JPH0781987B2 - 等電点電気泳動法及びそのための装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、使用される実験条件下で０の正味荷電を有す
るか又は中性である化合物、例えばペプチド及び蛋白質
を前記と同じ実験条件下で正味荷電を有する他の両性又
は非両性化合物、例えば他のペプチド、蛋白質及び／又
は塩から電気泳動により、特に分取用等電点電気泳動に
より分離するための新規且つ発明的な方法、並びにこの
方法を実施するための新規な手段、すなわち装置に関す
る。

〔従来の技術〕

分取用電気泳動は既知の技法であり、そして分析及び分
取の両目的のために種々の形の電気泳動装置が提案され
ている。基本的には、分取用電気泳動のための装置及び
原理は、用いられる電気泳動原理に従って４つの主たる
クラスに分類することができる〔A.T.Andrews,Electrop
horesis:Theory,Thchniques,and Biochemical and Clin
ical Applications,Clarendon Press、オックスフォー
ド、1986〕。

ａ）ディスク電気泳動、 ｂ）フリー・カーテン電気泳動、 ｃ）等速電気泳動、及び ｄ）等電点電気泳動〔P.G.Righetti,Isoelectric Focus
ing:Theory,Methodology and Applications,Elsevier、
アムステルダム、204−207頁（1983）を参照のこと〕。

一般にディスク電気泳動及び等速電気泳動は、親水性マ
トリスク中で連続的に（アガロース及びポリアクリルア
ミド）又は非連続的に（顆粒ベッド、例えばセファデッ
クス）行われる。これらは高い分離能により、しかし低
い許容サンプル負荷量により特徴付けられる。フリーカ
ーテン電気泳動は一般に連続緩衝液を使用し、自由液相
中で行われ、そしてサンプルの連続的導入を伴う連続流
薄相の緩衝液により特徴付けられる。基本的にこの技法
は大きなサンプル取扱い容量を提供するが、しかし分離
能は低い。さらに、蛋白質の一層高い拡散定数のため、
この方法はほとんど、無傷の細胞又は細胞下オルガネラ
の精製に限定される。

等電点電気泳動（IEF）は液体支持体中で（密度勾配）
又はゲル媒体中で、連続的に又は顆粒を用いて行うこと
ができる。実際に、IEFの技法はシュークロース密度勾
配を充填された垂直ガラスカラムを用いて分取法として
開始された。中程度に高いサンプル負荷量を高分離能を
伴って（ΔpI＝0.02pH単位;pI＝等電点）取扱うことが
できるが、この分離能は、底部回収漏斗を介するカラム
を用いる場合には非常に失われる。この技法は今日実際
に実質的に放棄されている。粒状支持体（ほとんどアガ
ロースマトリクス及びポリアクリルアミドマトリクス）
によりIEFが便利であるからである。後者は高い分離能
を許容するが、しかし蛋白質の負荷は中程度に過ぎな
い。さらに、対流防止媒体として親水性ゲルを用いるす
べての分取技法は精製された蛋白質をマトリクスから回
収する場合の問題点を有する。これは追加の取扱い段階
例えば注目のゾーンの検出、バンドの切り出し、及び拡
散による溶出又は電気泳動的回収を必要とする。これは
２つの大きな欠点、すなわちａ）低い回収率（いずれも
マトリクスも蛋白質を不可逆的に吸着する傾向があるた
め）；及びｂ）ゲル材料からの汚染の可能性（特にポリ
アクリルアミドのごとき合成支持体の場合、未反応モノ
マー、及びバルクマトリクスに非−共有結合的にグラフ
トされた短いオリゴマーポリアクリルアミドコイルから
の汚染）、を有する。

〔発明が解決しようとする課題〕

この発明は、ペプチドがそうである様に使用される条件
下で等電点を有し又は荷電されていない化合物の電気泳
動による精製方法を提供するための研究に基礎を置いて
おり、この方法においては目的の生成物ではなく不所望
の副生成物及び汚染物のみがマトリクスと接触し、そし
てこの方法は非常に純粋な形の目的生成物の卓越した収
量をもたらす。

この研究それ自体の概観及びその解決策の両者が発明的
段階を含む。

〔課題を解決するための手段〕

次に、図面に言及しながらこの発明を説明しよう。

この発明は、等電点電気泳動用溶媒に可溶性の荷電した
１又は複数の化合物から該溶媒に可溶性の両性又は中性
化合物を分離又は精製するための等電点電気泳動法であ
って、この方法は電気泳動装置を用いて行われ、この方
法においては電気泳動マトリクスを通過する電流が液流
（７），（８）及び（11）（図面を参照のこと）と関連
しており、該電流の方向が該液流のそれと異り、該液流
は前記溶媒中前記化合物の溶液を含んで成りそして前記
マトリクスを２個の部分に分けており、１つの部分
（５）又は（25）は陰極側に位置しそして他方（12）又
は（26）は陽極側に位置し、液流内で前記両性又は中性
化合物は等電状態又は非荷電状態に維持され、そして前
記の荷電した化合物が電流により前記液流から前記マト
リクスの前記２つの部分の少なくとも一方中に除去さ
れ、又は前記部分の少なくとも一方を介して電解質溶液
溜（３）及び（14）の少なくとも一方中に除去され、前
記２つの部分は相互に独立に固定化されたpH−勾配体
（５）及び（12）を代表し、それぞれがそのpH範囲にお
いて導電性並びに緩衝能力及びタイトラント（titran
t）能力の両方を有し、あるいはそれぞれがその特定のp
H−値において導電性並びに緩衝能力及びタイトラント
能力の両方を有することを特徴とする方法に関する。

〔具体的な説明〕

等電状態又は非荷電状態に維持される両性又は中性化合
物は、精製工程の条件下で、そして不所望の随伴化合物
からの分離が実際に起こる時点で正味の荷電を有さず又
は中性である化合物である。これは好ましくは蛋白質、
酵素、又は少なくとも２個のアミノ酸を有する一層小さ
いペプチド、あるいはペプチド成分又は蛋白質成分を含
有する化合物、例えば糖蛋白質であり、しかしさらに核
酸、複合脂質又は複合炭水化物でもある。

これに対して、荷電を有する化合物は、精製工程の条件
下で、そして目的化合物からの分離が実際に起こる時点
で荷電を有する化学種、例えば、荷電された、すなわち
非等電状態の蛋白質、酵素又は一層小さいペプチド、及
びさらに塩、例えばアルカリ金属塩、例えば塩化ナトリ
ウムである。

この発明の方法のために適当な溶媒は、目的の化合物を
溶解し且つ必要な電流を許容する任意の溶剤、例えば、
水又は水と適当なアルコール、例えば低級アルコール、
例えばメタノール又はエタノールとの混合物、あるいは
尿素、洗剤又は他の任意の水混和性有機溶剤もしくはプ
ロトン性溶剤を含有する水性溶液である。

電流は電源（１）により発生せしめる。発生した熱が適
当な冷却により消散され得る限り、系が耐え得る任意の
電圧、例えば100〜10000ボルト、特に500〜10000ボル
ト、好ましくは500〜5000ボルト、例えば500ボルト、10
00ボルト、5000ボルト、又は10000ボルトさえ使用する
ことができる。平衡における典型的な値は、例えば1000
V、3mA及び3W、又は500V、10mA及び5Wである。

電気泳動マトリクスは電気泳動分離のための担体であ
る。

液流はポンプにより、攪拌により、又は適当な軸を中心
にして流過室（８）を回転せしめることにより生じ、そ
して液相として分離されるべき混合物を含有する溶液を
含んで成る。

液流の方向は、電流の方向に対して任意の適当な角度を
なし、例えば５゜〜90゜、特に30゜〜90゜、好ましくは
およそ垂直（直角）をなす。

例えばシリンダー（５）又は（12）中に収容される固定
化pH−勾配体は電気泳動マトリクス、例えばゲル上の安
定なpH−機能（pH−function）を含む。固定化されたpH
−勾配体はpH−範囲（pH−interval）を構成し、これは
それ自体既知の方法により、例えば重層された密度勾配
及び重合により（LKB−Produkter AB、ボックス305、Ｓ
−16126ブロッマ，スエーデンの1982年８月付のApplica
tion Note 321を参照のこと）、例えば、その出口がシ
リンダー（５）又は（12）に連結されている勾配ミキサ
ー、例えばLKB−Produkter ABにより供給される“Micro
Grad Gradient Maker"中で、等容量の後記の２種類の出
発溶液Ａ及びＢを混合することにより形成されるpH−勾
配体を含んで成る。出発溶液Ａは酸性の重い溶液であ
り、そして緩衝性Immobiline（登録商標；以下この様に
標示しないで使用する）又はその均等物、非−緩衝性Im
mobiline又はその均等物、Ampholine（登録商標；以下
この様に標示しないで使用する）又はその均等物、アク
リルアミド、N,N′−メチレン−ビス−アクリルアミ
ド、グリセロール、水、及び適当な重合触媒を含有す
る。出発溶液Ｂは塩基性の軽い溶液であり、緩衝性Immo
biline、非緩衝性Immobiline,Ampholine、アクリルアミ
ド、N,N′−メチレン−ビス−アクリルアミド、水、及
び適当な重合触媒を含有するが、しかしグルセロールを
含有しない。

両性等電性の固定化されたpH−膜は、これらがpH−勾配
を含まず膜全体を通じて同じpH値を有する点において、
固定化されたpH−勾配体と区別ささる。この膜の製造は
pH−勾配体の製造に類似しているが、しかしそれよりも
簡単である。なぜなら、勾配ミキサーが必要でなく、そ
して密度勾配を調製するためにグリセロールを必要とし
ないからである。

膜は、Ampholineと共に所望の等電点を生じさせるのに
必要な比率での変化する量の緩衝性及びタイトラント
（titrant）性Immobiline、適当の重合触媒及び水を含
有するモノマーの溶液（一般に、10〜15％のＴ及び３〜
４％のＣ）の重合により、好ましくはおよそ中性のpH、
50℃、強性換気下で１時間にわたって行われる。正味荷
電の存在又は獲得により荵起される膜を通してのバルク
液の流れを意味する電気浸透（electroendosmosis）を
回避するため、膜はそれらの等電点において良好な緩衝
能力を有することが必須である。しかしながら、好まし
くは、Immobilineのモル濃度は膜中の各Immobilineにつ
き50mMを超えるべきでない。

Ampholineは低分子量両性物質、すなわち両性電解質（a
mpholyte）であり、Immobilineとは異りアクリルアミド
/N,N′−メチレン−ビス−アクリルアミドポリマーに固
定されず、そしてそれ故に導電性に寄与することができ
る。多くの両性物質、例えばアミノ酸及びペプチド並び
に幾つかの両性及び非−両性緩衝成分の混合物が適当な
両性電解質として作用し得る。しかしながら、大部分の
等電点電気泳動実験は市販の両性電解質混合物を用いて
行われる。これらの内最も広く使用されているものは、
LKB Produkterにより商品名Ampholineのもとに販売され
ているものである。これらは、ほとんどが300〜600の範
囲の分子量を有するポリアミノポリカルボン酸の合成混
合物から成る。アミノ基及びカルボン酸基に加えてスル
ホン酸基又はホスホン酸基を含有する他の製品を使用す
ることもできる。これらの製品〔Serva−lyte（登録商
標）、Serva−Feinbiochemica GmbH;Biolytes（登録商
標）、Bio−Rad Laboratories;Pharmalyte（登録商
標）、Pharmacid AB〕が最近Ampholineと比較され、そ
して類似の性能を有することが示された。

Immobilineは次の一般式： （式中、Ｒはカルボン酸又は第三アミノ基を含有する）
を有するアクリルアミド誘導体である。Immobilineはア
クリルアミド及びN,N′−メチレン−ビス−アクリルア
ミドと共重合して固定化されたpH−勾配体を生成するよ
うに設計されている。各誘導体は定められた且つ既知の
pK−値を有する。アクリルアミドは例えばメタクリルア
ミドで置き換えることができ、そしてN,N′−メチレン
−ビス−アクリルアミドは他の適当な架橋剤、例えば他
の適当なアクリルアミド誘導体により置き換えることが
できる。9.5のpK−値を有するＮ−（３−ジメチルアミ
ノ−プロピル）−メタクリルアミドを、Immobiline）に
類似すメタクリルアミド誘導体の例として挙げることが
できる。共重合の後、Immobilineは共有結合され、すな
わち固定化され、そしてpH−勾配体又はpH−膜の導電性
にはなんら寄与しない。しかしながらImmobilineは緩衝
能力及びタイトラント能力に寄与する。

好ましくは、pH−勾配体及びpH−膜は、使用されるImmo
biline及びAmpholineに依存して、約３〜10のpH範囲内
のいずれかで成形される。注目の化合物が両性である場
合、流過室（８）に対面する２つのゲル先端中のpHは、
前記両性物質を常時等電状態に維持するために必要とさ
れる正確さをもって、該両性物質の等電点よりわずかに
上及びわずかに下、又はそれと同じでなければならな
い。前記の正確さ及び前記ゲルの先端におけるpHの差、
すなわち前記ゲルの先端間におけるpH−単位のギャップ
の幅は要求される分離能、すなわちゲルに入らなければ
ならないすなわち少なくともゲルを通過しなければなら
ない汚染物の等電点に依存する可能な最も高い分離能を
達成するため、前記ゲル先端におけるpH−値は相互に同
一であって、且つ目的化合物の等電点に等しいことがで
きる。この場合、拡散によって起こるかもしれない目的
化合物のロスを、ある適当の機械的手段、例えば、適当
なミリポアフィルターをゲルと液流との間に挿入するこ
とによって防止することが有利である。注目の化合物が
中性である場合、汚染物がゲルに入らなければならない
様に前記ゲル先端のpHを選択する。この汚染物はゲル内
に留るか、又はゲルを去って陽極室14及び陰極室３に貯
積するであろう。

適当な重合触媒は例えばN,N,N′,N′−テトラメチレン
ジアミン（TEMED）及び過硫酸アンモニウムである。該
触媒は前記の重い溶液及び軽い溶液の混合を開始する直
前に添加される。重合のための他の手段は例えば紫外線
又はγ線照射を伴うリボフラビンである。

勾配ミキサー中で、塩基性の軽い溶液を酸性の重い溶液
中に混合し、同時のこの重い溶液を、容器（５）又は
（12）に連結された勾配ミキサーの出口に引き出す。こ
れによって、得られる密度勾配pH−勾配と一緒に変化す
る。容器（５）及び（12）の低端は例えばパラフィンに
よりあらかじめ閉じておく。重合過程が終了した後、パ
ラフィンを除去する。前記容器の内直径が長すぎる場
合、該容器の低端に、除去されないある種の支持体、例
えば穴をあけたプレートを挿入することが必要である。
少なくともポリマーと接触する容器部分はポリマーが良
好に付着する材料、例えばガラスから作られなければな
らない。これは容器の壁とポリマーとの間の幾らかの液
が通過するのを防止するためである。固定化されたpH−
勾配体を収容する容器（５）及び（12）を、例えば第１
図及び第２図に示すように本発明の装置に組み込む。こ
の後勾配体を適切に洗浄して不所望の物質、例えば未結
合のImmobiline化学物質、触媒及びグラフトされなかっ
たモノマーを除去する。そうしなければ、ゲルの中央部
の非常に低い導電性のため、弱い未結合の陰イオン及び
陽イオンが電気泳動的に枯渇される場合、陽極ゲル領域
及び陰極ゲル領域に向って蓄積された２つの塩先端が決
して該ゲルから除去されない。良好な等電点電気泳動を
達成するためには、第一のImmobiline勾配体に第二のキ
ャリヤー両性電解質により駆動されるpH−勾配体を重層
する。この発明の装置は、サンプルの適用に先立って定
常状態が達成されるまで、濾過質に液を満たして数時
間、例えば５時間運転される。その後、グラフトされな
かったモノマーのごときポリマーから浸出した有害物質
を除去するために流過室（８）及び必要であれば液流と
接触する他のすべての容器を空にし、そして精製される
べきサンプルで満たす。

この発明の全過程にわたって、サンプル溶液を激しく攪
拌することにより電気的デカンテーション（electrodec
antation）を防止し、そして一定温度に維持する。使用
される温度は特に溶剤、並びに目的物質の安定性及び溶
解性に依存する。水においては、これは約１〜20℃、例
えば２℃の一定値に維持される。

この発明の基本概念は、短かくてもよく且つその境界を
定める２つのゲル相に連結された液体ベッドを用いる組
み合わされた分取技法の概念であり、そして蛋白質の精
製についての下記の例により説明される。注目の蛋白質
が液相中、例えば小さな循環する室（８）中で等電状態
に維持され、他方それに随伴する不純物は陰極方向
（２）又は陽極方向（13）のいずれかの方向に駆動さ
れ、そして最終的には（しかし必然的ではないが）、pH
−勾配体を代表するゲル相（５）及び（12）（番号は図
面による）中に集中される。このpH−勾配体はpH−膜に
より置き換えることもできる。すなわち、この改変され
た等電点電気泳動技法においては、電気泳動的にゲルマ
トリクス（ここから追加の精製段階により回収されなけ
ればならない）中に駆動されるのではなく、液体供給原
料を構成する液流（７），（８）及び（11）中で等電状
態に維持され、そして（荷電した）不純物のみが、流入
液体サンプルの境界を定めるゲル相５及び12中に集中す
るように、又は電解質溜め（３）及び（14）の一方又は
両方に集まるように強制される。好ましくは、液流中の
pH−値は目的化合物の等電点に相当する。電気泳動的分
離はpH勾配中で達成される（等電点電気泳動）ので、pH
−勾配体（５）又は（12）内の等電点を有するすべての
種は、電圧勾配により、それらが０の正味荷電を示す特
定の領域に駆動され、そしてこれらは電界が適用されて
いる限り、その領域に留まる。他の種々の技法と比較し
た場合の相違は特に、系のサンプルフィードを構成する
流過室（８）中で注目の成分がすでに等電点にあるよう
に出発条件が整えられることである。従って、注目の成
分は電流によって泳動するように強制されない。両性緩
衝液に基礎を置く従来の等電点電気泳動（isoelctric f
ocusing）（IEF）系〔P.G.Righetti,Isoelectric Focus
ing:Theory,Methodology及びApplication,Elsevier、ア
ムステルダム、204〜207頁（1983）を参照のこと〕を用
いるのと異り、この発明の方法においては、その一層進
歩した変法、すなわち固定化pH−勾配（immobilized pH
−gradient）（IPG）技法〔P.G.Righetti,J.Chromatog
r.300,165−223（1984）が用いられる。

従来の等電点電気泳動（IEF）系は次の理由により、本
発明の方法のためには適当でないであろう。ａ）IEFは
時間に対して安定でなく、実際にpH勾配が崩壊し、そし
て漸進的な酸性（陽極ドリフト）を受け〔P.G.Righetti
及びJ.W.Drysdale,Amm.N.Y.Acad.Sci.209,163−186（19
73）を参照のこと〕、その結果注目の蛋白質が液相に維
持されず、最終的にはゲルマトリクス中に移行するであ
ろう。ｂ）従来のIEF系においてはpH勾配がおよその態
様でのみ生ずるので、等電点を有する注目の化合物を常
時ちょうどその等電状態に維持しそしてそれが液相〔液
流（７），（８）及び（11）〕から離れるのを防止する
ために必要な正確さをもって、流過室（８）に対面する
２つのゲル先端に境界条件を設定することが不可能であ
ろう。これに対して、固定化されたpH−勾配体（IPG）
及びpH−膜を使用すれば、ほとんどの場合に境界条件を
設定することが可能であり、その結果、サンプル流に対
面する陽極ゲル先端が注目の成分の等電点（pI）よりわ
ずかに低いpHを有し、他方対応する陰極ゲル先端は目的
化合物のpIよりわずかに高いpH値に設定される。言うま
でもなく、目的物質が非常に高いか又は低いpIを有する
比較的まれなケースにおいては適当なIPGは製造の困難
であろう。従って、等電点を有する前記化合物は、２つ
の固定化されたpH−勾配体又はpH−膜により限定される
この狭いpHギャップ内において等電的であろう。注目の
化合物が両性質である場合、このギャップは通常0.05〜
0.2pH−単位を占め、しかし0.001pH単位未満のギャップ
も達成し得る。さらに、ギャップが0pH−単位であるこ
と、すなわち前記ゲル先端のpH−値が注目の化合物の等
電点に相当することが可能である。このことは、pH−ギ
ャップが全く存在せず、２つのゲル相間の流体ギャップ
のみが存在することを意味する。注目の化合物が中性で
あれば、ゲル先端におけるpH値は目的化合物に関して選
択されるのではなく、不所望の両性の又は荷電した化合
物が前記pH−ギャップ内に等電点を有しないという意味
において該不所望の化合物との関連において選択され
る。中性化合物は、流過室（８）に対面するゲル先端に
おける境界条件には関係なく、pH−勾配体に決して入ら
ないであろう。境界条件の設定におけるこの正確さに加
えて、時間に対するIPGの無限定の安定性のため、pH勾
配が決してドリフトせず、このため精製される化合物の
等電状態が常に液流中、特に流過室（８）中に見出さ
れ、しかし他の場所、例えば陽極ゲル相（12）及び陰極
ゲル相（５）中には見出されないことが自動的に保証さ
れる。

本発明の方法は少なくとも下記の大きな利点を有する。
ａ）サンプルの回収率が非常に高く、100％に近ずく；
これは、精製されるべき化合物（例えば蛋白質）が決し
てゲル相に入らず、全精製工程を通じて液相中に非荷電
状態で、例えば等電状態で維持されるからである。ｂ）
サンプルの負荷量が大である；これは、精製されるべき
化合物、例えば蛋白質供給原料が別個の溜（11）と流過
室（８）との間を循環し、そしてある時点において電界
中に存在する必要がある量はわずかに過ぎないからであ
る。ｃ）目的化合物、例えば蛋白質の等電点をまたぐい
かに狭いpH間隔を選択するかに依存して高い分離能を有
する。ｄ）注目の化合物（例えばペプチド又は蛋白質に
随伴するあらゆる塩又は緩衝剤が自動的に除去される；
このことは、本発明の方法が電気透析（脱塩工程）のた
めにも使用され得ることを意味する。特に、強酸又は塩
基の一価イオン、例えばNa⁺及びCl^-の除去が非常に容易
である。弱酸又は塩基の一価イオン、例えばアンモニウ
ムイオン及び酢酸イオンの除去のためには、後記の両性
等電性Immobiline膜又は比較的短いpH−勾配体、すなわ
ち対応する弱酸及び塩基のpH値から実質的に隔たった比
較的小さいpH範囲、例えば0.5〜1.0pH−単位から成る勾
配体を用いるのが有利である。多価イオン、例えば硫酸
イオン、リン酸イオン、及びクエン酸イオンの除去は、
おそらくこれらのイオン種とImmobilineマトリクスとの
相互作用のために一層長時間を必要とし、そして例えば
pH−スタットを用いての外的pH調節の下で最良に行われ
る。これは、そうしなければ一価の反対イオンのより急
速な除去のために室（８）中の溶液が酸性又はアルカリ
性になり得るからである。種々の用途、例えば酵素反応
又はリガンド結合研究、のための蛋白質サンプルの迅速
な脱塩は、生化学において今日直面している問題点の１
つである。

サンプル供給原料中のあらゆる塩含量が（1mMの濃度に
おいてすでに）非等電生蛋白質の輸送を阻害する。これ
はおそらく、非常に多きな電流部分が蛋白質によってで
はなくイオン自体によって選ばれるためである。さら
に、サンプル溜中の高い塩レベルは、それぞれアルカリ
性及び酸性である陰極性イオン境界及び陽極性イオン境
界を形成し、これが蛋白質の移動を妨害し、そして変性
の誘発さえするであろう。区画された（segmented）
（従来法においても同様に）IPGゲルにおいて、サンプ
ルゾーン中に存在する実際上あらゆるレベルの塩がその
電気泳動的輸送を妨害する。従って、等電性成分から蛋
白質不純物を効果的に除去するための最良の方法はすで
に脱塩された蛋白質フィードを区画されたIPG装置に供
給することである。しかしながら、蛋白質不純物の除去
は、サンプル中の塩の存在下でも、非常に低速において
ではあるが達成され得る。後者の場合、塩レベルは蛋白
質の溶解性に適合する低下レベル（例えば5mM以下）に
維持されるべきであり、そして、塩成分によって形成さ
れる境界の発生により行われるサンプルフィード中の劇
的なpH変化を防止するために外的pH調節が行われるべき
である。非常に多数の事例においては、等電点における
又はその近傍における低すぎるイオン強度に基く蛋白質
の凝集又は沈澱を防止するために、電気泳動の間サンプ
ル中に最少の塩濃度が必要であろう。この目的のため、
外部液流を用いて、電気的物質輸送及び拡散による物質
輸送の組合わせによる塩の喪失を補充する〔Rilbesの定
常状態流動電気泳動（steadystate rheoelectrolysi
s）,H.Rilbe,J.Chromatography,159,193−205（1978）
の概念に類似する〕。

前記の方法は、この発明の対象に属する下記の電気泳動
装置のいずれかにより実施することができる。

該電気泳動装置のすべてが基本的に、２個の容器（５）
及び（12）に連結された流過室（８）を有し、これらの
容器の各々は相互に独立に固定化されたpH−勾配体によ
り満たされ、又はこれは固定化されたpH−膜により置き
換えられ、この勾配体又は膜の一方は流過室（８）に連
結されるその先端において、精製されるべき化合物の等
電点よりわずかに低いか又はそれと同一の等電点を有
し、そしてその他端において陽極室14に連結されてお
り、残りのpH−勾配体又はpH−膜は流過室（８）に連結
されるその先端において、精製されるべき前記化合物の
等電点よりわずかに高いか又はこれと同一の等電点を有
し、そしてその他端において陰極室（３）に連結されて
いる。

この新規な電気泳動装置の幾つかの可能な態様の１つの
略図を第１図に示す。流過室（８）はサンプル溜（11）
に連結され、このサンプル溜は、原理的には、任意の処
理容量を有することができ、供給原料はポンプ（９）を
介して電界中を循環する。一般に、ポンプ（９）は最高
スピードで、例えば5ml/分で運転される。液流（７）に
対して直角に、好ましくは白金で作られた２枚のプレー
ト（２）及び（13）間に電界がかけられ、これは流過室
（８）からすべてのイオン又は非−等電性両性種を除去
するために役立つ。流過室（８）は、例えば上方Ｏ−リ
ングシール（６）及び下方Ｏ−リングシール（10）を介
して、冷媒流（18）用のジャケット（19）を有する短い
ガラス管中に保持されたポリアクリルアミドゲルシリン
ダー（５）及び（12）に連結される〔（18）及び（19）
は第１図中には示されていないが、第２図中には示され
ている〕。上方管は、例えば水密性Ｏ−リングシール
（４）を介して、陽極室（３）に連結され、この陽極室
（３）は一般に常用の等電点電気泳動（IEF）において
そうであるように稀い塩基（例えば、50mM NaOH又はエ
タノールアミン、エチレンジアミン、等イオン性（isoi
onic）リジン又はアルギニン）を収容する。下方管（1
2）はその先端を陰極室（14）に直接浸漬し、この陰極
室（14）は一般に、標準的IEFにおいて日常的に使用さ
れるのとちょうど同様に、稀い（強又は弱）酸、例えば
酢酸、リン酸もしくは硫酸、又は等イオン性アスパラギ
ン酸もしくはグルタミン酸の溶液を収容する。言うまで
もなく、Ｏ−リングシールは、装置の種々の部分を連結
するための他の任意の適当な手段で置き換えることがで
きる。

本発明の分画技法の新規な特徴は、流過室（８）が固定
化されたpH−勾配体又はpH−膜を代表する下方ポリアク
リルアミドゲルの先端及び上方ポリアクリルアミドゲル
の先端と境界を接していることである。該pH−勾配体は
シリンダー（12）及び（５）に収容されており、これら
のシリンダーは好ましくはガラス、又は付着力によって
ゲルがそれに付着することができる他の適当な材料から
作られたものである。これら２個のゲル片の流過室
（８）に境界を接する先端が、精製されるべき目的化合
物の等電点よりわずかに低い（陽極側において）か又は
それと同一のあるいはそれよりわずかに高い（陰極側に
おいて）か又はそれと同一の等電点（pI）を有するよう
に整えることにより、この化合物は実際にそのpIに調整
（titrate）され、そしてそれ自体としては液流
（８），（７）及び（11）から離れることができないで
あろう。これに対して、精製されるべき化合物に随伴す
る異るpIを有するすべての不純物、例えば蛋白質性不純
物は自動的に〔流過室（８）中で優勢なpH値において〕
それらのそれぞれのpIよりも高く又は低く、そしてそれ
故に室（８）を離れそして固定化されたポリアクリルア
ミドゲルの下方又は上方セグメント（12）又は（５）中
に集中するか、あるいは陽極室（14）又は陰極室（３）
に集まるように強制されるであろう。電圧勾配のもとで
十分な循環時間が与えられれば、すべての不純物は流過
室（８）から離れ、そして純粋な化合物、例えば等電性
蛋白質が、最初に供給原料を収容していたサンプル溜
（11）及び流過室（８）から回収される。注目の化合
物、例えば蛋白質は常時液相に留まりそしてゲルに入ら
ないため、これ以上の操作又はサンプルの抽出は必要な
い。

陽極室及び陰極室（14）及び（３）、ゲルシリンダー
（12）及び（５）、シール（10），（６）及び（４）、
並びに流過室（８）を有し、垂直に又は好ましくは水平
に組み立てられた装置が電源（１）に接続される。平衡
時において、典型的な値は1000V、3mA及び3Wであり、発
生する熱を適切な冷却によって除去することができれば
他の任意の値が分離のために適当である。サンプル流過
室（８）にはその一定濃度を維持するための手段が設け
られ、そして／又は供給原料がサーモスタット接続され
た大きな、ジャケット付き溜（11）に保持される。サン
プル容器（11）を連続的な穏和な撹拌下におくことが好
ましく、そうしなければ時間と共に重い層が軽い層から
分離するかもしれない。循環のために任意のポンプ装置
（９）、例えばペリスタルポンプが使用され、このポン
プは、一般に最大速度（例えば、5ml/分）で運転され、
これによってサンプルは可能な限り短時間流過室（８）
に留まり、従って熱分解の危険が回避される。これは運
転のための最も簡単な装置の一つである。原理的には、
任意の他の検出又は計量装置、例えばバイオセンサー検
出系、免疫電気泳動装置、レーザー励起蛍光検出装置、
任意の所望のロボット系、pHの測定及び調整のための装
置、例えば流れ電極（flowelectrode）、ラジオアイソ
トープモニター用装置、及び／又は等電性モニター用装
置、例えばフロー−セル（flow−cell）を、必要により
この装置に設けることができる。言うまでもなく、特別
な目的のために、サンプル流（７）をUV観察、可視観察
又は蛍光観察により、混合物中のある成分の除去率を追
跡するためのクロマトグラフカラムに連結された標準的
装置を用いてモニターすることができる。

第２図は第１図に示したのとおよそ同じ装置の分解略図
を示し、第１図中に示された電源（１）、撹拌機（16）
及びサーモスタット（17）はこの図には示されていない
が、しかし第１図に加えて、シリンダー（５）及び（1
2）の周りの冷媒流（18）のためのジャケット19が示さ
れており、さらに種々の構成部品（３），（５），
（６），（８），（10），（12）、及び（14）がまだ組
立てられていないが組立のために正しい位置に示されて
いる。冷媒流（18）は、第２図中に示されていないサー
モスタット、例えば（17）に接続される。第２図には示
されていないが（但し、第１図には示されている）、サ
ンプル溜め（11）も一定温度、例えば２℃に維持される
べきである。等電点は温度に依存するからである。所望
により、流過室（８）にも冷媒流用ジャケットを設ける
ことができる。第２図は、第１図に加えてさらに、流過
室（８）の好ましい形態を示す。液流（７）の入口及び
出口は曲げられており、一方はシリンダー（12）に向
き、そして他方はシリンダー（５）に向いている。容器
（12）は、２個のスクリュー連結を有するように示され
ているが、電極室（14）の電解質溶液中に直接没入され
てもよい。

第３図は、異る等電点を有する２種類の両性化合物、例
えば２種類の蛋白質を同じ装置中で同時に精製するため
に適当な装置を、その部品を組立てた後の状態で示した
ものである。サンプル溜（11a）及び（11b）は最初の供
給原料を収容し、この原料は同一でもよく又は異ってい
てもよい。サンプル溜（11a）はある種のチューブ7aを
介して２個の流過室の内の１つ（8a）に連結される。サ
ンプル溜（11b）は他のチューブ7bを介して第二の流過
室（8b）に連結される。流過室（8a）及び（8b）は固定
化されたpH−勾配体を収容する中間シリンダー20により
相互に分離されている。流過室（8b）に向けられた前記
中間pH−勾配体の先端は、流過室（8b）中の目的化合物
の等電点よりわずかに高い、例えば＋0.05pH−単位高い
pH値を有するか、又は該目的化合物と同じpH値を有す
る。流過室（8a）に向けられた前記中間pH−勾配体の向
端は流過室（8a）中の目的化合物の等電点よりわずかに
低い、例えば−0.05pH−単位低いpH値を有するか、又は
該目的化合物と同じpH値を有する。IEP過程の終点にお
いて、目的の精製された種、例えば蛋白質は室（8a）／
（11a）、及び（8b）／（11b）に集められ、そしてすべ
ての荷電した汚染物は除去されている。

分析目的のために第１図の装置を使用することができ、
しかしながらこの場合、流過室（８）がサンプル溜（1
1）に連結されない限り流過室（８）に密閉される。こ
の場合、装置を水平に配置し、同じ冷媒に浸漬しそして
その軸のまわりに回転せしめることができる。装置全体
を回転せしめる代りに、流過液中のサンプルを、例えば
磁石棒により撹拌することができる。

液流のための入口及び出口が垂直位置にあり出口が入口
の上に位置するような、水平に配置された等電点電気泳
動装置を使用することは、密閉流過室を用いる前記の特
別な場合のみならず、液流のための入口及び出口を有す
る“開放”流過室を用いる通常の場合においても有利で
ある。垂直配置においては、流過室の上部に気泡が蓄積
する傾向がある。これは不純物の不均一な輸送及び電流
の障害をもたらす。気泡を除去するためには、装置を分
解しそして水平に置いて出口流を通して泡を完全に除去
しなければならない。さらに、下方の電解質溜（一般に
陽極）に浸漬された下方のIPG片が膨潤する傾向があ
る。これにより、ゲルが支持管から押し出され、そして
最後にはガラス壁から離れそしてその所定位置から脱落
することが余儀なくされる。これらの問題点は例えば第
８図に示すような水平装置により除去される。この装置
は、Immobilineゲル相をその場でプロックするために、
IPG片のすべての先端にフィルター21を有する。フィル
ター21は、外管中の環状レッジ上にＯ−リングを置くこ
とによりその場で伸ばされる。

第１図〜第３図においては、固定化されたゲル容器
（５）及び（12）は相互に逆向に配置される。しかしな
がら、第４図に示すようにこれらを相互に平行に配置す
ることもできる。この様な配置は特に大規模な精製のた
めに適当である。２個、例えば（５）及び（12）、より
多くの容器、例えば（４），（６）等、を流過室（８）
に浸漬することができるからである。

ほとんどの目的のために、この発明の方法及び装置は、
pH−勾配体の少なくとも１つを両性等電性の固定化され
たpH−膜で置き換えることにより改良することができ
る。これらの膜は非常に狭いpH間隔のみをカバーする非
常に短いpH−勾配体と見なすことができる。理想的に
は、このpH間隔は0pH−単位である。さらに、流過室
（８）に接するpH−勾配体又はpH−膜の先端におけるpH
値間の差異を０に減少することができる。すなわち、流
過室が、目的化合物の等電点に等しい同一のpH値を有す
る２枝の膜に境界を接するようにすることができる。こ
のことは驚くべきことであり、そして相互に異る膜では
なく２枚の同一の膜を調製することができる方法を促進
する。pH−勾配体ではなくpH−膜を使用することは、よ
り安価であるという追加の利点を有する。さらに、発生
する熱を一層容易に除去することができる。従って、pH
−膜（25）及び（26）は、大規模な精製が行われなけれ
ばならない場合ほとんどの事例において好ましい。

この発明はまた、この明細書に記載する等電点電気泳動
法において使用するのに適当な装置に関し、この装置
は、流過室（８）を有し、該室が、 ａ）固定化されたpH−勾配体（５）及び（12）を収容す
るのにそれぞれが適当な２個の容器と、又は ｂ）固定化されたpH−膜（25）及び（26）を収容するの
に適当な２個の装置と、又は ｃ）上記ａ）の１個の容器及び上記ｂ）の１個の装置と
直接的又は間接的に連結されており、前記容器又は装置
の一方がその他端において陽極室（14）に連結されてお
り、そして残りの容器又は装置がその他端において陰極
室（３）に連結されている。

次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。

略 号 A:アンペア C:（ゲル組成を記載する場合）全モノマーＴ（下記参照
のこと）に対する％（重量）；式CH₂＝CH−CO−NH−CH₂
−CO−CH＝CH₂を有する架橋剤N,N′−メチレン−ビス−
アクリルアミドに基く IPG:固定化されたpH−勾配体 pI:等電点 T:アクリルアミド及びN,N′−メチレン−ビス−アクリ
ルアミドの合計濃度〔g/100ml、すなわち重量／容量
％〕 TEMED:N,N,N′,N′−テトラメチルエチレンジアミン V:ボルト W:ワット 例1. 蛋白質混合物の精製 実験装置は第１図及び第２図に示すものである。合計容
量26mlを有する下方IPGセグメント（12）はpH3.5−7.2
範囲（７％T,4℃ C）−マトリクス及び１％のおよそ同
じpH間隔の担体両性電解質を含有し、そして次の様にし
て、適当な勾配ミキサーにより、酸性の重い溶液及び塩
基性の軟い溶液から調製する。

酸性の重い溶液を、685μのpK3.6、223μのpK4.6、
226μのpK6.2、118μのpK7.0及び154μのpK8.5の
各Immobiline（0.1Mストック溶液より）、0.6mlのAmpho
line pH3.5−7.0、3.1mlのストック（30％T,4％Ｃ）−
アクリルアミド並びに3.6mlのグリセロールの混合物か
ら、水を添加して13mlにすることにより調製する。

塩基性の軽い溶液を、124μのpK3.6、511μのpK4.
6、347μのpK6.2、139μのpK7.0、310μのpK8.5
及び238μのpK9.3のImmobiline、0.6mlのAmpholine p
H3.5−7.0及び3.1mlのストック（30％T,4％Ｃ）−アク
リルアミドの混合物から、水を加えて13mlにすることに
より調製する。

適当な二室勾配ミキサーに移した後、上記の溶液のそれ
ぞれに10μのTEMED及び13μの40％過硫酸アンモニ
ウムを添加する。勾配ミキサーの出口を室（12）に連結
し、この低端をあらかじめ例えばパラフィンにより閉じ
ておく。これを重合が終了するまで続ける。重合を50℃
にて約１時間（又は37℃にて２時間）行う。

上方IPGセグメント（５）（合計容量26ml）は、pH7.4−
10.0の範囲の（７％T,4％Ｃ）−マトリクス及び同じpH
範囲の１％担体両性電解質を含有し、次の様にして下記
の溶液ａ）及びｂ）から調製する。

ａ）酸性の重い溶液（pH7.4）を、506μのpK3.6、387
μのpK7.0、361μのpK8.5及び46μのpK9.3の各Im
mobiline（0.2Mストック溶液から）、0.6mlのAmpholine
pH7−10、3.1mlのストック（30％T,4％Ｃ）−アクリル
アミド並びに3.6mlのグリセロールの混合物から、水を
加えて13mlにすることにより調製する。

ｂ）塩基性の軟い溶液（pH10）を、93μのpK3.6、335
μのpK8.2及び289μのpK9.3の各Immobiline、0.6ml
のAmpholine pH7−10（すべてのAmpholineは40％スト
ック溶液より）並びに3.1mlのストック（30％T,4％Ｃ）
−アクリルアミドの混合物から、水を加えて13mlにする
ことにより調製する。

勾配ミキサーに移した後、溶液ａ）及びｂ）のそれぞれ
に、上記の様にして触媒（TEMED及び過硫酸アンモニウ
ムをこの順序で）加える。前記勾配ミキサーの出口を室
（５）に連結し、この室の下端はあらかじめ閉じてお
く。重合が完了した後、室（５）及び（12）をあらかじ
め閉じていた手段を除去し、そしてこうして調製された
IPG−ゲルを収容する該室を第１図の電気泳動装置に組
み込む。サンプルを適用する前に、すべての非−両性イ
オン（グラフトされなかったImmobiline、触媒、緩衝剤
等）を、5W/1000Vにて前−泳動することによりゲルから
除去する。そして、流過室（８）を、ヒト成人ヘモグロ
ビンのpI（7.30）（IPGゲル中10℃にてヒト成人ヘモグ
ロビンＡ〔HbA〕に典型的なpI〕を中心とする狭いpH範
囲（pH7.2−7.4）に限定する。25mlの0.5％担体両性電
解質（pH6〜８）中に溶解したヒト成人ヘモグロビンＣ
〔HbC〕からのヘテロ接合体からの合計70mgの細胞溶解
物（約60％のHbA及び約40％のHbCを含有する）を、1000
Vの一定電圧のもとで、前−泳動された装置中を循環せ
しめる。30分間ごとに30μのサンプルを採取し、そし
てその後の分析のために４℃に保持する。23時間後の最
終サンプリングと共に実験を停止する。アリコートをpH
6.5−8.5の範囲で（５％T,4％Ｃ）−IPGゲル中で分析す
る。レーザーデンシトメーター（LKB製）によるHbA及び
HbCピークのデンシトメーター走査により得られた結果
を第５図に示す。この図はＸ−軸にそって時間（時）
を、そしてＹ−軸にそってHbA及びHbCの量を示す。曲線
Ｉ（三角形）はHbAに関し、そして曲線II（円）はHbCに
関する。HbAは実験期間中一定に留まるが、HbAは23時間
まで徐々に除去され、もはや検出できなくなる。循環の
12時間後、HbAは95％以上の純度であり、他方23時間後
それは99.5％より高純度である。

例2. 蛋白質からの色素の除去 電気透析ユニットとしての第１図に示した装置の性能を
評価するため、蛋白質混合物からの着色色素（塩の形
態）の除去の動態を評価する。陽極アーム（12）におい
てIPG（pH3.5−7.2）ゲルを、そして陰極アーム（５）
においてIPG（pH7.4−10）ゲルを重合せしめる。こうし
て供給原料を7.2〜7.4のpHに維持する。供給原料は、10
mgの酸性色素（ブロムフェノールブルー）及び10mgの塩
基性色素（トルイジンブルー）が添加された0.5％Ampho
line（pH6−８）中40mgの精製ヒト成人ヘモグロビンＡ
の溶液（全容量25ml）から成る。1000Vの一定電圧での
これらの色素の除去を、サンプル溜から所定の時間間隔
で30μのサンプルを採取しそして残留量を600nmでの
分光光度計の読みにより評価することにより追跡する。
結果を第６図に示す。この図ではＸ−軸にそって時間
（時）を示し、そしてＹ−軸にそって２種類の色素の量
を示す。曲線Ｉ（三角）はトルイジンブルーの陰極への
泳動を示し、そして曲線IIはブロムフェノールブルーの
陽極への泳動を示す。第６図に示されるように、実質的
にすべての色素が流過質から除去され、脱塩されたヘモ
グロビンサンプルが後に残る。濃度の対数：時間のプロ
ットが直線となり、除去の速度は一次反応速度に従う様
である。トルイジンブルーの曲線Ｉの形はブロムフェノ
ールブルーのそれよりも急であるが、しかし、上方ゲル
中を３個の青色ゾーンが泳動するのが見られ、この色素
はこれら３成分の一群から成っている様である事実が測
定を複雑化している。

例3. 蛋白質の脱塩 ヒト成分ヘモグロビンＡ（HbA）の溶液30mlを50mM NaCl
とし、そして第１図に示す装置中を10W一定のもとで２
℃にて循環せしめる。循環室をpH7.2の上面及びpH7.4の
上面で囲む。循環速度は10ml/分である。所定の間隔で2
mlのアリコートを取り、25℃に温度調節し、そしてオリ
オン（Orion）導電セルを装着した分析調節導電計101に
よりモニターする。導電度の測定値をNaClの残留ミリモ
ルに換算する。脱塩は２時間で実質的に完了する。HbA
の脱塩の速度動態を第７図に示す。この図において、Ｘ
−軸にそって時間（時）を示し、そしてＹ−軸にそって
塩化ナトリウムの量（ミリモル）を示す。

例4. Ｎ−アセチル−エグリンＣの精製 ａ）Ｎ−アセチル−エグリンＣの等電点（pI＝5.5）
を、Ampholine PAG−プレート;pH3.7−9.5;5％T,3％C;A
mpholine濃度2.2％上で決定する。

約350μｇの全蛋白質を各ポケット（20μまでの容
量）に入れ、そして次に平衡において10W限界、10mA、
及び1000Vにて泳動を行う。分析試行は一般に２時間以
内に終了し、そして次にゲルを固定し、そしてクマッシ
ーブルーより染色する。

固定溶液は、15％のトリクロロ酢酸を二重蒸留水に溶解
し、そして二重蒸留水を加えて全容量を100mlにするこ
とにより調製する。

染色溶液は、0.46gのクマッシーブルーR250を400mlの下
記の脱染液に溶解することにより調製する。得られた溶
液を60℃に溶解し、そして使用前に濾過する。上記の脱
染溶液は、二重蒸留水を500mlのエタノールに加えて合
計1000mlとし（溶液Ｉ）、二重蒸留水を80mlの酢酸に加
えて合計1000mlとし（溶液II）、そして溶液Ｉ及びIIを
使用前に1:1で混合することにより調製する。

ｂ）２種類の両性等電性Immobiline膜（pH5.5）を調製
するため、10.512mlの0.2M Immobiline pK4.6溶液及び
9.664mlの0.2M Immobiline pK9.5溶液を混合し、そして
二重蒸留水で稀釈して全容量を30.0mlとする。こうして
得られた溶液のpH値はpHメーターにより5.5であると決
定される。この溶液に、40.0mlの溶液Ａ（下記参照のこ
と）、1.5mlのAmpholine pH5−８、96μのTEMED、120
μの溶液Ｂ（下記参照のこと）、及び全容量120.0ml
にするだけの二重蒸留水を加える。上記の溶液Ａは、2
8.8gのアクリルアミド及び1.2gのN,N′−メチレン−ビ
ス−アクリルアミドを二重蒸留水に溶解し、そして水を
全容量100mlまで加えることにより調製する。前記溶液
Ｂは、400mgの過硫酸アンモニウムを880μの二重蒸留
水に溶解することにより調製される。

60mlの得られた溶液を、下記の２つの装置（ｃを参照の
こと）に満たし、そして50℃にて１時間重合せしめる。

ｃ）膜の調製のために使用される上記の装置は不活性材
料、例えばポリテトラフルオロエチレン（テフロン）か
ら作られたプレートを有し、このプレートは重合物に付
着しないか、又は無視できる程度にしか付着しない。こ
のプレート上に孔を有する円形のディスク（22）を置
く。このディスクは、9cmの直径及び1mmの高さを有する
リング状ガスケット（23）により前記プレートから隔離
される。第９図はこのディスクを下から見た図であり、
第10図は上から見た図であり、そして第11図は第９図に
示される線XI−XIにそう断面図である。重合すべき溶液
を穴を有するディスクの孔（24）を通して満たす。

ｄ）次に、穴を有する担体プレート（22）と一緒になっ
た上記の方法に従って得られた膜を、約9.5cmの内直径
及び約3cmの膜間高さを有するシリンダーに組み込む。
このシリンダーは、液流（７）のための相互に対向する
入口（31）及び出口（30）を有し、そして流過室（８）
として使用される。所望により、酢酸セルロース又は6,
6−ポリアミド（ナイロン）から作られたミリポアフィ
ルター（８μｍ）あるいはこれに類似するもの、例えば
ポリプロピレンフィルターをpH−膜（25）及び（26）と
液流（７）との間に置いて、精製されるべき物質（例え
ば、ｎ−アセチル−エグリンＣ）が等電膜と直接接触す
るのを防止する。前記の流過室（８）並びに固定化され
たpH−勾配体（５）及び（12）の代りに膜が組み込まれ
た上記のシリンダーを使用して完全な電気泳動装置を組
み立てる。好ましくは、このシリンダーは、液流（７）
のための入口及び出口が垂直位置となり出口が入口の上
に位置するように、水平配置で使用される。垂直配置と
比較した場合のこの水平配置の利点は、気泡が自然に除
去されることである。

第12図は組立てられた装置の断面図を示す。円管状管
が、支持されたpH−膜（22）により陰極室（３）、流過
室（８）及び陽極室（14）に分断される。陰極（２）及
び陽極（13）がプラグ（32）を介して電源１（示されて
いない）に接続される。液流（７）は入口（31）を通っ
て流過室（８）に入り、そして出口（30）を通ってそこ
から出る。陰極室及び陽極室中の電解質溶液は入口及び
出口（27）及び（28）を通して更新される。この装置の
種々の部品が穴（33）に挿入される４本の通し棒（29）
により一つに保持される。

ｅ）精製されるべきＮ−アセチル−エグリンＣのサンプ
ルを含まない液を流過室に満たし、500V,25mA及び10Wに
て１時間、組立てられた電気泳動装置を用いて前−泳動
する。次に流過室を空にし、そして精製されるべきサン
プルを充たす。

ｆ）組換DNA−Ｎ−アセチルエグリンＣ（純度80％、ヨ
ーロッパ特許出願No.146,785に従って調製）を含有する
サンプル1gを100mlの0.2％担体両性電解質（pH5−８）
に溶解し、そして500Vの一定電圧、及び10mA/5Wで冷室
（＋５℃）中で、前泳動された装置中を循環せしめる。
30分ごとに100μのサンプルを採取し、そして後で分
析するまで４℃で保持する。５時間後の最終サンプル採
取をもって実験を停止する。アリコートを、Ampholine
PAG−プレート;pH3−5;5％T,3％C;Ampholine濃度2.2％
にて分析する。３時間の循環の後すべての不純物が除去
されることがわかる。

所望により、陰極室（３）及び陽極室（14）中の溶液を
例えば5ml/分の速度で排液系にポンプ輸送し、そして大
きな溜から再生することができる。

例5. 異る緩衝能力を有する膜 例４に記載したpI＝5.50の膜と同様の膜を、10mM,40mM
又は100mMの濃度のImmobilineを導入することにより調
製する。

10mM及び40mM“膜”は正しい電気浸透性（electroosmot
ic properties）を示し、そして正確な実験的pI値をも
たらすが、100mM表面に非常に大きな分散を示し、そし
てpIの近傍のpHにおいて変則的な流れプロフィールを示
す。従って、“膜”中の約50mMの各Immobilineのモル濃
度上限を設けることが合理的なようである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の電気泳動法を実施するために使用
することができる装置の全体的略図である。 第２図は、第１図に示した装置の部品の分解図である。 第３図は、この発明の装置の他の態様の分解図である。 第４図は、この発明の方法を実施するために使用するこ
とができる装置の他の態様の最も本質的な部分の略図で
ある。 第５図〜第７図は、この発明の方法による電気泳動分離
の成功を示すグラフである。 第８図は、この発明の装置の第三の態様の断面図であ
る。 第９図は、第12図に示す装置の部品である穴を有するデ
ィスクの下から見た図である。 第10図は、前記ディスクの上から見た図である。 第11図は、第９図の線XI−XIにおける断面図である。 第12図は、この発明の装置の第四の態様の断面図であ
る。 図中、１は電源 ２は陰極 ３は陰極室 4,6、及び10はＯ−リング ５及び12はpH−勾配体 ８は流過室 13は陽極 14は陽極室、を示す。

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】等電点電気泳動用溶媒に可溶性の荷電した
   １又は複数の化合物から該溶媒に可溶性の両性又は中性
   化合物を分離又は精製するための等電点電気泳動法であ
   って、この方法は電気泳動装置を用いて行われ、この装
   置中には電気泳動マトリクスを通過する電流及び流過室
   （８）を通過する液流が存在し、該電流の方向が該液流
   のそれと異り、該液流は前記溶媒中前記化合物の溶液を
   含んで成りそして前記マトリクスを２個の部分に分けて
   おり、１つの部分（５）又は（25）は陰極側に位置しそ
   して他方（12）又は（26）は陽極側に位置し、液流
   （７），（８）及び（11）内で前記両性又は中性化合物
   は等電状態又は非荷電状態に維持され、そして前記の荷
   電した化合物が電流により前記液流から前記マトリクス
   の前記２つの部分の少なくとも一方中に除去され、又は
   前記部分の少なくとも一方を介して電解質溶液溜（３）
   及び（14）の少なくとも一方中に除去されることを特徴
   とする方法。
2. 【請求項２】前記２つのマトリクス部分は、相互に独立
   に固定化されたpH−勾配体（５）及び（12）を表わし、
   それぞれがそのpH範囲において導電性並びに緩衝能力及
   びタイトラント（titrant）能力の両方を有し、あるい
   はそれぞれがその特定のpH−値において導電性並びに緩
   衝能力及びタイトラント能力の両方を有する両性等電性
   の固定化されたpH−膜を表わす、ことを特徴とする請求
   項１に記載の等電点電気泳動法。
3. 【請求項３】前記液流内で等電点に維持される目的の両
   性化合物の等電点とは分離・精製のために十分なだけ異
   る等電点を有する１又は複数の両性化合物から該目的と
   する両性化合物を分離又は精製するための、請求項２に
   記載の方法。
4. 【請求項４】１又は複数の塩から両性化合物を分離又は
   精製するための請求項１〜３のいずれか１項に記載の方
   法。
5. 【請求項５】前記の塩が１価の酸及び塩基の塩である請
   求項４に記載の方法。
6. 【請求項６】前記の塩が、二価又は多価の酸及び塩基の
   塩、あるいは二価又は多価の酸又は塩基の塩である、請
   求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】精製されるべき前記化合物がペプチド、蛋
   白質、又はペプチドもしくは蛋白質成分を含有する化合
   物であって、そのそれぞれがpH3と10の間の等電点を有
   するものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の
   方法。
8. 【請求項８】精製されるべき前記化合物がペプチド、蛋
   白質、又はペプチドもしくは蛋白質成分を含有する化合
   物であってpH5と９の間の等電点を有するものである、
   請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】精製されるべき両性化合物の等電点と除去
   されるべき不所望の両性化合物の等電点とが少なくとも
   0.001pH−単位異る、請求項3,7又は８に記載の方法。
10. 【請求項１０】前記等電点が少なくとも0.05pH−単位異
    る、請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】液流の方向が電流の方向に対して直交し
    ている、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
12. 【請求項１２】液流（７）の方向が、液過室（８）から
    気泡が除去されるようなものである、請求項１〜10のい
    ずれか１項に記載の方法。
13. 【請求項１３】前記固定化されたpH−勾配体がそれらの
    pH−範囲において緩衝能力及びタイトライト能力の両方
    を有し、そして同じpH−範囲において十分な導電性を保
    証する量の両性電解質を含有する、請求項２〜12のいず
    れか１項に記載の方法。
14. 【請求項１４】前記固定化されたpH−勾配体及びpH−膜
    が制御された緩衝能力及びタイトラント能力、pH−値並
    びに導電性を有し、そして再現可能に調製され得るもの
    である、請求項２〜13のいずれか１項に記載の方法。
15. 【請求項１５】目的化合物が水溶液中に存在する、請求
    項１〜14のいずれか１項に記載の方法。
16. 【請求項１６】液過室（８）に隣接するpH−勾配体又は
    pH−膜の先端における等電点が陽極側において精製され
    るべき両性化合物の等電点と同一であるか又はそれより
    わずかに低く、そして陰極側において精製されるべき該
    両性化合物の等電点と同一であるか又はわずかに高い、
    請求項3,13または14に記載の方法。
17. 【請求項１７】液流内のpH−値が目的化合物の等電点に
    相当する、請求項３〜16のいずれか１項に記載の方法。
18. 【請求項１８】請求項３に記載の方法を実施するために
    適当な等電点電気泳動装置であって、液過室（８）を有
    し、該流過室は、 ａ）そのpH−範囲において導電性並びに緩衝能力及びタ
    イトラント能力の両方を有する固定化されたpH−勾配体
    （５）及び（12）によりそれぞれが満たされている２個
    の容器と、又は、 ｂ）特定のpH−値において導電性並びに緩衝能力及びタ
    イトラント能力の両方を有する２個の両性等電性の固定
    化されたpH−膜（25）及び（26）と、又は、 ｃ）上記ａ）の１個とpH−勾配体及び上記ｂ）の１個の
    pH−膜）と、直接的又は間接的に連結されており、前記
    流過室（８）に隣接するpH−勾配体又は膜の先端におけ
    る等電点が陽極側において、精製されるべき両性化合物
    の等電点と同一であるか又はそれよりわずかに低く、そ
    して陰極側において、精製されるべき該両性化合物の等
    電点と同一であるか又はわずかに高く、該pH−勾配体又
    はpH−膜の一方はその他端において陽極室（14）に連結
    されており、そして残りのpH−勾配体又はpH−膜はその
    他端において陰極室（３）に連結されている、前記装
    置。
19. 【請求項１９】請求項３に記載の方法を実施するために
    適当な等電点電気泳動装置であって、該装置は流過室
    （８）を有し、該流過室は、固定化されたpH−勾配体に
    よりそれぞれが満たされた２個の容器（５）及び（12）
    を有し、該勾配体の１つは流過室（８）に連結されたそ
    の先端において精製されるべき両性化合物の等電点より
    わずかに低い等電点を有し、そしてその他端は陽極室
    （14）に連結されており、残りのpH−勾配体は流過室
    （８）に連結されたその先端において精製されるべき該
    両性化合物の等電点よりわずかに高い等電点を有し、そ
    してその他端が陰極室（３）に連結されている、前記装
    置。
20. 【請求項２０】前記流過室（８）がポンプ（９）を介し
    てサンプル溜（11）に連結されている、請求項18又は19
    に記載の装置。
21. 【請求項２１】pH−勾配体及びサンプルを一定の温度に
    保持するための装置を有する、請求項18〜20のいずれか
    １項に記載の方法。
22. 【請求項２２】pHの測定及び調節のための装置、導電性
    をモニターするための装置バイオセンサー検出系、免疫
    電気泳動装置、レーザー励起蛍光検出装置、ロボット
    系、ラジオアイソトープモニター装置又はUV、可視又は
    蛍光観察によるサンプル溶液モニター装置、等の少なく
    とも１つを有する、請求項18〜21のいずれか１項に記載
    の装置。
23. 【請求項２３】容器（５）及び（12）中のpH−勾配ゲル
    の又はpH−膜中のゲルの機械的支持のための装置を有す
    る請求項18〜22のいずれか１項に記載の装置。
24. 【請求項２４】中間の固定化pH−勾配体（20）又は１も
    しくは２個のpH−膜により相互に分離された２個の別個
    の流過室（8a）及び（8b）を有する、２種類の両性又は
    中性化合物を同時に精製するために適当な請求項18〜23
    のいずれか１項に記載の装置。
25. 【請求項２５】請求項18〜24のいずれか１項に記載の装
    置であって、液流（７）により流過室（８）から気泡が
    除去されるように配置される前記装置。
26. 【請求項２６】固定化されたpH−勾配体及びpH−膜が制
    御された緩衝能力及びタイトラント能力、pH−値、並び
    に導電性を有し、そして再現可能に調製され得る、請求
    項18〜25のいずれか１項に記載の装置。
27. 【請求項２７】固定化されたpH−勾配体及びpH−膜が制
    御された緩衝能力及びタイトラント能力を有し、そして
    十分な導電性を保証する量の両性電解質を含有する、請
    求項18〜26のいずれか１項に記載の装置。
28. 【請求項２８】陰極室（３）及び陽極室（14）中の電解
    質溶液を更新するための入口及び出口（27）及び（28）
    を有する、請求項18〜27のいずれか１項に記載の装置。
29. 【請求項２９】請求項３に記載の方法において使用する
    ために適当な等電点電気泳動装置であって、流過室
    （８）を有し、該室が、 ａ）固定化されたpH−勾配体（５）又は（12）を収容す
    るのにそれぞれが適当な２個の容器と、又は ｂ）固定化されたpH−膜（25）及び（26）を収容するの
    に適当な２個の装置と、又は ｃ）上記ａ）の１個の容器及び上記ｂ）の１個の装置と
    直接的又は間接的に連結されており、前記容器又は装置
    の一方がその他端において陽極室（14）に連結されてお
    り、そして残りの容器又は装置がその他端において陰極
    室（３）に連結されている、前記装置。