JPH08277303A - 分岐多糖類、それを生産する微生物とそれらを含有する組成物 - Google Patents

分岐多糖類、それを生産する微生物とそれらを含有する組成物

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JPH08277303A
JPH08277303A JP7233177A JP23317795A JPH08277303A JP H08277303 A JPH08277303 A JP H08277303A JP 7233177 A JP7233177 A JP 7233177A JP 23317795 A JP23317795 A JP 23317795A JP H08277303 A JPH08277303 A JP H08277303A
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branched polysaccharide
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microorganism
branched
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ニコル ファーヴル
Jerome Lemoine
ジェローム ルモワンヌ
Jean-Richard Neeser
ジョン−リシャール ニセール
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Nestle SA
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Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明はβ−ガラクトシド・レクチンとそ
の受容体の間の結合を阻止するのに使用できる、新規な
分岐多糖類および／またはそれを生産する微生物を提供
する。 【解決手段】 本発明は置換可能なラクトース単位だけ
から成る反復側鎖を有する主鎖を含む新規な天然の可溶
性分岐多糖類にかかわるものである。本発明はさらにこ
の分岐多糖類が得られる微生物と、前記分岐多糖類およ
び／または微生物を含有する食品組成物、化粧品組成物
および薬剤組成物にかかわるものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】
【０００２】本発明は新規な分岐多糖類、それを生産す
る微生物と、それらを含有する食品組成物、薬剤組成物
および化粧品組成物に関する。
【０００３】
【従来の技術】
【０００４】生物伝達（細胞が分子または別の細胞を認
識する可能性）は病理状態でも正常な状態でも中心的現
象である。
【０００５】細胞間、および／または細胞と分子の間の
分子認識の様々な機構の中で、特殊タンパク（レクチ
ン）による特定のグリコシド構造の結合は今日主要な分
子認識システムと見なされている。
【０００６】レクチンは特に、また非共有結合で、明確
なグリコシド配列に結合される。
【０００７】レクチンによっては、高いマンノース含有
率のオリゴ糖、シアル酸を担持する構造、フコース化グ
リコシド、などに結合されるものがある。
【０００８】他のレクチンはβ−ガラクトシドとラクト
ースを結合することができる。
【０００９】凝集して、歯垢として網目構造を形成する
口腔バクテリア細胞［アクチノミセス・ネスランディイ
(Actinomyces naeslundii)またはビスコスス(viscosu
s)、ストレプトコッカス・ミティス(Streptococcus mit
is)またはサングイス(sanguis)、フゾバクテリウム・ヌ
クレアトゥム(Fusobacterium nucleatum)、ポルフィロ
モナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、バ
クテリオデス・インテルメディウス(Bacteriodes inter
medius)、・・・］の間には多属共凝集が存在する。
【００１０】これらのバクテリア細胞の間では、一方の
細胞上のβ−ガラクトシド・レクチンと別の細胞上のグ
リコシド受容体の間の非共有結合による相互作用が得ら
れることが多い（参考文献１：参考文献のリストは、発
明の詳細な説明の欄の最後に添付する）。
【００１１】大半の感染症は病原体［アクチノミセス・
ネスランディイ、フゾバクテリウム・ヌクレアトゥム、
バクテリオデス・インテルメディウス、サルモネラ・テ
ィフィムリウム(Salmonella typhimurium)、ビブリオ・
コレラ(Vibrio Cholera)、カンピロバクテル・ジェジュ
ニ(Campylobacter jejuni)、バクテリオデス(Bacteriod
es)、フゾバクテリア(Fusobacteria)、クロストリディ
ア(Clostridia)、シゲッラ(Shigella)、イェルシニア(Y
ersinia)、およびヘリコバクテル・ピロリ(Helicobacte
r pylori)、・・・］が寄主の粘膜の上皮細胞に付着し
て開始され、それによって動物組織のコロニー形成が可
能になる。
【００１２】この付着はこの病原体の表面に位置するβ
−ガラクトシド・レクチンと上皮細胞の表面に位置する
グリコシド受容体の間の結合によって得られることが多
い（参考文献２）。
【００１３】免疫系の各種の細胞（ＴおよびＢリンパ
球，マクロファージ，好中球）はβ−ガラクトシド・レ
クチンを結合できるか、その表面にガレクチン科のかか
るレクチンを発現できることが知られている。
【００１４】加えて、腸管細胞またはケラチン生成細胞
などの一部の上皮細胞は同じくランゲルハンス(Langerh
ans)細胞を被おうことのできるこれらのガレクチンを生
成し、ＩｇＥなどの免疫グロブリンは特にガレクチンと
結合することができる（参考文献３，４および５）。
【００１５】微生物によって生成される多糖類について
は過去に多数の研究がなされ、近年、乳酸バクテリアに
よって得られた細胞外多糖類の構造と、その生物活性に
関する研究について数多くの報告がなされている。
【００１６】ガラクトース、グルコースおよびＮ−アセ
チルガラクトサミン（２：１：１）から成る多糖類がス
トレプトコッカス・テルモフィラス(Streptococcus the
rmophilus)ＣＮＣＭ Ｉ−７３３，ＣＮＣＭ Ｉ−７３４
およびＣＮＣＭ Ｉ−７３５の菌株によって得られた
（参考文献６および７）；
【００１７】ガラクトース単体から成る多糖類がラクト
コッカス・クレモリス(Lactococcuscremoris)Ｈ４１４
の菌株によって得られた（参考文献８）；
【００１８】ガラクトース、グルコース、ラムノースお
よびリン酸塩（２：２：１：１）から成る多糖類がラク
トコッカス・クレモリスＳＢＴ０４９５の菌株によって
得られた（参考文献９）；
【００１９】ガラクトース、グルコースおよびラムノー
ス（５：１：１）から成る多糖類はラクトバチルス・ブ
ルガリクスrr (Lactobacillus bulgaricus rr)の菌株に
よって得られた（参考文献１０）；
【００２０】グルコース、ラムノース、１−ホスホグリ
セロールおよびＯ−アセチル基（３：２：１：０．８
５）から成る多糖類はラクトバチルス・サケ(Lactobaci
llus sake)０−１の菌株によって得られた（参考文献１
１）。
【００２１】他方、ラクトバチルス・ヘルベチクス(Lac
tobacillus helveticus)の少数の菌株によって得られた
他の多糖類が研究されたが、その構造の特性化は実現さ
れたことがない。例えば、抗腫瘍剤として使用されるグ
ルコースおよびガラクトース（２：１）から成る未知の
構造の多糖類はラクトバチルス・ヘルベチクス・バル．
ジュグルティ(Lactobacillus helveticus var. jugurt
i) Ｎｏ．８５１”ＦＥＲＭ ＢＰ−６６（ＦＥＲＭ−Ｐ
Ｎｏ．５８５１）”の菌株によって得られた（参考文
献１２および１３）。同様に、炎症の治療と骨髄の成長
促進に用いられるガラクトース、グルコースおよびＮ−
アセチルグルコサミン（２．５−３．５：２．５−３．
５：１）から成る未知の構造の多糖類はラクトバチルス
・ヘルベチクス ＭＩＫＩ−０１０の菌株から得られた
（参考文献１４）。
【００２２】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】本発明はβ−ガラクトシド・レクチンとそ
の受容体の間の結合を阻止するのに使用できる、新規な
分岐多糖類および／またはそれを生産する微生物を提供
することを目的とする。
【００２４】本発明の別の目的は感覚受容性と質感特性
が改善された前記分岐多糖類および／または微生物を含
有する食品組成物を提供することである。
【００２５】本発明のさらに別の目的は前記多糖類およ
び／または微生物を含有する薬剤組成物および／または
化粧品組成物を提供することである。
【００２６】本発明の最後の目的は、ガングリオトリオ
ース、Ｓｄ−ａ血液グループ、またはシアリル−および
硫酸−Ｌｅｗｉｓ Ｘの重合した誘導体の生産のための
中間生成物として用いることのできる多糖類を提供する
ことである。
【００２７】
【課題を解決するための手段】
【００２８】本発明は置換可能なラクトース単位だけか
ら成る反復側鎖を有する主鎖を含む新規な天然の可溶性
分岐多糖類にかかわるものである。
【００２９】本発明の推奨実施態様によれば、分岐多糖
類の化学式は次の通りである。
【００３０】
【化２】
【００３１】ここで、ｎ＞１ Ｇａｌ＝ガラクトース Ｇｌｃ＝グルコース Ｒ1＝水素またはＧａｌＮＡｃβ１（Ｎ−アセチルガラ
クトサミン） Ｒ2＝水素、ＮｅｕＮＡｃα２（Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸）またはＨＳＯ3 Ｒ3＝水素またはＦｕｃα１（フコース）
【００３２】Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝水素であるとき、分岐多
糖類は下記の物理化学的特性を特徴とする。
【００３３】・分子量が２００００００をこえる。 ・水溶性であり、溶液のトリクロロ酢酸含有率は２０％
未満である。 ・アルコールやアセトンに溶けない。 ・中性。 ・凍結乾燥製品は白粉末状である。 ・成分糖と組成比が、グルコース：ガラクトース＝１：
１.１である。
【００３４】Ｒ1がＧａｌＮＡｃβ１（Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン）であり、Ｒ2＝Ｒ3＝水素であるとき、分
岐多糖類は参考文献１５および１６に記載の方法によっ
て、中間生成物（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝水素のある多糖類）
から有利に得られた限定ガングリオトリオースの誘導体
である。
【００３５】Ｒ1がＧａｌＮＡｃβ１（Ｎ−アセチルガ
ラクトサミン）であり、Ｒ2がＮｅｕＮＡｃα２（Ｎ−
アセチルノイラミン酸）であり、Ｒ3が水素であると
き、分岐多糖類は参考文献１７および１８に記載の方法
によって、中間生成物（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝水素のある多
糖類）から有利に得られた限定Ｓｄ−ａ血液グループの
誘導体である。
【００３６】Ｒ1が水素であり、Ｒ2がＮｅｕＮＡｃα２
（Ｎ−アセチルノイラミン酸）またはＨＳＯ3であり、
Ｒ3がＦｕｃα１（フコース）であるとき、分岐多糖類
は参考文献１９および２０に記載の医薬品シアリル−ま
たは硫酸−Ｌｅｗｉｓ Ｘの誘導体である。
【００３７】Ｇａｌβ１−４ＧｌｃとＲ1，Ｒ2の間の結
合は好適には参考文献１７に記載の方法によって中間生
成物（Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝水素である多糖類）から得られ
る。
【００３８】本発明は、Ｒ1＝Ｒ2＝Ｒ3＝水素を有する
分岐多糖類を生成する微生物にも関する。
【００３９】好適には、前記微生物はラクトバチルス・
ヘルベチクスの菌株、望ましくはラクトバチルス・ヘル
ベチクスＣＮＣＭ Ｉ−１４４９の菌株に対応する。
【００４０】この微生物はブダペスト条約に従って１９
９４年７月２７日に国立微生物培養保管所（ＣＮＣ
Ｍ）、パスツール研究所、２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃ
ｔｅｕｒＲｏｕｘ， ７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤ
ＥＸ １５， ＦＲＡＮＣＥに寄託された。
【００４１】本発明は、本発明による多糖類および／ま
たは微生物を含有する感覚受容性および質感特性が改善
された食品にも関する。
【００４２】好適には、前記食品組成物は凝固した酸敗
乳または攪拌された酸敗乳である。
【００４３】本発明の別の態様は本発明による多糖類お
よび／または微生物を含有する化粧品組成物にも関す
る。
【００４４】本発明の推奨実施態様によれば、前記化粧
品組成物は練り歯磨き、歯科ゲル、口腔洗浄液、チュー
インガムおよび／または錠剤から成る群から選ばれた口
腔衛生のための化粧品である。
【００４５】本発明の別の推奨実施態様によれば、前記
化粧品組成物はクリーム、軟膏または香膏から成る群か
ら選ばれた皮膚衛生のための製品である。
【００４６】本発明の別の態様は本発明による多糖類お
よび／または微生物を含有する薬剤組成物に関する。
【００４７】有益には、前記組成物はカプセル、シロッ
プ、粉末および／または錠剤から成る群から選ばれた止
瀉薬製品である。
【００４８】本発明の最後の態様は特定の分子および／
または微生物を取り出すための本発明による分岐多糖類
を含有する診断および／または分析装置に関するもので
ある。
【００４９】
【発明の実施の形態】
【００５０】本発明はラクトース単位だけから成る反復
側鎖を有する主鎖を備えた新規な天然の可溶性分岐多糖
類にかかわるものである；前記ラクトースは置換可能で
ある。
【００５１】本発明による「分岐多糖類」は１０をこえ
る反復単位、好適には４０をこえる反復単位を有する糖
類である。
【００５２】前記分岐多糖類は好適には下記のごとく主
鎖１から分岐した一つの側鎖２を含む同一の単一「単
位」の反復から成る「重合体」の構造を有する。
【００５３】
【化３】
【００５４】本発明による多糖類の生成と物理化学的構
造を以下に説明する。
【００５５】１．ラクトバチルス・ヘルベチクスＣＮＣ
Ｍ Ｉ−１４４９によって生成されるエキソ多糖類の調
製と精製
【００５６】１.１．発酵条件
【００５７】ラクトバチルス・ヘルベチクスＣＮＣＭ
Ｉ−１４４９はネスレの菌株収蔵品からの粘着性菌株で
あった。ネスレの収集の１６８のＬ．ヘルベチクス菌株
の中で、２つの菌株だけがエキソ多糖類を生成する。
【００５８】生長媒体は発酵に先立って殺菌のために加
熱処理した（１１５℃、３５分）１０％の再生脱脂乳と
した。磁気攪拌機付きの１リットル目盛りの発酵器を用
いて、発酵の間ｐＨを調整した。ｐＨは２Ｎの水酸化ナ
トリウムを用いて５．５に維持した。攪拌速度は毎分６
０回転に維持した。４０℃で培養した。媒質に植えた開
始培養物の量は１％であった。発酵の間（時間＝６時
間、９時間と２４時間）、いくつかのサンプルを抜き出
し、凍結して分析し、多糖類を抽出した。
【００５９】１.２．多糖類の抽出
【００６０】等量のトリクロロ酢酸（４０％）をサンプ
ルに添加し、沈殿、ついで遠心分離（１７０００ｇ、２
０分）によってタンパク質を除去した。多糖類を含む上
澄みの分画に同じ量のアセトンを添加した。沈殿した多
糖類は遠心分離（１７０００ｇ、２０分）で分離した。
【００６１】結果として沈殿した分画は蒸留水に溶かし
ｐＨは水酸化ナトリウム溶液で７．０に調整した。蒸留
水で透析した後（一夜）、溶けなかった物質を超遠心分
離（１１００００ｇ，１時間）で除去した。
【００６２】多糖類を含有する上澄み分画は凍結乾燥さ
れ、粗脱水多糖類が最終的に得られた。総中性糖含有率
はフェノール−硫酸法で決定した。
【００６３】１.３．エキソ多糖類の大きさ
【００６４】濾過は純度を確認し、ＦＰＬＣシステム
（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて多糖類の分子量を求め
るために実施した。使用したカラムはＳｕｐｅｒｏｓｅ
６（１．０ｃｍ×３０ｃｍ）であった（図１）。２００
〜４００μｇの脱水多糖類を含む２００μｌのサンプル
をカラムに充填し、毎分０．５ｍｌの速度でｐＨ７．２
で５０ｍＭのリン酸塩緩衝液で溶出した。分画（１．０
ｍｌ）は試験管内に収集した。それぞれの試験管内の多
糖類含有率はフェノール−硫酸法によって総中性糖とし
て決定した。
【００６５】１.４．単糖類の組成
【００６６】凍結乾燥多糖類の単糖類組成は気体液体ク
ロマトグラフィー技術を用いて分析した（参考文献２
１）。
【００６７】消費された培養液から得られたエキソ多糖
類は３つのサンプル（時間＝６時間、９時間と２４時
間）から抽出した後に検査した。その結果を表１に示
す。収率は発酵時間に応じて増加するが、重合体の大き
さと単糖類の組成は変化しないことがわかった。
【００６８】
【表１】
【００６９】図１はＦＰＬＣ分析（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６
のカラムで）ｔ＝２４時間で得られた多糖類の溶出と純
度を示している。多糖類は排除限度（およそ２×１０6
Ｍ．Ｗ．）の前後で溶出した。
【００７０】１.５．非調節発酵で得られた多糖類の収
率
【００７１】上述の多糖類はラクトバチルス・ヘルベチ
クスＣＮＣＭ Ｉ−１４４９単体で、或いはストレプト
コッカス・テルモフィルス（たとえば、Ｓ．テルモフィ
ルスＹＳ４）の菌株と共に用いられたこの菌株によっ
て、凝固条件での発酵の間にも生成された。
【００７２】この目的のために、生長媒体は発酵に先立
って殺菌のために加熱処理した（１１５℃、３５分）１
０％の再生ＭＳＫ（脱脂粉乳：１００ｇ／ｌと酵母抽出
物：１ｇ／ｌ）とした。典型的なサンプルの大きさは２
５０ｍｌ、４０℃で培養、媒質に植えた開始培養物の量
は１％であった。この条件で得られた純粋な多糖類の収
率は下記の表２のとおりであった。
【００７３】
【表２】
【００７４】２．ラクトバチルス・ヘルベチクスＣＮＣ
Ｍ Ｉ−１４４９によって生成されたエキソ多糖類の構
造特性化に用いた方法
【００７５】２.１．単糖類の分析
【００７６】多糖類（０．１ｍｇ）はメタノール化（メ
タノール性０．５Ｍ ＨＣｌ，２４時間、８０℃）し、
Ｎ−リアセチル化された（室温で一晩）。トリメチルシ
リル化したメチルグリコシドをＢＰ１溶融シリカ毛細管
カラム（２５ｍ×０．３２ｍｍ、ＳＧＥ）を用いて気相
クロマトグラフィー（Ｖａｒｉａｎ３４００）で分析し
た。溶出はカラムに毎分２℃で１２０℃から２４０℃の
温度勾配をかけて実施した。単糖類の絶対形状はトリメ
チルシリル化（Ｎ−リアセチル化）（−）−２−ブチル
グリコシドのＧＬＣによって決定した。
【００７７】２.２．メチル化分析
【００７８】サンプル（天然多糖類とオリゴ糖類アルジ
トール）は過メチル化し、メチル化生成物はメタノール
分解または酸加水分解（トリフルオロ酢酸４Ｎ，４時
間、１００℃）にかけ、その後ＢＤ4Ｎａで還元した。
【００７９】部分的にメチル化しアセチル化（ピリジ
ン.無水酢酸１：１）メチルグリコシドとアルジトール
は７０ｅｖの電子エネルギーと０．２ｍＡのイオン化電
流を用いてＮｅｒｍａｇ Ｒ１０−１０Ｓ質量分析計で
ｅ．ｉ．モードでＧＬＣ（ＢＰ１カラム）とＧＬＣ Ｍ
Ｓで識別した。
【００８０】２.３．部分酸加水分解
【００８１】多糖類（４０ｍｇ）を４ｍｌの０．５Ｍト
リフルオロ酢酸内で１時間３０分、１００℃で加水分解
した。完全な加水分解と低質量のオリゴ糖の獲得はブタ
ノール／水／酢酸２：１：１．５溶剤を用いるシリカゲ
ル６０ Ｆ２５４アルミシート（Ｍｅｒｃｋ）上の薄膜
クロマトグラフィーとオルシノール−硫酸による検出で
監視した。
【００８２】２.４．Ｈ．ｐ．ａ．ｅ−ｐ．ａ．ｄ．ク
ロマトグラフィー
【００８３】ＨＷ４０ピークの分別はＤｉｏｎｅｘ Ｂ
ｉｏ−ＬＣ４成分勾配モジュール、モデルｐ．ａ．ｄ．
２検出器とＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ−１ペリキュラーア
ニオン交換カラム（２５０×９ｍｍ）から成るＨＰＡＥ
−ＰＡＤ Ｄｉｏｎｅｘ ＬＣシステムで実施した。
【００８４】２つの溶出プログラムを用いた：
【００８５】・プログラム１：
【００８６】９９：１溶離剤Ａ（０．１Ｍ ＮａＯＨ）
−溶離剤Ｂ（Ｍ ＣＨ3ＣＯＯＮａを含有する０．１Ｍ
ＮａＯＨ）で０．２分間、ついで６５：３５溶離剤Ａ
（ＭＣＨ3ＣＯＯＮａを含有する０．１Ｍ ＮａＯＨ）
毎分３ｍｌで６０分。
【００８７】・プログラム２：
【００８８】９８：２溶離剤Ａ−溶離剤Ｂ、ついで７
０：３０溶離剤Ａ−溶離剤Ｂで６０分。
【００８９】溶出した分画はただちにＭ酢酸で中和し、
凍結乾燥した。分画は消イオン水を溶離剤として用い
て、Ｄｏｗｅｘ ５０Ｘ８（Ｈ’）樹脂のカラム（６×
１ｃｍ）とＦｒａｃｔｏｇｅｌのカラム（５５×２ｃ
ｍ）で連続的に脱塩した。
【００９０】２.５．1Ｈ−核磁気共鳴分光測定
【００９１】1Ｈ−ＮＭＲ測定において、重水素−交換
オリゴ糖は０．５ｍｌの 2Ｈ2Ｏ（９９．９６％ 原子
2Ｈ、Ａｌｄｒｉｃｈ）内に溶解した。４００ＭＨｚ 1
Ｈ−ＮＭＲ実験は５ｍｍ 1Ｈ−／13Ｃ 混合探子ヘッ
ドを備えた、脈動フーリエ変換モードで運転され、Ａｓ
ｐｅｃｔ３０００コンピュータ（共同測定センター、リ
ル・フランドル・アルトワ大学）によって制御されるＢ
ｒｕｋｅｒ ＡＭ−４００ＷＢ分光計で実施した。
【００９２】すべてのスペクトルは探子温度３５３°Ｋ
で得られた。１次元のスペクトルは１６Ｋ周波数−ドメ
インポイントと時間−ドメインデータポイントについて
３０００Ｈｚのスペクトル幅で得られ、最終デジタル解
像度は０．３６５Ｈｚ／ポイントであった。
【００９３】１００ＭＨｚ 13Ｃ−ＮＭＲ実験は 1Ｈ複
合パルス減結合で標準Ｂｒｕｃｋｅｒパルスプログラム
Ｐｏｗｇａｔｅで得られた。スペクトル幅は３２Ｋ周波
数−ドメインポイントと時間−ドメインデータについて
２２．７２７Ｈｚであり、最終デジタル解像度は１．３
８７Ｈｚ／ポイントであった；９０度パルス（６μｓ）
と１ｓのリサイクル遅延を用いた。薬品はアセトンのメ
チル基の信号に対して与えられた（ 1Ｈではδ２．２２
５、13Ｃについてはδ３１．５５）。
【００９４】２Ｄ−同一核分子ＣＯＳＹ４５、単一、二
重、三重中継転位ＣＯＳＹは標準Ｂｒｕｋｅｒパルスプ
ログラムライブラリまたはＢ．Ｐｅｒｌｙによって与え
られたプログラム（Ｃ．Ｅ．Ａ．，Ｓａｃｌａｙ）によ
って実施された。すべてのＲＣＴ実験について、３５ｍ
ｓの再合焦遅延を選定し、緩和遅延を２ｓとした。これ
らすべての実験において、スペクトル幅は１８４０Ｈｚ
で、1Ｈ９０度パルスは１０．６μｓであった、２５６
Ｗ×２Ｋのデータマトリクスが得られ、フーリエ変換に
先立って０を代入し、１Ｋ×２Ｋスペクトルデータマト
リクスが得られ、両方の次元について正弦ベル平方関数
を使用した。
【００９５】２Ｄ−13Ｃ／1Ｈ ＣＯＳＹ実験は標準Ｂｒ
ｕｋｅｒパルスプログラムＸＨＣＯＲＲＤを用いて1Ｈ
同一核分子結合を同時に抑圧して実施した。再合焦遅延
は１５０ＫＨｚの平均 1ｊC.H 結合定数に調節した。1
Ｈと13Ｃ９０度パルス幅は１０．６と６μｓであった。
緩和遅延は０．８ｓであった。１２８Ｗ×４Ｋのデータ
マトリクスが得られ、それに０を入れてからフーリエ変
換を実施し、５１２Ｗ×４Ｋのスペクトルデータマトリ
クスが得られた。13Ｃ−サブスペクトルのための対数関
数（ＬＢ＝１Ｈｚ）と1Ｈ−スペクトルのための正弦ベ
ル関数はＳＮ比を上げるのに適用した。
【００９６】３．ラクトバチルス・ヘルベチクスＣＮＣ
Ｍ Ｉ−１４４９によって生成されたエキソ多糖類の構
造
【００９７】３.１．多糖類の単離と組成分析
【００９８】トリメチルシリル化グリコシドと（−）−
２−ブチルグリコシドのＧＬＣ．分析はＤ−ガラクトー
スとＤ−グルコースがモル比１：１で存在することによ
って確認された。
【００９９】ＮＭＲ分光測定
【０１００】Ｄ2Ｏ、８０℃で記録された天然多糖類の
４００ＭＨｚ 1Ｈ n.m.r.スペクトルは１：２：２：１
の比率でアノマー陽子に特徴的な５．２０１、５．１５
８、４．５６８と４．３５０ｐｐｍで４つの信号を示し
６価の多糖類の反復単位を示唆している（表３）。
【０１０１】これは６つのアノマー炭素信号（１０８．
９５、１０３．７４、１０３．８、１０２．５２、１０
０．２６と９９．８７ｐｐｍ）を示す１００ＭＨｚ 13
Ｃスペクトル（表３）によって確認された。
【０１０２】1Ｈスピンシステムによれば、２つのセタ
ップス(setaps)中継ＣＯＳＹスペクトル上に描かれた個
々の糖単位上で、単糖類はそれぞれβ−Ｇａｌf（残留
物Ａ）、β−Ｄ−Ｇｌｃp（残留物ＢとＥ）、α−Ｄ−
Ｇｌｃp（残留物Ｃ），α−Ｄ−Ｇａｌp（残留物Ｄ）お
よびβ−Ｄ−Ｇａｌp（残留物Ｆ）として識別されるだ
ろう。
【０１０３】部分酸加水分解(後述)によって得られたオ
リゴ糖アルジトールＩＶ ＢとＩＩＡの中継ＣＯＳＹス
ペクトルの検査によってβ−Ｄ−Ｇａｌpが明らかに識
別された。多糖類のＣＯＳＹスペクトルによって示され
たようにβ−Ｄ−Ｇａｌp Ｆ残留物のＨ−２とＨ−３は
強い結合定数を示し、その多数のパターンを分析できな
い。
【０１０４】1Ｈ−13Ｃヘテロ核ＣＯＳＹスペクトル内
に認められた相関のピークは陽子共鳴の１つ（５．１５
８ｐｐｍ）が１０８．９５ｐｐｍでデシールドされた(d
eshielded)炭素共鳴に結びつけられることを示し、その
ことはＧａｌf Ａ残留物についてβ−アノマー配置を証
明している。
【０１０５】大半の陽子共鳴は、β−Ｄ−Ｇａｌp Ｆ残
留物のＨ−５とＨ−６スピンシステムを除いて同一核分
子ＣＯＳＹスペクトルに割り当てることができる。炭素
共鳴も直接相関によってその付着陽子に割り当てられ
る。
【０１０６】７３．５２と６１．１２ｐｐｍの２つの残
った非帰属炭素はβ−Ｄ−ＧａｌpＦ残留物のＣ−５お
よびＣ−６原子共鳴に対応すると演繹された。
【０１０７】要約すると、これらすべての帰属はそれら
のダウンフィールドへ変位した炭素共鳴にしたがって、
それぞれの糖単位の置換パターンを明確に提供する：
【０１０８】β−Ｄ−Ｇａｌf ＡについてはＣ−３とＣ
−５、α−Ｄ−Ｇｌｃp ＣについてはＣ−３、α−Ｄ−
Ｇａｌp ＤについてはＣ−３、β−Ｄ−Ｇｌｃp Ｂにつ
いてはＣ−３、またβ−Ｄ−Ｇｌｃp ＥについてはＣ−
４。
【０１０９】ダウンフィールド変位 13Ｃ共鳴を持たな
い６番目の糖単位β−Ｄ−ＧａｌpＦは、従って、非還
元位置で発生する。
【０１１０】３.２．メチル化分析
【０１１１】ＮＭＲの結果は部分的にメチル化された酢
酸アルジトールとペルメチル化多糖類から得られたメチ
ルグリコシド（表４）のＧＬＣ ＭＳ分析によって裏付
けされ、確認された。実際それは末端ガラクトシル残留
物の存在を示している。３−連結グルコシル残留物、４
−連結グルコシル残留物、３−連結ガラクトシル残留物
と３，５連結ガラクトシル残留物の比はそれぞれ１：
２：１：１：１。
【０１１２】３.３．部分酸加水分解
【０１１３】分岐末端ガラクトシル残留物の位置を明ら
かにするために、オリゴ糖が天然多糖類の部分酸加水分
解によって生成された。加水分解物からＦｒａｃｔｏｇ
ｅｌＨＷ４０ Ｆ上でのゲル濾過によって６つの主要分
画が分離された（図２）。
【０１１４】そのうち２つ（分画ＩＩとＩＶ）がＨＰＡ
Ｅ−ＰＡＤクロマトグラフィーにかけられ（図３、図４
と表５）、ＩＩ Ａ、ＩＶ ＡとＩＶ Ｂで示した副分画
の構造はＮＭＲとメチル化分析の両方によって調査され
た。
【０１１５】オリゴ糖・アルジトールＩＶ Ａは２段階
中継ＣＯＳＹスペクトルに描かれた1Ｈスピンシステム
によって示されたごとく２つのＧｌｃ残留物と１つのヘ
キシトール残留物を含んでいる。２つのＧｌｃ残留物
は，２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチルグルシトール
を提供したメチル化分析によって確認されたごとく、非
還元末端位置で発生する。最後の誘導体はフラン糖のＣ
−３およびＣ−５置換特性に対応するパターンを示して
いる。以前のn.m.r.データから、このヘキシトールはβ
−Ｄ−Ｇａｌf Ａ単位に由来している。これらの所見か
らつぎの構造が導かれる。
【０１１６】
【化４】
【０１１７】ここで注意するのは、ガラクチトールの1
Ｈスピンシステムは対称性を示すので、化合物の1Ｈ Ｎ
ＭＲ割り当ては化合物のＩＶ Ｂ構造が解明された後に
達成されることである。
【０１１８】オリゴ糖−アルジトールＩＶ Ｂは、隣接
結合定数のパターンによって明らかに示されるごとくβ
−Ｄ−Ｇａｌp とβ−Ｄ−Ｇｌｃp を１：１の比率で含
んでいる。メチル化分析（表６）は２，３，４，６−テ
トラ−Ｏ−メチルガラクトース、２，３，６−トリ−Ｏ
−メチルグルコースおよび１，２，４，５，６−ペンタ
−Ｏ−メチルガラクチトールの存在を示した。従って、
オリゴ糖アルジトール２は次の構造を持っている：
【０１１９】
【化５】
【０１２０】Ｇａｌ−ｏｌのＣ−３にβ−Ｄ−Ｇｌｃp
が付着しても、化合物ＩＶ ＡからのＮＭＲデータに比
較して、ヘキシトールのＨ−１およびＨ−２共鳴の化学
変位を劇的に変えるとは思われない。従って、３．７７
と４．０５６ｐｐｍの２つの信号はＧａｌ−ｏｌのＨ−
１とＨ−２に割り当てられ、他方Ｈ−５とＨ−６原子共
鳴は化合物ＩＶ Ａと比較して４．１４９と３．６８ｐ
ｐｍにアップフィールド変位している（表５）。
【０１２１】ＩＶ ＡとＩＶ ＢのＮＭＲスペクトルに
おいて、Ｇａｌ−ｏｌのＨ−５共鳴は分子の原子共鳴の
中でもっともアップフィールド変位し、この所見は他者
によって提議されている割り当てに一致している。
【０１２２】オリゴ糖アルジトールＩＩ Ａ（表４）は
２ β−Ｄ−Ｇｌｃp、１ β−Ｄ−Ｇａｌp と１ α−Ｄ
−Ｇｌｃp 残留物を含んでいるが、Ｃ−３およびＣ−５
置換Ｇａｌ−ｏｌの存在は化合物１内のＧａｌ−ｏｌの
Ｈ−１からＨ−６への化学変位の類似性によって容易に
演繹できる。２つのβ−Ｄ−Ｇｌｃp 単位と非還元性末
端β−Ｄ−Ｇａｌp はすでにオリゴ糖アルジトールＩＶ
ＡおよびＩＶ Ｂ内に位置するので、またβ−Ｄ−Ｇｌ
ｃp Ｂ残留物がＣ−３置換体であるという事実から、オ
リゴ糖アルジトールＩＩ Ａは次の構造をもっている。
【０１２３】
【化６】
【０１２４】６番目の糖単位、α−Ｄ−Ｇａｌp は部分
加水分解生成物の中には認められなかった。それにもか
かわらず、α−Ｄ−Ｇｌｃp 単位ＣがＣ−３置換体であ
り、多糖類内に存在するβ−Ｄ−Ｇａｌp だけが非還元
位置を占める（ＮＭＲデータから）という事実から、α
−Ｄ−Ｇａｌp がこのα−Ｄ−Ｇｌｃp 残留物に付着す
るという結論が導かれる。
【０１２５】従って、多糖類の構造単位は下記のように
定義された：
【０１２６】
【化７】
【０１２７】表３は、８０℃でのＤ2Ｏ内からの多糖類
のＮＭＲ化学変位（内部標準：アセトン）を示す。
【０１２８】
【表３】
【０１２９】表４は、天然多糖類のメチル化分析を示
す。
【０１３０】
【表４】
【０１３１】表５は、３５３゜KでＤ２Ｏ内のラクトバチ
ルス・ヘルベチクスから多糖類の酸部分加水分解によっ
て得られたオリゴ糖アルジトールのＮＭＲ化学変位を示
す。
【０１３２】
【表５】
【０１３３】表６は、天然多糖類の部分酸加水分解で得
られたオリゴ糖アルジトール（部分メチル化およびアセ
チル化メチルグリコシド）ＩＶ Ａ、ＩＶ ＢとＩＩ Ａ
のメチル化分析を示す。
【０１３４】
【表６】 （＊）：揮発性が高いために値は期待値よりも低い。
【０１３５】本発明による多糖類および／または微生物
を含む組成物は下記に例を挙げるがこれらに限定されな
い。
【０１３６】
【実施例１】：凝固酸敗乳
【０１３７】本発明によるＬ．ヘルベチクス菌株と凝固
したヨーグルトの生産に伝統的に使用されている２つの
Ｓ．テルモフィラス菌株を含む凝固した酸敗乳は次の方
法で得られた。３．７％の脂肪分を含む全乳に２．５％
の脱脂粉乳を加えた。４０リットルのこの乳を９２℃で
６分間低温殺菌し、７５℃、１５０バールで均質化（２
レベル）し、４２℃前後で冷却した。凍結乾燥したＳ．
テルモフィラスＣＮＣＭ Ｉ−１４２２、Ｓ．テルモフ
ィラスＣＮＣＭ Ｉ−１４２４とＬ．ヘルベチクスＣＮ
ＣＭ Ｉ−１４４９の菌株を殺菌ＭＳＫ媒質（市販の酵
母抽出物を０．１％含有する、１０％で戻した脱脂粉
乳）内でいくつかの連続する培養液で再活性化した。微
生物はブダペスト条約に従ってストレプトコッカス菌株
は１９９４年５月１８日に、ラクトバチルス菌株は１９
９４年７月２７日に国立微生物培養保管所（ＣＮＣ
Ｍ）、パスツール研究所、２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃ
ｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥ
ＤＥＸ １５， ＦＲＡＮＣＥ に寄託された。殺菌し
た乳はそれぞれＳ．テルモフィラス菌株の第３の培養菌
１％と媒質凝固段階で取られたＬ．ヘルベチクス菌株の
第２の培養菌２％を植えられた。乳は４２℃、ｐＨは
４．６５前後で保温し、ついで４℃で冷却した。
【０１３８】
【実施例２】：酸敗乳清
【０１３９】本発明によるＬ．ヘルベチクス菌株とヨー
グルトの生産に伝統的に使用されている２つのＳ．テル
モフィラス菌株を含む乳清は次の方法で得られた。甘い
乳漿(lactoserum)粉を水中で１２．５％で戻した。４０
リットルのこの乳清を９２℃で６分間低温殺菌し、７５
℃、１５０バールで均質化（２レベル）し、４２℃前後
で冷却した。凍結乾燥したＳ．テルモフィラスＣＮＣＭ
Ｉ−１４２２、Ｓ．テルモフィラスＣＮＣＭ Ｉ−１４
２４とＬ．ヘルベチクスＣＮＣＭ Ｉ−１４４９の菌株
を殺菌ＭＳＫ媒質（市販の酵母抽出物を０．１％含有す
る、１０％で戻した脱脂粉乳）内でいくつかの連続する
培養液で再活性化した。微生物はブダペスト条約に従っ
てストレプトコッカス菌株は１９９４年５月１８日に、
ラクトバチルス菌株は１９９４年７月２７日に国立微生
物培養保管所（ＣＮＣＭ）、パスツール研究所、２８
ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７５７２
４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５， ＦＲＡＮＣＥ
に寄託された。殺菌した乳はそれぞれのＳ．テルモフィ
ラス菌株の第３の培養菌１％と媒質凝固段階で取られた
Ｌ．ヘルベチクス菌株の第２の培養菌２％を植えられ
た。乳清は４２℃、ｐＨは４．６５前後で保温し、つい
で４℃で冷却した。
【０１４０】
【実施例３】：攪拌酸敗乳
【０１４１】本発明によるＬ．ヘルベチクスＣＮＣＭ
Ｉ−１４４９菌株と攪拌ヨーグルトの生産に伝統的に使
用されている２つの市販のＳ．テルモフィラス菌株を含
む撹拌した酸敗乳は次の方法で得られた。乳は、２．５
％の脱脂粉乳を添加して、３．７％の脂肪を含む全乳か
ら得られた。４０リットルのこの乳を１０５℃で２分間
低温殺菌し、７５℃、３００バールで均質化（１レベ
ル）し、４３℃前後で冷却した。凍結乾燥したＳ．テル
モフィラスＣＮＣＭ Ｉ−１４２１、Ｓ．テルモフィラ
スＣＮＣＭ Ｉ−１４２３とＬ．ヘルベチクスＣＮＣＭ
Ｉ−１４４９の菌株を殺菌ＭＳＫ媒質内でいくつかの連
続する培養液で再活性化した。微生物はブダペスト条約
に従ってストレプトコッカス菌株は１９９４年５月１８
日に、ラクトバチルス菌株は１９９４年７月２７日に国
立微生物培養保管所（ＣＮＣＭ）、パスツール研究所、
２８ ｒｕｅ ｄｕ Ｄｏｃｔｅｕｒ Ｒｏｕｘ， ７
５７２４ ＰＡＲＩＳ ＣＥＤＥＸ １５， ＦＲＡＮ
ＣＥ に寄託された。殺菌した乳はそれぞれＳ．テルモ
フィラス菌株の第３の培養菌１％と媒質凝固段階で取ら
れたＬ．ヘルベチクス菌株の第３の培養菌２％を植えら
れた。乳は４３℃、ｐＨは４．６５前後で保温し、つい
で撹拌している間４℃で冷却した。次の表７は得られた
製品の特性を表している。
【０１４２】
【表７】
【０１４３】
【実施例４】：口腔衛生のための化粧品組成
【０１４４】
【表８】
【０１４５】
【実施例５】：皮膚衛生のための化粧品組成
【０１４６】
【表９】
【０１４７】
【実施例６】：下痢止め用途の薬剤組成物
【０１４８】薬剤組成物はゼラチンと水で作られ、本発
明によるエキソ多糖類を５から５０ｍｇ含むカプセルの
形で得られた。代案として、上記実施例１、２と３に記
載の酸化した培養乳から、これらの発酵乳及び乳清を凍
結乾燥して、粉末錠剤配合を直接得ることができる。
【０１４９】
【参考文献リスト】
【０１５０】
【表１０】
【０１５１】
【表１１】
【０１５２】
【表１２】
【０１５３】
【表１３】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による多糖類のクロマトグラフィー（Ｆ
ＰＬＣ）分析を示している。
【図２】多糖類の加水分解物からゲル濾過で分離した６
つの主要な分画を示している。
【図３】分画ＩＩのクロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−Ｐ
ＡＤ）分析を示している。
【図４】分画ＩＶのクロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−Ｐ
ＡＤ）分析を示している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 7/00 Ｗ 7/16 7/16 9/08 9/08 Ｅ 9/14 9/20 Ｂ 9/20 9/48 Ｃ 9/48 Ｆ 31/715 ＡＣＲ 31/715 ＡＣＲ 8828−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ａ Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ Ｃ１２Ｐ 19/04 Ａ６１Ｋ 9/14 Ｌ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:225） (72)発明者 ルモワンヌ ジェローム フランス共和国，エフ−59000 リール, リュ ダラス 200 (72)発明者 ニセール ジョン−リシャール スイス，セーアッシュ−1073 サヴィニ ー，ソンチエール ドゥ クータレ ６

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 置換可能なラクトース単位だけから成る
    反復側鎖を有する主鎖を含むことを特徴とする天然の可
    溶性分岐多糖類。
  2. 【請求項２】 下記の化学式に対応する、請求項１に記
    載の分岐多糖類。 【化１】 ここで ｎ＞１、 Ｇａｌ＝ガラクトース、 Ｇｌｃ＝グルコース、 Ｒ1＝水素またはＧａｌＮＡｃβ１（Ｎ−アセチルガラ
    クトサミン） Ｒ2＝水素、ＮｅｕＮＡｃα２（Ｎ−アセチルノイラミ
    ン酸）またはＨＳＯ3 Ｒ3＝水素またはＦｕｃα１（フコース）
  3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の分岐多糖類を
    生成する微生物。
  4. 【請求項４】 ラクトバチルス・ヘルベチクス(Lactoba
    cillus helveticus)の菌株、好ましくはラクトバチルス
    ・ヘルベチクスＣＮＣＭ Ｉ−１４４９の菌株であるこ
    とを特徴とする、請求項３に記載の微生物。
  5. 【請求項５】 前記請求項１から４のいずれかに記載の
    分岐多糖類および／または微生物を含む食品組成物。
  6. 【請求項６】 凝固または攪拌した酸敗乳または乳清か
    ら成る群から選ばれることを特徴とする、請求項５に記
    載の食品組成物。
  7. 【請求項７】 前記請求項１から４のいずれかに記載の
    分岐多糖類および／または微生物を含む化粧品組成物。
  8. 【請求項８】 請求項７に記載の化粧品組成物におい
    て、口腔洗浄液、練り歯磨き、歯科ゲル、チューインガ
    ム、錠剤、クリーム、軟膏、香膏から成る群から選ばれ
    ることを特徴とする化粧品組成物。
  9. 【請求項９】 前記請求項１から４のいずれかに記載の
    分岐多糖類および／または微生物を含む薬剤組成物。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の薬剤組成物におい
    て、カプセル、シロップ、粉末、錠剤から成る群から選
    ばれることを特徴とする、薬剤組成物。
JP7233177A 1994-08-19 1995-08-21 分岐多糖類、それを生産する微生物とそれらを含有する組成物 Pending JPH08277303A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
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