JPS63263457A - 等電点電気泳動法及びそのための装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕　　　　・ 本発明は、使用される実験条件下でＯの正味荷電を有す
るか又は中性である化合物、例えばペプチド及び蛋白質
を前記と同じ実験条件下で正味荷電を有する他の両性又
は非両性化合物、例えば他のペプチド、蛋白質及び／又
は塩から電気泳動により、特に分取用等電点電気泳動に
より分離するための新規且つ発明的な方法、並びにこの
方法を実施するための新規な手段、すなわち装置に関す
る。

〔従来の技術〕

分取用電気泳動は既知の技法であり、そして分析及び分
取の両目的のために種々の形の電気泳動装置が提案され
ている。基本的には、分取用電気泳動のための装置及び
原理は、用いられる電気泳動装置に従って４つの主たる
クラスに分類することができる（Ａ、Ｔ、＾ｎｄｒｅｗ
ｓ＋　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　：Ｔｈｅｏｒ
ｙ、　Ｔｈｃｈｎｉｑｕｅｓ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　ａｎｄ　Ｃ１ｉ−ｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌｉ
ｃａｔｉｏｎｓ、　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　
、オックスフォード、１９８６）　。

ａ）ディスク電気泳動、 ｂ）フリー・カーテン電気泳動、 Ｃ）等速電気泳動、及び ｄ）等電点電気泳動（Ｐ、Ｇ、Ｒｉｇｈｅｔｔｉ、　ｌ
５ｏｅｌｅｃ−ｔｒｉｃ　Ｆｏｃｕｓｉｎｇ　：　Ｔｈ
ｅｏｒｙ＋　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ　ａｎｄＡｐｐｌ
ｉｃａｔｉｏｎｓ、　ｔ！１ｓｅｖｉｅｒ、アムステル
ダム、２０４−２０７頁（１９８３）を参照のこと〕。

一般にディスク電気泳動及び等速電気泳動は、親水性マ
トリクス中で連続的に（アガロース及びポリアクリルア
ミド）又は非連続的に（顆粒ベッド、例えばセファデッ
クス）行われる。これらは高い分離能により、しかし低
い許容サンプル負荷量により特徴付けられる。フリーカ
ーテン電気泳動は一般に連続緩衝液を使用し、自由液相
中で行われ、そしてサンプルの連続的導入を伴う連続流
薄層の緩衝液により特徴付けられる。基本的にこの技法
は大きなサンプル取扱い容量を提供するが、しかし分離
能は低い、さらに、蛋白質の一層高い拡散定数のため、
この方法はほとんど、無傷の細胞又は細胞下オルガネラ
の精製に限定される。

等電点電気泳動（ＩＥＦ）は液体支持体中で（密度勾配
）又はゲル媒体中で、連続的に又は顆粒を用いて行うこ
とができる。実際に、ＩＥＦの技法はシェークロース密
度勾配を充填された垂直ガラスカラムを用いて分取法と
して開始された。

中程度に高いサンプル負荷量を高分離能を伴って（Δｐ
Ｉ−０．０２ｐＨ単位：ｐｌ＝等電点）取扱うことがで
きるが、この分離能は、底部回収漏斗を介するカラムを
用いる場合には非常に失われる。この技法は今日実際に
実質的に放棄されている。粒状支持体（はとんどアガロ
ースマトリクス及びポリアクリルアミドマトリクス）に
よるＩＥＦが便利であるからである。後者は高い分離能
を許容するが、しかし蛋白質の負荷は中程度に過ぎない
。

さらに、対流防止媒体として親水性ゲルを用いるすべて
の分取技法は精製された蛋白質をマトリクスから回収す
る場合の問題点を有する。これは追加の取扱い段階例え
ば注目のゾーンの検出、バンドの切り出し、及び拡散に
よる溶出又は電気泳動的回収を必要とする。これは２つ
の大きな欠点、すなわちａ）低い回収率（いずれのマト
リクスも蛋白質を不可逆的に吸着する傾向があるため）
；及びｂ）ゲル材料からの汚染の可能性（特にポリアク
リルアミドのごとき合成支持体の場合、未反応モノマー
、及びバルクマトリクスに非−共有結合的にグラフトさ
れた短いオリゴマーポリアクリルアミドコイルからの汚
染）、を有する。

〔発明が解決しようとする課題〕

この発明は、ペプチドがそうである様に使用される条件
下で等電点を有し又は荷電されていない化合物の電気泳
動による精製方法を提供するための研究に基礎を置いて
おり、この方法においては目的の生成物ではなく不所望
の副生成物及び汚染物のみがマトリクスと接触し、そし
てこの方法は非常に純粋な形の目的生成物の卓越した収
量をもたらす。

この研究それ自体の概観及びその解決策の両者が発明的
段階を含む。

〔課題を解決するための手段〕

次に、図面に言及しながらこの発明を説明しよう。

この発明は、等電点電気泳動用溶媒に可溶性の荷電した
１又は複数の化合物から該溶媒に可溶性の両性又は中性
化合物を分離又は精製するための等電点電気泳動法であ
って、この方法は電気泳動装置を用いて行われ、この方
法においては電気泳動マトリクスを通過する電流が液流
（７）、（８）及び（１１）（図面を参照のこと）と関
連しており、該電流の方向が該液流のそれと異り、該液
流は前記溶媒中前記化合物の溶液を含んで成りそして前
記マトリクスを２個の部分に分けており、１つの部分（
５）又は（２５）は陰極側に位置しそして他方（１２）
又は（２６）は陽極側に位置し、液流内で前記両性又は
中性化合物は等電状態又は非荷電状態に維持され、そし
て前記の荷電した化合物が電流により前記液流から前記
マトリクスの前記２つの部分の少なくとも一方中に除去
され、又は前記部分の少なくとも一方を介して電解質溶
液溜（３）及び（１４）の少なくとも一方中に除去され
、前記２つの部分は相互に独立に固定化されたｐＨ−勾
配体（５）及び（１２）を代表し、それぞれがそのｐｔ
ｔ範囲において導電性並びに緩衝能力及びタイトラント
（ｔｉｔｒａｎｔ）能力の両方を有し、あるいはそれぞ
れがその特定のｐＨ−値において導電性並びに緩衝能力
及びタイトラント能力の両方を有することを特徴とする
方法に関する。

〔具体的な説明〕

等電状態又は非荷電状態に維持される両性又は中性化合
物は、精製工程の条件下で、そして不所望の随伴化合物
からの分離が実際に起こる時点で正味の荷電を有さす又
は中性である化合物である。

これは好ましくは蛋白質、酵素、又は少なくとも２個の
アミノ酸を有する一層中さいペプチド、あるいはペプチ
ド成分又は蛋白質成分を含有する化合物、例えば糖蛋白
質であり、しかしさらに核酸、複合脂質又は複合炭水化
物でもある。

これに対して、荷電を有する化合物は、精製工程の条件
下で、そして目的化合物からの分離が実際に起こる時点
で荷電を有する化学種、例えば、荷電された、すなわち
非等電状態の蛋白質、酵素又は一層中さいペプチド、及
びさらに塩、例えばアルカリ金属塩、例えば塩化ナトリ
ウムである。

この発明の方法のために適当な溶媒は、目的の化合物を
溶解し且つ必要な電流を許容する任意の溶剤、例えば、
水又は水と適当なアルコール、例えば低級アルコール、
例えばメタノール又はエタノールとの混合物、あるいは
尿素、洗剤又は他の任意の水混和性有機溶剤もしくはプ
ロトン性溶剤を含有する水性溶液である。

電流は電源（１）により発生せしめる。発生した熱が適
当な冷却により消散され得る限り、系が耐え得る任意の
電圧、例えば１００−１００００ボルト、特に５００〜
１００００ボルト、好ましくは５００〜５０００ボルト
、例えば５００ボルト、１０００ボルト、５０００ボル
ト、又は１００００ボルトさえ使用することができ体で
ある。

液流はポンプにより、撹拌により、又は適当な軸を中心
にして流過室（８）を回転せしめることにより生じ、そ
して液相として分離されるべき混合物を含有する溶液を
含んで成る。

液流の方向は、電流の方向に対して任意の適当な角度を
なし、例えば５°〜９０°、特に３０°〜９０°、好ま
しくはおよそ垂直（直角）をなす。

例えばシリンダー（５）又は（１２）中に収容される固
定化ｐＨ−勾配体は電気泳動マトリクス、例えばゲル上
の安定なｐＨ−機能（ｐＨＩ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を含
む、固定化されたｐＨ一勾配体はｐＨ−範囲（ｐＨ−１
ｎｔｅｒｖａｌ）を構成し、これはそれ自体既知の方法
により、例えば重層された密度勾配及び重合により　（
ＬＫＢ−Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ　ＡＢ、ボックス３０５　
、Ｓ−１６１２６ブロツマ、スエーデンの１９８２年８
月付のＡｐｐｌｉｃａ−ｔＬｏｎ　Ｎｏｔｅ　３２１を
参照のこと）、例えば、その出口がシリンダー（５）又
は（１２）に連結されている勾配ミキサー、例えばＬＫ
Ｂ−Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒ　ＡＨにより供給される“Ｍｉ
ｃｒｏＧｒａｄ　Ｇｒａｄｉｅｎｔ　Ｍａｋｅｒ”中で
、等容量の後記の２種類の出発溶液Ａ及びＢを混合する
ことにより形成されるｐＨ−勾配体を含んで成る。出発
溶液Ａは酸性の重い溶液であり、そして緩衝性■■ｍｏ
ｂｉｌｉｎｅ　（登録商標；以下この様に標示しないで
使用する）又はその均等物、非−緩衝性１＋＋ｎｏｂｉ
ｌｉｎｅ又はその均等物、Ａｓ＋ｐｈｏｌｉｎｅ（登録
商標；以下この様に標示しないで使用する）又はその均
等物、アクリルアミド、Ｎ、Ｎ’−メチレン−ビス−ア
クリルアミド、グリセロール、水、及び適当な重合触媒
を含有する。出発溶液Ｂは塩基性の軽い溶液であり、緩
衝性１ｍｍｏｂｉｌｉｎｅ、非緩衝性ｌ５ｓｏｂｉｌｉ
ｎｅ　、　Ａｓｐｈｏｌｉｎｅ　ｓアクリルレアミド、
Ｎ。

Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド、水、及び適当
な重合触媒を含有するが、しかしグリセロ−ルを含有し
ない。

両性等電性の固定化されたｐＨ−膜は、これらがｐＨ−
勾配を含まず膜全体を通じて同じｐＨ値を有する点にお
いて、固定化されたｐＨ−勾配体と区別ささる。この膜
の製造はｐＨ−勾配体の製造に類似しているが、しかし
それよりも簡単である。なぜなら、勾配ミキサーが必要
でなく、そして密度勾配を調製するためにグリセロール
を必要としないからである。

膜は、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅと共に所望の等電点を生じさ
せるのに必要な比率での変化する量の緩衝性及びタイト
ラント（ｔｉｔｒａｎｔ）性１ｓ＋５ｏｂｉｌｉｎｅ、
適当な重合触媒及び水を含有するモノマーの溶液（一般
に、１０〜１５％のＴ及び３〜４％のＣ）の重合により
、好ましくはおよそ中性のｐＨ１５０℃、強性換気下で
１時間にわたって行われる。正味荷電の存在又は獲得に
より惹起される膜を通してのバルク液の流れを意味する
電気浸透（ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏｓｍｏｓｉｓ）を回
避するため、膜はそれらの等電点において良好な緩衝能
力を有することが必須である。しかしながら、好ましく
は、Ｉｍｎ＋ｏｂｉｌ　ｉｎｅのモル濃度は膜中の各１
ｍｍｏｂｉｌｉｎｅにつき５０ｍＭを超えるべきでない
。

Ａｍｐｈｏｌｉｎｅは低分子量両性物質、すなわち両性
電解質（ａｍｐｈｏｌｙｔｅ）であり、Ｉｆｆｉｍｏｂ
　ｉ　ｌ　ｉ　ｎｅとは異りアクリルアミド／Ｎ　、　
Ｎ　’−メチレンービスーアクリルアミドポリマーに固
定されず、そしてそれ故に導電性に寄与することができ
る。多くの両性物質、例えばアミノ酸及びペプチド並び
に幾つかの両性及び非−両性緩衝成分の混合物が適当な
両性電解質として作用し得る。しかしながら、大部分の
等電点電気泳動実験は市販の両性電解質混合物を用いて
行われる。これらの丙辰も広く使用されているものは、
ＬＫＢ　Ｐｒｏｄｕｋｔｅｒにより商品名Ａｏ＋ｐｈｏ
ｌｉｎｅのちとに販売されているものである。

これらは、はとんどが３００〜６００の範囲の分子量を
有するポリアミノポリカルボン酸の合成混合物から成る
。アミノ基及びカルボン酸基に加えてスルホン酸基又は
ホスホン酸基を含有する他の製品を使用することもでき
る。これらの製品（Ｓｅｒｖａ−１ｙｔｅ（登録商標）
　、５ｅｒｖａ−Ｆｅｉｎｂｉｏｃｈｅｓｉｃａ　Ｇｓ
ｂｌｌＨＢｉｏｌｙｔｅｓ　（登録商標）　、Ｂｉｏ−
Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　：Ｐｈａｒｍａｌ
ｙｔｅ　（登録商標）　、Ｐｈａｒｍａｃｉｄ　ＡＢ）
が最近Ａｍｐｈｏｌｉｎｅと比較され、そして類似の性
能を有す−ることが示された。

１ｍ＋ｍｏｂｉｌｉｎｅは次の一般式：（式中、Ｒはカ
ルボン酸又は第三アミノ基を含有する）を有するアクリ
ルアミド誘導体である。

Ｉｍｍ＋ｏｂｉｌｉｎｅはアクリルアミド及びＮ、Ｎ’
−メチレン−ビス−アクリルアミドと共重合して固定化
されたｐｔｔ−勾配体を生成するように設計されている
。各誘導体は定められた且つ既知のｐＫ−値を有する。

アクリルアミドは例えばメタクリルアミドで置き換える
ことができ、そしてＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリ
ルアミドは他の適当な架橋剤、例えば他の適当なアクリ
ルアミド誘導体により置き換えることができる。９．５
のｐＫ−値を有するＮ−（３−ジメチルアミノ−プロピ
ル）−メタクリルアミドを、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅに類
似するメタクリルアミド誘導体の例として挙げることが
できる。共重合の後、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅは共有結合
され、すなわち固定化され、そしてρＩＩ−勾配体又は
ｐＨ−膜の導電性にはなんら寄与しない、しかしながら
Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅは緩衝能力及びタイトラント能力
に寄与する。

好ましくは、ｐＨ−勾配体及びｐＨ−膜は、使用される
Ｉｍｎ＋ｏｂｉｌｉｎｅ及びＡｍｐｈｏｌ　ｉｎｅに依
存して、約３〜約１０のｐＨ範囲内のいずれかで成形さ
れる。注目の化合物が両性である場合、流過室（８）に
対面する２つのゲル先端中のｐＨは、前記両性物質を常
時等電状態に維持するために必要とされる正確さをもっ
て、該両性物質の等電点よりわずかに上及びわずかに下
、又はそれと同じでなければならない、前記の正確さ及
び前記ゲルの先端におけるｐＨの差、すなわち前記ゲル
の先端間におけるｐＨ一単位のギャップの幅は要求され
る分離能、すなわちゲルに入らなければならないすなわ
ち少なくともゲルを通過しなければならない汚染物の等
電点に依存する。可能な最も高い分離能を達成するため
、前記ゲル先端におけるｐＨ−値は相互に同一であって
、且つ目的化合物の等電点に等しいことができる。この
場合、拡散によって起こるかもしれない目的化合物のロ
スを、ある適当な機械的手段、例えば、適当なミリポア
フィルタ−をゲルと液流との間に挿入することによって
防止することが有利である。注目の化合物が中性である
場合、汚染物がゲルに入らなければならない様に前記ゲ
ル先端のｐＨを選択する。この汚染物はゲル内に留るか
、又はゲルを去って陽極室１４及び陰極室３に貯積する
であろう。

適当な重合触媒は例えばＮ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメ
チレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）及び過硫酸アンモニウム
である。該触媒は前記の重い溶液及び軽い溶液の混合を
開始する直前に添加される。重合のための他の手段は例
えば紫外線又はＴ線照射を伴うリボフラビンである。

勾配ミキサー中で、塩基性の軽い溶液を酸性の重い溶液
中に混合し、同時にこの重い溶液を、容器（５）又は（
１２）に連結された勾配ミキサーの出口に引き出す。こ
れによって、得られる密度勾配はｐＨ−勾配と一緒に変
化する。容器（５）及び（１２）の低端は例えばパラフ
ィンによりあらかじめ閉じておく。重合過程が終了した
後、パラフィンを除去する。前記容器の内直径が長すぎ
る場合、該容器の低端に、除去されないある種の支持体
、例えば穴をあけたプレートを挿入することが必要であ
る。少なくともポリマーと接触する容器部分はポリマー
が良好に付着する材料、例えばガラスから作られなけれ
ばならない。これは容器の壁とポリマーとの間の幾らか
の液が通過するのを防止するためである。固定化された
ｐＨ−勾配体を収容する容器（５）及び（１２）を、例
えば第１図及び第２図に示すように本発明の装置に組み
込む、この後、勾配体を適切に洗浄して不所望の物質、
例えば未結合のＩｍｎ＋ｏｂ　ｉ　１　ｉ　ｎｅ化学物
質、触媒及びグラフトされなかった七ツマ−を除去する
。そうしなければ、ゲルの中央部の非常に低い導電性の
ため、弱い未結合の陰イオン及び陽イオンが電気泳動的
に枯渇される場合、陽極ゲル領域及び陰極ゲル領域に向
って蓄積された２つの塩先端が決して該ゲルから除去さ
れない。良好な等電点電気泳動を達成するためには、第
一のＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅ勾配体に第二のキャリヤー両
性電解質により駆動されるｐＨ−勾配体を重層する。こ
の発明の装置は、サンプルの適用に先立って定常状態が
達成されるまで、濾過室に液を満たして数時間、例えば
５時間運転される。その後、グラフトされなかったモノ
マーのごときポリマーから浸出した有害物質を除去する
ために流過室（８）及び必要であれば液流と接触する他
のすべての容器を空にし、そして精製されるべきサンプ
ルで満たす。

この発明の全過程にわたって、サンプル溶液を激しく撹
拌することにより電気的デカンテーション（ｅ　Ｉｅｃ
　ｔｒｏｄｅｃａｎ　ｔａ　ｔ　１ｏｎ）を防止し、そ
して一定温度に維持する。使用される温度は特に溶剤、
並びに目的物質の安定性及び溶解性に依存する。水にお
いては、これは約１〜２０℃、例えば２℃の一定値に維
持される。

この発明の基本概念は、短かくてもよく且つその境界を
定める２つのゲル相に連結された液体ベッドを用いる組
み合わされた分取技法の概念であり、そして蛋白質の精
製についての下記の例により説明される。注目の蛋白質
が液相中、例えば小さな循環する室（８）中で等電状態
に維持され、他方それに随伴する不純物は陰極方向（２
）又は陽極方向（１３）のいずれかの方向に駆動され、
そして最終的には（しかし必然的ではないが）　、ｐＨ
−勾配体を代表するゲル相（５）及び（１２）　（番号
は図面による）中に集中される。このｐＨ−勾配体はｐ
Ｈ−膜により置き換えることもできる。すなわち、この
改変された等電点電気泳動技法においては、電気泳動的
にゲルマトリクス（ここから追加の精製段階により回収
されなければならない）中に駆動されるのではな（、液
体供給原料を構成する液流（７）、（８）及び（１１）
中で等電状態に維持され、そして（荷電した）不純物の
みが、流入液体サンプルの境界を定めるゲル相５及び１
２中に集中するように、又は電解質溜め（３）及び（１
４）の一方又は両方に集まるように強制される。

好ましくは、液流中のｐＨ−値は目的化合物の等電点に
相当する。電気泳動的分離はｐｔ＋勾配中で達成される
（等電点電気泳動）ので、ｐＨ−勾配体（５）又は（１
２）内の等電点を有するすべての種は、電圧勾配により
、それらがＯの正味荷電を示す特定の領域に駆動され、
そしてこれらは電界が適用されている限り、その領域に
留まる。他の種々の技法と比較した場合の相違は特に、
系のサンプルフィードを構成する流過室（８）中で注目
の成分がすてに等電点にあるように出発条件が整えられ
ることである。従って、注目の成分は電流によって泳動
するように強制されない。両性緩衝液に基礎を置〈従来
の等電点電気泳動（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　ｆｏｃｕ
−ｓｉｎｇ）（ＩＥＦ）系　（Ｐ、Ｇ、Ｒｉｇｈｅｔｔ
ｉ、　　　夏５ｏｅｌｅｃｔｒｉｃ　　Ｆｏｃｕ−ｓｉ
ｎｇ　：　Ｔｈｅｏｒｙ、　Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ及
び八ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒｓアムステルダム、２０４〜２０７頁
（１９８３）を参照のこと〕を用いるのと異り、この発
明の方法においては、その一層進歩した変法、すなわち
固定化ｐＨ−勾配（ｉｍｎ＋ｏｂｉｌｉｚｅｄ　ｐＨ−
ｇｒａｄｉｅｎｔ）（ＩＰＧ）技法（Ｐ、Ｇ、Ｒｉｇｈ
ｅｔｔｉ、　Ｊ、Ｃｈｒｏａ＋ａｔｏｇｒ、　３０（Ｌ
ｉ２Ｓ　−２２３（１９８４）が用いられる。

従来の等電点電気泳動（ＩＥＦ）系は次の理由により、
本発明の方法のためには適当でないであろう。ａ）ＩＥ
Ｆは時間に対して安定でなく、実際にｐＨ勾配が崩壊し
、そして漸進的な酸性（陽極ドリフト）を受け（Ｐ、Ｇ
、Ｒｉｇｈｅｔｔｉ及びＪ、Ｗ、Ｄｒｙｓｄａｌｅ。

Ａａ＋ｓ、Ｎ、Ｙ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、　２０９．１６
３−１８６（１９７３）を参照のこと〕、その結果注目
の蛋白質が液相に維持されず、最終的にはゲルマトリク
ス中に移行するであろう、ｂ）従来のＩＥＦ系において
はｐＨ勾配がおよその態様でのみ生ずるので、等電点を
有する注目の化合物を常時ちょうどその等霧状態に維持
しそしてそれが液相〔液流（７）、（Ｅｊ）及び（１１
））から離れるのを防止するために必要な正確さをもっ
て、流過室（８）に対面する２つのゲル先端に境界条件
を設定することが不可能であろう、これに対して、固定
化されたｐＨ−勾配体（ＩＰＧ）及びｐＨ−膜を使用す
れば、はとんどの場合に境界条件を設定することが可能
であり、その結果、サンプル流に対面する陽極ゲル先端
が注目の成分の等電点（ｐ　Ｉ）よりわずかに低いｐＨ
値を有し、他方対応する陰極ゲル先端は目的化合物のｐ
Ｈよりわずかに高いｐＨ値に設定される。言うまでもな
く、目的物質が非常に高いか又は低いｐＨを有する比較
的まれなケースにおいては適当なＩＰＧは製造の困難で
あろう、従って、等電点を有する前記化合物は、２つの
固定化されたｐＨｌ−勾配体又はｐＨ−膜により限定さ
れるこの狭いｐＨギャップ内において等霊的であろう、
注目の化合物が両性質である場合、このギャップは通常
０．０５〜０．２　ｐＨ一単ｊ立を占め、しかし０．０
０１ｐＨ単位未満のギャップも達成し得る。さらに、ギ
ャップが０ｐＨ一単位であること、すなわち前記ゲル先
端のｐＨ−値が注目の化合物の等電点に相当することが
可能である。このことは、ｐＨ−ギャップが全く存在せ
ず、２つのゲル相聞の流体ギャップのみが存在すること
を意味する。注目の化合物が中性であれば、ゲル先端に
おけるｐＨ値は目的化合物に関して選択されるのではな
く、不所望の両性の又は荷電した化合物が前記ｐＨ−ギ
ャップ内に等電点を有しないという意味において該不所
望の化合物との関連において選択される。中性化合物は
、流過室（８）に対面するゲル先端における境界条件に
は関係なく、ｐＨ−勾配体に決して入らないであろう、
境界条件の設定におけるこの正確さに加えて、時間に対
するＩＰＧの無限定の安定性のため、ｐＨ勾配が決して
ドリフトせず、このため精製される化合物の等霧状態が
常に液流中、特に流過室（８）中に見出され、しかし他
の場所、例えば陽極ゲル相（１２）及び陰極ゲル相（５
）中には見出されないことが自動的に保証される。

本発明の方法は少なくとも下記の大きな利点を有する。

ａ）サンプルの回収率が非常に高＜、１００％に近ずく
；これは、精製されるべき化合物（例えば蛋白質）が決
してゲル相に入らず、全精製工程を通じて液相中に非荷
電状態で、例えば等霧状態で維持されるからである。ｂ
）サンプルの負荷量が大である；これは、精製されるべ
き化合物、例えば蛋白質供給原料が別個の溜（１１）と
流過室（８）との間を循環し、そしである時点において
電界中に存在する必要がある量はわずかに過ぎないから
である。Ｃ）目的化合物、例えば蛋白質の等電点をまた
ぐいかに狭いｐＨ間隔を選択するかに依存して高い分離
能を有する。ｄ）注目の化合物（例えばペプチド又は蛋
白質に随伴するあらゆる塩又は緩衝剤が自動的に除去さ
れる；このことは、本発明の方法が電気透析（脱塩工程
）のためにも使用され得ることを意味する。特に、強酸
又は塩基のｍ個イオン、例えばＮａ・及びＣＺ−の除去
が非常に容易である０弱酸又は塩基のｍ個イオン、例え
ばアンモニウムイオン及び酢酸イオンの除去のためには
、後記の両性等電性１ｍｍｏｂｉｌｉｎｅ膜又は比較的
短いｐＨ−勾配体、すなわち対応する弱酸及び塩基のｐ
Ｈ値から実質的に隔たった比較的小さいｐＨ範囲、例え
ば０．５〜１．０　ｐＨ一単位から成る勾配体を用いる
のが有利である。多価イオン、例えば硫酸イオン、リン
酸イオン、及びクエン酸イオンの除去は、おそらくこれ
らのイオン種と■■−ｏｂｉ　１　ｉｎｅマトリクスと
の相互作用のために一層長時間を必要とし、そして例え
ばｐＨ−スタンドを用いての外的ｐＨ１ｊ１節の下で最
良に行われる。これは、そうしなければ−価の反対イオ
ンのより急速な除去のために室（８）中の溶液が酸性又
はアルカリ性になり得るからである４種々の用途、例え
ば酵素反応又はリガンド結合研究、のための蛋白質サン
プルの迅速な脱塩は、生化学において今日直面している
問題点の１つである。

サンプル供給原料中のあらゆる塩含量が（Ｉｎ＋Ｈの濃
度においてすでに）非等電性蛋白質の輸送を阻害する。

これはおそらく、非常に多きな電流部分が蛋白質によっ
てではな（イオン自体によって選ばれるためである。さ
らに、サンプル溜中の高い塩レベルは、それぞれアルカ
リ性及び酸性である陰極性イオン境界及び陽掻性イオン
境界を形成し、これが蛋白質の移動を妨害し、そして変
性の誘発さえするであろう０区画された（ｓｅｇ＋ｗｅ
ｎｔｅｄ）（従来法においても同様に）ＩＰＧゲルにお
いて、サンプルゾーン中に存在する実際上あらゆるレベ
ルの塩がその電気泳動的輸送を妨害する。従って、等電
性成分から蛋白質不純物を効果的に除去するための最良
の方法はすてに脱塩された蛋白質フィードを区画された
ＩＰＧ装置に供給することである。しかしながら、蛋白
質不純物の除去は、サンプル中の塩の存在下でも、非常
に低速においてではあるが達成され得る。後者の場合、
塩レベルは蛋白質の溶解性に適合する低下レベル（例え
ば５ｓＭ以下）に維持されるべきであり、そして、塩成
分によって形成される境界の発生により行われるサンプ
ルフィード中の桐的なｐＨｌ変化を防止するために外的
ｐＨ調節が行われるべきである。非常に多数の事例にお
いては、等電点における又はその近傍における低すぎる
イオン強度に基く蛋白質の凝集又は沈澱を防止するため
に、電気泳動の間サンプル中に最少の塩濃度が必要であ
ろう、この目的のため、外部液流を用いて、電気的物質
輸送及び拡散による物質輸送の組合わせによる塩の喪失
を補充する（Ｒｉｌｂｅｓの定常状態流動電気泳動（ｓ
　ｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ　ｒｈｅｏｅｌｅｃｔｒｏｌ
ｙｓｉｓ）＋　Ｈ，Ｒ１１ｂｅ、　Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔ
ｏ−ｇｒａｐｈｙ、　１５９，１９３−２０５（１９７
Ｂ）の概念に類似する〕。

前記の方法は、この発明の対象に属する下記の電気泳動
装置のいずれかにより実施することができる。

該電気泳動装置のすべてが基本的に、２個の容器（５）
及び（１２）に連結された流過室（８）を有し、これら
の容器の各々は相互に独立に固定化されたｐＨ−勾配体
により満たされ、又はこれは固定化されたｐＨ−膜によ
り置き換えられ、この勾配体又は膜の一方は流過室（８
）に連結されるその先端において、精製されるべき化合
物の等電点よりわずかに低いか又はそれと同一の等電点
を有し、そしてその他端において陽極室１４に連結され
ており、残りのｐＨ一勾配体又はｐＨ−腹は流過室（８
）に連結されるその先端において、精製されるべき前記
化合物の等電点よりわずかに高いか又はこれと同一の等
電点を有し、そしてその他端において陰極室（３）に連
結されている。

この新規な電気泳動装置の幾つかの可能な態様の１つの
略図を第１図に示す。流過室（８）はサンプル溜（１１
）に連結され、このサンプル溜は、原理的には、任意の
処理容量を有することができ、供給原料はポンプ（９）
を介して電界中を循環する。一般に、ポンプ（９）は最
高スピードで、例えば５−７分で運転される。液流（７
）に対して直角に、好ましくは白金で作られた２枚のプ
レート（２）及び（１３）間に電界がかけられ、これは
流過室（８）からすべてのイオン又は非−等電性両性種
を除去するために役立つ、流過室（８）は、例えば上方
０−リングシール（６）及び下方〇−リングシール（１
０）を介して、冷媒流（１８）用のジャケット（１９）
ををする短いガラス管中に保持されたポリアクリルアミ
ドゲルシリンダー（５）及び（１２）に連結される（（
１Ｂ）及び（１９）は第１図中には示されていないが、
第２図中には示されている）、上方管は、例えば水密性
０−リングシール（４）を介して、陽極室（３）に連結
され、この陽極室（３）は一般に常用の等電点電気泳動
（ＩＥＦ）においてそうであるように稀い塩基（例えば
、５０＋Ｍ　Ｎａ０１１又はエタノールアミン、エチレ
ンジアミン、等イオン性（ｉｓｏｉｏｎｉｃ）リジン又
はアルギニン）を収容する。下方管（１２）はその先端
を陰極室（１４）に直接浸漬し、この陰極室（１４）は
一般に、標準的ＩＥＦにおいて日常的に使用されるのと
ちょうど同様に、稀い（強又は弱）酸、例えば酢酸、リ
ン酸もしくは硫酸、又は等イオン性アスパラギン酸もし
くはグルタミン酸の溶液を収容する。言うまでもなく、
０−リングシールは、装置の種々の部分を連結するため
の他の任意の適当な手段で置き換えることができる。

本発明の分画技法の新規な特徴は、流過室（８）が固定
化されたｐＨ一勾配体又はｐＨ一膜を代表する下方ポリ
アクリルアミドゲルの先端及び上方ポリアクリルアミド
ゲルの先端と境界を接していることである。該ｐＨ一勾
配体はシリンダー（１２）及び（５）に収容されており
、これらのシリンダーは好ましくはガラス、又は付着力
によってゲルがそれに付着することができる他の適当な
材料から作られたものである。これら２個のゲル片の流
過室（８）に境界を接する先端が、精製されるべき目的
化合物の等電点よりわずかに低い（陽極側において）か
又はそれと同一のあるいはそれよりわずかに高い（陰極
側において）か又はそれと同一の等電点（ｐ　Ｉ）を有
するように整えることにより、この化合物は実際にその
ｐＨに調整（ｔｉｔｒａｔｅ）され、そしてそれ自体と
しては液流（８）、（７）及び（１１）から離れること
ができないであろう、これに対して、精製されるべき化
合物に随伴する異るｐｌを有するすべての不純物、例え
ば蛋白質性不純物は自動的に〔流過室（８）中で優勢な
ｐＩ値において〕それらのそれぞれのｐＩよりも高く又
は低く、そしてそれ故に室（８）を離れそして固定化さ
れたポリアクリルアミドゲルの下方又は上方セグメント
（１２）又は（５）中に集中するか、あるいは陽極室（
１４）又は陰極室（３）に集まるように強制されるであ
ろう、電圧勾配のもとて十分な循環時間が与えられれば
、すべての不純物は流過室（８）から離れ、そして純粋
な化合物、例えば等電性蛋白質が、最初に供給原料を収
容していたサンプル溜（１１）及び流過室（８）から回
収される。注目の化合物、例えば蛋白質は常時液相に留
まりそしてゲルに入らないため、これ以上の操作又はサ
ンプルの抽出は必要ない。

陽極室及び陰極室（１４）及び（３）、ゲルシリンダー
（１２）及び（５）、シール（１０）、　（６）及び（
４）、並びに流過室（８）を有し、垂直に又は好ましく
は水平に組み立てられた装置が電源（１）に接続される
。平衡時において、典型的な値は１００ＯＶ、　３ｍＡ
及び３Ｗであり、発生する熱を適切な冷却によって除去
することができれば他の任意の値が分離のために適当で
ある。サンプル流退室（８）にはその一定濃度を維持す
るための手段が設けられ、そして／又は供給原料がサー
モスタットに接続された大きな、ジャケット付き溜（１
１）に保持される。サンプル容器（１１）を連続的な穏
和な撹拌下におくことが好ましく、そうしなければ時間
と共に重い層が軽い層から分離するかもしれない、循環
のために任意のポンプ装置（９）、例えばペリスタルポ
ンプが使用され、このポンプは、一般に最大速度（例え
ば、５−７分）で運転され、これによってサンプルは可
能な限り短時間流過室（８）に留まり、従って熱分解の
危　　　・険が回避される。これは運転のための最も簡
単な装置の１つである。原理的には、任意の他の検出又
は計量装置、例えばバイオセンサー検出系、免疫電気泳
動装置、レーザー励起蛍光検出装置、任意の所望のロボ
ット系、ｐＨの測定及び調整のための装置、例えば流れ
電極（ｆｌｏｗｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）　、ラジオアイソ
トープモニター用装置、及び／又は等電性モニター用装
置、例えばフロー−セル（ｆｌｏｗ−ｃｅｌｌ）を、必
要−よりこの装置に設けることができる。言うまでもな
く、特゛別な目的のために、サンプル流（７）をＵＶ観
察、可視観察又は蛍光観察により、混合物中のある成分
の除去率を追跡するためのクロマトグラフカラムに連結
された標準的装置を用いてモニターすることができる。

第２図は第１図に示したのとおよそ同じ装置の分解略図
を示し、第１図中に示された電源（１）、撹拌機（１６
）及びサーモスタット（１７）はこの図には示されてい
ないが、しかし第１図に加えて、シリンダー（５）及び
（１２）の周りの冷媒流（１８）のためのジャケット１
９が示されており、さらに種々の構成部品（３）、（５
）、（６）、（８）、（１０）。

（１２）、及び（１４）がまだ組立てられていないが組
立のために正しい位置に示されている。冷媒流（１８）
は、第２図中に示されていないサーモスタット、例えば
（１７）に接続される。第２図には示されていないが（
但し、第１図には示されている）、サンプル溜め（１１
）も一定温度、例えば２℃に維持されるべきである。等
電点は温度に依存するからである。所望により、流過室
（８）にも冷媒流用ジャケットを設けることができる。

第２図は、第１図に加えてさらに、流過室（８）の好ま
しい形態を示す。液流（７）の入口及び出口は曲げられ
ており、一方はシリンダー（１２）に向き、そして他方
はシリンダー（５）に向いている。容器（１２）は、２
個のスクリュ一連結を有するように示されているが、電
極室（１４）の電解質溶液中に直接没入されてもよい。

第３図は、異る等電点を有する２種類の両性化合物、例
えば２種類の蛋白質を同じ装置中で同時に精製するため
に適当な装置を、その部品を組立てた後の状態で示した
ものである。サンプル溜（１１ａ　）及び（ｌｌｂ）は
最初の供給原料を収容し、この原料は同一でもよく又は
異っていてもよい。

サンプル溜（１１３”）はある種のチューブ７ａを介し
て２個の流過室の内の１つ（８ａ）に連結される。サン
プル溜（１１ｂ　’）は他のチューブ７ｂを介して第二
の流過室（８ｂ）に連結される。流過室（８ａ）及び（
８ｂ）は固定化されたｐＨ−勾配体を収容する中間シリ
ンダー２０により相互に分離されている。流過室（８ｂ
）に向けられた前記中間ｐＨ−勾配体の先端は、流過室
（８ｂ）中の目的化合物の等電点よりわずかに高い、例
えば＋０．０５９）Ｉ一単位高いｐＨ値を有するか、又
は該目的化合物と同じｐＨ値を有する。流過室（８ａ）
に向けられた前記中間ｐＨ−勾配体の開端は流過室（８
ａ）中の目的化合物の等電点よりわずかに低い、例えば
−０，０５ｐＨ一単位低いｐＨ値を有するか、又は該目
的化合物と同じｐＨ値を有する。□ＩＥ濾過濾過路点に
おいて、目的の精製された種、例えば蛋白質は室（８ａ
）　／　（ｌｌａ）　、及び（８ｂ）　／　（ｌｌｂ）
に集められ、そしてすべての荷電した汚染物は除去され
ている。

分析目的のために第１図の装置を使用することができ、
しかしながらこの場合、流過室（８）がサンプル溜（１
１）に連結されない限り流過室（８）は密閉される。こ
の場合、装置を水平に配置し、同じ冷媒に浸漬しそして
その軸のまわりに回転せしめることができる。装置全体
を回転せしめる代りに、流通液中のサンプルを、例えば
磁石棒により撹拌することができる。

液流のための入口及び出口が垂直位置にあり出口が入口
の上に位置するような、水平に配置された等電点電気泳
動装置を使用することは、密閉流過室を用いる前記の特
別な場合のみならず、液流のための入口及び出口を有す
る“開放”流過室を用いる通常の場合においても有利で
ある。垂直配置においては、流過室の上部に気泡が蓄積
する傾向がある。これは不純物の不均一な輸送及び電流
の障害をもたらす。気泡を除去するためには、装置を分
解しそして水平に置いて出口流を通して泡を完全に除去
しなければならない。さらに、下方の電解質溜（一般に
陽極）に浸漬された下方のＩＰＧ片が膨潤する傾向があ
る。これにより、ゲルが支持管から押し出され、そして
最後にはガラス壁から離れそしてその所定位置から脱落
することが余儀なくされる。これらの問題点は例えば第
８図に示すような水平装置により除去される。この装置
は、Ｉａｅｍｏｂｉｌｉｎｅゲル相をその場でブロック
するために、ＩＰＧ片のすべての先端にフィルター２１
を有する。フィルター２１は、外管中の環状レンジ上に
０−リングを置くことによりその場で伸ばされる。

第１図〜第３図においては、固定化されたゲル容器（５
）及び（１２）は相互に逆向に配置される。

しかしながら、第４図に示すようにこれらを相互に平行
に配置することもできる。この様な配置は特に大規模な
精製のために適当である。２個、例えば（５）及び（１
２）　、より多くの容器、例えば（４）、　（６）等、
を流過室（８）に浸漬することができるからである。

はとんどの目的のために、この発明の方法及び装置は、
ｐＨ−勾配体の少なくとも１つを両性等電性の固定化さ
れたｐＨ一膜で置き換えることにより改良することがで
きる。これらの膜は非常に狭いｐＨ間隔のみをカバーす
る非常に短いｐＨ−勾配体と見なすことができる。理想
的には、このｐＨ間隔は０ｐ１１一単位である。さらに
、流過室（８）に接するｐＨ−勾配体又はｐＨ−膜の先
端におけるｐＨ価値間差異を０に減少することができる
。すなわち、流過室が、目的化合物の等電点に等しい同
一のｐＨ（直を有する２技の膜に境界を接するようにす
ることができる。このことは驚くべきことであり、そし
て相互に異る膜ではなく２枚の同一の膜を調製すること
ができる方法を促進する。ｐＨ−勾配体ではなくｐＨ−
膜を使用することは、より安価であるという追加の利点
を有する。さらに、発生する熱を一層容易に除去するこ
とができる。従って、ｐｌｌ−膜（２５）及び（２６）
は、大規模な精製が行われなければならない場合はとん
どの事例において好ましい。

この発明はまた、この明細書に記載する等電点電気泳動
法において使用するのに適当な装置に関し、この装置は
、流過室（８）を有し、酸室が、ａ）固定化されたｐＨ
−勾配体を収容するのにそれぞれが適当な２個の容器（
５）及び（１２）と、又は ｂ）固定化されたｐＨ−膜（２５）及び（２６）を収容
するのに適当な２個の装置と、又は Ｃ）上記ａ）の１個の容器及び上記ｂ）の１個の装置と
直接的又は間接的に連結されており、前記容器又は装置
の一方がその他端において陽極室（１４）に連結されて
おり、そして残りの容器又は装置がその他端において陰
極室（３）に連結されている。

次に、例によりこの発明をさらに具体的に説明するが、
これによりこの発明の範囲を限定するものではない。

監−号 Ａ：アンペア Ｃ：　（ゲル組成を記載する場合）全モノマーＴ（下記
参照のこと）に対する％（重量）：式％式％ ミドに基く ＩＰＧ：固定化されたｐＨ−勾配体 ｐ！：等電点 Ｔニアクリルアミド及びＮ、Ｎ’−メチレン−ビス−ア
クリルアミドの合計濃度（ｇ／１ｏＯｔａ！、すなわち
重量／容量％〕 ＴＩＥＭＥＤ　：Ｎ、Ｎ、Ｎ’、　Ｎ’−テトラメチル
エチレンジアミン Ｖ：ボルト Ｗ：ワット 肛　　ムの“ 実験装置は第１図及び第２図に示すものである。

合計容量２６−を有する下方ＩＰＧセグメント（１２）
はｐＨ３，５−７，２範囲（７％Ｔ、４℃Ｃ＞　−マト
リクス及び１％のおよそ同じ９Ｈ間隔の担体両性電解質
を含有し、そして次の様にして、適当な勾配ミキサーに
より、酸性の重い溶液及び塩基性の軟い溶液から調製す
る。

酸性の重い溶液を、６８５　ｔＬｌのｐＨ３，６，２２
３ＩのｐＨ４，６，２２６Ｉのｐに６．２．１１８１１
１のｐＨ７，０及び１５４ｍの９に８．５の各１ｍ５ｏ
ｂｉｌｉｎｅ　（０，１Ｍストック溶液より）、０．６
−のＡｍｐｈｏｌｉｎｅ　ｐＨ３，５ニア、０．３、１
−のストック（３０％Ｔ、４％Ｃ）−アクリルアミド並
びに３．６艷のグリセロールの混合物から、水を添加し
て１３−にすることにより調製する。

塩基性の軽い溶液を、１２４ＩのｐＨ３，６，５１１１
Ｊ１のｐＨ４，６，３４７ＩのｐＫｓ、ｚ、１３９Ｉ１
１のＧＩＫ？、０．３１０ｍのｐＨ８，５及び２３８　
ＩｉのｐＨ９，３のＩ＋ｕａｏｂｉｌｉｎｅ。

０．６−のＡｍｐｈｏｌｉｎｅ　ｐＨ３，５−７，０及
び３．１−のストック　（３０％Ｔ、４％Ｃ）−アクリ
ルアミドの混合物から、水を加えて１３−にすることに
より調製する。

適当な二車勾配ミキサーに移した後、上記の溶ｉノソ、
ｔＬｆレニ１０　ｉ１１ノＴＥＭＥＤ及び１３ｐｌの４
０％過硫酸アンモニウムを添加する。勾配ミキサーの出
口を室（１２）に連結し、この細端をあらかじめ例えば
パラフィンにより閉じておく、これを重合が終了するま
で続ける０重合を５０℃にて約１時間（又は３７℃にて
２時間）行う。

上方ＩＰＧセグメント（５）（合計容量２６ａｆ）は、
ｐＨ７，４−１０，０の範囲の（７％Ｔ、４％Ｃ＞　−
マトリクス及び同じｐＨ範囲の１％担体両性電解質を含
有し、次の様にして下記の溶液ａ）及びｂ）から調製す
る。

ａ）酸性の重い溶液（ａｌｌ　７．４　）を、５０６Ｉ
Ｊ１（７）ｐＨ３，６，３８７ＩのｐＨ７，ｏ、３６１
Ｊ１１のｐＨ８，５及び４６ＩのｐＨ９，３の各１ｓａ
＋ｏｂｉｌｉｎｅ　（０，２Ｍストック溶液から）、０
．６−のＡｓｐｈｏｌｉｎｅ　ｐＨ７−１０，３，１ｍ
Ｚのストック（３０％Ｔ、４％Ｃ）−アクリルアミド並
びに３．６ｄのグリセロールの混合物がら、水を加えて
１３−にすることにより調製する。

ｂ）塩基性の軟い溶液（ｐＨＩＯ）を、９３ｉのｐＨ３
，６，３３５ｄのｐＨ７，０，３６２Ｊ１１のｐＨ８，
２及び２８９１１１のｐＨ９，３の各１ｍｆｆ１ｏｂｉ
ｌｉｎｅ、　０．６−の八ｍｐｈｏ−１ｉｎｅ　　ｐＨ
７−１０（すべてのＡｍｐｈｏｌｉｎｅは４０％ストッ
ク溶液より）並びに３．１−のストック（３０％Ｔ、４
％Ｃ）−アクリルアミドの混合物から、水を加えて１３
ａｆにすることにより調製する。

勾配ミキサーに移した後、溶液ａ）及びｂ）のそれぞれ
に、上記の様にして触媒（ＴＩＪＥＤ及び過硫酸アンモ
ニウムをこの順序で）加える。前記勾配ミキサーの出口
を室（５）に連結し、この室の下端はあらかじめ閉じて
おく０重合が完了した後、室（５）及び（１２）をあら
かじめ閉じていた手段を除去し、そしてこうして調製さ
れたＩＰＧ−ゲルを収容する酸室を第１図の電気泳動装
置に組み込む、サンプルを適用する前に、すべての非−
両性イオン（グラフトされなかった！■−ｏｂｉｌｉｎ
ｅｓ触媒、緩衝剤等）を、５Ｗ／１００ＯＶにて前−泳
動することによりゲルから除去する。そして、流過室（
８）を、ヒト成人ヘモグロビンのｐ　Ｉ　（７，３０）
（ＩＰＧゲル中１０℃にてヒト成人ヘモグロビンＡ（ｌ
（ｂＡ）に典型的なｐＨ）を中心とする狭いｐＨ範囲（
ｐＨ７，２−７，４＞に限定する。２５−の０．５％担
体両性電解質（ｐＨ６〜８）中に溶解したヒト成人ヘモ
グロビンＣＣＨｂＣ〕からのへテロ接合体からの合計７
０■の細胞溶解物（約６０％のＨｂＡ及び約４０％のＨ
ｂＣを合材する）を、１ｏｏｏｖの一定電圧のもとで、
前−泳動された装置中を循環せしめる。３０分間ご゛と
に３０ｄのサンプルを採取し、そしてその後の分析のた
めに４℃に保持する。２３時間後の最終サンプリングと
共に実験を停止する。アリコートをｐＨ６，５−８，５
の範囲で（５％Ｔ、４％Ｇ）−１ＰＣゲル中で分析する
。レーザーデンシトメーター（ＬＫＢ製）によるＨｂＡ
及びＨｂＣピークのデンシトメーター走査により得られ
た結果を第５図に示す、この図はＸ−軸にそって時間（
時）を、そしてＹ−軸にそってＨｂＡ及びＨｂＣの量を
示す０曲線！　（三角形）はＨｂＡに関し、そして曲線
■（円）はＨｂＣに関する。）ＩｂＡは実験期間中一定
に留まるが、ＨｂＡは２３時間まで徐々に除去され、も
はや検出できなくなる。循環の１２時間後、ＨｂＡは９
５％以上の純度であり、他方２３時間後それは９９．５
％より高純度である。

！１ＩＬ１゛の　　の。

電気透析ユニットとしての第１図に示した装置の性能を
評価するため、蛋白質混合物からの着色色素（塩の形態
）の除去の動態を評価する。陽極アーム（１２）におい
てＩ　ＰＧ　（ｐＨ３，５−７，２）ゲルを、そして陰
極アーム（５）においてＩＰＧ（ｐＨ７，４−１０）ゲ
ルを重合せしめる。こうして供給原料を７．２〜７．４
のｐＨに維持する。供給原料は、１０■の酸性色素（ブ
ロムフェノールブルー）及び１０■の塩基性色素（トル
イジンブルー）が添加された０、　５％Ａｍｐｈｏｌ　
１ｎｅ（ｐｌＩ　６−８　）中４０■の精製ヒト成人ヘ
モグロビンＡの溶液（全容量２５−）から成る。　１ｏ
ｏｏｖの一定電圧でのこれらの色素の除去を、サンプル
溜から所定の時間間隔で３０ｐ１のサンプルを採取しそ
して残留量を６００ｎｍでの分光光度計の読みにより評
価することにより追跡する。結果を第６図に示す、この
図ではＸ−軸にそって時間（時）を示し、そしてＹ−軸
にそって２種類の色素の量を示す０曲線Ｉ　（三角）は
トルイジンブルーの陰極への泳動を示し、そして曲線■
はブロムフェノールブルーの陽極への泳動を示す、第６
図に示されるように、実質的にすべての色素が流過室か
ら除去され、脱塩されたヘモグロビンサンプルが後に残
る。濃度の対数：時間のプロットが直線となり、除去の
速度は一次反応速度に従う様である。トルイジンブルー
の曲線■の形はブロムフェノールブルーのそれよりも急
であるが、しかし、上方ゲル中を３個の青色ゾーンが泳
動するのが見られ、この色素はこれら３成分の一群から
成っている様である事実が測定を複雑化している。

！ｌＬＪ、Ｘ良１企肌１ ヒト成分ヘモグロビンＡ（ＨｂＡ）の溶液３〇−を５　
（１＋Ｍ　ＮａＣｊ！とじ、そして第１図に示す装置中
を１０Ｗ一定のもとて２℃にて循環せしめる。

循環室をｐＨ７，２の上面及びｐＨ７，４の上面で囲む
。

循環速度は１０ａｆ／分である。所定の間隔で２−のア
リコートを取り、２５℃に温度調節し、そしてオリ□オ
ン（Ｏｒｉｏｎ）導電セルを装着した分析調節導電計１
０１によりモニターする。導電度の測定値をＮａＣＩＩ
の残留ミリモルに換算する。脱塩は２時間で実質的に完
了する。ＨｂＡの脱塩の速度動態を第７図に示す、この
図において、Ｘ−軸にそって時間（時）を示し、そして
Ｙ−軸にそって塩化ナトリウムの量（ミリモル）を示す
。

■１　Ｎ−アセ　ルーニゲ奮ンＣの　１ａ）Ｎ−アセチ
ル−ニグリンＣの等電点（ｐＩ＝　５．５　）を、Ａａ
ｐｈｏｌｉｎｅ　ＰＡＧ−プレート：ｐＨ３，７−９，
５；５％７．３％Ｃ：　　Ａａ＋ｐｈｏｌｉｎｅ濃度２
．２％上で決定する。

約３５０躍の全蛋白質を各ポケット（２０ｄまでの容量
）に入れ、そして次に平衡においてＬＯＷ限界、１０ｍ
Ａ、及び１０００　Ｖにて泳動を行う０分析状行は一般
に２時間以内に終了し、そして次にゲルを固定し、そし
てクマッシーブルーにより染色する。

固定溶液は、１５％のトリクロロ酢酸を二重蒸留水に溶
解し、そして二重蒸留水を加えて全容量を１００−にす
ることにより調製する。

染色溶液は、０．４６ｇのクマッシープルーＲ２５０を
４０（１＋ｄの下記の脱染液に溶解することにより調製
する。得られた溶液を６０℃に溶解し、そして使用前に
濾過する。上記の脱染溶液は、二重蒸留水を５００−の
エタノールに加えて合計１０００−としく溶液Ｉ）、二
重蒸留水を８０−の酢酸に加えて合計１０００−としく
溶液■）、そして溶液！及び■を使用前に１：１で混合
することにより調製する。

ｂ）２種類の両性等電性Ｉｓｍｏｂｉｌｉｎｅ膜（ｐＨ
５，５）を調製するため、１０．５１２−の０．２　Ｍ
　ＩｍｍｏｂｉｌｉｎｅｐＫ４．６溶液及び９．６６４
−の０．２　Ｍ　Ｉｓｍｏｂｉｌｉｎｅ　ｐＫ９．５溶
液を混合し、そして二重蒸留水で稀釈して全容量を３０
．０−とする、こうして得られた溶液のｐＨ値はｐＨメ
ーターにより５．５であると決定される。

この溶液に、４０．０−の溶液Ａ（下記参照のこと）、
１、５−のＡｍｐｈｏｌｉｎｅ　ｐＨ５−８，９１のＴ
ＥＭＥＤ　。

１２０ｄの溶液Ｂ（下記参照のこと）、及び全容量１２
０．０艷にするだけの二重蒸留水を加える。上記の溶液
Ａは、２８．８ｇのアクリルアミを及び１．２　ｇのＮ
、Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドを二重蒸留水
に溶解し、そして水を全容ｆｆｉ　１００ｍｆまで加え
ることにより調製する。前記溶液Ｂは、４００■の過硫
酸アンモニウムを８８０Ｊ１１の二重蒸留水に溶解する
ことにより調製される。

６０−の得られた。溶液を、下記の２つの装置（Ｃを参
照のこと）に満たし、そして５０℃にて１時間重合せし
める。

Ｃ）膜の調製のために使用される上記の装置は不活性材
料、例えばポリテトラフルオロエチレン（テフロン）か
ら作られたプレートを有し、このプレートは重合物に付
着しないか、又は無視できる程度にしか付着しない。こ
のプレート上に孔を有する円形のディスク（２２）を置
く、このディスクは、９ＣＪの直径及びｌ　ｍｍの高さ
を有するリング状ガスケット（２３）により前記プレー
トから隔離される。第９図はこのディスクを下から見た
図であり、第１０図は上から見た図であり、そして第１
１図は第９図に示される線ＸＩ−ＸＩにそう断面図であ
る。重合すべき溶液を穴を有するディスクの孔（２４）
を通して満たす。

ｄ）次に、穴を有する担体プレート（２２）と−緒にな
った上記の方法に従って得られた膜を、約９、５　ａｍ
の内直径及び約３ｃｍの膜間高さを有するシリンダーに
組み込む、このシリンダーは、液流（７）のための相互
に対向する入口（３１）及び出口（３０）を有し、そし
て流過室（８）として使用される。所望により、酢酸セ
ルロース又は６．６−ポリアミド（ナイロン）から作ら
れたミリポアフィルタ−（８４）あるいはこれに類似す
るもの、例えばポリプロピレンフィルターをｐＨ−膜（
２５）及び（２６）と液流（７）との間に置いて、精製
されるべき物質（例えば、Ｎ−アセチル−ニグリンＣ）
が等電膜と直接接触するのを防止する。前記の流過室（
８）並びに固定化されたｐＨ−勾配体（５）及び（１２
）の代りに膜が組み込まれた上記のシリンダーを使用し
て完全な電気泳動装置を組み立てる。好ましくは、この
シリンダーは、液流（７）のための入口及び出口が垂直
位置となり出口が入口の上に位置するように、水平配置
で使用される。垂直配置と比較した場合のこの水平配置
の利点は、気泡が自然に除去されることである。

第１２図は組立てられた装置の断面図を示す。

円管状管が、支持されたｐＨ一膜（２２）により陰極室
（３）、流過室（８）及び陽極室（１４）に分断される
。陰極（２）及び陽極（１３）がプラグ（３２）を介し
て電源ｌ　（示されていない）に接続される。

液流（７）は入口（３１）を通って流過室（８）に入り
、そして出口（３０）を通ってそこから出る。

陰極室及び陽極室中の電解質溶液は入口及び出口（２７
）及び（２８）を通して更新される。この装置の種々の
部品が穴（３３）に挿入される４本の通し棒（２９）に
より一つに保持される。

ｅ）精製されるべきＮ−アセチル−ニグリンＣのサンプ
ルを含まない液を流過室に満たし、５００Ｖ、２５ｍ＋
＾及びＩＯＷにて１時間、組立てられた電気泳動装置を
用いて前−泳動す机次に流過室を空にし、そして精製さ
れるべきサンプルを充たす。

ｆ）＆Ｉｌ換ＤＮＡ−Ｎ−アセチルニグリンＣ（純度８
０％、ヨーロッパ特許出願Ｉｌ＆Ｌ１４６．７８５に従
って調製）を含有するサンプル１ｇを１００艷の０．２
％担体両性電解質（ｐＨ５−８）に溶解し、そして５０
０ｖノ一定電圧、及び１０ｍＡ／　５　Ｗテ冷室（＋５
℃）中で、前泳動された装置中を循環せしめる。３０分
ごとに１００Ｉ１１のサンプルを採取し、そして後で分
析するまで４℃で保持する。５時間後の最終サンプル採
取をもって実験を停止する。

アリコートを、Ａｍｐｈｏｌｉｎｅ　ＰＡＧ−プレート
；ｐＨ３−５；５％Ｔ、３％Ｃ；　　Ａ＋＊ｐｈｏｌｉ
ｎｅ？ｆｆｉ度２．２％にて分析する。３時間の循環の
後すべての不純物が除去されることがわかる。

所望により、陰極室（３）及び陽極室（１４）中の溶液
を例えば５−７分の速度で排液系にポンプ輸送し、そし
て大きな溜から再生することができる。

氾′°ゞる 例４に記載したｐ　Ｉ　−５，５０の膜と同様の膜を、
１０ｍＬ　４０ｓ＋Ｍ又は１００ｍＭのン農度のＩｍｍ
ｏｂｉｌｉｎｅを導入することにより調製する。

１０５Ｍ及び４０ａＭ“膜”は正しい電気浸透性（ｅｌ
ｅｃｔｒｏｏｓｍｏｔｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）を
示し、そして正確な実験的ｐＨ値をもたらすが、１００
ｍＭ表面に非常に大きな分散を示し、そしてｐＩの近傍
のｐＨにおいて変則的な流れプロフィールを示す。従っ
て、“膜”中の約５０ｍＭの各１ｍｍｏｂｉｌｉｎｅの
モル濃度上限を設けることが合理的なようである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、この発明の電気泳動法を実施するために使用
することができる装置の全体的略図である。 第２図は、第１図に示した装置の部品の分解図である。 第３図は、この発明の装置の他の態様の分解図である。 第４図は、この発明の方法を実施するために使用するこ
とができる装置の他の態様の最も本質的な部分の略図で
ある。 第５図〜第７図は、この発明の方法による電気泳動分離
の成功を示すグラフである。 第８図は、この発明の装置の第三の態様の断面・図であ
る。 第９図は、第１２図に示す装置の部品である穴を有する
ディスクの下から見た図である。 第１０図は、前記ディスクの上から見た図である。 第１１図は、第９図の線ＸＩ−ＸＩにおける断面図であ
る。 第１２図は、この発明の装置の第四の態様の断面図であ
る。 図中、１は電源 ２は陰極 ３は陰極室 ４．６、及び１０は０−リング ５及び１２はｐＨ−勾配体 ８は流過室 １３は陽極 １４は陽極室、を示す。 １　　　、、、、電源 ２　　　、、、、陰極 ３　　　、ｉ、、陰極室 ４　　０．、、ｏ−リングンール ５　　　、、、、、ｏ−勾配体 ５、、、、ｏ−リング　ンール ７　００１．液流（チューブ） ８　　　、、、、流過室 ９　　　、、、、　ポンプ ｉｏ、１．、ｏ−リングンール １１　　　、、、、　　サンプル溜 １２　　　、、、、ｐＨ−勾配体 １３　　　、、、、陽極 １４　　、、、、陽極室 ｉｓ　　、、、、冷媒（チーープ） １６　　、、、、撹拌機 １７　　、、、、温変調節器 ２、　　、、、、陰極 ３　　　、、、、陰極室 ４、、、、ｏ−リングシール ５、、、、、旧勾配体 ５　　０１１．０−リングシール ７　　　、、、、液流（チーープ） ８　　　＋＋＋＋流過室 ９　　　、、、、　　ポンプ １０　、．５．０−りング／−ル １１　　　、、、、サンプル溜 １２　　　、、、、　　ｐＨ一勾配体 １３　　　、、、、陽極 １４　　＋＋＋＋陽極室 １８　　、、、、冷媒流 １９　　　、、、、　　シャケ、ト ■ ５　　　＋＋＋＋＋”ト勾配体 ７ａ　　、、、、液流（チーープ） ７ｂ　　、、、、液流（チーーブ） ８ａ　　、、、、流過室 ８ｂ　　、、、、流過室 ９　　　、、、、　　ポンプ １１ａ　　、、、、　　サンプル溜 １１ｂ　　、、、、　　サンプル溜 １２　　ｎ＋＋＋　　、１１−勾配体 ２０　　、、、、　　中間シリンダー ｅ　　　■ 二Ｔ万ｒ４ ５、、、、、泪−勾配体 ８　　　、、、、流過室 １２、、、、、泪−勾配体 ２２　　、、、、ディスク ２３　　、、、、ガスケット ２４　　＋＋＋＋穴

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、等電点電気泳動用溶媒に可溶性の荷電した１又は複
   数の化合物から該溶媒に可溶性の両性又は中性化合物を
   分離又は精製するための等電点電気泳動法であって、こ
   の方法は電気泳動装置を用いて行われ、この方法におい
   ては電気泳動マトリクスを通過する電流が液流と関連し
   ており、該電流の方向が該液流のそれと異り、該液流は
   前記溶媒中前記化合物の溶液を含んで成りそして前記マ
   トリクスを２個の部分に分けており、１つの部分（５）
   又は（２５）は陰極側に位置しそして他方（１２）又は
   （２６）は陽極側に位置し、液流（７）、（８）及び（
   １１）内で前記両性又は中性化合物は等電状態又は非荷
   電状態に維持され、そして前記の荷電した化合物が電流
   により前記液流から前記マトリクスの前記２つの部分の
   少なくとも一方中に除去され、又は前記部分の少なくと
   も一方を介して電解質溶液溜（３）及び（１４）の少な
   くとも一方中に除去され、前記２つの部分は相互に独立
   に固定化されたｐＨ−勾配体（５）及び（１２）を代表
   し、それぞれがそのｐＨ範囲において導電性並びに緩衝
   能力及びタイトラント（ｔｉｔｒａｎｔ）能力の両方を
   有し、あるいはそれぞれがその特定のｐＨ−値において
   導電性並びに緩衝能力及びタイトラント能力の両方を有
   することを特徴とする方法。 ２、前記電流が該電流の方向と異る方向の液流と関連し
   ていること、並びに目的とする両性又は中性化合物が前
   記液流（７）、（８）及び（１１）内で等電状態又は非
   荷電状態に維持され、他方荷電した化合物が前記電流に
   より固定化されたｐＨ−勾配体（５）及び（１２）の少
   なくとも一方中に除去され、又は該ｐＨ−勾配体を介し
   て前記電解質溶液溜の少なくとも一方中に除去されるこ
   とを特徴とする、等電点電気泳動用溶媒に可溶性の荷電
   した１又は複数の化合物から該溶媒に可溶性の両性又は
   中性化合物を分離又は精製するための、請求項１に記載
   の等電点電気泳動法。 ３、前記液流内で等電的に維持される目的化合物の等電
   点とは十分に異る等電点を有する１又は複数の両性化合
   物から該目的とする両性化合物を分離又は精製するため
   の、請求項１又は２に記載の方法。 ４、１又は複数の塩から両性化合物を分離又は精製する
   ための請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。 ５、前記の塩が１価の酸及び塩基の塩である請求項４に
   記載の方法。 ６、前記の塩が、二価又は多価の酸及び塩基の塩、ある
   いは二価又は多価の酸又は塩基の塩である、請求項４に
   記載の方法。 ７、精製されるべき前記化合物がペプチド、蛋白質、又
   はペプチドもしくは蛋白質成分を含有する化合物であっ
   て、そのそれぞれがｐＨ３と１０の間の等電点を有する
   ものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法
   。 ８、精製されるべき前記化合物がペプチド、蛋白質、又
   はペプチドもくしは蛋白質成分を含有する化合物であっ
   てｐＨ５と９の間の等電点を有するものである、請求項
   ７に記載の方法。 ９、精製されるべき両性化合物の等電点と除去されるべ
   き不所望の両性化合物の等電点とが少なくとも０．００
   １ｐＨ−単位異る、請求項３、７又は８に記載の方法。 １０、前記等電点が少なくとも０．０５ｐＨ−単位異る
   、請求項９に記載の方法。 １１、液流の方向が電流の方向に対して直交している、
   請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。 １２、液流（７）の方向が、流過室（８）から気泡が除
   去されるようなものである、請求項１〜１０のいずれか
   １項に記載の方法。 １３、前記固定化されたｐＨ−勾配体がそれらのｐＨ−
   範囲において緩衝能力及びタイトラント能力の両方を有
   し、そして同じｐＨ−範囲において十分な導電性を保証
   する量の両性電解質を含有する、請求項１〜１２のいず
   れか１項に記載の方法。 １４、前記固定化されたｐＨ−勾配体及びｐＨ−膜が制
   御された緩衝能力及びタイトラント能力、ｐＨ−値並び
   に導電性を有し、そして再現可能に調製され得るもので
   ある、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。 １５、目的化合物が水溶液中に存在する、請求項１〜１
   ４のいずれか１項に記載の方法。 １６、流過室（８）に隣接するｐＨ−勾配体又はｐＨ−
   膜の先端における等電点が精製されるべき両性化合物の
   等電点と同一であるか又はそれよりわずかに低く（陽極
   側）、そして精製されるべき該両性化合物の等電点と同
   一であるか又はわずかに高い（陰極側）、請求項１〜１
   ４のいずれか１項に記載の方法。 １７、液流内のｐＨ−値が目的化合物の等電点に相当す
   る、請求項３〜１６のいずれか１項に記載の方法。 １８、請求項３〜１７のいずれか１項に記載の方法を実
   施するために適当な等電点電気泳動装置であって、流過
   室（８）を有し、該流過室は、ａ）そのｐＨ−範囲にお
   いて導電性並びに緩衝能力及びタイトラント能力の両方
   を有する固定化されたｐＨ−勾配体によりそれぞれが満
   たされている２個の容器（５）及び（１２）と、又は ｂ）特定のｐＨ−値において導電性並びに緩衝能力及び
   タイトラント能力の両方を有する２個の両性等電性の固
   定化されたｐＨ−膜（２５）及び（２６）と、又は ｃ）上記ａ）の１個のｐＨ−勾配体及び上記ｂ）の１個
   のｐＨ−膜と、 直接的又は間接的に連結されており、前記流過室（８）
   に隣接するｐＨ−勾配体及び膜の先端における等電点が
   精製されるべき両性化合物と同一であるか又はそれより
   わずかに低く（陽極側）、そして精製されるべき該両性
   化合物の等電点と同一であるか又はわずかに高く（陰極
   側）、該ｐＨ−勾配体又はｐＨ−膜の一方はその他端に
   おいて陽極室（１４）に連結されており、そして残りの
   ｐＨ−勾配体又はｐＨ−膜はその他端において陰極室（
   ３）に連結されている、前記装置。 １９、請求項３〜１７のいずれか１項に記載の方法を実
   施するために適当な等電点電気泳動装置であって、該装
   置は流過室（８）を有し、該流過室は、固定化されたｐ
   Ｈ−勾配体によりそれぞれが満たされた２個の容器（５
   ）及び（１２）を有し、該勾配体の１つは流過室（８）
   に連結されたその先端において精製されるべき両性化合
   物の等電点よりわずかに低い等電点を有し、そしてその
   他端は陽極室（１４）に連結されており、残りのｐＨ−
   勾配体は流過室（８）に連結されたその先端において精
   製されるべき該両性化合物の等電点よりわずかに高い等
   電点を有し、そしてその他端が陰極室（３）に連結され
   ている、前記装置。 ２０、前記流過室（８）がポンプ（９）を介してサンプ
   ル溜（１１）に連結されている、請求項１８又は１９に
   記載の装置。 ２１、ｐＨ−勾配体及びサンプルを一定の温度に保持す
   るための装置を有する、請求項１８〜２０のいずれか１
   項に記載の方法。 ２２、ｐＨの測定及び調節のための装置、導電性をモニ
   ターするための装置、バイオセンサー検出系、免疫電気
   泳動装置、レーザー励起蛍光検出装置、ロボット系、ラ
   ジオアイソトープモニター装置又はＵＶ、可視又は蛍光
   観察によるサンプル溶液モニター装置、等の少なくとも
   １つを有する、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載
   の装置。 ２３、容器（５）及び（１２）中のｐＨ−勾配ゲルの又
   はｐＨ−膜中のゲルの機械的支持のための装置を有する
   請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の装置。 ２４、中間の固定化ｐＨ−勾配体（２０）又は１もしく
   は２個のｐＨ−膜により相互に分離された２個の別個の
   流過室（８ａ）及び（８ｂ）を有する、２種類の両性又
   は中性化合物を同時に精製するために適当な請求項１８
   〜２３のいずれか１項に記載の装置。 ２５、液流（７）により流過室（８）から気泡が除去さ
   れる位置に配置されている、請求項１８〜２４のいずれ
   か１項に記載の方法。 ２６、固定化されたｐＨ−勾配体及びｐＨ−膜が制御さ
   れた緩衝能力及びタイトラント能力、ｐＨ−値、並びに
   導電性を有し、そして再現可能に調製され得る、請求項
   １８〜２５のいずれか１項に記載の装置。 ２７、固定化されたｐＨ−勾配体及びｐＨ−膜が制御さ
   れた緩衝能力及びタイトラント能力を有し、そして十分
   な導電性を保証する量の両性電解質を含有する、請求項
   １８〜２６のいずれか１項に記載の装置。 ２８、陰極室（３）及び陽極室（１４）中の電解質溶液
   を更新するための入口及び出口（２７）及び（２８）を
   有する、請求項１８〜２７のいずれか１項に記載の装置
   。 ２９、請求項３〜１７のいずれか１項に記載の方法にお
   いて使用するために適当な等電点電気泳動装置であって
   、流過室（８）を有し、該室が、ａ）固定化されたｐＨ
   −勾配体を収容するのにそれぞれが適当な２個の容器（
   ５）及び（１２）と、又は ｂ）固定化されたｐＨ−膜（２５）及び（２６）を収容
   するのに適当な２個の装置と、又は ｃ）上記ａ）の１個の容器及び上記ｂ）の１個の装置と
   直接的又は間接的に連結されており、前記容器又は装置
   の一方がその他端において陽極室（１４）に連結されて
   おり、そして残りの容器又は装置がその他端において陰
   極室（３）に連結されている、前記装置。