポックスベクターvFP−6は、ニワトリにおける免疫反応惹起に関しより効果的であるように思われる。しかしアビポックスウイルスであるファウルポックス及びカナリーポックスの両方の組換え体は、卵中における免疫化に有効であるということは重要である。
【0253】
【表18】
【0254】
【表19】
【0255】
実施例25 子豚にvFP−6を接種することの安全性と免疫原性
1群子豚3匹から成る2群に対し、2投与経路のひとつで組換えvFP−6を接種した。
【0256】
a) 子豚3匹に筋肉内接種で8.1 log10TCID50を投与し、
b) 子豚3匹に経口接種で同量を投与した。
【0257】
全動物から週間隔で採血後、同経路・同投与量で35日目に追加接種した。子豚の臨床徴候を毎日観察した。血清は、ELISA法及び血清中和検査で抗ファウルポックス抗体を調べた。狂犬病抗体をRFFI試験でアッセイした。
【0258】
子豚は全て良好な健康状態を保ち、接種後病巣部は全く見られなかった。体温曲線は正常で、接種動物と非接種動物間で全く違いがなかった。
【0259】
ELISA及び血清中和で測定したところ、筋肉内経路及び経口経路で接種を受けた子豚の両方ともが、ファウルポックス抗原に対する血清学的反応を誘起した。二次接種後において、二次反応が著明であった(結果を示さず)。RFFI試験で測定すると、全子豚が狂犬病糖タンパクに対する免疫学的反応を発症し、両経路による追加効果は顕著である。これらの結果を表XVIIに示す。
【0260】
前記結果から、ファウルポックス/狂犬病組換え体の接種が子豚において無害であること、及びこの組換え体は経口又は筋肉内接種による狂犬病糖タンパクに対し顕著な免疫応答を誘起させることができることが示唆される。
【0261】
【表20】
Claims (5)
- カナリーポックスウイルスゲノムの非必須領域内で、哺乳類病原体の抗原をエンコードするDNAの存在により人工的に修飾された組換えカナリーポックスウイルス。
- DNAが適切なプロモーターから下流に存在する、請求項1記載の組換えカナリーポックスウイルス。
- プロモーターがPiワクシニアプロモーター、Hind III H(HH及びH6)ワクシニアプロモーター、11Kワクシニアプロモーター、25.8KD FP−1ファウルポックスプロモーター及びAmEPV 42Kエントモポックスプロモーターからなる群から選択される、請求項2記載の組換えカナリーポックスウイルス。
- 組換えカナリーポックスウイルスは、DNA及びプロモーターが非必須領域の座C3、C4、C5またはC6に挿入されているカナリーポックスウイルスである、請求項3記載の組換えカナリーポックスウイルス。
- 抗原が狂犬病抗原、狂犬病G抗原、ウシ白血病ウイルスのgp51、30エンベロープ抗原、ネコ白血病ウイルスのFeLVエンベロープ抗原及び単純ヘルペスウイルスの糖タンパクD抗原からなる群から選択される、請求項1、2、3または4記載の組換えカナリーポックスウイルス。
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