JP2639573B2 - 補体測定用リポソームおよびそれを用いる補体測定法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトなどの哺乳動物の血液中に含まれる補
体測定用リポソームおよび該リポソームを用いる補体ま
たは補体成分の測定法に関する。

〔従来技術と問題点〕

補体系はヒトなどの動物の新鮮血清中に含まれる20種
類近いタンパク質より構成され、生体の感染防御、免疫
反応、炎症等にあずかる重要な反応系である。補体系の
各成分は通常独立した形で存在しそのままでは機能を発
揮しないが、２つの経路によって活性化を受ける。これ
らの活性化経路は、古典的経路（classical pathway）
および第２経路（alternative pathway）と呼ばれてい
る。

生体に細菌やウイルスなどの異物（抗原）が侵入する
と、それに対して特異的な抗体が産生され、その抗体が
異物（抗原）と結合し抗原抗体結合物が形成される。こ
の抗原抗体結合物は補体成分を次々に活性化して細胞膜
障害複合体を形成させ、溶菌、溶血などの細胞傷害反応
を通じて、また食細胞による抗原抗体結合物の消化分解
を促進して異物を排除する。この補体系の活性化経路が
古典的経路である。

また、補体系では抗原抗体結合物以外の天然に存在す
る種々の物質、例えば細菌、複合多糖類、ある種の合成
高分子などの異物を認識し攻撃する機能を持っており、
抗体産生以前の生体の細菌に対する初期防御の面で重要
な役割を担っている。この補体系の活性化経路が第２経
路である。

このように補体系は生体防御にとって欠くことのでき
ないものであるが、一方、もし補体系の活性がうまくコ
ントロールされずに過度に反応が進めば、生体自身に障
害的に作用し、アレルギーや過敏症反応が引き起こされ
る。

従って、ヒトの血清中の補体活性のレベルは生体防御
能やアレルギー反応の指標となることが明らかとなって
おり、また血清中の補体系の不全は種々の疾患と密接な
関係をもつため、補体活性のレベルすなわち補体価の測
定は臨床上有用な検査として広く普及している。特に全
身性エリテマトーデスや膜性増殖性糸球体腎炎等補体価
が減少する疾患の場合、その補体価測定が重要視されて
いる。

このように補体価の測定により補体系の全体の活性を
知ることができるが、さらに補体系の各成分を測定する
ことにより、遺伝性血管浮腫、全身性エリテマトーデス
等の補体成分欠損症などの疾患について、より詳細な臨
床診断が可能となる。

現在最も一般的な補体価測定法としては、メイヤー
（Mayer）の50％溶血法（CH₅₀）が知られている。これ
は、至適条件下で全量7.5mlの反応液中の５×10³個のヒ
ツジ感作赤血球（対応する抗体を結合させた赤血球）の
うち、その半数を溶血させるために必要な補体量を示す
ものと規定されており、実際の測定に際しては、測定す
べき補体を含む血清を段階的に希釈して８本程度の試験
管に一定量の感作赤血球を加えて反応させ、反応液を遠
心し、上清の吸光度から溶血度を算出し、得られた溶血
度（Ｙ）からY/（１−Ｙ）を算出して、両対数方眼紙に
その値と補体量とをプロットして得られた直線がY/（１
−Ｙ）＝1.0を切る所の補体量からCH₅₀の値を求めてい
る。

このCH₅₀価は古典的経路の総合的な活性を反映するも
のであるが、一方、第２経路の活性測定法は、Ca²⁺をキ
レートすことにより古典的経路を遮断しつつ、ウサギ
（かたはマウス、モルモット）の赤血球が被検血清中の
抗体を介して第２経路を活性化し、その結果、赤血球膜
上に形成された膜攻撃複合体により溶血が起こることを
利用するものである。古典的経路の活性はCH₅₀で示すの
に対し、第２経路の活性はACH₅₀で示される。

これらのCH₅₀及びACH₅₀の測定方法は非常に煩雑で時
間がかかり、操作に熟練を要する。また、を測定の再現
性も良くなく、生体由来の赤血球は不安定で長期保存が
不可能でありまた高価である等の欠点を有している。こ
のため、補体価の測定において一般的に広く受け入れら
れているルーチン法および自動化法は確立されていな
い。また、CH₅₀及びACH₅₀を同時に測定する場合、C
H₅₀、ACH₅₀の測定は上記のように異なる赤血球を用いて
別々の方法でそれぞれ面倒な測定を行わなければならな
いため、簡便な測定法、測定システムの開発が望まれて
いた。

また補体成分の活性を測定するには、現在のところ、
上記と同様に赤血球を用いて補体系の機能の１つである
溶血現象を利用した成分の活性測定が有効な方法である
が、本法は非常に煩雑であり、また生体由来の不安定で
高価な赤血球を使用する等上記と同様の問題点を有して
いる。

本発明者らは安定なリポソームを用い、かつ操作が簡
単で迅速な自動化に適した補体測定法について鋭意研究
した結果、標識物質をその内部に封入し、かつ補体系の
第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込むかある
いはその膜表面上に結合したリポソーム（liposome）あ
るいはこれに補体系第２経路を活性化する物質を抗原と
する抗体を結合したリポソームを用いることにより、被
検試料中の補体系古典的経路および第２経路のそれぞれ
の活性あるいは成分活性が、同一の方法、システムで、
感度良くかつ容易に短時間で測定できることを見出し、
本発明を完成するに至った。

〔問題点を解決するための手段〕

すなわち本発明の第１は、標識物質をその内部に封入
し、かつ補体系の第２経路を活性化する物質をその膜内
に組み込むかあるいはその膜表面上に結合した補体測定
用リポソームを、 本発明の第２は、標識物質をその内部に封入し、かつ
補体系の第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込
むかあるいはその膜表面上に結合したリポソームに補体
系の第２経路を活性化する物質を抗原とする抗体を結合
した補体測定用リポソームを、 本発明の第３は、標識物質をその内部に封入し、かつ
補体系の第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込
むかあるいはその膜表面上に結合したリポソームを被検
試料中に存在する補体と作用させることにより、該被検
試料の補体活性に応じて該ポリソームから遊離する標識
物質を測定することを特徴とする補体測定法を、 本発明の第４は、標識物質をその内部に封入し、かつ
補体系の第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込
むかあるいはその膜表面上に結合したリポソームに補体
系の第２経路を活性化する物質を抗原とする抗体を結合
した後、被検試料中に存在する補体と作用させることに
より、該被検試料の補正活性に応じて該ポリソームから
遊離する標識物質を測定することを特徴とする補体測定
法を、 本発明の第５は、上記２種のリポソームを併用するこ
とを特徴とする補体系の古典的経路および第２経路の同
時測定方法をそれぞれ内容とするものである。

本発明のリポソームおよび該リポソームを用いる補体
測定法は以下の通りである； Ａ）標識物質をその内部に封入し、かつ補体系の第２経
路を活性化する性質をもつ物質をその膜内に組み込むか
あるいはその膜表面上に結合したリポソーム。このリポ
ソームに被検試料中に存在する補体を作用させると、被
検試料の補体系第２経路の活性に応じた一連の補体系第
２経路依存のリポソーム膜損傷反応が起こる。その結
果、リポソームから遊離した標識物質を測定することに
より、被検試料の補体第２経路の総合的な活性を測定す
ることができる。

Ｂ）標識物質をその内部に封入し、かつ補体系の第２経
路を活性化する物質をその膜内に組み込むかあるいはそ
の膜表面上に結合したリポソームに、前記補体系第２経
路を活性化する物質を抗原とする抗体を添加し、リポソ
ーム膜上に抗原抗体結合物を形成させたリポソーム。こ
のリポソームに被検試料中に存在する補体を作用させる
と、リポソーム膜表面上に形成された抗原抗体結合物に
よって被検試料の補体系古典的経路が新たに活性化され
る。

Ｂ−１）上記リポソームの膜内に組み込むかあるいはそ
の膜表面上に結合する補体系第２経路を活性化する物質
が、それに対する抗体の抗原結合部位によって覆われて
しまう程度の大きさのものである場合、上記抗体の添加
により第２経路を活性化する物質は抗体により覆われて
しまうため、第２経路の活性化は起こらなくなる。した
がって、本測定では、被検試料の古典的経路のみの活性
に応じた一連の補体系古典的経路依存のリポソーム膜損
傷反応が起こり、リポソームから遊離した標識物質を測
定することにより、被検試料の補体系古典的経路の総合
的な活性を測定することができる。

よって、上記のＡ）およびＢ−１）のリポソームを併
用し、同一の条件下で第２経路の活性測定Ａ）、および
古典的経路の活性測定Ｂ−１）を行うと、被検試料の古
典的経路および第２経路それぞれの活性を同一の測定
法、システムを用いて測定することができる。

Ｂ−２）上記ポリイソームの膜内に組み込むかあるいは
その膜表面上に結合する補体系第２経路を活性化する物
質が、それに対する抗体の抗原結合部位によって覆われ
てしまわない程度の十分大きいものである場合、被検試
料の古典的経路および第２経路の両方の活性に応じたリ
ポソーム膜損傷反応が起こる。この結果、リポソームか
ら遊離した標識物質を測定することにより、被検試料の
補体系両経路の総合的な活性を測定することができる。

したがって、上記のリポソームＡ）およびＢ−２）を
併用し、同一の条件下で第２経路の活性測定Ａ）、およ
び古典的経路と第２経路の両方の活性の測定Ｂ−２）を
行うと、後者Ｂ−２）の活性から前者Ａ）の活性を差し
引くことにより、古典的経路のみの活性を算出でき、そ
れゆえ、古典的経路および第２経路それぞれの活性を同
一の測定法、システムを用いて測定することができる。

上記の測定法はいずれも、補体系古典的経路または第
２経路の特定成分を特異的に吸着するアフィニティクロ
マトグラフィ等を用いて補体系古典的経路または第２の
経路の特定成分のみを除去した血清（補体系の特定成分
を除去した血清の調製法については、従来公知の方法、
例えば「役にたつ免疫実験法」、西岡、嶋田、真崎編、
講談社サイエンティフィク（1984）、149頁参照）をあ
わせて用いることによって、被検試料中の、前記血清か
ら除去した補体系古典的経路または第２経路の特定成分
の活性測定に使用できる。

また、上記の測定法はいずれも、活性化された少なく
とも１つ以上の補体成分をリポソームに結合することに
よって、従来補体成分の活性測定に用いられてきた中間
体細胞（インターメディエートセル、intermediate cel
l）の代わりに使用できる。補体成分のリポソームへの
結合法については、従来公知の中間体細胞の作成法を用
いることができる（例えば「役にたつ免疫実験法」、西
岡、嶋田、真崎編、講談社サイエンティフィク（198
4）、128〜139頁参照）。

実際の測定に際しては、あらかじめ既知の濃度の補体
または補体成分を用いて検量線を作成しておき、これを
もとにして同じ条件下で被検試料中の未知の濃度の補体
の作用により遊離した標識物質を測定して補体または補
体成分の測定を行うと、被検試料を希釈した数多くの検
体の測定を行う必要がなく１つの試料について１回の測
定で済み、簡単に補体または補体成分の測定を行うこと
ができる。

また、本発明の補体測定法において、リポソームは生
体由来の赤血球に比べてすこぶる安定であり、同じ組成
のものを大量に調製でき、かつ測定の操作が非常に簡単
であり、遠心等の分離操作が不要である均一系の測定で
あるため自動化にも適している等の利点を有する。

本発明で用いるリポソームの膜内に組み込むかあるい
はその膜表面上に結合する補体系第２経路を活性化する
物質としては、たとえば酵母細胞壁多糖類であるザイモ
サン（zymosan）、Streptococcus mutansの産生するム
タン（mutan）、ダリヤやキクイモ類の根塊に由来する
イヌリン（inulin）などの種々の多糖類や、Gram陰性細
菌細胞壁のリポ多糖体（LPS、endotoxin）、コブラ毒因
子（CoF）、Gram陽性陰性を問わず多くの細菌の表面構
成物質、ある種の動物細胞表面構成物質、種々の抗体あ
るいはγ−グロブリンまたはこれらを含む免疫複合体、
トリニトロフェニル（trinitrophenyl）基などのハプテ
ン基等、補体系第２経路を活性化しかつリポソームの膜
内に組み込めるかあるいは膜表面上に結合できるもので
あればあらゆるものが使用可能であり、その大きさに応
じて上記Ｂ−１）またはＢ−２）のいずれかが適用され
る。

本発明で用いる、リポソームの膜内に組み込むかある
いはその膜表面上に結合する補体系第２経路を活性化す
る物質を抗原とする抗体は、抗原抗体結合物を形成した
ときに補体系古典的経路を活性化するものであれば特に
制限されない。上記の抗原をウサギ、マウス、ヤギ、ヒ
ツジ、ウマ、ウシ等の動物に免疫することによって得ら
れるポリクローナル抗体でも、ハイブリドーマ法によっ
て得られるモノクローナル抗体でもよいが、高い測定感
度が得られる点から特にモノクローナル抗体が適してい
る。また、上記の抗原がたとえばウサギ由来のものを用
いるのであれば、抗体を得るには当然ウサギ以外の免疫
動物を用いねばならない。

本発明の補体測定法で用いるポリソームとは、リン脂
質等を水溶液中に分散すると得られる、脂質二分子膜に
より囲まれた内水相をもつ人工の脂質膜小胞のことを指
し、その形状より多重層リポソーム（multilamellar ve
sicle、以下、MLVという）、小さな一枚膜リポソーム
（small unilamellar vesicle、以下、SUVという）、大
きな一枚膜リポソーム（large unilamellar vesicle、
以下、LUVという）に大別されているが、これらはいず
れも本発明に応用可能である。

本発明の補体測定法で用いるリポソームを作製する際
に使用できる脂質としては、リン脂質、糖脂質、コレス
テロールなどが挙げられ、リン脂質としては、動物や微
生物などの細胞膜に広く存在するリン脂質、たとえばホ
スファチジルエタノールアミン類、ホスファチジルコリ
ン類、ホスファチジルセリン類、スフィンゴミエリン類
などの各種リン脂質が挙げられる。もちろん、天然の卵
黄、牛脳や大豆から得られるホスチファチジルコリンも
適用できる。

このようなリン脂質中の脂肪酸の種類は各種の飽和ま
たは不飽和脂肪酸が含まれ、たとえばホスファチジルコ
リンについて挙げれば、ジヘプタノイル−、ジカプロイ
ル−、ジデカノイル−、ジラウロイル−、ジヘプタデカ
ノイル−、ジベヘノイル−、ジミリストイル−、ジパル
ミトイル−ホスファチジルコリン等の脂肪酸が挙げら
れ、前述のその他のリン脂質も同様に各種飽和および不
飽和脂肪酸が含まれる。

標識物質を封入したリポソームの調製法としては、従
来公知のリポソーム調製法を応用することができる。た
とえば（１）有機溶媒に溶解したリン脂質を容器に入
れ、減圧下のエバポレータまたは窒素ガスの吹きつけに
より溶媒を除去して薄い脂質膜を形成させ、次にあらか
じめ封入したい標識物質を含む適当な塩類溶液やあらか
じめ標識物質を溶解した水溶液を加え振盪する方法〔エ
ー・ディー・バンガム（A.D.Bangham）ら、ジャーナル
・オブ・モレキュラー・ハイオロジー（J.Mol.Bio
l.）、13巻、238頁（1965）およびディー・パパジョポ
ウラス（D.Papahadjopoulos）ら、バイオケミカル・バ
イオフィジカル・アクタ（Biochim.Biophys.Acta）、13
5巻、639頁（1967〕やボルテックスミキサーで振盪撹拌
する方法〔ケー・イノウエ（K.Inoue）、バイオケミカ
ル・バイオフィジカル・アクタ、339巻、390頁（1974）
およびエス・シー・キンスキー（S.C.Kinsky）ら、バイ
オケミストリー（Biochemistry）,8巻、4149頁（1969）
参照〕、（２）前記（１）の方法で得たMLVをさらに超
音波発振装置で超音波処理しSUVを作製する方法〔ディ
ー・パパジョポウラスら、バイオケミカル・バイオフィ
ジカル・アクタ、311巻、310頁（1973）参照〕、（３）
有機溶媒に溶解したリン脂質を急激に標識物質を含む塩
類溶液と混和する方法〔エス・バツィーリ（S.Batzri）
ら、バイオケミカル・バイオフィジカル・アクタ、298
巻、1015頁（1973）参照〕、（４）エーテルに溶解した
リン脂質をエーテルの沸点より高くした、あらかじめ標
識物質を溶解した水溶液にゆっくりと吹き出させる方法
〔ディー・ダブリュー・ディーマー（D.W.Deamer、アニ
ュアル・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス
（Ann.N.Y.Acad.Sci）、308巻、259頁（1978）参照〕、
（５）ホスファチジルセリン単独あるいは等量のホスフ
ァチジルセリンとコレステロールからなるリポソームを
超音波発振装置で超音波処理してSUVを作成し、カルシ
ウム処理の後、標識物質を含む塩類溶液とEDTAを加えLU
Vを作成する方法〔ディー・パパジョポウラス、アニュ
アル・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス、
（Ann.N.Y.Acad.Sci）、308巻、259頁（1978）参照〕、
および（６）脂質を含む有機溶媒に標識物質を溶解した
水溶液を加え超音波発振装置で超音波処理した後、ロー
タリーエバポレータで有機溶媒を除去し逆相リポソーム
とする方法〔エフ・ズォカ・ジュニア（F.Szoka.Jr.）
ら、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス・イン・ユー・エス・エー（Proc.N
atl.Ac−ad.Sci.USA）、75巻、4149頁（1978）参照〕な
どの種々の方法を利用することができる。

また、脂質やジアルキルリン酸、ジアルキルアンモニ
ウム塩などにアクリル基、メタクリル基、ジアセチレン
基、ジエン基などの重合可能な官能基を導入し、前記の
方法に基づき少なくとも一部にこの重合性の脂質などを
含んだリポソームを作製し、その後に紫外線を照射した
り重合開始剤を加えるなどの方法により、リポソーム膜
中で重合を起こさせリポソームを安定化する方法〔たと
えば、エイチ・オオノ（H.Ohno）ら、マクロモレキュー
ルズ（Macromolecules）、20巻、929頁（1987）、およ
びイー・ツチダ（E.Tsuchida）ら、マクロモレキュラー
・ヘミー（Makromol.Chem.）、187頁、1351頁（1986）
参照〕も利用することができる。リポソームの重合を行
うと、膜の物理的強度が増大し、リポソーム内に封入す
る標識物質の保持能が改善され、またリポソームどうし
の融合を防止できるため、長期間安定に保存可能であ
り、また測定の高感度化を図ることができるため、極め
て好都合である。また重合性化合物と非重合性の脂質等
からなる混合リポソームの場合、それらの組合せによ
り、相溶性のものおよび相溶性がなくリポソーム膜内で
相分離を起こすものを選択することができ、これらは重
合性化合物と非重合性の脂質等の組成の割合を変えるこ
とによって、膜の物理的強度、安定性を制御することも
できる。リポソーム膜内で相分離が起こるような混合リ
ポソームの場合、ある特定の濃度以上の補体が存在する
と、補体の作用によりステップ状に標識物質の遊離が起
こるようなものを作製することも可能であり、これを用
いると補体の存在を簡単に定性的に知ることができる。

リポソーム内に封入する標識物質としては、新水性で
あって、リポソーム外に遊離した際に定量可能な物質で
あればよく、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、金属、
色素類などリポソームに封入できるものは適用可能であ
る。たとえば、ラジオイムノアッセイで用いられる¹²⁵I
や¹³¹Iなどの放射性同位元素、蛍光免疫測定法で用いら
れるカルボキシフルオレセイン、フルオレセインイソチ
オシアネート、フルオレセインイソシアネート、テトラ
ローダミンイソチオキシアネート、５−ジメチルアミノ
−１−ナフタレンスルフォニルクロリドなどの蛍光物
質、およびエオシンＹ、オーラミンＯ、ルミノール、ル
シフェリンなどの発光物質などが使用できる。

特に、酵素免疫測定法などで用いられるβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリフォスファ
ターゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素などの酵素
またはカルシウムイオンなどの金属をリポソームに封入
すれば、補体の作用によりリポソームが破壊されること
によりこれらの物質が外部に流出した際に、それぞれの
酵素に対する基質として、４−メチルウムベリフェニル
β−Ｄ−ガラクトシド、ｐ−ヒドロキシフェニルプロピ
オン酸、４−メチルウムベリフェリルフォスフェート、
グルコース−６−リン酸、エタノールなどを用いたり、
カルシウムイオンに対するカルシウム依存性酵素、たと
えば、カルパイン、プロテインキナーゼＣ、トランスグ
ルタミナーゼを反応液中に入れておけばいずれも生化学
的増幅反応を構成し、極微量の抗原に対して高感度に応
答するので好都合である。

本発明で用いる補体系第２経路を活性化する物質をリ
ポソーム膜内に組み込む、あるいはリポソーム膜上に結
合する方法は、従来公知の方法を用いることができる。
例えば、脂質であればリポソーム作成時にリン脂質に混
和してリポソームを調製すればよい。また、トリニトロ
フェニル基等のハプテン基をホスファチジルエタノール
アミン等に導入したハプテン化脂質をリポソーム作成時
にリン脂質に混和してリポソームを調製してもよい。タ
ンパク質であれば、後述の抗体やγ−グロブリンをリポ
ソームの膜表面に結合する方法を応用することもでき
る。

抗体やγ−グロブリンのリポソーム結合法について
も、従来公知の方法、たとえば（１）ホスファチジルエ
タノールアミンと抗体をグルタルアルデヒドで架橋する
方法（ブイ・ピー・トールチリン（V.P.Torchilin）
ら、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コ
ミュニケーション（Biochem.Biophys.Reo.Comm）、85
巻、983頁（1978）参照）、（２）ホスファチジルエタ
ノールアミンにSH基と反応する試薬を共有結合したもの
をリポソームに組み込み、これにSH基を導入した抗体を
結合する方法〔エル・ディー・レーザーマン（L.D.Lese
rman）ら、ネイチャー（Nature）、288巻、602頁（198
0）およびワイ・ハシモト（Y.Hashimoto）ら、ジャーナ
ル・オブ・イムノロジカル・メソッズ（J.Immnol.Metho
ds）、62巻、155頁（1983）参照〕、および（３）リポ
ソーム内に糖脂質を組み込んでおき、過ヨウ素処理で生
じたアルデヒド基と抗体を反応させる方法〔テェー・デ
ィー・ヒース（T.D.Heath）ら、バイオケミカル・バイ
オフィジカル・アクタ、640巻、66頁（1981）参照〕な
どが利用される。

上記のようにして調製したリポソームは勿論そのまま
の状態で使用できるが、さらにリポソームを一般的に用
いられる担体結合法、架橋法、包括法などの固定化法を
用いることによって得られた固定化物として利用するこ
ともできる。担体結合法の担体としては、セルロース、
デキストラン、アガロース、デンプンなどの多糖類の誘
導体、多孔性の合成樹脂、金属酸化物などの無機物質な
どが、また包括法の担体としては、合成高分子物質のポ
リアクリルアミド、光硬化性樹脂（ENT膜など）、ウレ
タンプレポリマーおよび天然高分子物質のアルギン酸、
カラギーナン、デンプン、ゼラチン、キトサンなどが適
用である。また固定化物の形状は、固定下方の種類によ
っても異なるが膜状、ビーズ状あるいはその他の形状の
ものが適用できる。

〔実施例〕

以下、本発明を実施例により更に詳しく説明するが、
本発明はこれに限定されるものではない。

実施例１ ウサギγ−グロブリン結合リポソームの調製： Ｎ−サクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニ
ル）ブチレート（SMPB）28.1μmolとジパルミトイルフ
ォスファチジルエタノールアミン（DPPE）20μmolをク
ロロホルム4.5mlと無水メタノール0.5mlとの混液に溶解
した。これにトリエチルアミン20μmolを添加し、窒素
封入下室温で２時間撹拌し反応させた。反応終了後、メ
タノール3.5ml、蒸留水2mlを加え、よく振盪した、これ
を静置し、クロロホルム相をとり、溶媒を蒸発させた
後、約5mlのクロロホルムを添加し溶解した。この溶液
を、150℃で12時間以上乾燥させクロロホルムで平衡化
した10ml容量のシリカゲル（Wakogel C−100、和光純薬
工業（株）製）カラムに負荷し、クロロホルム−メタノ
ール（20:1、V/V）40〜50mlで洗浄した。クロロホルム
−メタノール（5:1、V/V）により溶出する画分を集め、
溶媒を蒸発させた後、あらたに5mlのクロロホルムに溶
解した。以上の操作により、Ｎ−〔４−（ｐ−マレイミ
ドフェニル）ブチリル〕ジパルミトイルホスファチジル
エタノールアミン（MPB−DPPE）を調製した。

100mlナス型フラスコに、ジパルミトイルホスファチ
ジルコリン（DPPC）75μmol、コレステロール75μmol、
リン酸ジセチル（DCP）7.5μmol、MPB−DPPE7.5μmolを
とり、約10mlのクロロホルムに溶解し、42℃以上の水浴
中にてロータリーエバポレーターで溶媒を除去した後、
残った脂質薄膜に、標識物質水溶液として自己消光性の
蛍光物質である0.2Mカルボキシフルオレセイン（CF）15
mlを加えボルテックス（Vortex）ミキサーで10分間振盪
撹拌しMLVを調製した。これを15分間プローブ型超音波
発振装置（（株）日本精機製作所製、US−300）で超音
波処理することによって均一化しSUVにした。ついでリ
ポソームに封入されなかったCFを除去するためにSephad
ex G−25（商品名、ファルマシア社製）カラムにてクロ
マト分離し、反応性リポソームを得た。

5mg/mlのウサギγ−グロブリンリン酸緩衝生理食塩水
溶液5mlに10mM N−サクシンイミジル−３−（２−ピリ
ジルジチオ）プロピオネイト（SPDP）エタノール溶液を
0.1ml加え、室温で15分間撹拌し反応させた。未反応のS
PDP等を除くために、0.1M酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液
＋0.15M NaCl（pH4.5）で平衡化したSephadex G−25カ
ラムでクロマト分離した。最初のピーク部分を集め、こ
れに50mMになるようにジチオスライトール（DTT）を固
体のまま加えて溶解し、窒素封入下室温で30分間放置し
た。反応終了後、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH7.
4）で平衡化したSephadex G−25でクロマト分離し、最
初のピーク部分を集めた。以上の操作によりSPDPを通じ
てウサギγ−グロブリンにSH基を導入し、SH基導入γ−
グロブリンを調製した。

次に、反応性リポソームを２倍に希釈したものと上記
の操作で得たSH基導入γ−グロブリンを1:1（V/V）の割
合で混合し、窒素封入下４℃で12時間放置し反応させた
後、リポソームに結合しなかったγ−グロブリンを除く
ためにSephacryl S−1000（商品名、ファルマシア社
製）カラムでクロマト分離し、ウサギγ−グロブリン結
合リポソームを得た。

補体系第２経路の活性の測定： 上記のウサギγ−グロブリン結合リポソームを、その
初期蛍光強度が適当なものになるように、0.5mM MgC
l₂、0.15mM CaCl₂、および0.1重量％ゼラチンを含有し
たリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で100倍程度に希釈し
たもの4mlに、あらかじめ既知の濃度となるようPBSで稀
釈したモルモット全補体（石津製薬（株）製）を被検試
料として0.2ml加え、37℃で60分間放置して反応させた
後、各試料の蛍光強度を分光蛍光光度計（（株）島津製
作所製、RF−5000）で測定した（励起波長:490nm、蛍光
波長518nm）。尚、測定値は、測定終了後測定試料に１
−プロパノール（ｎ−プロピルアルコール）を4.2ml加
えリポソームを完全に破壊した後の蛍光強度を２倍した
もの（１−プロパノールで２倍稀釈したため）と、モル
モット全補体の代わりにPBSを0.2ml添加したものの差を
100％として、各被検試料の蛍光強度を相対的に換算し
たものを標識物質遊離率（％）とした。結果を第１図に
示す８実施例１−１）。同図からわかるように、補体濃
度に依存した標識物質の遊離が認められる。

同様に、ウサギγ−グロブリン結合リポソームを、0.
5mM MgCl₂および0.1重量％ゼラチンを含有したリン酸緩
衝生理食塩水（pH7.4）で希釈し、標識物質遊離率を測
定した。結果を第１図に示す（実施例１−２）。第１図
において、１−１と１−２は、ほぼ同じ結果を示してい
る。この例では、ウサギγ−グロブリン（抗体）は抗原
抗体結合物を形成しておらず、また補体系古典的経路が
遮断されているCa²⁺を含まない系（１−２）でも結果は
変わらないことから、この例での補体系の活性化は、補
体系第２経路の活性化に基づくものであることがわか
る。したがって、第１図にみられるような線を検量線と
して用いることにより、補体系第２経路の活性測定を行
えることがわかる。

実施例２ 補体系古典的経路および第２経路両経路の活性の測定： 実施例１と同様に、ウサギγ−グロブリン結合リポソ
ームを、その初期蛍光強度が適当なものになるように、
0.5mM MgCl₂、0.15mM CaCl₂および0.1重量％ゼラチンを
含有したリン酸緩衝生理食塩水（pH7.4）で100倍程度に
希釈したもの4mlに、ヒツジ抗ウサギIgG抗体（12mg/m
l）を10μ加え、室温で10分間放置しリポソームに結
合しているウサギγ−グロブリンとヒツジ抗ウサギIgG
抗体を反応させ、リポソーム膜表面上に抗原抗体結合物
を形成させた。その後、あらかじめ既知の濃度となるよ
うにPBSで希釈したモルモット全補体（石津製薬（株）
製）を被検試料として0.2ml加え、37℃で60分間放置し
て反応させた後、各試料の標識物質遊離率を測定した。
結果を第２図に示す（実施例２−１）。ヒツジ抗ウサギ
IgG抗体を添加していない場合の標識物質遊離率も、合
わせて同図に示した（実施例２−２）。尚、標識物質遊
離率の表示は実施例１にしたがった。

同図からわかるように、ヒツジ抗ウサギIgG抗体の添
加により標識物質遊離率の増大が認められる。これは、
リポソーム膜表面上に形成された抗原抗体結合物によっ
て新たに補体系古典的経路が活性化され、補体系の古典
的経路と第２経路の両経路の活性を反映したためであ
る。したがって、第２図にみられるような線（２−１）
を検量線として用いることにより、補体系古典的経路と
第２経路の両経路の活性を測定でき、また２−２は補体
系第２経路の活性を反映していることから、２−１と２
−２の結果の差をとることで古典的経路の活性を算出で
きることがわかる。

実施例３ ヒト補体の測定： 実施例１、２と同様にして、ヒト補体（ヒト全補体、
石津製薬（株）製）の測定を行った。結果を第３図に示
す。ヒツジ抗ウサギIgG抗体を添加した場合に標識物質
遊離率を３−１、ヒツジ抗ウサギIgG抗体を添加してい
ない場合の標識物質遊離率を３−２とした。なお、標識
物質遊離率の表示は実施例１にしたがった。ヒト補体で
もモルモット補体同様の結果が得られ、補体系古典的経
路と第２経路のそれぞれの活性を測定することができる
ことがわかる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、標識物質をその内部に封入し、かつ
補体系の第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込
むかあるいはその膜表面上に結合したリポソームと上記
補体系第２経路を活性する物質を抗原とする抗体を用
い、補体活性に応じて遊離する標識物質を測定すること
により、被検試料中の補体系古典的経路および第２経路
のそれぞれの活性あるいは成分活性が、同一の方法、シ
ステムで、感度よく、分離操作なしにきわめて簡単に、
一時間程度の短時間で、赤血球などに比べて安定な試薬
を用いて測定できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１で測定したモルモット補体濃度と標
識物質遊離率との関係を示すグラフである。第２図は、
実施例２で測定したヒツジ抗ウサギIgG抗体を添加した
場合および添加しない場合のモルモット補体濃度と標識
物質遊離率との関係を示すグラフである。第３図は、実
施例３で測定したヒツジ抗ウサギIgG抗体を添加した場
合および添加しない場合のヒト補体濃度と標識物質遊離
率との関係を示すグラフである。

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】標識物質をその内部に封入し、かつ補体系
   の第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込むかあ
   るいはその膜表面上に結合した補体測定用リポソーム。
2. 【請求項２】標識物質をその内部に封入し、かつ補体系
   の第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込むかあ
   るいはその膜表面上に結合したリポソームに補体系の第
   ２経路を活性化する物質を抗原とする抗体を結合した補
   体測定用リポソーム。
3. 【請求項３】標識物質をその内部に封入し、かつ補体系
   の第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込むかあ
   るいはその膜表面上に結合したリポソームを被検試料中
   に存在する補体と作用させることにより、該被検試料の
   補体活性に応じて該ポリソームから遊離する標識物質を
   測定することを特徴とする補体測定法。
4. 【請求項４】標識物質をその内部に封入し、かつ補体系
   の第２経路を活性化する物質をその膜内に組み込むかあ
   るいはその膜表面上に結合したリポソームに補体系の第
   ２経路を活性化する物質を抗原とする抗体を結合した
   後、被検試料中に存在する補体と作用させることによ
   り、該被検試料の補正活性に応じて該ポリソームから遊
   離する標識物質を測定することを特徴とする補体測定
   法。
5. 【請求項５】請求項１および２のリポソームを併用する
   ことを特徴とする補体系の古典的経路および第２経路の
   同時測定方法。