CN1051245C - 制备型等电点电泳分离方法及设备 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于分离蛋白质不同组分的制备型等电点电泳分离方法和分离设备，属生物化工技术领域。本方法是在二个平行的窄长电极之间，沿长度方向设置凝胶膜，将电极间的空间分成中间的分离室和两侧的冲洗室。分离室中通入pH调至目标产品等电点(pI值)的待分离样品液，冲洗室中通入pH为目标产品等电点普通缓冲液，在电场作用下等电点与目标产品相异的杂蛋白迁移入两侧的冲洗室而被洗出，从而实现了分离。

Description

制备型等电点电泳分离方法及设备

本发明涉及一种用于分离两性生物物质(如蛋白质、多肽)的制备型等电点电泳分离方法，属于生物化工技术领域。

在已有技术中，有一种多腔室的等电聚焦装置，名称为“多腔室电泳装置中的等电聚焦”，出自一篇由玛茨·乔纳森(Mats.Jonsson)和哈里·黎泊(Harry.Rilbe)所写的名为“Large-scale fracitionationof proteins by isoelectric focusing in a multi-compartment electrolysisapparatus”的论文，发表于《电泳》杂志1980年第一期第3页到第14页(Electrophoresis，1，P3-14(1980))。该技术利用载体两性电解质溶液形成的连续的pH梯度场为背景，蛋白质根据各自等电点的不同在相应的pH背景下聚焦而得以分离，并提出了相应的分离设备。其核心部分为一个长圆柱形电泳槽，由相隔一定间距的隔膜将其分隔为数十个腔室，如附图一所示：分离前，将载体两性电解质溶液与待分蛋白质样品均匀混合后注入各腔室中；分离时，在电泳槽的两端加直流电压，载体两性电解质在电场作用下发生电迁移，形成由正极到负极pH值逐渐升高的梯度，蛋白质在相异于其等电点的pH环境中不能保持电中性，因而在电场作用下发生电泳迁移，穿过隔膜，在相当于其等电点的pH值的腔室中聚焦，电泳产生的热量通过一套复杂的内循环冷却***带走，这样经过相当长的时间(2-3天)后，聚焦结束，具有不同等电点的蛋白相互分开在不同的腔室中；最后打开各腔室的样品出口，分别收集样品液，在某一个或与之相邻的几个腔室中就得到纯化了的目标蛋白质组分。

该技术的缺点是：(1)需要大量价格昂贵的载体两性电解质，另外在后续处理中还需通过透析等方法除去目标组分样品中混杂的载体两性电解质，使分离的成本很高；(2)由于蛋白质的迁移距离很长，电极间距大，而提高场强又受到装置的换热能力的限制，造成该法分离时间过长，处理量较低。

在已有技术中，还有一种多腔室的循环流动等电聚焦装置，名称为“使用非载体两性电解质缓冲剂的等电聚焦”，出自一篇由皮埃尔·温格尔(Pierre.Wenger)和菲里蒲·杰夫特(Philippe.Javet)所写的名为“Isoelectric focusing using non-amphoteric buffers in freesolution：II.Apparatus and measures of pH stability”的论文，发表于《生物化学和生物物理方法》杂志1986年第13期第275页到第287页(Journal of Biochemical and Biophysical Methods，13，P275-287(1986))。该技术采用多腔室的循环流动的形式，利用简单缓冲液(不含载体两性电解质)在电场作用下形成的pH梯度作为等电聚焦的背景，用以分离氨基酸和蛋白质，并提出了相应的分离设备。如附图二所示：1 为一个多腔室的电泳槽，2 为织物支撑的琼脂糖凝胶膜，3为离子交换膜，4 为换热器，5 为电极液贮槽，6 为缓冲液贮槽。凝胶膜和离子交换膜将电泳槽分隔成相互平行的若干腔室和二个电极室，在电极室中通入电极液，中间的各腔室中通入醋酸—醋酸钠缓冲液，电极液和缓冲液都在相互独立的通路中循环，在电泳槽的两侧加载直流电压，在电场作用下，缓冲液中的一部分离子发生电泳迁移，通过凝胶膜和离子交换膜进入邻近的腔室，经过一段时间后，各腔室的pH值发生变化，形成从阴极到阳极逐渐升高的pH梯度，并使用此pH梯度作为等电聚焦的背景。

该技术的缺点是：(1)形成的pH梯度不够稳定，各腔室的pH值容易发生漂移，很难用简便的方法校正每一个腔室的pH值；(2)其分离精度的提高受腔室数目的制约，过多的腔室数目将给操作带来极大的不便，所以只能用于粗分，难以分离等电点接近的样品。

本发明的目的是提出一种新型电泳分离方法，应用等电聚焦的原理，使用简单缓冲液来形成一个稳定的单一pH值，而不是一个稳定的pH梯度作为分离的背景，其目的是分离一个目标产品而不是一系列产品。

本发明的目的是这样实现的：在垂直放置的二个相互平行的窄长电极之间，沿电极的长度方向平行设置二张到四张凝胶膜，它们将电极之间的空间分隔成三到五个相互平行的腔室，中间的腔室为分离室，分离室的两侧为冲洗室，分离进行时，分离室内通入pH值调至目标蛋白质的等电点(pI值)的待分离的样品液，两侧冲洗室中通入pH值等于目标蛋白质等电点且电导小的缓冲液，两电极之间加载恒定的直流电压。

下面结合附图，详细介绍本发明的内容。

附图三是制备型等电点电泳分离方法原理图。

图中7为电极，8为凝胶膜，9为通入的样品液，9a为分离室，10为通入的缓冲液，10a为冲洗室，11为目标蛋白质，12为等电点(pI值)大于目标蛋白质的等电点的杂蛋白，13为等电点(pI值)小于目标蛋白质的等电点的杂蛋白。

其分离过程是：分离室9a通入pH值调至目标蛋白质的等电点(pI值)的待分离的样品液，冲洗室10a通入pH值等于目标蛋白质等电点的缓冲液，两电极7之间加载恒定的直流电压。在这样的pH值条件下目标蛋白质分子11(附图三中以小园圈表示)总体上呈电中性，因此在电场作用下不发生电泳迁移；而其它等电点与目标蛋白有差别的杂蛋白在此条件下则带正电荷或负电荷，等电点(pI值)大的蛋白12带正电(附图三中以三角形表示)，等电点小的蛋白13带负电(附图三中以小黑方块表示)，在电场作用下，必然发生电泳迁移，它们分别穿过分离室两侧的凝胶膜进入两侧冲洗室，从而实现了与目标蛋白质的相互分离。

本发明的目的也可以这样实现：在垂直放置的二个相互平行的窄长电极之间，沿电极的长度方向平行设置二张凝胶膜，在凝胶膜的外侧设置二张离子交换膜，从而将电极之间的空间分隔成五个相互平行的腔室，中间腔室为分离室，与分离室相邻的两个腔室为冲洗室，靠近电极的两个腔室为电极室，分离进行时，分离室内通入pH值调至目标蛋白质的等电点的待分离的样品液，两侧冲洗室中通入pH值等于目标蛋白质等电点且电导小的缓冲液，电极室内通入电极液，两电极之间加载恒定的直流电压。

本发明使用普通缓冲液，如三羟甲基氨基甲烷—廿氨酸、三羟甲基氨基甲烷—醋酸、醋酸—醋酸钠等，浓度为0.005-0.1摩尔/升；分离室的流速为100-1000毫升/小时，冲洗室的流速为200-2000毫升/小时；所用的凝胶膜的厚度为0.2-2毫米；电极之间的电压为20-500伏，电流强度不高于100毫安，在此范围内，可以适当调整电极电压。

在本发明原理的基础上，设计了制备型等电点电泳的设备，其核心部分都为电泳槽。

附图四是制备型等电点电泳的三腔室电泳槽的装配示意图。

上图为平视图，下图为顶视图，图中14为分离室，15为冲洗室，16为分离室腔室框，17为冲洗室腔室体，18为凝胶膜，19为导管，20为用有机玻璃粘制而成的夹紧装置，21为电源插座，22为用来固定腔室体的六角螺栓。

四个螺栓用来固定腔室体17、腔室框16和凝胶膜18以围成三个四周封闭的腔室，中间为分离室14，两侧为冲洗室15，分离室和冲洗室上下都有供样品液和缓冲液出入的导管，铂丝电极放在冲洗室内，并与电源插座连接，电泳槽易于拆卸和组装，以便于更换凝胶膜和加装组件。

附图五是电泳槽的腔室体和腔室框示意图。

23为分离室腔室框，24、25为两侧冲洗室腔室体(二者左右对称)，26为用来加装电源插座的通孔，27为铂丝电极，28为聚四氟乙稀导管，腔室体用有机玻璃等绝缘材料制成。

附图六是制备型等电点电泳的五腔室电泳槽的结构示意图

图中29为凝胶膜，30为离子交换膜，31为电极，32为分离室，33为冲洗室，34为阳极室，35为阴极室，36为样品液，37为缓冲液，38为阳极电极液，39为阴极电极液。

如附图六左图所示，操作时，分离室32内通入pH值等于目标组分等电点的样品液，冲洗室33内通入pH值等于目标组分等电点的缓冲液，阳极室34内通入阳极电极液，阴极室35内通入阴极电极液。

由于使用离子交换膜和电极液比较复杂，为方便起见也可以采用附图六右图中所示的结构，四张膜都采用凝胶膜，两侧电极室中通入与冲洗室相同的缓冲液，也能起到较好的稳定pH值的效果。

附图七是制备型等电点电泳的五腔室电泳槽的装配示意图(只画出了平视图)

用螺栓固定腔室体、腔室框、凝胶膜和离子交换膜围成五个四周封闭的腔室，中间为分离室，分离室的两侧为冲洗室，最外的两侧电极室(阳极室和阴极室)。每个腔室的上下都有供液体出入的导管，铂丝电极放在电极室内，并与电源插座连接。

在以上介绍的电泳槽的基础上，设计了一系列的制备型电泳分离设备。下面逐一介绍：

附图八是制备型等电点电泳三腔室的工作情况的流程示意图。

40为电泳槽，41为换热器，42为活性炭吸附柱，43为夹套冷却缓冲液贮槽，44为夹套冷却样品液贮槽，45为多组恒流泵(图中以一个示意)，46为磁力搅拌器，47为直流恒压电源，48为带制冷的恒温循环器。进行电泳分离时，两个冲洗室内的铂丝电极上通上恒定的直流电压；样品液通过恒流泵45的驱动从样品液贮槽44进入电泳槽的分离室40a，在电泳槽中，杂蛋白在电场作用下通过凝胶膜迁移到两侧的冲洗室40b中，从两个冲洗室流出的缓冲液相互混合，经过换热器41换热后进入活性炭吸附柱42吸尽杂蛋白，返回缓冲液贮槽43，再由恒流泵送入冲洗室重复使用；经过分离的样品液从电泳槽的分离室40a流出，经过换热器41进入样品液贮槽44，再经恒流泵的驱动进入电泳槽的分离室，如此循环反复直获得合格的目标蛋白质产品；由恒温循环器48产生的低温循环水(0-10℃可调)，在换热器和各贮槽中给缓冲液和样品液以充分的冷却，保证了生物物质的活性；多组恒流泵45驱动缓冲液和样品液分别以设定的流量循环流动；另外还有pH电极(图中略去)检测样品液贮槽和缓冲液贮槽中的pH值的变化情况，在经过长时间后，样品液贮槽和缓冲液贮槽的pH值会略有变化，此时可以滴加pH缓冲液调整。

当所使用三张凝胶膜和四张凝胶膜(分别构成四腔室和五腔室)的电泳槽时，所使用的工作流程与上面所述的三腔室电泳槽的流程基本相同。

附图九是制备型等电点电泳五腔室的工作情况的流程示意图

49为五腔室电泳槽，50为阳极电极液贮槽，51为阴极电极液贮槽，52为换热器，53为活性炭吸附柱，54为夹套冷却缓冲液贮槽，55为夹套冷却样品液贮槽，56为多组恒流泵(图中以一个示意)，57为磁力搅拌器，58为直流恒压电源，59为带制冷的恒温循环器。样品液在样品液贮槽55和电泳槽分离室49a之间循环，缓冲液在缓冲液贮槽54和电泳槽冲洗室49b之间循环，电极液在电极室49c和电极液贮槽50、51之间循环。

需要说明的是，附图八、九是等电点电泳装置三腔室和五腔室典型的工作情况，适合于目标产物比较稳定，在样品液中含量不是很稀的情况。在实际应用中，有时会遇到非常易失活的产品以及大量的稀浓度样品，可以采用单程的操作方式，如附图十所示，为简便起见只画出由三腔室电泳槽构成的工作流程。

附图十是适合于易失活样品和大量稀浓度样品情况的等电点电泳工作流程。

60是电泳槽(为简便起见只画出了三腔室的情况)，61是夹套冷却样品液贮槽，62为夹套冷却缓冲液贮槽，63是夹套冷却样品液收集槽，64为换热器，65为活性炭吸附柱，66为多组恒流泵(图中以一个示意)，67为磁力搅拌器，68为直流恒压电源，69为带制冷的恒温循环器。

当电泳进行时，样品液在经过电泳槽60后不返回样品液贮槽61，而是进入样品液收集槽63，当样品液贮槽61的样品液全部通过电泳槽60后，就完成了一个单程的操作。此时，将样品液收集槽63中的样品液转移回样品液贮槽61，便可进入下一个单程分离过程，经过几次单程后(一般为2-4次)，就可以完成分离。这种操作方式总的分离时间可以大大缩短，更利于保证生物样品的活性，但操作要比循环操作要略微复杂。

当采用三张凝胶膜、四张凝胶膜的电泳槽时，其流程与上面二张凝胶膜的工作流程相同。当采用使用离子交换膜的电泳槽时，其流程基本相同，所不同点在于增加两个电极液贮槽，电极液在电泳槽的电极室和电极液贮槽之间循环。

由于等电点电泳进行过程中，仍有少量的目标产品通过扩散等作用通过凝胶膜进入冲洗室，所以对于分离价值很昂贵的样品，为最大限度的提高收率，设计了可回收目标产品的操作流程。

附图十一是等电点电泳的可回收操作流程图

70为电泳槽，71是夹套冷却缓冲液贮槽，72是缓冲液收集槽，73为换热器，74为夹套冷却样品液贮槽，75为多组恒流泵(图中以一个示意)，76为磁力搅拌器，77为直流恒压电源，78为带制冷的恒温循环器，79是恒流泵，80是离子交换层析柱，81是梯度混合器，82是自动部分收集器。

在这种操作流程中，冲洗室的出口的缓冲液不返回原来的缓冲液贮槽71，另外用一个缓冲液收集槽72收集。然后对这部分缓冲液进行离子交换柱层析，少量通过扩散作用进入冲洗室的目标产品可以被离子交换柱80吸附，当离子交换柱吸附接近饱和时，进行梯度洗脱，收集洗脱液中包含目标产品的洗脱组分，调整pH值和电导后(可用透析法)，再次进行等电点电泳。

当采用三张凝胶膜、四张凝胶膜的电泳槽时，其流程与上面二张凝胶膜的工作流程相同的。当采用使用离子交换膜的电泳槽时，其流程基本相同，所不同点在于增加两个电极液贮槽，电极液在电泳槽的电极室和电极液贮槽之间循环。

本发明的效果是由于分离过程中利用简单缓冲液形成一个稳定的pH点(而不是一个过续的区带)来作为等电聚焦所必需的pH背景，既降低了成本又避免了对产品引入新的污染。与传统的多腔室等电聚焦相比，其分离精度的提高不是靠增加腔室的数目来实现，而是采用少数的几个腔室(一般为三到五个)，就可以完成较高精度的分离；分离过程中电场方向与冲洗载流的方向相互垂直，可以通过缩短电极之间的距离，在低电压条件下产生高的电场强度，加快了组分迁移速度，缩短了电迁移的路径，减小了电泳热效应，总体上提高了分离的效率；而且结构简单，易于进行规模放大。

通过对牛血红—牛血清模式蛋白混合物和尿激酶、白细胞介素-6等实际体系的分离实验，证明了制备型等电点电泳可以快速、高精度的分离目的样品。

下面介绍本发明的几个实施例。

实施例1：

用等电点电泳的典型流程分离模式蛋白混合物

1 冲洗室缓冲液：醋酸—醋酸钠(0.01摩尔/升)

2 分离室样品液：

   含牛血红蛋白1毫克/毫升、牛血清蛋白1毫克/毫升，用

   0.01摩尔/升醋酸—醋酸钠配制

3 凝胶膜厚度：1毫米

4 操作    附图八所示流程

   电极电压：100伏    电流强度：小于100mA

   流量：分离室200毫升/小时，冲洗室200毫升/小时

5 结果：

   缓冲液pH值为4.83(牛血清等电点)时，获得纯度为98％

   的牛血清蛋白，收率92％；缓冲液pH值为6.90(牛血红等

   电点)时，获得纯度为95％的牛血红蛋白，收率大于90％。

   处理量100毫克蛋白/小时

实施例2：

用等电点电泳的典型流程分离模式蛋白混合物

1 冲洗室缓冲液：醋酸—醋酸钠(0.1摩尔/升)

2 分离室样品液：

   含牛血红蛋白1毫克/毫升，含牛血清蛋白1毫克/毫升，用

   0.1摩尔/升醋酸—醋酸钠配制

3 凝胶膜厚度：0.2毫米

4 操作    附图八所示流程

  电极电压：20伏    电流强度：小于100mA

流量：分离室100毫升/小时，冲洗室5000毫升/小时5结果：

缓冲液pH值为4.83(牛血清等电点)时，获得纯度为88％

的牛血清蛋白，收率71％；缓冲液pH值为6.90(牛血红等

电点)时，获得纯度为79％的牛血红蛋白，收率60％。处理

量20毫克蛋白/小时实施例3：用等电点电泳的五腔室流程分离模式蛋白混合物1冲洗室缓冲液：醋酸—醋酸钠(0.01摩尔/升)2分离室样品液：

含牛血红蛋白0.5毫克/毫升，含牛血清蛋白0.5毫克/毫

升，用0.01摩尔/升醋酸—醋酸钠配制3凝胶膜厚度：2毫米4阴、阳离子交换膜：0.5毫米5操作    附图九所示流程

电极电压：350伏    电流强度：小于100mA

流量：分离室500毫升/小时，冲洗室1000毫升/小时；阳极

室0.05摩尔/升的硫酸溶液，300毫升/小时；阴极室0.1

摩尔/升的氢氧化钠溶液，300毫升/小时6结果：

缓冲液pH值为6.90(牛血红等电点)时，获得纯度为95％

的牛血红蛋白，收率大于95％。处理量50毫克蛋白/小时实施例4：用可回收流程分离白细胞介素-61电极电压：155伏2冲洗室缓冲液：三羟甲基氨基甲烷—柠檬酸(pH＝5.65，0.01摩尔/升)3分离室样品液：

经过粗分的白细胞介素-6包函体破碎液，其中白细胞介

素-6含量约0.22毫克/毫升，用三羟甲基氨基甲烷—柠

檬酸(pH＝5.65，0.01摩尔/升)透析平衡4凝胶膜厚度：1.5毫米5操作    附图十一回收操作流程

电极电压：155伏     电流强度：小于100mA

流量：分离室300毫升/小时，冲洗室500毫升/小时6回收：

离子交换柱：DEAE-Sephadex A-50阴离子交换剂

回收样品电泳：电极电压140伏，分离室流量400毫升/小

时，冲洗室流量2000毫升/小时7结果：

将第一次的样品和回收样品混合后，取样进行SDS-聚丙

烯酰胺电泳分析，与标准品对照，没有杂质谱带检出。总蛋

白收率大于80％实施例5：单程操作分离尿激酶1冲洗室缓冲液：

三羟甲基氨基甲烷—甘氨酸(pH＝8.60，0.02摩尔/升)2分离室样品液：

尿激酶半精品(比活为4000活力单位/毫克蛋白)，用三羟

甲基氨基甲烷—甘氨酸(pH＝8.60，0.02摩尔/升)透析平

衡3凝胶膜厚度：1.5毫米4操作     附图十单程操作流程

电极电压：180伏    电流强度：小于100mA

流量：分离室200毫升/小时，冲洗室500毫升/小时

四次单程操作5结果：

获得比活大于40000活力单位/毫克蛋白的尿激酶精品，活

性收率为32％实施例6：单程操作分离尿激酶1冲洗室缓冲液：

三羟甲基氨基甲烷—甘氨酸(pH＝8.60，0.005摩尔/升)2分离室样品液：

尿激酶半精品(比活为4000活力单位/毫克蛋白)，用三羟

甲基氨基甲烷—甘氨酸(pH＝8.60，0.005摩尔/升)透析平

衡3凝胶膜厚度：1.5毫米4操作    附图十单程操作流程

电极电压：500伏     电流强度：小于100mA

流量：分离室1000毫升/小时，冲洗室1000毫升/小时

三次单程操作5结果：

获得比活大于20000活力单位/毫克蛋白的尿激酶产品，活

性收率为40％

Claims (14)

1、一种用于制备型的等电点电泳分离的电泳槽，其特征是在电泳槽的腔室体内，垂直设置两个窄长的电极；在所述的两个电极之间，沿电极长度方向平行设置凝胶膜；所述的凝胶膜将所述电极之间的空间分隔成几个相互平行的腔室，中间的腔室为分离室，在分离室内，通入pH值调至目标蛋白质的等电点的待分离样品液；在分离室的两侧为冲洗室，在冲洗室内，通入pH值等于目标蛋白质等电点且电导小的缓冲液；在所述的两电极之间，加载恒定的直流电压，电极所在的腔室，为阴(阳)极室。

2、按权利要求1的电泳槽，其特征是在凝胶膜的外侧，设置离子交换膜，从而将电极之间的空间分隔成相互平行的腔室，中间腔室为分离室，与分离室相邻的两个腔室为冲洗室，靠近电极的两个腔室为电极室(阴或阳极室)。

3、按权利要求1或2的电泳槽，其特征是所述的凝胶膜为2～4张，其每张的厚度为0.2～2毫米。

4、按权利要求2的电泳槽，其特征是等离子交换膜为阴离子交换膜和/或阳离子交换膜。

5、按权利要求1或2的电泳槽，其特征是腔室为3～5个。

6、一种制备型的等电点电泳分离方法，其特征是利用权利要求1～4之一的电泳槽，该方法包括如下步骤：

(1)将pH值调至目标蛋白质的等电点的待分离样品液通入分离室；

(2)将pH值等于目标样品蛋白质等电点且电导小的缓冲液通入冲洗室；

(3)将电极液通入电极室内；

(4)两电极之间加载恒定的直流电压。

7、按权利要求6的电泳分离方法，其特征是缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷—甘氨酸、三羟甲基氨基甲烷—醋酸、醋酸—醋酸钠溶液的一种。

8、按权利要求6的电泳分离方法，其特征是通入分离室的待分离样品液的流速为100～1000ml/分。

9、按权利要求6的电泳分离方法，其特征是通入冲洗室的缓冲液的流速为200～2000ml/分。

10、按权利要求6的电泳分离方法，其特征是缓冲液的浓度为0.005～0.1摩尔/升。

11、按权利要求6的电泳分离方法，其特征是施加于电极间的电压为20～500伏，电流强度为小于100毫安。

12、按权利要求6的分离方法，其特征是样品液为含牛血红蛋白、牛血清蛋白的液体。

13、按权利要求6的电泳分离方法，其特征是样品液是经过粗分的白细胞介素-6包函体破碎液，其中白细胞介素-6含量为约0.22克/毫升。

14、按权利要求6的电泳分离方法，其特征是样品液为尿激酶半精品，其比活为4000活力单位/毫克蛋白。

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