JPH01305100A - 固定形生物学的活性物質の安定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、固定化された形における生物学的に活性な物
質の安定法に関する。

その方法は固定化された生物学的に活性な物質を不活性
の充填剤の存在で乾燥される。この種類の方法は生化学
、生物工学及び免疫診断の分野で非常に重要である。

〔従来の技術〕

これに関連して「生物学的に活性な物質」なる術語は詩
に酵素、酵素阻害物質、抗原、抗体、オルガネラ、及び
これらの種類の物質の成分と同様にすべての細胞である
と理解され、これらの生物学的に活性な物質はタンパク
質に特有の物理化学的性質をある程度有するものである
と理解されるものである。

そのような生物学的に活性な物質−以下これを生物学的
活性物質と略称するーは固定化された形に変換されると
きには固相生化学における不均一反応を行う機能的な性
質を利用することが出来る。

この型の反応の例は特に固定化された抗体または抗原の
たすけによる免疫反応を行うことを基礎とする不均一免
疫アッセイと同様に、固定化された酵素、オルガネラま
たは全細胞のたすけによる基質の転換である。

これに関連して生物学的活性物質は特にポリマ担体材料
またはガラス表面上で行われる固定によって多数の固体
担体材料の上で固定される。これに関連して、ポリマ担
体上の固定は天然の固体担体材料または合成的に製造さ
れた固体担体材料の表面への物理吸着により、または架
橋ゲルの細胞のなかに固定のためのとじこめにより、ま
たは機能的反応基による共有結合により固定される物質
及び担体材料の性質に依存してもたらされる。

所望の方法を利用して固定化した生物学的活性物質の機
能的性質を可能にするためには生物学的活性が固定化に
より損なわれることが全然ないか、またはわずかである
ことが不可欠である。そのような活性を損なうことをさ
けるために特別な固定法及び固定のあいだの反応条件が
適切な方法において選択されねばならない。

特に固定化された生物学的活性物質が向けられる不均一
反応において直ちに使用できないで、そのことがすべて
商業製品についての場合であるときには、生物学的活性
物質を固定して保持することは重要であるばかりでなく
、また数か月から数か年の長期間延長して保持されるこ
とがこの固定物の生物学的活性にとって必要であり、そ
のような固定物を満足して貯蔵できるような条件下に置
くことが特にのぞましいことである。

さらに乾燥状態において固定製品を貯蔵できることは湿
気状態における貯蔵以上に有利であることは明らかであ
る。多くの場合、乾燥状態における固定製品の供給は実
際上その利用のためには不可欠な必須条件である。

それ故、固定は乾燥製品を得るために乾燥工程として簡
単な空気乾燥、真空乾燥または凍結乾燥を選択して行わ
なければならない。しかしながら、簡単な乾燥による固
定化された生物学的活性物質は長期間の貯蔵後、特に生
物学的活性の完全たまは部分的損失が顕著にしばしば生
ずることが明らかにされている。

これに関連して、生物学的活性の損失の程度は固定化さ
れた生物学的活性物質の性質とその割合に依存し、乾燥
方法に依存し、固定に用いられた担体材料の割合に依存
している。これに関連して、固定化された抗体はしばし
ば乾燥状態での貯蔵の間で免疫的性質を部分的に損失し
、その結果としてそのような固定化された抗体の使用は
分析の精度及び感度において貯蔵の間で増加する活性の
損失によって限定されることになる。

生物学的活性物質の活性損失が乾燥のあいだで減少し、
または乾燥が充填剤の存在で適切な条件の下で行われる
ならば活性損失は全くさけることができることはすでに
知られている。かくして、アメリカ特許明細書３１３３
０１１は充填剤として作用する２糖が乾燥前とくに凍結
乾燥前に酵素溶液に加えられるならば酵素の乾燥間の活
性の損失をさけることができることを開示している。

さらにドイツ特許明細書２９５２８１５には、充填剤の
存在における乾燥がタンパク質材料さらに重要な固定生
物学的活性物質では活性損失を減少することを開示して
いる。これに関連してドイツ特許明細書２９５２８１５
は、水に溶解する不活性な固体充填剤の存在において特
殊な担体材料上に固定されたタンパク質の懸濁物の凍結
乾燥に関するものであり、この種の詳述された充填剤は
無機塩類、炭水化物、タンパク質または合成ポリマ、特
に固体のポリアルキレングリコールである。

イギリス特許出願２１２４２３１は抗体または抗原の安
定化に関し、その安定化は例えば血清アルブミン、ゼラ
チン及び劣化ゼラチンのような免疫学的に不活性なタン
パク質を被覆することにより固体担体に結合させること
である。

しかしながら、これに関連して今迄に示された物質の安
定化作用は甲状腺条件の免疫診断に使用される抗原及び
感受性の抗体の場合には特に不十分であった。

かくして本発明の目的は固定された形の生物学的活性物
質の安定化のための方法を提供し、そこでは固定化され
た生物学的活性物質が不活性な充填剤の存在で乾燥され
、貯蔵期間が延長されても活性損失の観点で公知の方法
よりもさら（こ効果的である方法を提供するものである
。

この目的は特許請求の範囲第１項に記載されている糖ア
ルコールと結晶化を抑制するよう作用するところの糖ア
ルコール誘導体または水素化されたオリゴ糖のある割合
の混合物が充填剤として使用する型の方法により達成さ
れる。

本発明による方法の有利な具体例は従属の特許請求の範
囲に記載されている。

本発明による方法において、乾燥されるべき固定製品、
特に試験管内の免疫学的の分析に向けられる抗原及び固
定化された抗体は特にその乾燥前に低分子量の直鎖糖ア
ルコールを主成分として含有する結晶化抑制、混合物の
水溶液または緩衝液により処理される。

結晶化抑制剤として存在する物質は化学的には糖アルコ
ールに関連していて、特に水素化されたオリゴ糖であり
、例えばアメリカ特許明細書２１７２３５７に述べられ
た型の糖アルコール誘導体である。

「糖アルコール誘導体」なる術語は特に分岐鎖のデオキ
シへキシトール及びデオキシペンチトール及び糖アルコ
ールの無水誘導体、特に１．４−ソルビタンであるソル
ビタンの糖アルコール誘導体を包含している。

特別に満足できる安定化作用はＤ−ソルビトールと出発
物質としてグルコースンロップを水素化することにより
製造された水素化オリゴ糖水溶液を使用するときに得ら
れてきた。これに関連してこの型の水溶液の全固体含量
におけるＤ−ソルビトールの割合は５０から９５重量％
の範囲、好ましくは７０から９０重量％の範囲にある。

所望の結晶化の抑制をもたらす水素化オリゴ糖の割合は
固体含量を基にして１から６重量％の範囲にある。

その混合物はＤ−ソルビトールのほかに小量の他の関連
する化学的性質を持つ他の物質を含み、特にマンニトー
ルであり、その割合は８重量％までである。この型の乾
燥溶液により製造された糖アルコール混合物は通常はと
んど低温度でのみ結晶化のしるしを示している。結晶化
度はさらに容易に混合物の水素化オリゴ糖の割合により
影響される。本発明による方法の目的に適切であるとこ
ろのＤ−ソルビトール及び水素化されたオリゴ糖との特
別な混合物はさらに商業製品（カリオン（ＴＭ）Ｆ及び
ＦＰ、　　メルク社より）として人手できる。

例えばクリセロールおよびグリコールのような吸湿性の
高い物質は非常に急速に湿潤環境から水を吸いとり、乾
燥環境において再び急速に水を失うことは知られている
。そのような水分レベルの変動は生物学的活性物質の活
性損失を導（。逆に本発明により用いられる糖アルコー
ル混合物は吸湿性が比較的に低いという理由により環境
における湿気を顧慮しないで特別なやり方で固定化され
たタンパク質の水分レベルを制御し、かくしてタンパク
質安定化作用を示す１つの剤を示している。

安定剤として知られてきた充填剤と比較することにより
後で示される本発明で用いられる混合物によって達成さ
れる安定化は化学的性質が相対的に同じであるときでさ
え、公知の充填剤による安定化よりも可成りすぐれてい
る。

成功的安定化はラジオイムノアッセイ、酵素−５蛍光−
１及び発光イムノアッセイのような試験管内分析におけ
る免疫診断に極めて重要である。これらの場合、抗原ま
たは抗体が固体の体に結合して長期間にわたり安定でな
ければならない。固体の体はイムノアッセイの使用のた
めに粒子の直径約１μｍの微視的重合粒子または磁化で
きる粒子であり、または彼等は大きさ６Ｉまでのプラス
チックビーズである。しかしながら固体の体として特に
好ましいのは実際上の理由でポリスチレン、ポリプロピ
レン、ポリアミド、ポリエチレン及び同様なプラスチッ
クからつくられたマイクロタイター板または管である。

本発明による方法の利点はこの場合において特に抗原ま
たは抗体が管の内表面にまたはマイクロタイター板に共
有結合で結合するかまたは吸着によって結合されるとき
に、換言すれば被覆管技術の名前の下で免疫診断におい
て公知である技術が選択されるときに、特別に明らかで
ある。

実施例においてさらに詳しく説明される使用の特殊な場
合はポリスチレン管の内表面にモノクロナールまたはポ
リクロナールの抗−ヒト甲状腺刺激ホルモン（ｈ−ＴＳ
Ｈ）抗体に関連している。

それは化学的及び／または物理的処理により吸着固定を
あらかじめ製造することができ、そのたすけによってヒ
トの血清中の甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）濃度を決定
する試験管内分析において免疫診断を可能としている。

しかしながら、本発明に使用される混合物の優れた安定
化性質はまた他の抗体及び抗原についても示され、特別
に試験されてきた物質は出願人が興味を持つ特殊な分野
においてこれらはＴ４及びＴ３抗原と同様に、抗−Ｔ３
抗体、抗〜Ｔ４抗体、抗−ＰＴＨ抗体及び抗−サイログ
ロブリン抗体である。

本発明による方法は、実際上乾燥前の固定において得ら
れた生成物が糖アルコール混合物の溶液で１回またそれ
以上の回数手動または自動機械のたすけによって洗浄さ
れ、または簡単にこの種類の溶液のなかに浸漬される方
法で行われる。作用のための必要な時間は処理溶液の性
質及び濃度によるのと同様に特殊な生物学的活性物質の
性質によって決定される。これに関連して、必要な作用
時間は数分から数時間までであり、簡単な予備実験によ
り困難なく確立される。固定生成物な及ぼす所望の安定
化効果を達成し、作用時間は通常３０から１２０分であ
る。

次の乾燥法において、結晶化を抑制するように作用する
糖アルコール及び水素化オリゴ糖の混合物は固体、特に
ポリマーの担体材料の上に均−及び固体の保護層を形成
し、その層は結晶化領域または細孔によって邪魔されず
、池の公知の安定剤とはこの性質が異なっている。この
保護層の目的は化学的／物理的及び機械的に作用する安
定効果によって、長期間にわたり固定法の生物学的活性
を確実にすることである。化学的／物理的保護効果は水
素結合の形成により、ファンデアワールス結合の促進に
よる生物学的活性物質の分子構成の固定として説明でき
る。本発明に用いられる糖アルコール混合物から形成さ
れる固体薄膜の機械的に効果的な安定化作用は例えば、
固定化された物質の水分含量の制御に関連している。さ
らに固体薄膜は長期間の貯蔵により本質的に促進する後
の微生物汚染が起こるのを防いでいる。

特殊な固定生成物のための保護層の層厚は予備実験にお
ける特別な場合で確立される。その厚さは糖アルコール
の割合及び性質に、固定反応に使用される担体材料に、
使用の指向する形態に依存する。水溶液または緩衝水溶
液における低分子量の糖アルコールと水素化オリゴ糖の
混合物の固体濃度は各々個々の場合において安定効果及
び固定物の視覚的出現を考慮して変化できる。これに関
して、０．１から１０重量％特に１から５重量％の固体
濃度が好ましく、有利であることが証明されている。大
抵の目的に使用する好ましい固体の濃度は３重量％であ
る。

本発明に使用される混合物につけ加えて生物学的活性物
質の安定化を促進、援助する他の充填剤を加えることは
個々の場合で便宜的に行われる。

本発明に用いられる混合物水溶液をもって担体材料の上
に固定される生物学的活性物質の処理は空気中での乾燥
、真空乾燥または好ましくは凍結乾燥によって行われる
。

生物学的活性物質の生物学的活性は本発明により使用さ
れる混合物の存在において固定物の凍結乾燥によって目
立って減少しない。

乾燥のあいだに形成された保護層は使用した処理溶液の
固体成分から成り、長期間にわたり生物学的活性を保持
している。形成された保護層は明るい透明無色の薄膜被
覆物から成り、固定製品の視覚的外観を何ら損なわない
。保護層は固定化生成物が血液、プラスマ及び血清のよ
うな体液または水溶液に接触するときにはさらに処置す
ることな（、撹拌及び振とつする必要なくただちに溶解
する。試験管内分析における固定化の場合において糖ア
ルコールと水素化オリゴ糖との混合物の成分は決定に対
していかなる方法に於いても干渉しない。それ故に試験
管内の実際の免疫診断前に充填剤の成分を消去するため
に検査過程を妨げるような追加の工程を必要としない。

もしも、所望の固定化生成物が非−結晶性の低分子量の
糖アルコールを追加することなく、乾燥状態における固
定物の貯蔵において所望の使用のため固定生成物の適合
性を限定する生物学的活性を漸進的に非常に短時間後に
減少する。

乾燥の間に形成される均一保護層のもとで、恐ら（Ｄ−
ソルビトールと水素化オリゴ糖から成る保護層のもとで
、固定化生成物はその使用まで長期間で活性の損失なし
に貯蔵できる。

それ故に、本発明によれば生物学的に活性な物質がガラ
スのような無機担体またはポリスチレン、ポリ塩化ビニ
ル、ポリアミド、ポリエチレンのような完全重合体の担
体またはデキストランまたはアルギン酸塩のような天然
重合体の担体に幾ケ月から数ケ年にわたる期間の乾燥状
態で安定に保って吸着または共有結合的に固定できる。

このことは免疫診断用キットとくに被覆管キットのよう
な商業製品が可成り容易に供給され、生物学的活性物質
の工業的使用を可能としている。

本発明は次に特殊な典型的な具体例と比較の実験例によ
りさらに詳しく説明される。

実施例１ ａ）　ポリスチレン管上の吸着により 抗−ｈＴＳＨ抗体の固定 ９．６８ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタンと４
．６４ｇの塩化ナトリウムを蒸留水８ｇに溶解し、その
溶液を希塩酸によりｐＨ７，８に滴定する。

２０ｍｇのモノクロナール抗−ｈＴＳＨ抗体を緩衝液に
溶解し、その溶液を３０分間撹拌または振とうしながら
均一にする。

抗体溶液を自動ピペッタの手段により２２０００本のポ
リスチレン管の各管に３００μａの分前で分配される。

抗体を室温または４から８°Ｃの温度で、２０時間、物
理吸着によりポリスチレン管の表面に固定する。過剰の
抗体を水による洗浄により簡単に除去する。

ｂ）　　ａ）において固定した抗−ｈＴＳＨ抗体の安定
化及び被覆管の乾燥 ４．５ｋｇのＤ−ソルビトールと水素化オリゴ糖類（商
業製品カリオンＫａｒｉｏｎ　（Ｔ　Ｍ　）　Ｆ　）と
の混合物と７５０ｇの牛血清アルブミンＢＳＡと７゜５
ｇのナトリウムアジドとを蒸留水１５０ｇに溶解する。

管にこの溶液を満たし、溶液を２時間管のなかに置いた
。その溶液をそこで傾斜し、管を凍結乾燥法によって乾
燥する。

管を室温または４から８°Ｃの温度で、使用するまで変
性作用を保護するために他の処置することなく保管する
。

Ｃ）　固定及び安定化した抗−ｈＴｓＨ抗体の特性づけ 安定化溶液で処理された固定抗−ｈＴＳＨ抗体はラジオ
イムアッセイ法における抗原結合挙動及び精度に特徴が
ある。

その特性づけはヒトの血清におけるＴＳＨ８０ｍ　Ｕ　
／　（ｌのところまでのまえもって決定した量の存在に
おいて第２のヨウ素−１２５−標識した抗−ＴＳＨ抗体
をもって行われる。固定及び安定化抗−ｈＴＳＨ抗体の
培養はＴＳＨ２００μ！を含有するヒトの血清及び１０
０μｇの放射能的に標識した第２の抗体と共に２時間、
室温で振とうして行われ、抗体化抗−ｈＴＳＨ抗体によ
り結合された放射能量をガンマ線計数器で測定した。安
定された抗−ｈＴＳＨ抗体により管の表面上に結合した
放射能の量は結合したＴＳＨの量に直接比例している。

安定化抗体の抗原結合挙動の精度は次の式により計算さ
れる変動係数Ｃｖ（％）を決定することにより得られる
。

ＣＶ　＝　Ｓ　／　ｎ　Ｘ　１００ ここでＳは標準偏差であり、ｎは決定数である。

実施例２ 実施例１のａ）におけるように固定された抗体を安定化
のため、蒸留水１５０１のなかに７．５ｇのナトリウム
アジドと商業製品カリオン（ＴＭ）ＦＰの形において混
合した糖アルコールの７．５ｋｇの溶液をもって処理さ
れる。

溶液は安定化のため３０分間管のなかに置かれる。冷凍
乾燥法により乾燥を行った。

実施例３ 実施例１のａ）のように固定された抗体は蒸留水１５０
１２のなかに、７．５ｇのナトリウムアジドと、ｌＯｌ
の３％の強度の緩衝され無菌濾過された　アルブミンの
溶液と、商業製品カリオン（ＴＭ）Ｆの形のなかに４．
５ｋｇの糖アルコールを混合した混合物でもって安定化
する。

管は自動洗浄器を用いて、２回各回とも５ｍ＋２の溶液
をもって洗浄される、各洗浄は１分間行った。

管はそこで凍結乾燥または空気中で乾燥される。

実施例４（比較） 吸着によりポリスチレン管上に固定したモノクロナール
抗−ｈＴＳＨ抗体は下の表１に示される水溶液の形の種
々の安定剤により処理され、凍結乾燥により乾燥される
。得られた生成物活性度は１．２，４．８及び１６週間
の期間後にラジオイムノアッセイで決定された。

下の表１にその結果を要約している。

表　　　１ カリオンＦ及び他の公知の安定剤により比較処理後の固
定化された抗−ｈＴＳＨ抗体による活性度の保持率（開
始の活性度は１００％！等しい）活性度の保持率　　　
　　　　　　週 安定剤　１　２　３　８　１６ カリオンＦ　　　１００　１００　　９９　　９９　　
９７ソルビトール　　９５　　８０　　７７　　６８　
　６０グルコース　　　９３　　８０　　７３　　７０
　　５５スクロース　　　９３　　８２　　７３　　６
５　　５６グリセロール　　５０　　３３　　　ｔｏ　
　　−−固定化抗体の変性の初期過程はその以前に結合
活性度において変化が測定できるとしても、免疫学的な
反応において精度の損失が増大することから明らかであ
る。それ故に安定化物質の量と効果は貯蔵の間に知られ
る変動係数Ｃｖ（％）として表現されるところの抗−ｈ
ＴＳＨ反応の精度における変化から確立できる。表２は
０，４，８，１６．３２及び４８週間の後の変動係数Ｃ
ｖ（％）における変化による安定化効果の研究の結果で
ある。

表　　　２ カリオンＦ及び他の公知の安定剤で処理した後のＴＳＨ
抗体により被覆されたポリスチレン管の長期間精度（Ｃ
Ｖ％） 精度（ＣＭ％、ｎ・１０）　　　　　　　　　週安定剤
　０　４　８　１６　３２　４８カリオンＦ　　　　１
．６　２．Ｑ　　２．３　２．３　２．７　２．７スク
ロース　　　５．２　４．１　５．１　５．８グルコー
ス　　　２．９　３．８　５．３　６．４グリセロール
　１２．４　２０．６　　−　　−−表１及び表２に集
約された研究の結果は、本発明に用いられる混合物の安
定効果はソルビトールのみと同様にスクロース、グルコ
ース及びグリセロールが可成りすぐれていることを明確
に示している。

実施例５ 糖アルコール及び水素化オリゴ糖の混合物における固体
濃度の安定化に及ぼす効果が実施例１ｈ）ら実施例３と
同じ管を使用して、前の実施例と同様に変動係数の変化
によって決定された。

表３において集約された結果が得られた。

表　　　３ ＴＳＨ抗体で被覆したポリスチレン管の精度に及ぼすカ
リオンＦ濃度の効果 カリオンＦ濃度　　　精　　度 （％重量’）　　　　　（ＣＶ％、　ｎ＝１Ｏ）０　　
　　　　１２．３ １　　　　　　３．１ ２　　　　　　２．７ ３　　　　　　１．６ ５　　　　　　１．６ １０　　　　　　　２．０ １から５重量％、特に約３重量％の固体濃度が特にすぐ
れた結果を与えることがあきらかである。

さらに実験は本発明による過程は抗−ｈＴＳＨ抗体の安
定化に特に効果的であるばかりでなく、同一の有利な結
果が抗−Ｔ３抗体、抗−Ｔ４抗体、抗−１）ＴＨ抗体及
び抗−サイログロブリン抗体においてもＴ４及びＴ３抗
体の固定物の場合におけると同様に得られている。

〔発明の効果〕

本発明は固定化形における生物学的活性物質の安定化方
法であり、例えば固定化形における免疫診断に向けられ
る生物学的活性物質は固定及び後の乾燥生成物への変換
に及ぼす活性度を失うことなく乾燥形においてできるだ
け長期間活性度を変化しないように保持することができ
る。活性度を改善し、有用な寿命をもつ乾燥生成物は特
に水素化オリゴ糖の形において結晶化抑制剤と共に１つ
またはそれ以上の糖アルコールの混合物の存在において
固定した生成物学的活性物質を乾燥することにより製造
できる。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）不活性充填剤の存在において乾燥され固定化され
   た生物学的活性物質の安定法において、使用される前記
   充填剤が式ＣＨ＿２ＯＨ（ＣＨＯＨ）＿ｎＣＨ＿２ＯＨ
   で表され、ｎが２から４の整数であり、１つまたはそれ
   以上の糖アルコールと、結晶化を遅延する水素化オリゴ
   糖または糖アルコールとの一つの割合からなる混合物で
   あることを特徴とする固定形生物学的活性物質の安定法
   。
2. （２）前記糖アルコールがＤ−ソルビトールであり、水
   溶液の形で５０から９５重量％の固体含量の混合物とし
   て使用されることを特徴とする特許請求の範囲第１項記
   載による固定形生物学的活性物質の安定法。
3. （３）前記糖アルコールと結晶化遅延剤との混合物が固
   定化生物学的活性物質に対して０．１から１０重量％、
   好ましくは１から５重量％の固体濃度を有する水溶液の
   形で使用され、そこで空気乾燥、真空乾燥または凍結乾
   燥によって乾燥されることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項及び第２項記載のいずれか１つによる固定形生物
   学的活性物質の安定法。
4. （４）前記固定化生物学的活性物質は吸着され、かくし
   てマイクロタイター板または被覆管技術のプラスチック
   管の内壁上に固定化することを特徴とする特許請求の範
   囲第１項から第３項記載のいずれか１つによる固定形生
   物学的活性物質の安定法。
5. （５）前記固定化生物学的活性物質はモノ−またはポリ
   クロナール抗体またはハプテンまたは抗原であることを
   特徴とする特許請求の範囲第１項から第４項記載のいず
   れか１つによる固定形生物学的活性物質の安定法。
6. （６）前記固定化生物学的活性物質がモノ−またはポリ
   クロナール抗−ヒト甲状腺刺激ホルモン抗体ｈＴＳＨＡ
   ｂであることを特徴とする特許請求の範囲第５項記載に
   よる固定形生物学的活性物質の安定法。
7. （７）前記固定化生物学的活性物質が糖アルコールと結
   晶化遅延剤との混合物の使用のために、この前記混合物
   の水溶液により１回またはそれ以上の回数で洗浄し、ま
   たはそのような水溶液のなかに浸漬し、その後に前記溶
   液は３０から１２０分間前記固定化される生物学的活性
   物質に作用させることを特徴とする特許請求の範囲第１
   項から第６項記載のいずれか１つによる固定形生物学的
   活性物質の安定法。