JPH07505714A

JPH07505714A - 流体試料中のチロキシンを検出・定量するための試薬および方法

Info

Publication number: JPH07505714A
Application number: JP5517596A
Authority: JP
Inventors: アダムクジツク，マシエージ; ジヨンソン，ドナルド・デイー; マテイングリイ・フイリツプ・ジー; クラリツセ，ダイアナ・イー; タイナー，ジヨアン・デイー; ペルコビツツ，メリー・エム
Original assignee: アボツト・ラボラトリーズ
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1993-03-29
Publication date: 1995-06-22
Anticipated expiration: 2017-09-24
Also published as: DE69328622T2; JP3327551B2; DE69332988T2; HK1026264A1; EP0649533A4; DE69328622D1; EP0649533A1; US5648272A; WO1993020442A1; US5593896A; ES2148225T3; CA2131727A1; EP0649533B1; ES2198823T3; DE69332988D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】流体試料中のチロキシンを検出・定量するための試薬および方法発明の詳細な説明発明の背景本発明は、テスト試料中のチロキシンの免疫定量法に関する。

特に、本発明は、テスト試料中のチロキシンの特異的定量法、好ましくは蛍光偏光イムノアッセイに使用するための免疫原、該免疫原から作られる抗体および標識化試薬に関する。

一般にチロキシンと呼ばれ、Ｔ４と略記されることが多いアミノ酸である３、５．３’　、５’　−テトラヨード−Ｌ−チロニンは、甲状腺から分泌される主なヨードチロニンである。Ｔ４は、正常な代謝および神経機能に不可欠な体中の種々の生化学反応の調節に関与する。甲状腺機能の変化の診断では、まず血清Ｔ４濃度を測定するのが普通である。甲状腺疾患以外のいくつかの条件でもＴ４の血清レベルの異常が生じる可能性がある。

これらの状態としては、妊娠、エストロゲンまたはアンドロゲンステロイド、経口避妊薬、ヒダントインおよびサリチル酸塩、ストレス、高蛋白血症および低蛋白血症ならびに主要な血清Ｔ４運搬系であるチロキシン結合グロブリン（Ｔ　Ｂ　Ｇ）の血清レベルの変化を招く条件（遺伝性または後天性）が挙げられる。

血流中のチロキシン濃度Ｉｔ、極めて低く、非常に感度の高い方法でのみ検出可能である。−循環している全チロキシンの約０．０５％が生理学的に活性（すなわち、遊離したチロキシン）である。残りの循環しているチロキシンは蛋白質、主にチロキシン結合蛋白質（Ｔ　Ｂ　Ｇ）に結合している。また、チロキシンは他の結合蛋白質、特にチロキシン結合プレアルブミンおよびアルブミンにも結合する。初期のＴ４測定は、血清中の蛋白質に結合したヨウ素またはブタノールで抽出可能なヨウ素の濃度を間接的に測定するものであった。後に、競合的蛋白質結合（ＣＰ　Ｂ）測定法が開発された。さらに最近は、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を使用するラジオイムノアッセイが開発されている。これは、米国特許Ｎｏ。

４．６３６．４７８および４．　８８８．　２９６　（Ｓｉｅｂｅｔｌ　ら）に開示され、Ｌ−チロキシンを認識する特異的モノクローナル抗体を使用するチロキシンのラジオイムノアッセイが開示されている。一般に、公知のラジオイムノアッセイは、抗体とＬ−チロキシンの結合に関連する放射能を計数するものである。

Ｄ−チロキシンは天然には存在しないチロキシンの異性体である。Ｌ−およびＤ −チロキシンは共に、下記式１で表される。

式Ｉ　Ｌ−およびＤ〜チロキシンさらに最近は、蛍光偏光法がチロキシンの測定に使用されている。蛍光偏光法は、蛍光標識した化合物が直線偏光によって励起されると、その回転速度と逆比例する偏光度を有する蛍光を放射するという原理に基づく。従って、蛍光標識したトレーサー−抗体複合体が直線偏光によって励起されると、光が吸収されて放射される間、蛍光子（ｆ　１ｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）は回転が抑制されるので、放射される光は高度に偏光された状態に止まる。「遊離した」　（すなわち、抗体に結合していない）トレーサー化合物が直線偏光によって励起されると、その回転は対応するトレーサー−抗体抱合体よりもかなり速く、分子の配向はよりランダムになり、従って放射される光は偏光が解消される。すなわち、蛍光偏光は、競合的結合測定法で生じるトレーサー−抗体抱合体の量を測定するための定量的手段となる。

米国特許Ｎｏ、４，５１０，２５１およびＮｏ。

４、　６１４．　８２３　（Ｋｉｔｋｅａｏ　ら）は、各々、トレーサーとしてアミノメチルフルオレセン誘導体を使用するリガンド用の蛍光偏光分析法およびアミノメチルフルオレセン誘導体を開示している。米国特許Ｎｏ、４，４７６．２２９　（ＦｉｎＯら）は、蛍光偏光イムノアッセイに使用するための置換カルボキシフルオレセン（チロキシン類似体を含むものなど）を開示している。

米国特許Ｎｏ、４．６６８，６４０　（ＷｓＢら）は、置換カルボキシフルオレセンを使用する蛍光偏光イムノアッセイを開示している。ＷｌｎＨらの実施例■ は、下記式：のＬ−チロキシンカルボキシフルオレセン抱合体の製造法を開示しでいる。

ＷｒｎＨらの特許およびＦｉｏｏらの特許は共に、カルボキシフルオレセンがアミド結合によってチロキシン用アミノ基に直接結合した抱合体を提示している。

チロキシン用に市販されている蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）の例としては、ＴＭ、、ＴＤ、およびＴＤ。

ＦＬ、Ｔ１′Ｔ４測定法（本出願人）（以下、「市販のＡｂｂｏｌｌＴ４測定法」または「市販のＴ４測定法」とも言う。）が挙げられる。これらの方法は、血清または血漿サンプルに存在する全チロキシン（すなわち、遊離したものと蛋白質に結合したもの）を定量的に測定するための試薬系を含む。これらの測定法は全て、トレーサーとしてカルボキシフルオレセンで標識した同一の蛍光性Ｔ４誘導体（以下、市販のＴ４トレーサー」または「市販のトレーサー」とも言う。）；チロキシンに対する同一のヤギポリクローナル抗体（以下、「市販のＴ４抗体」または「市販の抗体ｊとも言う。）；および蛋白質結合チロキシンから蛋白質を除いてチロキシンを測定のために遊離するための同一の試薬を使用している。

Ｆ、Ｅ！ＩＡは、処分する放射性物質がない点でラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）より−も有利であり、ＦＰＩＡは均一系測定法であって、容易に行うことができる。しかし、市販の　＾ｂｂｏ目ＴＤ、Ｔ４測定法は低いＴ４レベルを示し、ラジオイムノアッセイの測定値および甲状腺機能低下の臨床上の症状と一致しなかったことが報告されている。Ｌｅｗｉｎｓ、Ｓ、ら、Ｃｌ１ｏ、　Ｃｂｔｍ、、３６（１０１：　１８３８−１８４０Ｆ！９９０１参照。

発明の要旨本発明は、テスト試料中のチロキシンを定量するためのユニークな抗体試薬および標識化試薬を提供する。また、本発明は、標識化試薬の合成法および抗体試薬の製造に使用する免疫原の合成法を提供する。本発明の標識化試薬および抗体試薬は、テスト試料中のチロキシンを定量するためのイムノアッセイに使用する場合、公知方法よりも改善が見られる。本発明の好ましい態様によれば、標識化試薬および抗体試薬を、特異性を有するだけでなく迅速かつ均一系の有利さをも有する蛍光偏光イムノアッセイで使用することにより、テスト試料中のチロキシンの信頼できる定量が得られ、一部のヒトによって産生される内因性免疫グロブリンＧ（以下、ｒＴｇＧＪという。）の妨害が避けられる。

発明の詳細な説明本発明によれば、最初に、テスト試料を標識化試薬またはトレーサーおよび抗体試薬と同時または順次接触させ、次いで、抗体との結合反応に関与した、または関与しなかった標識化試薬の量をテスト試料中のチロキシンの量の関数として測定することにより、チロキシンの特異的定量が達成される。

テスト試料は天然の体液もしくは組織、ま元はその抽出物もしくは希釈物であり、全血、血清、血漿、尿、唾液、脳を髄液、脳組織、便などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

特に、本発明は、チロキシンの特異的定量のための蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）に使用するための免疫原、該免疫原から作られる抗体および標識化試薬に関する。

本明細書全体にわたって式中に示す化学構造は、ＬもしくはＤ異性体、またはＬおよびＤ異性体の組み合わせのいずれかである。しかし、全ての式において、Ｌ異性体が最も好ましい。

本発明の抗体（ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方）は、下記一般式式２　免疫原の一般構造［式中、Ｐは免疫原担体物質であり、Ｘは結合部分である。］の免疫原により作る。結合部分、つなぎ、スペーサー、スペーサーアームおよびリンカ−の用語は交換可能であり、１個の規定物質（ハブテンなど）冴第二の規定物質（免疫原ｉｌｌまたは検出可能な部分）と分離する共有的に結合した化学因子として定義されるものである。

本発明において、Ｘは好ましくは直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成る結合部分であるが、ただしく１）へテロ原子が直接結合するのは２個までであり、（２）Ｘは−０−〇−結合を含むことができず、（３）環式部分は６員環か、それより小さく、（４）分岐は炭素原子上にのみある。ヘテロ原子としては、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられる。Ｘの例としては、アルキレン、アラルキレンおよびアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられる。なお、ここでの定義によれば、Ｘは０であってもよい。すなわち、炭素およびヘテロ原子がＯの場合である。ｘ−０てあれば、結合部分が存在しないことになり、これは、Ｐが式２のチロキシン誘導体に直接結合することを示す。

当業者であれば理解されるように、免疫°原担体物質Ｐは従来の公知物質から選択することができ、はとんどの場合、蛋白質またはポリペプチドであるが、炭水化物、多糖類、リボ多糖類、ポリ（アミノ）酸、核酸など、大きさおよび免疫原性が十分な他の物質も使用できる。好ましくは、免疫原担体物質が牛血清アルブミン（Ｔ３ＳＡ）　、ｋｅｙｈｏ　Ｉ　ｅ　ｌ　ｉｍｐｅ　ｔヘモシアニン（ＫＬＨ）、チログロブリンなどの蛋白質である。

好ましい免疫原において、Ｐは牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）であね、Ｘは− ＮＨ（ＣＨ−２）５Ｃ（＝０）−である。−この好ましい免疫原を以下に示す。

式３　好ましいチロキシン免疫原の構造量も好ましいチロキシン免疫原は、式３のＬ異性体である。

式２および３は、当業者であれば理解されるように、チロキシンと免疫原担体との１：１抱合体に限らない。チロキシン誘導体と免疫原担体との比は免疫原担体の化学的に利用可能な官能基の数により規定され、合成中の２個の物質の比率により制御される。Ｐ上のチロキシン誘導体による置換度は、免疫原担体上の利用可能な官能基の１〜１００％の間で変わり得る。置換レベルは、好ましくは１０〜９５％であり、より好ましくは１５〜８５％である。

本発明の標識化試薬は、下記一般式：式４　標識化試薬の一般構造［式中、Ｑは検出可能な部分、好ましくは蛍光部分であり、Ｗは結合部分である。］を有する。好ましい標識化試薬では、Ｑが、４゛−アミノメチルフルオレセン、５−アミノメチルフルオレセン、６−アミノメチルフルオレセン、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、５−および６−アミノフルオレセン、チオウレアフルオレセンならびにメトキントリアジツリルーアミノフルオレセンから成る群から選択されるフルオレセン誘導体である。Ｗは、好ましくは直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成る結合部分であるが、ただしく１）へテロ原子が直接結合するのは２個までであり、（２）Ｗは一〇−〇−結合を含むことができず、（３）環式部分は６員環か、それより小さく、（４）分岐は炭素原子上にのみある。

ヘテロ原子としては、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられる。Ｗの特定の化学構造は、式２のＸの構造と同じでも異なっていてもよい。Ｗの例としては、アルキレン、アラルキレンおよびアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられる。なお、ここでの定義によれば、Ｗは０でもよい。すなわち、この場合、炭素およびヘテロ原子は０である。Ｗ＝Ｑの場合、結合部分は存在しない。これは、Ｑが式４のチロキシン誘導体に直接結合することを示す。

好ましい標識化試薬は、下記式を有する。

式５　好ましいチロキシントレーサーの構造量も好ましい標識化試薬は、式５のＬ異性体である。式５の５−メチル置換フルオレセン誘導体の製造法の例は、米国特許出願Ｎｏ、　８５９．７７５　（Ｐ、　Ｇ、　Ｍｓｌｌｉｎ！ＩＦ　、１９９２年３月３０日出願、ｒ５　（６）−メチル置換フルオレセン誘導体」）に開示されている。

本発明は驚くべき特徴を有する。特異的抗体および相補的な標識化ハブテン（標識化試薬）を製造する場合、抗体反応を励起するために使用する免疫原および標識化ハブテンの両方の化学構造を考慮する必要があることは当業者であれば周知である。

伝統、的には、ハブテンを、選択的抗体の達成に必須なハブテンのユニークな基から遠く離れた部位で担体蛋白質に結合する。

同様に、そのような抗体に結合可能な標識化ハブテンを製造する場合は、担体蛋白質の場合と同様の部位で標識をハブテンに結合するのが通例である。そのような方法を行う理由は、免疫系がハブテンのその部分に接近するのを担体蛋白質が立体的に阻害する可能性があるからである。通常、相補的な標識化ハブテンは、その標識を、ハブテンの、免疫原がその担体蛋白質の結合に使用する部位と同じ部位に結合することにより合成し、抗体がハブテンの決定基に結合するのを妨害しないようにする。

従って、チロキシン上の異なる結合部位から誘導された本発明のチロキシン免疫原および標識化チロキシンにより、チロキシンに特異的な抗体およびチロキシンの定量化が改善された優れた測定法が開発されることは驚くべきことであり、予期しなかったことである。

特に、本発明では、チロキシンのカルボン酸末端を介して担体蛋白質に結合したチロキシン分子から免疫原を製造したが、標識化チロキシン試薬は、標識をチロキシンのアミノ末端で結合することにより製造した。

さらに、「発明の背景」で述べたように、ＷＩＢらの特許およびＦｉｎｏらの特許は、カルボキシフルオレセンがチロキシンのアミノ基にアミド結合により直接結合している抱合体を提示している。本発明では、検出可能な部分がＮ−カルボキシメチル−Ｌ−チロキシンに結合部分を介して結合しており、チロキシンの最初のアミン基は第二アミンであってアミドではない。さらに、ＷｉｎＨらの特許およびＦｉｎｏらの特許と違って、本発明の合成法は、直交保護基を多用して所望の構造を得るために、チロキシンの多段処理を必要とする。

免疫原の合成免疫原の一般構造は図２０式中、Ｘは結合部分であり、Ｐは免疫原担体である。

］に示す通りである。式２の免疫原は、下記反応式に従って得ることができる。

■　（ＩＩ′）Ｆｏ−６１３□ Ｎ−アセチル−し−チロキシン（＋）を、当業者には周知の方法に従って、二官能性リンカ−；ｖ−Ｘ−ｙ［式中、■−および−ｙは官能基であり、一方は、Ｎ −アセチル−し−チロキシン（１）のカルボキシレートと反応し、他方は、Ｐ上の化学的に利用できる官能基と反応する。］と結合させる。又は結合部分である。当業者には多くの二官能性リンカ−が周知である。例えば、ヘテロ三官能性リンカ−は、米国特許Ｎｏ。

５．００２，８８３　（Ｂｉｅａ１口ら）に記載されている。これらのへテロ三官能性リンカ−は、それらの末端の一方の官能基または他方の官能基に対する特異性により、好ましい場合もある。

同様に、合成の便利さから、当業者には周知の、官能基Ｖ−および−ｙが保護された形を使用して、所望のときに保護基を脱離してもよい（例えば、Ｔ、　Ｗ、　Ｇ「ｅｅｎｔｇｎｄ　Ｐ、　Ｇ、　Ｍ、　Ｗｗｌ目。

？ｏｌ＠ｃｌｉｗｔ　Ｇｒｏｕｐｓ　ｉｎ　ＯＢｇｏｉｃ　５７ｎｌｈｅ＋ｉ＋、２ｎｄ　ｅ６．　１９Ｈ。

Ｊｏｈｎ　ＷｉｌＢ　ｔｎｄ　Ｓｏｎ＋参照）。

一般に、本発明の免疫原の合成では、■が一〇Ｈ，−／＼ロゲン（例えば、−ＣＩ、−Ｂ　ｒ、−１）　、−３Ｈおよび−ＮＨＲ’−から成る群から選択される。Ｒｏは、Ｈ’ｌアルキル、アリール、置換アルキルおよび置−換アリールから選択される。ｙは、ヒドロキシ（−ＯＨ）、カルボキン（−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）　、アミノ（−ＮＨ２）、アルデヒド（−ＣＩ　（＝Ｏ）　）およびアジド（−Ｎ３）から成る群から選択される。Ｘは、好ましくは直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成る結合部分であるが、ただしく１）へテロ原子が直接結合するのは２個までであり、（２）Ｘは一〇−〇−結合を含むことができず、（３）環式部分は６員環か、それより小さく、（４）分岐は炭素原子上にのみある。ヘテロ原子としては、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられる。Ｘの例としては、アルキレン、アラルキレンおよびアルキレン置換ンクロアルキレン基が挙げられる。なお、ここでの定義によれば、Ｘは０であってもよい。すなわち、炭素およびヘテロ原子が０である。Ｘ＝Ｑであれば、結合部分が存在しないことになり、これは、Ｐが式２のチロキシン誘導体に直接結合することを示す。

Ｎ−アセチル−し−チロキシン（５）とｖ−Ｘ−ｙとの反応により、官能基ｙを伴う結合部分Ｘを有するつながれた中間化合物（ｎ）が得られる。官能基−ｙは、当業者に周知のいくつかの方法のいずれかにより、−免疫原担体上の官能基と反応させることができる。アミド結合を形成すると好ましいことが多く、これは、典型的にかなり安定である。アミド結合は、まず、スペーサーアームのカルボン酸部分［ｙ＝Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）］を、１．３−ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの活性化試薬およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの添加剤と反応させることにより活性化して形成する。活性型は、次いで、免疫原担体物質を含む緩衝溶液と反応させる。あるいは、カルボン酸基を、単離はしてもしなくてもよいが、かなり反応性の高い混合無水物、ハロゲン化アシル、イミダゾールアシルまたは混合炭酸塩に変換した後、免疫原担体物質と結合してもよい。当業者であれば、上記以外のアミド結合を形成するのに使用できる多くの試薬があることが認められる。

末端アミン（ｙ　＝　Ｎ　Ｈ２）官能基を有するスペーサーアームは、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミドなどの適当な溶媒中で、炭酸Ｎ、Ｎ“　−ジスクシンイミジルとの反応により、反応性の高いＮ−ヒドロキシスクシンイミドウレタンに変換することができる。得られたウレタンは、次いで、緩衝水溶液中で免疫原担体物質と反応させて免疫原を得る。

末端アルデヒド官能基（ｙ＝−ｃＨ（−〇））を有するスペーサーアームは、当業者には公知の方法による還元的アミノ化により、ンアノホウ水素化ナトリウムの存在下、緩衝水溶液中で免疫原担体物質に結合することができる。

あるいは、アルコール基（ｙ＝−ＯＨ）を含むスペーサーアームは、最初にホスゲンまたはホスゲンと同等の物質（ジもしくはトリホスゲンまたはカルボニルンイミダゾールなど）と反応させて反応性の高いクロロギ酸エステル誘導体またはイミダゾールギ酸エステル誘導体を生成する（通常は単離しない）ことにより免疫原担体物質に結合することができる。ついで、その結果得られる活性ギ酸エステルを緩衝水溶液中で免疫原担体物質と反応させて免疫原を得る。

あるいは、ｙ＝−Ｎ３の場合、つながれた中間体は緩衝水溶液中での光分解によりＰに結合することができる。

すなわち、式３の好ましい免疫原は、図１の反応式に従って合成される。Ｌ−チロキシン（１）のナトリウム塩は、Ｎ−アセチル−し−チロキシン（５）に変換される。Ｎ−アセチル−し−チロキシン（５）のカルボキシル基は、ジシクロへキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドによって活性化される（括弧内の数字は、図１で使用される構造式に対応する。）。さらにリンカ− の６−アミノカプロン酸［Ｖ＝−ＮＨ、Ｘ＝−（ＣＩ　）　−、ｙ＝−Ｃｏ２ＨＥ　と反応さセルト、ツナカレタ中間体（６，ｘ＝−（ＣＨ２）　５−、ｙ＝− Ｃｏ２Ｈ）が得られる。次いで、ｙ−基をジシクロへキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化してＰに結合する。当業者であればわかるように、ペプチド結合を生成するための他の方法も同様に使用することができる。

免疫原と同様の方法で、スペーサーアームを、その反応基と相補的に反応するアミノ基、水酸基またはカルボキシル基などの官能基を有する固体支持体に結合することができる。その結果、ハブテンに対する抗体を分離または精製するために使用できる固相となる。

すなわち、上記チロキシン誘導体は、公知の種々の常法により免疫原担体物質Ｐに結合することができる。

抗体の産生本発明に係る免疫原を使用し、周知の方法に従って、本発明に係る免疫測定系に使用するための抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）−を作る。

一般に、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモットまたはウマなどの宿主動物に、１か所以上の種々の部位で、免疫原（通常はアジュバントとの混合物）を注入する。

さにら、同じ部位または異なる部位で規則的または不規則的に注入を行い、最適力価に達したと決定されるまで出血を行って抗体力価を評価する。抗体は、宿主動物を出血させである量の抗血清を得るか、体細胞雑種形成法または他の公知方法によりモノクローナル抗体を得ることにより得られ、例えば−２０℃で保存することができる。本明細書での抗体は、全免疫グロブリンの他に、免疫グロブリンの抗原結合断片を含む。これらの断片の例としては、Ｆ　ａ　ｂ、　Ｆ　（ａ　ｂ’　）　２およびＦｖがある。そのような断片は、公知方法により得ることができる。

実施例４かられかるように、市販のＴ４トレーサーを本発明の標識化試薬のみで置き換えると、チロキシン分析の性能が改善される。すなわち、その分析法またはキットでは、本発明の標識化試薬を、チロキシンおよび標識化試薬の両方を認識する抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）（好ましくは、式２および３の免疫原によって高められる抗体）とともに使用することができる。さらに、ＦＰＩＡなどの競合的イムノアッセイ−９実施を可能にするに−は、トレーサーおよびチロキシンが抗体に競合的に結合できなければならない。抗体はチ℃キシンの両方の異性体に結合可能で−あるけれども、テスト試料はほとんどが生物学的試料であるため、抗体は、好ましくはＬ−チロキシンに結合するのが好ましい。同様に、免疫原はＬ−チロキシンの誘導体または類似体が好ましい。標識化試薬は、テスト試料に存在する可能性がある内因性の免疫グロブリン、すなわち、標識化試薬と結合する予定の抗体ではないので、結合すると測定の正確さを妨害する抗体に結合しないか、実質的に結合しないのが好ましい。下記実施例４において、これらの免疫グロブリンは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。

標識化試薬の合成下記に本発明の標識化試薬の合成法を記載する。これらの標識化試薬は、チロキシンから、（ａ）チロキシンのカルボン酸、α−アミノ基およびフェノール基を特異的に保護しく例えば、Ｔ、Ｗ、　Ｇｔｅｅｎｅ　ｇｏｄ　Ｐ、Ｇ、Ｍ、Ｗａｌｔｚ、　Ｐｒｏｌｅｃｌｉｒｅ　ＧＩｏｕｐｓ　ｉｎＯｒｇａＩｌｉｃ　５７ｎｌｈｅ＋口、２ｎｄ　ｅｄ、１９９１．　Ｉｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ｔｎｄ　Ｓｏ＋＋＋に記載の方法に従う）、次いで（ｂ）チロキシン誘導体のα−アミノ基の保護基を選択的に脱離し、次いで（Ｃ）α−アミノ基を選択的にカルボアルコキシメチル化し、次いで（ｄ）チロキシン誘導体のα−Ｎ−カルボキンメチル基およびフェノール基の保護基を選択的に脱離し、次いで（ｅ）α−Ｎ−カルボキンメチル基を活性化し、次いで（ｆ）チロキシン誘導体の活性化α−Ｎ−カルボキシメチル基を二官能性結合部分と結合し、次いで（ｇ）検出可能な部分と結合し、最後に（ｈ）標識化試薬のカルボン酸基の保護基を脱離することにより合成できる。また、当業者であれば、工程ｆおよびｇは一緒にずぶごとができ、工程ｅのチロキシン誘導体に結合する前に検出可能な部分を二官能性結合部分に結合することができることが理解されるであろう。

さらに詳細には、標識化試薬は、（ａ）（ｉ）チロキシンのナトリウム塩を塩化９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ−ＣＩ）と反応させてアミノ基を保護した後、（ｉｉ）得られたチロキシン誘導体のフェノール官能基をアセチル化により保護し、次いで（ｉｉｉｌＮ−ＦＭＯＣ−０−アセチル−チロキシンのカルボキシル基を保護してｔ−ブチルエステルとし、次いで（ｂ）ＦＭＯＣ保護基を脱離してｔ−ブチル−０−アセチルチロキシンとし、次いで（ｃ）ｔ−ブチル−０−アセチル−チロキシンのアミノ基をブロモ酢酸エチルエステルでアルキル化してｔ−ブチル−０−アセチル−Ｎ−カルボエトキシメチルチロキシンとし、次いで（ｄ）ｔ−ブチル−０−アセチル−Ｎ−カルボエトキシメチルチロキシンのエチルエステル基およびアセチル基を水酸化ナトリウム／メタノールで加水分解し、１工程でｔ−ブチルＮ−カルボキシメチル−チロキシンを得て、（ｅ）ｔ−ブチルＮ−カルボキシメチル−チロキシンをジシクロへキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化し、次いで（ｆ）チロキシン誘導体を５−アミノメチルフルオレセンと反応させてｔ−ブチルＮ−（５−カルボキサミドメチルフルオレセイニルメチル）チロキシンとし、次いで（ｇ）ｔ− ブチルエステルをトリフルオロ酢酸により加水分解して標識化試薬を得ることにより合成できる。この方法は、図２に示す好ましい標識化試薬の合成で例示する。

好ましくは、上記合成方法を使用して、式４および５の標識化試薬、より好ましくはこれらの式のし構造を作る。

蛍光偏光イムノアッセイを利用するチロキシン測定法テスト試料中のチロキシンの濃度またはレベルは、本発明の試薬を使用して、蛍光偏光メムノアッセイ（Ｆ　Ｐ　Ｉ　Ａ）で正確に定量できる。チロキシンを特異的に定量するためにＦＰｒＡを行うには、既知量のチロキシンを使用した検量線を作って試料中のチロキシンを測定する。

本発明によれば、予期せぬことに、また驚いたことに、式５の蛍光性の標識化試薬（またはトレーサー）のし−異性体を使用すると、チロキシンの定量化のための蛍光偏光イムノアッセイによる優れた測定結果が得られることが見出された。

特に、予期せぬことに、また驚いたことに、この標識化試薬の使用が矛盾した結果の回避に重要であることがわかった。

このことは、チロキシンの特異的定量化に対して、市販の＾ｂｂｏｌｌ　Ｔ　４測定法よりも有利であることを示す。より一般的には、トレーサーを式４のものにすることができる。本明細書に記載し、たチロキシンの特異的定量化のための蛍光偏光イムノアッセイを行う場合、トレーサーの検出可能な部分の成分は、フルオレセン、アミノフルオレセン、カルボキシフルオレセンなどの蛍光性部分であり、好ましくは、５−および６−アミノメチルフルオレセン、５−および６− アミノフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、５−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセンおよびメトキシトリアジツリルーアミノフルオレセンならびに同様づ蛍光性誘導体である。蛍光性のトレーサーは、トレーサーおｌびＴ４の両方に結合可能な抗体と組み合わせて使用することが−できる。競合的イムノアッセイの場合は、トレーサーおよびＴ４が抗体に競合的に結合可能でなければならない。チロキシンの定量化の場合、抗体試薬は、チロキシンに結合可能であるが、チロキシンを認識することができる抗体を含み、その抗体は、好ましくは式２の免疫原、より好ましくは式３の免疫原により産生される。

抗体に結合するトレーサーの量は、テスト試料に存在するチロキシンの量とは逆に変化する。従って、チロキシンおよびトレーサーの抗体結合部位に対する相対的結合親和性がその測定系の重要なパラメータである。

一般に、蛍光偏光法は、蛍光性トレーサーが固有波長の平面偏光で励起されると、別の固有波長の光（すなわち、蛍光）を放射するという原理に基づき、与えられた媒体におけるトレーサーの回転速度に逆比例する、入射刺激光に関する偏光度が保持される。この性質のために、粘性溶液相中または比較的回転速度の遅い抗体などの別の溶液成分に結合した場合など、回転が抑制されたトレーサー物質では、束縛のない溶液の場合より、放射光の比較的大きい偏光度が保持される。

本発明に係るチロキシンの特異的定量化のための蛍光偏光イムノアッセイを行う場合、チロキシンを含むと考えられるテスト試料を、本発明に係る免疫原により産生される抗血清またはモノクローナル抗体と、本発明に係る免疫原により産生される抗血清またはモノクローナル抗体の存在に対して検出可能な蛍光偏光反応を生じ得る本発明の標識化試薬の存在下で接触させる。次いで、平面偏光を溶液に通して蛍光偏光反応を得、その反応をテスト試料に存在するチロキシンの量の尺度として検出する。

本発明のチロキシン誘導体を通常の担体物質と結合させて免疫原を合成し、次いで、それを使用して抗体を得る。また、本発明のチロキシン誘導体を使用すると、テスト試料中のチロキシンを定量化するためのイムノアッセイにおいて検出試薬となる標識化試薬を合成することができる。

蛍光偏光測定法は、ＩＭ、　、ＴＤ、およびＴＤ、ＦＬ、”（本出願人）などの市販の自動装置で行うことができる。

他の測定形式蛍光偏光測定法の他にも、他の種々の免疫測定法に従って本発明に係るチロキシンの定量化を行うことができる。そのような免疫測定法としては競合的測定法およびサンドイッチ測定法があるが、これらに限定されない。一般に、そのような免疫測定系は、免疫グロブリン（すなわち、全抗体またはその断片）がテスト試料の特定の分析物に結合できるがどうかに依存し、本発明の抗体またはその断片が標識化試薬の標識または検出可能な部分に結合した標識化試薬を使用して結合の程度を測定する。そのような標識または検出可能な部分としては、酵素、放射性標識、ビオチン、毒素、薬物、ハプテン、ＤＮＡ、ＲＮＡ。

リポゾーム、発色団、化学ルミネセンス、着色粒子および着色微粒子、蛍光性化合物（アミノメチルフルオレセン、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、アミノフルオレセン、チオウレアフルオレセンおよびメトキシトリアジツリルーアミノフルオレセンなど）、ならびに蛍光性誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。

典型的には、そのような免疫測定系での結合の程度は、標識化合物試薬に存在する検出可能な部分（分析物との結合反応に関与した、または関与しなかった部分）の量によって決定され。

検出・測定される検出可１部分の量は、テスト試料に存在する分析物の量と関連させることができる。例えば、競合的イムノアッセイ系では、測定される物質（リガンドということが多い。）が検出可能な部分を伴う構造的に密接に類似した物質（トレーサーということが多い。）と、リガンドおよび構造的に類似したトレーサーのその部分に特異的な抗体上の限られた結合部位を競合する。これらの結合部位は通常、該抗体を産生ずるために使用される免疫原と共有される。

テストキット本発明に係るテストキットは、テスト試料中のチロキシンを定量するための本発明にかかる所望の特異的蛍光偏光イムノアッセイを行うのに必要な必須試薬全部を含む。テストキットは、市販のパッケージ型に入れて、必要な試薬を含む１個以上の容器の組み合わせとして提供され、試薬の相溶性によっては組成物または混合物として提供される。

特に好ましいのは、上述した、チロキシンの定量化のための蛍光性トレーサー化合物および抗体を含む、テスト試料中のチロキシンの蛍光偏光イムノアッセイによる定量化のためのテスｉ・キットである。なお、テストキットはもちろん、公知で、使用者の観点から好ましいと考えられる、緩衝液、希釈剤、標準物質、μ どの他の物質を含む−ことができる。

次に、本発明を下記実施例により説明するが、本発明は下記実施例により限定されないよ一実施例１および２において、括弧内に示す数字は、各々、図１および２で使用した構造式に対応する。

実施例ＩＬ−チロキシン免疫原（７）の合成略号：ＥｔＯＨ＝ｘ９）−ル、ＮＨ４０Ｈ＝水酸化アンモニウム、ＨＣ１＝塩酸、ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド、Ｎ　ａ　ＯＨ＝水酸化ナトリウム、ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン、ＣＨ２Ｃｌ２＝塩化メチレン、Ｍ　ｅ　ＯＨ＝メタノール、ＨＯＡｃ＝酢酸Ｌ−チロキシン　ナトリウム塩・５水和物（１）　（１０ｇ。

１１ミリモル）を４００　ｍ　ｌ　ノＥ　ｔ　ＯＨ／　２　Ｎ　Ｎ　）Ｔ　４０　Ｈ（１／１、ｖ　／　ｖ　）にほぼ完全に溶解し、濾過し、濾液を４２５ｍ１の５％ＨＣＩに注入した。得られた析出物を真空濾過により単離し、高真空下で乾燥すると白色固体が得られた。この物質を１６０ｍｌｃ７）ＤＭＦｌ、ｍ溶解し、１００ｍ１　（１，０６％ル）の無水酢酸を添加し、反応物を１．５時間攪拌した後、８５゜ｍｌの■Ｉ２０で希釈し、４℃で１６時間放置した。得られた析出物を濾過により単離した後、３５０ｍ１のＥｔＯＨおよび４１ｍ１のｌＮＮａＯＨに溶解し、２．５時間攪拌し、６８０ｍ１の５％ＨＣＩを添加し、その混合物を４℃で１６時間放置した。得られた析出物を真空濾過により単離し、高真空下で乾燥すると、所望のＮ−アセチル−Ｌ−チロキシン（５）が白色固体として８．１ｇ（９０％）得られた。’ＨＮ　Ｍ　Ｒ（２００Ｍ　Ｈｚ　、ＣＤ　３０　Ｄ　）δ７．８　（ｓ、２Ｈ）　、７゜１（ｓ、２Ｈ）、４．　６〜４．　７　（ｍ、ＩＨ）、２．　８〜３．　０（ｍ、２Ｈ）　、２．０　（ｓ、３Ｈ）；７ススベクトル（Ｆ　Ａ　Ｂ）（Ｍ＋１−ｒ）　８２０゜Ｎ−アセチル−し−チロキシン（５）（１，０ｇ、１．２ミリモル）を５０ｍ１のＴＨＦに溶解し、１７０ｍｇ　（１，５ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、３００ｍｇ（ｔ、ｓミリモル）の１，３−ジシクロへキシルカルボジイミドを添加して、反応物を窒素雰囲気下で３日間攪拌した。

次いで、反応物を真空濾過して不溶尿素を除去すると、４０ｍ１の濾液が得られた。半分の濾液（２０ｍｌ、０．６ミリモル）を８０ｍｇ　（０，６ミリモル）の６−アミノカプロン酸と一緒にし、反応物のｐＨをトリエチルアミンで９に調整して、反応物を窒素雰囲気下で２日間攪拌した。次いで、溶媒を真空除去し、粗生成物をシリカゲルＣｈ＋ｏｓ＊１ｏｌｒｏｎ　（Ｈａｉｒロ◇ロＲｅ■＋ｃｈ、Ｐ！ｌｏ＾ｌｌｏ、Ｃ人）上でＣＨ２ＣＩ　２　／　Ｍ　ｅ　ＯＨ／ＨＯＡ　ｃ　（９０／　１０　／　０　、　２　、ｖ　／　ｖ　）により溶離して精製すると、所望の物質（６）が黄色油状物として３０　Ｑｍｇ（５４％）得られた。マススペクトル（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）’９３３゜その酸（６）（３００ｍｇ、０．３２２ミリモル）を２５ｍ１のＴＨＦに溶解し、４５ｍｇ　（０，３９ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、８０ｍｇ　（０，３９ミリモル）の１，３−ジシクロへキシルカルボジイミドを添加して、反応混合物を窒素雰囲気下で１６時間攪拌した。次いで、反応物を真空濾過して不溶尿素を除去すると、１６ｍ１の濾雇が得られた。次いで、２５０ｍｇ　（０，００３７ミリモル）の牛血清アルブミンを１０ｍ１の０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨこれに４ｍｌ　（０，０８ミリモル）の濾液を添加した。

反応物を３日間攪拌した後、４１の０．０５Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ＝８．０）１ｍ対して２４時間、次いで４１のＨ２Ｏに対して２４時間透析し、凍結乾燥すると、所望のし一チロキシン免疫原（７）が２９７ｍｇ得られた。

実施例２Ｌ−チロキシントレーサー（４）の合成略号：ＴＨＦ＝テトラヒドロフラン、ＥｔＯＡｃ；酢酸エチル、ＤＭＳＯ＝ジメチルスルホキシド、ＣＨＣｌ３＝クロロホルム、ＣＨ２Ｃｌ２＝塩化メチレン、Ｍ　ｅ　ＯＨ＝メタノール、ＨＯＡｃ＝酢酸、Ｌ（ｅ　ｘ　＝　ヘキサン、ＤＭＦ＝ジメチルホルムアミド炭酸ナトリウム（７，８５ｇ、７４．１ミリモル）を４８０ｍ１の■］２０に溶解し、４８０ｍ１のＴＨＦを添加し、２２．０ｇ　（２４，７ミリモル）のし− チロキシン　ナトリウム塩・５水和物（１）を添加し、７．０４ｇ　（２７，２ミリモル）のクロロギ酸９−フルオレニルメチルを添加し、反応物を３０分間攪拌した。次いで、反応物を１７０ｍ１のＩ　Ｍ　ｌ−Ｉ　ＣＩで希釈し、ＥｔＯＡｃ　（３Ｘ７００ｍｌ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を一緒にしてＮａ２ｓ０４で脱水し、溶媒を真空除去すると、所望のＮ−ＦＭＯＣ生成物がベージュ色の固体として２６．３ｇ得られた。　’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ。

ＤＭＳＯ−Ｄ６）　δ９．２−９　（ｓ、ＩＨ）　、７．０８〜７、　８９　（ｍ、１２Ｈ）　、４−＝　１９〜４．　２９　（ｍ、４Ｈ）　、３、０６〜３．１６　（ｍ、　ＬＨ）　、２．８２　（ｔ、　ＩＨ）　；７ススベクトル（ＦＡＢ）（Ｍ−Ｈ＋Ｎａ）　１０２１゜Ｎ−ＦＭＯＣで保護したし一チロキシン（２６，３ｇ。

ｍｌ　（３４，８ミリモル）の無水酢酸を添加し、２８３ｍｇ（２，３２ミリモル）の４−ジメチルアミノピリジンを添加し、反応物を窒素雰囲気下で４５分間攪拌した後、４００ｍ１のＨ２Ｏに注入してＣＨＣｌ　３（３ｘ　４００　ｍ　ｌ　）で抽出した。

ＣＨＣｌ３抽出物を一緒にしてＮａ２ＳＯ４で脱水し、溶媒を真空除去した。次いで、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：　ＣＨＣｌ　２　／　Ｍ　ｅ　ＯＨ／　ＨＯＡ　ｃ　（９０／　１０　／０．４．ｖ／ｖ）　）で精製すると、所望の０−アセチルチロキシンがベージュ色の固体として２１’、９５ｇ（９１％）得られまた。　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（３００Ｍ　Ｈｚ　、Ｄ　Ｍ　Ｓ　ＯＤ　６）δ７．１２〜７．９１　（ｍ、１２Ｈ）、４゜０７〜４．３１　（ｍ、４Ｈ）、３．０７〜３．１９　（ｍ、ＩＨ）　、２．８２　（ｔ、ＩＨ）、２．２９〜２．４０　（ｍ、３Ｍ）；マススペクトル（Ｆ　Ａ　Ｉ３）（Ｍ＋Ｈ）　”　１０４２゜Ｎ−ＦＭＯＣ，Ｏ−アセチルし一チロキシン（２１，７０ｇ。

１９．１７ミリモル）を２５０ｍ１のＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、０℃に冷却し、１９．２０ｇ　（９５，８５ミリモル）の０−ｔ−ブチル−Ｎ、Ｎ“　−ジイソプロピルイソウレア／　ＣＨ２Ｃｌ　２　（５０ｍ　ｌ　）を滴下した。次いで、反応物を窒素雰囲気下、室温で一夜攪拌した後、真空濾過して不溶不純物を除去し、濾液溶媒を真空除去した。得られた残渣を３００ｍ１のＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ　（４０／６０．ｖ／ｖ）中で４時間攪拌し、真空濾過して不溶不純物を除去し、濾液溶媒を真空除去した。

次いで、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：Ｅ　ｔ　ＯＡ　ｃ　／　Ｈｅ　ｘ　（４０／　６０　、ｖ　／　ｖ　）　）で精製すると、所望のｔ− ブチルエステル（２）がベージュ色の固体として９．６４ｇ　（４６％）得られた。　’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ。

ＣＤＣｌ５）　６７．１８−７．８２　（ｍ、１２Ｈ）　、４．２１−４．５７　（ｍ、４Ｈ）、３．０５　（ｓ、２Ｈ）、２．３９（ｓ、３Ｈ）　、１．３３〜１．５４　（ｍ、９ｌ−Ｔ）；’ｖススベクトル（ＦＡＢ）　（Ｍ＋Ｈ）　１０９８゜Ｎ−ＦＭＯＣ，Ｏ−アセテ−トム−チロキシンｔ−ブチルエステル（２）（９，５９ｇ、８．０４ミリモル）を４０ｍ１のＤＭＦに溶解し、１．１２ｍ１　（８，０４ミリモル）のトリエチルアミンを添加し、反応物を窒素雰囲気下で一夜攪拌した。

次いて、１．７８ｍ１　（１６，１ミリモル）のブロモ酢酸エチルを添加した後、さらに１．１２ｍ１　（８，０４ミリモル）のトリエチルアミンを添加し、反応物を窒素雰囲気下でさらに２時間攪拌した後、２００ｍ１の１１２０に注入してＥｔＯＡｃ（３Ｘ２００ｍｌ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を一緒にしてＭｇＳＯ４で脱水し、溶媒を真空除去した。得られた油状物を最初にシリカゲルクロマトグラフィー（溶離液：ＥｔＯＡｃ／　Ｈｅ　ｘ　（４０／　６０　、ｖ　／　ｖ　）　）　テ精製し、次イテ分離用シリカゲルＨＰＬＣ（溶離液：ＥｔＯＡｃ／Ｈｅｘ　（２０／８０゜ｖ／ｖ））で精製すると、所望のＮ−カルボキシメチル　エチルエステル誘導体が白色固体として３．７７ｇ　（４９％）得られた。　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（３００Ｍ　Ｈｚ　、ＣＤ　Ｃｌ　３）δ７．７５（ｓ、２Ｈ）　、７．１９　（ｓ、２Ｈ）　、４．２０　（Ｑ、２ｔ（）、３．３９〜３．４９　（ｍ、３Ｈ）　、２．８（１−２，９８（ｍ。

２Ｈ）　、２．３９　（ｓ、ＪＨ）　、１．４２　（ｓ、９Ｈ）、１．２７　（ｔ、３Ｈ）；マススペクトル　（ＦＡＢＩ（Ｍ＋Ｈ）９６２゜エチルエステル中間体（３，７３ｇ、３；　８８ミリ−モル）を８５ｍ１のＭ　ｅ　ＯＨに溶解し、１２．４ｍｌ　（３１ミリモル）の１０％水酸化ナトリウムを添加し、反応物を４０分間攪拌した。次いで、反応物を２５０ｍ１のＨ２Ｏに注入し、ｐＨをＩＭＭＣＩで４に調整し、ＥｔＯＡｃ　（３Ｘ２５０ｍｌ）で抽出した。ＥｔＯＡｃ抽出物を一緒にしてＭｇ５０４で脱水し、溶媒を真空除去すると、所望の物質（３）が白色固体として３、　２９　ｇ　（９５％）　得うｈｆ：、。　’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ。

ＤＭＳＯ−Ｄ６）６７．８１　（ｓ、２Ｈ）　、７．０７　（ｓ。

２Ｈ）、３．５２　（ｔ、ＬＨ）　、３．３２　（ｓ、２Ｈ）、２．８９〜２．９８　（ｍ、ＩＨ）　、２．２０〜２．３１　（ｍ。

ＩＨ）　、１．３２　（ｓ、９Ｈ）；マススペクトル（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）　８９２゜遊離酸（３）（１，７８ｇ、２．００ミリモル）を２０ｍ１ノＤ　Ｍ　Ｆ　＋、：溶解し、２３０ｍｇ　（２，００−ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、４１３ｍｇ　（２，００ミリモル）の１，３−ジシクロへキシルカルボジイミドを添加し、反威−物を窒素雰囲気下で１“６時間攪拌した。次いで、反応物を真空濾過し、濾液を８８４ｍｇ　（２，００ミリモル）Φ５−アミノメチルフルオレセン臭化−水素酸塩および１．８ｍｌ　（１３ミリモル）のトリエチルアミンと一緒にして、反応物を窒素雰囲気下、暗所で１６時間攪拌した後、溶媒を真空除去した。

残渣を分離用逆相Ｃ，８ＨＰＬＣ（溶離液：　ｌ（２０／　Ｍ　ｅ　ＯＨ／ＨＯＡ　ｃ　（２５／　７５　／　０　、　４　（ｖ　／　ｖ　）　）で精製すると、所望のｔ−ブチルエステルで保護されたトレーサーが橙色の固体として１．５１ｇ（６１％）得られた。’ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＤＭＳＯＤ６）６１０．１３　（ｓ、２Ｈ）、９、２９　（ｓ、　ＩＨ）、８．４３　（ｔ、　ＩＨ）、７．８５　（ｓ。

ＩＨ）　、７．８３　（ｓ、２Ｈ）　、７．６８　（δ、ＩＨ）、７．１２〜７．２８　（ｍ、２Ｈ）　、７．０７　（ｓ、２Ｈ）、６．６８　（ｓ、２Ｈ）、６．５４　（ｓ、４Ｈ）、４．３６〜４．６１　（ｍ、２Ｈ）　、３．２６〜３．５０　（ｍ、３Ｈ）、２、９４〜３．０４　（ｍ、　ＬＨ）　、２．７１〜２．８２　（ｍ。

ＬＨ）　、１．３３　（ｓ、９Ｈ）；マススペクトル（ＦＡＩ３）（Ｍ）　１２３４゜ｔ−ブチルエステルトレーサー（１，４６４ｇ、１．１９ミリモル）を３０ｍ１のＣＨＣ１２／トリフルオロ酢酸（１／１．ｖ／ｖ）に溶解し、５時間攪拌し、溶媒を真空除去した。粗生成物を分離用逆相ＣＨＰＬＣ（溶離液ニド■２０／ＭｅＯＨ／ＨＯＡｃ　（２５／７５１０．４　（ｖ／ｖ））で精製すると、所望のし一チロキシントレーサー（４）が橙色の固体として１．０１ｇ（７２％）得られた。　’ＨＮＭＲ（３００Ｍ　Ｈｚ　、Ｄ　Ｍ　Ｓ　ＯＤ　ｓ　）　δ１０．Ｏ〜１０．３　（ｂｓ。

２Ｈ）　、８．３１　（ｔ、ＩＨ）　、７．８６　（ｓ、２Ｈ）、７．８３　（ｓ、ＩＨ）、７．６４　（ｄ、ＬＨ）、７．１５〜７．３０　（ｍ、２Ｈ）、７．０８　（ｓ、２Ｈ）、６．６８（ｓ、２Ｈ）　、６．５５　（ｓ、４Ｈ）　、４．３１〜４．５９（ｍ、２Ｈ）　、３．２８〜３．５５　（ｍ、３Ｈ）　、２．８２〜２．９９　（ｍ、２Ｈ）；マススペクトル　（ＦＡＢ）（Ｍ＋Ｈ）　＋１１７９゜実施例３抗体の産生免疫感作生理的緩衝食塩水（カタログ番号：＃ＮＤＣｏｏ７−７９８３−０２．本出願人）に実施例１で記載した１、０ｍｇの凍結乾燥免疫原を含むスラリー混合物２ｍｌを、製造者が提供するバイアルに含まれているＭＰＬ＋ＴＤＭアジュバント溶液（カタログ番号：　＃　Ｒ−７００、ＲＩＢＩ　１ｍｍａｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｉｎｃ、、Ｈｌｍｉｌｌｏｎ　ＭＴ　）に添加し、３分間激しく攪拌した。ＢＣＦｌ系マウス（Ｉｚｃｋ＋ｏａ　Ｌｔｂｏ口１ｏ＋ｉξＩ、　Ｂｔ＋　Ｈ１ｒｂｏ＋、ＭｌｉＩｌｅ　）１５匹の各々に、Ｑ、１ｍｌの注射液を与えて、皮下および腹腔内の間に等しく分散させた。この免疫感作を２週間ごとに繰り返して全部で４回追加免疫を行った後、２週間後に血清サンプルを採取した。その血液を室温で２時間インキュベートした後、血清を取り出して、−２０℃以下で保存した。

血清の評価血清試料を市販のＴ４試薬バックを使用してＴＤＩ装置（共に、本出願人製品）によりテストし、ＴＤＸ　Ｔ４試薬パック（カタログコードＮｏ、９７６０８．本出願人）の市販のＴＤｘＴ４トレーサーに結合可能な抗体の量を蛍光偏光測定法で測定した。スクリーニング試験は、市販のＴ４試薬パックのＴ４抗体を市販のＴＤＸ希釈剤（本出願人）で置き換えた他は、市販のＴＤＫ　Ｔ４測定法の取扱説明書に記載のものと本質的に同じであった。テストすへ１血清試料をＴＤＩ試料台のカートリッジの試料用ウェルに加えた。血清試料を、ＴＤＩ試料台の試料用ウェルにおいて、１０ｇ２の希釈度で滴定した。９匹のマウスが市販のＴＤＩＴ４１−レーサーに結合する抗体を産生じた。非免疫感作マウス（カタログ番号：＃５０１１−１３８０゜凍結乾燥した正常マウス血清、Ｃｔｐｐｅｌ、　Ｄａａｌｕｍ、ＮＣ）の滴定した正常マウス血清コントロールよりもＮｅｔＰ（すなわち、正味の偏光）が６０〜８０ｍＰ　（ｒｍＰＪは「ミリ偏光」を示す。）だけ大きい、動物＃１２と指定した１匹の動物を選択した。

鰺童５か月間休息させた後、融合の３日前に、動物＃１２に２５μｇ／ｍｌの前融合ブースターを静脈内投与した。融合の日に、その動物を層殺し、牌臓細胞をｌ５ｃｏｖｅの改良ダルベツコ培地（Ｉ　ＭＤＭ）　（Ｇ　Ｉ　Ｂ　Ｃｏ、Ｇａｔｅｄ　Ｉ＋ｈｅｄ、Ｎｅｗ　Ｙｏｌｋ）中で１回洗浄し、１１０００ｒｐで１０分間遠心分離にかけた。ペレット状の牌臓細胞を５Ｐ２１０ミエローマ細胞（ＤｒＭｉｌ＋１ｅｉｎ研究室からの提供、Ｃｔｍｂ＋１ｄ（ｅ、　Ｕａｉｌ＜ｄ　Ｗｉｓｄｏｍ）と１・３の比で合わせ、ＩＭＤＭ中で洗浄して遠心分離にかけた。

上清を除き、ペレットを、とんとん叩いて渦を巻がせることにより静かに分散させながら、１ｍｌの５０％ＰＥＧ−（ポリエチレングリコール）（＾ｓ！ｒ−ｉｃ＊ｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃｓ１１ｍ＋ｅ　Ｃｏ１１！−ｃｌｉｏａ。

Ｒｏｃｋｗｉｌｌｅ、　ＭＩＢＩ＊Ｉｌｄ　）をベーレットに１分間添加した。

３０ｍ１のＩＭＤＭをその混合物に添加し、前述したように遠心分離にかけた。

上清をデカントし、ペレットをＨＡＴ　（ヒボキサンチン　アミノプテリン　チミジン）（ＧＩＢＣＯ）、１０％ＦＢＳ　（牛胎児血清）　（ｌ１７ｃｌｏ＠ｅ、　Ｌｏｌ■、υ１ｔｈ）および１％Ｓ　ＴＭ　ｖ　／　ｖ　（ＲＩ　Ｂ　Ｉ　ｌｓｍｗｎｏｃｈｅｍ　Ｒｅｔｔｓｒｃｋ、　ｌｌＩＣ，）とともにＩＭＤＭに再懸濁した。ＳＴＭは、Ｓ＊１ｍｏａｅｌｌｓ１７ｐｂｉｓａ＋ｉｓｍ　ミトゲンを示す。３７Ｍ溶液をＢ−細胞ミトゲンとして添加した。融合細胞懸濁物を９６ウエルの細胞培養プレートにブレーティングした。

第一融合スクリーニング融合の第一スクリーニングは、集密的培養の１２２日目行った。ＳｃｒｅｅＩＩＭ＊ｃｈｉｎｔ　（Ｉ　Ｄ　Ｅ　Ｘ　Ｘ、　Ｐｏ＋Ｉｌ■ｄ、　Ｍｏ１ｆｉりによる蛍光濃縮粒子イムノアッセイ（ＦＣＰＩＡ）では、ヤギ抗マウスミクロ粒子を使用して、上清のハイブリッドから分泌されるマウス抗体を捕獲する。市販のＡｂｂｏｌｌ　Ｔ　４　トレーサー（ＴＤ！Ｔ４測定法試薬バック、本出願人）を添加して１４反応性（すなわち、Ｔ４に結合する）抗体を同定した。ハイブリッド＃１−１８９の相対的蛍光強度は、負のコントロール（カタログ番号・＃５０１１−１３８０．乾燥凍結した正常なマウス血清、ＣＪｐｐｅｌ、　Ｄ＊ｎｈｉｍ、　ＮＣ）の３倍であり、さらに評価してクローニングするための候補として選択した。

ハイブリッドクローニングハイブリッド＃１−１８９を９６ウエルの融合プレートから限界希釈法（１−１００でスタート、１０倍豐っ１０６まで）により直接クローン化した。使用したクローン用培地は、１゜％ｖ　／　ｖ　Ｆ　Ｂ　Ｓおよび１％ｖ／ｖＨＴ（ヒボキサンチンチミジン）　５ｎｐｐｌｅｓｓｉ　（Ｇ　！　Ｂ　ＣＯ）を有するＩＭＤＭであった。

１００μｌの細胞懸濁物を細胞培養プレートの９６ウエルの各々に添加した。７日目にプレートに２００μｍ／ウェルのクローン用培地を供給した。

クローンの選択上記の「血清の評価」の項の改良ＴＤｘ　Ｔ４スクリーンに基づいてクローンＴ４　１−１８９−２５２を選択し、さらに評価した。Ｔ４試薬パックのポリクローナル抗血清を市販のＴＤｒ希釈剤（本出願人）で置き換えた。クローン上清をＴＤＩ試料台のカートリッジの試料ウェルに添加した。ＴＤｘカートリッジの前希釈ウェルには、０および２４μｇ／ｄｉの遊離Ｔ４を重複して入れた。ＴＤＩＴ４　Ｐｌｕｓ測定法（以前に本出願人から市販されたＴＤ！装置用の測定法：この測定法は、血清または血漿試料中の全循環Ｔ４を測定する）を行い（以前に市販されたＴＤＩＴ４　ＰＩＬＩ９１１Ｍ定法の取扱説明書の記載に従う）、偏光の減少を示したモノクローナル抗体試料を選択してさらに評価した。偏光の減少は、試料中のＴ４がモノクローナル抗体の７４−Ｆ　ＩＴＣと競合して置き代わることに基づ（。この実験に対しては、その取扱説明書に従って行われる現在市販のＴＤｘＴ４測定法（本出願人；この測定法も、血清または血漿試料中の全循環Ｔ４を測定する）をＴＤＩ　Ｔ４Ｐｌｕｓ測定法の代わりに使用することができた。ＴＤｘＴ４　Ｐｌｕｓ測定法で使用されるポリクローナル抗体およびトレーサーは、ＴＤ！Ｔ４測定法で使用されるものと同じである。

同位体Ｔ４　１−１８９−２５２として同定される細胞系から分泌されるモノクローナル抗東の同位体をＥＩＡ　ｃｌｏｎｏｔｙｐｉｎｇキット（５ｏｕｔｈｅｒｎ　Ｂｉｏｌｅｅｂ、Ｂｉ＋ｍｉＢｌｕｍ、Ａりで測定した。その分析は、販売者の指示に従って行い、結果は１ｇ０２ａ、にの同位体を示した。

等電点電気泳動Ｔ４　１−１８９−２５２として同定される細胞系から分泌されるモノクローナル抗体の等電点（ｐ　ｒ）を等電点電気泳動装［（Ｂｉｏ　Ｒｒｄ、Ｒｉｅｈｍｏａｄ、　Ｃ＾）により測定する。ゲルの注入および実行は販売者の指示に従った。結果は、ｐＩ＝７．４±０．２を示した。

細胞系の寄託ハイブリドーマ細胞系Ｔ４　１−１８９−２５２は、ブタペスト条約に従ってＡ　Ｔ　ＣＣ（１２３０１Ｐｚ＋ｋ１ｇｖｎ　Ｄ＋ｉｙｅ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｃ、　ＭＤ　２Ｇ８５２．１１．ｓ、Ａ、　）に寄託されている。寄託日は、１９９２年９月１６日であり、その細胞系のＡＴＣＣ番号はＨＢ１１１２５である。このハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体を、本明細書ではモノクローナル抗体１−１８９−２５２とする。

実施、−例４チロキシンの蛍光偏光イムノアッセイ一部の人の血清試料に匹在する抗体は、市販のＴＤＩ、ＴＤＩ　ＦＬ！　’“およびｒＭｘ測定法において全Ｔ４の示度を不当に低くする。これらの同じ試料をＲＩＡ法で評価すると、臨床的診断と一致する値が得られる。これらの血清試料の評価は、市販の＾ｂ’ｂｏＮ’　Ｔ　４　トレーサーに対する親和力が高い結合因子である免疫グロブリンが存在することを示した。これは、偏光の保持力を増加してミリ偏光単位（ｍＰ）の高い値を生じることになり、従ってＴ４値が低くなる。

本発明では、実施例２のトレーサーおよびモノクローナル抗体１−１８９−２５２を、市販の＾ｂｂｏｌｌＴ４ＦＰＩＡと同様に効果を発揮するように最適化すると、この新規測定法が、上記の矛盾した示度を回避するという点でさらに有利であることが見出された。その新規測定法は、市販の測定法で使用されるのと同じ標準手順および希釈剤を使用する。測定結果は、ミリ偏光単位（ｍＰ）で報告される。このｍＰ単位は、記憶されている標準検量線と自動的に対比され、分析試料中のチロキシンの濃度（μｇ／ｄｌ）として表される。この方法は、市販の＾ｂｂｏｌｌ試薬と新規トレーサーおよびモノクローナル抗体との両方で同じである。

例えば、ＴＤＩの新しいＴ４測定法では、試料を標準手順に従ってＴＤｘ分析器にかけた。ＴＤＩの新しいＴ４測定法の効果は、３７３人の血清試料を使用して、市販のＴＤＩ　Ｔ４測定法と比較することにより評価した。Ｔ４を検出する二つの測定法の間には好ましい一致が得られた。新規測定法では、試料中００〜２４μｇ／ｄ　Ｉの範囲のチロキシンを検出することができた。２４μｇ／ｄ　ｌより大きい濃度のチロキシンを含む試料は、最初に、例えば市販のＴＤＩ　Ｔ４測定法の販売者の指示に従って希釈すべきである。

さらに、ＴＤＩ　、ＴＤｔ　ＦＬｘ　”およびＩＭＩの新しいＴ４測定法の場合、標準検量線の最小偏光範囲は少な（とも１００ｍＰが好ましく、より好ましくは１２５ｍＰまたは１３０ｍＰ以上である。市販の測定法は同様の偏光範囲を有する。その範囲の上限は好ましくは３００ｍＰ未満である。所望の範囲を達成するためには、その測定法のトレーサーが使用抗体に結合しなければならず、また、試料に内在するＴ４と効果的に競合しなければならない。

さらに、Ｔ４標準検量線の偏光範囲の中央に対応するＴ４とトリョードチロニン（Ｔ３）との濃度の比を測定することにより、ＴＤＩの新規Ｔ４測定法におけるモノクローナル抗体１−１８９−２５２とＴ３との交差反応性が約８％であることが確認された。交差反応性がそのように低いことは重要である。

Ｔ３がヒト血清中に存在する、Ｔ４に似た別の甲状腺ホルモンであるかζである。従って、Ｔ４の正確な測定には、Ｔ４に対する抗体がＴ３と実質的に交差反応しないことが重要である。

すなわち、そのような交差反応は約１５％以下が好ましく、より好ましくは約１０％以下である。

市販のＴ４トレーサーおよび抗体を本発明のものと比較するために、市販の＾ｂｂｏｔｌ　Ｔ　Ｄ　！　Ｔ　４測定法の標準手順を使用し、１）市販のＴＤ！Ｔ４トレーサーおよび抗体、２）市販のＴＤＩ　Ｔ４　トレーサー、および、抗体は市販のものに代えてモノクローナル抗体１−１８９−２５２．３）市販のＴＤＩＴ４抗体およびトレーサーに代えて、モノクローナル抗体１−１８９−２５２および実施例２のトレーサー、を使用して、いくつかの異なる矛盾する試料を測定した。これらの試料は、その販売者の勧める手順にトて、＾ｂｂｏｌｌ　Ｔｓｌ＋ｔｂｔ＊ｄ−１２５ラジオイムノアッセイ（Ｔ４ＲＩＡ、本出願人）にもかけて測定した。

ＴＤｔ測定法に関する情報は、ＴＤＩシステム操作マニュアルに記載しである。

ＴＤｘシステム操作マニュアルは、１）操作理論：蛍光偏光イムノアッセイ、２）操作上の注意および限界、３）毎日の始動操作、４）維持すべき品質管理に必要な毎月および定期的な操作を含む。非定形試料は、市販のＴＤＩ　Ｔ４測定法ではチロキシン濃度が０または異常に低いが、Ｔ４ＲＩＡ測定法ではより高レベルのチロキシン濃度を示す試料を患者から採取した。

上記測定結果は以下の通りである。

表　１Ｔ４（μｇ／ｃｌ）ＴＯ１丁↓測定法　丁Ｄｘ　Ｔ４測定法ＴＤ！　Ｔ４測定法　１１ＡＢＩ−１８９−２５２ＭＡＲＩ−１８９−２５２Ｒ１＾　市販試薬　及びτ４トレード　及び実施例２４Ｔ４非定形試料１１．９７　Ｇ、　０　９．８０１０、２６２　０．０　Ｇ、０　６．７８　７．０２３　２．２１　０．０　６．１７　６．４１４　＋、０４　７．９７　９ｊ９５　０．０　０．０　？、０３　１１．２３６　Ｇ、０　０．０　５．３４　４．６３７　０．０　０．０　１２．７５＋５．９５８　Ｃｏ　１０　ｇ、ＨＩＱ、１Ｇ９　２．６５　２．２４　ＬＤ３　Ｂ、１８１０　０．０　Ｇ、０　１５．ａ５１５．４３＋１　３．３１　０．８９　７．０　８．７１１２　２．３７　０．０　ｇ、５？１０、０５上記結果は、Ｔ４ＲＩＡ結果と比較して、予想範囲内のＴ４値を与える新規トレーサー（第：Ｎｌ）の有効性を示す。

本発明のトレーサーおよび抗体はまた、Ｉ　’Ｍ　ＩおよびＴＤＩＦＬｌ”Ｔ４測定法にも使用することができる。

トレーサーが非定形試料の不当に低いＴ４値の原因であるかどうかを決定するために、次の測定を行った。市販のＴＤｘ試薬パックは、「Ｓ」、ｒＴＪおよびｒＰＪボットと記した３本の試薬瓶を含む。ＳボットはＴ４抗体を含む。Ｔポットは市販のＴ４トレーサーＴ４−Ｆ　ＩＴＣを含む。Ｐボットは、測定するチロキシンを遊離するために蛋白質結合チロキシンから蛋白質を脱離したＴ４前処理溶液を含む。市販の測定法を次のようにして行ったが、通常はＴ４抗体を含むＳボットを緩衝液で置き換えた。最初に、非定形血清試料（表１の試料の一つ）および正常な血清試料をテストし、その結果を表２に示す。表２に示したように、その分析法では、非定形試料に対して高いｍＰ値が得られた。これに対して、正常な試料のｍＰ値はかなり低かった。

表　２市販の７４トレーサを使用し、丁４抗体は存在させな０場合のｍＰ値試料　ｍＰ値非定形試料　２Ｎ、　＋３正常血清　１０５．９２次いで、上述の測定法（Ｓボットは抗体の代わりに緩衝液を含む。）を表１で使用したものと同じ矛盾試料に対して行（１、その結果を下記表３に示す。１回は市販のトレーサーを使用して測定を行い、１回は実施例２のトレーサーを使用して行った。

実施例２のトレーサーの場合にｍＰの減少が認められた。これは、非定形試料に内在する免疫グロブリンが実施例２のトレーサーに結合しないことを示す。

表　３市販のトレーサーおよび実施例２のトレーサーによる内在免疫プロプリンの結合（ｍＰ値）非定形試料　市販のトレーサー　実施例２のトレーサー１　２３４．５５　９５．３４２　２２５．７９　９９．８８３　１９９．０５　９６．７Ｂ４　２３２．７６　９６．１６５　２１３．２６　９６．０１６　１７６．０４　１０４．４４７　２７６．６３　１０８．８９８　３９７．７４　１０３．３０９　１９５．６４　１００．２１１０　２８２．７１　８４．１５１１　１９５．２５　９７．５５１２　２３０．４８　１１５．７７上述したように、これらの非定形血清試料の評価は、存在する結合因子が市販のＴ４トレーサーに対して親和性を有する免疫グロブリンであることを一示した。

測定は、下記のＨ，−ＰＬＣ。

免疫プロット分析および蛋白質Ｇセファロース分離によっテ行った。

ＨＰＬＣでは、非定形試料に存在する蛋白質を、陰イオン交換カラムを使用するＨ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより分離した。Ｔ４１−レーサーに対する結合力を有する両分を単離した。これらの両分は、クロマトグラフィーでＩｇＧが溶離する領域に対応する。

さらに、選択した両分の免疫プロット分析は、ヤギ抗ヒトＴｇＧで検出されるヒトＩｇＧに対応するバンドを示した。

次いで、これらの選択画分を蛋白質Ｇセファロースとともにインキュベートした。蛋白質Ｇセファロースは、ＩｇＧに選択的に結合する。遠心分離により蛋白質Ｇセファロースを脱離した後の上清の分析により、Ｔ４結合成分はもはや存在しないことが示された。

本発明のトレーサーおよび抗体を使用する測定法は、ＴＤＩ、ＴＤＩＦＬＩ”およびＩＭ！以外の他のＦＰＩＡ装置に対しても行うことができることは当業者であれば明らかである。検出可能なチロキシンの範囲および濃度などのパラメータは、使用する各装置の感度などの特徴に従って最適化される。

本発明を明確にし、理解するために、説明および実施例によって詳細に記載したが、当業者の範囲内での種々の改良および変更は本発明の請求の範囲内であると考えられる。ここに示した基本的発明の自明の変化を可能にする将来の技術的進歩も本発明の請求の範囲内である。

図面の簡単な説明図１は、本発明の合成方法によりＬ−チロキシンを牛血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ）に結合することによる本発明の免疫原の合成工程を示す。

図２は、本発明の合成方法による本発明の蛍光トレーサーの合成工程を示す。

ＦＩＧ、１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，６識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１６／２６　８３１８−４ＨＧＯＩＮ　３３１５４２　Ａ　７０５５−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ）、ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　マテイングリイ・フィリップ・ジ−アメリカ合衆国、イリノイ・６００３０、グレイズレイク、シーツエラー・ドライブ・Ｉ− （７２）発明者　クラリツセ、ダイアナ・イーアメリカ合衆国、イリノイ・６０６６４、ネパーピル、ウイルデン・レーン・１４０・サウス・１０（７２）発明者　タイナー、ジョアン・ディーアメリカ合衆国、イリノイ・６００８７、ビーチ・パーク、ノース・オーチャード・ロード・３７８３５（７２）発明者　ベルコビツツ、メリー・エムアメリカ合衆国、イリノイ・６００４７・レイク・ズーリツク、ベテイー・ドライブ・

Claims

【特許請求の範囲】

（１）テスト試料中のチロキシンを定量するための競合的免疫測定法において、下記工程：（ａ）テスト試料を、チロキシンおよび下記式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは結合部分である。］の標識化試薬に結合可能な抗体を含む抗体試薬と接触させる工程、および（ｂ）反応溶液中の該抗体と結合した標識化試薬の量をテスト試料中のチロキシンの量の関数として測定する工程を含むことを特徴とする方法。
（２）Ｗが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項１に記載の方法。
（３）ヘテロ原子が、窒素、酸素、硫黄およびリンから成る群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
（４）検出可能な部分が、酸素、発色団、蛍光性分子、化学発光性分子、燐光性分子および発光性分子から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
（５）抗体を、下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、（ａ）Ｐは免疫原担体物質であり、Ｘは第二結合部分であり、（ｂ）Ｐのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の化合物から得られる免疫原により産生することを特徴とする請求項１に記載の方法。
（６）Ｘが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項５に記載の方法。
（７）Ｗが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項６に記載の方法。
（８）免疫原担体物質が牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ｋｅｙｈｏｌｅ　ｌｉｍｐｅｔヘモシアニンおよびチログロブリンから成る群から選択されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
（９）免疫測定法が蛍光偏光イムノアッセイであり、標識化試薬の検出可能な部分が蛍光性部分であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
（１０）Ｗが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項９に記載の方法。
（１１）抗体を、下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、（ａ）Ｐは免疫原担体物質であり、（ｂ）Ｘは第二結合部分であり、（ｃ）Ｐのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の免疫原により産生することを特徴とする請求項９に記載の方法。
（１２）Ｘが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり・２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
（１３）Ｗが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせて配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあるこどを特徴とする請求項１２に記載の方法。
（１４）免疫原担体物質が牛血清アルブミン、ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔヘモシアニンおよびチログロブリンから成る群がら選択されることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
（１５）標識化試薬の量を、（ａ）平面偏光を反応溶液に通して蛍光偏光応答を生じさせ、（ｂ）該反応溶液の蛍光偏光応答をテスト試料中のチロキシンの関数として検出する、ことにより測定することを特徴とする請求項９に記載の方法。
（１６）蛍光性分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセンおよびメトキシトリアジノリルーアミノフルオレセンから成る群から選択されることを特徴とする請求項９に記載の方法。
（１７）イムノアッセイの結果をミリ偏光単位（ｍＰ）で表し、このｍＰ単位を標準検量線と対比して試料中のチロキシン濃度として表し、標準検量線の最小偏光範囲が少なくとも１００ｍＰであることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
（１８）イムノアッセイにより試料中の０〜２４ｍｇ／ｄｌのチロキシンが検出可能であることを特徴とする請求項１５に記載の方法。
（１９）抗体と試料中のトリヨードチロニンとの交差反応が約１５％以下であり、標識化試薬が試料中の内在性免疫グロブリンＧと結合しないことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
（２０）イムノァッセイの結果をミリ偏光単位（ｍＰ）で表し、このｍＰ単位を標準検量線と対比して試料中のチロキシン濃度として表し、標準検量線の最小偏光範囲が少なくとも１００ｍＰであり、試料中の０〜２４ｍｇ／ｄｌのチロキシンが検出可能であることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
（２１）標識化試薬が下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ であり、抗体が下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＢＳＡは牛血清アルブミンを示し、ＢＳＡのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の免疫源により得られることを特徴とする請求項１に記載の方法。
（２２）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、（ａ）Ｐは免疫原担体物質であり、（ｂ）Ｘは結合部分であり、（ｃ）Ｐのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の免疫原により産生される抗体。
（２３）Ｘが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２値までであり、２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項２２に記載の抗体。
（２４）免疫原担体物質が牛血清アルブミン、ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔヘモシアニンおよびチログロブリンから成る群がら選択されることを特徴とする請求項２３に記載の抗体。
（２５）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＢＳＡは牛血清アルブミンを示し、ＢＳＡのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の免疫原により得られる抗体。
（２６）チロキシンおよびトレーサーの両方に結合可能な抗体であって、トレーサーとの結合が気競合的にチロキシンと置き代わることが可能であり、該トレーサーが下記式：▲数式、化学式、表等があります▼ を有し、該抗体がチロキシンの蛍光偏光測定法において該トレーサーとともに使用することができる抗体。
（２７）さらに、抗体とトリヨードチロニンとの交差反応性が１５％未満であることを特徴とする請求項２６に記載の抗体。
（２８）チロキシンがＬ−チロキシンであり、式で示した化合物がＬ−異性体であることを特徴とする請求項２６に記載の抗体。
（２９）モノクローナル抗体１−１８９−２５２。
（３０）ＡＴＣＣ寄託番号がＨＢ１１１２５である細胞系。
（３１）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｑは検出可能な部分であり、Ｗは結合部分である。］の標識化試薬。
（３２）Ｗが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項３１に記載の標識化試薬。
（３３）検出可能な部分が、酵素、発色団、蛍光性分子、化学発光性分子、燐光性分子および発光性分子から成る群から選択されることを特徴とする請求項３１に記載の標識化試薬。
（３４）蛍光性分子が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセンおよびメトキシトリアジノリルーアミノフルオレセンから成る群から選択されることを特徴とする請求項３３に記載の標識化試薬。
（３５）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の標識化試薬。
（３６）請求項３５に記載の標識化試薬のＬ−異性体。
（３７）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、（ａ）Ｐは免疫原担体物質であり、（ｂ）Ｘは結合部分であり、（ｃ）Ｐのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の免疫原。
（３８）Ｘが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項３７に記載の免疫原。
（３９）免疫原担体物質が牛血清アルブミン、ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔヘモシアニンおよびチログロブリンから成る群がら選択されることを特徴とする請求項３７に記載の免疫原。
（４０）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＢＳＡは牛血清アルブミンを示し、ＢＳＡのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の免疫原。
（４１）ＢＳＡのチロキシン誘導体による置換度が１０〜９５％であることを特徴とする請求項４０に記載の免疫原。
（４２）請求項４０に記載の免疫原のＬ−異性体。
（４３）テスト試料中のチロキシンを定量化するためのテストキットであって、該テストキットが、（ａ）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｑは検出可能な部分であり、Ｗは結合部分である。］の標識化試薬および（ｂ）テスト試料中のチロキシンおよび標識化試薬に結合可能な抗体を含む抗体試薬を含むことを特徴とするテストキット。
（４４）Ｗが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項４３に記載のテストキット。
（４５）Ｑが蛍光性部分であることを特徴とする請求項４３に記載のテストキット。
（４６）蛍光性部分が、アミノメチルフルオレセン、アミノフルオレセン、５− カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフルオレセン、チオウレアフルオレセンおよびメトキシトリァジノリルーアミノフルオレセンから成る群から選択されることを特徴とする請求項４５に記載のテストキット。
（４７）抗体が、下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、（ａ）Ｐは免疫原担体物質であり、（ｂ）Ｘは結合部分であり、（ｃ）Ｐのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］のチロキシン誘導体から得られる免疫原により産生されることを特徴とする請求項４３に記載のテストキット。
（４８）Ｘが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項４７に記載のテストキット。
（４９）免疫原担体物質が牛血清アルブミン、ｋｅｙｈｏｌｅｌｉｍｐｅｔヘモシアニンおよびチログロブリンから成る群がら選択されることを特徴とする請求項４７に記載のテストキット。
（５０）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｑは検出可能な部分であり、Ｗは結合部分である。］を有する標識化試薬であって、該標識化試薬はチロキシンに対する抗体と結合することができるが、その抗体との結合はＬ−チロキシンと競合的に置き代わることができ、また、血清試料の内在性ＩｇＧとは結合できない標識化試薬。
（５１）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｐは免疫原担体物質であり、Ｘは結合部分であり、Ｐのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の免疫源の製造性において、該方法が下記工程：ａ）Ｌ−チロキシンをＮ−アセチル化してα−Ｎ−アセチルーＬ−チロキシンを生成する工程、ｂ）α−Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシンを二官能性リンカーと結合させてチロキシン誘導体を生成する工程、およびｃ）チロキシン誘導体を免疫原担体物質に結合する工程を含むことを特徴とする方法。
（５２）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、ＢＳＡは牛血清アルブミンを示し、牛血清アルブミンのチロキシン誘導体による置換度は１〜１００％である。］の免疫原の製造法において、該方法が下記工程：ａ）Ｌ−チロキシンをＮ−アセチル化してα−Ｎ−アセチルーＬ−チロキシンを生成する工程、ｂ）α−Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシンを６−アミノカブロン酸と結合させてチロキシン抱合体を生成する工程、およびｃ）工程ｂ）のチロキシン抱合体を牛血清アルブミンに結合する工程を含むことを特徴とする方法。
（５３）チロキシンを出発物質とする、下記式：▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｑは検出可能な部分であり、Ｗは結合部分である。］の標識化試薬の製造法において、該方法が下記工程：ａ）チロキシンのカルボン酸、α−アミノ基およびフェノール基を個別に保護する工程、およびｂ）チロキシン誘導体のα−アミノ基の保護基を選択的に脱離する工程、およびｃ）チロキシン誘導体のα−アミノ基を選択的にカルボァルコキシメチル化する工程、次いで、ｄ）チロキシン誘導体のα−Ｎ−カルボキシメチル基およびフェノール基の保護基を選択的に脱離する工程、次いで、ｅ）チロキシン誘導体のα−Ｎ−カルボキシメチル基を活性化する工程、次いで、ｆ）チロキシン誘導体の活性化したα−Ｎ−カルボキシメチル基を二官能性結合部分と結合する工程、次いで、ｇ）チロキシン誘導体を検出可能な部分と結合する工程、ならびに最後に、ｈ）該標識化試薬のカルボン酸基の保護基を脱離する工程を含むことを特徴とする方法。
（５４）Ｗが直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜５０個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は１０個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあることを特徴とする請求項５３に記載の方法。
（５５）チロキシンがＬ−体であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
（５６）下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の標識化試薬の製造法において、該方法が下記工程：（ａ）（ｉ）チロキシンのナトリウム塩を塩化９−フルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ−Ｃｌ）と反応させてアミノ基を保護した後、（ｉｉ）得られたチロキシン誘導体のフェノール官能基をアセチル化により保護し、次いで（ｉｉｉ）Ｎ−ＦＭＯＣ−Ｏ−アセチル−チロキシンのカルボキシル基を保護してｔ−ブチルエステルとする工程、（ｂ）ＦＭＯＣ保護基を脱離してｔ−ブチル−Ｏ−アセチルチロキシンとする工程、次いで、（ｃ）ｔ−ブチル−Ｏ−アセチル−チロキシンのアミノ基をブロモ酢酸エチルエステルでアルキル化してｔ−ブチル−Ｏ−アセチル−Ｎ−カルボエトキシメチルチロキシンとする工程、次いで、（ｄ）ｔ−ブチル−Ｏ−アセチル−Ｎ−カルボエトキシメチルチロキシンのエチルエステル基およびアセチル基を水酸化ナトリウム／メタノールで加水分解し、同じ工程でｔ−ブチル　Ｎ−カルボキシメチル−チロキシンを得る工程、（ｅ）ｔ−ブチル　Ｎ−カルボキシメチル−チロキシンをジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化する工程、次いで、（ｆ）チロキシン誘導体を５−アミノメチルフルオレセンと反応させてｔ−ブチル　Ｎ−（５−カルボキサミドメチルフルオレセニルメチル）チロキシンとする工程、次いで、（ｇ）ｔ−ブチルエステルをトリフルオロ酢酸により加水分解して標識化試薬を得る工程を含むことを特徴とする方法。