DK174962B1 - Fremgangsmåde til isoelektrisk fokusering samt apparat til udøvelse af fremgangsmåden - Google Patents

Description

i DK 174962 B1

Opfindelsen angår en elektroforetisk fremgangsmåde af den i krav l's indledning angivne art. Sådanne fremgangsmåder kan anvendes til separering af kemiske forbindelser, 5 f.eks. peptider og proteiner, der har en elektrisk nettoladning på nul og er neutrale under de anvendte forsøgsbetingelser, fra andre amfotere eller ikke-amfotere kemiske forbindelser, f.eks. andre peptider, proteiner og/eller salte, som under de samme forsøgsbetingelser har 10 en elektrisk nettoladning.

Præparativ elektroforese er en kendt metode, og forskellige former af elektroforeseapparater er blevet foreslået, både til analytiske og præparative formål. I grundtrækkene kan instrumentationerne og principperne for 15 præparativ elektroforese Inddeles i fire hovedkategorier i overensstemmelse med det anvendte elektroforetiske princip (jf. A.T. Andrews, Electrophoresis: Theory, Techniques, and Biochemical and Clinical Applications, Clarendon Press, Oxford 1986): 20 a) skive-elektroforese b) elektroforese med "frit gardin" c) isotachoforese og d) isoelektrisk fokusering (jf· P.G. Righetti,

Isoelectric Focusing: Theory, Methodology and 25 Applications, Elsevier, Amsterdam, s. 204-207 (1983)).

I almindelighed udføres skive-elektroforese og isotachoforese i hydrofile matrixer, enten kontinuerligt Λ (agarose og polyacrylamid) eller diskontinuerligt (granulerede lejer, såsom "Sephadex"®). De kendetegnes ved 30 en høj opløsningsevne, men tåler kun små prøveportioner. Elektroforese med "frit gardin" er i almindelighed baseret på anvendelsen af kontinuerlige puffere og udføres i en fri væskefase, idet denne metode kendetegnes ved en kontinuerligt strømmende tynd pufferhinde og kontinuerlig 35 tilførsel af prøven. Stort set giver denne metode muligheder til håndtering af store prøveportioner, men udviser 2 DK 174962 B1 en lav opløsningsevne. Desuden er denne metode, på grund af proteinernes højere diffusionskoefficient, for det meste begrænset til rensning af intakte celler eller 5 subcellulære organeller.

Isoelektrisk fokusering kan udføres enten 1 bærevæsker (tætheds-gradienter) eller i gelmedier, enten kontinuerlige eller granulerede. Metoden med isoelektrisk fokusering blev faktisk først brugt til præparative formål 10 under anvendelse af lodrette glassøjler, der blev fyldt med en saccharose-tæthedsgradient. Middelstore prøveportioner kunne håndteres med en høj opløsningsevne (Δ pi = 0,02 pH-enhed; pi s isoelektrisk punkt), men denne gik imidlertid tabt, når søjlen blev tømt gennem samletragten 15 forneden. I dag er denne metode faktisk i alt væsentligt forladt til fordel for isoelektrisk fokusering i gelatinøse bæremedier (for det meste agarose- og polyacrylamid-matrixer). Sidstnævnte muliggør en høj opløsningsevne, men tillader kun middelstore protein-20 belastninger. Derudover er alle præparative metoder, der

er baseret på anvendelsen af hydrofile geler som I

antikonvektive medier, behæftet med problemet med at indvinde det rensede eller renfremstillede protein fra matrixen. Hertil kræves yderligere arbejdstrin, f.eks.

25 påvisning af den Interessante zone, båndudskæring og eluering ved diffusion eller elektroforetisk indvinding.

Dette medfører to væsentlige ulemper, nemlig: a) lave indvindingsprocenter, eftersom enhver matrix er tilbøjelig til at absorbere proteiner irreversibelt, og b) risikoen 30 for forurening fra gelmateriale (navnlig i tilfælde af syntetiske bærere, såsom polyacrylamid, forurening fra ikke-reagerede monomerer og fra korte, oligomere polyacrylamid-spoler, der er ikke-kovalent Indpodet i matrix-massen).

35 Det er opfindelsens formål at anvise en fremgangsmåde af den ovenfor angivne art til rensning eller renfremstil- 3 DK 174962 B1

Ung af kemiske forbindelser, der i lighed med peptider har et isoelektrisk punkt eller er uladet under de anvendte betingelser, ved elektroforese, således, i 5 modsætning til det ønskede produkt, at kun de uønskede biprodukter og forureninger kommer i berøring med matrixen, hvilken fremgangsmåde skal give høje udbytter af det ønskede produkt i en meget ren form, og dette formål opnås ved ifølge opfindelsen at gå frem som angivet i krav 10 l’s kendetegnende dell Opfindelsen angår også et apparat til udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og dette apparat er ejendommeligt ved den i krav 20 angivne udformning og indretning.

Opfindelsen skal i det følgende forklares nærmere under 15 henvisning til tegningen, på hvilken fig. 1 er et skematisk, perspektivisk oversigtsbillede af et apparat, der kan anvendes til at udføre den elektroforetiske fremgangsmåde ifølge opfindelsen, fig. 2 er en skematisk sprængskitse af dele af det i fig.

20 1 viste apparat samt enkelte yderligere dele, fig. 3 er en skematisk sprængskitse af en alternativ udførelsesform for et apparat ifølge opfindelsen, fig. 4 skematisk viser de vigtigste dele i en yderligere alternativ udførelsesform for et apparat, der kan anvendes .. 25 til at udøve fremgangsmåden ifølge opfindelsen, fig. 5, 6 og 7 er kurver, der viser resultaterne af elektroforetiske separationsprocesser ifølge opfindelsen, fig. 8 er et længdesnit gennem en tredje alternativ udførelsesform for et apparat Ifølge opfindelsen, 30 fig. 9 set nedefra viser en hulskive, der indgår i det i 4 DK 174962 B1 fig. 12 viste apparat, fig. 10 viser den i fig. 9 viste hulskive, set ovenfra, fig. 11 er et snit efter linien XI-XI i fig. 9, og 5 fig. 12 er et længdesnit gennem en fjerde alternativ udførelsesform for et apparat ifølge opfindelsen.

Opfindelsen angår således en elektroforetisk fremgangsmåde til isoelektrisk fokusering med henblik på separation og rensning af en amfoter eller neutral kemisk forbin-10 delse, der er opløselig i et til fremgangsmåden egnet opløsningsmiddel, fra en eller flere elektrisk ladede kemiske forbindelser, der er opløselige i det nævnte opløsningmiddel, hvilken fremgangsmåde udføres ved anvendelse af et elektroforetisk apparat, hvori den 15 elektriske strøm, der flyder · gennem den elektroforetiske matrix, er forbundet med en væskestrøm 7, 8 og 11, jf. tegningen, idet den nævnte elektriske strøms retning afviger fra den nævnte væskestrøms retning, hvilken væskestrøm omfatter en opløsning af den nævnte forbindelse > 20 i det nævnte opløsningsmiddel, idet den nævnte matrix opdeles i to dele, hvoraf den ene, 5 eller 25, er beliggende ved katodesiden og den anden, 12 eller 26, er \ beliggende ved anodesiden, idet det nye består i, at den nævnte amfotere eller neutrale kemiske forbindelse holdes 25 i en isoelektrisk eller uladet tilstand inden i væske- s* strømmen, og at den eller de nævnte ladede elektriske forbindelser fjernes fra væskestrømmen ved hjælp af den elektriske strøm til i det mindste én af de nævnte dele af den nævnte matrix eller gennem mindst én af de nævnte dele 30 til mindst et af elektrolyt-opløsningsreservoirerne 3 og 14, hvilke dele indbyrdes^, uafhængigt repræsenterer immobiliserede pH-gradienter^ 9 og 12, som begge udviser ledningsevne og både puffer- og titreringskapacitet inden for sine pH-intervalier, eller amfotere isoelektriske 5 DK 174962 B1 immobiliserede pH-membraner 25 og 26, som begge udviser ledningsevne og både puffer- og titreringskapacitet ved en bestemt pH-værdi.

5 Den amfotere eller neutrale forbindelse, som holdes i en isoelektrisk eller uladet tilstand, er en kemisk forbindelse, som under rensningsprocessens betingelser og på det tidspunkt, hvor separationen fra den eller de uønskede ledsagende kemiske forbindelser faktisk finder sted, ikke 10 har nogen elektrisk nettoladning eller er neutrale. Forbindelsen udgør fortrinsvis et protein, et enzym eller et mindre peptid med mindst to aminosyrer, eller en forbindelse indeholdende en peptid- eller proteindel, f.eks. et glycoprotein, men også en nucleinsyre, et 15 komplekst lipid eller et komplekst kulhydrat.

I modsætning hertil er en elektrisk ladet kemisk forbindelse et kemisk stof, som under rensningsprocessens betingelser og på det tidspunkt, når separationen fra den ønskede kemiske forbindelse faktisk finder sted, har en 20 elektrisk ladning, f.eks. et protein, et enzym eller et mindre peptid, der er ladet, dvs. ikke-isoelektrisk, samt også et salt, f.eks. et alkalimetalsat, f.eks. natrium-chlorid.

Et opløsningsmiddel, der er egnet til brug ved fremgangs-25 måden ifølge opfindelsen, kan være et vilkårligt opløsningsmiddel, der gør den ønskede kemiske forbindelse opløselig og tillader den fornødne elektriske strøm, f.eks. vand eller en blanding af vand med en egnet alkohol, f.eks. en lavere alkanol, f.eks. methanol eller 30 ethanol, eller en vandig opløsning indeholdende urinstof, overfladeaktive midler eller et hvilket som helst andet med vand blandbart organisk eller protisk opløsningsmiddel .

Den elektriske strømning frembringes af en strømforsy- 6 DK 174962 B1 nlngsenhed 1. Der kan anvendes en hvilken som helst spænding, som udstyret kan tåle, f.eks. 100-10.000 V, Især 500-10.000 V, fortrinsvis 500-5.000 V, f.eks. 500, 1000, 5 5000 eller endog 10.000 V, forudsat at den udviklede varme kan bortledes ved passende køling. Typiske værdier ved ligevægt er f.eks. 1000 V, 3 mA og 3 W eller 500, 10 mA og 5 W.

Den elektroforetiske matrix er en bærer for den elektrofo-10 retiske separation.

Den hydrauliske strømning frembringes f.eks. af en pumpe, ved omrøring eller ved at lade strømningskammeret 8 rotere om en passende akse, og omfatter som væskefase en opløsning, der indeholder den blanding, der skal 15 separeres.

Den hydrauliske strømnings retning danner en hvilken som helst egnet vinkel, f.eks. 5“-90”, især 30e-90e, fortrinsvis ca. 90” (orthogonalt) med den elektriske strømnings-retning.

20 En inunobiliseret pH-gradient, således som den er indeholdt f.eks. 1 cylindre 5 eller 12, omfatter en stabil pH-funktion på en elektroforetisk matrix, f.eks. en gel. Inunobiliserede pH-gradienter omfatter et pH-interval, der er frembragt på kendt måde, f.eks. ved hjælp af en over-25 lejret tæthedsgradient og polymerisation (jf. Application Note 321, dateret august 1982 fra LKB-Produkter AB, Box 305, S-16126 Bromma, Sverige), f.eks. ved at blande lige store rumfang af de to nedenfor beskrevne startopløsninger A og B i en gradientblander, f.eks. den af LKB-Produk-30 ter AB leverede "MicroGrad Gradient Maker", idet blanderens udløb er forbundet med cylinderen 5 eller 12. Startopløsningen A er en sur, tung opløsning og indeholder pufferfungerende "Immobilines" eller tilsvarende, ikke-pufferfungerende "Immobilines" eller tilsvarende, 7 DK 174962 B1 "Ampholines" eller tilsvarende, acrylamid, N,N'methylen-bis-acrylamid, glycerol, vand og egnede polymeriserings-katalysatorer. Startopløsningen B er en basisk, let 5 opløsning, der Indeholder pufferfungerende "ImmobilInes”, ikke-pufferfungerende "ImmobilInes", "Ampholines", acrylamid, N,Ν'-methylen-bis-acrylamid, vand og egnede polymeriseringskatalysatorer, men ingen glycerol.

Amfotere isoelektriske Immobiliserede pH-membraner 10 adskiller sig fra de immobiliserede pH-gradienter ved ikke at omfatte et pH-interval, men har den samme pH-værdi gennem hele membranen. Fremstillingen af membranerne sker på en lignende, men endnu enklere måde end fremstillingen af pH-gradienterne, eftersom der ikke kræves nogen 15 gradientblander, og der ikke behøves glycerol til fremstillingen af en tæthedsgradient.

Membranerne fremstilles ved polymerisation, fortrinsvis omkring neutral pH-værdi, ved 50eC i en ovn med forceret ventilation i 1 time, af en opløsning af monomerer (i 20 almindelighed 10-15% T og 3-4% C), der indeholder varierende mængder af pufferfungerende og titrerende "Immobilines" i de forhold, der kræves til frembringelse af det ønskede isoelektriske punkt, tillige med "Ampholines", egnede polymeriseringskatalysatorer og vand.

25 Det er af væsentlig betydning, at membranerne har en god pufferkapacitet ved deres isoelektriske punkt for at forhindre elektroendosmose, dvs. en massiv væskestrømning gennem membranet, der bevirkes af tilstedeværelsen eller opbygningen af en elektrisk nettoladning.

30 Molariteten for "Immobiline" bør imidlertid fortrinsvis ikke overstige 50 mM for hvert "Immobiline” i membranen.

"Ampholines" er amfotere stoffer med lav molekylvægt, dvs. amfolytter, som i modsætning til "Immobilines" ikke er fikseret til acrylamid/N,N'-methylen-bis-acrylamid-35 polymeren, og som derfor kan bidrage til den elektriske 8 DK 174962 B1 ledningsevne. Blandinger af mange amfotere stoffer, såsom aminosyrer og peptider, og nogle amfotere og ikke-amfotere pufferbestanddele kan virke som passende amfolytter.

5 Imidlertid udføres de allerfleste isoelektriske fokuseringsforsøg ved hjælp af kommercielle amfolytblan-dinger. Den af disse blandinger, der har den mest udbredte anvendelse, markedsføres af LKB Produkter AB under varemærket "Ampholines". De består af syntetiske 10 blandinger af polyaminopolycarboxylsyrer med molekylvægte for det meste i området 300-600. Der kan anvendes andre produkter, der indeholder sulfonsyre- eller phosphonsyre-grupperinger i tillæg til aminosyre- og carboxylsyre-grupperne. Disse produkter ("Servalyts"®, 15 Serva-Feinbiochemica GmbH; "Biolytes"®, Bio-Rad Laboratories; "Pharmalytes"®, Pharmacia AB) er i nyere tid blevet sammenlignet med "Ampholines" og har vist sig at fungere på lignende måde.

"Immobilines" er acrylamidderivater med den almindelige 20 struktur O H

CH2=CH-C-N-R, hvor R indeholder enten en carboxylsyre eller en tertiær aminogruppe. "Immobilines" er indrettet til copolymerisatlon med acrylamid og N,N'-methyien-bis-acrylamid med henblik på frembringelse af 25 immobiliserede pH-gradienter. Hvert derivat har en defineret og kendt ρκ-værdi. Acrylamid kan erstattes af f.eks. methacrylamid, og N,N'-methylen-bis-acrylamid kan erstattes af et hvilket som helst andet egnet tværbindingsdannende stof, f.eks. andre egnede acrylamid-30 derivater. Som eksempel på et methacrylamidderivat, der er analogt med en "Immobiline", kan nævnes N-(3-dimethyl-aminopropyl)-methacrylamid med en pK-værdi på 9,5. Efter copolymerisationen er "Immobilines"-stofferne kovalent bundet, dvs. immobiliseret, og yder intet bidrag til 35 ledningsevnen i pH-gradienten eller pH-membranen. "Immobilines"-stofferne bidrager imidlertid til puffer- og titreringskapaciteten.

DK 174962 B1 9

Fortrinsvis lægges pH-gradienterne og pH-membranerne et eller andet sted inden for et pH-område fra ca. 3 til ca.

10, afhængigt af de til rådighed stående "Immobilines" og 5 "Ampholines". Dersom den forbindelse, der er af Interesse, er amfoter, skal pH-værdierne i de to gel-ender, der vender mod strømningskammeret 8, indstilles lige over og under eller lig med det nævnte amfotere stofs isoelektri-ske punkt med den fornødne præcision til at holde det i 10 den isoelektriske tilstand hele tiden. Den nævnte præcision og forskellen mellem pH-værdierne i de nævnte gel-ender, dvs. afstanden eller bredden som målt i pH-enheder i mellemrummet mellem de nævnte gel-ender, afhænger af den ønskede opløsningsevne, dvs. af de iso-15 elektriske punkter for de forureninger, der skal bevæge sig ind 1 gelen, dvs. i det mindste passere gelen. Med henblik på at opnå en så høj opløsningsevne som mulig, kan pH-værdierne i de nævnte gel-ender være ens og lig med den ønskede forbindelses isoelektriske punkt. I så fald er det 20 fordelagtigt at forhindre tab af den ønskede forbindelse, hvad der kunne ske ved diffusion, ved at indføre passende mekaniske midler, f.eks. et egnet milliporøst filter, mellem gelen og den hydrauliske strømning. Dersom den forbindelse, der er af interesse, er neutral, vælges pH-25 værdierne i de nævnte gel-ender således, at forureningerne er nødt til at bevæge sig ind i gelen. De nævnte forureninger kan forblive inden i gelen eller igen forlade denne og opsamles i anode- og katodekammeret 14 henholdsvis 3.

30 Egnede polymerisationskatalysatorer er f.eks. Ν,Ν,Ν’,Ν'-tetramethylethylendiamin (TEMED) og ammoniumpersulfat. De nævnte katalysatorer tilsættes kort før blandingen af de ovennævnte tunge og lette opløsninger påbegyndes. Andre polymerisationsmidler er f.eks. riboflavin med ultraviolet 35 lys eller gammastråling.

I gradientblanderen indblandes den basiske, lette opløs- 10 DK 174962 B1 ning 1 den sure, tunge opløsning, der udtages samtidigt i gradientblanderens udløb, der er forbundet med beholderen 5 eller 12. Derved varierer den fremkomne tæthedsgradient 5 i takt med pH-gradienten. De nederste ender på beholderne 5 og 12 forsegles midlertidigt, f.eks. med "parafilm".

Efter at polymerisationsprocessen er fuldført, fjernes "parafilmen". Dersom den nævnte beholders indvendige diameter er for lang, kan det være nødvendigt at Indføre 10 et eller andet støtteorgan, f.eks. en perforeret plade, som ikke fjernes, ved beholderens nederste ende. I det mindste de dele af beholderen, der kommer i berøring med polymeren, skal være fremstillet af et materiale, som polymeren hæfter godt til, f.eks. glas, for at forhindre 15 at noget af væsken passerer mellem beholdervæggen og polymeren. Beholderne 5 og 12, der indeholder de immobiliserede pH-gradienter, er indbygget i et apparat ifølge opfindelsen, f.eks. som vist i fig. 1 og 2. Bagefter vaskes gradienterne grundigt for at fjerne uønskede 20 stoffer, f.eks. ubundne "Immobiline"-kemikalier, katalysatorer og upodede monomerer. I øvrigt er de to saltfronter, der er ansamlet hen imod de anodiske og katodiske gelområder, på grund af den meget lave ledningsevne i gelens midterste del, der fremkommer ved den elek-25 troforetiske udtømning af svage ubundne anioner og kationer, aldrig i stand til at forlade gelen. For at opnå en god fokusering overlejres den primære gradient, "Immobiline”-gradienten, med en sekundær, af en bære-amfolyt drevet pH-gradient. Apparatet ifølge 30 opfindelsen holdes i reglen i drift med strømningskammeret fyldt med væske i adskillige timer, f.eks. ca. 5 timer, indtil der er opnået en stabil tilstand, inden prøven indføres. Bagefter tømmes strømningskammeret 8 og, om nødvendigt, samtlige øvrige beholdere, der kommer i 35 berøring med den hydrauliske strømning, f.eks. prøvebeholderen 11, for at fjerne skadeligt materiale, der er udludet fra polymeren, såsom upodede monomerer, og fyldes med den prøve, der skal renses.

11 DK 174962 B1

Under hele forløbet omrøres prøveopløsningen kraftigt for at forhindre elektro-dekantering, og den holdes ved en konstant temperatur. pH-Gradienterne 1 beholderne 5 og 12 5 holdes også ved en konstant temperatur. Den anvendte temperatur afhænger bl.a. af opløsningsmidlet og det ønskede stofs stabilitet og opløselighed. I vand holdes temperaturen normalt på en fast værdi mellem ca. 1 og ca.

20°C, f.eks. ved 2eC.

10 Opfindelsens grundidé er en blandet tilberedningsmetode baseret på anvendelse af et væskeleje, der kan være kort, og som er forbundet med og afgrænset af to gel faser, således som belyst i det følgende eksempel på renfremstilling af et protein. Det protein, der har interesse, holdes 15 i en isoelektrisk tilstand i væskefasen, f.eks. i et lille recirkulationskammer 8, mens de medfølgende urenheder drives bort, enten hen imod katoden 2 eller anoden 13 og til sidst, men ikke nødvendigvis, fokuseres i gelfaserne 5 og 12, der repræsenterer pH-gradienterne. I stedet for 20 pH-gradienter kan der anvendes pH-membraner. Ved denne modificerede isoelektriske fokuseringsmetode bliver det interessante protein således ikke drevet elektroforetisk ind i gel-matrixen, hvorfra den i så fald skulle genvindes ved et yderligere renfremstillingstrin, men holdes i en 25 isoelektrisk tilstand i væskefasen, dvs. den hydrauliske strømning 7,8 og 11, der udgør prøvetilførselsvejen, og kun urenhederne (der er elektrisk ladet) tvangsfokuseres i gelfaserne 5 og 12, der afgrænser væskeprøvelndgangen, eller opsamles i det ene af eller begge , 30 elektrolyt-reservoirerne 3 og 14. Fortrinsvis svarer pH-værdien inden i den hydrauliske strømning til den ønskede forbindelses isoelektriske punkt. Eftersom den elektroforetiske separation udføres i en pH-gradient, dvs. ved isoelektrisk fokusering, vil samtlige stoffer med et 35 isoelektrisk punkt inden for pH-gradienten 5 eller 12 af spændingsgradienten blive drevet ind i netop den zone, hvor de udviser en nettoladning på nul, og hvori de 12 DK 174962 B1 forbliver stationære, så længe det elektriske felt påtrykkes. I sammenligning med tidligere metoder består forskellen bl.a. i, at startbetingelserne arrangeres på en 5 sådan måde, at den interessante bestanddel allerede er isoelektrisk i strømningskammeret 8, der udgør anlæggets prøvetilførselsvej. Derfor vil den interessante bestanddel ikke af den elektriske strømning blive tvunget til at vandre. I stedet for at anvende et sædvanligt isoelektrisk 10 fokuseringsanlæg baseret på amfotere puffere (jf. P.G. Rlghetti, Isoelectric Focussing: Theory, Methodology and Applications, Elsevier, Amsterdam, s. 204-207 (1983)), anvendes der ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen en mere avanceret version, hvori en immobiliseret pH-gradient 15 udnyttes (jf. P.G. Righetti, J. Chromatogr. 300, 165-223 (1984)).

Et sædvanligt isoelektrisk fokuseringsanlæg ville ikke være egnet til brug med fremgangsmåden ifølge opfindelsen af følgende årsager: 20 a) isoelektrisk fokusering er ikke stabil med hensyn til tiden; faktisk henfalder pH-gradienten og undergår en fremadskridende forsuring (katodisk afdrift) (jf. P.G. Righetti og J.W. Drysdale, Ann. N.Y. Acad. Sci. 209, 163-186 (1973)), således at det interessante protein ikke 25 ville kunne fastholdes i væskefasen, men ville efterhånden bevæge sig ind i gel-matrixen, b) på grund af den kendsgerning, at pH-gradienter i de sædvanlige anlæg med isoelektrisk fokusering kun frembringes som tilnærmelser til det ønskede, ville det være 30 umuligt at indstille grænsebetingelserne i de to gel--ender, der vender mod strømningskammeret 8, med den fornødne præcision til at holde den Interessante kemiske forbindelse, der har et Isoelektrisk punkt, netop i den isoelektriske tilstand hele tiden, således at den 35 forhindres i at forlade væskefasen eller den hydrauliske strømningsbane 7,8 og 11.

13 DK 174962 B1 1 modsætning hertil er det ved anvendelse af Immobilise-rede pH-gradienter og pH-membraner i de fleste tilfælde muligt at indstille grænsebetingelserne således, at den 5 anodiske gel-ende, der vender mod prøvestrømmen, har en pH-værdi lige under den interessante bestanddels isoelek-triske punkt, mens den tilsvarende katodiske gel-ende er indstillet til en pH-værdi lige over den ønskede forbindelses isoelektriske punkt. Selvsagt kan fremstillingen af 10 egnede immobiliserede pH-gradienter være vanskelig i de forholdsvis sjældne tilfælde, hvor den ønskede substans har et ekstremt højt eller lavt isoelektrisk punkt. Den nævnte kemiske forbindelse, der har et isoelektrisk punkt, vil således være isoelektrisk i denne snævre pH-spalte, 15 der afgrænses af de to immobiliserede pH-gradienter eller pH-membraner. Dersom den interessante forbindelse er amfoter, omfatter denne spalte normalt mellem 0,05 og 0,2 pH-enheder; det er imidlertid også muligt at opnå spalter helt ned til 0,001 pH-enheder. Det er også muligt, at 20 spalten omfatter 0 pH-enheder, dvs. at pH-værdierne i de nævnte gel-ender svarer til den ønskede forbindelses isoelektriske punkt. Dette betyder, at der slet ikke er nogen pH-spalte, men kun en væskespalte mellem to gelfaser. Dersom den interessante forbindelse er neutral, 25 vælges pH-værdierne i gel-enderne ikke under hensyntagen til den ønskede forbindelse, men under hensyntagen til de uønskede amfotere eller ladede forbindelser, i den betydning, at de nævnte uønskede forbindelser ikke bør have et isoelektrisk punkt inden for den nævnte pH-spalte.

30 Den neutrale forbindelse vil aldrig gå ind i pH-gradienterne, uanset grænsebetingelserne i de mod strømningskammeret 8 vendende gel-ender. Ud over denne præcision ved indstillingen af grænsebetingelserne, der skyldes den ubegrænsede stabilitet af de isoelektriske 35 pH-gradienter med hensyn til tiden, sikres det automatisk, at pH-gradienten aldrig driver af, således at de isoelektriske betingelser for den kemiske forbindelse, der er ved at blive renfremstillet, opretholdes konstant i den 14 DK 174962 B1 hydrauliske strømningsbane, især 1 strømningskammeret 8, og Ikke andre steder, f.eks. Inden 1 de anodlske eller katodlske gelfaser 12 henholdsvis 5.

5 Fremgangsmåden Ifølge opfindelsen medfører bl.a. følgende væsentlige fordele: a) yderst høj prøvegenvindingsgrad, der nærmer sig 100%, da den kemiske forbindelse, f.eks. proteinet, der bliver renfremstlllet, aldrig går Ind 1 gelfasen, men holdes 10 uladet, f.eks. i en isoelektrisk tilstand, under hele det 1 væskefasen forløbende renfremstillingstrin, b) store prøveportioner, da den forbindelse, der skal renfremstilles, f.eks. det tilførte protein, kan holdes 1 cirkulation mellem et særskilt reservoir 11 og strømnings- 15 kammeret 8, idet kun små mængder behøver at være til stede i det elektriske felt ved et hvilket som helst givet tidspunkt, c) høj opløsningsevne, afhængigt af hvor snævert det pH-interval, der er valgt hen over den ønskede forbindelses, 20 f.eks. proteins, isoelektriske punkt, er, d) automatisk fjernelse af eventuelle salte eller puffere, der ledsager den Interessante forbindelse, f.eks. peptidet eller proteinet, der betyder, at fremgangsmåden ifølge opfindelsen også kan anvendes til elektrodialyse, 25 f.eks. afsaltning. Navnlig er fjernelsen af monovalente ioner af stærke syrer eller baser, f.eks. Na® og Cl®, meget problemfri. Til fjernelse af monovalente ioner af svage syre og baser, f.eks. ammonium og acetat, er det hensigtsmæssigt at anvende de i det følgende omtalte 30 amfotere isoelektriske "Immobiline"-membraner, eller snarere korte pH-gradienter, dvs. gradienter, der kun omfatter et forholdsvis lille pH-område, f.eks. 0,5-1,0 pH-enheder, der ligger i betydelig afstand fra de pågældende svage syrers og basers pK-værdler. Fjernelsen 35 af multivalente ioner, f.eks. sulfat, phosphat og citrat, tager længere tid, hvad der kan skyldes en vekselvirkning mellem disse ioner og nImmobiline"-matrixen, og udføres 15 DK 174962 B1 bedst under ydre styring af pH-værdien, f.eks. ved hjælp af "pH-stat", fordi ellers kan opløsningen i kammeret 8, på grund af den hurtigere fjernelse af den monovalente 5 mod-ion, blive temmelig sur eller alkalisk. Hurtig afsaltning af proteinprøver til mange forskellige anvendelser, f.eks. enzymreaktioner eller studier 1 ligandbindinger, er et af de problemer, man for tiden står overfor inden for biokemien.

10 Et hvilket som helst indhold af salt i prøvetilførselsstrømmen, hvis koncentration allerede er 1 mM, hæmmer transporten af ikke-isoelektriske proteiner, måske på grund af den meget større strømandel, der bæres af selve ionerne til forskel fra proteiner. I tillæg hertil kan 15 høje saltkoncentrationer i prøvereservoiret bevirke dannelse af katodiske og anodiske iongrænser, henholdsvis alkaliske og sure, der kan besværliggøre proteinvandringen og endog fremkalde denaturering. I segmenterede iso-elektriske pH-gradient-geler såvel som i sædvanlige 20 sådanne vil praktisk taget hvilken som helst saltkoncentration i prøvezonen hæmme den elektroforetiske transport. Derfor er den bedste måde at opnå en effektiv fjernelse af protein-urenheder fra en isoelektrisk bestanddel at indføre en allerede afsaltet proteintilførselsstrøm i det 25 segmenterede apparat med immobiliseret pH-gradient. Selv under tilstedeværelse af salte i prøven er det dog muligt at fjerne proteinurenheder, selv om det går langsommere.

I sidstnævnte tilfælde bør saltkoncentrationerne holdes på et minimum, der er foreneligt med protein-opløseligheden, 30 f.eks. 5 mM eller mindre, og der bør udføres ydre pH-styring, f.eks. med en pH-stat, for at forhindre drastiske pH-ændringer i prøvetilførselsstrømmen, der skyldes frembringelsen af grænser, dannet af salt- bestanddelene. I et ikke ubetydeligt antal tilfælde kan 35 det være nødvendigt at have en vis minimal saltkoncen tration i prøvefasen under elektroforesen for at forhindre protein-aggregation og -udfældning på grund af 16 DK 174962 B1 en for lav ionstyrke ved eller 1 nærheden af det isoelektriske punkt. Til dette formål anvendes en ydre hydraulisk strømning, der genopretter det salttab, der 5 skyldes kombineret elektrisk og diffusionsbetinget massetransport, svarende til Rilbe's i stabil tilstand udførte rheoelektrolyse, jf. H. Rilbe, J. Chromatography 159, 193-205 (1978).

Den ovenfor omtalte fremgangsmåde kan udføres med et af de 10 i det følgende omtalte elektroforetiske apparater, som også omfattes af opfindelsen.

Samtlige sådanne elektroforetiske apparater omfatter i grundtrækkene et strømningskammer 8, der er forbundet med to beholdere 5 og 12, som hver uafhængigt af den anden er 15 fyldt med en immobiliseret pH-gradient eller erstattet af en immobiliseret pH-membran, af hvilke gradienter eller membraner den ene, ved den med strømningskammeret 8 forbundne ende eller side, har et isoelektrisk punkt lige under eller lig med det isoelektriske punkt for den 20 kemiske forbindelse, der skal renses, og er med sin anden ende eller side forbundet med anodekammeret 14. Den anden pH-gradient eller pH-membran har, ved den med strømningskammeret 8 forbundne ende eller side, et isoelektrisk punkt lige over eller lig med det isoelektriske punkt for 25 den nævnte kemiske forbindelse, der skal renses, og er med sin anden ende eller side forbundet med katodekammeret 3.

Fig. 1 viser skematisk et af mange mulige udførelseseksempler på dette nye elektroforetiske apparat. Et strømningskammer 8 er forbundet med en prøvebeholder 11, som i 30 princippet kan indeholde et hvilket som helst rumfang til behandling gennem en pumpe 9, hvormed prøvevæsken cirkuleres gennem det elektriske felt. I almindelighed holdes pumpen 9 i drift ved maksimal hastighed, f.eks. 5 ml/min. Vinkelret på væskestrømningen 7 påtrykkes et 35 elektrisk felt mellem to plader 2 og 13, fortrinsvis af 17 DK 174962 B1 platin, der tjener til elektroforetisk fjernelse af eventuelle ioner eller ikke-isoelektriske amfotere stoffer fra strømningskammeret 8. Strømningskammeret 8 er, f.eks.

5 gennem øvre og nedre O-ringpakninger 6 og 10, forbundet med to gelcylindre 5 og 12 af polyacrylamid, der er fastholdt i korte glasrør og udstyret med kapper 19 for en kølemiddelstrøm 18 - kapperne 19 og kølemiddelstrømmen 18 er ikke vist i fig. 1, men kan ses i fig. 2. Det øverste 10 rør 5 er, f.eks. over en vandtæt O-ringpakning 4, forbundet med katodekammeret 3, som i almindelighed indeholder en fortyndet base, f.eks. 50 mM NaOH eller ethanolamin, ehylendiamin, isoionisk lysin eller arginin, således som det er normalt i sædvanlig isoelektrisk 15 fokusering. Det nederste rør 12 er med sin nederste ende direkte nedsænket i et anodekammer 14, som i almindelighed indeholder en fortyndet (stærk eller svag) syre, såsom en opløsning af eddikesyre, phosphorsyre eller svovlsyre eller Isoionisk aspartinsyre eller glutaminsyre, således 20 som det er rutinemæssig praksis i normal isoelektrisk fokusering. O-ringpakningerne kan selvsagt erstattes med hvilke som helst andre egnede organer til at forbinde apparatets forskellige dele med hinanden.

Det nye træk ved den her beskrevne fraktioneringsmetode 25 består i, at strømningskammeret 8 er afgrænset af enderne på en nedre og en øvre polyacrylamid-gel, der repræsenterer immobiliserede pH-gradienter eller pH-membraner. De nævnte pH-gradienter er Indeholdt i cylindrene 12 og 5, der fortrinsvis består af glas eller andet egnet materi-30 ale, som gelen kan hæfte til ved adhæsionskraft. Ved at sørge for, at de ender på disse to gelsegmenter, der afgrænser strømningskammeret 8, har isoelektriske punkter, som på anodesiden ligger lige under eller er lig med det isoelektriske punkt for den ønskede forbindelse, f.eks.

35 protein, der skal renses, og på katodesiden ligger lige over eller er lig med det nævnte isoelektriske punkt, vil denne forbindelse i praksis blive titreret til det iso- 18 DK 174962 B1 elektriske punkt og vil derfor ikke være i stand til at forlade væskestrømningsbanen 8,7 og 11. Omvendt vil alle urenheder med et afvigende isoelektrisk punkt, f.eks.

5 urenheder i form af proteiner, der ledsager den forbindelse, der er ved at blive renset, automatisk - ved den i strømningskammeret 8 herskende pH-værdi - ligge over eller under sine respektive isoelektriske punkter og således være tvunget til at forlade kammeret 8 og enten blive 10 fokuseret i de nedre eller øvre segmenter 12 eller 5 af den immobiliserede polyacrylamid-gel eller samle sig i anode- eller katodekammeret 1 eller 3. Forudsat at cirkulationstiden under påvirkning af en spændingsgradient er tilstrækkelig, forlader samtlige urenheder strømnlngs-15 kammeret 8, og den rene forbindelse, f.eks. isoelektrisk protein, indvindes fra strømningskammeret 8 og prøvebeholderen, som oprindeligt indeholdt prøven. Ingen yderligere manipulationer eller prøveekstraktioner behøves, eftersom den forbindelse, f.eks. et protein, der er af 20 interesse, hele tiden befinder sig i væskefasen og ikke kommer ind i gelen.

Apparatet, der er samlet f.eks. lodret eller fortrinsvis vandret og omfatter anode- og katodekamrene 14 og 3, gelcylindrene 12 og 5, pakningerne 10,6 og 4 og strømnings-25 kammeret 8, er forbundet med en strømforsyningsenhed 1. I ligevægtstilstanden er typiske værdier 1000 V, 3 mA og 3 W, idet der kan anvendes hvilke som helst andre værdier, der er egnet til separation, forudsat at den udviklede varme kan fjernes ved passende køling. Det prøve-30 indeholdende strømningskammer 8 er udstyret med organer til at holde det på en konstant temperatur, og/eller prøveportionen opbevares i en større, med kappe forsynet beholder 11, der er forbundet med en termostat 17. Det er fordelagtigt at holde prøvebeholderen 11 under uafbrudt 35 forsigtig omrøring, idet der ellers med tiden kunne ske en tyngdekraftbetirtget lagdeling. En hvilken som helst pumpeindretning 9, f.eks. en peristaltisk pumpe, anvendes 19 DK 174962 B1 til recirkulationen, som i almindelighed udføres ved maksimal hastighed, f.eks. 5 ml/min., således at prøvens opholdstid i strømningskammeret bliver så kort som mulig 5 med henblik på undgåelse af en eventuel risiko for termisk denaturering. Dette er en af de enkleste driftsopstillinger. I princippet kan dette apparat indgå som en del af et prøve- eller måleanlæg af en hvilken som helst art, f.eks. et detekteringsanlæg baseret på biosensorer, 10 et immunoelektroforetisk udstyr, et laser-anslået fluore-scensdetektionsudstyr, et hvilket som helst "robotisk" forbundet anlæg, indretninger, f.eks. strømningselektroder, til pH-måling og -styring, indretninger til radio-isotop-overvågning og/eller indretninger, f.eks.

15 strømningsceller til ledningsevne-overvågning. Det vil være indlysende, at med henblik på specielle anvendelser kunne prøvevæskestrømmen 7 også overvåges i den ultraviolette eller synlige del af spektret eller ved fluorescens, med standardudstyret forbundet med 20 kromatografisøjler til overvågning af den hastighed, hvormed nogle af blandingens bestanddele fjernes.

Fig. 2 viser skematisk omtrent det samme apparat som vist i fig. 1, men med delene ført bort fra hinanden og uden omrøreren 16 og termostaten 17 som vist i fig. 1, idet 25 fig. 2, ud over hvad fig. 1 viser, også viser kapperne 19 før kølemiddelstrømmen 18 omkring gelcylindrene 5 og 12, såvel som de forskellige dele 3,5,6,8,10,12 og 14 i den rigtige indbyrdes stilling med henblik på samling, men endnu ikke samlet. Kølemiddelstrømmen 18 er forbundet med 30 en termostat, f.eks. termostaten 17, som ikke er vist i fig. 2. Selv om det ikke er vist i fig. 2, Jf. imidlertid fig. 1, bør også prøvebeholderen 11 holdes ved en konstant temperatur, f.eks. 2°C, eftersom de isoelektriske punkter er temperaturafhængige. Dersom det ønskes, kan strømnings-35 kammeret 8 også være udstyret med kapper til kølemiddelstrømning. Ud over hvad der er vist i fig. 1 viser fig. 2 også en foretrukken udformning af strømningskammeret 8, 20 DK 174962 B1 idet indløbet og udløbet for væskestrømningen 7 er bøjet, det ene hen imod cylinderen 12 og det andet hen imod cylinderen 5. Selv om beholderen 12 her er vist med to 5 forskruningsforbindelser, kan den også nedsænkes direkte i anolyt-Opløsningen i elektrodekammeret 14.

Fig. 3 viser et apparat, som efter samling af sine komponenter er egnet til renfremstilling af to amfotere forbindelser, f.eks. to proteiner, der har forskellige 10 isoelektriske punkter, i det samme apparat og på samme tid. Prøvebeholdere 11a og 11b indeholder den oprindeligt tilførte prøve, der kan være den samme eller forskellige i de to beholdere. Prøvebeholderen 11a er gennem en slange 7a af en eller anden art forbundet med det ene 8a af to 15 strømningskamre, mens prøvebeholderen 11b gennem en anden slange 7b er forbundet med det andet strømningskammer 8b. Strømningskamrene 8a og 8b er adskilt fra hinanden ved hjælp af en mellemliggende cylinder 20, der indeholder en immobiliseret pH-gradient. Den ende af den nævnte mel-20 lemliggende pH-gradient, der vender mod strømningskammeret 8, har en pH-værdi, der er en smule højere, f.eks.

+0,05 pH-enheder, end det isoelektriske punkt for den ønskede forbindelse i strømningskammeret 8b, eller også den samme pH-værdi som den ønskede forbindelse. Den ende 25 af den nævnte mellemliggende pH-gradient, der vender mod strømningskammeret 8a, har en pH-værdi, der ligger en smule lavere, f.eks. -0,05 pH-enheder, end det Isoelektriske punkt for den ønskede forbindelse i strømningskammeret 8a, eller også den samme pH-værdi som den ønskede 30 forbindelse. Når den isoelektriske fokuseringsproces er tilendebragt, er de ønskede renfremstillede stoffer, f.eks. proteiner, opsamlet i kamrene 8a/lla og 8b/llb, idet eventuelle ladede forureninger er blevet fjernet.

Til analytiske formål kan der anvendes et apparat ifølge 35 fig. 1, men med den ændring, at strømningskammeret 8 er lukket 1 den forstand, at det ikke er forbundet med 21 DK 174962 B1 prøvebeholderen 11. I dette tilfælde kan apparatet orienteres vandret, nedsænkes 1 det samme kølemiddel og bringes til at rotere om sin akse. 1 stedet for at hele apparatet 5 roterer, kan der foretages en omrøring af prøven 1 strømnlngskammeret, f.eks. ved hjælp af en magnetisk stang eller pind.

Ikke alene 1 det ovenfor omtalte specielle tilfælde med et lukket strømnlngskammer, men også 1 det sædvanlige til-10 fælde med et "åbent" strømnlngskammer med Indløb og udløb for væskestrømmen, er det fordelagtigt at anvende elektro-fokuseringsapparatet 1 vandret stilling med de nævnte indløb og udløb i lodret stilling med udløbet øverst. Når apparatet er lodret orienteret, er der en tilbøjelighed 15 til, at luftbobler samler sig i strømningskammerets øverste del. Dette medfører en uensartet transport af urenheder og udgør en hindring for den elektriske strøm.

Når luftboblerne skal fjernes, er det nødvendigt at demontere apparatet og lægge det vandret med henblik på 20 fuldstændig fjernelse af boblerne gennem udløbsstrømmen. Ydermere har det nederste immobiliserede pH-gradient-segment, der er nedsænket i den nedre elektrolytbeholder (i amindelighed anoden), en tilbøjelighed til opkvældning.

Dette bringer gelen til at rage ud fra bærerøret og kan 25 til sidst bringe gelen til at løsne fra glasvæggene og falde ud af sit leje. Disse problemer er undgået i et vandret apparat, f.eks. som vist i fig. 8, hvilket apparat er udstyret med filtre ved samtlige ender eller sider på de immobiliserede pH-gradient-segmenter med henblik på at 30 holde "Immoblllne"-gelfaserne på plads. Filtrene 21 holdes strakt på stedet af en O-ring, der hviler mod en ringformet afsats i det ydre rør.

I fig. 1-3 er de immobiliserede gelbeholdere 5 og 12 anbragt over for hinanden. Det er imidlertid også muligt 35 at anbringe dem indbyrdes parallelt som vist i fig. 4. En sådan opstilling er især velegnet til renfremstilling i 22 DK 174962 B1 stor skala, eftersom det er muligt at nedsænke mere end to beholdere 5 og 12, f.eks. fire, seks etc., 1 strømnings-kammeret 8.

5 Til de fleste anvendelsesformål kan fremgangsmåden og apparatet forbedres ved at erstatte 1 det mindste den ene af pH-gradlenterne med amfotere Isoelektrlske immobilise-rede pH-membraner. Sådanne membraner kan betragtes som meget korte pH-gradlenter, som kun dækker et meget snævert 10 pH-interval. Ideelt omfatter dette pH-interval nul pH-enheder. Ydermere kan forskellen mellem pH-værdlerne 1 de ender eller sider på pH-gradienterne eller pH-membra-nerne, der afgrænser strømningskammeret 8, også reduceres til nul, dvs. strømningskammeret kan af grænses f.eks. af 15 to membraner med samme pH-værdi, der er identisk med den ønskede forbindelses isoelektrlske punkt. Denne kendsgerning er overraskende, og gør metoden mere bekvem, eftersom der kan fremstilles to identiske membraner i stedet for to forskellige membraner. Anvendelsen af pH-membraner i 20 stedet for pH-gradienter udviser den yderligere fordel, at den er billigere. Ydermere er det lettere at fjerne den udviklede varme. Derfor vil det foretrækkes at anvende pH-membraner 25 og 26 i de fleste tilfælde, hvor der skal udføres renfremstillinger i stor skala.

25 Opfindelsen skal i det følgende belyses nærmere ved en række eksempler, hvori der er anvendt følgende

Forkortelser: A: ampere C: (når det anvendes til at angive gelsammensætnin- 30 gen) vægt-% af samlet indhold af monomer T (jf.

det følgende), der skyldes tværbindingsmidlet N,N'-methylen-bis-acrylamid med formlen CH2=CH-CO-NH-CH2-CO-CH=CH2 23 DK 174962 B1 IPG: inunobi li seret pH-gradient pi: isoelektrisk punkt T: samlet koncentration i g/100 ml af acrylamid og 5 N,Ν'-methylen-bis-acrylamid TEMED: Ν,Ν,Ν',N'-tetramethylethylendiamin V: volt U: watt

Eksempel 1 10 Renfremstilling af en proteinblanding

Forsøgsopstillingen er som vist i fig. 1 og 2. Det nedre iPG-segment 12 med et samlet rumfang på 26 ml indeholder en pH-matrix ved området 3,5-7,2 (7% T, 4% C), samt 1% bæreamfolytter i omtrent det samme pH-interval, og er 15 fremstillet ud fra en sur tung opløsning og en basisk let opløsning ved hjælp af en passende gradientblander som følger:

Den sure tunge opløsning fremstilles ud fra en blanding af "Immobilines" (fra 0,2 M stamopløsninger), nemlig 685 /il 20 af pK 3,6, 223 /ti af pK 4,6, 226 μΐ af pK 6,2, 118 /ti af pK 7,0 og 154 /ti af pK 8,5, samt 0,6 ml "Ampholine" med pH

3,5-7,0, 3,1 ml acrylamid fra en stamblanding (30% T, 4% C) og 3,6 ml glycerol ved tilsætning af vand op til 13 ml.

Den basiske lette opløsning fremstilles ud fra en blanding 25 af "Immobi 1 ines", nemlig 124 /ti af pK 3,6, 511 μΐ af pK

4,6, 347 /ti af pK 6,2, 139 /ti af pK 7,0, 310 μΐ af pK 8,5

og 238 /il af pK 9,3, samt 0,6 ml "Ampholine" med pH

24 DK 174962 B1 3,5-7,0 og 3,1 ml acrylamid af en stamblanding (30% T, 4% C) og tilsætning af vand op til 13 ml.

Efter overførsel til en passende gradientblander med to 5 kamre, tilsættes 10 μΐ TEMED og 13 μΐ 40% ammoniumper-sulfat til hver af de ovennævnte opløsninger.

Udløbet fra gradientblanderen forbindes med kammeret 12, hvis nedre ende er midlertidigt lukket, f.eks. ved hjælp af parafilm, Indtil polymeriserlngsprocessen er færdig.

10 Polymeriseringen forløber i ca. 1 time ved 50°C (eller i 2 timer ved 37eC).

Det øvre IPG-segment 5 med et samlet rumfang på 26 ml indeholder en matrix med pH-området 7,4-10,0 (7% T, 4% C) og 1% bæreamfolytter i det samme pH-område, og tilberedes 15 ud fra nedennævnte opløsninger a) og b) som følger:

a) Den sure tunge opløsning med pH 7,4 tilberedes fra en blanding af "Immobilines" (fra 0,2 M stamopløsninger), nemlig 506 μΐ af pK 3,6, 387 μΐ af pK 7,0, 361 μΐ af pK

8,5 og 46 μΐ af pK 9,3, samt 0,6 ml "Ampholine" med pH

20 7-10, 3,1 ml acrylamid fra en stamblanding (30% T, 4% C) og 3,6 ml glycerol ved tilsætning af vand op til 13 ml.

b) Den basiske lette opløsning med pH 10 tilberedes fra en blanding af "Immobi 1 ines", nemlig 93 μΐ af pK 3,6, 335 μΐ af pK 7,0, 362 μΐ af pK 8,5 og 289 μΐ af pK 9,3, samt 25 0,6 ml "Ampholine" med pH 7-10 (samtlige "Ampholines" fra 40% stamopløsninger) og 3,1 ml acrylamid fra en stamblanding (30% T, 4% C) ved tilsætning af vand op til 13 ml.

Så snart de er blevet overført til gradientblanderen, tilsættes der til hver af opløsningerne a) og b) katalysa-30 torer, nemlig TEMED og ammoniumpersulfat i denne rækkefølge, som nævnt ovenfor.

25 DK 174962 B1

Udløbet fra denne gradientblander forbindes med kammeret 5, hvis nederste ende lukkes midlertidigt.

Efter at polymeriseringen er tilendebragt, fjernes de 5 midler, hvormed kamrene 5 og 12 har været lukket, og disse kamre, der indeholder de på den omtalte måde tilberedte IPG-geler, indbygges i det i fig. 1 viste elektroforetiske apparat. Alle ikke-amfotere ioner (upodede "Immobilines", katalysatorer, puffere etc.) fjernes fra gelen inden 10 prøven tilføres, ved at apparatet "indkøres" i 5 timer ved 5 W/1000 V. Strømningskammeret 8 er således begrænset til et snævert pH-interval (pH 7,2-7,4) centreret om pi (7,30) af humant voksenhæmoglobin (pi typisk for humant voksenhæmoglobin A [ HbA ] i en iPG-gel ved 10°C). 70 mg samlet 15 lysat fra en heterozygotisk bestanddel af humant voksenhæmoglobin C [HbA] (indeholdende ca. 60% HbA og 40% HbC), opløst i 25 ml 0,5% bæreamfolytter ved pH 6-8 cirkuleres i det på forhånd fokuserede apparat under en konstant spænding på 1000 V. Med intervaller på 30 minutter udtages 20 prøver på 30 μΐ og holdes ved 4®C til senere analyse.

Forsøget afsluttes med den sidste prøvetagning efter 23 timer. Prøveportionerne analyseres i en IPG-gel (5% T, 4% C) i pH-området 6,5-8,5. De resultater, der blev opnået ved densitometriske afsøgninger af spidsværdierne af HbA 25 og HbC med et laser-densitometer (tilvejebragt af LKB) er vist i fig. 5, der viser tiden i timer langs med x-aksen og mængden i mg af HbA og HbC langs med y-aksen. Kurve I (trekanter) henfører til HbA og kurve II henfører til HbC.

Det vil kunne ses, at mens HbA forbliver konstant gennem 30 hele forsøgets varighed, fjernes HbC efterhånden, indtil det ved 23 timer ikke længere kan påvises. Efter cirkulation i 12 timer er HbA mindst 95% rent, mens det efter 23 timer er mere end 99,5% rent.

26 DK 174962 B1

Eksempel 2

Fjernelse af farvestoffer fra et protein

For at bedømme præstationen af det i fig. 1 viste apparat 5 som elektrodialyseenhed, bedømmes de kinetiske forhold ved fjernelse af farvestoffer (i form af salte) fra proteinblandinger. I den anodiske arm 12 polymeres en IPG-gel med pH 3,5-7,2, og i den katodiske arm 5 polymeres en IPG-gel med pH 7,4-10. Tilførselsstrømmen holdes således ved en 10 pH-værdi mellem 7,2 og 7,4. Tilførselsstrømmen omfatter en opløsning af 40 mg renset humant voksenhæmoglobin Λ i 0,5% "Ampholine" med pH 6-8, hvortil er tilsat 10 mg surt farvestof (bromphenolblåt) og 10 mg basisk farvestof (toluidinblåt) (samlet rumfang 25 ml). Fjernelsen af de 15 nævnte farvestoffer under påvirkning af en konstant spænding på 1000 V efterfølges af prøve- udtagninger på 30 /il ved bestemte tidsintervaller fra prøvebeholderen og bedømmelse af restmængderne ved spektrofotometrisk aflæsning ved 600 nm. Resultaterne er vist i fig. 6, hvori 20 tiden i timer er vist langs med x-aksen og mængden i mg af de to farvestoffer er vist langs med y-aksen. Kurve I (trekanter) viser den katodiske vandring af toluidinblåt og kurve II viser den anodiske vandring af bromphenolblåt.

Som vist i fig. 6 er efter to timer i alt væsentligt alt 25 farvestof blevet fjernet fra strømningskammeret, hvor de efterlader den afsaltede hæmoglobinprøve. Fjernelseshastigheden synes at svare til en reaktionskinetik af første orden, eftersom en ikke vist kurve, der viser koncentrationen logaritmisk som funktion af tiden, er 30 lineær. Formen af toluidinblåt-kurven I er til at begynde med stejlere end kurven for bromphenolblåt, men målingerne kompliceres af den kendsgerning, at dette farvestof synes at bestå af en familie af tre bestanddele, eftersom der i den øverste gel kunne iagttages en vandring af tre blå 35 zoner.

Eksempel 3 DK 174962 B1 27

Proteln-afsaltning 30 ml af en opløsning af humant voksenhsmoglobln A (HbA) 5 bringes til 50 mM 1 NaCl og cirkuleres i det i fig. 1 viste apparat ved 10 W konstant og ved 2eC. Cirkulations-kammeret afgrænses af et gulv med pH 7,2 og et loft med pH 7,4. Cirkulationshastigheden er 10 ml/min. Ved de givne tidsintervaller udtages portioner på 2 ml, som ved hjælp 10 af en termostat bringes til og holdes på 25°C og overvåges med en ledningsevnemåler af typen "Analytical Control 101", der er udstyret med en ledningsevnecelle af typen "Orlon". Ledningsevnemålingerne omregnes til mM rest-NaCl. Afsaltningen er i alt væsentligt fuldført i løbet af 2 15 timer. De kinetiske forhold ved afsaltningen af HbA er vist i fig. 7, hvor tiden i timer er vist langs med x-aksen og mængden af natriumchlorid i mM er vist langs med y-aksen.

Eksempel 4

20 Renfremstilling af N-acetyl-eglln C

a) Det isoelektriske punkt for N-acetyl-eglin C (pi = 5,5) bestemmes på "Ampholine" PAG-plader med pH 3,5-9,5,5% T, 3% C, 2,2% "Ampholine"-koncentration.

Ca. 350 μg samlet protein indføres i hver lomme (i rumfang 25 op til 20 μΐ), hvorpå fokuseringen udføres ved 10 W grænseværdi, 10 mA, og 1000 V ved ligevægt. De analytiske forløb er i almindelighed færdige inden for 2 timer, hvorpå gelerne fikseres og farves med Coomassie-blåt.

Fikseringsopløsningen tilberedes ved at opløse 15 g 30 trichloreddikesyre i dobbeltdestilleret vand og tilsætte dobbeltdest i lieret vand op til et samlet rumfang på 100 28 DK 174962 B1 ml.

Farvningsopløsningen tilberedes ved at opløse 0,46 g Coomassie-blåt R 250 i 400 ml af den nedenfor omtalte 5 affarvningsopløsning. Den fremkomne opløsning opvarmes til 60°C og filtreres før brugen. Den ovenfor omtalte affarvningsopløsning tilberedes ved at tilsætte dobbeltdestil-leret vand til 500 ml ethanol op til et samlet rumfang på 1000 ml (opløsning I) og ved at tilsætte dobbeltdestil-10 leret vand til 8 ml eddikesyre op til et samlet rumfang på 1000 ml (opløsning II), hvorpå opløsningerne I og II sammenblandes i et blandingsforhold på 1:1 (volumenforhold) før brugen.

b) Til fremstillingen af to amfotere, lsoelektriske 15 "Immobiline"-membraner med pH 5,5, blandes 10,512 ml af en 0,2 M opløsning af "Immobiline" med pK 4,6 og 9,664 ml af en 0,2 M opløsning af "Immobiline" med pK 9,3 og fortyndes med dobbeltdestilleret vand til et samlet rumfang på 30,0 ml. pH-Værdien af den således fremkomne opløsning bestem-20 mes ved hjælp af et pH-meter til at være 5,5. Til den nævnte opløsning tilsættes 40,0 ml opløsning A (jf. det følgende), 1,5 ml "Ampholine" med pH 5-7, 96 μΐ TEMED, 120 μΐ opløsning B (jf. det følgende) og dobbeltdestilleret vand op til et samlet rumfang på 120,0 ml. Ovennævnte 25 opløsning A tilberedes ved at opløse 28,8 g acrylamid og 1,2 g N,N,-methylen-bis-acrylamid i dobbeltdestilleret vand og tilsætte vand op til et samlet rumfang på 100 ml. Ovennævnte opløsning B tilberedes ved at opløse 400 mg ammoniumpersulfat i 880 μΐ dobbeltdestilleret vand.

30 60,0 ml af den fremkomne opløsning fyldes i hvert af de nedenfor beskrevne 2 apparater (jf. c) og polymeriseres ved 50*C i 1 time.

c) Ovennævnte apparat, der anvendes til tilberedning af membranerne, omfatter en plade, der er fremstillet af DK 174962 B1 29 inaktivt materiale, f.eks. polytetrafluorethylen ("Teflon"®), som ikke eller kun i forsvindende grad hæfter til polymerisatet. På den nævnte plade anbringes en rund 5 hulskive 22, der adskilles fra pladen ved hjælp af en ring-pakning 23 med en diameter på 9 cm og en højde på 1 mm. Fig. 9 viser skiven set nedefra, fig. 10 skiven set ovenfra og fig. 11 er et snit efter linien XI-XI i fig. 9.

Den opløsning, der skal polymeriseres, fyldes gennem 10 hulskivens huller 24.

d) De membraner, der er fremstillet ved den ovenfor beskrevne procedure, indbygges derefter sammen med de som bærere fungerende hulskiver 22 i en cylinder med en indvendig diameter på ca. 9,5 cm og en højde mellem 15 membranerne på ca. 3 cm. Den nævnte cylinder er udstyret I

med et indløb 31 og et modsat over for indløbet beliggende udløb 30 for væskestrømningen 7, og anvendes som strøra-ningskammer 8. Dersom det ønskes, kan et milliporøst filter (8 μπι) fremstillet af celluloseacetat eller 20 6,6-polyamid ("Nylon"®) eller lignende, f.eks. et polypropylenfilter, anbringes mellem pH-membranerne 25 og 26 og væskestrømmen 7 for at forhindre, at det stof, der skal renfremstilles, f.eks. N-acetyl-Eglin C, kommer i direkte berøring med de isoelektriske membraner. Hele elektro-25 fokuseringsapparatet samles, idet den ovenfor omtalte cylinder med de indbyggede membraner erstatter strømningskammeret 8 og de immobiliserede pH-gradienter 5 og 12. Den nævnte cylinder anvendes fortrinsvis i vandret orientering med ind- og udløbet for væskestrømningen 7 30 orienteret lodret med udløbet øverst. Fordelen med denne vandrette orientering sammenlignet med den lodrette samling består i, at luftbobler fjernes spontant.

Fig. 12 er et længdesnit gennem apparatet i samlet tilstand. Et cylindrisk rør er af de ophængte pH-membraner 35 22 opdelt i katodekammeret 3, strømningskammeret 8 og anodekammeret 14. Katoden 2 og anoden 3 er gennem kontakt- 30 DK 174962 B1 stifter 32 forbundet med den her Ikke viste strømforsyningsenhed 1. Væskestrømmen 7 kommer Ind 1 strømnings-kammeret 8 gennem indløbet 31 og forlader kammeret gennem 5 udløbet 30. Elektrolytopløsningen 1 katode- og anodekamrene kan fornys gennem tilhørende indløb og udløb 27 henholdsvis 28. Apparatets forskellige dele holdes sammen ved hjælp af fire gevindbolte 29, der er ført gennem huller 33.

10 e) Det samlede elektrofokuseringsapparat "indkøres" i 1 time ved 500 V, 25 mA og 10 W i et koldt rum (5eC) med strømningskamre fyldt med væske, men uden den prøve af N-acetyl-Eglin C, der skal renses. Derpå tømmes strømningskammeret, og fyldes med den prøve, der skal renses.

15 f) 1 g af prøven indeholdende rekombinant DNA-N-acetyl-Egiin C (renhed 80%, tilberedt ifølge EP-ansøgning nr. 146.785) opløses i 100 ml 0,2% bsreamfolytter med pH 5-7 og cirkuleres (20 ml/min.) i det på forhånd fokuserede apparat uder 500 V konstant og 10 mA/5 W i et koldt rum 20 (5BC). Med tidsintervaller på 30 minutter udtages prøver på 10 μΐ og holdes ved 4BC til senere analyse. Forsøget afsluttes med den sidste prøveudtagning efter 5 timer. Prøveportionerne analyseres i en "Ampholine" PAG-plade med pH 3-5 til 9-5, 5% T, 3% C, 2,2% "Ampholine"-koncentra- 25 tion. Det vil kunne ses, at samtlige urenheder er fjernet efter 3 timers cirkulation.

Dersom det ønskes, kan opløsningerne i katode- og anodekammeret 3 henholdsvis 14 udpumpes til en afløbsledning ved en hastighed på f.eks. 5 ml/min. og regenereres fra 30 store lagertanke.

31 DK 174962 B1

Eksempel 5

Membraner med forskellig pufferkapacitet

Der tilberedes membraner, der er analoge med de 1 eksempel 5 4 beskrevne membraner med pi = 5,50, på en sådan måde, at de Indeholder en "Immobl line "-koncentration på 10 mM, 40 mM eller 100 mM.

Mens "membranerne" med 10 og 40 mM udviser korrekte elektroosmotiske egenskaber og giver nøjagtige 10 forsøgsværdler af pi, udviser overfladen med 100 mM en meget større spredning og unormale strømningsprofiler i det pH-område, der omgiver pi. Det forekommer således rimeligt at fastlægge en øvre molaritetsgrænse på ca. 50 mM for hvert "Immobiline"-stof i "membranen".

Claims (2)

32 DK 174962 B1 1. Elektroforetisk fremgangsmåde til isoelektrisk fokusering med henblik på separation og rensning af en 5 amfoter eller neutral kemisk forbindelse, der er opløselig i et til fremgangsmåden egnet opløsningsmiddel, fra en eller flere elektrisk ladede kemiske forbindelser, der er opløselige i det nævnte opløsningmiddel, hvilken fremgangsmåde udføres ved anvendelse af et elektroforetisk 10 apparat, hvori den elektriske strøm, der flyder gennem den elektroforetiske matrix, er forbundet med en væskestrøm, idet den nævnte elektriske strøms retning afviger fra den nævnte væskestrøms retning, hvilken væskestrøm omfatter en opløsning af den nævnte forbindelse i det nævnte opløs-15 ningsmiddel, idet den nævnte matrix opdeles i to dele, hvoraf den ene (5) eller (25) er beliggende ved katodesiden og den anden (12) eller (26) er beliggende ved anodesiden, kendetegnet ved, at den nævnte amfotere eller neutrale kemiske forbindelse holdes 1 en Isoelektrisk * 20 eller 'uladet tilstand inden i væskestrømmen (7), (8) og (11), og at den eller de nævnte ladede elektriske forbindelser fjernes fra væskestrømmen ved hjælp af den elektriske strøm til i det mindste én af de nævnte dele af den nævnte matrix eller gennem mindst én af de nævnte dele 25 til mindst ét af elektrolyt-opløsningsreservoirerne (3,14). 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der gås frem på en sådan måde, at de nævnte to dele indbyrdes uafhængigt repræsenterer immobiliserede 30 pH-gradienter (5) og (12), som begge udviser ledningsevne og både puffer- og titreringskapacitet inden for sine pH-intervaller, eller amfotere lsoelektriske immobil iserede pH-membraner (25) og (26), som begge udviser ledningsevne og både puffer- og titrerings-35 kapacitet ved en bestemt pH-værdi. 33 DK 174962 B1 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, a) at den elektriske strømning er forbundet med en væske-5 strømning, hvis retning afviger fra den elektriske strøms retning, b) at den ønskede amfotere eller neutrale kemiske forbin-delse holdes isoelektrisk eller uladet inden for væskestrømningen (7), (8) og (11), og 10 c) at de ladede kemiske forbindelser fjernes fra væskestrømmen ved hjælp af den elektriske strøm ind i mindst én af de immobiliserede pH-gradienter (5), (12) eller gennem disse til mindst én elektrolytopløsningsbeholder (3,14). 4. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 15 1-3, kendetegnet ved, at den anvendes til separation og rensning af en amfoter kemisk forbindelse fra en eller flere amfotere kemiske forbindelser, hvis lsoelektriske punkter afviger tilstrækkeligt fra det isoelektriske punkt for den ønskede forbindelse, som holdes isoelektrisk inden 20 for væskestrømmen. 5. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den anvendes til separation og rensning af en amfoter kemisk forbindelse fra et eller flere salte. 6. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at de salte, hvorpå fremgangsmåden anvendes, er salte af monovalente syrer og baser. 7. Fremgangsmåde ifølge krav 5, kendetegnet ved, at de salte, hvorpå fremgangsmåden anvendes, er salte af di- 30 eller multivalente syrer eller baser. 8. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-7, kendetegnet ved, at den anvendes på en kemisk forbindelse, der udgøres af et peptid, et protein eller en 34 DK 174962 B1 forbindelse, der indeholder en peptid- eller protein-del, som alle har et isoelektrisk punkt mellem pH 3 og 10. 9. Fremgangsmåde Ifølge krav 8, kendetegnet ved, at 5 den anvendes på en kemisk forbindelse, der udgøres af et peptid, et protein eller en forbindelse, der indeholder en peptid- eller protein-del, som alle har et isoelektrisk punkt mellem 5 og 9. 10. Fremgangsmåde ifølge krav 4, 8 eller 9, kende- 10 tegnet ved, at det isoelektriske punkt for den amfotere forbindelse, der skal renses, og det isoelektriske punkt for de uønskede amfotere forbindelser, der skal fjernes, afviger fra hinanden med mindst 0,001 pH-enheder. 11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at 15 de nævnte isoelektriske punkter afviger fra hinanden med mindst 0,05 pH-enheder. 12. Fremgangsmåde ifølge krav 10 eller 11, kende tegnet ved, at de nævnte isoelektriske punkter afviger fra hinanden med højst 0,2 pH-enheder. 13. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1-12, kendetegnet ved, at der anvendes en væskestrøm, der forløber vinkelret på den elektriske strøms retning. 14. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 1- 13, kendetegnet ved, at vsskestrømmens (7) retning er en 25 sådan, at luftbobler fjernes fra strømningskammeret (8). 15. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 2- 14, kendetegnet ved, at der anvendes immobiliserede pH-gradienter, som i deres pH-interval har både puffer- og titreringskapacitet, og som indeholder en mængde 30 amfolytter i det samme pH-interval, der er tilstrækkelig til at sikre den fornødne ledningsevne. 35 DK 174962 B1 16. Fremgangsmåde Ifølge et eller flere af kravene 2-15, kendetegnet ved, at der anvendes immobiliserede pH-gradienter og pH-roembraner med styret puffer- og titre- 5 ringskapacitet, pH-værdi og ledningsevne, der kan tilberedes på en reproducerbar måde. 17. Fremgangsmåde Ifølge et eller flere af kravene 1-16, kendetegnet ved, at den ønskede forbindelse holdes opløst i en vandig opløsning. 18. Fremgangsmåde ifølge et eller flere af kravene 4-17, kendetegnet ved, at der anvendes pH-gradienter eller pH-membraner, hvori de isoelektriske punkter i de mod strømningskammeret (8) vendende ender eller sider på anodesiden er lig med et eller en smule lavere end det 15 isoelektriske punkt for den amfotere kemiske forbindelse, der skal renses, og på katodesiden er lig med eller en smule højere end det isoelektriske punkt for den nævnte amfotere kemiske forbindelse, der skal renses. 19. Fremgangsmåde Ifølge et eller flere af kravene 20 4-18, kendetegnet ved, at væskestrømningens pH-værdi holdes på en værdi svarende til den ønskede forbindelses isoelektriske punkt. 20. Elektroforetisk isoelektrisk fokuseringsapparat til udøvelse af fremgangsmåden ifølge et eller flere af 25 kravene 4-19, kendetegnet ved et strømningskammer (8), der er direkte eller indirekte forbundet enten a) med to beholdere (5,12), som begge er egnet til at optage en immobiliseret pH-gradient, eller b) med to indretninger til optagelse af immobiliserede 30 pH-membraner (25,16), eller c) med en beholder ifølge a) og med en indretning ifølge b), idet af de nævnte beholdere eller Indretninger den ene med sin modsatte ende eller side er forbundet med anodekammeret (14) og den anden med sin modsatte ende 36 DK 174962 B1 eller side er forbundet med katodekanuneret (3). 21. Elektroforetisk apparat Ifølge krav 20 til isoelektrisk fokusering ved udøvelse af fremgangsmåden 5 Ifølge et eller flere af kravene 4-19, kendetegnet ved et strømnlngskammer (8), der er direkte eller Indirekte forbundet enten a) med to beholdere (5,12), som begge er fyldt med en lmmobillseret pH-gradlent med ledningsevne og både puffer- 10 og titreringskapacitet 1 sit pH-lnterval, eller b) med to amfotere isoelektriske Immobiliserede pH-mem-braner (25,26) med ledningsevne og både puffer- og titreringskapacitet ved en bestemt pH-værdi, eller c) med en pH-gradient ifølge a) og med en pH-membran 15 ifølge b), idet de isoelektriske punkter i de mod strømningskammeret (8) vendende sider eller ender på pH-gra-dienterne eller -membranerne på anodesiden er lig med eller en smule lavere end det isoelektriske punkt for den amfotere kemiske forbindelse, der skal renses, og på 20 katodesiden er lig med eller en smule højere end det isoelektriske punkt for den nævnte amfotere kemiske forbindelse, der skal renses, af hvilke pH-gradienter eller pH-membraner den ene ved sin modsatte ende eller side er forbundet med anodekammeret (14) og den anden 25 pH-gradient eller pH-membran ved sin modsatte ende eller side er forbundet med katodekammeret (3). 22. Elektroforetisk isoelektrisk fokuseringsapparat ifølge krav 20 til udøvelse af fremgangsmåden ifølge et eller flere af kravene 4-19, kendetegnet ved et 30 strømningskammer (8), der er forbundet med to beholdere (5,12), som begge er fyldt med en immobiliseret pH-gradient, af hvilke gradienter den ene ved sin med strømningskammeret (8) forbundne ender eller sider har et isoelektrisk punkt en smule lavere end det isoelektriske 35 punkt for den amfotere kemiske forbindelse, der skal renses, og ved sin anden ende eller side er forbundet med 37 DK 174962 B1 anodekammeret (14), idet den anden pH-gradient ved sin med strøinningskammeret (8) forbundne ende eller side har et isoelektrisk punkt en smule højere end det isoelektriske 5 punkt for den nævnte amfoteriske kemiske forbindelse, der skal renses, og ved sin modsatte ende eller side er forbundet med katodekammeret (3). 23. Apparat ifølge krav et eller flere af kravene 20-22, kendetegnet ved, at strømningskammeret (8) gennem 10 en pumpe (9) er forbundet med en prøvebeholder (11). 24. Apparat ifølge et eller flere af kravene 20-23, kendetegnet ved en indretning til at holde pH-gradien- terne og prøven ved en konstant temperatur. 25. Apparat ifølge et eller flere af kravene 20-24, 15 kendetegnet ved mindst én eller ét af følgende indret ninger eller udstyr: a) en indretning til måling og styring af pH-værdi, b) en indretning til overvågning af elektrisk ledningsevne, 20 c) et biosensorisk affølingsudstyr, d) et immuno-elektroforetisk udstyr, e) et laser-anslået fluorescens-påvisningsudstyr, f) et robotisk koblet udstyr, g) en indretning til overvågning af radioaktive isotoper, 25 og h) en indretning til overvågning af prøveopløsningen i det ultraviolettte eller synlige område eller ved fluorescens. 26. Apparat ifølge et eller flere af kravene 20-25, 30 kendetegnet ved en indretning til mekanisk understøtning af pH-gradient-gelen i beholderne (5,12) eller gelen i pH-membranerne. 27. Apparat ifølge et eller flere af kravene 20-26, 38 DK 174962 B1 kendetegnet ved. at det kun omfatter 2 - to pH-membraner. 28. Apparat ifølge et eller flere af kravene 20-26 og 5 egnet til samtidig rensning af to amfotere eller neutrale forbindelser, kendetegnet ved to særskilte strømningskamre (8a, 8b), der er adskilt fra hinanden ved en mellemliggende immobiliseret pH-gradient (20) eller en / eller to pH-membraner. 29. Apparat ifølge et eller flere af kravene 20-28, kendetegnet ved en sådan orientering, at væskestrømmen (7) fjerner luftbobler fra strømningskammeret (8). 30. Apparat ifølge et eller flere af kravene 21-29, kendetegnet ved, at de immobiliserede pH-gradienter og 15 pH-membraner har styret puffer- og titreringskapacitet, pH-værdi og ledningsevne, og kan tilberedes på en reproducerbar måde. 31. Apparat ifølge et eller flere af kravene 21-30, kendetegnet ved, at de immobiliserede pH-gradienter og 20 pH-membraner har styret puffer- og titreringskapacitet og indeholder amfolytter i en til opnåelse af den fornødne ledningsevne tilstrækkelig mængde. 32. Apparat ifølge et eller flere af kravene 20-31, kendetegnet ved Indløb (27) og udløb (28) til fornyelse af 25 elektrolyt-opløsningerne i katode- og anodekamrene (3,14). DK 174962 B1 i »A i ' \ ^T\ JUn.i ___/ DK 174962 B1 a~i|-------τι u τή—i 2-H i ! 1—~,r----T.-Jl I I i I I I 1 -ί π-π I I _ I ““l------Γ J i i i 1 1 ^=8 18 H^Tj j-b^ ™ i \v ^4j iJ^'9 ___ 7 l>j»' ^ ^ rj/ZT^^^^r Λ ’-I j:; m fli Vi (r-t^-r L \ ! n"^*l ' !„ X I t^n !13 ! i ! ! 9..J ! V------------------v I_ DK 174962 B1 Θ α I I åtia: 3 j_j. -i" ^ 20. i \\ 7bN // J) I , g 5 —^ Z— i 7b i \—11b i \—11a i—ή w;M////bsM///. =f=F I i I ! I r2

1 I Θ _1 DK 174962 B1 © ® g~' il ;i 5, ^ ! | ^-p-—12 1 i ! < I I π-1 — i-Π V I I 1 I V s I I X ZZZl ill! ίΖΖΖ; S___! !__! ___ί s Li_l) u_U ' !-----------! i----------i s ( ' 8 ttial 4· _ y ♦ to- Δ --*-Λ—Δ—*---*-Δ— 30- oV 20- Ν. \. ° ,0- °\^π ^ Τ Τ I I-1-1-1 02 k 6 Β 10 12 yo-ι __________ Δ— 2- ^ 1 6~ / Δ β- / / Δ 10- </ \ο β- ^ 6- Ο-U---,-°~Τ 0 1 y 50- δ ^*Δ to- \ 'δ 30- \ Miia'· 1 'δ 20- \ 10 - Δν ο -L,-,-—.............Δ—= Ο 1 πΑ Γ Ν V t ' $ , ) 3 ^ ^ J&g.a τνπτ.α ___—“ / Ο u / /XXXJS Ο θ1 L·// y^n0^000°°OoCi0o \ Χ\\Λ Α^/η00θΟΟΟο ///^WXofo°o °SX° ο / /ο°ο0ο°0 ° 0 c //// 0Α0Λ°Ο ο ° ° ο Ο°ο °Λο Χ/\\ \ / // ο ουο°η0οοο /// / °Λ°η°Λθ θΟ°Οθ On0n0o<V\ \\ \ / / / Ο Ο Ο ο °00 Ο Or / /ί /θ°0 ° °°0°0 °<Χθ° °°° ΟΟ0 Ο ο\ \\\ / / /Ο0ο0ο0ο0ο0οθθ°ο( I // 'SS§i^%lSo^/o0^o\\\ / / /ο00°ο0ο0ο0ο0ο°ο0ο°ο°0° J_ ί |[ i oo0åooO°o0ooooo%°°oo°\ III I (o°°^ooO°°0oo°C \\\ 1°°¾°°°¾ 11¾¾¾°°¾¾ \%κ \°ο°οΡοοοοθ0ο οyWAC^ \ \\ο0°ο θοοοο \ VV X OqO° ° ° Ο ο °υX x/y \ \\°0ο°0000' \χ X Ο,ιροοθ°χ ΧΧ/ \ \X°OoooC --------^ Xy \ __

/“ /2 -Λάα' ___b κι ri-am wfora fj κι fj κι κπττΚΧ] ρΡΤΊ hin'.ii 23 V ΗΖΖΛ f 33*y C .1.(.1. „ 1 TfllJ /VV^'33 'y7^ / /y/ η-τι 27 ^11^30 ιττ| yy7 y=n= i=^i =n=^ θ vy r'2‘ 22y z ~LLj< /EM-. ‘ 22-^ j s_Visa/ τν/Γ · j-__22 i 1 ' pv ” y r - -1 ry ^ 33v/y/· ijf^i iTjl^r y i =ng ~kie:i2 33