JPS6339581A - アルギン酸リア−ゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアルギン酸リアーゼの製造法、更に詳しくは微
生物を培養して、その培養物からアルギン酸リアーゼを
製造する方法に関する。

〔従来の技術〕

アルギン酸リアーゼは、アルギン酸およびその塩に作用
してそれらを低分子化させる酵素である。

アルギン酸およびその塩は多くの用途に使用されている
。例えば経糸剤、食品加工、塗料、歯科印象材等にその
用途が開かれている。そしてこれらの用途においてはア
ルギン酸および／またはその塩は使用後これを除去する
必要があることがある。例えば歯科印象材としてアルギ
ン酸カルシウムゲルを使用した時、形成した義歯等から
これらを除去しなければならない。

かかる場合従来はエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）
または酸を主成分とする溶解液を用い、化学的にアルギ
ン酸および／またはその塩を可溶化させ【いる。しかし
ながらＥＤＴＡは金属を腐蝕する作用があり、基材を損
傷することがあるので、好ましくない。またクエン酸ま
たはリン酸の如き酸を用いてアルギン酸および／または
その塩のゲル除去をする方法もあるが、これらはその溶
解作用が弱いため効率的でない。

また繊維産業において経糸剤または糊剤としてアルギン
酸およびその塩を使用した時、後に染色その他の処理を
するに当っては、上記アルギン酸および／またはその塩
を予め除去する必要がある。しかもそれを除去する際、
普通に使用される方法である加温抽出は時間がかかり非
能率的であった。

上述した化学的方法に代るものとしてアルギン酸リアー
ゼを使用した力価測定方法が知られている〔例えばメン
ツズ・イン・エンジモロジー第８巻第６４１頁〜第６４
４頁（１９６６年）、参照〕。

アルギン酸リアーゼは上述した化学的方法と異なり、ア
ルギン酸および／またはその塩にのみ作用して、これを
分解し、低分子化して除去を容易にすると共に、アルギ
ン酸および／またはその塩が適用された他の材料を損う
ことがないので非常に有利である。

かかるアルギン酸リアーゼを生産する微生物としてはシ
ュウトモナス属（ジャーナル・オブ・バイオケミストリ
ー、第６６巻、１９６９年、第５０３頁〜第５１２頁）
、エーロモナス属（科学と工業、第４３巻１９６９年第
２１３頁〜第２１８頁）、タレプシエラ属（カルボハイ
ドレイト・リサーチ、１９７７年、第１６３頁〜第１７
１頁）、およびバシラス属（アプライドΦアンド・エン
ピロメンタル・マイクロハイオロジイ、第４７巻、１９
８４年、第７０４頁〜第７０９頁）等の微生物が知られ
ている。

〔発明が解決しようとする問題点〕

上述した従来より知られている微生物からアルギン酸リ
アーゼを製造する方法は何れも酵素生産能が低く、この
ため工業的な規模での酵素生産は行なわれていない。

従って本発明の目的はアルギン酸リアーゼを工業的に容
易に製造することにある。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明はアルギン酸リアーゼな製造する方法に関するも
のであって、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ　）に属するアルギン酸リアーゼ生産菌を培養し、こ
の培養物よりアルギン酸リアーゼを採取することにある
。

本発明で用いられるキサントモナス属に属する微生物は
アルギン酸リアーゼを培養物中に著量生産することが可
能で、また後述する如く非常に精製が容易である。

以下本発明について詳細に説咀する。

本発明で使用される菌株としては、キサントモナス属に
属するアルギン酸リアーゼ生産能を有する菌株であれば
いかなる菌株でもよく、またこれらの変異株でもよい。

そして、キサントモナス属に屈し、アルギン酸リアーゼ
生産能を有する菌株の具体例としては、例えばキサント
モナスａエスピー　Ｎ　−２６（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａ
ｓ　５ｐＮ−２６）を挙げることができる。本菌株は京
都府福知山市内の畑地の土壌より分離された。

本菌株の菌学的性質は次のとおりである。

＆形態的性質 顕微鏡的観察（肉汁液体培地で３０℃で培養）（１）細
胞の形および大きさ： 通常細胞の大きさは４〜５μｍＸ０．６〜０．７μ悔。

（２）細胞の多形性の有無：なし、単独である。

（３）運動性の有無：有、極雫毛を有する。

（４）胞子の有無：なし。

（５）ダラム染色性：陰性。

ｂ、各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培養： ３０℃、４８時間の培養で、直径２〜５罰の凸円形コロ
ニーを形成する。表面は滑らかでやや黄色。

（２）肉汁寒天斜面培養： ３０℃の培養で、糸状、周縁は滑らかで光沢が有り、生
育は普通。

（３）肉汁液体培養： ３０℃の培養で２４時間で生育し、生育は普通。

（４）肉汁ゼラチン穿刺培養： ３０℃の培養で２４時間で生育し、生育は普通。液化は
漏斗状。

（５）リドマスミルク培養： ３０℃の培養で凝固せず色調は青紫色で変化なし。

巳生理学的性質 （１）硝酸塩の還元：陰性 （２）脱窒反応：陰性 （３）ＭＲテスト：陽性 （４）ＶＰテスト：陰性 （５）インドールの生成：陰性 （６）硫化水素の生成：陽性 （７）二つの加水分解：陽性 （８）栄養要求性：メチオニン （９）クエン酸の利用：陽性 （１０撫機窒素源の利用：陽性 （１１）ウレアーゼ：陰性 （１２）オキシダーゼ：陰性 （１３）カタラーゼ：陽性 （１４）生育ｐＨ：５〜１０ （１５）生育温度：１５〜４０℃ （１６）酸素に対する態度：好気的 （１７）Ｏ−Ｆテスト二酸化的 （１８）糖類からのガスの生成：陽性 （１９）糖類からの酸の生成： 陽性；マルトース、レブロース、ラクトース、グルコー
ス、セロビオース、フ ラクトース、シュクロース、サリシ ン 陰性；ソルビトール、キシロース、アラビノース、アン
ドール、ガラクトース、 ラムノース、ラフィノース、イノシ トール 以上の諸性質を「バーシーズ・マニュアル・オブ・デタ
ミネイティブ・バクテリオロジイ」第８版（１９７４年
）より検索するとキサントモナス・キャンペストリスと
類似していることが分ったが糖類からの酸の生成などに
おいて異なっているのでキサントモナス属の新種と判断
しキサントモナス・エスピー　Ｎ−２６と命名した。な
お本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に微生物受
託番号微工研菌寄第８８００号として寄託されている。

本菌株は微生物の培養に通常用いられる栄養物例えば肉
エキス、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキス、コーンス
チープリカー、カザミノ酸などにアルギン酸およびアル
ギン酸の塩を０．０１〜２％、好ましくは０．１％〜１
％を加えた培地で２０℃〜４０℃、好ましくは２７℃〜
３６℃の好気的条件で良好に増殖し、培養５〜４０時間
でアルギン９　リアーゼを生産する。

本発明の菌によって生産されたアルギン酸リアーゼは菌
体内に存在するので菌体からのアルギン酸リアーゼの抽
出はビーズや超音波を用いた細胞破砕、有機溶媒抽出な
どが使用できるが好ましくは以下の方法で行なう。アル
ギン酸リアーゼを生産し菌体内に蓄積した菌体を遠心等
によって集め緩衝液に分散させた液、あるいは菌体を含
んだ培養液に、界面活性剤例えばトリトンＸ−１００を
０．０１％〜５％好ましくは０．０５％〜２％を加える
。この時リゾチームを０．００１〜１０ダ／ＩＩＬｌ好
ましくは０．０１〜１■／ゴ加えると抽出効果が良くな
る。処理後、添加量や菌体濃度によっても異なるが、１
分〜５時間放置したのち凝集剤による凝集、遠心などに
より菌体残渣を除去すると粗酵素液を得ることができる
。本発明で製造されるアルギン酸す７−ゼは上記の粗酵
素液に限定するものではなく粗酵素液の処理物例えば有
機溶媒沈澱、塩析、クロマトグラフィーなどの公知の方
法で精製した酵素液およびそれらの乾燥物、固定化物さ
らには細胞懸濁液でもよい。

本発明により得られるアルギン酸リアーゼの酵素化学的
および理化学的性質は次のとおりである。

（１）作用ニアルギン酸を基質として反応させた時、７
／Ｉ／ギン酸リアーゼの反応生成物である二重結合に由
来する２３５ｎｍの特異吸収の増加が確認された。

（３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ範囲： ｐＨ６，１付近に至適ｐＨを示す（第１図参照）ｐＨ５
，５〜６．５にて安定（第２図り照）（４）至適温度お
よび熱安定性： 至適温度は５０°Ｃ付近である（第３図参照）熱安定性
は４０°Ｃ付近まで安定（第４図参照） （７）分子量ニゲル濾過法により約７００００（８）酵
素活性測定法ニアルギン酸との反応によって生成した二
重結合出来の２３５ｎｍの吸光度をｐｌＪ定することに
よりアルギン酸リアーゼの酵素活性を測定することがで
きろ。

１）反応液の組成 酵素液　　　　　　　　　　　　　０．３ｍ２）反応条
件 ３７℃にて反応させ２３５ｎｍの吸光度変化を経時的に
測定する。

３）酵素活性 アルギン酸リアーゼ１単位はｐＨ６，３，３７℃の条件
で１分間に基質１ゴの２３５ｎｍの吸光度を１上昇させ
る酵素量とする。

〔実施例〕

以下に実施例を挙げて本発明を説明する。

実施例　１ 培地組成 ０．５％アルギン酸ナトリウム、０．５％ペプトン、０
．５％肉エキス、０．３％Ｎ　ａｓ　ＨＰ　Ｏ４”　１
２８ｔ　Ｏ％０．１％Ｎａ＊ＨＰＯ４＊２ＨｔＯ１０，
５％ＮａＣ／、　０．１％プロ　ナール　ＳＴ　　−１ 上記の培地１０ｍｊを５０プの試験管に入れ１２０℃で
２０分間オートクレブ殺菌する。キサントモナス・エス
ピー　Ｎ−２６（微工研菌寄第８８００号）の１白金耳
を上記培地に接種し３０℃で２０時間振どう培養し種培
養液とする。同条件で殺菌した培地１１を含む２１容ミ
ニジヤーフアメンターへ上記種培養液１０ｍを接種し５
００ｒｐｍ、通気量１ｖｖｍ、３３℃で１１時間培養す
る。集菌した菌体を超音波破砕機にて水冷下３分間処理
した。その時のアルギン酸リアーゼの活性は培養液１ｍ
ｌ当り０．７３単位であった。

実施例　２ 実施例１で得た培養液１１を遠心分離し湿菌体１４．３
．９を得た。これを５Ｏｎ＋Ｈ即ｓｏ、を含む２０ｍＭ
りん酸ナトリウム緩衝液に懸濁し１００づとする。この
液にトリトンＸ−１０００，７５Ｉとリゾチーム１５ｍ
９を含む５０ｍの２０ｍＭりん酸ナトリウム緩衝液を加
え撹拌した後２０℃で１時間放置する。この液に０．６
％ポリエチレンイミン水溶液５０ｍ７を加え撹拌した後
遠心分離し菌体残渣を取り除き粗酵素液１８１ゴを得た
。この粗酵素液のアルギン酸リアーゼの活性は３．９２
単位／祷であった。

〔発明の効果〕

本発明により、アルギン酸リアーゼが工業的に生産可能
となった。このことをこより現在非酵素的に行なわれて
いるアルギン酸およびその塩の分解あるいは除去が、こ
の酵素を用いることにより、より早く、効率的に行なう
ことか可能となった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法で得られたアルギン酸リアーゼの
各ｐＨにおけろ活性を表わすグラフであり、第２図は各
ｐＨにおける３０°Ｃ，１時間処理によるｐＨ安定性を
表わすグラフであり、第３図は各温度における活性を表
わすグラフであり、第４図は各温度における１０分間処
理による熱安定性を示すグラフである。 特許出願人　　ナガセ生化学工業株式会社第１図 第２図 第３ｖ！Ｊ 第４図 手続補正書（自発） 昭和６１年９　月１２日 特許庁長官熱　１）明雄殿　　で １、事件の表示　　昭和６１年特許願第１８４６８６号
２、発明の名称 アルギン酸リアーゼの製造法 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 へへ＼に ４、代理人 ５、補正の対象 明細書の発明の詳細な説明の欄 −Ｊ　鴫Ｊ！ ６、補正の内容 （１）明何１１書第２頁第３行〜第４行「使用した時、
形成した義山等から」を「使用後、トレイ等から」と訂
正する。 （２）同第１３頁第４行「オートクレプ」を「オートク
レーブ」と訂正する。 以上

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １、キサントモナス属に属するアルギン酸リアーゼ生産
   菌を培養し、培養物よりアルギン酸リアーゼを採取する
   ことを特徴とするアルギン酸リアーゼの製造法。