JPH02291283A - アミドの生物学的製造法 - Google Patents
アミドの生物学的製造法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔発明の苛景〕
(技術分野)
本発明は、水性媒体中で、ニトリルを水和して対応する
アミドを生成する能力を有する微生物由来の酵素の作用
によってニトリルを水和してこれを対応するアミドに変
換させる方法に関する。さらに具体的には、本発明は、
該水性媒体中に特定の界面活性剤を存在させることに特
徴を有するアミドの生物学的製造法に関する。
アミドを生成する能力を有する微生物由来の酵素の作用
によってニトリルを水和してこれを対応するアミドに変
換させる方法に関する。さらに具体的には、本発明は、
該水性媒体中に特定の界面活性剤を存在させることに特
徴を有するアミドの生物学的製造法に関する。
(先行技術)
アミドは水性媒体中で対応するニトリルの水和によって
製造されるが、この水和を微生物の産生ずる酵素(ニト
リラーゼあるいはニトリルヒドラターゼ)の作用によっ
て行なう方法が提案されている(たとえば、特公昭62
−21519号、特公昭56−17918号、特公昭5
9−37951号、特開昭61 7 162193号お
よび特開昭62−91189号各公報ならびに特願昭6
3−231744号明細書参照)。このようなアミドの
生物学的製造法は、工業的にも実施されていて、アクリ
ルアミドの有利な製造法として注目されている。
製造されるが、この水和を微生物の産生ずる酵素(ニト
リラーゼあるいはニトリルヒドラターゼ)の作用によっ
て行なう方法が提案されている(たとえば、特公昭62
−21519号、特公昭56−17918号、特公昭5
9−37951号、特開昭61 7 162193号お
よび特開昭62−91189号各公報ならびに特願昭6
3−231744号明細書参照)。このようなアミドの
生物学的製造法は、工業的にも実施されていて、アクリ
ルアミドの有利な製造法として注目されている。
このようなアミドの生物学的水和反応に使用し得る基質
ニトリルとして、脂肪族および芳香族等の数多くのニト
リルが提案されているが、本発明者らの知見によれば、
水に溶解しきれない基質が多量に反応系に存在する場合
は、反応中に菌体、基質および生成物等の巻き込みを生
じて塊を形成し、均一な撹拌が行えなくなる。この現象
は、特に芳香族ニトリル等の水に難溶性の基質を用いた
場合に顕著であって、そのようなニトリルの水和は工業
的には実施し難い。
ニトリルとして、脂肪族および芳香族等の数多くのニト
リルが提案されているが、本発明者らの知見によれば、
水に溶解しきれない基質が多量に反応系に存在する場合
は、反応中に菌体、基質および生成物等の巻き込みを生
じて塊を形成し、均一な撹拌が行えなくなる。この現象
は、特に芳香族ニトリル等の水に難溶性の基質を用いた
場合に顕著であって、そのようなニトリルの水和は工業
的には実施し難い。
(要 旨)
本発明は、上記の問題点を解決することを目的として種
々検討した結果、ニトリルの水和反応に際して反応系に
ポリオキシエチレン基を有する界面活性剤を存在させる
ことにより、反応系を均一な分散状懇に保持できること
のみならず、全く意外にも該水和反応速度を大巾に向上
させ得ることを見出し、この知見に基いてなされたもの
である。
々検討した結果、ニトリルの水和反応に際して反応系に
ポリオキシエチレン基を有する界面活性剤を存在させる
ことにより、反応系を均一な分散状懇に保持できること
のみならず、全く意外にも該水和反応速度を大巾に向上
させ得ることを見出し、この知見に基いてなされたもの
である。
従って、本発明によるアミドの製造法は、水性媒体中で
、ニトリルを水和して対応するアミドを生成する能力を
有する微生物由来の酵素の作用によってニトリルを水和
してこれを対応するアミドに変換する方法において、該
水性媒体中にボリオキシエチレン基を有する界面活性剤
を存在させること、を特徴とするものである。
、ニトリルを水和して対応するアミドを生成する能力を
有する微生物由来の酵素の作用によってニトリルを水和
してこれを対応するアミドに変換する方法において、該
水性媒体中にボリオキシエチレン基を有する界面活性剤
を存在させること、を特徴とするものである。
(効 果)
本発明によれば、特定の界面活性剤の作用によって水に
難溶性のニトリルの永和反応を均一な分散状態に保持し
撹拌等のトラブルを生じることなく水和反応が行なえる
とともに、ニトリルの水和反応速度を大巾に向上させる
ことができる。水和反応速度の向上が、水に難溶性のニ
トリルにも、さらには水に易溶性のニトリルにも認めら
れることは、全く思いがけなかったことと解される。
難溶性のニトリルの永和反応を均一な分散状態に保持し
撹拌等のトラブルを生じることなく水和反応が行なえる
とともに、ニトリルの水和反応速度を大巾に向上させる
ことができる。水和反応速度の向上が、水に難溶性のニ
トリルにも、さらには水に易溶性のニトリルにも認めら
れることは、全く思いがけなかったことと解される。
このように、本発明によれば、特に芳香族ニトリルの永
和を有利に行なうことができる。農薬原料としての2.
6−ジフルオ口ペンズアミド(すなわち2,6−ジフル
オ口ベンゾニトリルの水和物)あるいは各種有機工業薬
品原料として有用なペンズアミド(すなわちペンゾニト
リルの水和物)等の重要性からいって、本発明のこの効
果は有用なものである。
和を有利に行なうことができる。農薬原料としての2.
6−ジフルオ口ペンズアミド(すなわち2,6−ジフル
オ口ベンゾニトリルの水和物)あるいは各種有機工業薬
品原料として有用なペンズアミド(すなわちペンゾニト
リルの水和物)等の重要性からいって、本発明のこの効
果は有用なものである。
1.アミドの生物学的製造の基本的内容本発明は微生物
由来の酵素の作用によってニトリルを水和してこれをア
ミドに変換する方法であるが、この方法は基本的には微
生物の培養および酵素の誘導ならびに得られた酵素の基
質ニトリルに対する作用からなる。
由来の酵素の作用によってニトリルを水和してこれをア
ミドに変換する方法であるが、この方法は基本的には微
生物の培養および酵素の誘導ならびに得られた酵素の基
質ニトリルに対する作用からなる。
これらは単位操作としてそれ自身公知であって、本発明
でも合目的的な任意の態様を採ることができる。
でも合目的的な任意の態様を採ることができる。
本発明が前提とする「水性媒体中で、ニトリルを水和し
て対応するアミドを生成する能力を有する微生物由来の
酵素の作用によってニトリルを水和してこれを対応する
アミドに変換する方法」は、酵素の作用のさせ方につい
て合目的的な任意の態様を包含するものである。そのよ
うな態様の一つとして、微生物に産生させた酵素を回収
して、これを酵素標品として使用する方法があるが、こ
のようなふつうの触媒反応のような場合をも本発明では
「生物学的製造法」として扱うものとする。
て対応するアミドを生成する能力を有する微生物由来の
酵素の作用によってニトリルを水和してこれを対応する
アミドに変換する方法」は、酵素の作用のさせ方につい
て合目的的な任意の態様を包含するものである。そのよ
うな態様の一つとして、微生物に産生させた酵素を回収
して、これを酵素標品として使用する方法があるが、こ
のようなふつうの触媒反応のような場合をも本発明では
「生物学的製造法」として扱うものとする。
2,水和反応の詳細
1) 微生物
本発明で使用する微生物は、前記した公報等に記載され
ているバチルス(Bacillus) 、バクテリジウ
ム(Baeterldium)、ミクロコツカス(旧c
ro−coccus) 、プレビバテリウム(Brev
ibacterium)、コリネバクテリウム(Cor
ynebacterlun+ ) 、ノカルジア(No
cardia) 、シュードモナス( Pseudo−
monas ) 、ロドコツカス(Rhodoeocc
us ) 、アース口バクター(Arthrobact
er)およびミクロバクテリウム(Microbact
erium)各属に属するものであるが、特に特願昭6
3−234744号明細書記載のロドコッカス属ロドク
ロウス種 (Rhodococcus rhodochrous
)の微生物がその産生ずるニトリルヒドラターゼ酵素が
、芳香族ニトリルの水和に特に有効であることおよび安
定性に優れていることにより好適である。
ているバチルス(Bacillus) 、バクテリジウ
ム(Baeterldium)、ミクロコツカス(旧c
ro−coccus) 、プレビバテリウム(Brev
ibacterium)、コリネバクテリウム(Cor
ynebacterlun+ ) 、ノカルジア(No
cardia) 、シュードモナス( Pseudo−
monas ) 、ロドコツカス(Rhodoeocc
us ) 、アース口バクター(Arthrobact
er)およびミクロバクテリウム(Microbact
erium)各属に属するものであるが、特に特願昭6
3−234744号明細書記載のロドコッカス属ロドク
ロウス種 (Rhodococcus rhodochrous
)の微生物がその産生ずるニトリルヒドラターゼ酵素が
、芳香族ニトリルの水和に特に有効であることおよび安
定性に優れていることにより好適である。
この種の株の代表的なものは、J−1株である。
J−1株の詳細は下記の通りである。
(1)由来および寄託
J−1株は、本発明者らが京都市左京区の土壌から採取
したものであって、昭和62年9月18日に工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されて、FERM BP
−1478号の受託番号を得ている。
したものであって、昭和62年9月18日に工業技術院
微生物工業技術研究所に寄託されて、FERM BP
−1478号の受託番号を得ている。
(2) 菌学的性質
(a)形 態
(1)細胞の形および 。,9〜、.。、3〜、。
7大きさ
(2)細胞の多形性の有無 培養初期に長桿状を呈し、
捉棒状で湾曲なくスナッピングを伴った発育 を示し、のちに短桿菌状に断裂する。
捉棒状で湾曲なくスナッピングを伴った発育 を示し、のちに短桿菌状に断裂する。
(3)粗性 なし
(4)胞子の有無 な し
(5)ダラム染色性 陽 性
(8)抗雅 陰性
(7)異染小体 認められる(b)各培地に
おける生育状態(30℃)(1)肉汁寒天平板培養
直径1mm(48時間)円形、不規則、(2)肉汁寒天
斜面培養 (3)肉汁液体培養 (4)肉汁ゼラチン穿刺 培養 (5)リトマスミルク (c)生理学的性質 (1)硝酸塩の還元 (2)脱窒反応 (3)MRテスト (4)VPテスト (5)インドールの生成 (6)硫化水素の生成 (7)デンブンの加水分解 平滑で表面乾き気味、扁平、不透明、 淡オレンジピンク色 糸状、表面平滑、断面はやや***状 で乾き気味、淡オレンジピンク色 菌膜を形成し、旺盛に発育する。生 育するにしたがって、中程度の濁り、 沈澱を生ずる。
おける生育状態(30℃)(1)肉汁寒天平板培養
直径1mm(48時間)円形、不規則、(2)肉汁寒天
斜面培養 (3)肉汁液体培養 (4)肉汁ゼラチン穿刺 培養 (5)リトマスミルク (c)生理学的性質 (1)硝酸塩の還元 (2)脱窒反応 (3)MRテスト (4)VPテスト (5)インドールの生成 (6)硫化水素の生成 (7)デンブンの加水分解 平滑で表面乾き気味、扁平、不透明、 淡オレンジピンク色 糸状、表面平滑、断面はやや***状 で乾き気味、淡オレンジピンク色 菌膜を形成し、旺盛に発育する。生 育するにしたがって、中程度の濁り、 沈澱を生ずる。
表面に良く生育、穿刺部にそって口
−ト状に発育するが、下層部にはほ
とんど発育しない。ゼラチンは、液
化は認められない。
変化しない
陽性
陰性
陰性
陰性
陽性
陽性
陰性
(8)クエン酸の利用
(9)無機窒素源の利用
(10色素の生成
(11)ウレアーゼ
(l2)オキシダーゼ
(l3)カタラーゼ
(l4)セルロースの
加水分解
(15)生育の範囲
(16〉酸素に対する態度
(17)チロシンの分解
(18)アデニンの分解
(19)ホスファターゼ
(20)Tween80
加水分解
(21)0−Fテスト
コーサーの培地:陰 性
クリステンセンの培地:陽 性
硝酸塩:陽 性
アンモニウム塩:陽 性
陰性
陽性
陰性
陽性
陰性
pH:5〜10
# : 10〜41℃
好気性
陽性
陽性
陽性
陽性
0(弱い)
(22)耐熱性(10%スキ
ムミルク中72℃、
15分) なし
(23)糖から酸および 酸の生成ガスの生成
L−アラビノース
D−キシロース
D−グルコース +
D−マンノース
D−フラクトース +
麦芽糖 十
ショ糖 十
乳糖
トレハロース
D−ソルビット +
D−マンニット +
グリセリン +
(24)単一炭素源としての
生育
イノシトール
ガスの生成
麦芽糖
D−マンニット
ラムノース
D−ソルビット
m−ハイドロキシ
安息香酸
アジピン酸ナトリウム
安息香酸ナトリウム
クエン酸ナトリウム
乳酸ナトリウム
テストテトロン
L−チロシン
グリセロール(1%)(ν/V)
トレハロース
p−ハイドロ−午シ
安息香酸(1%) (W/V)
十
+
十
(25)脂肪酸と細胞壁分析
(+)弱いが陽性である。
不飽和、飽和直鎖脂肪酸、およびツ
ベルクロステアリン酸を含む。ミコ
ール酸のTLCは単一スポットを与
える。
以上の菌体的性質をバージ一の細菌分類書(Bergy
’s Manual of Systematic B
acteriology )(1980)に基づいて分
類すると、J−1−Rは、好気性、グラム陽性、弱抗酸
性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であり、
鞭毛を若生しない。また、発育の初期過程で長桿菌状で
菌糸状を呈し、枝分れ(Branching )を伴な
った発育を示し、後に短桿菌状に断裂することよりノカ
ルディア型の細菌に属するものと認められる。
’s Manual of Systematic B
acteriology )(1980)に基づいて分
類すると、J−1−Rは、好気性、グラム陽性、弱抗酸
性、カタラーゼ陽性の内生胞子を生じない桿菌であり、
鞭毛を若生しない。また、発育の初期過程で長桿菌状で
菌糸状を呈し、枝分れ(Branching )を伴な
った発育を示し、後に短桿菌状に断裂することよりノカ
ルディア型の細菌に属するものと認められる。
脂肪酸組成の分析は、ツベルクロステアリン酸を含む不
飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のTLCは
標準菌Rodococcus rhodochrous
(IP0 3338)と同じRfを示す単一スポットを
与えることから、Mycobacterium属とは区
別される。
飽和、飽和の直鎖脂肪酸を含む。ミコール酸のTLCは
標準菌Rodococcus rhodochrous
(IP0 3338)と同じRfを示す単一スポットを
与えることから、Mycobacterium属とは区
別される。
またミコール酸の組成(炭素数)からNocardia
属とは区別される。その他生化学的諸性質の検討から、
本菌はRhodococcus rhodochous
と認められる。
属とは区別される。その他生化学的諸性質の検討から、
本菌はRhodococcus rhodochous
と認められる。
2) 基質/ニトリル
上記のような微生物の産生ずる酵素の基質となるニトリ
ルは、芳香族および脂肪族のモノニトリルまたはジニト
リル、就中モノニトリル、である。
ルは、芳香族および脂肪族のモノニトリルまたはジニト
リル、就中モノニトリル、である。
本発明の特色を最もよく享受するのは、芳香族ニトリル
、特に芳香環を形成する炭素数が4〜10のもの、であ
る。芳香族ニトリルの具体例のいくつかを例示すれば下
記の通りであって、下記の一般式(1)〜(Vr)で示
される化合物が挙げられる。
、特に芳香環を形成する炭素数が4〜10のもの、であ
る。芳香族ニトリルの具体例のいくつかを例示すれば下
記の通りであって、下記の一般式(1)〜(Vr)で示
される化合物が挙げられる。
N
p−クロロヘンゾニトリル、0 − 、m−およびp−
フルオロベンゾニトリル、0−およびm−ニトロペンゾ
ニトリル、p−アミノベンゾニトリル、0−、m−およ
びp−トルニトリル、4−シアノフェノール、アニソニ
トリル、フタ口ニトリル、イソフタロニトリル、テレフ
タ口ニトリル、2.6−ジクロ口ペンゾニトリル、2,
4−ジクロ口ベンゾニトリル、2,6−ジフルオ口ペン
ゾニトリル、がそれである。
フルオロベンゾニトリル、0−およびm−ニトロペンゾ
ニトリル、p−アミノベンゾニトリル、0−、m−およ
びp−トルニトリル、4−シアノフェノール、アニソニ
トリル、フタ口ニトリル、イソフタロニトリル、テレフ
タ口ニトリル、2.6−ジクロ口ペンゾニトリル、2,
4−ジクロ口ベンゾニトリル、2,6−ジフルオ口ペン
ゾニトリル、がそれである。
例えば、4−、3−、および2−シアノビリジン、がそ
れである。
れである。
例えば、α一およびβ−ナフトニトリル、がそれである
。
。
(ここで、R およびR2は、それぞれ、H、CH3、
OH10CH3、C I,F,CN,NHっまたはNO
2である。) 例えば、ペンゾニトリル、0−、m一および(ここで、
XはSまたはOである) 例えば、2−チオフエン力ルポニトリルおよび2−フロ
ニトリル、がそれである。
OH10CH3、C I,F,CN,NHっまたはNO
2である。) 例えば、ペンゾニトリル、0−、m一および(ここで、
XはSまたはOである) 例えば、2−チオフエン力ルポニトリルおよび2−フロ
ニトリル、がそれである。
リルおよび2−フロニトリル、がそれである。
H
例えば、5−シアノインドール、3−インドールアセト
ニトリル、がそれである。
ニトリル、がそれである。
N
N
すなわち、シアノピラジンである。
本発明で対象とするニトリルの他の一群は、脂肪族ニト
リルである。炭素数2〜6のモノまたはジニトリル、就
中モノニトリル、が適当である。
リルである。炭素数2〜6のモノまたはジニトリル、就
中モノニトリル、が適当である。
生成アミドの有用性からいって、アクリロニトリルが代
表的であり、また生産性も良好である。
表的であり、また生産性も良好である。
これらのニトリルに対応するアミドは、CN基がCON
H2基に変換されたものであることはいうまでもない。
H2基に変換されたものであることはいうまでもない。
なお、ジニトリルの場合はCN基の少なくとも1個がC
ONH2に変換したものを対応するアミドと考えるもの
とする。
ONH2に変換したものを対応するアミドと考えるもの
とする。
3) 界面活性剤
本発明で使用する界面活性剤は、ポリオキシエチレン基
を有するものであって、例えば、アルキルエーテル型、
アルキルアリールエーテル型、アルキルエステル型、ソ
ルビタンモノアルキルエステル型、ポリオキシエチレン
アルキルアミン等である。具体的には、アルキルエーテ
ル型としてはポリオキシエチレンステアリルエーテル(
n=14)〔エマルゲン(Emu,Igen ) 32
0P (花王■)]、アルキルアリルエーテル型として
はポリオキシエチレンオクチルフエニルエーテル(n
= 1 0)〔トリトン(Triton)XIOO
(和光純薬■)〕、ソルビタンモノアルキルエステル型
としてはポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン
(n=20)[ツイン(Tween) 80 (半井
化学薬品■)]、ポリオキシエチレンアルキルアミンと
してはポリオキシエチレンドデシルアミン(n=5)C
アミ− ト(Amiet ) 105 (花王■)〕
等が挙げられる。
を有するものであって、例えば、アルキルエーテル型、
アルキルアリールエーテル型、アルキルエステル型、ソ
ルビタンモノアルキルエステル型、ポリオキシエチレン
アルキルアミン等である。具体的には、アルキルエーテ
ル型としてはポリオキシエチレンステアリルエーテル(
n=14)〔エマルゲン(Emu,Igen ) 32
0P (花王■)]、アルキルアリルエーテル型として
はポリオキシエチレンオクチルフエニルエーテル(n
= 1 0)〔トリトン(Triton)XIOO
(和光純薬■)〕、ソルビタンモノアルキルエステル型
としてはポリオキシエチレンモノオレイン酸ソルビタン
(n=20)[ツイン(Tween) 80 (半井
化学薬品■)]、ポリオキシエチレンアルキルアミンと
してはポリオキシエチレンドデシルアミン(n=5)C
アミ− ト(Amiet ) 105 (花王■)〕
等が挙げられる。
これらの界面活性剤の使用量は、基質のPin類により
変わり、また反応系の基質の濃度の増加とともに増加の
傾向があるが、通常は反応系に対して0,1〜5重量%
の範囲である。
変わり、また反応系の基質の濃度の増加とともに増加の
傾向があるが、通常は反応系に対して0,1〜5重量%
の範囲である。
4) 培養/酵素の産生
本発明で使用する微生物の培養は、それが合目的的なも
のである限り制限はなく、前記した各公報に記載された
方法に準じて行うことができる。
のである限り制限はなく、前記した各公報に記載された
方法に準じて行うことができる。
5) ニトリルの永和
本発明が前提とする「微生物由来の酵素の作用によって
ニトリルを水和してこれを対応するアミドに変換する方
法」とは、酵素の作用のさせ方について合目的的な種々
の態様を包含するものであることは前記したところであ
る。
ニトリルを水和してこれを対応するアミドに変換する方
法」とは、酵素の作用のさせ方について合目的的な種々
の態様を包含するものであることは前記したところであ
る。
そのような態様の一つは、微生物の培養系に基質のニト
リルを存在させておいて、培地中にアミドを生成させる
ことである。
リルを存在させておいて、培地中にアミドを生成させる
ことである。
酵素を作用させる態様の他の一つは、酵素が蓄積されて
いる培養液に基質ニトリルを添加して水和反応を行なわ
せることである。この態様の改変例として、菌体を破砕
した培養液を使用する方法が挙げられよう。
いる培養液に基質ニトリルを添加して水和反応を行なわ
せることである。この態様の改変例として、菌体を破砕
した培養液を使用する方法が挙げられよう。
酵素を作用させる悪様のさらに他の一つは、酵素を蓄積
した菌体を培養液から分離して、好ましくはこれを適当
な担体に担持させて「固定化」して、基質と接触させる
方法である。この方法、特にこの好ましい態様は、上記
の第二の態様と並んで、あるいは第二の態様以上に、工
業的実施に適したものということができる。担体の種類
および微生物の担持方法を含めて、そして所謂バイオリ
アクターとしての固定化微生物の利用も含めて、この技
術は周知のものである。
した菌体を培養液から分離して、好ましくはこれを適当
な担体に担持させて「固定化」して、基質と接触させる
方法である。この方法、特にこの好ましい態様は、上記
の第二の態様と並んで、あるいは第二の態様以上に、工
業的実施に適したものということができる。担体の種類
および微生物の担持方法を含めて、そして所謂バイオリ
アクターとしての固定化微生物の利用も含めて、この技
術は周知のものである。
酵素を作用させる態様の他の一つは、酵素原品を得て、
この酵素によっていわば非生物学的にニトリルを水和す
る方法である。永和反応は、酵素活性が失なわれない範
囲のpHおよび温度条件で行なわれることはいうまでも
なく、これらの条件は一般に上記の生物学的手法でのそ
れと同じてあるということができる。このような酵素作
用時に微生物が存在しない態様も本発明では「生物学的
製造法」として取扱うことは前記した通りである。
この酵素によっていわば非生物学的にニトリルを水和す
る方法である。永和反応は、酵素活性が失なわれない範
囲のpHおよび温度条件で行なわれることはいうまでも
なく、これらの条件は一般に上記の生物学的手法でのそ
れと同じてあるということができる。このような酵素作
用時に微生物が存在しない態様も本発明では「生物学的
製造法」として取扱うことは前記した通りである。
培養液ないし水和反応液中の基質濃度は、基質の種類に
よっても異なるが、通常0. 5〜15モル/リット
ルであり、また反応温度は通常0〜30℃の範囲、至適
pHは7〜9の範囲である。
よっても異なるが、通常0. 5〜15モル/リット
ルであり、また反応温度は通常0〜30℃の範囲、至適
pHは7〜9の範囲である。
pHの調整にはリン酸カリウムバッファー トリス/H
CIバッファ−、HEPES/KOHバッファ一、ホウ
酸ナトリウムバッファ一等の緩衝剤を用いることが望ま
しい。
CIバッファ−、HEPES/KOHバッファ一、ホウ
酸ナトリウムバッファ一等の緩衝剤を用いることが望ま
しい。
3、実験例
以下の実験例で酵素活性の単位1ユニット(U)は、各
反応条件で各基質から対応するアミドを1μモル/分の
速度で生成させる酵素の量、として定義されたものであ
る。
反応条件で各基質から対応するアミドを1μモル/分の
速度で生成させる酵素の量、として定義されたものであ
る。
実施例1
2.6−ジフルオ口ベンゾニトリル40mMおよび表−
1に示す界面活性剤を所定量添加あるいは添加せずに調
製した0.1Mリン酸緩衝液(pH7)5mlに、ロド
コッカス・ロドクロウスJ−1菌より精製単離した酵素
(ニトリルヒドラターゼ)185μgを添加して、撹拌
下20℃で30分間反応を行った。酵素活性は生成した
アミドを高速液体クロマトグラフィ−(IIPLC)に
より定量し、それぞれ界面活性剤を添加しない場合の活
性を100としたときの相対活性で示した。基質の大部
分か不溶解の状態で反応が行われたか、界面活性剤を添
加した系では、いずれも基質か均一に分散し良好な撹拌
状態が得られた。
1に示す界面活性剤を所定量添加あるいは添加せずに調
製した0.1Mリン酸緩衝液(pH7)5mlに、ロド
コッカス・ロドクロウスJ−1菌より精製単離した酵素
(ニトリルヒドラターゼ)185μgを添加して、撹拌
下20℃で30分間反応を行った。酵素活性は生成した
アミドを高速液体クロマトグラフィ−(IIPLC)に
より定量し、それぞれ界面活性剤を添加しない場合の活
性を100としたときの相対活性で示した。基質の大部
分か不溶解の状態で反応が行われたか、界面活性剤を添
加した系では、いずれも基質か均一に分散し良好な撹拌
状態が得られた。
結果を表−1に示す。
なお、上記J−1菌の培養および酵素の粘製単離条件は
以下の通りである。
以下の通りである。
(1)培養
基本培地(1Ω中)
グルコース 10 gK2
H P O 40. 5 g KH2PO4 0.5gMgSO4・7
H20 0.5gイーストエキス
1.0gペプトン
7.5g蒸留水 残部(p}{ 7
.2)C o C l 2 1 0 ml /リット
ルを含む上記基本培地に7.5g/リットルの尿素を添
加し、この培地60mlにロドコッカス・ロドクロウス
J1株(FERM BP−1478)の前培養液(
上記基本培地使用)4mlを加えて、28℃で96時間
振盪培養を行った。
H P O 40. 5 g KH2PO4 0.5gMgSO4・7
H20 0.5gイーストエキス
1.0gペプトン
7.5g蒸留水 残部(p}{ 7
.2)C o C l 2 1 0 ml /リット
ルを含む上記基本培地に7.5g/リットルの尿素を添
加し、この培地60mlにロドコッカス・ロドクロウス
J1株(FERM BP−1478)の前培養液(
上記基本培地使用)4mlを加えて、28℃で96時間
振盪培養を行った。
(2)反応用菌体の調製
菌体を遠心分離によって採取し、0,85%NaC 1
溶液で洗浄して再び遠心分離した後、0.8596
NaCl溶液に懸濁させて、反応用湿性菌体液とした。
溶液で洗浄して再び遠心分離した後、0.8596
NaCl溶液に懸濁させて、反応用湿性菌体液とした。
(3)反応用酵素の調製
上記の方法で培養した菌体を遠心分離によって採取した
後、ホモジナイズして無細胞抽出液を調製した。下表に
示した硫安分画および各種クロマトグラフィーを行って
、精製酵素を調製した。得られた酵素を反応用酵素とし
た。
後、ホモジナイズして無細胞抽出液を調製した。下表に
示した硫安分画および各種クロマトグラフィーを行って
、精製酵素を調製した。得られた酵素を反応用酵素とし
た。
fi m lit Is ill 1 6180
22300(1(Ni+4)2So4(30−60
%) 2110 158000DEAE−セ7アク
リル(第一) LL2QQ
ODEAE−セフアクリル(第二)
107000フェニル セ71ロース
IOGOOOセルaフ
ァイン GCL−1000
83100セフアクリル S−300
690003B.1
1(to 73.9 70.0 48.0 47.5 37.3 30,9 ■ 2.0 *U:基質として3−シアノビリジンを使用しpH7.
で反応 20℃ 表−1 界面活性剤無添加の場合の活性 アミート105 : 4.OU/mgprotei
nトリトン XIOO : 4.Otl/mgpr
oLeinエマルゲン320P : 4.01J/
mg,proternツイン go : 4.OU/
gprotein実施例2 界面活性剤アミート 105を用い、表−2に示す各種
基質を所定濃度含む0.1Mリン酸緩衝液(pH 7
)5mlに、実施例1と同様にして得たロツドコッカス
・ロドクロウス J−1菌体0,1〜4+ng(乾燥重
量)を添加して、撹拌下20゜Cで20〜30分間反応
を行い、実施例1と同様にして相対活性を4111定し
た。
22300(1(Ni+4)2So4(30−60
%) 2110 158000DEAE−セ7アク
リル(第一) LL2QQ
ODEAE−セフアクリル(第二)
107000フェニル セ71ロース
IOGOOOセルaフ
ァイン GCL−1000
83100セフアクリル S−300
690003B.1
1(to 73.9 70.0 48.0 47.5 37.3 30,9 ■ 2.0 *U:基質として3−シアノビリジンを使用しpH7.
で反応 20℃ 表−1 界面活性剤無添加の場合の活性 アミート105 : 4.OU/mgprotei
nトリトン XIOO : 4.Otl/mgpr
oLeinエマルゲン320P : 4.01J/
mg,proternツイン go : 4.OU/
gprotein実施例2 界面活性剤アミート 105を用い、表−2に示す各種
基質を所定濃度含む0.1Mリン酸緩衝液(pH 7
)5mlに、実施例1と同様にして得たロツドコッカス
・ロドクロウス J−1菌体0,1〜4+ng(乾燥重
量)を添加して、撹拌下20゜Cで20〜30分間反応
を行い、実施例1と同様にして相対活性を4111定し
た。
表−2には、最高の活性が得られたときの界面活性剤濃
度およびそのときの相対活性を示した。
度およびそのときの相対活性を示した。
なお、ペンゾニトリル(10mM)、3−シアノピリジ
ン、アクリロニトリルおよびプロピオニ1・リルはこれ
らが溶解した状態で、その他は基質の大部分が不溶解の
状態で行われたが、この場合でも界面活性剤を添加した
系では基質が均一に分散して良好な撹拌状態が得られた
。
ン、アクリロニトリルおよびプロピオニ1・リルはこれ
らが溶解した状態で、その他は基質の大部分が不溶解の
状態で行われたが、この場合でも界面活性剤を添加した
系では基質が均一に分散して良好な撹拌状態が得られた
。
表−2
界面活性剤無添加の場合の活性
ペンゾニトリル
2,6
ジフル才ロペンゾニトリル
アミノベンゾニトリル
インドールアセトニトリル
ンアノビリジン
クリ口ニトリル
ブaビオニトリル
12.
12,
15.
17.
17,
0. 13
0, 14
0,74
1.02
29.4
100 74.5
380 74.5
68.
実施例3
アミ−ト105を所定量添加または無添加の0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH 7)に、実施例1と同様にして得
たロドコッカス・ロドクロウスJ−1菌体0.85mg
(乾燥重量)を含有するように添加して4.5mlとし
、この懸濁液に0.5gのペンゾニトリルを添加し、撹
拌しながら20℃に維持した。反応の進行状態はペンゾ
ニトリルおよび生成するペンズアミドをHPLC分折に
より調べ、ベンゾニトリルが完全に消費されるまで反応
を継続した。
ン酸緩衝液(pH 7)に、実施例1と同様にして得
たロドコッカス・ロドクロウスJ−1菌体0.85mg
(乾燥重量)を含有するように添加して4.5mlとし
、この懸濁液に0.5gのペンゾニトリルを添加し、撹
拌しながら20℃に維持した。反応の進行状態はペンゾ
ニトリルおよび生成するペンズアミドをHPLC分折に
より調べ、ベンゾニトリルが完全に消費されるまで反応
を継続した。
この反応において、基質の大部分が不溶解の状態で反応
が行われたが、界面活性剤を添加した系では基質が均一
に分散して良好な撹拌状態が得られた。一方、界面活性
剤添加の系では、菌体、基質、生成物の巻き込みを生じ
塊をつくり撹拌が良好に行えなかった。
が行われたが、界面活性剤を添加した系では基質が均一
に分散して良好な撹拌状態が得られた。一方、界面活性
剤添加の系では、菌体、基質、生成物の巻き込みを生じ
塊をつくり撹拌が良好に行えなかった。
結果を表−3に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、水性媒体中で、ニトリルを水和して対応するアミド
を生成する能力を有する微生物由来の酵素の作用によっ
てニトリルを水和してこれを対応するアミドに変換する
方法において、該水性媒体中にポリオキシエチレン基を
有する界面活性剤を存在させることを特徴とする、アミ
ドの生物学的製造法。 2、微生物が、ロドコッカス属ロドクロウス種のJ−1
株(FERM BP−1478号)である、請求項1記
載のアミドの生物学的製造法。 3、ニトリルが、芳香環を形成する炭素数が4〜10の
芳香族ニトリルである、請求項1〜2のいずれか1項記
載のアミドの生物学的製造法。 4、芳香族ニトリルが、下記の一般式〔 I 〕〜〔VI〕
で示される化合物のいずれかである、請求項3記載のア
ミドの生物学的製造法。 ▲数式、化学式、表等があります▼〔 I 〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔II〕 (ここで、R^1およびR^2は、それぞれH、CH_
3、OH、OCH_3、Cl、F、CN、NH_2また
はNO_2である) ▲数式、化学式、表等があります▼〔III〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔IV〕 (ここで、XはSまたはOである) ▲数式、化学式、表等があります▼〔V〕 ▲数式、化学式、表等があります▼〔VI〕 5、ニトリルが、炭素数2〜6の脂肪族ニトリルである
、請求項1〜2のいずれか1項記載のアミドの生物学的
製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8113789A JPH0773503B2 (ja) | 1989-03-31 | 1989-03-31 | アミドの生物学的製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8113789A JPH0773503B2 (ja) | 1989-03-31 | 1989-03-31 | アミドの生物学的製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02291283A true JPH02291283A (ja) | 1990-12-03 |
JPH0773503B2 JPH0773503B2 (ja) | 1995-08-09 |
Family
ID=13738015
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8113789A Expired - Lifetime JPH0773503B2 (ja) | 1989-03-31 | 1989-03-31 | アミドの生物学的製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0773503B2 (ja) |
-
1989
- 1989-03-31 JP JP8113789A patent/JPH0773503B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0773503B2 (ja) | 1995-08-09 |
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