JP3529134B2 - 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン - Google Patents
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- C12N2710/16011—Herpesviridae
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ネコヘルペスウイルス（FHV）ゲノムの１
セクションに突然変異を含むFHV突然変異体、FHVゲノム
の前記セクションを含む核酸配列、前記セクションから
誘導されるDNAを両端に有する異種DNA配列を含む核酸配
列、このような核酸配列を含む組換えDNA分子、FHV突然
変異体に感染した細胞培養物及びFHV突然変異体を含む
ワクチンに係る。
セクションに突然変異を含むFHV突然変異体、FHVゲノム
の前記セクションを含む核酸配列、前記セクションから
誘導されるDNAを両端に有する異種DNA配列を含む核酸配
列、このような核酸配列を含む組換えDNA分子、FHV突然
変異体に感染した細胞培養物及びFHV突然変異体を含む
ワクチンに係る。
ネコの疾患における主要な臨床の問題の１つは気道感
染に結び付けられる。これらの症例の大部分はネコヘル
ペスウイルス１（FHV）又はネコカリチウイルスに起因
する。
染に結び付けられる。これらの症例の大部分はネコヘル
ペスウイルス１（FHV）又はネコカリチウイルスに起因
する。
FHVはネコにおけるネコウイルス性鼻気管炎の原因剤
である。子ネコではFHV感染は全身化し、致死率は50％
に達し得る。この疾患は一般的であり、世界中に認めら
れ、くしゃみ、抑鬱及び目鼻からの粘液分泌により特徴
付けられる。
である。子ネコではFHV感染は全身化し、致死率は50％
に達し得る。この疾患は一般的であり、世界中に認めら
れ、くしゃみ、抑鬱及び目鼻からの粘液分泌により特徴
付けられる。
FHVはヘルペスウイルス科、アルファヘルペスウイル
ス亜科の１員である。ゲノムは長さ約126kbであり、約9
9kbのユニークな長（UL）領域と、約8kbの倒置反復配列
を両端に有する約9kbのユニークな短（US）領域からな
る27kbの短領域とから構成される（Grailら,Arch.Viro
l.116,209−220,1991）。
ス亜科の１員である。ゲノムは長さ約126kbであり、約9
9kbのユニークな長（UL）領域と、約8kbの倒置反復配列
を両端に有する約9kbのユニークな短（US）領域からな
る27kbの短領域とから構成される（Grailら,Arch.Viro
l.116,209−220,1991）。
FHV感染の有病率及び重度性により、生又は殺した修
飾FHVを含むネコウイルス性鼻気管炎ワクチンが開発さ
れ、その結果、疾患発生率は低下するようになった。
飾FHVを含むネコウイルス性鼻気管炎ワクチンが開発さ
れ、その結果、疾患発生率は低下するようになった。
FHV感染以外に、ネコはネコ白血病ウイルス、ネコカ
リチウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ネココロナウ
イルス及びネコクラミジアのような種々の他の病原体に
よる感染も受ける。
リチウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、ネココロナウ
イルス及びネコクラミジアのような種々の他の病原体に
よる感染も受ける。
現在では、一般にこれらの病原性微生物によるネコの
感染は生ワクチン又は不活性化ワクチンで防御すること
ができる。
感染は生ワクチン又は不活性化ワクチンで防御すること
ができる。
しかしながら、この種のワクチンには多数の欠点があ
る。弱毒性ワクチンを使用すると、弱毒化の不十分な病
原性微生物を動物に接触する危険が常に伴う。更に、弱
毒病原体はビルレント状態に戻り、接種動物が発病し、
病原体が他の動物に広がる恐れがある。
る。弱毒性ワクチンを使用すると、弱毒化の不十分な病
原性微生物を動物に接触する危険が常に伴う。更に、弱
毒病原体はビルレント状態に戻り、接種動物が発病し、
病原体が他の動物に広がる恐れがある。
不活化ワクチンは一般に低レベルの免疫しか誘導しな
いので、繰り返し免疫感作することが必要である。更
に、病原体の中和誘導抗原決定基が不活化処理により変
化し、ワクチンの保護力価が低下する恐れがある。
いので、繰り返し免疫感作することが必要である。更
に、病原体の中和誘導抗原決定基が不活化処理により変
化し、ワクチンの保護力価が低下する恐れがある。
更に、複数種の生ウイルスワクチンを組み合わせる
と、抗原成分の相互作用により、構成成分の１種以上の
力価が低下するという問題がある。
と、抗原成分の相互作用により、構成成分の１種以上の
力価が低下するという問題がある。
更に、現在投与されている生弱毒又は不活化FHVワク
チンでは、特定の動物がFHVフィールドウイルスのキャ
リヤーであるのか、あるいは動物がワクチン接種された
のかを決定することができない。従って、FHVワクチン
を接種した動物とフィールドウイルスに感染した動物と
を区別し、ビルレントフィールドウイルスの拡散を減じ
るように適切な対策を講じることが重要である。感染宿
主動物中で抗体の産生を通常もたらすFHVの非必須
（糖）タンパク質をコードする遺伝子に突然変異を導入
することにより、例えば血清学的に識別可能なマーカー
を導入することができる。
チンでは、特定の動物がFHVフィールドウイルスのキャ
リヤーであるのか、あるいは動物がワクチン接種された
のかを決定することができない。従って、FHVワクチン
を接種した動物とフィールドウイルスに感染した動物と
を区別し、ビルレントフィールドウイルスの拡散を減じ
るように適切な対策を講じることが重要である。感染宿
主動物中で抗体の産生を通常もたらすFHVの非必須
（糖）タンパク質をコードする遺伝子に突然変異を導入
することにより、例えば血清学的に識別可能なマーカー
を導入することができる。
本発明の目的は、ネコウイルス性鼻気管炎に対するワ
クチンの製造用としてのみならず、ネコの他の感染性疾
患に対するワクチンの製造用としても使用可能なFHV突
然変異体を提供することであり、該変異体は生きた弱毒
病原体をワクチンとして使用した場合に予想される潜在
的危険を解消し、必ずしもアジュバントを必要とせずに
体液免疫系と細胞免疫系のいずれをも有効に刺激し、種
々の抗原成分の不利な相互干渉の危険なしに多価ワクチ
ンを実現可能にする。
クチンの製造用としてのみならず、ネコの他の感染性疾
患に対するワクチンの製造用としても使用可能なFHV突
然変異体を提供することであり、該変異体は生きた弱毒
病原体をワクチンとして使用した場合に予想される潜在
的危険を解消し、必ずしもアジュバントを必要とせずに
体液免疫系と細胞免疫系のいずれをも有効に刺激し、種
々の抗原成分の不利な相互干渉の危険なしに多価ワクチ
ンを実現可能にする。
本発明の別の目的は、フィールド株又は他のFHVワク
チンウイルスから区別可能なFHVワクチンウイルスを提
供することである。
チンウイルスから区別可能なFHVワクチンウイルスを提
供することである。
本発明は、図１に主に定義する制限酵素地図を有する
FHVゲノムのDNAフラグメントの内側に一するオープンリ
ーディングフレーム−１の上流非コーディング領域から
オープンリーディングフレーム−６の下流非コーディン
グ領域に及ぶFHVゲノムのセクションに突然変異を含むF
HV突然変異体を提供する。
FHVゲノムのDNAフラグメントの内側に一するオープンリ
ーディングフレーム−１の上流非コーディング領域から
オープンリーディングフレーム−６の下流非コーディン
グ領域に及ぶFHVゲノムのセクションに突然変異を含むF
HV突然変異体を提供する。
突然変異とは、親FHVのゲノムの上記セクションに存
在する遺伝情報に対してこのセクションにおける遺伝情
報が変化していることを意味する。
在する遺伝情報に対してこのセクションにおける遺伝情
報が変化していることを意味する。
突然変異は特に、配列番号２〜７に示す１種以上の抗
原性もしくは機能性ポリペプチドを産生することができ
ないFHV突然変異体又は挿入異種核酸配列を含むFHV突然
変異体をもたらす核酸置換、欠失、挿入もしくは逆位又
はその組み合わせである。
原性もしくは機能性ポリペプチドを産生することができ
ないFHV突然変異体又は挿入異種核酸配列を含むFHV突然
変異体をもたらす核酸置換、欠失、挿入もしくは逆位又
はその組み合わせである。
本発明のFHV突然変異体は任意のFHV株から誘導するこ
とができ、例えばG2620株（オランダ国、Intervet Int
ernational B.V.の市販品）、Ｃ−27（ATCC VR−63
6）、FVRm（ATCC VR−814）、FVRmワクチン（ATCC VR
−815）又はF2から誘導することができる。
とができ、例えばG2620株（オランダ国、Intervet Int
ernational B.V.の市販品）、Ｃ−27（ATCC VR−63
6）、FVRm（ATCC VR−814）、FVRmワクチン（ATCC VR
−815）又はF2から誘導することができる。
本明細書中で使用する「ポリペプチド」なる用語はア
ミノ酸の分子鎖を意味し、産物の特定長ではなく、所望
により、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル
化又はリン酸化によってin vivo又はin vitro修飾さ
れ得る。即ち、特にペプチド、オリゴペプチド及びタン
パク質がポリペプチドの定義に含まれる。
ミノ酸の分子鎖を意味し、産物の特定長ではなく、所望
により、例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル
化又はリン酸化によってin vivo又はin vitro修飾さ
れ得る。即ち、特にペプチド、オリゴペプチド及びタン
パク質がポリペプチドの定義に含まれる。
本発明の有用なFHV突然変異体の必要条件は、突然変
異がゲノムFHV配列の許容位置又は領域、即ち感染や複
製に必要なFHVの必須機能を損なうことなく突然変異の
組み込みに使用可能な位置又は領域に導入されることで
ある。
異がゲノムFHV配列の許容位置又は領域、即ち感染や複
製に必要なFHVの必須機能を損なうことなく突然変異の
組み込みに使用可能な位置又は領域に導入されることで
ある。
FHVゲノム中の遺伝子の位置については従来ほとんど
解明されていない。Rotaら（Virology 154,168−179,1
986）及びGrailら（Arch.Virol.116,209−220,1991）は
FHVゲノムの物理的地図を開示した。
解明されていない。Rotaら（Virology 154,168−179,1
986）及びGrailら（Arch.Virol.116,209−220,1991）は
FHVゲノムの物理的地図を開示した。
Nunbergら（J.Virology 63,3240−3249,1989）及びC
oleら（J.Virology 64,4930−4938,1990）はチミジン
キナーゼ（TK）遺伝子を同定し、この遺伝子をFHVゲノ
ムのSal I−Ａ制限フラグメント（Rotaら、前出）中に
マッピングした。その後、FHV TK遺伝子にFeL V env
及びgag遺伝子を挿入した数種の組換えFHV株が構築され
た。
oleら（J.Virology 64,4930−4938,1990）はチミジン
キナーゼ（TK）遺伝子を同定し、この遺伝子をFHVゲノ
ムのSal I−Ａ制限フラグメント（Rotaら、前出）中に
マッピングした。その後、FHV TK遺伝子にFeL V env
及びgag遺伝子を挿入した数種の組換えFHV株が構築され
た。
本発明で言及するFHVゲノムのセクションは、FHVゲノ
ムでは従来同定されていない。驚くべきことに、この領
域ではFHVの必須機能を損なわずに異種DNAの組み込みな
どの突然変異が可能であることが判明した。
ムでは従来同定されていない。驚くべきことに、この領
域ではFHVの必須機能を損なわずに異種DNAの組み込みな
どの突然変異が可能であることが判明した。
本発明のFHV突然変異体を作成するべく１以上の突然
変異を導入するために使用されるFHVゲノムのセクショ
ンは、ゲノムFHV DNAを酵素Sau3Aで部分消化すること
により生成される13.5kb制限フラグメント内に位置する
（図１）。
変異を導入するために使用されるFHVゲノムのセクショ
ンは、ゲノムFHV DNAを酵素Sau3Aで部分消化すること
により生成される13.5kb制限フラグメント内に位置する
（図１）。
前記フラグメントを制限酵素マッピングにより詳細に
分析すると、Grailら（前出）の地図上の地図単位0.87
〜0.96のウイルスゲノムのUSセグメント内の１領域にほ
ぼ対応する。
分析すると、Grailら（前出）の地図上の地図単位0.87
〜0.96のウイルスゲノムのUSセグメント内の１領域にほ
ぼ対応する。
１以上の突然変異を導入するために本発明で使用する
FHVゲノムのセクションは1.9及び5.2kbの２つの隣接す
るBamH Iフラグメント内に位置し、長さ約6.1kbであ
り、６個の連続するオープンリーディングフレーム（OR
F）のDNA配列と、これらのオープンリーディングフレー
ムの両端の遺伝子間配列とからなり、該遺伝子間配列は
ORF−１の上流非コーディング配列及びORF−６の下流の
非コーディング配列を含む。
FHVゲノムのセクションは1.9及び5.2kbの２つの隣接す
るBamH Iフラグメント内に位置し、長さ約6.1kbであ
り、６個の連続するオープンリーディングフレーム（OR
F）のDNA配列と、これらのオープンリーディングフレー
ムの両端の遺伝子間配列とからなり、該遺伝子間配列は
ORF−１の上流非コーディング配列及びORF−６の下流の
非コーディング配列を含む。
これらのフランキング遺伝子間配列はORFもしくはタ
ンパク質コーディングDNA配列の一部を形成せず、又は
ウイルスの複製を調節する配列を含まない。該フランキ
ング配列は最近傍のオープンリーディングフレームの始
点又は終点まで上流及び下流方向に伸びている。
ンパク質コーディングDNA配列の一部を形成せず、又は
ウイルスの複製を調節する配列を含まない。該フランキ
ング配列は最近傍のオープンリーディングフレームの始
点又は終点まで上流及び下流方向に伸びている。
特に、本発明は配列番号２〜７に示すポリペプチドを
コードするORF1〜６のDNA配列とその遺伝子間フランキ
ング配列とを含む領域、より好ましくは配列番号１に示
すDNA配列を含む領域に及ぶFHVゲノムのセクションに突
然変異を含むFHV突然変異体を提供する。
コードするORF1〜６のDNA配列とその遺伝子間フランキ
ング配列とを含む領域、より好ましくは配列番号１に示
すDNA配列を含む領域に及ぶFHVゲノムのセクションに突
然変異を含むFHV突然変異体を提供する。
ORF−１はヌクレオチド位置127〜1281（配列番号１）
に位置するオープンリーディングフレームであり、348
アミノ酸（配列番号２）のポリペプチドをコードし、β
−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の挿入に使用される
ヌクレオチド位置1210にユニークなBgl II部位を含み、
従って、ORF−１によりコードされる仮想ポリペプチド
は細胞の感染又はウイルスの複製のための必須機能をも
たない。
に位置するオープンリーディングフレームであり、348
アミノ酸（配列番号２）のポリペプチドをコードし、β
−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子の挿入に使用される
ヌクレオチド位置1210にユニークなBgl II部位を含み、
従って、ORF−１によりコードされる仮想ポリペプチド
は細胞の感染又はウイルスの複製のための必須機能をも
たない。
ORF−２はヌクレオチド位置1460からヌクレオチド位
置3058（配列番号１）まで伸びており、532アミノ酸
（配列番号３）のポリペプチドをコードする。β−ガラ
クトシダーゼマーカー遺伝子を同様にこのORFのEcoR V
の部位の１つに挿入した。
置3058（配列番号１）まで伸びており、532アミノ酸
（配列番号３）のポリペプチドをコードする。β−ガラ
クトシダーゼマーカー遺伝子を同様にこのORFのEcoR V
の部位の１つに挿入した。
ORF−３は小さいオープンリーディングフレームであ
り、ORF−２以外の相で同定され、ORF−２と共通のヌク
レオチド配列を共有する。ORF−３はヌクレオチド位置3
055〜3357（配列番号１）に位置し、100アミノ酸（配列
番号４）のポリペプチドをコードする。β−ガラクトシ
ダーゼマーカー遺伝子の挿入のためにSpe I部位を選択
した。
り、ORF−２以外の相で同定され、ORF−２と共通のヌク
レオチド配列を共有する。ORF−３はヌクレオチド位置3
055〜3357（配列番号１）に位置し、100アミノ酸（配列
番号４）のポリペプチドをコードする。β−ガラクトシ
ダーゼマーカー遺伝子の挿入のためにSpe I部位を選択
した。
ORF−４はヌクレオチド位置3505からヌクレオチド位
置3963（配列番号１）まで伸びており、152アミノ酸
（配列番号５）のポリペプチドをコードする。
置3963（配列番号１）まで伸びており、152アミノ酸
（配列番号５）のポリペプチドをコードする。
ORF−５及びORF−６はいずれも内部反復配列に向かっ
て逆方向に翻訳される。ORF−５はヌクレオチド位置425
6〜4897に位置し、213アミノ酸（配列番号１に相補的な
配列番号６）のポリペプチドをコードするする。ORF−
６はヌクレオチド位置5138〜6142に位置し、334アミノ
酸（配列番号１に相補的な配列番号７）のポリペプチド
をコードする。
て逆方向に翻訳される。ORF−５はヌクレオチド位置425
6〜4897に位置し、213アミノ酸（配列番号１に相補的な
配列番号６）のポリペプチドをコードするする。ORF−
６はヌクレオチド位置5138〜6142に位置し、334アミノ
酸（配列番号１に相補的な配列番号７）のポリペプチド
をコードする。
生存可能なウイルスをもたらす異種β−ガラクトシダ
ーゼマーカー遺伝子を組み込みための挿入部位として57
37位（配列番号１、ORF−６）のSau3A部位も使用され、
従ってこの領域はウイルス感染及び複製に必須ではな
い。
ーゼマーカー遺伝子を組み込みための挿入部位として57
37位（配列番号１、ORF−６）のSau3A部位も使用され、
従ってこの領域はウイルス感染及び複製に必須ではな
い。
特に、本発明のFHV突然変異体を得るためにFHVに導入
される突然変異は上記に定義したような１以上のオープ
ンリーディングフレーム、好ましくはORF−1,ORF−2,OR
F−３及び／又はORF−６の内側に導入される。
される突然変異は上記に定義したような１以上のオープ
ンリーディングフレーム、好ましくはORF−1,ORF−2,OR
F−３及び／又はORF−６の内側に導入される。
ORF−１に突然変異を導入すると、FHV突然変異体の保
護特性をさほど悪化させずに生きたFHV突然変異体のビ
ルレンスを著しく低下できることが予測外にも判明し
た。この知見の結果、例えば上記に定義したような領域
に欠失又は挿入を導入することにより、ワクチン接種す
べき動物に口鼻経路であっても生形態で安全に投与し得
る弱毒化FHV突然変異対を得ることが可能になった。
護特性をさほど悪化させずに生きたFHV突然変異体のビ
ルレンスを著しく低下できることが予測外にも判明し
た。この知見の結果、例えば上記に定義したような領域
に欠失又は挿入を導入することにより、ワクチン接種す
べき動物に口鼻経路であっても生形態で安全に投与し得
る弱毒化FHV突然変異対を得ることが可能になった。
FHVゲノムのDNA配列には個々のFHVウイルス間に自然
の変異が存在し得ることが理解されよう。これらの変異
は１以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、逆位又は
付加をもたらし得る。これらのFHV変異体は、本明細書
中に開示するORFとは異なる対応するORFをコードし得
る。このような変異ORFのDNA配列は、配列番号１のDNA
配列とのハイブリダイゼーションや、当該ORFを含む類
似領域を位置決定するように物理的地図を比較するなど
数種の方法により位置決定され得る。従って本発明は、
上記に定義したような突然変異を導入することが可能で
あり且つ任意のFHV株から取得可能なFHVゲノムのセクシ
ョンを提供する。
の変異が存在し得ることが理解されよう。これらの変異
は１以上のヌクレオチドの欠失、置換、挿入、逆位又は
付加をもたらし得る。これらのFHV変異体は、本明細書
中に開示するORFとは異なる対応するORFをコードし得
る。このような変異ORFのDNA配列は、配列番号１のDNA
配列とのハイブリダイゼーションや、当該ORFを含む類
似領域を位置決定するように物理的地図を比較するなど
数種の方法により位置決定され得る。従って本発明は、
上記に定義したような突然変異を導入することが可能で
あり且つ任意のFHV株から取得可能なFHVゲノムのセクシ
ョンを提供する。
更に、遺伝子工学技術を使用して上記変異を誘導し、
その結果として上記セクションのDNA配列に関連するDNA
配列を得ることも可能である。当然のことならが、この
ような関連DNA配列により特徴付けられるFHVゲノムの前
記セクションに組み込まれた突然変異体を含むFHV突然
変異体も本発明の範囲内に含まれる。
その結果として上記セクションのDNA配列に関連するDNA
配列を得ることも可能である。当然のことならが、この
ような関連DNA配列により特徴付けられるFHVゲノムの前
記セクションに組み込まれた突然変異体を含むFHV突然
変異体も本発明の範囲内に含まれる。
本発明の好適態様によると、突然変異がFHVゲノムへ
異種DNA配列の挿入からなるFHV突然変異体が提供され
る。
異種DNA配列の挿入からなるFHV突然変異体が提供され
る。
FHVゲノムに組み込まれる異種DNA配列は、ターゲット
ORFによりコードされるポリペプチドと異なるポリペプ
チドをコードするか又は非コーディングDNA配列に相当
するDNA配列であり、上記ORFからの遺伝子産物の発現を
妨げるのに適切なオリゴヌクレオチドを含む任意の源
（例えばウイルス、真核生物、原核生物又は合成源）か
ら誘導され得る。
ORFによりコードされるポリペプチドと異なるポリペプ
チドをコードするか又は非コーディングDNA配列に相当
するDNA配列であり、上記ORFからの遺伝子産物の発現を
妨げるのに適切なオリゴヌクレオチドを含む任意の源
（例えばウイルス、真核生物、原核生物又は合成源）か
ら誘導され得る。
このような適切なオリゴヌクレオチドは、第２の異種
DNA配列の挿入に有用な１以上の適切な制限酵素開裂部
位以外に、可能な読み枠の各々で両方向に３個の翻訳停
止コドンを含み得る。
DNA配列の挿入に有用な１以上の適切な制限酵素開裂部
位以外に、可能な読み枠の各々で両方向に３個の翻訳停
止コドンを含み得る。
特に、異種DNA配列は保護免疫応答を誘発することが
可能なネコ種の重要な病原体の抗原をコードし、該抗原
は宿主細胞中で複製後に本発明のFHV突然変異体により
発現される。
可能なネコ種の重要な病原体の抗原をコードし、該抗原
は宿主細胞中で複製後に本発明のFHV突然変異体により
発現される。
好ましくは、本明細書中に開示するFHVゲノムのセク
ションに組み込むDNA配列としては、ネコ白血病ウイル
ス、ネコ免疫不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネ
コパルボウイルス、ネココロナウイルス及びネコクラミ
ジアの抗原をコードするDNA配列が予想される。
ションに組み込むDNA配列としては、ネコ白血病ウイル
ス、ネコ免疫不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネ
コパルボウイルス、ネココロナウイルス及びネコクラミ
ジアの抗原をコードするDNA配列が予想される。
更に、医薬又は診断用ポリペプチド、特に例えばリン
フォカイン、インターフェロン又はサイトカインのよう
な免疫調節材をコードする核酸配列を前記セクションに
組み込んでもよい。
フォカイン、インターフェロン又はサイトカインのよう
な免疫調節材をコードする核酸配列を前記セクションに
組み込んでもよい。
更に、本明細書中に開示するオープンリーディングフ
レームは必須機能を示さないので、これらの領域の１以
上を部分的又は完全に欠失させて夫々のオープンリーデ
ィングフレームの抗原性又は機能性遺伝子産物を発現さ
せないようにし、所望によりその後、異種DNA配列を欠
失部位に組み込んでもよい。
レームは必須機能を示さないので、これらの領域の１以
上を部分的又は完全に欠失させて夫々のオープンリーデ
ィングフレームの抗原性又は機能性遺伝子産物を発現さ
せないようにし、所望によりその後、異種DNA配列を欠
失部位に組み込んでもよい。
本発明のFHV突然変異体により異種DNA配列を発現させ
るために必須条件は、異種DNA配列に適切なプロモータ
ーが作動的に結合していることである。当業者に自明の
通り、プロモーターは、FHV突然変異体に感染した細胞
中に遺伝子転写を誘導し得る任意の真核生物、原核生物
又はウイルスプロモーターから選択することができ、例
えばレトロウイルスLTRのプロモーター（Gormanら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 79,6777−6781,1982）、SV40プ
ロモーター（Mulligan及びBerg,Science 209,1422−14
27,1980）又はサイトメガロウイルシタンパク質合成前
プロモーター（Schaffnerら,Cell 41,521−530,1985）
から選択することができる。
るために必須条件は、異種DNA配列に適切なプロモータ
ーが作動的に結合していることである。当業者に自明の
通り、プロモーターは、FHV突然変異体に感染した細胞
中に遺伝子転写を誘導し得る任意の真核生物、原核生物
又はウイルスプロモーターから選択することができ、例
えばレトロウイルスLTRのプロモーター（Gormanら,Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 79,6777−6781,1982）、SV40プ
ロモーター（Mulligan及びBerg,Science 209,1422−14
27,1980）又はサイトメガロウイルシタンパク質合成前
プロモーター（Schaffnerら,Cell 41,521−530,1985）
から選択することができる。
FHVゲノムに異種DNA配列を導入するためにはin vivo
相同組換え技術を使用することができる。このために
は、まずFHVゲノムDNAとの組換えのための組換えDNA分
子を構築する。このような分子は任意の適切なプラスミ
ド、コスミド又はファージ、最適にはプラスミドから誘
導され得、所望によりプロモーターと作動的に結合した
異種DNA配列を含む。本明細書中に定義するようなFHVゲ
ノムの非必須セクションの全部又は一部を含むゲノムFH
V DNAのフラグメントに前記DNA配列及びプロモーター
を導入し、組換えDNA分子にサブクローニングする。
相同組換え技術を使用することができる。このために
は、まずFHVゲノムDNAとの組換えのための組換えDNA分
子を構築する。このような分子は任意の適切なプラスミ
ド、コスミド又はファージ、最適にはプラスミドから誘
導され得、所望によりプロモーターと作動的に結合した
異種DNA配列を含む。本明細書中に定義するようなFHVゲ
ノムの非必須セクションの全部又は一部を含むゲノムFH
V DNAのフラグメントに前記DNA配列及びプロモーター
を導入し、組換えDNA分子にサブクローニングする。
異種DNA配列の両端のこれらの所謂挿入領域配列は、F
HVウイルスゲノムとin vivo相同組換えが可能なよう
に、例えば50〜3000bpの適当な長さを有するべきであ
る。所望であれば、同一又は異なる病原体に由来し且つ
本明細書中に定義するFHVの挿入領域配列を両端に有す
る２種以上の異なる異種DNA配列を含む構築物を作成し
てもよい。このような組換えDNA分子を利用して２種以
上の異なる抗原性ポリペプチドを発現する組換えFHVを
製造し、多価ワクチンを提供することができる。
HVウイルスゲノムとin vivo相同組換えが可能なよう
に、例えば50〜3000bpの適当な長さを有するべきであ
る。所望であれば、同一又は異なる病原体に由来し且つ
本明細書中に定義するFHVの挿入領域配列を両端に有す
る２種以上の異なる異種DNA配列を含む構築物を作成し
てもよい。このような組換えDNA分子を利用して２種以
上の異なる抗原性ポリペプチドを発現する組換えFHVを
製造し、多価ワクチンを提供することができる。
第２に、適切なFHV配列を両端に有する異種DNA配列を
含む組換えDNA分子の存在下で細胞（例えばネコ腎細胞
（CRFK）又はネコ胚細胞）をFHV DNAでトランスフェク
トし、組換えDNA分子中の挿入領域配列とFHVゲノム中の
挿入領域配列との間で組換えが行われるようにしてもよ
い。適切なフランキング挿入領域配列を両端に有する異
種DNA配列を含む核酸配列で感染細胞をトランスフェク
トすることにより、組換えを誘導することもできる。そ
の後、例えばハイブリダイゼーション、異種DNA配列と
共に同時に組込みされた遺伝子によりコードされる酵素
活性を検出するか又は組換えFHVにより免疫学的に発現
される抗原性異種ポリペプチドを検出することにより、
細胞培養物中で産生された組換えウイルス子孫を例えば
遺伝子型又は表現型により選択することができる。ネオ
マイシン、ゲンタマイシン又はミコフェノール酸のよう
な化合物に対する耐性に基づいてポジティブに組換えウ
イルスを選択することもできる。選択下組換えFHVを細
胞培養物中で大規模に培養した後、組換えFHVを含有す
る材料又は前記FHVにより発現された異種ポリペプチド
を収集する。
含む組換えDNA分子の存在下で細胞（例えばネコ腎細胞
（CRFK）又はネコ胚細胞）をFHV DNAでトランスフェク
トし、組換えDNA分子中の挿入領域配列とFHVゲノム中の
挿入領域配列との間で組換えが行われるようにしてもよ
い。適切なフランキング挿入領域配列を両端に有する異
種DNA配列を含む核酸配列で感染細胞をトランスフェク
トすることにより、組換えを誘導することもできる。そ
の後、例えばハイブリダイゼーション、異種DNA配列と
共に同時に組込みされた遺伝子によりコードされる酵素
活性を検出するか又は組換えFHVにより免疫学的に発現
される抗原性異種ポリペプチドを検出することにより、
細胞培養物中で産生された組換えウイルス子孫を例えば
遺伝子型又は表現型により選択することができる。ネオ
マイシン、ゲンタマイシン又はミコフェノール酸のよう
な化合物に対する耐性に基づいてポジティブに組換えウ
イルスを選択することもできる。選択下組換えFHVを細
胞培養物中で大規模に培養した後、組換えFHVを含有す
る材料又は前記FHVにより発現された異種ポリペプチド
を収集する。
本発明による欠失変異体が所望される場合には、in
vivo相同組換え技術により上記ウイルスゲノムからの領
域を部分的又は完全に欠失させることができる。
vivo相同組換え技術により上記ウイルスゲノムからの領
域を部分的又は完全に欠失させることができる。
まず、配列番号１に示したユニークな短配列の一部を
含み且つ少なくとも100個のヌクレオチドを両端に有す
るDNAフラグメントを適当なプラスミドベクターにサブ
クローニングする。
含み且つ少なくとも100個のヌクレオチドを両端に有す
るDNAフラグメントを適当なプラスミドベクターにサブ
クローニングする。
上記領域に導入すべき欠失を上記プラスミド中に形成
するには、オープンリーディングフレーム内又はその近
傍に適正に位置付けられた部位で１種以上の酵素で制限
消化する。残りのプラスミド分子を再環化すると、新規
同定された領域内に存在するコーディング配列の少なく
とも一部を欠失する誘導体が形成される。あるいは、オ
ープンリーディングフレームの配列内に存在する制限部
位内から出発する漸進的欠失を１又は２方向に導入して
もよい。この目的のためには、Bal Iやエンドヌクレア
ーゼIIIといった酵素を使用することができる。再環化
されたプラスミド分子を大腸菌細胞に形質転換し、個々
のコロニーを制限マッピングにより分析し、指定領域に
導入された欠失の寸法を決定する。欠失の正確な位置付
けは配列解析により得られる。定義された欠失を含むプ
ラスミドをFHVウイルスDNAと共に培養ネコ細胞に同時に
トランスフェクトしてもよい。in vivo組換え後、ウイ
ルスゲノムの上記領域内の適正位置に欠失が導入され
る。ウイルス子孫中の組換え体は例えば、最初に欠失を
導入した接合部に生成されるヌクレオチド配列と特異的
にハイブリダイズする15〜20塩基長の合成オリゴマーに
より同定され得る。
するには、オープンリーディングフレーム内又はその近
傍に適正に位置付けられた部位で１種以上の酵素で制限
消化する。残りのプラスミド分子を再環化すると、新規
同定された領域内に存在するコーディング配列の少なく
とも一部を欠失する誘導体が形成される。あるいは、オ
ープンリーディングフレームの配列内に存在する制限部
位内から出発する漸進的欠失を１又は２方向に導入して
もよい。この目的のためには、Bal Iやエンドヌクレア
ーゼIIIといった酵素を使用することができる。再環化
されたプラスミド分子を大腸菌細胞に形質転換し、個々
のコロニーを制限マッピングにより分析し、指定領域に
導入された欠失の寸法を決定する。欠失の正確な位置付
けは配列解析により得られる。定義された欠失を含むプ
ラスミドをFHVウイルスDNAと共に培養ネコ細胞に同時に
トランスフェクトしてもよい。in vivo組換え後、ウイ
ルスゲノムの上記領域内の適正位置に欠失が導入され
る。ウイルス子孫中の組換え体は例えば、最初に欠失を
導入した接合部に生成されるヌクレオチド配列と特異的
にハイブリダイズする15〜20塩基長の合成オリゴマーに
より同定され得る。
本発明により生きたFHV突然変異体、特に特定病原体
に由来する１種以上の異なる異種ポリペプチドを発現さ
せる生きたFHVは、動物、特に家畜及び家畜以外のネコ
科及びイヌ科種にワクチン接種するために使用すること
ができる。このような生ベクターワクチンの接種後、好
ましくはFHV突然変異体は接種宿主内で複製され、FHVポ
リペプチドと共に異種ポリペプチドをin vivoで発現す
る。接種宿主で発現されたポリペプチドはこうして、FH
Vと特定病原体の両方に対する免疫応答を誘発する。特
定病原体に由来する異種ポリペプチドが感染防御免疫応
答を刺激し得る場合、本来のFHV突然変異体を接種した
動物は、当該病原体による事後感染及びFHV感染に対し
て免疫性となる。即ち、本発明のFHVゲノムの挿入領域
に組み込まれた異種核酸配列はin vivoで連続的に発現
され得、病原体に対して確実で、安全で且つ長期的な免
疫を提供する。
に由来する１種以上の異なる異種ポリペプチドを発現さ
せる生きたFHVは、動物、特に家畜及び家畜以外のネコ
科及びイヌ科種にワクチン接種するために使用すること
ができる。このような生ベクターワクチンの接種後、好
ましくはFHV突然変異体は接種宿主内で複製され、FHVポ
リペプチドと共に異種ポリペプチドをin vivoで発現す
る。接種宿主で発現されたポリペプチドはこうして、FH
Vと特定病原体の両方に対する免疫応答を誘発する。特
定病原体に由来する異種ポリペプチドが感染防御免疫応
答を刺激し得る場合、本来のFHV突然変異体を接種した
動物は、当該病原体による事後感染及びFHV感染に対し
て免疫性となる。即ち、本発明のFHVゲノムの挿入領域
に組み込まれた異種核酸配列はin vivoで連続的に発現
され得、病原体に対して確実で、安全で且つ長期的な免
疫を提供する。
１種以上の異なる異種ポリペプチドを含有及び発現す
る本発明のFHV突然変異体は、一価又は多価ワクチンと
して機能し得る。
る本発明のFHV突然変異体は、一価又は多価ワクチンと
して機能し得る。
生ワクチンを製造するには、本発明の組換えFHV突然
変異体をネコ起源の細胞培養物上で成長させる。組織細
胞培養液及び／又は細胞を収集することにより、こうし
て成長したウイルスを回収する。生ワクチンは懸濁液の
形態で製造してもよいし、あるいは凍結乾燥してもよ
い。
変異体をネコ起源の細胞培養物上で成長させる。組織細
胞培養液及び／又は細胞を収集することにより、こうし
て成長したウイルスを回収する。生ワクチンは懸濁液の
形態で製造してもよいし、あるいは凍結乾燥してもよ
い。
ワクチンは、免疫学的有効量の組換えFHV以外に医薬
的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤も包含し得る。
的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤も包含し得る。
本発明で有用な医薬的に許容可能なキャリヤー又は希
釈剤の例としては、安定剤（例えばSPGA）、炭水化物
（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロー
ス、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えば
アルブミンやカゼイン）、タンパク質含有物質（例えば
ウシ血清や脱脂乳）、及び緩衝液（例えばリン酸塩緩衝
液）が挙げられる。
釈剤の例としては、安定剤（例えばSPGA）、炭水化物
（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、スクロー
ス、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例えば
アルブミンやカゼイン）、タンパク質含有物質（例えば
ウシ血清や脱脂乳）、及び緩衝液（例えばリン酸塩緩衝
液）が挙げられる。
場合により、アジュバント活性を有する１種以上の化
合物をワクチンに添加してもよい。適切なアジュバント
は、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、
酸化アルミニウム、油エマルジョン（例えばBayol Ｆ
（登録商標）又はMarcol 52（登録商標））、サポニン
又はビタミンＥ溶解物などである。
合物をワクチンに添加してもよい。適切なアジュバント
は、例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、
酸化アルミニウム、油エマルジョン（例えばBayol Ｆ
（登録商標）又はMarcol 52（登録商標））、サポニン
又はビタミンＥ溶解物などである。
有用な用量は年齢、体重、投与法及びワクチン接種が
所望される病原体の型により異なる。適切な用量は、例
えば約103.0〜107.0pfu/匹であり得る。
所望される病原体の型により異なる。適切な用量は、例
えば約103.0〜107.0pfu/匹であり得る。
本発明のFHV突然変異体は不活化ワクチンの製造にも
利用することができる。
利用することができる。
動物に投与する場合、本発明によるFHV突然変異体は
特に鼻腔内、皮内、皮下又は筋肉内投与され得る。
特に鼻腔内、皮内、皮下又は筋肉内投与され得る。
本発明は更に、本発明のFHV突然変異体により発現さ
れる異種ポリペプチドを含むサブユニットワクチン、医
薬製剤及び診断用製剤にも係る。このためには、異種ポ
リペプチドの発現を促進する条件下で前記FHVに感染し
た細胞を培養する。異種ポリペプチドをその後、所期用
途に応じてある程度まで常法により精製し、更に処理し
て免疫活性、治療活性又は診断活性を有する製剤を得
る。
れる異種ポリペプチドを含むサブユニットワクチン、医
薬製剤及び診断用製剤にも係る。このためには、異種ポ
リペプチドの発現を促進する条件下で前記FHVに感染し
た細胞を培養する。異種ポリペプチドをその後、所期用
途に応じてある程度まで常法により精製し、更に処理し
て免疫活性、治療活性又は診断活性を有する製剤を得
る。
特定病原体に対する上記能動免疫感作は、健康な動物
への感染防御処置として適用され得る。抗原性ポリペプ
チドをコードする特定病原体に由来する異種遺伝子を含
む本発明のFHV突然変異体により誘発された抗体を含む
抗血清を用いて、既に該特定病原体に感染した動物を治
療できることは言うまでもない。本発明の組換えFHVに
対する抗血清は、適当な免疫応答を誘発するために有効
な量の前記FHV突然変異体で動物（例えばネコ）を免疫
感作することにより製造され得る。その後、動物から採
血して抗血清を製造することができる。
への感染防御処置として適用され得る。抗原性ポリペプ
チドをコードする特定病原体に由来する異種遺伝子を含
む本発明のFHV突然変異体により誘発された抗体を含む
抗血清を用いて、既に該特定病原体に感染した動物を治
療できることは言うまでもない。本発明の組換えFHVに
対する抗血清は、適当な免疫応答を誘発するために有効
な量の前記FHV突然変異体で動物（例えばネコ）を免疫
感作することにより製造され得る。その後、動物から採
血して抗血清を製造することができる。
本発明の別の目的は、FHV慣性に対するネコ種の免疫
感作用ワクチンの製造及び診断試験の準備に適用可能な
FHVポリペプチドをコードする核酸配列を提供すること
である。
感作用ワクチンの製造及び診断試験の準備に適用可能な
FHVポリペプチドをコードする核酸配列を提供すること
である。
このような核酸配列は、夫々配列番号２及び３に示す
ようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ORF−１又はOFR−２の少なくとも一部を含むことを特徴
とする。
ようなアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする
ORF−１又はOFR−２の少なくとも一部を含むことを特徴
とする。
好ましくは、核酸配列は夫々ヌクレオチド位置127〜1
281及び1460〜3058（配列番号１）に位置するヌクレオ
チド配列を有するORF−１又はORF−２のDNA配列の少な
くとも一部を含む。
281及び1460〜3058（配列番号１）に位置するヌクレオ
チド配列を有するORF−１又はORF−２のDNA配列の少な
くとも一部を含む。
本発明の核酸配列は、天然では該配列が会合又は結合
しない種々の複製実施DNA配列と連結することができ、
このようなDNA配列は、場合によりβ−ガラクトシダー
ゼのような融合タンパク質配列をコードするDNAの部分
を含み、こうして適切な原核又は真核生成物宿主の形質
転換に使用可能な所謂組換えDNA分子を生成する。この
ようなハイブリッドDNA分子は好ましくは、例えばプラ
スミド又はバクテリオファージ、コスミドもしくはウイ
ルス中に存在する核酸配列から誘導される。
しない種々の複製実施DNA配列と連結することができ、
このようなDNA配列は、場合によりβ−ガラクトシダー
ゼのような融合タンパク質配列をコードするDNAの部分
を含み、こうして適切な原核又は真核生成物宿主の形質
転換に使用可能な所謂組換えDNA分子を生成する。この
ようなハイブリッドDNA分子は好ましくは、例えばプラ
スミド又はバクテリオファージ、コスミドもしくはウイ
ルス中に存在する核酸配列から誘導される。
一般に、本発明で有用なベクターを構築するのにDNA
配列をクローニングするためには原核生物が好適であ
る。例えば、大腸菌K12が特に有用である。例えばDH5α
又はJM101のような他の大腸菌株も使用できる。
配列をクローニングするためには原核生物が好適であ
る。例えば、大腸菌K12が特に有用である。例えばDH5α
又はJM101のような他の大腸菌株も使用できる。
発現のためには、本発明の核酸配列を発現制御配列に
作動的に連結する。このような制御配列はプロモータ
ー、エンハンサー、オペレーター及びリボソーム結合部
位を含み得る。
作動的に連結する。このような制御配列はプロモータ
ー、エンハンサー、オペレーター及びリボソーム結合部
位を含み得る。
本発明は更に、配列番号２及び３に夫々示すようなア
ミノ酸配列を有するORF−１又はORF−２によりコードさ
れるポリペプチドの免疫学的特徴を示すポリペプチドを
含み、即ち、該ポリペプチドは該ポリペプチドが通常会
合する完全ウイルス又は他のタンパク質を本質的に含ま
ないORF−１又はORF−２によりコードされるポリペプチ
ドの１種以上の免疫反応性及び／又は抗原決定基を含
む。
ミノ酸配列を有するORF−１又はORF−２によりコードさ
れるポリペプチドの免疫学的特徴を示すポリペプチドを
含み、即ち、該ポリペプチドは該ポリペプチドが通常会
合する完全ウイルス又は他のタンパク質を本質的に含ま
ないORF−１又はORF−２によりコードされるポリペプチ
ドの１種以上の免疫反応性及び／又は抗原決定基を含
む。
FHV感染に対するネコの免疫感作は例えば、免疫学的
に該当する範囲での本発明のポリペプチドを所謂サブユ
ニットワクチンとして動物に投与することにより達せら
れる。
に該当する範囲での本発明のポリペプチドを所謂サブユ
ニットワクチンとして動物に投与することにより達せら
れる。
サブユニットワクチンの代わりに生ベクターワクチン
を使用してもよい。本発明の核酸配列は、組換え微生物
がなおも複製することができ、挿入核酸配列によりコー
ドされるポリペプチドを発現できるように、組換えDNA
技術により微生物（例えば細菌又はウイルス）に導入さ
れる。
を使用してもよい。本発明の核酸配列は、組換え微生物
がなおも複製することができ、挿入核酸配列によりコー
ドされるポリペプチドを発現できるように、組換えDNA
技術により微生物（例えば細菌又はウイルス）に導入さ
れる。
上記ORF1又は２によりコードされるFHVポリペプチド
を使用して、ポリクローナル、単一特異性及びモノクロ
ーナルの抗体を製造することができる。本発明のポリペ
プチドに対する抗体又は抗血清は、受動免疫療法、診断
イムノアッセイ及び抗イディオタイプ抗体の製造に使用
することができる。
を使用して、ポリクローナル、単一特異性及びモノクロ
ーナルの抗体を製造することができる。本発明のポリペ
プチドに対する抗体又は抗血清は、受動免疫療法、診断
イムノアッセイ及び抗イディオタイプ抗体の製造に使用
することができる。
本発明は更に、本発明のポリペプチドの少なくとも１
種又はその抗原フラグメントを含む「免疫化学試薬」に
も係る。
種又はその抗原フラグメントを含む「免疫化学試薬」に
も係る。
「免疫化学試薬」なる用語は、本発明のポリペプチド
が適切な支持体に結合されているか又は標識物質を備え
ていることを意味する。
が適切な支持体に結合されているか又は標識物質を備え
ていることを意味する。
実施例１
FHVゲノムのユニークな短配列における新規挿入領域の
特徴付け。
特徴付け。
−FHV DNAの調製及びλベクターEMBL4におけるゲノム
ライブラリーの樹立。
ライブラリーの樹立。
トリプトース2.0g/l、ラクトアルブミン水解物2.5g/l
及びウシ胎児血清５％を補充したグラスゴーの変形最少
必須培地中で、Crandell−Reesネコ腎臓（CRFK）細胞
（Crandell,R.A.ら,In Vitro ９,176−185,1973）上
でFHV−１のワクチン株（ネコ鼻気管炎ウイルス、G2620
株としてオランダ、Intervet International B.V.か
らの市販品）を成長させた。十分な細胞変性効果が生じ
た後に細胞上清を回収し、ポリエチレングリコール沈殿
によりウイルスを濃縮した（Yamamoto,K.R.ら,Virology
40,734−744,1970）。20mM Tris−HCl（pH7.5）、10
mM EDTA及び0.5％SDSを含有する緩衝液中で100μg/ml
プロテイナーゼＫ（Promega,Wisconsin,米国）で37℃で
２時間消化することによりDNAをウイルス粒子から遊離
させた。フェノール／クロロホルム1:1混合物で繰り返
し抽出後、核酸を２倍容量のエタノールで沈殿させ、TE
（10mM Tris−HCl,pH7.5,1mM EDTA）に溶解させた。
酵素製造業者により推奨される条件に従ってウイルスDN
Aを制限酵素Sau3A（Promega,Wisconsin,米国）で部分消
化し、反応生成物を分取用0.8％アガロースゲル上で分
離した。
及びウシ胎児血清５％を補充したグラスゴーの変形最少
必須培地中で、Crandell−Reesネコ腎臓（CRFK）細胞
（Crandell,R.A.ら,In Vitro ９,176−185,1973）上
でFHV−１のワクチン株（ネコ鼻気管炎ウイルス、G2620
株としてオランダ、Intervet International B.V.か
らの市販品）を成長させた。十分な細胞変性効果が生じ
た後に細胞上清を回収し、ポリエチレングリコール沈殿
によりウイルスを濃縮した（Yamamoto,K.R.ら,Virology
40,734−744,1970）。20mM Tris−HCl（pH7.5）、10
mM EDTA及び0.5％SDSを含有する緩衝液中で100μg/ml
プロテイナーゼＫ（Promega,Wisconsin,米国）で37℃で
２時間消化することによりDNAをウイルス粒子から遊離
させた。フェノール／クロロホルム1:1混合物で繰り返
し抽出後、核酸を２倍容量のエタノールで沈殿させ、TE
（10mM Tris−HCl,pH7.5,1mM EDTA）に溶解させた。
酵素製造業者により推奨される条件に従ってウイルスDN
Aを制限酵素Sau3A（Promega,Wisconsin,米国）で部分消
化し、反応生成物を分取用0.8％アガロースゲル上で分
離した。
10〜15kbのサイズフラクションのフラグメントを単離
し、BamH I及びSal Iで消化したバクテリオファージλE
MBL4からのDNAと２時間15℃で連結した（Kaiser,K.及び
Murray,N.“DNA Cloning",第１巻、第１章、IRL Pres
s,1985）。反応生成物をin vitroパッケージングし（P
romega,Wisconsin,米国）、組換えファージを大腸菌宿
主株LE392上にプレートした。Sal Iで消化したFHVゲノ
ムDNAの分取用アガロースゲル電気泳動により単離した1
0〜15kb制限フラグメントから構成される32P標識DNAプ
ローブでニトロセルロースレプリカフィルターをスクリ
ーニングすることによりλEMBL4中のライブラリーを集
積し、ウイルスゲノムの比較的大きいSal I制限フラグ
メント中の特異的に存在する配列を有するインサートを
含む組換え体を得た（技術的詳細についてはSmabrook,
J.ら，“Molecular Cloning:A laboratory manual",
第２章,Cold Spring Harbor Laboratory Press,198
9を参照されたい）。これらのスクリーニング手順から
得た個々の組換え体を増幅し、λインサートDNAの制限
パターンを完全FHVゲノムの公知地図（Grail A.ら,Arc
h.Virol.,116,209−220,1991）と比較した。更に検討す
るために単離株の１つλFHV04を選択し、このクローン
の13.5kbインサート（図１参照）を前出のgrailらの地
図上の単位0.87〜0.96のウイルスゲノムのユニークな短
セグメント中に位置付けした。
し、BamH I及びSal Iで消化したバクテリオファージλE
MBL4からのDNAと２時間15℃で連結した（Kaiser,K.及び
Murray,N.“DNA Cloning",第１巻、第１章、IRL Pres
s,1985）。反応生成物をin vitroパッケージングし（P
romega,Wisconsin,米国）、組換えファージを大腸菌宿
主株LE392上にプレートした。Sal Iで消化したFHVゲノ
ムDNAの分取用アガロースゲル電気泳動により単離した1
0〜15kb制限フラグメントから構成される32P標識DNAプ
ローブでニトロセルロースレプリカフィルターをスクリ
ーニングすることによりλEMBL4中のライブラリーを集
積し、ウイルスゲノムの比較的大きいSal I制限フラグ
メント中の特異的に存在する配列を有するインサートを
含む組換え体を得た（技術的詳細についてはSmabrook,
J.ら，“Molecular Cloning:A laboratory manual",
第２章,Cold Spring Harbor Laboratory Press,198
9を参照されたい）。これらのスクリーニング手順から
得た個々の組換え体を増幅し、λインサートDNAの制限
パターンを完全FHVゲノムの公知地図（Grail A.ら,Arc
h.Virol.,116,209−220,1991）と比較した。更に検討す
るために単離株の１つλFHV04を選択し、このクローン
の13.5kbインサート（図１参照）を前出のgrailらの地
図上の単位0.87〜0.96のウイルスゲノムのユニークな短
セグメント中に位置付けした。
実施例２
FHVのユニークな短ゲノムセグメントの制限部位におけ
るマーカー遺伝子の挿入。
るマーカー遺伝子の挿入。
λFHV04の4.8kb Sac IフラグメントをpGEM3Zにサブ
クローニングし、pFHV13（図2A参照）を形成した処、マ
ーカー遺伝子の組み込みに適切な位置にユニークなBgl
II制限部位があることが判明した。挿入に使用した遺伝
子はpCH110（Pharmacia,Uppsala,スウェーデン）から、
SV40複製起点の近傍の72bp Sph Iフラグメントを、Bam
H IおよびSal Iの両方の認識配列と、DNAをSph Iで消化
後に生成される末端に適合可能な一重鎖末端とを含む12
塩基二重鎖合成オリゴヌクレオチドにより置換して誘導
した。
クローニングし、pFHV13（図2A参照）を形成した処、マ
ーカー遺伝子の組み込みに適切な位置にユニークなBgl
II制限部位があることが判明した。挿入に使用した遺伝
子はpCH110（Pharmacia,Uppsala,スウェーデン）から、
SV40複製起点の近傍の72bp Sph Iフラグメントを、Bam
H IおよびSal Iの両方の認識配列と、DNAをSph Iで消化
後に生成される末端に適合可能な一重鎖末端とを含む12
塩基二重鎖合成オリゴヌクレオチドにより置換して誘導
した。
pCH110の２つのSph I制限部位の間にリンカーを挿入
すると、いずれの部位にもSph Iの認識配列は復元され
ず、SV40所期プロモーターの上流にBamH I及びSal I部
位が生成される。次いでBamH Iで消化して4.0kbβ−ガ
ラクトシダーゼ発現カセットを生成し、pFHV13のBgl II
部位に挿入してpFHV19を得た（図2B参照）。プラスミド
pFHV19の線形化DNAをリン酸カルシウム媒介DNA沈殿（gr
aham,F.L.およびv.d.Eb,A.J.,Virology 52,456−467,1
973）によりウイルスDNAと共にCRFK細胞に導入した。pF
HV19からのDNA1μｇを最終容量376μｌのH2O中でFHV感
染細胞からのDNA15μｇと混合し、２×HBSP（10mM KC
l,280mM NaCl,12mMグルコース、1.5mM Na2HPO4,50mM
HEPES,pH7.0）500μｌに加えた。1M CaCl2溶液124μ
ｌを漸次加え、混合物を室温で30分間インキュベートす
ることにより沈殿を形成した。
すると、いずれの部位にもSph Iの認識配列は復元され
ず、SV40所期プロモーターの上流にBamH I及びSal I部
位が生成される。次いでBamH Iで消化して4.0kbβ−ガ
ラクトシダーゼ発現カセットを生成し、pFHV13のBgl II
部位に挿入してpFHV19を得た（図2B参照）。プラスミド
pFHV19の線形化DNAをリン酸カルシウム媒介DNA沈殿（gr
aham,F.L.およびv.d.Eb,A.J.,Virology 52,456−467,1
973）によりウイルスDNAと共にCRFK細胞に導入した。pF
HV19からのDNA1μｇを最終容量376μｌのH2O中でFHV感
染細胞からのDNA15μｇと混合し、２×HBSP（10mM KC
l,280mM NaCl,12mMグルコース、1.5mM Na2HPO4,50mM
HEPES,pH7.0）500μｌに加えた。1M CaCl2溶液124μ
ｌを漸次加え、混合物を室温で30分間インキュベートす
ることにより沈殿を形成した。
培養培地5ml中にCRFK細胞の半集密的単層を各々収容
する２つのφ6cmの皿に沈殿DNAの懸濁液を静かに加え
た。５時間後、培地を除去し、15％グリセロールを含有
するHBSP5mlを細胞に重層した。１〜２分間インキュベ
ーション後、溶液を除去し、細胞を培地で洗い、皿を培
養培地中0.75％アガロースの上層と共にインキュベート
した。３〜４日後、細胞変性効果が現れ始めたら、最終
濃度0.2mg/mlの基質Bluogal（Gibco−BRL,Maryland,米
国）を含有する第２のアガロース上層を加え、青色のプ
ラークが検出されるまでプレートをインキュベートし
た。陽性プラークを肉眼的に釣菌し、新鮮なCRFK細胞を
含むフラスコに移し、ウイルスを増幅した。組換えウイ
ルスの均質なストックが樹立されるまでプレート培養手
順及びプラーク単離を続けた。最終調製物からのウイル
ス材料を使用してサザンブロッティングによりウイルス
ゲノムを詳細に分析すると共に、動物ワクチン接種実験
を行った。
する２つのφ6cmの皿に沈殿DNAの懸濁液を静かに加え
た。５時間後、培地を除去し、15％グリセロールを含有
するHBSP5mlを細胞に重層した。１〜２分間インキュベ
ーション後、溶液を除去し、細胞を培地で洗い、皿を培
養培地中0.75％アガロースの上層と共にインキュベート
した。３〜４日後、細胞変性効果が現れ始めたら、最終
濃度0.2mg/mlの基質Bluogal（Gibco−BRL,Maryland,米
国）を含有する第２のアガロース上層を加え、青色のプ
ラークが検出されるまでプレートをインキュベートし
た。陽性プラークを肉眼的に釣菌し、新鮮なCRFK細胞を
含むフラスコに移し、ウイルスを増幅した。組換えウイ
ルスの均質なストックが樹立されるまでプレート培養手
順及びプラーク単離を続けた。最終調製物からのウイル
ス材料を使用してサザンブロッティングによりウイルス
ゲノムを詳細に分析すると共に、動物ワクチン接種実験
を行った。
pFHV13中に存在するようなBgl II部位に挿入されたβ
−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含む組換えFHV
は、CRFK細胞上の組織培養物中で連続継代後も安定的で
あることが判明した。
−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含む組換えFHV
は、CRFK細胞上の組織培養物中で連続継代後も安定的で
あることが判明した。
FHVゲノムのユニークな短セグメントにおいてβ−ガ
ラクトシダーゼ遺伝子を挿入可能な第２の部位をλFHV0
4の5.2kb BamH I制限フラグメント中にマッピングし
た。pGEM3Z中にこのフラグメントを含むサブクローンを
pFHV10（図3A参照）と命名し、４塩基認識配列を有して
おり且つ酵素Bgl II又はBamH Iにより生成される末端に
適合可能な付着DNA末端を生成する制限酵素Sau3Aで部分
消化した。Sau3A制限消化物に臭化エチジウム10μg/ml
を加えることにより、線形化プラスミドDNAがより小さ
いフラグメントに消化しないようにした。
ラクトシダーゼ遺伝子を挿入可能な第２の部位をλFHV0
4の5.2kb BamH I制限フラグメント中にマッピングし
た。pGEM3Z中にこのフラグメントを含むサブクローンを
pFHV10（図3A参照）と命名し、４塩基認識配列を有して
おり且つ酵素Bgl II又はBamH Iにより生成される末端に
適合可能な付着DNA末端を生成する制限酵素Sau3Aで部分
消化した。Sau3A制限消化物に臭化エチジウム10μg/ml
を加えることにより、線形化プラスミドDNAがより小さ
いフラグメントに消化しないようにした。
pFHV10の全長7.9kbの線形化DNAを精製し、上記BamH I
β−ガラクトシダーゼ発現カセットと連結し、pFHV10の
Sau3A制限部位の１つにランダムに挿入されたマーカー
遺伝子を含む組換え体（λFH04に由来する5.2kb BamH
IインサートのSau3A部位の１つにマーカー遺伝子を含む
組換え体を含む）を得た。
β−ガラクトシダーゼ発現カセットと連結し、pFHV10の
Sau3A制限部位の１つにランダムに挿入されたマーカー
遺伝子を含む組換え体（λFH04に由来する5.2kb BamH
IインサートのSau3A部位の１つにマーカー遺伝子を含む
組換え体を含む）を得た。
この実験から選択した候補の１つは、図3Aに示すSau3
A部位に挿入されたマーカー遺伝子を含むことが判明し
た。
A部位に挿入されたマーカー遺伝子を含むことが判明し
た。
この構築物をpFHV23と命名し、このプラスミドのDNA
をpFHV19について上述したようにウイルスDNAと共にCRF
K細胞にトランスフェクトした。
をpFHV19について上述したようにウイルスDNAと共にCRF
K細胞にトランスフェクトした。
β−ガラクトシダーゼ活性を発現する組換えFHVをト
ランスフェクション子孫から検出することができ、これ
らのFHVを上記手順に従って精製した。従って、この場
合も図3Aに示すSau3A部位に対応するFHVゲノム中の位置
にDNAを挿入しても、ウイルス維持に必須の機能には支
障ない。
ランスフェクション子孫から検出することができ、これ
らのFHVを上記手順に従って精製した。従って、この場
合も図3Aに示すSau3A部位に対応するFHVゲノム中の位置
にDNAを挿入しても、ウイルス維持に必須の機能には支
障ない。
配列番号１に示す完全配列から詳細な制限地図を作成
し、該当するオープンリーディングフレームの正確な位
置をその近傍に示した。この結果として得られるグラフ
（図４）から明らかなように、ORF−２とORF−３の両方
の内側に正確に位置付けられた数個の制限部位が判明し
た。しかしながら、実施例２中で上述したβガラクトシ
ダーゼ発現カセットは両端にBamH I部位を有するので、
前記制限部位のいずれもマーカー遺伝子の挿入に直接使
用することはできなかった。従って、まず下記修飾を導
入する必要があった。以下の全操作にはプラスミドpFHV
10（図１及び3a参照）を選択した。第１段階では地図位
置5100と5300の間の0.2kb BamH I−Bgl IIフラグメン
ト（図3a参照）を除去し、焼く7.7kbの寸法を有する残
りの部分を再環化し、領域のこの部分に最初に存在して
いたBgl II及びBamH I部位の両方を除去した。この欠失
により、ただ１つのBamH I部位を含み且つBgl II部位を
含まないプラスミドpFHV40が形成された。配列番号１に
より定義される領域の内側の適切な位置にBgl II認識配
列AGATCTを含む合成二重鎖リンカー分子を挿入すること
により、pFHV40から誘導体を作成することができた。
し、該当するオープンリーディングフレームの正確な位
置をその近傍に示した。この結果として得られるグラフ
（図４）から明らかなように、ORF−２とORF−３の両方
の内側に正確に位置付けられた数個の制限部位が判明し
た。しかしながら、実施例２中で上述したβガラクトシ
ダーゼ発現カセットは両端にBamH I部位を有するので、
前記制限部位のいずれもマーカー遺伝子の挿入に直接使
用することはできなかった。従って、まず下記修飾を導
入する必要があった。以下の全操作にはプラスミドpFHV
10（図１及び3a参照）を選択した。第１段階では地図位
置5100と5300の間の0.2kb BamH I−Bgl IIフラグメン
ト（図3a参照）を除去し、焼く7.7kbの寸法を有する残
りの部分を再環化し、領域のこの部分に最初に存在して
いたBgl II及びBamH I部位の両方を除去した。この欠失
により、ただ１つのBamH I部位を含み且つBgl II部位を
含まないプラスミドpFHV40が形成された。配列番号１に
より定義される領域の内側の適切な位置にBgl II認識配
列AGATCTを含む合成二重鎖リンカー分子を挿入すること
により、pFHV40から誘導体を作成することができた。
夫々図５に示すようにORF−２及びORF−３に挿入でき
るように、EcoR V又はSpe Iのいずれかの制限部位に基
づいてこれらの位置の２つを選択した。即ち、実施例２
中でSau3Aについて上述した手順と同様に臭化エチジウ
ムの存在下で、配列及び制限消化物中の複数位置で両方
の酵素により切断し、分取用アガロースゲル電気泳動に
より精製可能な線形化全長プラスミドDNA分子の大部分
を生成した。EcoR Vの場合には平滑末端を有する合成Bg
l II−リンカーを使用し、Spe I消化DNAの場合にはCTAG
末端を含むBgl II−リンカーを使用してDNAを再環化し
た。
るように、EcoR V又はSpe Iのいずれかの制限部位に基
づいてこれらの位置の２つを選択した。即ち、実施例２
中でSau3Aについて上述した手順と同様に臭化エチジウ
ムの存在下で、配列及び制限消化物中の複数位置で両方
の酵素により切断し、分取用アガロースゲル電気泳動に
より精製可能な線形化全長プラスミドDNA分子の大部分
を生成した。EcoR Vの場合には平滑末端を有する合成Bg
l II−リンカーを使用し、Spe I消化DNAの場合にはCTAG
末端を含むBgl II−リンカーを使用してDNAを再環化し
た。
pFHV40中の適切な位置にBgl II部位が挿入されている
か否かを制限分析により確認した。次に、実施例２中で
上述したと同一の手順に従って、新たに生成されたBgl
II部位に、BamH I部位を両端に有するβ−ガラクトシダ
ーゼ発現カセットを挿入した。2.1kb（図４参照）に位
置付けられるEcoR Vに置換するBgl II部位を生成した後
にORF−２にマーカー遺伝子を挿入し、図5aに示すよう
な制限地図を有するpFHV60を得た。ORF−３の場合に
は、約3.1kbのSpe I位に新たに生成されたBgl II部位に
よりマーカー遺伝子を組み込んだ。
か否かを制限分析により確認した。次に、実施例２中で
上述したと同一の手順に従って、新たに生成されたBgl
II部位に、BamH I部位を両端に有するβ−ガラクトシダ
ーゼ発現カセットを挿入した。2.1kb（図４参照）に位
置付けられるEcoR Vに置換するBgl II部位を生成した後
にORF−２にマーカー遺伝子を挿入し、図5aに示すよう
な制限地図を有するpFHV60を得た。ORF−３の場合に
は、約3.1kbのSpe I位に新たに生成されたBgl II部位に
よりマーカー遺伝子を組み込んだ。
実施例２中で上述したように、pFHV60及びpFHV55の両
方のDNAをウイルスDNAと共にCRFK細胞に同時トランスフ
ェクトした。β−ガラクトシダーゼ活性を発現する組換
えFHVをBluogal染色により検出することができ、アガロ
ース重層を使用して単一プラーク単離によりウイルスを
回収した。組換えウイルスを細胞培養物中で数回継代培
養した処、pFHV60及びpFHV55に由来する構築物のいずれ
にも安定的に組み込まれたβはガラクトシダーゼマーカ
ー遺伝子を保持していることが判明した。
方のDNAをウイルスDNAと共にCRFK細胞に同時トランスフ
ェクトした。β−ガラクトシダーゼ活性を発現する組換
えFHVをBluogal染色により検出することができ、アガロ
ース重層を使用して単一プラーク単離によりウイルスを
回収した。組換えウイルスを細胞培養物中で数回継代培
養した処、pFHV60及びpFHV55に由来する構築物のいずれ
にも安定的に組み込まれたβはガラクトシダーゼマーカ
ー遺伝子を保持していることが判明した。
実施例３
FHVゲノムのユニークな短セグメントにおける挿入領域
の構造解析。
の構造解析。
図１に示す5.2kb BamH I及び4.8kb Sac I制限フラ
グメントの該当部分でヌクレオチド配列解析を行った。
グメントの該当部分でヌクレオチド配列解析を行った。
pGEM3Z又はpSP72（Promega,Wisconsin,米国）のいず
れかにλFHV04のフラグメントを両方向にサブクローニ
ングした。
れかにλFHV04のフラグメントを両方向にサブクローニ
ングした。
張り出した5'及び3'末端を生成する適切な制限酵素で
プラスミドDNAを二重消化後、酵素エキソヌクレアーゼI
II（Henikoff,S.,Gene 28,351−359,1984）を使用して
漸進的欠失を導入した。張り出した一重鎖3'末端の存在
により、プラスミドベクターDNAはエキソヌクレアーゼI
IIにより消化されなかった。反応混合物のサンプルを30
秒間隔で採取し、前出のHenikoffの方法に従って処理
し、再環化したDNA分子を生成し、コンピテント大腸菌
細胞に形質転換させた。個々のコロニーのミニ調製物か
らのプラスミドDNAを、元のフラグメントに導入された
欠失のサイズの制限マッピングにより分析した。T7ポリ
メラーゼ（Pharmacia,Uppsala,スウェーデン）を使用す
る鎖停止反応で二重鎖DNA上のヌクレオチド配列決定に
より、漸進的欠失を含む候補群を分析した。
プラスミドDNAを二重消化後、酵素エキソヌクレアーゼI
II（Henikoff,S.,Gene 28,351−359,1984）を使用して
漸進的欠失を導入した。張り出した一重鎖3'末端の存在
により、プラスミドベクターDNAはエキソヌクレアーゼI
IIにより消化されなかった。反応混合物のサンプルを30
秒間隔で採取し、前出のHenikoffの方法に従って処理
し、再環化したDNA分子を生成し、コンピテント大腸菌
細胞に形質転換させた。個々のコロニーのミニ調製物か
らのプラスミドDNAを、元のフラグメントに導入された
欠失のサイズの制限マッピングにより分析した。T7ポリ
メラーゼ（Pharmacia,Uppsala,スウェーデン）を使用す
る鎖停止反応で二重鎖DNA上のヌクレオチド配列決定に
より、漸進的欠失を含む候補群を分析した。
鎖伸長反応を特異的に開始させることにより、ヌクレ
オチド配列内の不完全又は曖昧な読み取り値を解析し
た。配列データをまとめ、Gene−Master（Bio−Rad,Cal
ifornia,米国）又は同等のソフトウェアを使用して解析
した。全データをまとめた結果、配列番号2,3,4,5,6及
び７に示すアミノ酸配列を有する夫々のポリペプチドを
コードする６個のオープンリーディングフレームからな
るFHVゲノムのユニークな短セグメントないの約6.1kb領
域（配列番号１）が判明した。
オチド配列内の不完全又は曖昧な読み取り値を解析し
た。配列データをまとめ、Gene−Master（Bio−Rad,Cal
ifornia,米国）又は同等のソフトウェアを使用して解析
した。全データをまとめた結果、配列番号2,3,4,5,6及
び７に示すアミノ酸配列を有する夫々のポリペプチドを
コードする６個のオープンリーディングフレームからな
るFHVゲノムのユニークな短セグメントないの約6.1kb領
域（配列番号１）が判明した。
６個のオープンリーディングフレームとその両端の介
在非翻訳DNA配列とからなる約6.1kbの領域は、感染及び
複製に必要な必須ウイルス機能を失わせることなくFHV
のゲノムに外来遺伝子を挿入するために使用することが
できる。
在非翻訳DNA配列とからなる約6.1kbの領域は、感染及び
複製に必要な必須ウイルス機能を失わせることなくFHV
のゲノムに外来遺伝子を挿入するために使用することが
できる。
特に、夫々pFHV13及びpFHV10にβ−ガラクトシダーゼ
マーカー遺伝子を挿入するために実施例２で使用したヌ
クレオチド位置1210のBal II制限部位と5737位のSau3A
部位とは、ウイルス感染又は複製に必須ではないFHVゲ
ノムの位置にマッピングすることが判明した。
マーカー遺伝子を挿入するために実施例２で使用したヌ
クレオチド位置1210のBal II制限部位と5737位のSau3A
部位とは、ウイルス感染又は複製に必須ではないFHVゲ
ノムの位置にマッピングすることが判明した。
実施例４
感染動物におけるFHV突然変異体の病原性
ORF−１（図１参照）のCOOH末端領域内に位置するBgl
II部位に挿入されたβ−ガラクトシダーゼマーカー遺
伝子を含む組換えFHV株C4−１−４−１を、ネコワクチ
ン接種後経過における評価のために選択し、親FHV株G26
20と比較した。病原性とビルレントFHV株による抗原投
与感染により生じた臨床徴候に対するウイルスの防御能
力とに基づき、新規FHVワクチン株としてのC4−１−４
−１の力価を調べた。
II部位に挿入されたβ−ガラクトシダーゼマーカー遺
伝子を含む組換えFHV株C4−１−４−１を、ネコワクチ
ン接種後経過における評価のために選択し、親FHV株G26
20と比較した。病原性とビルレントFHV株による抗原投
与感染により生じた臨床徴候に対するウイルスの防御能
力とに基づき、新規FHVワクチン株としてのC4−１−４
−１の力価を調べた。
特異的病原体を含まない12週齢のネコに約１×105 T
CID50のFHV突然変異体又は親株を、片外鼻孔0.3ml、口
腔咽頭に0.4ml投与することによって口鼻感染させた。F
HV感染に特異的な臨床徴候について動物を２週間にわた
って毎日観察し、表１に示すような基準に基づいて採点
した。ワクチン接種から６週間後に１×105 TCID50のF
HV株SGE（National Veterinary Service Laborator
y、米国）を口鼻投与することによってネコに抗原投与
し、FHV感染の臨床徴候を２週間にわたって監視した。
CID50のFHV突然変異体又は親株を、片外鼻孔0.3ml、口
腔咽頭に0.4ml投与することによって口鼻感染させた。F
HV感染に特異的な臨床徴候について動物を２週間にわた
って毎日観察し、表１に示すような基準に基づいて採点
した。ワクチン接種から６週間後に１×105 TCID50のF
HV株SGE（National Veterinary Service Laborator
y、米国）を口鼻投与することによってネコに抗原投与
し、FHV感染の臨床徴候を２週間にわたって監視した。
ワクチン接種及び抗原投与後の臨床観察結果を表２に
要約する。C4−１−４−１株を口鼻経路でワクチン接種
した群１のネコは親株G2620を接種した群２の動物に比
較して臨床徴候のスコアレベルが低かった。
要約する。C4−１−４−１株を口鼻経路でワクチン接種
した群１のネコは親株G2620を接種した群２の動物に比
較して臨床徴候のスコアレベルが低かった。
抗原投与後では、ワクチン接種した群１のネコはワク
チン接種しない群３の対照に比較して臨床スコアが更に
著しく低かった。
チン接種しない群３の対照に比較して臨床スコアが更に
著しく低かった。
従って、突然変異株C4−１−４−１はネコに口鼻投与
した場合にビルレンスが低く、しかも抗原投与FHV感染
の臨床徴候に対して高レベルの防御を誘発し得る。
した場合にビルレンスが低く、しかも抗原投与FHV感染
の臨床徴候に対して高レベルの防御を誘発し得る。
実施例５
FHVのゲノムに異種遺伝子を挿入するための組換えプラ
スミドの構築。
スミドの構築。
FHVに外来遺伝子を挿入し、その後発現させるために
使用する組換えプラスミドは、ORF−１（図１）中にマ
ッピングされるヌクレオチド位置1210（配列番号１）に
位置するBgl II制限部位に基づいて作成した。ORF−１
の方向がプラスミドベクターのT7 RNAポリメラーゼプ
ロモーターの方向と同一になるように、λFHV04からの
5.2kb BamH IフラグメントをpSP72（Promega,Wisconsi
n,米国）のBgl II部位でプラスミドにサブクローニング
した。ヌクレオチド配列解析について実施例３に記載し
たと同様の手順に従って、酵素エキソヌクレアーゼIII
を使用する単一方向欠失技術によりこの構築物pFHV11を
処理した。この結果、元の5.2kb BamH Iフラグメント
からの残りの0.4kbと、ほぼ中央に位置するユニークなB
gl II部位と、ウイルスゲノムとのin vivo組換えを可
能にするために十分なフランキングFHVゲノム配列とを
有するむpFHV27が生成された。
使用する組換えプラスミドは、ORF−１（図１）中にマ
ッピングされるヌクレオチド位置1210（配列番号１）に
位置するBgl II制限部位に基づいて作成した。ORF−１
の方向がプラスミドベクターのT7 RNAポリメラーゼプ
ロモーターの方向と同一になるように、λFHV04からの
5.2kb BamH IフラグメントをpSP72（Promega,Wisconsi
n,米国）のBgl II部位でプラスミドにサブクローニング
した。ヌクレオチド配列解析について実施例３に記載し
たと同様の手順に従って、酵素エキソヌクレアーゼIII
を使用する単一方向欠失技術によりこの構築物pFHV11を
処理した。この結果、元の5.2kb BamH Iフラグメント
からの残りの0.4kbと、ほぼ中央に位置するユニークなB
gl II部位と、ウイルスゲノムとのin vivo組換えを可
能にするために十分なフランキングFHVゲノム配列とを
有するむpFHV27が生成された。
FHVウイルスをゲノムに挿入した後に外来遺伝子の発
現を誘発し得る強力なプロモーターをラウス肉腫ウイル
ス（RSV）のLTR配列から選択した。プロモーターはpRSV
cat（Gorman,C.Mら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,6777
−6781,1982）からの580bp Nde I/Hind III制限フラグ
メント上にマッピングし、フラグメントの両側で二重鎖
合成リンカーによりpGEM3ZのHind III及びPst I部位間
に挿入した。一方の部位でHind IIIに適合可能な付着末
端を含み且つ他方の部位でNde Iに適合可能な付着末端
を含む30bpリンカーを用いて、ベクターpGEM3ZからのHi
nd III部位とLTRプロモーターを有するRSVフラグメント
のNde I部位とを連結した。しかしながら、連結後、両
方の制限部位は６塩基対認識配列の外側のヌクレオチド
における故意の修飾により復元されない。これらの２つ
の部位の除去以外に、リンカー自体の内側に存在する新
しい制限部位（BamH I）が対応位置に生成された。LTR
フラグメントからのHind III部位をpGEM3ZからのPst I
部位に結合する第の20bpリンカーを合成し、この場合は
末端のいずれの認識配列も破壊せずにpGEM3Zのポリリン
カー中に既に存在していた制限部位Bgl II及びXho Iに
適切な制限部位Bgl II及びXho Iを付加した。従って、
合成された誘導体pVEC01は、LTRプロモーター配列と外
来遺伝子を挿入するために使用可能なその直後の多重制
限部位とを有する650bp制限フラグメントを含む。650bp
フラグメントは両端にBamH I制限部位を有しており、pF
HV27中に存在するユニークなBgl II部位にそのまま転移
させた。これらの２種の制限酵素により生成された付着
末端は適合可能であるが、連結はBgl II又はBamH Iの元
の認識配列のいずれも復元しない。得られた構築物をpF
HV38と命名し、制限マッピング（図６）により検討し
た。このFHV組換えベクターの構造はLTRプロモーターの
すぐ下流に外来遺伝子を挿入し、その後、in vivo組換
えによりFHVゲノムに完全な発現カセットを組み込むこ
とが可能であった。LTRの下流の種々の制限部位、特に
酵素Bgl II及びSal Iの制限部位の位置は、多重遺伝子
挿入をも可能なように設計する。
現を誘発し得る強力なプロモーターをラウス肉腫ウイル
ス（RSV）のLTR配列から選択した。プロモーターはpRSV
cat（Gorman,C.Mら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79,6777
−6781,1982）からの580bp Nde I/Hind III制限フラグ
メント上にマッピングし、フラグメントの両側で二重鎖
合成リンカーによりpGEM3ZのHind III及びPst I部位間
に挿入した。一方の部位でHind IIIに適合可能な付着末
端を含み且つ他方の部位でNde Iに適合可能な付着末端
を含む30bpリンカーを用いて、ベクターpGEM3ZからのHi
nd III部位とLTRプロモーターを有するRSVフラグメント
のNde I部位とを連結した。しかしながら、連結後、両
方の制限部位は６塩基対認識配列の外側のヌクレオチド
における故意の修飾により復元されない。これらの２つ
の部位の除去以外に、リンカー自体の内側に存在する新
しい制限部位（BamH I）が対応位置に生成された。LTR
フラグメントからのHind III部位をpGEM3ZからのPst I
部位に結合する第の20bpリンカーを合成し、この場合は
末端のいずれの認識配列も破壊せずにpGEM3Zのポリリン
カー中に既に存在していた制限部位Bgl II及びXho Iに
適切な制限部位Bgl II及びXho Iを付加した。従って、
合成された誘導体pVEC01は、LTRプロモーター配列と外
来遺伝子を挿入するために使用可能なその直後の多重制
限部位とを有する650bp制限フラグメントを含む。650bp
フラグメントは両端にBamH I制限部位を有しており、pF
HV27中に存在するユニークなBgl II部位にそのまま転移
させた。これらの２種の制限酵素により生成された付着
末端は適合可能であるが、連結はBgl II又はBamH Iの元
の認識配列のいずれも復元しない。得られた構築物をpF
HV38と命名し、制限マッピング（図６）により検討し
た。このFHV組換えベクターの構造はLTRプロモーターの
すぐ下流に外来遺伝子を挿入し、その後、in vivo組換
えによりFHVゲノムに完全な発現カセットを組み込むこ
とが可能であった。LTRの下流の種々の制限部位、特に
酵素Bgl II及びSal Iの制限部位の位置は、多重遺伝子
挿入をも可能なように設計する。
図面の説明
図１
λFHV04からの13.5kb DNAインサートの制限地図。こ
のDNAフラグメントの位置はFHVゲノムのユニークな短領
域の右側部分にマッピングされる。挿入領域は上部に示
す６個のオープンリーディングフレームと遺伝子間非翻
訳配列から構成される。4.8kb Sac I及び5.2kb BamH
I制限フラグメントをpGEM3Zにサブクローニングし、夫
々pFHV13及びpFHV10を得た。配列分析の結果、最も左側
のEcoR I制限部位は相互に50bp内に位置付けられる２個
の６塩基認識配列を含むことが判明した。
のDNAフラグメントの位置はFHVゲノムのユニークな短領
域の右側部分にマッピングされる。挿入領域は上部に示
す６個のオープンリーディングフレームと遺伝子間非翻
訳配列から構成される。4.8kb Sac I及び5.2kb BamH
I制限フラグメントをpGEM3Zにサブクローニングし、夫
々pFHV13及びpFHV10を得た。配列分析の結果、最も左側
のEcoR I制限部位は相互に50bp内に位置付けられる２個
の６塩基認識配列を含むことが判明した。
図２
A.λFHV04からの4.8kb Sac Iを含むpGM3Zの誘導体であ
るプラスミドpFHV13の制限地図。DNAを挿入するために
使用した3.1kbのユニークなBgl IIを三角形で明示す
る。
るプラスミドpFHV13の制限地図。DNAを挿入するために
使用した3.1kbのユニークなBgl IIを三角形で明示す
る。
B.β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含む4.0kb B
amH Iフラグメントの挿入によりpFHV13から誘導される
プラスミドpFHV19の制限地図。
amH Iフラグメントの挿入によりpFHV13から誘導される
プラスミドpFHV19の制限地図。
図３
A.FHV04からの5.2kb BamH Iフラグメントを含むpGEM3Z
の誘導体であるプラスミドpFHV10の制限地図。三角形で
明示したSau3A部位をDNAの挿入に使用した。
の誘導体であるプラスミドpFHV10の制限地図。三角形で
明示したSau3A部位をDNAの挿入に使用した。
B.β−ガラクトシダーゼマーカー遺伝子を含む4.0kb B
amH Iフラグメントの挿入によりpFHV10から誘導される
プラスミドpFHV23の制限地図。
amH Iフラグメントの挿入によりpFHV10から誘導される
プラスミドpFHV23の制限地図。
図４
配列番号１に示す配列から誘導される詳細な制限地
図。６個のオープンリーディングフレームの位置を上部
に示す。ウイルスDNAをプラスミドpFHV60と共に同時ト
ランスフェクトすることによりマーカー遺伝子をORF−
２に挿入するために2.1kbのEcoR V部位を使用した。
図。６個のオープンリーディングフレームの位置を上部
に示す。ウイルスDNAをプラスミドpFHV60と共に同時ト
ランスフェクトすることによりマーカー遺伝子をORF−
２に挿入するために2.1kbのEcoR V部位を使用した。
同様にマーカー遺伝子をORF−３に挿入するために3.1
kwのSpe I部位を使用した。この場合には、プラスミドp
FHV55を同時トランスフェクションに使用した。
kwのSpe I部位を使用した。この場合には、プラスミドp
FHV55を同時トランスフェクションに使用した。
図５
いずれもpFHV40から誘導したpFHV60（Ａ）及びpFHV55
（Ｂ）の制限地図。このプラスミドはpFHV10から誘導
し、両方の制限部位が連結後に復元されないように5.1k
b付近（図3A）で0.2kb BamH I−Bal IIフラグメントを
欠失させた。
（Ｂ）の制限地図。このプラスミドはpFHV10から誘導
し、両方の制限部位が連結後に復元されないように5.1k
b付近（図3A）で0.2kb BamH I−Bal IIフラグメントを
欠失させた。
A.図４に示すEcoR V部位に等価の位置にβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を挿入したpFHV40の誘導体であるpFHV60の
制限地図。
ダーゼ遺伝子を挿入したpFHV40の誘導体であるpFHV60の
制限地図。
B.図４に示すSpe I部位に挿入することによりpFHV40か
ら誘導したpFHV55の制限地図。ORF−３のコーディング
配列はこの構築物では失われている。
ら誘導したpFHV55の制限地図。ORF−３のコーディング
配列はこの構築物では失われている。
図６
pFHV38の制限地図。in vivo組換えベクターは制限部
位（例えばBgl II又はSal I）でプロモーターの下流に
挿入可能な外来遺伝子の発現に必要なLTRプロモーター
を含む。
位（例えばBgl II又はSal I）でプロモーターの下流に
挿入可能な外来遺伝子の発現に必要なLTRプロモーター
を含む。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:6154塩基対
配列の型：核酸
鎖の数：二本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類:DNA（ゲノム）
起源：
生物名：ネコヘルペスウイルス（FHV−１）
株名:G2620
配列の特徴
特徴を表わす記号:CDS
存在位置:127..1281
他の情報:/ラベル＝ORF−１
配列の特徴
特徴を表わす記号:CDS
存在位置:1460..3058
他の情報:/ラベル＝ORF−２
配列の特徴
特徴を表わす記号:CDS
存在位置:3055..3357
他の情報:/ラベル＝ORF−３
配列の特徴
特徴を表わす記号:CDS
存在位置:3055..3963
他の情報:/ラベル＝ORF−４
配列の特徴
特徴を表わす記号:CDS
存在位置：相補（4256..4897）
他の情報:/ラベル＝ORF−５
配列の特徴
特徴を表わす記号:CDS
存在位置：相補（5138..6142）
他の情報:/ラベル＝ORF−６
配列：配列番号1:
配列番号:2
配列の長さ:384アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴
他の情報:/ラベル＝ORF−１
配列：配列番号2:
配列番号:3
配列の長さ:532アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴
他の情報:/ラベル＝ORF−２
配列：配列番号3:
配列番号:4
配列の長さ:100アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴
他の情報:/ラベル＝ORF−３
配列：配列番号4:
配列番号:5
配列の長さ:152アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴
他の情報:/ラベル＝ORF−４
配列：配列番号5:
配列番号:6
配列の長さ:213アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴
他の情報:/ラベル＝ORF−５
配列：配列番号6:
配列番号:7
配列の長さ:334アミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：タンパク質
配列の特徴
他の情報:/ラベル＝ORF−６
配列：配列番号7:
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19
1/21 1/21
5/10 15/00 ＺＮＡＡ
15/09 ＺＮＡ 5/00 Ｂ
(56)参考文献 特開 平６−70761（ＪＰ，Ａ)
特表 平４−500007（ＪＰ，Ａ)
Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ．64，Ｎ
ｏ．10（1990）Ｐ．4930−4938
Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ.
73，Ｐｔ．７（1992．Ｊｕｌ．）ｐ.
1811−1818
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．154，Ｎ
ｏ．１（1986）ｐ．168−179
Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，Ｖｏｌ.
116，Ｎｏ，１−４（1991）ｐ．209−
220
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (28)
- 【請求項１】下記図の制限地図で示されるネコヘルペス
ウイルス（FHV）のDNA内にあるオープンリーディングフ
レーム（ORF）１、２又は３において１つ又はそれ以上
の突然変異を有し、該突然変異により、変異させたORF
に対応する機能性ポリペプチドが生産されなくなってい
る、単離されたFHV突然変異体。 - 【請求項２】ORF1、２および３が配列番号２、３及び４
のアミノ酸配列それぞれをコードする、請求項１に記載
のFHV突然変異体。 - 【請求項３】１つ又はそれ以上の突然変異が異種DNA配
列の挿入からなる、請求項１に記載のFHV突然変異体。 - 【請求項４】該DNA配列がポリペプチドをコードし、FHV
突然変異体が感染した細胞内において該ポリペプチドの
発現を調節するプロモーターの制御下にある、請求項に
記載のFHV突然変異体。 - 【請求項５】異種DNA配列がネコ病原体の抗原をコード
する、請求項４に記載のFHV突然変異体。 - 【請求項６】該病原体が、ネコ白血病ウイルス、ネコ免
疫不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボウ
イルス、ネココロナウイルスおよびネコクラミジアから
なる群から選択される、請求項５に記載のFHV突然変異
体。 - 【請求項７】１つ又はそれ以上の突然変異が欠失であ
る、請求項１に記載のFHV突然変異体。 - 【請求項８】下記図の制限地図で示されるFHVのDNA内に
あるORF1に突然変異を有するFHV突然変異体と医薬的に
許容可能な担体とからなり、該突然変異により、機能性
ORF1ポリペプチドが生産されなくなっている、ワクチ
ン。 - 【請求項９】該突然変異が異種DNA配列の挿入からな
る、請求項８に記載のワクチン。 - 【請求項１０】該DNA配列がネコ病原体の抗原をコード
する、請求項９に記載のワクチン。 - 【請求項１１】該病原体が、ネコ白血病ウイルス、ネコ
免疫不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボ
ウイルス、ネココロナイウルスおよびネコクラミジアか
らなる群から選択される、請求項10に記載のワクチン。 - 【請求項１２】該FHV突然変異体が更にORF2またはORF3
に異種DNA配列を挿入している、請求項８に記載のワク
チン。 - 【請求項１３】該DNA配列がネコ病原体である抗原をコ
ードする、請求項12に記載のワクチン。 - 【請求項１４】該病原体が、ネコ白血病ウイルス、ネコ
免疫不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパルボ
ウイルス、ネココロナウイルスおよびネコクラミジアか
らなる群から選択される、請求項13に記載のワクチン。 - 【請求項１５】下記図の制限地図で示されるFHVのDNA内
にあるORF2及びORF3の少なくとも１つに異種DNA配列の
挿入である突然変異を有する弱毒化FHV菌株と許容可能
な担体とからなるワクチン。 - 【請求項１６】該DNA配列がネコ病原体の抗原をコード
する、請求項15に記載のワクチン。 - 【請求項１７】該病原体が、ネコ白血病ウイルス、ネコ
免疫性不全症ウイルス、ネコカリチウイルス、ネコパル
ボウイルス、ネココロナウイルスおよびネコクラミジア
からなる群から選択される、請求項16に記載のワクチ
ン。 - 【請求項１８】下記図の制限地図で示されるFHVのDNA内
にあるORF1、ORF2およびORF3の少なくとも１つに欠失突
然変異または挿入異突然変異を有する弱毒化FHV菌株と
許容可能な担体とからなるマーカーワクチン。 - 【請求項１９】下記図に示す制限地図をもつFHVゲノム
のDNAの単離された核酸フラグメントであって、ウイル
ス性FHVゲノムとin vivo相同的組換えができるような
長さのものであり、ORF1、ORF2およびORF3の少なくとも
１つに、対応する機能性タンパク質が発現されないよう
になっている突然変異を有する、前記単離された核酸フ
ラグメント。 - 【請求項２０】更に異種DNA配列を含み、該異種DNA配列
は、その両端が十分な量の塩基対と結合して相同的組換
えができるように核酸フラグメントに挿入されている、
請求項19に記載の核酸フラグメント。 - 【請求項２１】請求項19の核酸フラグメントからなる組
換えDNA分子。 - 【請求項２２】請求項21の組換えDNA分子でトランスフ
ォームされた宿主細胞。 - 【請求項２３】請求項20の核酸フラグメントからなる組
換えDNA分子。 - 【請求項２４】請求項23の組換えDNA分子でトランスフ
ォームされた宿主細胞。 - 【請求項２５】請求項１のFHV突然変異体で感染された
細胞培養物。 - 【請求項２６】請求項８のワクチンを有効量投与するこ
とからなる、FHVに対してネコを免疫する方法。 - 【請求項２７】請求項15のワクチンを有効量投与するこ
とからなる、FHVに対してネコを免疫する方法。 - 【請求項２８】請求項18のワクチンを有効量投与するこ
とからなる、FHVに対してネコを免疫する方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NL92202365.0 | 1992-07-30 | ||
| EP92202365 | 1992-07-30 | ||
| PCT/EP1993/001971 WO1994003621A1 (en) | 1992-07-30 | 1993-07-23 | Vector vaccines of recombinant feline herpesvirus |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06511392A JPH06511392A (ja) | 1994-12-22 |
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Family
ID=8210815
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50495894A Expired - Fee Related JP3529134B2 (ja) | 1992-07-30 | 1993-07-23 | 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6521236B1 (ja) |
| EP (1) | EP0606452B1 (ja) |
| JP (1) | JP3529134B2 (ja) |
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| DE (1) | DE69332480T2 (ja) |
| DK (1) | DK0606452T3 (ja) |
| ES (1) | ES2187508T3 (ja) |
| PT (1) | PT606452E (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JPH09512177A (ja) * | 1994-04-29 | 1997-12-09 | ファルマシア・アンド・アップジョン・カンパニー | ネコ免疫不全ウイルスワクチン |
| FR2741806B1 (fr) * | 1995-11-30 | 1998-02-20 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant a base d'herpesvirus felin de type 1, notamment contre la peritonite infectieuse feline |
| US6231863B1 (en) | 1997-06-10 | 2001-05-15 | American Cyanamid Company | DNA sequences, molecules, vectors and vaccines for feline calicivirus disease and methods for producing and using same |
| JP2002513581A (ja) * | 1998-05-01 | 2002-05-14 | シャリング−プルーフ・リミテッド | ネコｃｄ８０、ネコｃｔｌａ−４またはネコｃｄ８６をコードする外来ｄｎａを発現する組換えウイルスおよびその使用 |
| US7279168B2 (en) | 1998-05-01 | 2007-10-09 | Texas A & M University System | Recombinant virus expressing foreign DNA encoding feline CD86 and uses thereof |
| JP2002112770A (ja) | 2000-10-05 | 2002-04-16 | Kyoritsu Seiyaku Kk | 新規組換えネコヘルペスウイルス１型およびこれを用いた多価ワクチン |
| WO2009051823A2 (en) * | 2007-10-18 | 2009-04-23 | Michigan State University | Bacterial artificial chromosome containing feline herpes virus type 1 genome and uses thereof |
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|---|---|---|---|---|
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