DE69421921T2 - Verzweigtes Polysaccharide, es produzierender Mikroorganismus und Zusammensetzungen welche sie enthalten - Google Patents

Verzweigtes Polysaccharide, es produzierender Mikroorganismus und Zusammensetzungen welche sie enthalten

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Description

    Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, verzweigtes Polysaccharid und einen Mikroorganismus, der es produziert, sowie die Nahrungsmittelzusammensetzung, die pharmazeutische Zusammensetzung, und die kosmetische Zusammensetzung, die dieses Polysaccharid und diesen Mikroorganismus enthalten.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Die biologische Kommunikation (die Möglichkeit, daß eine Zelle ein Molekül oder eine andere Zelle erkennt) ist ein zentrales Phänomen in dem pathologischen, sowie in dem normalen Zustand.
  • Unter den verschiedenen Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen Zellen und/oder zwischen Zellen und Molekülen wird die Bindung von spezifischen Glykosidstrukturen durch spezialisierte Proteine (Lektine) heute als ein hauptsächliches molekulares Erkennungssystem angesehen.
  • Die Lektine können auf spezifische und nicht-kovalente Weise an gut definierte Glykosidsequenzen gebunden werden.
  • Manche Lektine werden gebunden an Oligosaccharide, die erhöhte Mannoseanteile enthalten, an Strukturen, die Sialsäuren tragen, an fukosylierte Glykoside, ... .
  • Andere Lektine können β-Galaktoside und Laktose binden.
  • Zwischen oralen Bakterienzellen (Actinomyces naeslundii oder viscosus, Streptococcus mitis oder sanguis, Fusobacterium nucleatum, Porphyromonas gingivalis, Bacteriodes intermedius, ...) gibt es multigenerische Coaggregationen, die aggregieren und ein Netzwerk bilden, wie der Zahnbelag.
  • Zwischen diesen Bakterienzeilen wird die Wechselwirkung oft durch eine nicht-kovalente Bindung zwischen einem β-Galaktosid-lektin bei einer Zelle und einem Glykosidrezeptor bei einer anderen Zelle erhalten (Literaturverzeichnis 1).
  • Die meisten Infektionskrankheiten werden durch die Haftung von pathogenen Stoffen (Actinomyces naeslundii, Fusobacterium nucleatum, Bacteriodes intermedius, Salmonella typhimurium, Vibrio Cholera, Campylobacter jejuni, Bacteriodes, Fusobacteria, Clostridia, Shigella, Yersinia und Helicobacter pylori, ...) auf den Epithelzellen der Schleimhaut ihres Wirtes eingeleitet, was dann die Kolonisierung der Tiergewebe ermöglicht.
  • Diese Haftung wird oft durch eine Bindung zwischen einem an der Oberfläche dieses pathogenen Stoffes gelegenen β-Galaktosid-lektin und einem an der Oberfläche der Epithelzelle gelegenen Glykosidrezeptor erhalten (Literaturverzeichnis 2).
  • Verschiedene Zellen des Immunsystems (Lymphozyten T und B, Makrophagen, Neutrophile) sind dafür bekannt, daß sie die β-Galaktosid-lektine binden können, oder an ihrer Oberfläche solche Lektine der Galektin-Familie exprimieren können.
  • Außerdem produzieren manche Epithelzellen, wie Darmzellen oder Keratinozyten diese Galaktine, die auch Langerhanssche Zellen und Immunoglobuline, wie IgE, auf spezifische Weise an Galektine binden können (Literaturverzeichnis 3, 4 und 5).
    • Stand der Technik
  • Es gibt viele frühere Untersuchungen über von Mikroorganismen produzierte Polysaccharide, und in den letzten Jahren gab es mehrere Berichte von Untersuchungen über die Struktur von mittels Milchsäurebakterien gewonnenen, exzellularen Polysacchariden, und über ihre biologischen Wirksamkeiten.
  • Ein aus Galaktose, Glukose und N-Acetylgalaktosamin (2 : 1 : 1) bestehendes Polysaccharid wird mittels der Stämme Streptococcus thermophilus CNCM I-733, CNCM I-734 und CNCM I-735 gewonnen (Literaturverzeichnis 6 und 7);
  • ein nur aus Galaktose bestehendes Polysaccharid wird mittels des Stammes Lactococcus cremoris H414 gewonnen (Literaturverzeichnis 8);
  • ein aus Galaktose, Glukose, Rhamnose und Phosphat (2 : 2 : 1 : 1) bestehendes Polysaccharid wird mittels des Stammes Lactococcus cremoris SBT 0495 gewonnen (Literaturverzeichnis 9);
  • ein aus Galaktose, Glukose und Rhamnose (5 : 1 : 1) bestehendes Polysaccharid wird mittels des Stammes Lactobacillus bulgaricus rr gewonnen (Literaturverzeichnis 10);
  • ein aus Glukose, Rhamnose, 1-Phosphoglyzerol und einer O-acetyl-Gruppe (3 : 2 : 1 : 0,85) bestehendes Polysaccharid wird mittels des Stammes Lactobacillus sake 0-1 gewonnen (Literaturverzeichnis 11).
  • Andererseits wurden weitere, mittels einiger weniger Stämme von Lactobacillus helveticus gewonnene Polysaccharide untersucht, aber nie wurden ihre strukturellen Kennzeichnungen bestimmt. Zum Beispiel wird ein aus Glukose und Galaktose (2 : 1) bestehendes Polysaccharid mit unbekannter Struktur, das als Antitumormittel verwendet wird, mittels des Stammes Lactobacillus helveticus var. jugurti No 851 "FERM BP-66 (FERM-P No 5851)" gewonnen (Literaturverzeichnis 12 urd 13). In ähnlicher Weise wird ein aus Galaktose, Glukose und N-acetylglukosamin (2,5-3,5 : 2,5-3,5 : 1) bestehendes Polysaccharid mit unbekannter Struktur, das bei der Entzündungsbehandlung und zum Beschleunigen des Knochenmarkwachstums verwendet wird, mittels des Stammes Lactobacillus helveticus MIKI-010 gewonnen (Literaturverzeichnis 14).
  • In der japanischen Patentanmeldung JP-A-5039304 wird eine Kultur von Laktobakterien beschrieben, die ein aus Glukose- und Galaktoseeinheiten in einem molekularen Verhältnis von 1/1 bestehendes Polysaccharid produzieren.
  • In Milchwissenschaft, Band 42(9) 1987 Seite 565-568 wird ein aus dem Stamm Lactobacillus kefir gewonnenes und aus Glukose- und Galaktoseeinheiten in einem molekularen Verhältnis von 1/0,96-1,09 bestehendes Polysaccharid beschrieben.
  • In diesen Dokumenten wird keine Saccharidkette beschrieben, die sich wiederholende, nur aus Laktoseeinheiten bestehende Seitenketten hat.
  • Ein letztes Ziel der Erfindung ist, ein Polysaccharid herzustellen, das als ein Zwischenprodukt für die Produktion von polymerisierten Derivaten von Sialyl- und sulfatiertem Lewis X verwendet werden kann.
    • Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, natürliches, lösliches, verzweigtes Polysaccharid, das eine Hauptkette aufweist, die sich wiederholende Seitenketten hat, die Laktoseeinheiten sind, die möglicherweise substituiert sind.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entspricht das verzweigte Polysaccharid der folgenden Formel:
  • wobei n > 1,
  • Gal = Galaktose,
  • Glc = Glukose,
  • R¹ = Wasserstoff, NeuNAcα² (N-acetylneuraminsäure) oder HSO&sub3;,
  • R² = Wasserstoff oder Fucα1 (Fukose)
  • Wenn R¹ = R² = Wasserstoff ist, ist das verzweigte Polysaccharid durch die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften gekennzeichnet:
  • - Molekulargewicht größer als 2.000.000,
  • - löslich in Wasser und in Lösungen, die weniger als 20% Trichloressigsäure enthalten,
  • - unlöslich in Alkohol und in Aceton,
  • - neutrale Eigenschaft,
  • - das gefriergetrocknete Produkt hat die Form eines weißen Pulvers,
  • - Komponenten-Zucker und Zusammensetzungsverhältnis:
  • Glukose: Galaktose (1 : 1,1).
  • Wenn R¹ = NeuNAcα² (N-acetylneuraminsäure) oder HSO&sub3; ist, und R² = Fucα1 (Fukose) ist, ist das verzweigte Polysaccharid ein Derivat der in den Dokumenten 15 und 16 beschriebenen pharmazeutischen Produkte Sialyl- oder sulfatiertes Lewis X.
  • Die Bindungen zwischen Gal β 1 - 4 Glc und R¹, R² werden in vorteilhafter Weise aus einem Zwischenprodukt (dem Polysaccharid mit R¹ = R² = Wasserstoff) nach dem in dem Dokument 17 beschriebenen Verfahren erhalten.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch den Mikroorganismus, der das verzweigte Polysaccharid produziert, bei dem R¹ = R² = Wasserstoff ist.
  • Dieser Mikroorganismus entspricht dem Stamm Lactobacillus helveticus CNCM I-1449.
  • Eine Anmeldung dieses Mikroorganismus erfolgte gemäß der Vertrag von Budapest am 27. Juli 1994 bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 nie du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANKREICH.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft auch das Nahrungsmittel, das verbesserte orgamoleptische und Textureigenschaften hat, und das das Polysaccharid und/oder den Mikroorganismus der Erfindung aufweist.
  • Vorzugsweise ist diese Nahrungsmittelzusammensetzung eine geronnene, angesäuerte Milch oder eine gerührte, angesäuerte Milch.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die kosmetische Zusammensetzung, die das Polysaccharid und/oder den Mikroorganismus der Erfindung aufweist.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die kosmetische Zusammensetzung ein für die Mundhygiene bestimmtes kosmetisches Produkt, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus einer Zahnpasta, einem Zahngel, einem Mundspülmittel, einem Kaugummi und/oder einer Tablette besteht.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die kosmetische Zusammensetzung ein für die Hauthygiene bestimmtes Produkt, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus einer Creme, einer Salbe, oder einem Balsam besteht.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die pharmazeutische Zusammensetzung, die das Polysaccharid und/oder den Mikroorganismus der Erfindung aufweist.
  • In vorteilhafter Weise ist die Zusammensetzung ein antidiarrhoisches Produkt, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus einer Kapsel, einem Sirup, einem Pulver und/oder einer Tablette besteht.
  • Ein letzter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine diagnostische und/oder analytische Vorrichtung, die das erfindungsgemäße verzweigte Polysaccharid aufweist, um spezifische Moleküle und/oder Mikroorganismen einzufangen.
    • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • Die Fig. 1 gibt die chromatographische (FPLC)-Analyse des erfindungsgemäßen Polysaccharids wieder.
  • Die Fig. 2 gibt sechs hauptsächliche Fraktionen wieder, die durch Gelfiltration aus dem Polysaccharid-Hydrolysat abgetrennt wurden.
  • Die Fig. 3 gibt die chromatographische (HPAE-PAD)-Analyse der Fraktion II wieder.
  • Die Fig. 4 gibt die chromatographische (HPAE-PAD)-Analyse der Fraktion IV wieder.
    • Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues, natürliches, verzweigtes Polysaccharid mit einer Hauptkette, die sich wiederholende Seitenketten hat, die Laktoseeinheiten sind; die Laktose ist möglicherweise substituiert.
  • Das erfindungsgemäße "verzweigte Polysaccharid" ist ein Saccharid, das mehr als 10 sich wiederholende Einheiten, vorzugsweise mehr als 40 sich wiederholende Einheiten hat.
  • Das verzweigte Polysaccharid hat vorzugsweise die Struktur eines "Polymers", das aus der Wiederholung von identischen einzelnen "Einheiten" besteht, die eine Seitenkette 2 aufweisen, die von einer Hauptkette 1 abzweigt, wie nachstehend dargestellt ist:
  • Die Produktion und die physikalisch-chemische Struktur eines erfindungsgemäßen Polysaccharids wird nachstehend beschrieben.
    • 1. HERSTELLUNG UND REINIGUNG DES VON LACTOBACILLUS HELVETICUS CNCM I-1449 PRODUZIERTEN EXOPOLYSACCHARIDS 1. Fermentationsbedingungen
  • Lactobacillus helveticus CNCM I-1449 war ein klebriger Stamm aus der Nestle-Stammsammlung. Von den 168 Stämmen des L. helveticus der Nestle- Sammlung produzieren nur 2 Stämme Exopolysaccharide.
  • Das Wachstumsmedium war aus 10% Pulver rekonstituierte, entrahmte Milch, die vor der Fermentation zur Sterilisation wärmebehandelt wurde (115ºC, 35 min). Um den pH während der Fermentation zu regulieren, wurde ein Fermentor mit Ein-Liter-Skala und magnetischem Rührer verwendet. Der pH wurde mittels 2N Natriumhydroxyd auf 5,5 gehalten. Die Rührgeschwindigkeit wurde auf 60 UPM gehalten. Die Inkubation wurde bei 40ºC gemacht. Die auf das Medium überimpfte Menge Starterkultur betrug 1%. Während der Fermentation (Zeit = 6 h, 9 h und 24 h) wurden mehrere Proben für die weitere Analyse und die Polysaccharidextraktion entnommen und eingefroren.
    • 1.2. Extraktion des Polysaccharids
  • Ein gleiches Volumen Trichloressigsäure (40%) wurde zu der Probe zugegeben, um die Proteine durch Ausfällung und anschließende Zentrifugation (17.000 g, 20 Minuten) zu entfernen. Zu der oben schwimmenden Fraktion, die Polysaccharide enthält, wurde das gleiche Volumen Aceton zugegeben. Die ausgefällten Polysaccharide wurden dann durch Zentrifugation (17.000 g, 20 Minuten) abgetrennt.
  • Die sich ergebende ausgefällte Fraktion wurde in destilliertem Wasser aufgelöst, und der pH wurde mit Natriumhydroxydlösung auf 7,0 eingestellt. Nach Dialyse gegen destilliertes Wasser (über Nacht) wurden die unlöslichen Substanzen durch Ultrazentrifugation (110.000 g, 1 Stunde) entfernt.
  • Die oben schwimmende Fraktion, die Polysaccharide enthält, wurde lyophilisiert, und schließlich wurden rohe, dehydratisierte Polysaccharide erhalten. Der gesamte Gehalt an neutralem Zucker wurde nach der Phenol- Schwefelsäure-Methode bestimmt.
    • 1.3. Größe des Exopolysaccharids
  • Die Filtration wurde ausgeführt, um die Reinheit zu bestätigen und das Molekulargewicht der Polysaccharide unter Verwendung des FPLC-Systems (Pharmacia) abzuschätzen. Die verwendete Säule war Superose 6 (1,0 cm · 30 cm (Fig. 1). 200 ul-Proben, die 200-400 ug dehydratisierte Polysaccharide enthielten, wurden auf die Säule aufgebracht, und mit 50 mM Phosphatpuffer bei pH 7,2 und einer Rate von 0,5 ml/min eluiert. Fraktionen (1,0 ml) wurden in Röhrchen gesammelt. Der Polysaccharidgehalt in jedem Röhrchen wurde nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode als gesamter neutraler Zucker bestimmt.
    • 1.4. Monosaccharidzusammensetzung
  • Die Monosaccharidzusammensetzung eines gefriergetrockneten Polysaccharids wurde mittels der Gas-Flüssigkeits-Chromatographie-Technik analysiert (Literaturverzeichnis 18).
  • Das aus dem erschöpften Kulturmedium gewonnene Exopolysaccharid wurde nach Extraktion aus drei Proben untersucht (Zeit = 6 h, 9 h und 24 h). Es wurde festgestellt, daß die Ausbeute in Abhängigkeit von der Fermentationszeit zunimmt, aber die Größe, sowie die Monosaccharidzusammensetzung des Polymers unveränderlich waren:
  • Die Fig. 1 gibt die Elution und die Reinheit des bei t = 24 h durch FPLC-Analyse (mit einer Säule aus Superose 6) erhaltenen Polysaccharids wieder. Das Polysaccharid wurde bei ungefähr der Ausschlußgrenze (ungefähr 2 · 10&sup6; M. G.) eluiert.
    • 1.5. Ausbeuten von bei nicht-geregelten Fermentationen gewonnenem Polysaccharid
  • Das oben beschriebene Polysaccharid wurde auch während Fermentationen unter geronnenen Bedingungen von Lactobacillus helveticus CNCM I-1449 allein, oder von diesem Stamm zusammen mit einem Stamm von Streptococcus thermophilus (zum Beispiel S. thermophilus Y54) produziert.
  • Für diesen Zweck war das verwendete Wachstumsmedium aus 10% Pulver rekonstituierte MSK (Pulver von entrahmter Milch: 100 g/l und Hefeextrakt: 1 g/l), das vor der Fermentation zur Sterilisation wärmebehandelt wurde (115ºC, 35 min). Die typische Probengröße war 250 ml, die Inkubation wurde bei 40ºC gemacht, und die auf das Medium überimpfte Menge Starterkultur betrug 1%. Die unter diesen Bedingungen erhaltenen Ausbeuten an reinem Polysaccharid waren:
    • 2. METHODEN, DIE FÜR DIE STRUKTURELLE KENNZEICHNUNG DES VON LACTOBACILLUS HELVETICUS CNCM I-1449 PRODUZIERTEN EXOPOLYSACCHARIDS VERWENDET WURDEN 2.1. Monosaccharid-Analyse
  • Polysaccharid (0,1 mg) wurde methanolysiert (methanolische 0,5 M HCl, 24 h, 80ºC), N-reacetylisiert (eine Nacht bei Raumtemperatur). Die trimethylsilylierten Methylglykoside wurden mittels Gasphasenchromatographie (Varian 3400) analysiert, wobei eine BP1-Quarzglas-Kapillarsäule (25 m · 0,32 mm, SGE) verwendet wurde. Die Elution wurde durch Anwendung eines Temperaturgradienten bei der Säule von 120ºC bis 240ºC bei 2ºC min&supmin;¹ ausgeführt. Die absolute Konfiguration der Monosaccharide wurde durch GLC der trimethylsilylierten (N-reacetylisierten) (-)-2-Butylglykoside bestimmt.
    • 2. Methylierungsanalyse
  • Proben (natürliches Polysaccharid und Oligosaccharid-alditole) wurden permethyliert, und die methylierten Produkte wurden entweder einer Methanolyse oder einer Säurehydrolyse (Trifluoressigsäure 4N, 4 h, 100ºC), und einer anschließenden Reduktion mit BD&sup4;Na unterworfen.
  • Die partiell methylierten und acetylierten (Pyridin/Essigsäureanhydrid 1 : 1) Methylglykoside und Alditole wurden durch GLC (BP1-Säule) und GLC MS in dem e.i.-Modus mit einem Nermag R10-10S-Massenspektrometer identifiziert, wobei eine Elektronenenergie von 70 eV und ein ionisierender Strom von 0,2 mA verwendet wurden.
    • 2.3 Partielle Säurehydrolyse
  • Polysaccharid (40 mg) wurde in 4 ml 0,5 M Trifluoressigsäure während 1h30 bei 100ºC hydrolysiert. Die vollständige Hydrolyse und die Bildung von Oligosacchariden mit niedriger Masse wurden durch Dünnschicht-Chromatographie auf Silikagel 60 F254-Aluminiumfolien (Merck) unter Verwendung eines Butanol/Wasser/Essigsäure 2 : 1 : 1,5-Lösungsmittels und Nachweis mit Orcinol- Schwefelsäure überwacht.
    • 2.4. HPAE-PAD-Chromatographie
  • Eine Fraktionierung von HW40-Peaks wurde bei dem HPAE-PAD-Dionex-LC- System ausgeführt, das aus einem Dionex-Bio-LC-Quaternärgradientenmodul, einem Detektor Modell PAD 2, und einer membranartigen Carbopac-PA-1- Anionenaustauschsäule (250 · 9 mm) besteht.
  • Es wurden zwei Elutionsprogramme verwendet:
  • - Programm 1: 99 : 1 Eluierungsmittel A (0,1 M NaOH) - Eluierungsmittel B (0,1 M NaOH, das M CH&sub3;COONa enthält) während 0,2 min. dann Übergang zu 65 : 35 Eluierungsmittel A (0,1 M NaOH, das M CH&sub3;COONa enthält) in 60 min bei 3 ml min&supmin;¹;
  • - Programm 2: 98 : 2 Eluierungsmittel A - Eluierungsmittel B, dann Übergang zu 70 : 30 Eluierungsmittel A - Eluierungsmittel B in 60 min.
  • Die eluierten Fraktionen wurden sofort mit M-acetat neutralisiert und lyophilisiert. Die Fraktionen wurden nacheinander auf einer Säule (6 · 1 cm) aus Dowex 50 · 8 (H') -Harz, und auf einer Säule aus Fractogel (55 · 2 cm) unter Verwendung von deionisiertem Wasser als Eluierungsmittel entsalzt.
    • 2.5. ¹H-Kernresonanzspektroskopie
  • Für ¹H-Kernresonanzmessungen wurden die deuterium-ausgetauschten Oligosaccharide in 0,5 ml 2H&sub2;O (99,96% Atom ²H, Aldrich) aufgelöst. Die 400 MHz-¹H-Kernresonanzexperimente wurden mit einem Bruker AM-400WB-Spektrometer ausgeführt, das mit einem gemischten 5 mm&supmin;¹H-/¹³C-Sondenkopf ausgerustet war und in dem gepulsten Fouriertransformationsmodus arbeitete, und durch einen Aspect 3000-Computer (Centre Commun de Mesures, Universität Lille, Flandres Artois) gesteuert wurde.
  • Alle Spektren wurden bei einer Sondentemperatur von 353ºK aufgenommen. Eindimensionale Spektren wurden mit einer spektralen Breite von 3000 Hz für Punkte eines 16 k-Frequenzbereichs und Zeitbereichs-Datenpunkte aufgenommen, wodurch eine endgültige digitale Auflösung von 0,365 Hz/Punkt erhalten wurde.
  • Die 100 MHz-¹³C-Kernresonanzexperimente wurden mit dem Standard- Brucker-Impulsprogramm Powgate mit ¹H-Verbundimpuls-Entkopplung durchgeführt. Die spektrale Breite war 22,727 Hz für Datenpunkte eines 32k-Frequenzbereichs und Zeitbereichsdaten, wodurch eine endgültige digitale Auflösung von 1,387 Hz/Punkt erhalten wurde; dabei wurden ein Neunzig-Grad-Impuls (6 us), und eine Recycle-Verzögerung von 1 s verwendet. Die chemische Verschiebung relativ zu dem Signal der Methylgruppe von Aceton war vorgegeben (δ 2,225 für ¹H und δ 31,55 für ¹³C).
  • Das 2D-homonukleare COSY 45- und das COSY mit einfachen, doppelten und dreifachen Relaistransfers wurden unter Verwendung der Standard-Bruker- Impulsprogrammbibliothek oder der von B. Perly (C.E.A., Saclay) angegebenen Programme ausgeführt. Für alle RCT-Experimente wurden Refokussie rverzögerungen von 35 ms gewählt, und die Relaxationsverzögerung war 2 s. Bei allen diesen Experimenten betrug die spektrale Breite 1840 Hz, und der ¹H-neunzig- Grad-Impuls betrug 10,6 us; 256 W · 2K Datenmatrizen wurden erfaßt, die vor der Fourier-Transformation mit Nullen gefüllt wurden, um eine 1 K · 2 K- Spektraldatenmatrix zu erhalten, und eine quadratische Sinusglocken-Funktion wurde bei beiden Dimensionen verwendet.
  • Die 2D-¹³C/¹H-COSY-Experimente wurden bei gleichzeitiger Unterdrückung von homonuklearen ¹H-Kopplungen unter Verwendung des Standard-Bruker- Impulsprogramms XHCORRD durchgeführt. Die Refokussierverzögerungen wurden auf eine mittlere ¹jC.H-Kopplungskonstante von 150 kHz eingestellt. Die ¹H- und ¹³C-neunzig-Grad-Impuls-Breiten betrugen 10,6 und 6 us. Die Relaxationsverzögerung betrug 0,8 s. Es wurde eine 128 W · 4 K-Datenmatrix erfaßt, die vor der Fourier-Transformation mit Nullen gefüllt wurde, um eine 512 W · 4 K- Spektraldatenmatrix zu erhalten. Eine exponentielle Funktion (LB = 1 Hz) für die ¹³C-Subspektren, und eine Sinusglocken-Funktion für die ¹H-Spektren wurden angewandt, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.
    • 3. STRUKTUR DES VON LACTOBACILLUS HELVETICUS CNCM I-1449 PRODUZIERTEN EXOPOLYSACCHARIDS 3.1. Isolierung und Zusammensetzungsanalyse des Polysaccharids
  • Die GLC-Analyse der trimethylsilylierten Glykoside und (-)-2-butyl- Glykoside hat die Anwesenheit von D-Galaktose und D-Glukose in einem Molverhältnis von 1 : 1 bestätigt.
    • Kernresonanzspektroskopie
  • Das in D&sub2;O bei 80ºC aufgezeichnete 400 MHz-¹H-Kernresonanzspektrum des natürlichen Polysaccharids weist bei 5,201, 5,158, 4,568 und 4,350 ppm 4 Signale auf, die für anomere Protonen in einem Verhältnis von 1 : 2 : 2 : 1 charakteristisch sind, was auf eine sich wiederholende Hexasaccharideinheit hindeutet (Tabelle 1).
  • Dies wird durch das 100 MHz-¹3C-Spektrum (Tabelle 1) bestätigt, das sechs Signale für anomeren Kohlenstoff (108,95, 103,74, 103,8, 102,52, 100,26 und 99,87 ppm) aufweist.
  • Gemäß dem ¹H-Spinsystem können bei einzelnen Zuckereinheiten, die in dem zweistufigen Relais-COSY-Spektrum dargestellt sind, die Monosaccharide identifiziert werden als β-Galf (Rest A), β-D-Glcp (Reste B und E), α-D-Glcp (Rest C), α-D-Galp (Rest D), und β-D-Galp (Rest F).
  • Eine Prüfung der Relais-COSY-Spektren der durch partielle Säurehydrolyse erhaltenen Oligosaccharid-alditole IV B und II A (siehe unten) führt zu der klaren Identifizierung der β-D-Galp. Wie durch das COSY-Spektrum des Polysaccharids nachgewiesen wird, weisen das H-2 und H-3 des β-D-Glap F- Restes eine starke Kopplungskonstante auf, die nicht ermöglicht, ihre mehrfachen Muster zu analysieren.
  • Eine Korrelation der bei dem heteronuklearen ¹H - ¹³C-COSY-Spektrum beobachteten Peaks zeigt, daß eine der Protonresonanzen (5,158 ppm) mit der bei 108,95 ppm unabgeschirmten Kohlenstoffresonanz verbunden ist, was beweist, daß der Galf A-Rest eine β-anomere Konfiguration hat.
  • Die meisten der Protonresonanzen können bei dem homonuklearen COSY- Spektrum zugeordnet werden, jedoch nicht die H-5- und H-6-Spinsysteme des β- D-Galp F-Restes. Die Kohlenstoffresonanzen können auch durch direkte Korrelation ihren gebundenen Protonen zugeordnet werden.
  • Für die zwei verbleibenden, nicht zugeordneten Kohlenstoffatome bei 73,52 und 61,12 ppm wurde gefolgert, daß sie mit den C-5- und C-6- Atomresonanzen des β-D-Galp F-Restes übereinstimmen.
  • Zusammenfassend kann gesagt werden, daß alle diese Zuordnungen in klarer Weise das Substitutionsmuster jeder Zuckereinheit entsprechend den feldabwärts verschobenen Kohlenstoffresonanzen liefern:
  • C-3 und C-5 für β-D-Galf A,
  • C-3 für α-D-Glcp C,
  • C-3 für α-D-Galp D,
  • C-3 für β-D-Glcp B und
  • C-4 für g-D-Glcp E.
  • Die sechste Zuckereinheit β-D-Galp F, die keine feldabwärts verschobene ¹³C-Resonanz besitzt, kommt folglich in einer nicht-reduzierenden Position vor.
    • 3.2. Methylierungsanalyse
  • Die Kernresonanzergebnisse werden durch die GLC MS-Analyse der aus den permethylierten Polysacchariden gewonnenen, partiell methylierten Alditolacetate und Methylglykoside (Tabelle 2) gestützt und bestätigt. Diese Analyse beweist in der Tat die Anwesenheit eines endständigen Galaktosylrestes, eines 3-gebundenen Glukosylrestes, eines 4-gebundenen Glukosylrestes, eines 3-gebundenen Galaktosylrestes und eines 3,5-gebundenen Galaktosylrestes in dem Verhältnis 1 : 2 : 1 : 1 : 1.
    • 3.3. Partielle Säurehydrolyse
  • Um die Position des verzweigten endständigen Galaktosylrestes zu bestimmen, wurden durch partielle Säurehydrolyse des natürlichen Polysaccharids Oligosaccharide produziert. Aus dem Hydrolysat wurden sechs hauptsächliche Fraktionen durch Gelfiltration auf Fractogel HW40F hergestellt (Fig. 2).
  • Zwei von ihnen (Fraktionen II und IV) wurden der HPAE-PAD-Chromatographie unterworfen (Fig. 3, 4 und Tabelle 3), und die Struktur der mit II A, IV A und IV B bezeichneten Unterfraktionen wurde sowohl durch Kernresonanz, als auch durch eine Methylierungsanalyse untersucht.
  • Das Oligosaccharid-alditol IV A enthält zwei Glc-Reste und einen Hexitolrest, wie von dem ¹H-Spinsystem gezeigt wird, das in dem zweistufigen Relais-COSY-Spektrum dargestellt ist. Die zwei Glc-Reste kommen bei der nicht-reduzierenden Endposition vor, wie durch die Methylierungsanalyse bestätigt wird, die 2, 3, 4, 6-Tetra-O-methyl-glucitol ergab. Das letzte Derivat zeigt ein Muster, das einer für einen Furan-Zucker charakteristischen C-3- und C-5-Substitution entspricht. Aufgrund der obigen Kernresonanzdaten stammt dieses Hexitol von der β-D-Galf A-Einheit. Diese Erkenntnisse führen zu der folgenden Struktur:
  • Es muß angemerkt werden, daß infolge der Symmetrie, die das ¹H- Spinsystem von Galaktitol aufweist, die ¹H-Kernresonanz-Zuordnung der Verbindung nach der Bestimmung der Struktur der Verbindung IV B ausgeführt werden konnte.
  • Das Oligosaccharid-alditol IV B enthält β-D-Galp und Q-D-Glcp in dem Verhältnis 1 : 1, wie von den Mustern der benachbarten Kopplungskonstanten klar gezeigt wird. Die Methylierungsanalyse (Tabelle 4) zeigte die Anwesenheit von 2, 3, 4, 6-Tetra-O-methyl-galaktose, 2, 3, 6-Tri-O-methyl-glukose, und 1, 2, 4, 5, 6-Penta-O-methyl-galaktikol an. Daher besitzt das Oligosaccharidalditol 2 die folgenden Struktur:
  • Die Bindung von β-D-Glcp bei C-3 von Gal-ol ist nicht geeignet, die chemische Verschiebung der H-1- und H-2-Resonanzen des Hexitols wesentlich zu ändern, verglichen mit den Kernresonanzdaten der Verbindung IV A. Durch Vergleich mit der Verbindung IV A (Tabelle 3) können daher die zwei Signale bei 3,77 und 4,056 ppm dem H-1 und H-2 von Gal-ol zugeordnet werden, während die Resonanzen der Atome H-5 und H-6 bei 4,149 und 3,68 ppm feldaufwärts verschoben sind.
  • Bei den Kernresonanzspektren von IV A und IV B ist die H-5-Resonanz von Gal-ol die am stärksten feldaufwärts verschobene Atomresonanz des Moleküls, und diese Beobachtung stimmt mit den von anderen vorgeschlagenen Zuordnungen überein.
  • Das Oligosaccharid-alditol II A (Tabelle 2) enthält 2 β-D-Glcp-Reste, 1 3-D-GalP-Rest, und 1 α-D-Glcp-Rest, während die Anwesenheit von C-3- und C-5- substituiertem Gal-ol aus der Ähnlichkeit der chemischen Verschiebungen von H-I bis H-6 von Gal-ol bei der Verbindung 1 leicht abgeleitet werden kann. Da die zwei β-D-Glcp-Einheiten und das nicht-reduzierende endständige β-D-Galp bereits bei den Oligosaccharid-alditolen IV A und IV B lokalisiert wurden, und aufgrund der Tatsache, daß der β-D-Glcp B-Rest C-3-substituiert ist, besitzt das Oligosaccharid-alditol 1I A die folgende Struktur:
  • Die sechste Zuckereinheit, α-DGalp, wurde unter den Produkten der partiellen Hydrolyse nicht beobachtet. Dennoch führen die Tatsache, daß die α-DGlcp-Einheit C-3-substituiert ist, und daß die einzige in dem Polysaccharid anwesende β-D-Galp-Einheit (aufgrund der Kernresonanzdaten) die nicht-reduzierende Position einnimmt, zu der Schlußfolgerung, daß die α-D- Galp-Einheit an diesen α-D-Glcp-Rest gebunden ist.
  • Daher wurde die strukturelle Einheit des Polysaccharids wie folgt definiert: Tabelle 1: Chemische Kernresonanzverschiebung des Polysaccharids in D&sub2;O bei 80ºC (interner Standard: Aceton) Tabelle 2: Methylierungsanalyse des natürlichen Polysaccharids Tabelle 3: Chemische Kernresonanzverschiebungen der Oligosaccharid-alditole, die durch partielle Säurehydrolyse des Polysaccharids aus Lactobacillus helveticus gewonnen wurden, in D&sub2;O bei 353ºK. Tabelle 4: Methylierungsanalyse von Oligosaccharid-alditol (partiell methylierte und acetylierte Methylglykoside) IV A, IV B und II A, das durch partielle Säurehydrolyse von natürlichem Polysaccharid gewonnen wurde
  • (*) Infolge seiner hohen Flüchtigkeit ist der Wert niedriger als erwartet.
  • Die Zusammensetzungen, die das Polysaccharid und/oder den Mikroorganismus der Erfindung aufweisen, werden in den folgenden nichtbegrenzenden Beispielen beschrieben.
    • Beispiel 1: Geronnene, angesäuerte Milch
  • Geronnene, angesäuerte Milch, die den erfindungsgemäßen L. helveticus- Stamm und zwei in herkömmlicher Weise für die Herstellung eines geronnenen Joghurts verwendete S. thermophilus-Stämme aufweist, wurde nach dem folgenden Prozeß hergestellt.
  • Zu Vollmilch, die 3,7% Fette aufwies, wurden 2,5% Pulver von entrahmter Milch zugegeben.
  • 40 Liter dieser Milch wurden bei 92ºC während sechs Minuten pasteurisiert, bei 75ºC und 150 bar homogenisiert (2 Niveaus), und auf eine Temperatur von ungefähr 42ºC abgekühlt.
  • Die gefriergetrockneten Stämme S. thermophilus CNCM I-1422, S. thermophilus CNCM I-1424, und L. helveticus CNCM I-1449 wurden mit mehreren aufeinanderfolgenden Kulturen in einem sterilen MSK-Medium (rekonstituiert mit 10% Pulver aus entrahmter Milch und 0,1% eines kommerziellen Hefeextrakts) reaktiviert.
  • Eine Anmeldung des Mikroorganismus erfolgte gemäß dem Vertrag von Budapest am 18. Mai 1994 für die Streptococcus-Stämme, und am 27. Juli 1994 für den Lactobacillus-Stamm bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANKREICH.
  • Die sterilisierte Milch wurde mit 1% der dritten Kultur von jedem S. thermophilus-Stamm und mit 2% der zweiten Kultur des L. helveticus-Stamms in dem mittleren Koagulationsstadium geimpft.
  • Die Molkemilch wurde bei 42ºC und bei einem pH von ungefähr 4,65 inkubiert, und dann auf eine Temperatur von 4ºC abgekühlt.
    • Beispiel 2: Angesäuerte Molkemilch
  • Molkemilch, die den erfindungsgemäßen L. helveticus-Stamm und zwei in herkömmlicher Weise für die Herstellung eines Joghurts verwendete S. thermophilus-Stämme aufwies, wurde nach dem folgenden Prozeß hergestellt. Die Molkemilch wurde mit 12,5% süßem Lactoserumpulver in Wasser rekonstituiert.
  • 40 Liter dieser Molke wurden bei 92ºC während sechs Minuten pasteurisiert, bei 75ºC und 150 bar homogenisiert (2 Niveaus), und auf eine Temperatur von ungefähr 42ºC abgekühlt.
  • Die gefriergetrockneten Stämme S. thermophilus CNCM I-1422, S. thermophilus CNCM I-1424 und L. helveticus CNCM I-1449 wurden mit mehreren aufeinanderfolgenden Kulturen in einem sterilen MSK-Medium (rekonstituiert mit 10% Pulver aus entrahmter Milch und 0,1% eines kommerziellen Hefeextrakts) reaktiviert.
  • Eine Anmeldung des Mikroorganismus wurde gemäß dem Vertrag von Budapest am 18. Mai 1994 für die Streptococcus-Stämme, und am 27. Juli 1994 für den Lactobacillus-Stamm bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANKREICH.
  • Die sterilisierte Milch wurde mit 1% der dritten Kultur von jedem S. thermophilus-Stamm und mit 2% der zweiten Kultur des L. helveticus-Stamms in dem mittleren Koagulationsstadium geimpft.
  • Die Molke wurde bei 42ºC und bei einem pH von ungefähr 4,65 inkubiert, und dann auf eine Temperatur von 4ºC abgekühlt.
    • Beispiel 3: Gerührte, angesäuerte Milch
  • Gerührte angesäuerte Milch, die den erfindungsgemäßen L. helveticus- Stamm CNCM I-1449 und zwei kommerzialisierte, in herkömmlicher Weise für die Herstellung eines gerührten Joghurts verwendete S. thermophilus-Stämme aufwies, wurde nach dem folgenden Prozeß hergestellt.
  • Die Milch wurde aus Vollmilch, die 3,7% Fette aufwies, durch Zugabe von 2,5% Pulver von entrahmter Milch hergestellt.
  • 40 Liter dieser Milch wurden bei 105ºC während zwei Minuten pasteurisiert, bei 75ºC und 300 bar homogenisiert (erstes Niveau), und auf eine Temperatur von ungefähr 43ºC abgekühlt.
  • Die lyophilisierten Stämme S. thermophilus CNCM I-1421, S. thermophilus CNCM I-1423, und L. helveticus CNCM I-1449 wurden mit mehreren aufeinanderfolgenden Kulturen in einem sterilen MSK-Medium reaktiviert.
  • Eine Anmeldung des Mikroorganismus erfolgte gemäß dem Vertrag von Budapest am 18. Mai 1994 für die Streptococcus-Stämme, und am 27. Juli 1994 für den Lactobacillus-Stamm bei der Collection Nationale de Culture de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur, 28 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, FRANKREICH.
  • Die sterilisierte Milch wurde mit 1% der dritten Kultur von jedem S. thermophilus-Stamm und mit 2% der dritten Kultur des L. helveticus-Stamms in dem mittleren Koagulationsstadium geimpft.
  • Die Milch wurde bei 43ºC und bei einem pH von ungefähr 4,65 inkubiert, und dann unter Rühren auf eine Temperatur von 4ºC abgekühlt.
  • Die folgende Tabelle 5 gibt die Eigenschaften der erhaltenen Produkte wieder. Tabelle 5 Beispiel 4: Kosmetische Zusammensetzung für die Mundhygiene Beispiel 5: Kosmetische Zusammensetzung für die Hauthvgiene
    • Beispiel 6: Pharmazeutische Zusammensetzung für antidiarrhoische Verwendung
  • Eine pharmazeutische Zusammensetzung wurde als eine Kapsel hergestellt, die mit Gelatine und Wasser gemacht wurde, und die 5 bis 50 mg des Exopolysaccharids der vorliegenden Erfindung enthielt. In alternativer Weise können pulverisierte Tablettenformulierungen direkt aus den bei den obigen Beispielen 1, 2 und 3 beschriebenen, angesäuerten Kultur-Milchen durch Gefriertrocknen dieser fermentierten Milchen und der Molke hergestellt werden.
    • Literaturverzeichnis
  • 1. Kolenbrander, P.E., Ganeshkumar, N., Cassels, F.J. & Hughes, C.V., Coaggregation: specific adherence among human oral plaque bacteria. The FASEB Journal, 7 (1993) 406-413.
  • 2. Karlsson, K.-A., Animal glycosphingolipids as membrane attachment sites for bacteria. Annual Review of Biochemistry, 58 (1989) 309-350.
  • 3. Hughes, R.C., Mac-2: A versatile galactose-binding protein of mammalian tissues. Glycobiology, 4 (1994) 5-12.
  • 4. Truong, M.-J., Gruart, V., Kusnierz, J.-P., Papin, J.-P., Loiseau, S., Capron, A. & Capron, M., Human neutrophils express immunoglobulin E (IgE)-binding proteins (Mac-2/EBP) of the S-type lectin family: role in IgE-dependent activation. Journal of Experimental Medicine, 177 (1993) 243-248.
  • 5. Wollenberg, A., de la Salle, H., Hanau, D., Liu, F.-T. & Bieber, T., Human keratinocytes release the endogenous β-galactoside-binding soluble lectin immunoglobulin E (IgE-binding protein) which binds to Langerhans cells where it modulates their binding capacity for IgE glycoforms. Journal of Experimental Medicine, 178 (1993) 777-785.
  • 6. Doco, T., Fournet, B., Carcano, D., Ramos, P., Loones, A., Piot, J.-M. & Guillochon, D., Polysaccharide, application comme agent epaississant et comme agent anti-tumoral. Demande de brevet europeen, EUR 331 564, 06.09.1989.
  • 7. Doco, T., Wieruszeski, J.-M., Fournet, B., Carcano, D., Ramos, P. & Loones, A., Structure of an exocellular polysaccharide produced by Streptococcus thermophilus. Carbohydrate Research, 198 (1990) 313-321.
  • 8. Gruter, M., Leeflang, B.R., Kuiper, J., Kamerling, J.P. & Vliegenthart, J.F.G., Structure of the exopolysaccharide produced by Lactococcus lactis subspecies cremoris H414 grown in a defined medium or skimmed milk. Carbohydrate Research, 231 (1992) 273-291.
  • 9. Nakajima, H., Hirota, T., Toba, T., Itoh, T., & Adachi, S., Structure of the extracellular polysaccharide from slime-forming Lactococcus lactis subsp. cremoris SBT 0495. Carbohydrate Research, 224 (1992) 245-253.
  • 10. Gruter, M., Leeflang, B.R., Kuiper, J., Kamerling, J.P. & Vliegenthart, J.F.G., Structural characterization of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus delbrückii subspecies bulgaricus rr grown in skimmed milk. Carbohydrate Research, 239 (1993) 209-226.
  • 11. Van den Berg, D.J.C., Ledeboer, A.M., Robijn, G.W. & Vreeker, R., Lactobacillus sake like strains, production and use of their exopolysaccharides. International Patent Application PCT No WO 94/12656, 9 June 1994.
  • 12. Tsuchiya, F., Miyazawa, K., Kanbe, M., Oda, M. & Ebisawa, N., High molecular polysaccharide MPS-80. United States Patent No 4,396,763, August 2, 1983.
  • 13. Oda, M., Hasegawa, H., Komatsu, S., Kambe, M. & Tsuchiya, F., Anti-tumor polysaccharide from Lactobacillus sp. Agricultural and Biological Chemistry, 47 (1983) 1623-1625.
  • 14. Yamamoto, Y., Polysaccharide NPS, method for making it and uses thereof. Laid-open patent application from the Japanese Patent Office No 5-186501, 27 July 1993.
  • 15. Hodgson, J., Carbohydrate-based therapeutics. Bio/Technology, 9 (1991) 609-613.
  • 16. Yuen, C.-T., Bezouska, K., O'Brien, J., Stoll, M., Lemoine, R., Lubineau, A., Kiso, M., Hasegawa, A., Bockovitch, N.J., Nicolaou, K.C. & Feizi, T., Sulfated blood group Lewis3. A superior oligosaccharide ligand for human E-selectin. Journal of Biological Chemistry, 269 (1994) 1595-1598.
  • 17. Ichikawa, Y., Lin, Y.-C., Dumas, D.P., Shen, G.-J., Garcia-Junceda, E., Williams, M. A., Bayer, R., Ketcham, C., Walker, L.E., Paulson, J.C. & Wong, C.-H., Chemical-enzymatic synthesis and conformational analysis of sialyl Lewis X and derivatives. Journal of the American Chemical Society, 114 (1992) 9283-9298.
  • 18. Neeser, J.-R. & Schweizer, T.F., A quantitative determination by capillary gas-liquid chromatography of neutral and amino-sugars (as O- methyloxime acetates), and a study on hydrolytic conditions for glycoproteins and polysaccharides in order to increase sugar recoveries. Analytical Biochemistry, 142 (1984) 58-67.

Claims (9)

1. Verzweigtes, natürliches, lösliches Polysaccharid, dadurch gekennzeichnet, daß es aus dem Stamm Lactobacillus helveticus CNCM I-1449 gewonnen wird, und daß es aus einer Saccharid-Hauptkette besteht, die sich wiederholende Seitenketten hat, die Laktoseeinheiten sind, wobei die Laktoseeinheiten möglicherweise substituiert sind.
2. Verzweigtes Polysaccharid gemäß Anspruch 1, das der folgenden Formel entspricht:
wobei n > 1,
Gal = Galaktose,
Glc = Glukose,
R¹ = Wasserstoff oder GalNAcβ1 (N-acetylgalaktosamin),
R² = Wasserstoff, NeuNAcα2 (N-acetylneuraminsäure) oder HSO&sub3;,
R³ - Wasserstoff oder Fucα1 (Fukose)
3. Lactobacillus helveticus CNCM I-1449, der das verzweigte Polysaccharid gemäß Anspruch 1 oder 2 produziert, wobei R¹ = R² = Wasserstoff ist.
4. Nahrungsmittelzusammensetzung, die das verzweigte Polysaccharid und/oder den Lactobacillus helveticus gemäß irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche umfaßt.
5. Nahrungsmittelzusammensetzung gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus geronnenen oder gerührten, angesäuerten Milchen oder Molke besteht.
6. Kosmetische Zusammensetzung, die das verzweigte Polysaccharid und/oder dem Lactobacillus helveticus gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
7. Kosmetische Zusammensetzung gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Mundspülmittel, einer Zahnpasta, einem Zahngel, einem Kaugummi, einer Tablette, einer Creme, einer Salbe oder einem Balsam besteht.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung, die das verzweigte Polysaccharid und/oder den Lactobacillus helveticus gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 umfaßt.
9. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einer Kapsel, einem Sirup, einem Pulver oder einer Tablette besteht.
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0889136A1 (de) * 1997-07-05 1999-01-07 Societe Des Produits Nestle S.A. Exozellulares Polysaccharid hergestellt durch Streptococcus thermophilus
US5972311A (en) * 1998-01-26 1999-10-26 Duke University Method of preventing dental caries and other oral lesions
EP0957169A1 (de) * 1998-04-22 1999-11-17 Societe Des Produits Nestle S.A. Identifizierung von Lactobacillus helveticus LH59 Gene verantwortlich für Exopolysaccharidbiosynthese
WO1999062316A2 (fr) * 1998-04-22 1999-12-09 Societe Des Produits Nestle S.A. Identification de genes de bacteries lactiques impliques dans la biosynthese d'exopolysaccharides
EP1159951A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-05 Societe Des Produits Nestle S.A. Verwendung von exogenen Milchsäurebakterien-Stämmen zur Behandlung von durch Actinomyces naeslundii hervorgerufene Krankheiten
EP1104281B1 (de) * 1998-08-12 2011-03-16 Societe Des Produits Nestle S.A. Inkorporation von exogenen milchsäurebakterien in die mikroflora
DK1142481T4 (da) * 1999-01-11 2009-12-21 Calpis Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af fermenteret mælk indeholdende et peptid, der inhiberer et angiotensinomdannende enzym og fremgangsmåde til fremstilling af mælkeserum
EP1255447A4 (de) * 2000-02-02 2006-05-17 Oregon State Biopolymeres verdickungsmittel
US6861077B1 (en) 2000-03-17 2005-03-01 L'oreal S.A. Use of plant extracts in a cosmetic composition to protect keratinous fibers
EP2295971B1 (de) * 2001-03-09 2016-09-07 TrovaGene, Inc. Konjugatsonden und optische Erkennung von Analyten
US20110150795A1 (en) * 2008-04-15 2011-06-23 Innovactiv Inc. Cosmetic compositions comprising exopolysaccharides derived from microbial mats, and use thereof
EP2183984B1 (de) * 2008-11-10 2011-12-28 Nestec S.A. Sialsäure produzierende Bakterien
CA2917268C (en) 2013-07-05 2023-11-07 Integra Medical Inc. Oral compositions
CN104586642A (zh) * 2015-02-06 2015-05-06 武汉中科光谷绿色生物技术有限公司 N-乙酰神经氨酸单体、n-乙酰神经氨酸水合物或n-乙酰神经氨酸盐在个人护理用品中的应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4396763A (en) * 1981-01-14 1983-08-02 Meiji Milk Products Company Limited High molecular polysaccharide MPS-80
DE3750139T2 (de) * 1986-04-16 1994-10-06 Brigham & Womens Hospital Bakterielle antigene, antikörper, impfstoffe und deren herstellung.
JP2518663B2 (ja) * 1987-12-24 1996-07-24 株式会社ヤクルト本社 ガラクトオリゴ糖含有加工乳の製造法
JPH0539304A (ja) * 1991-08-05 1993-02-19 Glyco Kyodo Nyugyo Kk 可溶性食物繊維及びその製造方法
CH683223A5 (fr) * 1991-10-25 1994-02-15 Nestle Sa Procédé de préparation d'un lait acidifié.

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Publication number Publication date
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CA2155134A1 (en) 1996-02-20

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