JPH06209772A - リパーゼの製造法及びそれに用いるリパーゼ生産菌 - Google Patents
リパーゼの製造法及びそれに用いるリパーゼ生産菌Info
- Publication number
- JPH06209772A JPH06209772A JP3202093A JP3202093A JPH06209772A JP H06209772 A JPH06209772 A JP H06209772A JP 3202093 A JP3202093 A JP 3202093A JP 3202093 A JP3202093 A JP 3202093A JP H06209772 A JPH06209772 A JP H06209772A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lipase
- producing
- strain
- pseudomonas
- antibiotic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 抗生物質耐性を有するリパーゼ生産菌を培養
し、培養物からリパーゼを採取することによるリパーゼ
の製造法およびそれに用いるリパーゼ生産菌。 【構成】 シュードモナス属菌株を親株として変異によ
り得られた抗生物質耐性を有する菌株を培養し、培養物
からリパーゼを採取することを特徴とするリパーゼの製
造法およびそれに用いるリパーゼ生産菌。 【効果】 本発明によるリパーゼの製造法およびそれに
用いるリパーゼ生産菌によりリパーゼの高生産化がはか
れる。
し、培養物からリパーゼを採取することによるリパーゼ
の製造法およびそれに用いるリパーゼ生産菌。 【構成】 シュードモナス属菌株を親株として変異によ
り得られた抗生物質耐性を有する菌株を培養し、培養物
からリパーゼを採取することを特徴とするリパーゼの製
造法およびそれに用いるリパーゼ生産菌。 【効果】 本発明によるリパーゼの製造法およびそれに
用いるリパーゼ生産菌によりリパーゼの高生産化がはか
れる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は工業用酵素として有用で
あるリパーゼを効率よく製造する方法に関する。更に詳
しくは抗生物質耐性を有するリパーゼ生産菌株を用いて
効率よくリパーゼを製造する方法に関する。また、酵素
の生産に有用である抗生物質耐性を有する菌に関する。
あるリパーゼを効率よく製造する方法に関する。更に詳
しくは抗生物質耐性を有するリパーゼ生産菌株を用いて
効率よくリパーゼを製造する方法に関する。また、酵素
の生産に有用である抗生物質耐性を有する菌に関する。
【０００２】
【従来の技術】リパーゼは、食品加工用酵素、消化剤と
しての医療用酵素、血中脂質の測定のための試薬用酵
素、油脂の加水分解や油脂の改質のための工業用酵素と
して広範に使用されている。近年においてはさらに洗剤
用酵素としてリパーゼが洗浄力の向上に有効であるとい
われ注目されている。
しての医療用酵素、血中脂質の測定のための試薬用酵
素、油脂の加水分解や油脂の改質のための工業用酵素と
して広範に使用されている。近年においてはさらに洗剤
用酵素としてリパーゼが洗浄力の向上に有効であるとい
われ注目されている。
【０００３】工業用リパーゼの生産菌に関しては従来よ
り多くの菌株が報告されており、その一部は工業的生産
に利用されている。例えば、それらの菌株はシュードモ
ナス(Pseudomonas) 属、アルカリゲネス(Alcaligenes)
属、アクロモバクター(Achromobacter) 属、ムコール(M
ucor) 属、キャンディダ(Candida) 属、フミコーラ(Hum
icola)属に由来することが知られている。また、リパー
ゼを生産するシュードモナス属の菌株にはシュードモナ
ス・フルオレッセンス(Ps. fluorescens) 、シュードモ
ナス・セパシア(Ps. cepacia) 、シュードモナス・フラ
ジ(Ps. fragi)、シュードモナス・アエルギノサ(Ps. ae
ruginosa)、シュードモナス・アルカリゲネス(Ps. alca
ligenes) などがある。
り多くの菌株が報告されており、その一部は工業的生産
に利用されている。例えば、それらの菌株はシュードモ
ナス(Pseudomonas) 属、アルカリゲネス(Alcaligenes)
属、アクロモバクター(Achromobacter) 属、ムコール(M
ucor) 属、キャンディダ(Candida) 属、フミコーラ(Hum
icola)属に由来することが知られている。また、リパー
ゼを生産するシュードモナス属の菌株にはシュードモナ
ス・フルオレッセンス(Ps. fluorescens) 、シュードモ
ナス・セパシア(Ps. cepacia) 、シュードモナス・フラ
ジ(Ps. fragi)、シュードモナス・アエルギノサ(Ps. ae
ruginosa)、シュードモナス・アルカリゲネス(Ps. alca
ligenes) などがある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの菌株
によるリパーゼの生産性は一般的に極めて低く、産業上
の利用において必ずしも満足できるものではない。そこ
で、通常、この問題を解決するために突然変異による生
産性の改善が試みられる。従来の生産性改善方法は、突
然変異処理を施し、生き残った全ての菌の中からより生
産性の高い菌株を選び出すという方法であるが、この方
法は膨大な時間と労力を要するものである。そこで、こ
れらリパーゼを一層効率よく製造する方法の確立が強く
求められている。また、他の酵素については、バンコマ
イシンあるいはリストセチンに耐性を有する菌株を用い
てセルラーゼ、プロテアーゼあるいはアミラーゼを効率
よく製造する方法（特開平１−２２２７７１号）、ツニ
カマイシンに耐性を有する菌株を用いてα−アミラーゼ
を製造する方法(T. Sasaki et. al., BIOCHEMICAL AND
BIOPHYSICAL RESEACH COMMUNICATIONS, 70, 125-131, 1
976)などの例があるが、リパーゼにおいてこのような報
告はなされていない。
によるリパーゼの生産性は一般的に極めて低く、産業上
の利用において必ずしも満足できるものではない。そこ
で、通常、この問題を解決するために突然変異による生
産性の改善が試みられる。従来の生産性改善方法は、突
然変異処理を施し、生き残った全ての菌の中からより生
産性の高い菌株を選び出すという方法であるが、この方
法は膨大な時間と労力を要するものである。そこで、こ
れらリパーゼを一層効率よく製造する方法の確立が強く
求められている。また、他の酵素については、バンコマ
イシンあるいはリストセチンに耐性を有する菌株を用い
てセルラーゼ、プロテアーゼあるいはアミラーゼを効率
よく製造する方法（特開平１−２２２７７１号）、ツニ
カマイシンに耐性を有する菌株を用いてα−アミラーゼ
を製造する方法(T. Sasaki et. al., BIOCHEMICAL AND
BIOPHYSICAL RESEACH COMMUNICATIONS, 70, 125-131, 1
976)などの例があるが、リパーゼにおいてこのような報
告はなされていない。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、リパーゼ
生産菌のリパーゼ生産性の向上について鋭意研究を行っ
た結果、リパーゼ生産菌に抗生物質耐性を付与すれば、
リパーゼ生産性が大きく向上することを見いだし、本発
明を完成した。例えば、シュードモナス属の人工あるい
は自然突然変異株であって、抗生物質の一つであるスト
レプトマイシンに対する耐性を有する菌株がリパーゼを
培地中に著量生産することを見いだした。なお、本発明
におけるストレプトマイシン耐性とは、普通の細菌では
本来生育できないような濃度のストレプトマイシン存在
下、例えば菌株の種類により異なるが、一般には数十pp
m 程度のストレプトマイシン存在下でも生育が可能な性
質である。
生産菌のリパーゼ生産性の向上について鋭意研究を行っ
た結果、リパーゼ生産菌に抗生物質耐性を付与すれば、
リパーゼ生産性が大きく向上することを見いだし、本発
明を完成した。例えば、シュードモナス属の人工あるい
は自然突然変異株であって、抗生物質の一つであるスト
レプトマイシンに対する耐性を有する菌株がリパーゼを
培地中に著量生産することを見いだした。なお、本発明
におけるストレプトマイシン耐性とは、普通の細菌では
本来生育できないような濃度のストレプトマイシン存在
下、例えば菌株の種類により異なるが、一般には数十pp
m 程度のストレプトマイシン存在下でも生育が可能な性
質である。
【０００６】また、例えば、リパーゼ生産菌に、抗生物
質の一種である細胞壁合成阻害剤に対する耐性を付与す
れば、リパーゼ生産性が大きく向上することを見いだし
た。なお、本発明における細胞壁合成阻害剤耐性とは、
普通の菌株では本来生育できないような濃度の細胞壁合
成阻害剤存在下、例えば菌株の種類により異なるが、一
般には数十ｐｐｍ程度の細胞壁合成阻害剤存在下でも生
育が可能な性質である。
質の一種である細胞壁合成阻害剤に対する耐性を付与す
れば、リパーゼ生産性が大きく向上することを見いだし
た。なお、本発明における細胞壁合成阻害剤耐性とは、
普通の菌株では本来生育できないような濃度の細胞壁合
成阻害剤存在下、例えば菌株の種類により異なるが、一
般には数十ｐｐｍ程度の細胞壁合成阻害剤存在下でも生
育が可能な性質である。
【０００７】すなわち、本発明は抗生物質耐性を有する
リパーゼ生産菌を用いたリパーゼの製造方法を提供する
ものである。また、リパーゼのごとき酵素の生産に有用
である抗生物質耐性を有する菌を提供するものである。
本発明において、抗生物質耐性を有する菌は、例えば、
次のようにして得られる。すなわち、耐性を付与したい
リパーゼ生産菌（親株）を適当な培地に生育させ、その
菌体を紫外線、Ｘ線などの照射、あるいはエチルメタン
スルフォネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ｐ−ジメチルア
ミノベンゼンジアゾスルホン酸などの既知の突然変異誘
発物質で処理し、適当に洗浄希釈して親株の生育できな
い濃度（最小生育阻止濃度（ＭＩＣ））の抗生物質を含
む、例えばストレプトマイシンの場合には数十ppm 程度
を、また細胞壁合成阻害剤の場合には１００ｐｐｍ程度
を含む寒天培地に広げ、生育してくるストレプトマイシ
ン耐性や細胞壁合成阻害剤耐性などの抗生物質耐性菌株
のコロニーを得る。このようにして得られた耐性株の多
くが驚くべきことに親株に比べ多量のリパーゼを生産す
るので、これらの耐性株の中から高リパーゼ生産菌を得
ることができる。
リパーゼ生産菌を用いたリパーゼの製造方法を提供する
ものである。また、リパーゼのごとき酵素の生産に有用
である抗生物質耐性を有する菌を提供するものである。
本発明において、抗生物質耐性を有する菌は、例えば、
次のようにして得られる。すなわち、耐性を付与したい
リパーゼ生産菌（親株）を適当な培地に生育させ、その
菌体を紫外線、Ｘ線などの照射、あるいはエチルメタン
スルフォネート（ＥＭＳ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ
−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、ｐ−ジメチルア
ミノベンゼンジアゾスルホン酸などの既知の突然変異誘
発物質で処理し、適当に洗浄希釈して親株の生育できな
い濃度（最小生育阻止濃度（ＭＩＣ））の抗生物質を含
む、例えばストレプトマイシンの場合には数十ppm 程度
を、また細胞壁合成阻害剤の場合には１００ｐｐｍ程度
を含む寒天培地に広げ、生育してくるストレプトマイシ
ン耐性や細胞壁合成阻害剤耐性などの抗生物質耐性菌株
のコロニーを得る。このようにして得られた耐性株の多
くが驚くべきことに親株に比べ多量のリパーゼを生産す
るので、これらの耐性株の中から高リパーゼ生産菌を得
ることができる。
【０００８】また得られた耐性株を親株として、更に人
工的あるいは自然突然変異によりリパーゼ生産性のより
優れた菌株を得ることができるが、それらの変異株およ
び該変異株を培養することによるリパーゼの製造法も本
発明に包含される。
工的あるいは自然突然変異によりリパーゼ生産性のより
優れた菌株を得ることができるが、それらの変異株およ
び該変異株を培養することによるリパーゼの製造法も本
発明に包含される。
【０００９】本発明で用いられるリパーゼ生産菌の代表
的な例として具体的に例示すれば、シュードモナス(Pse
udomonas) 属ＮＣＩＭＢ１０５４１株を親株として上記
の操作により得られたシュードモナスＳＤ７０３（微工
研菌寄第１３３０７号）などのストレプトマイシン耐性
株およびＮＣＩＭＢ１０５４１株を親株として上記の操
作により得られたシュードモナス・メンドシナＳＤ７０
４（微工研菌寄第１３３５７号）などの細胞壁合成阻害
剤耐性株が挙げられる。なお、ＮＣＩＭＢ１０５４１株
は英国 National Collection of Industrial and Marin
e Bacteria, Aberdeen, Scotlandより入手したタイプカ
ルチャーであり、その菌学的性質はバージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Ber
gey's Mannual of Systematic Bacteriology (1984))に
記載されている。この菌株の変異により得られたストレ
プトマイシン耐性株であるシュードモナスＳＤ７０３な
どのストレプトマイシン耐性株の菌学的性質は、ストレ
プトマイシン耐性度及びリパーゼの生産性以外は親株と
実質的に同一であり、同様に細胞壁合成阻害剤耐性株で
あるシュードモナス・メンドシナＳＤ７０４などの細胞
壁合成阻害剤耐性株の菌学的性質は細胞壁合成阻害剤耐
性度及びリパーゼの生産性以外は親株と実質的に同一で
ある。
的な例として具体的に例示すれば、シュードモナス(Pse
udomonas) 属ＮＣＩＭＢ１０５４１株を親株として上記
の操作により得られたシュードモナスＳＤ７０３（微工
研菌寄第１３３０７号）などのストレプトマイシン耐性
株およびＮＣＩＭＢ１０５４１株を親株として上記の操
作により得られたシュードモナス・メンドシナＳＤ７０
４（微工研菌寄第１３３５７号）などの細胞壁合成阻害
剤耐性株が挙げられる。なお、ＮＣＩＭＢ１０５４１株
は英国 National Collection of Industrial and Marin
e Bacteria, Aberdeen, Scotlandより入手したタイプカ
ルチャーであり、その菌学的性質はバージーズ・マニュ
アル・オブ・システマティック・バクテリオロジー(Ber
gey's Mannual of Systematic Bacteriology (1984))に
記載されている。この菌株の変異により得られたストレ
プトマイシン耐性株であるシュードモナスＳＤ７０３な
どのストレプトマイシン耐性株の菌学的性質は、ストレ
プトマイシン耐性度及びリパーゼの生産性以外は親株と
実質的に同一であり、同様に細胞壁合成阻害剤耐性株で
あるシュードモナス・メンドシナＳＤ７０４などの細胞
壁合成阻害剤耐性株の菌学的性質は細胞壁合成阻害剤耐
性度及びリパーゼの生産性以外は親株と実質的に同一で
ある。
【００１０】本発明において用いられる抗生物質とは、
微生物その他の細胞の発育を阻害する物質と定義され
る。本発明において用いられるかかる抗生物質は特に限
定されるものではなく、通常、細胞壁合成阻害剤、蛋白
質合成阻害剤、核酸合成阻害剤、もしくは細胞膜構造に
障害を与える抗生物質として分類されている抗生物質で
あればよい。細胞壁合成阻害剤としては、例えば、β−
ラクタム系抗生物質、リピッドサイクルに作用する抗生
物質、Ｄ−アラニンの取り込みを阻害する抗生物質など
が挙げられる。β−ラクタム系抗生物質の例としては、
カルベニシリン、ペニシリン、アンピシリンなど、リピ
ッドサイクルに作用する抗生物質の例としては、バンコ
マイシン、レストセチン、エンラマイシン、マコルボマ
イシン、モエノマイシンなど、Ｄ−アラニンの取り込み
を阻害する抗生物質の例としては、Ｄ−シクロセリンな
どが挙げられ、またその他の細胞壁合成阻害剤としては
ツニカマイシンなどが挙げられる。蛋白質合成阻害剤と
しては、例えば、ストレプトマイシン、スペクチノマイ
シンなどが挙げられる。核酸合成阻害剤としては、例え
ば、リファマイシンなどが挙げられる。
微生物その他の細胞の発育を阻害する物質と定義され
る。本発明において用いられるかかる抗生物質は特に限
定されるものではなく、通常、細胞壁合成阻害剤、蛋白
質合成阻害剤、核酸合成阻害剤、もしくは細胞膜構造に
障害を与える抗生物質として分類されている抗生物質で
あればよい。細胞壁合成阻害剤としては、例えば、β−
ラクタム系抗生物質、リピッドサイクルに作用する抗生
物質、Ｄ−アラニンの取り込みを阻害する抗生物質など
が挙げられる。β−ラクタム系抗生物質の例としては、
カルベニシリン、ペニシリン、アンピシリンなど、リピ
ッドサイクルに作用する抗生物質の例としては、バンコ
マイシン、レストセチン、エンラマイシン、マコルボマ
イシン、モエノマイシンなど、Ｄ−アラニンの取り込み
を阻害する抗生物質の例としては、Ｄ−シクロセリンな
どが挙げられ、またその他の細胞壁合成阻害剤としては
ツニカマイシンなどが挙げられる。蛋白質合成阻害剤と
しては、例えば、ストレプトマイシン、スペクチノマイ
シンなどが挙げられる。核酸合成阻害剤としては、例え
ば、リファマイシンなどが挙げられる。
【００１１】本発明のリパーゼ製造法で用いられる培地
は、用いる菌株が増殖し得るものならば任意のものでよ
く、例えば炭素源としては同化できる炭素化合物または
これを含有するものであればよく、例えばグルコース、
澱粉もしくは液化澱粉などの澱粉水解物、糖蜜、グリセ
リン、油脂、コーンスティープリカー、Ｔｗｅｅｎ系界
面活性剤など、窒素源としては同化可能な窒素化合物ま
たはこれを含有するものであればよく、例えば大豆粉、
肉エキス、ファーマメディア、コーンスティプリカーな
どの有機窒素源、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒
素源が用いられる。またこの他に、無機塩類としては通
常用いられるリン酸一水素塩等のリン酸塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩、マンガン塩などを適宜添加するこ
ともできる。
は、用いる菌株が増殖し得るものならば任意のものでよ
く、例えば炭素源としては同化できる炭素化合物または
これを含有するものであればよく、例えばグルコース、
澱粉もしくは液化澱粉などの澱粉水解物、糖蜜、グリセ
リン、油脂、コーンスティープリカー、Ｔｗｅｅｎ系界
面活性剤など、窒素源としては同化可能な窒素化合物ま
たはこれを含有するものであればよく、例えば大豆粉、
肉エキス、ファーマメディア、コーンスティプリカーな
どの有機窒素源、アンモニウム塩、硝酸塩などの無機窒
素源が用いられる。またこの他に、無機塩類としては通
常用いられるリン酸一水素塩等のリン酸塩、マグネシウ
ム塩、カルシウム塩、マンガン塩などを適宜添加するこ
ともできる。
【００１２】本発明における抗生物質耐性菌の培養は好
気条件下に例えば通気撹拌法や振盪培養法によって行
う。培養温度は１０〜４０℃の範囲で行うがとりわけ２
０〜３７℃の範囲で行うことが好ましい。培養時のｐＨ
については培養全期を通してｐＨ５〜１２で行えば良い
が、特に初発ｐＨは７〜9.5 の範囲とすることが好まし
い。培養時間は通常８〜１００時間の範囲であるが、リ
パーゼ蓄積量が最高に達したときに培養を終了すればよ
い。特に経済性の見地から２０〜５０時間の範囲とする
ことが好ましい。培地組成および培養条件により抗生物
質耐性株のリパーゼの生産性は大きく変動するが、いか
なる培養条件においても各々の親株の1.5 〜２倍以上の
リパーゼを生産する。
気条件下に例えば通気撹拌法や振盪培養法によって行
う。培養温度は１０〜４０℃の範囲で行うがとりわけ２
０〜３７℃の範囲で行うことが好ましい。培養時のｐＨ
については培養全期を通してｐＨ５〜１２で行えば良い
が、特に初発ｐＨは７〜9.5 の範囲とすることが好まし
い。培養時間は通常８〜１００時間の範囲であるが、リ
パーゼ蓄積量が最高に達したときに培養を終了すればよ
い。特に経済性の見地から２０〜５０時間の範囲とする
ことが好ましい。培地組成および培養条件により抗生物
質耐性株のリパーゼの生産性は大きく変動するが、いか
なる培養条件においても各々の親株の1.5 〜２倍以上の
リパーゼを生産する。
【００１３】このようにして培養を行った後、培養液か
らのリパーゼの採取は、リパーゼを採取するための常法
にしたがって分離、精製することにより行うことができ
る。すなわち培養液から濾過法や遠心分離法などの公知
の適当な方法により菌体や培地固形物を分離して、上清
液または濾液を得ることができる。これらの分離液を濃
縮しまたは濃縮することなく可溶性塩類を添加して酵素
を沈澱させる塩析法、親水性有機溶剤を添加し酵素ある
いは夾雑物を沈澱させる有機溶剤沈澱法、イオン交換樹
脂を用いた吸着脱離法、膜分離あるいはゲル濾過法、安
定補助剤なしに噴霧乾燥する方法、凍結乾燥法などの分
離もしくは精製手段を単独または複数組み合わせてリパ
ーゼを溶液あるいは粉末など所望の形態で得ることがで
きる。
らのリパーゼの採取は、リパーゼを採取するための常法
にしたがって分離、精製することにより行うことができ
る。すなわち培養液から濾過法や遠心分離法などの公知
の適当な方法により菌体や培地固形物を分離して、上清
液または濾液を得ることができる。これらの分離液を濃
縮しまたは濃縮することなく可溶性塩類を添加して酵素
を沈澱させる塩析法、親水性有機溶剤を添加し酵素ある
いは夾雑物を沈澱させる有機溶剤沈澱法、イオン交換樹
脂を用いた吸着脱離法、膜分離あるいはゲル濾過法、安
定補助剤なしに噴霧乾燥する方法、凍結乾燥法などの分
離もしくは精製手段を単独または複数組み合わせてリパ
ーゼを溶液あるいは粉末など所望の形態で得ることがで
きる。
【００１４】本発明で得られるリパーゼの活性は公知の
方法、例えば、トリオレイン−ポリビニルアルコール
（ＰＶＡ）エマルジョンを基質とする乳化系測定法を用
いて測定する。具体的には酵素液0.1ml 、２００mMトリ
ス緩衝液（ｐＨ9.0)0.4ml 、及びトリオレインエマルジ
ョン0.5ml からなる反応液を共栓付き試験管中で３７℃
にて１０分間反応させ、反応停止液として１Ｎ塩酸0.2m
l を用いて反応を停止させる。トリオレイン−ＰＶＡエ
マルジョンは、ＰＶＡ２％水溶液（ポバールＰＶＡ１１
７（（株）クラレ商品名）：ポバールＰＶＡ２０５
（（株）クラレ商品名）＝９：１）１５mlに1.5 ｇのト
リオレインを加え氷冷しながら18000rpm１０分間ホモジ
ナイズしたものである。反応停止液、ｎ−ヘキサン２m
l、イソプロピルアルコール２ml、蒸留水１mlを加え激
しく撹拌し、静置後ヘキサン層をサンプリングし、ＴＬ
Ｃ−ＦＩＤ法（Minagawa et. al., Lipids. 18 732(198
3)）にてオレイン酸を定量する。活性の単位は、１分間
に１マイクロモルのオレイン酸を生成する酵素量を１ユ
ニット（Ｕ）とする。
方法、例えば、トリオレイン−ポリビニルアルコール
（ＰＶＡ）エマルジョンを基質とする乳化系測定法を用
いて測定する。具体的には酵素液0.1ml 、２００mMトリ
ス緩衝液（ｐＨ9.0)0.4ml 、及びトリオレインエマルジ
ョン0.5ml からなる反応液を共栓付き試験管中で３７℃
にて１０分間反応させ、反応停止液として１Ｎ塩酸0.2m
l を用いて反応を停止させる。トリオレイン−ＰＶＡエ
マルジョンは、ＰＶＡ２％水溶液（ポバールＰＶＡ１１
７（（株）クラレ商品名）：ポバールＰＶＡ２０５
（（株）クラレ商品名）＝９：１）１５mlに1.5 ｇのト
リオレインを加え氷冷しながら18000rpm１０分間ホモジ
ナイズしたものである。反応停止液、ｎ−ヘキサン２m
l、イソプロピルアルコール２ml、蒸留水１mlを加え激
しく撹拌し、静置後ヘキサン層をサンプリングし、ＴＬ
Ｃ−ＦＩＤ法（Minagawa et. al., Lipids. 18 732(198
3)）にてオレイン酸を定量する。活性の単位は、１分間
に１マイクロモルのオレイン酸を生成する酵素量を１ユ
ニット（Ｕ）とする。
【００１５】
【実施例】次にこれらの抗生物質耐性株の取得につい
て、参考例・実施例で示すが、これは単なる例示であり
本発明を限定するものではなく、本発明で用いられる抗
生物質耐性株は他の方法によって得られたものでもよ
い。
て、参考例・実施例で示すが、これは単なる例示であり
本発明を限定するものではなく、本発明で用いられる抗
生物質耐性株は他の方法によって得られたものでもよ
い。
【００１６】参考例１ ＮＣＩＭＢ１０５４１株を各濃度のストレプトマイシン
を含有せしめた以下に示す培地組成１に塗布し、ストレ
プトマイシンの最小生育阻止濃度を求めた。すなわち、
ストレプトマイシンを添加した培地１に上記ＮＣＩＭＢ
１０５４１株懸濁液（菌濃度１０8 個／ml）を一白金耳
塗布した後、３５℃で１日放置し該菌株の表面生育を目
視で観察した。この結果を表１に示す。
を含有せしめた以下に示す培地組成１に塗布し、ストレ
プトマイシンの最小生育阻止濃度を求めた。すなわち、
ストレプトマイシンを添加した培地１に上記ＮＣＩＭＢ
１０５４１株懸濁液（菌濃度１０8 個／ml）を一白金耳
塗布した後、３５℃で１日放置し該菌株の表面生育を目
視で観察した。この結果を表１に示す。
【００１７】 培地組成１ ヘプトン 1.0 ％ 酵母エキス 0.5 ％ 塩化ナトリウム 0.5 ％ 炭酸ナトリウム 0.3 ％ 寒天 2.0 ％ （培地はオートクレーブにより１２１℃・２０分間の滅
菌処理を行った。）
菌処理を行った。）
【００１８】
【表１】
【００１９】この結果から明らかなようにＮＣＩＭＢ１
０５４１株に対する最小阻止濃度はストレプトマイシン
約５０ppm であった。
０５４１株に対する最小阻止濃度はストレプトマイシン
約５０ppm であった。
【００２０】参考例２ ＮＣＩＭＢ１０５４１株を各濃度のカルベニシリンを含
有せしめた以下に示す培地組成２に塗布し、カルベニシ
リンの最小生育阻止濃度を求めた。すなわち、カルベニ
シリンを添加した培地２に上記ＮＣＩＭＢ１０５４１株
懸濁液（菌濃度１０8 個／ml）を一白金耳塗布した後、
３５℃で１日放置し該菌株の表面生育を目視で観察し
た。この結果を表２に示す。
有せしめた以下に示す培地組成２に塗布し、カルベニシ
リンの最小生育阻止濃度を求めた。すなわち、カルベニ
シリンを添加した培地２に上記ＮＣＩＭＢ１０５４１株
懸濁液（菌濃度１０8 個／ml）を一白金耳塗布した後、
３５℃で１日放置し該菌株の表面生育を目視で観察し
た。この結果を表２に示す。
【００２１】 培地組成２ ヘプトン 1.0 ％ 酵母エキス 0.5 ％ 塩化ナトリウム 0.5 ％ 寒天 2.0 ％ （培地はオートクレーブにより１２１℃・２０分間の滅
菌処理を行った。）
菌処理を行った。）
【００２２】
【表２】
【００２３】この結果から明らかなようにＮＣＩＭＢ１
０５４１株に対する最小阻止濃度はカルベニシリン約１
００ppm であった。
０５４１株に対する最小阻止濃度はカルベニシリン約１
００ppm であった。
【００２４】実施例１ ＮＣＩＭＢ１０５４１株を培地組成１の平板培地を用
い、３５℃で１６時間培養しその一白金耳量をモルトン
栓付き試験管に入れた寒天を含まぬ前記培地組成１の液
体培地５mlに接種した。これを５時間培養し遠心分離を
行い、得られた菌体を生理食塩水に懸濁し終濃度１００
ppm になるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン（ＮＴＧ）溶液を加え、１０分間３０℃
に放置した。次に遠心分離により菌体を集め、生理食塩
水で洗浄し、寒天を除いた前記培地組成１の液体培地で
３５℃で１６時間振盪培養した。この培養液をストレプ
トマイシンを２００ppm 含有する培地組成１の平板培地
に、１枚あたり生菌数が約１０8 個になるように希釈し
て撒いた。３５℃で１日間培養し生育してきた菌の集落
はその大部分がストレプトマイシン耐性株であった。
い、３５℃で１６時間培養しその一白金耳量をモルトン
栓付き試験管に入れた寒天を含まぬ前記培地組成１の液
体培地５mlに接種した。これを５時間培養し遠心分離を
行い、得られた菌体を生理食塩水に懸濁し終濃度１００
ppm になるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン（ＮＴＧ）溶液を加え、１０分間３０℃
に放置した。次に遠心分離により菌体を集め、生理食塩
水で洗浄し、寒天を除いた前記培地組成１の液体培地で
３５℃で１６時間振盪培養した。この培養液をストレプ
トマイシンを２００ppm 含有する培地組成１の平板培地
に、１枚あたり生菌数が約１０8 個になるように希釈し
て撒いた。３５℃で１日間培養し生育してきた菌の集落
はその大部分がストレプトマイシン耐性株であった。
【００２５】実施例２ 実施例１で得た菌株及び親株をモルトン栓付き試験管に
入れた下に示す培地組成３の液体培地２mlに一白金耳接
種した。これを３５℃で１８時間振盪培養した後、培養
液を遠心分離してその上清について前記の方法により、
リパーゼ活性を測定した。その結果、表３に示すリパー
ゼ高生産性の耐性株を得た。得られたストレプトマイシ
ン耐性株の約６０％でリパーゼの生産性が親株を上回っ
ており、その生産性は親株の約 1.5〜２倍であった。表
３のなかで最も生産性の高い菌株である NO.３１をシュ
ードモナスＳＤ７０３と命名し工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１３３０７号として寄託した。
入れた下に示す培地組成３の液体培地２mlに一白金耳接
種した。これを３５℃で１８時間振盪培養した後、培養
液を遠心分離してその上清について前記の方法により、
リパーゼ活性を測定した。その結果、表３に示すリパー
ゼ高生産性の耐性株を得た。得られたストレプトマイシ
ン耐性株の約６０％でリパーゼの生産性が親株を上回っ
ており、その生産性は親株の約 1.5〜２倍であった。表
３のなかで最も生産性の高い菌株である NO.３１をシュ
ードモナスＳＤ７０３と命名し工業技術院微生物工業技
術研究所に微工研菌寄第１３３０７号として寄託した。
【００２６】 培地組成３ 大豆粉 2.0 ％ グルコース 2.0 ％ 硫酸アンモニウム 0.1 ％ 尿素 0.1 ％ 酵母エキス 0.5 ％ リン酸一水素二カリウム 0.5 ％ 硫酸マグネシウム・７水和物 0.1 ％ 炭酸ナトリウム 0.3 ％ （培地はオートクレーブにより１２１℃・２０分間の滅菌処理を行った。）
【００２７】
【表３】
【００２８】実施例３ シュードモナスＳＤ７０３及び親株を各々、モルトン栓
付き試験管に入れた以下に示す培地組成４の液体培地２
mlに一白金耳接種した。これを３５℃で１８時間振盪培
養した後、培養液を遠心分離してその上清について前記
の方法によりリパーゼ活性を測定したところ、表４に示
す結果を得た。
付き試験管に入れた以下に示す培地組成４の液体培地２
mlに一白金耳接種した。これを３５℃で１８時間振盪培
養した後、培養液を遠心分離してその上清について前記
の方法によりリパーゼ活性を測定したところ、表４に示
す結果を得た。
【００２９】 培地組成４ カザミノ酸 2.0 ％ グルコース 2.0 ％ リン酸一水素二アンモニウム 0.1 ％ リン酸一水素二カリウム 0.3 ％ 酵母エキス 0.5 ％ 硫酸マグネシウム・７水和物 0.1 ％ 炭酸ナトリウム 0.3 ％ Ｔｗｅｅｎ８０ 0.7 ％
【００３０】
【表４】
【００３１】実施例４ ＮＣＩＭＢ１０５４１株を培地組成２の平板培地を用
い、３５℃で１６時間培養しその一白金耳量をモルトン
栓付き試験管に入れた寒天を含まぬ前記培地組成１の液
体培地５mlに接種した。これを５時間培養し遠心分離を
行い、得られた菌体を生理食塩水に懸濁し終濃度１００
ppm になるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン（ＮＴＧ）溶液を加え、１０分間３０℃
に放置した。次に遠心分離により菌体を集め、生理食塩
水で洗浄し、寒天を除いた前記培地組成２の液体培地で
３５℃で１６時間振盪培養した。この培養液をカルベニ
シリンを１００ppm 含有する培地組成２の平板培地に、
１枚あたり生菌数が約１０8個になるように希釈して撒
いた。３５℃で１日間培養し生育してきた菌の集落はそ
の大部分がカルベニシリン耐性株であった。
い、３５℃で１６時間培養しその一白金耳量をモルトン
栓付き試験管に入れた寒天を含まぬ前記培地組成１の液
体培地５mlに接種した。これを５時間培養し遠心分離を
行い、得られた菌体を生理食塩水に懸濁し終濃度１００
ppm になるようにＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニト
ロソグアニジン（ＮＴＧ）溶液を加え、１０分間３０℃
に放置した。次に遠心分離により菌体を集め、生理食塩
水で洗浄し、寒天を除いた前記培地組成２の液体培地で
３５℃で１６時間振盪培養した。この培養液をカルベニ
シリンを１００ppm 含有する培地組成２の平板培地に、
１枚あたり生菌数が約１０8個になるように希釈して撒
いた。３５℃で１日間培養し生育してきた菌の集落はそ
の大部分がカルベニシリン耐性株であった。
【００３２】実施例５ 実施例４で得た菌株及び親株をモルトン栓付き試験管に
入れた培地組成３の液体培地２mlに一白金耳接種した。
これを３５℃で１８時間振盪培養した後、培養液を遠心
分離してその上清について前記の方法により、リパーゼ
活性を測定した。その結果、表５に示すリパーゼ高生産
性の耐性株を得た。得られたカルベニシリン耐性株の多
くのリパーゼの生産性が親株を上回っており、その生産
性は親株の約２〜2.5 倍であった。表５のなかで最も生
産性の高い菌株である NO.１５をシュードモナス・メン
ドシナＳＤ７０４と命名し工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第１３３５７号として寄託した。
入れた培地組成３の液体培地２mlに一白金耳接種した。
これを３５℃で１８時間振盪培養した後、培養液を遠心
分離してその上清について前記の方法により、リパーゼ
活性を測定した。その結果、表５に示すリパーゼ高生産
性の耐性株を得た。得られたカルベニシリン耐性株の多
くのリパーゼの生産性が親株を上回っており、その生産
性は親株の約２〜2.5 倍であった。表５のなかで最も生
産性の高い菌株である NO.１５をシュードモナス・メン
ドシナＳＤ７０４と命名し工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研菌寄第１３３５７号として寄託した。
【００３３】
【表５】
【００３４】実施例６ シュードモナス・メンドシナＳＤ７０４及び親株を各
々、モルトン栓付き試験管に入れた培地組成４の液体培
地２mlに一白金耳接種した。これを３５℃で１８時間振
盪培養した後、培養液を遠心分離してその上清について
前記の方法によりリパーゼ活性を測定したところ、表６
に示す結果を得た。
々、モルトン栓付き試験管に入れた培地組成４の液体培
地２mlに一白金耳接種した。これを３５℃で１８時間振
盪培養した後、培養液を遠心分離してその上清について
前記の方法によりリパーゼ活性を測定したところ、表６
に示す結果を得た。
【００３５】
【表６】
【００３６】
【発明の効果】本発明による抗生物質耐性株は、親株の
1.5 〜2.5 倍以上のリパーゼ生産性を有するので、リパ
ーゼの工業的生産に極めて有利に利用されるものであ
る。
1.5 〜2.5 倍以上のリパーゼ生産性を有するので、リパ
ーゼの工業的生産に極めて有利に利用されるものであ
る。
Claims (10)
- 【請求項１】 抗生物質耐性を有するリパーゼ生産菌を
培養し、培養物からリパーゼを採取することを特徴とす
るリパーゼの製造法。 - 【請求項２】 抗生物質耐性を有するリパーゼ生産菌が
シュードモナス（Pseudomonas ）属に属する菌である請
求項１記載のリパーゼの製造法。 - 【請求項３】 抗生物質が細胞壁合成阻害剤である請求
項１乃至２記載のリパーゼの製造法。 - 【請求項４】 細胞壁合成阻害剤がβ−ラクタム系抗生
物質である請求項３記載のリパーゼの製造法。 - 【請求項５】 β−ラクタム系抗生物質がカルベニシリ
ンである請求項４記載のリパーゼの製造法。 - 【請求項６】 抗生物質がストレプトマイシンである請
求項１乃至２記載のリパーゼの製造法。 - 【請求項７】 抗生物質耐性を有するリパーゼ生産菌が
シュードモナスＳＤ７０３（微工研菌寄第１３３０７
号）である請求項１乃至２または６記載のリパーゼの製
造法。 - 【請求項８】 抗生物質耐性を有するリパーゼ生産菌が
シュードモナス・メンドシナＳＤ７０４（微工研菌寄第
１３３５７号）である請求項１乃至５記載のリパーゼの
製造法。 - 【請求項９】 シュードモナスＳＤ７０３（微工研菌寄
第１３３０７号）およびその変異株。 - 【請求項１０】 シュードモナス・メンドシナＳＤ７０
４（微工研菌寄第１３３５７号）およびその変異株。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3202093A JPH06209772A (ja) | 1992-11-26 | 1993-02-22 | リパーゼの製造法及びそれに用いるリパーゼ生産菌 |
| CA002097000A CA2097000A1 (en) | 1992-05-27 | 1993-05-26 | Alkaline lipase, method for producing the same, microorganism producing the same and detergent composition containing alkaline lipase |
| EP93108512A EP0571982A1 (en) | 1992-05-27 | 1993-05-26 | Alkaline lipase, method for producing the same, microorganism producing the same and detergent composition containing alkaline lipase |
| US08/067,075 US5454971A (en) | 1992-05-27 | 1993-05-26 | Alkaline lipase, method for producing the same, microorganism producing the same and detergent composition containing alkaline lipase |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP31731992 | 1992-11-26 | ||
| JP4-317319 | 1992-11-26 | ||
| JP3202093A JPH06209772A (ja) | 1992-11-26 | 1993-02-22 | リパーゼの製造法及びそれに用いるリパーゼ生産菌 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06209772A true JPH06209772A (ja) | 1994-08-02 |
Family
ID=26370540
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3202093A Pending JPH06209772A (ja) | 1992-05-27 | 1993-02-22 | リパーゼの製造法及びそれに用いるリパーゼ生産菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06209772A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996027002A1 (fr) * | 1995-02-27 | 1996-09-06 | Novo Nordisk A/S | Nouveau gene de lipase et procede de production de lipase a l'aide de celui-ci |
| WO1996027659A1 (fr) * | 1995-03-06 | 1996-09-12 | Novo Nordisk A/S | Nouvelle lipase, son procede de production, et micro-organisme la produisant |
-
1993
- 1993-02-22 JP JP3202093A patent/JPH06209772A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996027002A1 (fr) * | 1995-02-27 | 1996-09-06 | Novo Nordisk A/S | Nouveau gene de lipase et procede de production de lipase a l'aide de celui-ci |
| WO1996027659A1 (fr) * | 1995-03-06 | 1996-09-12 | Novo Nordisk A/S | Nouvelle lipase, son procede de production, et micro-organisme la produisant |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Currier et al. | Isolation and preliminary characterization of auxotrophs of a filamentous cyanobacterium | |
| JP2001519654A (ja) | ストレプトミセス・エキソフォリアツスｙｊ−１１８と上記菌株を利用するプラバスタチンナトリウムの製造方法 | |
| US5739015A (en) | Biotransformation of chitin to chitosan | |
| US4492756A (en) | Microorganisms of the genus Hyphomicrobium and process for degrading compounds wich contain methyl groups in aqueous solutions | |
| JP4707251B2 (ja) | 活性汚泥及び排水処理方法 | |
| JPH06209772A (ja) | リパーゼの製造法及びそれに用いるリパーゼ生産菌 | |
| EP0343330A2 (en) | Biotransformation of L-tyrosine and L-phenylalanine to 2,5-dihydroxyphenylacetic acid | |
| RU2148645C1 (ru) | Штамм бактерий serratia marcescens-продуцент липазы | |
| JP2719703B2 (ja) | インドールおよびスカトール分解能を有する微生物並びにインドールおよびスカトールの微生物的分解方法 | |
| JP3154348B2 (ja) | スカトール分解能を有する微生物およびスカトールの微生物的分解法 | |
| JP3154349B2 (ja) | スカトール分解能を有する微生物およびスカトールの微生物的分解法 | |
| RU2310685C1 (ru) | Штамм бактерий serratia marcescens, продуцирующий липолитические ферменты, для получения препарата для очистки сточных вод от жиров | |
| JP3514799B2 (ja) | リパーゼ及びこれを産生する微生物 | |
| JPH0753104B2 (ja) | 細菌の培養法 | |
| JP2898022B2 (ja) | コラーゲン分解酵素の製造方法 | |
| JP4752024B2 (ja) | 細胞壁分解酵素と産生する微生物、並びにそれを用いたプロトプラスト調製法 | |
| JPH01144989A (ja) | コロミン酸の製造法 | |
| JPH0515387A (ja) | 細菌によるアルギン酸の分解法 | |
| CN1089807C (zh) | 生产l－天冬氨酸的方法 | |
| KR100463114B1 (ko) | 당질섬유소 폐수의 생물학적 처리방법 및 미생물 | |
| JP3858065B2 (ja) | 新規ｎ−アセチルキトオリゴ糖デアセチラーゼ及びその製造法 | |
| JPH1014563A (ja) | シュードモナス属に属するセラミダーゼ生産菌 | |
| JPS6228678B2 (ja) | ||
| JPH05176794A (ja) | 光学活性な２−フェニルプロピオン酸および２−フェニ ルプロピオンアミドの製造法 | |
| SU958498A1 (ru) | Способ получени @ -маннаназы |