JPH08173152A - 細菌の培養法 - Google Patents
細菌の培養法Info
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- JPH08173152A JPH08173152A JP33687594A JP33687594A JPH08173152A JP H08173152 A JPH08173152 A JP H08173152A JP 33687594 A JP33687594 A JP 33687594A JP 33687594 A JP33687594 A JP 33687594A JP H08173152 A JPH08173152 A JP H08173152A
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Abstract
際し、培養液中にエチレンシアンヒドリンを存在させる
細菌の培養法。 【効果】エチレンシアンヒドリンは、培養中に資化され
難く、揮発性も低いので、ニトリラーゼ活性を有する細
菌の培養に際して、培養液中に、安定した濃度の誘導剤
であるエチレンシアンヒドリンを存在させることがで
き、結果として高収量でニトリラーゼ活性を有する細菌
菌体を得ることができる。
Description
の高い細菌菌体を培養により高収量で生産する方法に関
する。近年、微生物またはその酵素を種々の単位化学反
応や複合化学反応の触媒として利用しようとする動きが
盛んになってきている。ニトリラーゼはニトリル類を加
水分解して対応する酸類を生成させる酵素として知られ
ており、有機酸を製造する触媒として有用である。
リラーゼ酵素活性を有する微生物としては、例えば、バ
チルス(Bacilius)属、バクテリジウム(Bacteridium)
属、ミクロコッカス(micrococcus) 属およびブレビバク
テリウム(Brevibacterium)属〔特公昭58−15120
号公報参照〕、アシネトバクター(Acinetobacter) 属
〔特公昭63−2596号公報参照〕、コリネバクテリ
ウム(Corynebacterium) 属〔特公昭63−5680号公
報参照〕およびアルカリゲネス(Alcaligenes) 属〔特開
平1−132392号公報参照〕、ロドコッカス(Rhodo
coccus) 属〔特開平3−251192号公報参照〕等に
属する細菌が知られている。
120号公報記載の方法では、その活性が低く実用的で
はない。そこで、微生物の触媒活性を高めるために、上
記特公昭63−2596号公報等には、アセトニトリ
ル、イソブチロニトリルなどの、ニトリル化合物をニト
リラーゼ誘導物質として添加して微生物の培養を行う方
法が提案されている。しかしながら、このような方法で
は、微生物が培地中に添加されたこれらニトリル化合物
を培養中に資化するために、ニトリル化合物をその消費
に応じて培地に追加する必要があり、常に安定して高活
性の菌体を得ることは難しい。また、一部のニトリル化
合物は揮発性、引火性が強く、中には著しい悪臭を放つ
ものもあり、工業的培養において用いることは困難であ
る。上記特開平3−251192号公報では、ラクタム
化合物を添加した培地でロドコッカス属を培養すること
により、ニトリラーゼ酵素活性を有する菌体を製造する
方法が提案されている。この方法では、培養液中のラク
タム化合物はほとんど資化されず、一定濃度を保つため
にニトリラーゼ酵素の誘導効果が安定している点で優れ
ているが、その誘導効果は全てのロドコッカス属の細菌
にあるわけではない。そこで、ラクタム化合物以外の有
効なニトリラーゼ酵素誘導物質の開発が望まれていた。
において、ニトリラーゼ酵素を誘導生成させる物質およ
び使用条件について鋭意検討を行った結果、エチレンシ
アンヒドリンを培地に添加して培養することによりニト
リラーゼ酵素活性を有する菌体を容易に取得することを
見い出し、本発明を完成するに至った。
を有する細菌を培養するに際し、培養液中にエチレンシ
アンヒドリンを存在させることを特徴とする細菌の培養
法、である。
は誘導剤として使用するが、ニトリラーゼの誘導にエチ
レンシアンヒドリンが有効であることは、従来知られて
いなかったことである。
リラーゼを有し、ニトリルを加水分解して対応する酸を
生成させることができる細菌であり、例えば、ロドコッ
カス属の細菌、具体的には、例えば、ロドコッカス(Rho
dococcus) sp. SK92〔微工研条寄第3324号〕、ロド
コッカス ロドクロウス(Rhodococcus rhodochrous) AT
CC 33025、ロドコッカス ロドクロウス(Rhodococcus r
hodochrous) ATCC 33258等を挙げることができる。これ
らのうち、ロドコッカス sp. SK92 株は、本出願人によ
り見出されたものであり、その菌学的性質は、特開平5
−192189号公報に記載されている。
る。すなわち、炭素源として、例えば、グルコース、フ
ラクトース、シュークロース、グリセロールなど、有機
栄養源として、例えば、酵母エキス、肉エキス、麦芽エ
キス、ペプトンなど、無機塩として、例えば、リン酸
塩、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、その他微量
金属などを適宜含有する培地に、ニトリラーゼ活性を有
する細菌を接種し、これに酵素誘導剤としてエチレンシ
アンヒドリンを一括、あるいは分割添加して好気的条件
下に培養を行う。
〜9、温度は通常15〜37℃、好ましくは25〜32
℃で好気的に1〜7日間培養する。培地へのエチレンシ
アンヒドリンの添加は0.05%〜10%(V/V) 、好ま
しくは0.5〜5%(V/V) である。
するが、本発明はこれらの例のみに限定されるものでは
ない。
v) 、KH2 PO4 0.1%(w/v) 、K2 HPO4 0.
1%(w/v) 、MgSO4 ・7H2 O 0.1%(w/v) か
らなる培地(pH7.2)を調製し、これを500ml容
三角フラスコに100ml分注して綿栓をし、120℃で
15分間オートクレーブで滅菌した。この培地に、ロド
コッカス sp. 92 株を接種して30℃で3日間振盪培養
した。この培養液1mlを同じ培地に接種し、同時にエチ
レンシアンヒドリン2mlを添加して30℃で20時間振
盪培養した後、エチレンシアンヒドリンを3ml添加して
さらに3日間培養を行った。この培養終了液から遠心分
離によって菌体を回収し、培養液と同量の50mMKH2
PO4 −Na2 HPO4 緩衝液(pH7.7)に菌体を
懸濁した。
0mMKH2 PO4 −Na2 HPO4緩衝液(pH7.
7)0.25ml、および蒸留水0.225mlからなる反
応液に上記菌体懸濁液0.025mlを添加して30℃で
15分間反応を行い、ニトリラーゼ活性を測定した。1
N塩酸0.2mlを添加して反応を止めた後、遠心分離で
菌体を取り除き、反応液中に生成したアクリル酸をHP
LCによって定量した(和光純薬工業社製Wakocil 5C8
カラム使用)。その結果、1mlの反応液中に6.45μ
mol のアクリル酸が生成していた。なお、アクリルアミ
ドの生成は見られなかった。
エチレンシアンヒドリンを2ml添加して30℃で2日間
振盪培養を行った。実施例1と同様の方法で集菌して菌
体懸濁液を調製して、ニトリラーゼ活性を測定した。但
し、反応時間は20分間とした。結果を表1に示す。
母エキス0.1%(w/v) 、KH2 PO4 0.05%(w/
v) 、MgSO4 ・7H2 O0.05%(w/v) からなる
培地(pH7.2)を調製し、これを500ml容三角フ
ラスコに100ml分注して実施例1と同様に滅菌した。
この培地にエチレンシアンヒドリンを0.5ml添加して
実施例1と同様に前培養したロドコッカス sp. SK92 を
接種し、30℃にて1日間培養した後、エチレンシアン
ヒドリンを1ml追添加してさらに1日間培養した。この
培養液から実施例1と同様に集菌してニトリラーゼ活性
を測定したところ、30分の反応で反応液1ml中に2.
07μmol のアクリル酸が生成していた。なお、上記培
養終了時の培養液中のエチレンシアンヒドリン濃度をガ
スクロマトグラフィーで定量したところ、1.4%(v/
v)(残存率約93%)であった。
化され難く、揮発性も低いので、ニトリラーゼ活性を有
する細菌の培養に際して、培養液中に、安定した濃度の
誘導剤であるエチレンシアンヒドリンを存在させること
ができ、結果として、高収量でニトリラーゼ活性を有す
る細菌菌体を得ることができる。
Claims (2)
- 【請求項1】 ニトリラーゼ産生能を有する細菌を培養
するに際し、培養液中にエチレンシアンヒドリンを存在
させることを特徴とする細菌の培養法。 - 【請求項2】 細菌がロドコッカス(Rhodococcus) 属に
属するものである請求項1記載の細菌の培養法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33687594A JP3437879B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 細菌の培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP33687594A JP3437879B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 細菌の培養法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH08173152A true JPH08173152A (ja) | 1996-07-09 |
JP3437879B2 JP3437879B2 (ja) | 2003-08-18 |
Family
ID=18303464
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP33687594A Expired - Fee Related JP3437879B2 (ja) | 1994-12-27 | 1994-12-27 | 細菌の培養法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3437879B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5998180A (en) * | 1995-12-12 | 1999-12-07 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Nitrilase from Rhodoccus rhodochrous for converting acrylonitrile directly to acrylic acid |
-
1994
- 1994-12-27 JP JP33687594A patent/JP3437879B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US5998180A (en) * | 1995-12-12 | 1999-12-07 | Ciba Specialty Chemicals Water Treatments Limited | Nitrilase from Rhodoccus rhodochrous for converting acrylonitrile directly to acrylic acid |
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