PT699689E - Polissacarideo ramificado microorganismo que o produz e composicoes contendo-os - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO “Polissacarídeo ramificado, microrganismo que o produz e composições contendo-os”
Campo do invento O presente invento respeita a um novo polissacarídeo ramificado, a um microrganismo que o produz, à composição alimentar, à composição farmacêutica e à composição cosmética que os contêm.
Bases do invento A comunicação biológica (a possibilidàde de uma célula reconhecer uma molécula ou outra célula) é um fenómeno central tanto no estado patológico como no normal.
Entre os vários mecanismos de reconhecimento molecular entre as células, e/ou entre as células e as moléculas, a ligação de estruturas glicosídicas específicas por proteínas especializadas (lectinas) é hoje considerada como um sistema principal de reconhecimento molecular.
As lectinas podem ser ligadas específica e não-covalentemente a sequências glicosídicas bem definidas.
Algumas lectinas são ligadas a oligossacarídeos que contêm montantes de manose elevados, a estruturas que transportam ácidos siálicos, a glicósidos fucosilados.....
Outras lectinas podem ligar β-galactósidos e lactose.
Existem co-agregações multigenéricas entre as células bacterianas orais (Actinomyces naeslundii ou viscosus, Strepcococcus mitis ou sanguis,
Fusobacterium nucleatum, Porphymmonas gingivalis, Bacteriodes intermedius, ...) as quais se agregam e formam uma rede como a placa dental.
Entre estas células bacterianas, a interacção é muitas vezes obtida por uma ligação não-covalente entre uma lectina β-galactósida numa célula e um receptor glicosídico noutra célula (ref. 1). A maioria das doenças infecciosas são iniciadas pela adesão de agentes patogénicos (Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Bacteriodes intermedius, Salmonella typhimurium, Vibrio Cholera, Campylobacter jejuni, Bacteriodes, Fusobacteria, Clostridia, Shigella, Yersinia e Helicobacter pylori, ...) às células epiteliais da mucosa do seu hospedeiro, o que permite então a colonização dos tecidos do animal.
Esta adesão é muitas vezes obtida por uma ligação entre uma lectina β-galactósida localizada na superfície de tal agente patogénico e um receptor glicosídico localizado na superfície da célula epitelial (ref. 2). Várias células do sistema imune (linfócitos T e B, macrófagos e neutrófilos) são conhecidas quer por serem capazes de ligar lectinas β-galactósidas, quer por exprimirem na sua superfície tais lectinas da família das galectinas.
Adicionalmente, algumas células epiteliais tais como células intestinais ou queratinócitos produzem estas galectinas que podem também cobrir células de Langerhans e as imunoglubinas tais como a IgE podem especificamente ligar-se às galectinas (ref. 3, 4 e 5).
Estado da técnica
Houve muitos estudos anteriores acerca dos polissacarídeos produzidos por microrganismos e, nos anos recentes, houve vários relatórios de estudos sobre a estrutura de polissacarídeos exocelulares obtidos pela bactéria do ácido láctico e sobre as suas actividades biológicas.
Um polissacarídeo composto de galactose, glucose e N- -acetilgalactosamina (2:1:1) é obtido pelas estirpes de Streptococcus thermophilus CNCM I-733, CNCM I-734 e CNCM I-735 (ref. 6 e 7); um polissacarídeo composto apenas de galactose é obtido pela estirpe Lactococcus cremoris H414 (ref. 8); um polissacarídeo composto de galactose, glucose, ramnose e fosfato (2:2:1:1) é obtido pela estirpe Lactococcus cremoris SBT 0495 (ref. 9); um polissacarídeo composto de galactose, glucose e ramnose (5:1:1) é obtido pela estirpe Lactobacillus bulgaricus rr (ref. 10); um polissacarídeo composto de glucose, ramnose, 1-fosfoglicerol e um grupo O-acetil (3:2:1:0,85) é obtido pela estirpe Lactobacillus sake 0-1 (ref. 11).
Por outro lado, foram estudados outros polissacarídeos obtidos por algumas estirpes de Lactobacillus helveticus, mas nunca foram demonstradas as suas características estruturais. Por exemplo, um polissacarídeo de estrutura desconhecida composto de glucose e galactose (2:1) usado como agente anti-tumor é obtido pela estirpe Lactobacillus helveticus var. jugurti No 851 "FERM BP-66 (FERM-P No. 5851)" (ref. 12 e 13). De igual modo, um polissacarídeo de estrutura desconhecida composto de galactose, glucose e N-acetilglucasamina (2,5-3,5:2,5-3,5:1), usado no tratamento de inflamações e na aceleração do crescimento da medula óssea, é obtido pela estirpe Lactobacillus helveticus MIKI-010 (ref. 14). O pedido de patente japonesa JP-A-5039304 descreve uma cultura de bactéria láctea que produz um polissacarídeo feito de unidades de glucose e de galactose numa razão molecular de 1/1.
Milchwissenschaft, Vol. 42(9) 1987 páginas 565-568 descreve um polissacarídeo obtido da estirpe Lactobacillus kefir feito de unidades de glucose e de galactose numa razão molecular de 1/0, 0,96-1,09.
Estes documentos não descrevem uma cadeia sacarídea dotada de cadeias laterais que se repetem feitas apenas de unidades de lactose.
Um objectivo último do invento é fornecer um polissacarídeo que possa ser usado como um produto intermédio para a produção de derivados polimerizados de sialil- e sulfatado- Lewis X.
Descrição do invento O presente invento refere-se a um novo polissacarídeo ramificado natural solúvel que compreende uma cadeia principal possuindo cadeias laterais repetidas que são unidades de lactose, eventualmente substituídas.
De acordo com uma concretização preferencial do presente invento, o polissacarídeo ramificado corresponde à seguinte fórmula: 3 Gala 1 - 3 Glc a 1-3 Glc β 1 - 5 Galf β 1 n,
Gal β 1 3 R' / 4 Glc β 1 3 RÂ onde n > 1,
Gal = galactose,
Glc = glucose, R1 = hidrogénio, NeuNAca2 (ácido N-acetilneuramínico) ou HS03, R2 = hidrogénio ou Fuca1 (fucose).
Quando R1 = R2 = Hidrogénio, o polissacarídeo ramificado é caracterizado pelas seguintes propriedades físico-químicas: - peso molecular superior a 2.000.000; - solúvel na água e em soluções contendo menos do que 20% de ácido tricloroacético; - insolúvel no álcool e na acetona; - propriedade neutra; - o produto congelado-desidratado encontra-se em forma de pó branco; - açúcares componentes e razões de composição;
Glucose : Galactose (1 : 1,1).
Quando R1 é NeuNAca2 (Ácido N-acetilneuramínico) ou HS03 e R2 é Fucal (fucose), o polissacarídeo ramificado é um derivado dos produtos farmacêuticos sialil- ou sulfatado- Lewis X descritos nos documentos 15 e 16.
As ligações entre Gal β 1 - 4 Glc e R1, R2 são vantajosamente obtidas através de um produto intermédio (o polissacarídeo com R1 = R2 = Hidrogénio) pelo método descrito no documento 17. O presente invento também se refere a um microrganismo que produz o polissacarídeo ramificado tendo R1 = R2 = Hidrogénio.
Tal microrganismo corresponde à estirpe Lactobacillus helveticus, CNCM 1-1449.
Foi feito um depósito deste microrganismo de acordo com o Tratado de Budapeste, em 27 de Julho de 1994, na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANCE. O presente invento também se refere aos alimentos possuindo propriedades organolépticas e de textura melhoradas compreendendo o polissacarídeo e/ou o microrganismo de acordo com o invento.
Preferencialmente, tal composto alimentar é um leite acidificado solidificado ou um leite acidificado batido.
Outro aspecto do presente invento respeita à composição cosmética que compreende o polissacarídeo e/ou o microrganismo de acordo com o invento.
De acordo com uma concretização preferencial do invento, tal composição cosmética é um produto cosmético destinado à higiene bucal, escolhido entre o grupo que consiste de pasta de dentes, gel de dentes, solução bucal, pastilha elástica e/ou comprimidos.
De acordo com outra concretização preferencial do presente invento, tal composição cosmética é um produto destinado à higiene da pele, escolhido entre o grupo que consiste de creme, unguento ou bálsamo.
Outro aspecto do presente invento respeita à composição farmacêutica que compreende o polissacarídeo e/ou o microrganismo de acordo com o presente invento.
Vantajosamente, tal composição é um produto antidiarreico escolhido entre o grupo que consiste de cápsulas, xaropes, pós ou comprimidos.
Um último aspecto do presente invento respeita a um aparelho de diagnóstico e/ou de análises que compreende o polissacarídeo ramificado de acordo com o invento para captar moléculas específicas e/ou microrganismos.
Breve descrição dos desenhos A figura 1 representa a análise cromatográfica (FPLC) do polissacarídeo de acordo com o invento. A figura 2 representa seis fracções principais separadas por filtração em gel através de um hidrolisado polissacarídeo. A figura 3 representa a análise cromatográfica (HPAE - PAD) da fracção II. A figura 4 representa a análise cromatográfica (HPAE - PAD) da fracção IV.
Descrição de uma concretização preferencial do presente invento 0 presente invento refere-se a um novo polissacarídeo ramificado natural solúvel que compreende uma cadeia principal com cadeias laterais repetidas que são unidades de lactose; sendo tal lactose eventualmente substituída. O "polissacarídeo ramificado" de acordo com o invento é um sacarídeo contendo mais de 10 unidades repetidas, preferencialmente mais de 40 unidades repetidas.
Tal polissacarídeo ramificado tem preferencialmente a forma de um "polímero" consistindo na repetição de unidades individuais idênticas que compreendem uma cadeia lateral 2 ramificada numa cadeia principal 1, conforme descrito abaixo:
n >1 A produção e a estrutura físico-química de um polissacarídeo de acordo com o invento irão ser descritas mais adiante. 1. PREPARAÇÃO E PURIFICAÇÃO DE UM EXOPOLISSACARÍDEO PRODUZIDO POR LACTOBACILLUS HELVETICUS CNCM1-1449 1.1. Condições de fermentação
Lactobacillus helveticus CNCM 1-1449 foi um cordão de uma estirpe da colecção de estirpes da Nestlé. Entre as 168 estirpes de L. helveticus da colecção da Nestlé, apenas 2 estirpes produzem exopolissacarídeos. O meio de crescimento foi leite desnatado 10% reconstituído, tratado a temperatura alta (115°C, 35 min) com vista à esterilização prévia, antes da fermentação. Foi usado um aparelho de fermentação com capacidade nominal de um litro, com um agitador magnético, para regular o pH durante a fermentação. O pH foi mantido a 5,5, usando hidróxido de sódio 2N. A frequência da agitação foi mantida nas 60RPM. A incubação foi feita a 40°C. A quantidade de cultura de arranque inoculada no meio foi de 1%. Durante a fermentação (tempo = 6h, 9h e 24h), várias amostras foram colhidas e congeladas para ulterior análise e extracção de polissacarídeo. 1-2. Extracçãodo Polissacarídeo Ácido tricloroacetático (40%) foi adicionado em partes (volume) iguais à amostra para retirar as proteínas por precipitação seguida de centrifugação (17.000g, 20 minutos). Á fracção sobrenadante contendo os polissacarídeos foi adicionado o mesmo volume de acetona. Os polissacarídeos precipitados foram então separados por centrifugação (17.000g, 20 minutos). A fracção precipitada resultante foi dissolvida em água destilada e o pH foi ajustado para 7,0 com uma solução de hidróxido de sódio. Após diálise em contacto com água destilada (durante a noite), foram removidas as substâncias insolúveis por ultracentrifugação (HO.OOOg, 1 hora). A fracção sobrenadante contendo polissacarídeos foi liofilizada e foram finalmente obtidos polissacarídeos desidratados em bruto. O conteúdo total de açúcar neutro foi determinado pelo método do ácido fenol-sulfúrico. 1.3. Tamanho do Exopolissacarídeo A filtração foi conduzida com vista a confirmar a pureza e a estimar o peso molecular dos polissacarídeos, usando o sistema FPLC (Pharmacia). A coluna usada foi Superose 6 (1,0 cm x 30 cm) (Fig. 1). Foram aplicadas amostras de 200 pl, contendo 200-400 pg de polissacarídeos desidratados, na coluna, sendo eluidas (dissolvidas) com tampão de fosfato 50 mM com um pH de 7,2 e à taxa de 0,5 ml/min. Fracções (1,0 ml) foram colhidas em tubos. O conteúdo de polissacarídeos de cada tubo foi determinado como o total de açúcar neutro, pelo método do ácido fenol-sulfúrico. 1.4. Composição dos monossacarídeos A composição dos monossacarídeos de um polissacarídeo congelado--desidratado foi analisada usando a técnica cromatográfica de gás-líquido (ref. 18). O exopolissacarídeo obtido a partir do meio de cultura usado foi examinado após a extracção de três amostras (tempo = 6h, 9h e 24h). Verificou-se que a produção aumentava em função do tempo de fermentação, mas que tanto o tamanho, como a composição dos monossacarídeos do polímero, eram invariáveis.
Composição dos monossacarídeos Período de Fermentação (horas) Produção Bruta (mg/l) Açúcares Neutros (%) Produção Pura (mg/l) Rha Gal Glc GalNAc 6 42 27,6 11,6 - 1,1 1 - 9 142 70,4 100,0 - 1,1 1 - 24 272 83,3 226,6 - 1,1 1 - A figura 1 mostra a eluição (dissolução) e a pureza do polissacarídeo obtidas para t = 24h, pela análise FPLC (com uma coluna de Superose 6). O polissacarídeo foi eluído (dissolvido) cerca do limite de exclusão (aproximadamente 2 x 106 M. W.). 1.5. Produção de Polissacarídeo Obtida nas Fermentações Não-Reguladas O polissacarídeo acima descrito foi também produzido durante as fermentações em condições de solidificação, por Lactobacillus helveticus CNCM 1-1449 sozinha, ou por tal estirpe usada conjuntamente com uma estirpe de Streptococcus thermophilus (por exemplo S. thermophilus YS4).
Para tal efeito, o meio de crescimento MSK (leite em pó desnatado: 100 g/l e extracto de fermento: 1 g/l) foi 10% reconstituído e tratado a temperatura alta (115°C, 35 min) para esterilização prévia antes da fermentação. A quantidade média da amostra foi de 250 ml, a incubação foi feita a 40°C e a quantidade de cultura de arranque inoculada no meio foi de 1%. A produção de polissacarídeo puro obtida em tais condições foi a seguinte:
Estirpes na Cultura de Arranque Período de Fermentação (horas) Produção Pura (mg/l) L. helveticus CNCM 1-1449 8 85 16 140 L. helveticus CNCM 1-1449 & S. thermophilus YS4 4 23 8 81 2. MÉTODOS USADOS PARA A CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL DO EXOPOLISSACARÍDEO PRODUZIDO POR LACTOBACILLUS HELVETICUS CNCM-1449 2.1. Análise dos monossacarídeos O polissacarídeo (0,1 mg) foi metanolisado (metanólico 0,5 M HCI, 24h, 80°C) e N-reacetilado (uma noite à temperatura ambiente). Os glicósidos de metil trimetilsililados foram analisados por cromatografia de fase de gasosa (Varian 3400), usando uma coluna capilar de sílica-fundida BP1 (25 m x 0,32 mm, SGE). A eluição (dissolução) foi levada a cabo aplicando na coluna um gradiente de temperaturas desde 120°C a 240°C a 2°C min-1. A configuração absoluta dos monossacarídeos foi determinada por GLC (Cromatografia Líquido-Gás) dos (-)-2-butil glicósidos (N-reacetila-dos) e trimetilsililados. 2.2. Análise de metilação
As amostras (polissacarídeos nativos e oligossacarídeos-alditois) foram permetiladas e os produtos metilados foram sujeitos, seja a metanólise, seja a hidrólise ácida (ácido trifluoroacético 4N, 4 h, 100°C), seguida de uma redução com BD4Na.
Os glicósidos de metil parcialmente metilisados e acetilados (piridina. anidrido acético 1:1) e os alditois foram identificados por GLC (coluna BP1) e GLC MS em modo e.i. num espectrómetro de massa Nermag R10-10S usando uma energia de electrão de 70 ev e uma corrente de ionização de 0,2 mA. 2.3. Hidrólise Ácida Parcial O polissacarídeo (40mg) foi hidrolisado em 4 ml de ácido trifluoroacético 0,5M durante 1h30 a 100°C. A hidrólise completa e a obtenção de oligossacarídeos leves foram monitorizadas por cromatografia de camada fina em folhas de alumínio (Merck) de Gel de Sílica 60 F254 (Merck), usando um solvente de butanol/água/ácido acético 2:1:1,5, e detecção com ácido orcinol-sulfúrico. 2.4. Cromatografia H.p.a.e.-p.a.d.
Foi levado a cabo o fraccionamento dos picos HW40 no sistema HPAE - PAD Dionex LC, consistindo de ácido um módulo de gradiente quaternário Dionex Bio-LC, um detector de modelo p.a.d. 2 e uma coluna de troca aniónica pelicular Carbopac PA-1 (250 x 9 mm).
Foram usados dois programas de eluição (dissolução):
- programa 1: 99:1 de eluente (dissolvente) A (NaOH 0,1 M) - eluente (dissolvente) B (NaOH 0,1 M contendo CH3COONa M) durante 0,2 min, passando então para 65:35 de eluente (dissolvente) A (NaOH 0,1 M contendo CH3COONa M) em 60 min a 3 ml min-1; - programa 2: 98:2 de eluente (dissolvente) A - eluente (dissolvente) B, passando então para de 70:30 de eluente (dissolvente) A - eluente (dissolvente) B em 60 min.
As fracções eluidas (dissolvidas) foram imediatamente neutralizadas com acético M e liofilizadas. As fracções foram sucessivamente dessalinizadas numa coluna (6 x 1cm) de resina Dowex 50 x 8 (H') e numa coluna de Fractogel (55 x 2 cm) usando água desionisada como eluente (dissolvente).
2.5. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear-1H
Para as medições NMR-1H, os oligossacarídeos com troca de deutério foram dissolvidos em 0,5 ml de 2H20 (99,96% átomo 2H, Aldrich). As experiências de NMR-1H a 400 MHz foram levadas a cabo com um espectrómetro Bruker AM-400WB, equipado com uma sonda de 5 mm com mistura de 1H-/13C, operando no modo pulsado da transformada de Fourier e controlado por um computador Aspect 3000 (Centre Commun de Mesures, Université de Lille Flandres Artois).
Todos os espectros foram obtidos a uma temperatura de sonda de 353°K. Espectros unidimensionais foram obtidos com uma largura espectral de 3000 Hz para 16 K pontos de dados do domínio frequência e do domínio tempo, dando uma resolução digital final de 0,365 Hz/ponto.
As experiências de NMR-13C a 100 MHz foram obtidas com o programa Powgate de pulsação Bruker padrão com pulsação de desacoplamento de 1H compósito. A largura espectral foi 22,727 Hz para 32 K pontos de dados do domínio frequência e dados do domínio tempo dando uma resolução digital final de 1,387 HZ/ponto; usou-se uma pulsação de noventa graus (6 ps) e um tempo de reiniciação de ciclo de 1 s. O químico mostrou corresponder ao sinal do grupo metilo da acetona (52,225 para 1H e 031,55 para 13C). O espectro bidimensional COSY 45, COSY homonuclear com transferências de substituição simples, duplas e triplas foi levado a cabo pelo uso da livraria de programas de pulsação Bruker padrão ou dos programas dados por B. Perly (C.E.A., Saclay). Para todas as experiências RCT, foram escolhidos atrasos de refocagem de 35 ms e o atraso de relaxamento foi de 2 s. Em todas estas experiências a largura espectral foi de 1840 Hz e a pulsação de noventa graus 1H foi 10,6 ps; foram obtidas matrizes de dados 256 W X 2K, preenchidas com zeros antes da transformada de Fourier, para obter uma matriz de dados espectrais 1 K X 2 K e foi usada uma função sinusoidal quadrática em campânula em ambas as dimensões.
As experiências COSY 2D-13C/1H foram levadas a cabo com a supressão simultânea de acoplamentos homonucleares 1H por utilização do programa XHCORRD de pulsação Bruker padrão. Os atrasos de refocagem foram ajustados para uma constante de acoplamento média Vc.h. de 150 KHz. A largura do pulso de noventa graus 1H e 13C foi de 10,6 e 6 ps. O atraso de relaxamento foi 0,8 s. Foi obtida uma matriz de dados 128 W X 4 K, preenchida com zeros antes da transformada de Fourier, para obter uma matriz de dados espectrais 512 W X 4 K. Aplicou-se uma função exponencial (LB = 1 Hz) ao subespectro-13C e uma função sinusoidal em campânula ao espectro- 1H, para melhorar a razão entre o sinal e o ruído. 3. A ESTRUTURA DO EXOPOLISSACARÍDEO PRODUZIDO POR LACTOBACILLUS HELVETICUS CNCM1-1449 3.1. Isolamento e análise de composição do polissacarídeo A análise GLC de glicósidos trimetilsililados e (-)-2-butyl glicósidos confirmou a presença de D-galactose e D-glucose numa razão molar 1:1.
Espectroscopia NMR O espectro n.m.r. 1H a 400 MHz do polissacarídeo nativo registado em D20 a 80°C mostra 4 sinais para 5,201, 5,158, 4,568 e 4,350 ppm característicos de protões anoméricos numa razão 1:2:2:1, sugerindo uma unidade de repetição hexassacarídea (Tabela 1).
Isto é confirmado pelo espectro de 13C a 100 MHZ (tabela) que exibe seis sinais de carbono anomérico (108,95; 103,74; 103,8; 102,52; 100,26 e 99,87 ppm).
De acordo com o sistema de spin (momento cinético total) do 13C, nas unidades de açúcar individuais representadas no espectro COSY de duas fases de substituição, os monossacarídeos podem ser, respectivamente, identificados como β-Galf (resíduo A), β-D-GICp (resíduos B e E), α-D-GICp (resíduo C), a-D-Galp (resíduo D) e β-D-Galp (resíduo F). O exame do espectro COSY de substituição dos oligossacarídeos alditois IV B e II A obtidos pela hidrólise parcial em ácido (ver abaixo) conduz à imediata identificação de β-D-GICp. Tal como demonstrado pelo espectro COSY do polissacarídeo, os H-2 e H-3 do β-D-Galp do resíduo F demonstram uma forte constante de acoplamento que não permite a análise das suas múltiplas configurações.
Os picos de correlação observados no espectro COSY heteronuclear 1H e 13C mostram que uma das ressonâncias de protão (5,158 ppm) se relaciona com a ressonância de carbono desescudada a 108,95 ppm, o que prova uma configuração β-anomérica para o Galf do resíduo A. A maioria das ressonâncias de protão podem ser atribuídas no espectro COSY homonuclear excepto para os sistemas de spin H-5 e H-6 do β-D-Galp do resíduo F. As ressonâncias de carbono podem também ser atribuídas por correlação directa com os seus protões juntos.
Deduziu-se que os dois carbonos a 73,52 e 61,12 ppm que permaneciam por atribuir correspondem às ressonâncias atómicas C-5 e C-6 do β-D-Galpdo resíduo F.
Em resumo, todas estas atribuições claramente fornecem a configuração de substituição de cada unidade de açúcar, de acordo com as suas ressonâncias de substituição de campo inferior de carbono: C-3 e C-5 para β-D-Galf A; C-3 para a-D-Glcp C; C-3 para a-D-Galp D; C-3 para β-D-GICpB e C-4 para β-D-GICp E. A sexta unidade de açúcar β-D-Galp F, que não possui qualquer ressonância de substituição de campo inferior de 13C, ocorre, consequentemente, numa posição não-redutora. 3.2. Análise de Metilação
Os resultados da NMR são suportados e confirmados pela análise GLC MS dos acetatos de alditol e dos glicósidos de metil, parcialmente metilados, (Tabela 2) obtidos a partir dos polissacarídeos permetilados. De facto, ela demonstra a presença de resíduo galactosil terminal, resíduo glucosil 3-ligado, resíduo glucosil 4-ligado, resíduo galactosil 3-ligado e resíduo galactosil 3,5-ligado, numa razão de 1:2:1:1:1, respectivamente. 3.3. Hidrólise Ácida Parcial
De modo a clarificar a posição do resíduo galactosil terminal ramificado, foram produzidos oligossacarídeos por hidrólise ácida parcial do polissacarídeo nativo. Seis fracções principais foram separadas por filtração em gel em Fractogel HW40 F a partir do hidrolisado (Fig. 2).
Duas delas (fracções II e IV) foram sujeitas a cromotografia HPAE -PAD (Fig. 3, 4 e tabela 3) e a estrutura das subfracções denominadas II A, IV A e IV B foi investigada tanto por NMR, como por análise de metilação. O oligossacarídeo-alditol IV A contém dois resíduos Glc e um resíduo hexitol, tal como revelado pelo sistema de spin 1H mostrado no espectro COSY de substituição em dois passos. Os dois resíduos Glc ocorrem na posição terminal não-redutora, tal como confirmado pela análise de metilação que forneceu 2, 3, 4, 6-tetra-O-metil glucitol. O último derivado mostra um padrão que corresponde a uma substituição de C-3 e C-5 característica de um açúcar furânico. Pelos dados anteriores da n.m.r., este hexitol provém da unidade A 3-D-Galf. Estes resultados conduzem à seguinte estrutura:
B A β - D - Glcp - (1 - 3) - D - Gais - ol
E B - D - Glcp -1 Há que notar que devido à simetria mostrada pelo sistema de spin 1H do galactitol, a atribuição da NMR 1H do composto foi conseguida após a determinação da estrutura do composto IV B. O oligossacarídeo-alditol IV B contém 3-D-Galpe β-D-GICp na razão de 1:1, como claramente mostrado pelo padrão das constantes de acoplamento vicinais. A análise de metilação (Tabela 4) indicou a presença de 2, 3, 4, 6-tetra-O-metil galactose, 2, 3, 6-tri-O-metil glucose e 1, 2, 4, 5, 6-penta-O-metil galacticol. Consequentemente, o oligossacarídeo-alditol 2 possui a seguinte estrutura:
F E A β - D - Galp - (1 - 4) - β - D - Glcp -(1-3)- Gal - ol A ligação do β-D-GICp a C-3 do Gal-ol não é susceptível de modificar drasticamente a troca química das ressonâncias H-1 e H-2 do hexitol, em comparação com os dados da NMR do composto IV A. Consequentemente, os dois sinais a 3,77 e 4,056 ppm podem ser atribuídos aos H-1 e H-2 do Gal-ol, enquanto as ressonâncias dos átomos H-5 e H-6 são trocadas no campo superior a 4,149 e 3,68 ppm, por comparação com o composto IV A (Tabela 3).
No espectro da NMR de IV A e IV B, a ressonância H-5 do Gal-ol é a ressonância de átomo substituído no campo mais alto da molécula e tal observação está de acordo com as atribuições propostas por outros. O oligossacarídeo-alditol II A (Tabela 2) contém 2 resíduos de β-D-Glcp, 1 resíduo de β-D-Galp e 1 resíduo de a-D-Glcp, enquanto a presença do Gal-ol com substituição de C-3 e C-5 pode ser facilmente deduzida pela similaridade na trocas químicas de H-1 a H-6 do Gal-ol no composto 1. Uma vez que as duas unidades β-D-GICp e o terminal não-redutor β-D-Galp foram já localizados nos oligossacarídeos-alditois IV A e IV B, e considerando o facto de o resíduo B β-D-GICp ser substituído em C-3, o oligossacarídeo--alditol II A possui a seguinte estrutura:
C BA α - D - Glcp -(1-3)- β - D - Glcp - (1 - 5) - Gal - ol
F E β - D - Galp - (1 - 4) - β - D - Glcp -1 - A sexta unidade de açúcar a-D-Galp não foi observada entre os produtos da hidrólise parcial. No entanto, o facto de a unidade a-D-Glcp C ser substituída em C-3 e de o único β-D-Galp presente no polissacarídeo ocupar a posição não-redutora (com base nos dados da NMR) leva a concluir que o α-D-Galp está ligado a este resíduo a-D-Glcp.
Portanto, a unidade estrutural do polissacarídeo foi definida do seguinte modo:
D C B A -3) - α - D - Galp - (1-3) - α - D - Glcp - (1-3) - β - D - Glcp - (1-5) - β - D -Galf - (1- / 3 F e/ β - D - Galp - (1-4) - β - D - Glcp
Tabela 1: NMR da troca química do polissacarídeo com D20 a 80°C (padrão interno: acetona)
Resíc uos Atribuição β-Galf P-Glcp a-GICp a-Galp β-GICp β-Galp A B C D E F Ή (ppm) H-1 5,158 4,568 5,201 5,158 4,568 4,350 H-2 4,240 3,289 3,542 3,888 3,206 3,470 H-3 4,419 3,532 3,752 3,776 3,488 3,470 H-4 4,125 3,533 3,512 3,999 3,533 3,796 H-5 4,118 3,354 3,920 4,108 3,455 3,582 H-6 3,723 3,84 3,61 3,62 3,90 3,67 H-6' 3,62 3,66 3,61 3,62 3,70 3,67 13C (ppm) C-1 108,95 103,08 99,87 100,26 102,52 103,74 C-2 80,52 72,72 71,19 68,33 73,47 71,19 C-3 85,08 85,15 82,90 77,31 74,90 75,32 C-4 81,64 70,14 70,20 69,19 80,19 68,69 C-5 78,84 76,43 72,48 71,27 73,52 75,80 C-6 61,68 61,38 61,07 61,26 61,12 60,99
Tabela 2: Análise de metilação do polissacarídeo nativo
Derivados Razão molar Acetatos de alditol párcialmente metilados Metilglicósidos parcialmente metilados 2, 3, 4, 6 Gal 1 1 2, 4, 6 Glc 22 19 2, 3, 6 Glc 9 13 2, 4, 6 Gal 7 16 2, 6 Gal 1 9
Tabela 4: Análise de metilação dos oligossacarídeos-alditois (glicósidos parcialmente metilados e acetilados) IV A, IV B e II A obtidos por hidrólise ácida parcial dos polissacarídeos nativos.
Derivados Razão molar IV A IV B II A 1, 2, 4, 5, 6 Gal-ol - 1 - 1,2, 4, 6Gal-ol 1 - 1 2, 3, 4, 6 Glc 1,2 - 1,0 2, 3, 4, 6 Gal (*) - 1,4 0,9 2, 4, 6 Glc - - 1,3 2, 3, 6 Glc - 1,0 1,2 (*): Devido à sua alta volatilidade o valor é mais baixo do que o esperado
As composições que compreendem o polissacarídeo e/ou o microrganismo de acordo com o invento são descritas nos seguintes exemplos não limitativos.
Exemplo 1: leite acidificado solidificado
Foi obtido leite acidificado solidificado compreendendo a estirpe L helveticus de acordo com o invento e duas estirpes S. thermophilus, tradicionalmente usadas para a produção de um iogurte solidificado, pelo processo que se segue. 2 Ο t (Ο Ω. φ ο φ ;g 'l_ 03 Ο Φ (Λ (Λ Õ
CL Ο "Ο 1? ο 1» Φ Ω. π g ο ^φ ω <Λ g !c ο
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CO _φ φ
JD Φ I- ο CO ΙΩ co φ ο CM Ο Ε φ C0 3 .Ο ηΞ I φ -C Φ φ υ φ -Q -2 ο φ φ Τ3
Resíduos em II A Q. Φ o LU 1 CQ. 4,460 • 3,542 3,665 3,928 3,73 3,79 3,79 | Q. O CD Q co. 4,590 1 3,379 3,647 3,678 3,590 3,90 3,75 α υ CD O 1 CQ. 5,340 3,559 3,748 3,463 4,025 3,80 3,80 Q. O CD OD 1 ca 4,707 1 3,423 3,647 3,748 3,47 3,97 3,85 Gal-ol A 3,77 3,77 4,120 co M- 3,911 4,299 r^- oo 3,77 Resíduos em IV B Q. O CD LLJ 1 ca 4,428 1 3,541 3,661 3,927 3,732 3,79 3,79 Q. 0 CD CQ 1 ca 4,539 1 3,421 3,661 3,674 3,62 4,02 3,80 Gal-ol A-ol 3,77 3,77 4,056 3,915 3,797 4,149 3,68 3,68 Resíduos em IV A CL Φ CD L·-eà 4,557 1 3,320 3,484 3,406 3,453 3,899 3,758 CL O CD Li· 1 ca 4,686 1 3,328 3,500 3,424 3,543 3,899 3,758 Gal-ol A-ol 3,77 3,77 4,118 4,141 3,907 4,301 3,77 3,77 Atribuição 1H (ppm) r~ X 1 X CM 1 X H-3 H-4 H-5 H-6 H-6’ ίΐ ’ΜΊ
Foi adicionado a um leite inteiro compreendendo 3,7% de gordura, 2,5% de leite em pó desnatado.
Foram pasteurizados 40 litros de tal leite a 92°C durante 6 minutos, homogeneizados a 75°C e 150 bar (dois níveis) e arrefecidos a uma temperatura de cerca de 42°C.
As estirpes congeladas-desidratadas de S. thermophilus CNCM 1-1422, de S. thermophilus CNCM 1-1424 e de L. helveticus CNCM 1-1449 foram reactivadas com várias culturas sucessivas num ambiente estéril MSK (leite em pó desnatado reconstituído a 10%, compreendendo 0,1% de um extracto de fermento comercial).
Foi feito um depósito do microrganismo de acordo com o Tratado de Budapeste, em 18 de Maio de 1994, para as estirpes de Streptococcus e, em 27 de Julho de 1994, para a estirpe de Lactobacillus, na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANCE. O leite esterilizado foi inoculado com 1% da terceira cultura de cada estirpe S. thermophilus e com 2% da segunda cultura da estirpe L. helveticus tomada na fase de coagulação do meio. O leite foi incubado a 42°C, com um pH à volta de 4,65 e, posteriormente, arrefecido a uma temperatura de 4°C.
Exemplo 2: soro de leite acidificado
Foi obtido soro de leite compreendendo a estirpe L. helveticus de acordo com o invento e duas estirpes S. thermophilus, tradicionalmente usadas para a produção de um iogurte, pelo processo que se segue.
Um pó de soro lácteo doce foi reconstituído em água a 12,5%.
Foram pasteurizados 40 litros de tal soro a 92°C durante 6 minutos, homogeneizados a 75°C e 150 bar (dois níveis) e arrefecidos a uma temperatura de cerca de 42°C.
As estirpes congeladas-desidratadas de S. thermophilus CNCM 1-1422, de S. thermophilus CNCM 1-1424 e de L. helveticus CNCM 1-1449 foram reactivadas com várias culturas sucessivas num ambiente estéril MSK (leite em pó desnatado reconstituído a 10%, compreendendo 0,1% de um extracto de fermento comercial).
Foi feito um depósito do microrganismo de acordo com o Tratado de Budapeste, em 18 de Maio de 1994, para as estirpes de Streptococcus e, em 27 de Julho de 1994, para a estirpe de Lactobacillus, na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANCE. O leite esterilizado foi inoculado com 1 % da terceira cultura de cada estirpe S. thermophilus e com 2% da segunda cultura da estirpe L. helveticus tomada na fase de coagulação do meio. O soro de leite foi incubado a 42°C, com um pH à volta de 4,65 e, posteriormente, arrefecido a uma temperatura de 4°C.
Exemplo 3: leite acidificado batido
Foi obtido um leite acidificado batido compreendendo a estirpe L. helveticus CNCM 1-1449 de acordo com o invento e duas estirpes S. thermophilus comercializadas, tradicionalmente usadas para a produção de um iogurte batido, pelo processo que se segue. O leite foi obtido a partir de um leite inteiro compreendendo 3,7% de gordura, adicionando 2,5% de leite em pó desnatado.
Foram pasteurizados 40 litros de tal leite a 105°C durante 2 minutos, homogeneizados a 75°C e 300 bar (primeiro nível) e arrefecidos a uma temperatura de cerca de 43°C.
As estirpes liofilisadas de S. thermophilus CNCM 1-1421, de S. thermophilus CNCM 1-1423 e de L. helveticus CNCM 1-1449 foram reactivadas com várias culturas sucessivas num ambiente estéril MSK.
Foi feito um depósito do microrganismo de acordo com o Tratado de Budapeste, em 18 de Maio de 1994, para as estirpes de Streptococcus e, em 27 de Julho de 1994, para a estirpe de Lactobacillus, na Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANCE. O leite esterilizado foi inoculado com 1% da terceira cultura de cada estirpe S. thermophilus e com 2% da terceira cultura da estirpe L. helveticus tomada na fase de coagulação do meio. O leite foi incubado a 43°C, com um pH à volta de 4,65 e, posteriormente, arrefecido a uma temperatura de 4°C durante a agitação. A Tabela 5, seguinte, representa as propriedades dos produtos obtidos.
Tabela 5
Exemplo 1 Exemplo 3 Período de acidifi-cação com pH = 4,65 6 h 7h 15 PH do produto após 1 dia a 4°C 4,34 4,49 PH do produto após 24 dias a 4°C 4,1 4,3 Sabor após 24 dias Sabor agradável, ligeiramente ácido Textura suave Sabor muito bom, aromático e textura suave e untuosa
Exemplo 4: composição cosmética para a higiene bucal
Nome químico Nome comercial % Peso FASE A Ôleo de castor hidrogenado PEG-40 Cremophor RH 40 0,10 Sabor Strawberry E 2226 0,04 Sabor Raspberry 9/022436 0,10 FASEB Ciclamato de sódio Sodium Cyclamate 0,10 Exopolissacarídeo de acordo com a presente invenção - 0,50-5,00 Água desmineralizada 94,66-99,16 TOTAL 100 Λ
Exemplo 5: composição cosmética para a higiene da pele % PESO FASE DE ÓLEO BRIJ 721 (Steareth 21) 4,00 Álcool cetílico 10,00 Óleo mineral 5,00 Propil parahidroxibenzoato 0,02 FASE DE ÁGUA Carbopol 934 (Carmober 934) 0,10 Hidróxido de sódio (solução a 10%) 0,10 Metil parahidroxibenzoato 0,18 Exopolissacarídeo de acordo com a presente invenção 0,50-5,00 Água desmineralizada 75,60-80,10 TOTAL 100
Exemplo 6: composição farmacêutica para uso antidiarreico
Foi obtida uma composição farmacêutica sob a forma de uma cápsula feita de gelatina e água, contendo de 5 a 50 mg do exopolissacarídeo de acordo com o presente invento. Alternativamente, formulações de comprimidos pulveriformes podem ser obtidas directamente dos leites cultivados acidificados descritos nos exemplos 1,2 e 3 acima dados, congelando e desidratando tais leites e soros fermentados.
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Porto, 1 de Março de 2000
O Mandatário
RUY PELAYO DE SOUSA HENRIQUES
Rua Sá da Bandeira, 706-2°.-E - 4000-432 PORTO
Claims (9)
- REIVINDICAÇÕES 1. Polissacarídeo ramificado natural solúvel, caracterizado por ser obtido da estirpe Lactobacillus helveticus CNCM 1-1449 e por compreender uma cadeia sacarídea principal possuindo cadeias laterais repetidas que são unidades de lactose, em que as ditas unidades de lactose são eventualmente substituídas.
- 2. Polissacarídeo ramificado conforme a reivindicação 1, correspondendo à seguinte fórmula:
- '3 Gala 1-3 Glc a 1 - 3 Glc β 1 - 5 Galf β l" Rl \ 3 4 / Gal β 1-4 Glc β 1 3 I 3 I I R2 I R onde n > 1, Gal = galactose, Glc = glucose, R1 = hidrogénio ou GalNAcpi (N-acetilgalactosamina), R2 = hidrogénio, NeuNAca2 (ácido N-acetilneuramínico) ou HS03, R1 = hidrogénio ou Fucal (fucose). 1 Lactobacillus helveticus CNCM 1-1449 produzindo o polissacarídeo ramificado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde R1 = R2 = hidrogénio.
- 4. Composição alimentar incluindo o polissacarídeo ramificado e/ou o Lactobacillus helveticus conforme qualquer uma das reivindicações anteriores.
- 5. Composição alimentar conforme a reivindicação 4, caracterizada por ser seleccionada a partir do grupo consistindo de leites acidificados ou de soro de leite, solidificados ou batidos.
- 6. Composição cosmética incluindo o polissacarídeo ramificado e/ou o Lactobacillus helveticus conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
- 7. Composição cosmética conforme a reivindicação 6, caracterizada por ser seleccionada a partir do grupo consistindo de solução bucal, pasta de dentes, gel de dentes, pastilha elástica, comprimidos, creme, unguento ou bálsamo.
- 8. Composição farmacêutica incluindo o polissacarídeo ramificado e/ou o Lactobacillus helveticus conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
- 9. Composição farmacêutica conforme a reivindicação 8, caracterizada por ser seleccionada a partir do grupo consistindo de cápsulas, xaropes, pós ou comprimidos. Porto, 29 de Fevereiro de 2000 datárioRUY PELAYO DE SOUSA HENRIQUES Rua Sá da Bandeira. 706-2°.-E - 4000-432 PORTO
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