JPS59211861A - オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 - Google Patents
オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法Info
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- JPS59211861A JPS59211861A JP8715783A JP8715783A JPS59211861A JP S59211861 A JPS59211861 A JP S59211861A JP 8715783 A JP8715783 A JP 8715783A JP 8715783 A JP8715783 A JP 8715783A JP S59211861 A JPS59211861 A JP S59211861A
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- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ド垂体ホルモンであるオキシトシンの酵素免
疫測定法lこよる測定を目的♂する酵素標識オキシトシ
ンの製造法に関する。
疫測定法lこよる測定を目的♂する酵素標識オキシトシ
ンの製造法に関する。
オキシトシンは膨下垂体より分泌される平滑筋収縮作用
を有するホルモンであって妊娠、分娩時および授乳時に
血中レベルの上昇がみられるアミノ酸9個からなるペプ
チドホルモンである。
を有するホルモンであって妊娠、分娩時および授乳時に
血中レベルの上昇がみられるアミノ酸9個からなるペプ
チドホルモンである。
ペプチドホルモンの測定方法としては、生物学的測定法
と免疫化学的測定法が用いられるが、後者がその簡便さ
のために望ましい方法である。
と免疫化学的測定法が用いられるが、後者がその簡便さ
のために望ましい方法である。
オキソしシンの如き低分子量ペプチドホルモンに対する
免疫化学的測定法としては、そのホルモンをウシ血清ア
ルブミン等と結合せしめたものを抗原として動物に免疫
して作製した抗体に対して、あらかじめ用意された既知
量の標識ペプチドホルモンと検体中のペプチドホルモン
を競合的に反応せしめた後、木結合の標識ペプチドホル
モンと抗体と結合した標識ペプチドホルモンを分離し、
抗体と結合し1こ標識ペプチドホルモンの垣を測定する
いわゆる競合反応法が用いられる。
免疫化学的測定法としては、そのホルモンをウシ血清ア
ルブミン等と結合せしめたものを抗原として動物に免疫
して作製した抗体に対して、あらかじめ用意された既知
量の標識ペプチドホルモンと検体中のペプチドホルモン
を競合的に反応せしめた後、木結合の標識ペプチドホル
モンと抗体と結合した標識ペプチドホルモンを分離し、
抗体と結合し1こ標識ペプチドホルモンの垣を測定する
いわゆる競合反応法が用いられる。
1rでにオキシトシンに対[7ても、標識ヘフチ!2ミ
ドホルモンとして Lの如き放射性同位元素(以下1
’−It I Jという)による標識体を使用するラジ
オイムノアッセイ法(以下1− IL I A法」とい
う)が開発され利用されてきた。〔大板ら、日本内分泌
学会誌52.941〜949(1981))しかしなか
らこのRI A法はRIの使用に起因する種々の大きな
欠点を有する。例えば放射線にまる人体障害の危険性、
放射能の拡散防止のための特殊な施設を要すること、R
Iの半減期が短いことから保存期聞か限定される等の欠
点である。
’−It I Jという)による標識体を使用するラジ
オイムノアッセイ法(以下1− IL I A法」とい
う)が開発され利用されてきた。〔大板ら、日本内分泌
学会誌52.941〜949(1981))しかしなか
らこのRI A法はRIの使用に起因する種々の大きな
欠点を有する。例えば放射線にまる人体障害の危険性、
放射能の拡散防止のための特殊な施設を要すること、R
Iの半減期が短いことから保存期聞か限定される等の欠
点である。
これらの几11L法のもつ欠点を解決するfこめに酵斯
を標識物質とした醋素免&副定法(以下「15IA注」
という)か開発され、RIA法と向等の50度を得る1
こめ柚々の物質の測定に対して多くの試みが行なわれて
いる。しかるに本発明の目的でJ〕るオキシトシンの測
定においてはEiA法による測定は報告されておらず、
RIA法にかわってEiA法により測定可能とすること
はそのもたらす利益は大きく臨床家に強く要望されてい
るところである。
を標識物質とした醋素免&副定法(以下「15IA注」
という)か開発され、RIA法と向等の50度を得る1
こめ柚々の物質の測定に対して多くの試みが行なわれて
いる。しかるに本発明の目的でJ〕るオキシトシンの測
定においてはEiA法による測定は報告されておらず、
RIA法にかわってEiA法により測定可能とすること
はそのもたらす利益は大きく臨床家に強く要望されてい
るところである。
ところでこのE I A法による測定法を確立するため
の技術的な問題点の一つは酵素標識法である。オキシト
シンの如き抗原を競合反応法でEIA法lζよる測定を
行なうには、測定すべき抗原と同等の抗体結合性を有し
、かつ十分な酵素活性を自回゛るI#素標識抗原を製造
する技術が重要である。
の技術的な問題点の一つは酵素標識法である。オキシト
シンの如き抗原を競合反応法でEIA法lζよる測定を
行なうには、測定すべき抗原と同等の抗体結合性を有し
、かつ十分な酵素活性を自回゛るI#素標識抗原を製造
する技術が重要である。
このtこめ抗原と6を素を結合させるための種々の化学
結合剤が検討されてきた。「エンザイムイムノアッセイ
J (Enzyme Imtnunoassay 、
1981 。
結合剤が検討されてきた。「エンザイムイムノアッセイ
J (Enzyme Imtnunoassay 、
1981 。
1GakuL−8hotn ) (II) 54頁〜1
05頁に、種々の物質に対して酵素標識を行なうための
化学結合剤の例が記載されている。高感度の6iU疋を
行なうためには、標識酵素として、β−D−ガラクトシ
ダーゼ(以下「β−〇allという)が望まし、いこと
が知られでいる。β−(iajは酵素活性に関与しない
チオール基を有する。したがってこのβ−Ualのチオ
ール基と抗原側のアミノ基を利用して、結合可能な化学
結合剤を介して、β−Galと抗原とを結合させZlの
が一般的である。特に”7 L−イミド基を有するカル
ホン酸のN−ハイドロキンサクシンイミドエステル体カ
望ま(〕いことが多くの文献に記載されてい乙。
05頁に、種々の物質に対して酵素標識を行なうための
化学結合剤の例が記載されている。高感度の6iU疋を
行なうためには、標識酵素として、β−D−ガラクトシ
ダーゼ(以下「β−〇allという)が望まし、いこと
が知られでいる。β−(iajは酵素活性に関与しない
チオール基を有する。したがってこのβ−Ualのチオ
ール基と抗原側のアミノ基を利用して、結合可能な化学
結合剤を介して、β−Galと抗原とを結合させZlの
が一般的である。特に”7 L−イミド基を有するカル
ホン酸のN−ハイドロキンサクシンイミドエステル体カ
望ま(〕いことが多くの文献に記載されてい乙。
ペプチドホルモンのいくつかについても、マレイミド基
を有するカルボン酸のへ−ハイドロキシ−リフシンイミ
ドエステルを化学結合剤としてβ−Gum標識ペプチド
ホルモンを製造し、これを用いたEiA法での測定がす
でlこ知られている。例えば、アミノ酸10個からなる
ペプチドホルモンであるアンギオテンシン■のEIA法
での測定の例か’+2iJ出の「エンサイムイムノアツ
セイJ (Enzyme 1nunu++5asoay
) l 63 @ ニ記載さオtている。この方法に
よるとアンギオテンシン■とβ−C))l Iとの結合
において、化学結合剤としてN −(メクーマしノイミ
ドベンゾイロキシ)ゆクンンイミド(以下i st B
S Jといつ)カ使用さIしている、1r4られたβ
−Ga1g識アノギオテノノノ1を用いζアノギオテ゛
ノシン1の競合反応法による1“:■、〜測定が行なK
)れ、it I A法と同等の感度がf’Uられfコと
ノ小べCいる。特開昭56−10647号公報にはオキ
ソトレンを含むド垂体ホルモンの競合ii !、J法に
まるEIA法での測定法に関する記載があり、β−(j
alを標識酵素としj、= IJ−Gal標識1Z垂体
ホル七ンの製造法についでこτ及している。この中でも
化学結合剤さしてマレイミド基を含む芳香族あるいは脂
環式カルボン酸のN−ハイドロキシサクシンイミドエス
テル体例えばMBSあるいはN −(4−カルボキシシ
クロへキシルメチル)マレイミドのN−ヒドロキシサク
シンイミドエステル(以下[Ckl M Jという)等
を用1.)tこ製造法か望ましいと記載されている。
を有するカルボン酸のへ−ハイドロキシ−リフシンイミ
ドエステルを化学結合剤としてβ−Gum標識ペプチド
ホルモンを製造し、これを用いたEiA法での測定がす
でlこ知られている。例えば、アミノ酸10個からなる
ペプチドホルモンであるアンギオテンシン■のEIA法
での測定の例か’+2iJ出の「エンサイムイムノアツ
セイJ (Enzyme 1nunu++5asoay
) l 63 @ ニ記載さオtている。この方法に
よるとアンギオテンシン■とβ−C))l Iとの結合
において、化学結合剤としてN −(メクーマしノイミ
ドベンゾイロキシ)ゆクンンイミド(以下i st B
S Jといつ)カ使用さIしている、1r4られたβ
−Ga1g識アノギオテノノノ1を用いζアノギオテ゛
ノシン1の競合反応法による1“:■、〜測定が行なK
)れ、it I A法と同等の感度がf’Uられfコと
ノ小べCいる。特開昭56−10647号公報にはオキ
ソトレンを含むド垂体ホルモンの競合ii !、J法に
まるEIA法での測定法に関する記載があり、β−(j
alを標識酵素としj、= IJ−Gal標識1Z垂体
ホル七ンの製造法についでこτ及している。この中でも
化学結合剤さしてマレイミド基を含む芳香族あるいは脂
環式カルボン酸のN−ハイドロキシサクシンイミドエス
テル体例えばMBSあるいはN −(4−カルボキシシ
クロへキシルメチル)マレイミドのN−ヒドロキシサク
シンイミドエステル(以下[Ckl M Jという)等
を用1.)tこ製造法か望ましいと記載されている。
本発明者らはオキソトレンのi;iAiによる測定を可
能にすべく鋭意検討を行なつfコ結果、従来望ましいと
されているマレイミド基を含むβ−Ual標識オキ標識
オキモトシンを達し得す、一般式[1] %式%[] で表わされる化学結合剤を用いた場合ζこ、競合法によ
るEIA法での筒感度オキシトシンの定量が可能である
ことを見出し、本発明に到った。
能にすべく鋭意検討を行なつfコ結果、従来望ましいと
されているマレイミド基を含むβ−Ual標識オキ標識
オキモトシンを達し得す、一般式[1] %式%[] で表わされる化学結合剤を用いた場合ζこ、競合法によ
るEIA法での筒感度オキシトシンの定量が可能である
ことを見出し、本発明に到った。
一般式〔IJにおけるXとしては、一般的に蛋白を変性
させない温和な条件下で蛋白の有するSR4と反応して
、スルフィド結合ま1こはジスルフィド結合を形成して
蛋白と結合し得る公知の官能基のいずれでも良い。
させない温和な条件下で蛋白の有するSR4と反応して
、スルフィド結合ま1こはジスルフィド結合を形成して
蛋白と結合し得る公知の官能基のいずれでも良い。
蛋HO)8H)i、とスルフィド結合を形成し得る官能
参の例と(7ては、171素、臭素、ヨード専のハロゲ
ン覗あるいはマレイミド基が挙げられるが、好ま(7〈
は塩素、臭素、ヨードであり、特にヨードが泥和jf条
件で反応[7得るこにから望まし1)。
参の例と(7ては、171素、臭素、ヨード専のハロゲ
ン覗あるいはマレイミド基が挙げられるが、好ま(7〈
は塩素、臭素、ヨードであり、特にヨードが泥和jf条
件で反応[7得るこにから望まし1)。
蛋白の81i基とジスルフィド結合を形成し得る官能基
の例としては、一般式−5−Z(Zは隣りの硫黄原子と
共に粘性ジスルフィドゐ(を形成L〕得るノ1(を表わ
す。)で表わされる活11゛ジスルフィド基である。2
の具体例としては2−ピことができるか、特に2−ピリ
ジルチオ基が望ましい。
の例としては、一般式−5−Z(Zは隣りの硫黄原子と
共に粘性ジスルフィドゐ(を形成L〕得るノ1(を表わ
す。)で表わされる活11゛ジスルフィド基である。2
の具体例としては2−ピことができるか、特に2−ピリ
ジルチオ基が望ましい。
Aとしては、炭素数1〜3の直鎮状アルキレン基であり
、好ましくはメチレン基またはエチレン基である。
、好ましくはメチレン基またはエチレン基である。
Yとしては、アミノ基と反応してペプチド結合を形成し
得るカルボキシル基、またはその反応性誘導体であるが
、カルボキシル基の反応性誘導体であることが望ましい
。
得るカルボキシル基、またはその反応性誘導体であるが
、カルボキシル基の反応性誘導体であることが望ましい
。
ここでカルボキシル基の反応性誘導体とは、ペプチド結
合を形成するために、ペプチド合成の分野で通常用いら
れる反応性誘導体であり、例えば活性エステル基が該当
する。活性エステル基としては、射−ヒドロキシサクシ
ンイミドエステル基、p−ニトロフェニルエステル基な
どが反応性が高いので望ましい。
合を形成するために、ペプチド合成の分野で通常用いら
れる反応性誘導体であり、例えば活性エステル基が該当
する。活性エステル基としては、射−ヒドロキシサクシ
ンイミドエステル基、p−ニトロフェニルエステル基な
どが反応性が高いので望ましい。
一般式[IJで表わされる化学結合剤として特に望まし
いものは、N−サクシンイミジルヨードアセテート(以
下[NIIIAJという)〔■〕おまびヘーサクシンイ
ミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(以
ド[5PDPJという) [111]である。
いものは、N−サクシンイミジルヨードアセテート(以
下[NIIIAJという)〔■〕おまびヘーサクシンイ
ミジル3−(2−ピリジルジチオ)プロピオネート(以
ド[5PDPJという) [111]である。
前者はその製造法が文献(Rectorら: J、Im
munoj。
munoj。
Merbods 24.321〜386 (1978)
)に記載されている公知の化合物であって、ジオキサン
等の有機溶媒中でN−ハイドロキシサクシンイミドをジ
シクロへキシルカルボジイミドの存在下、ヨード酢酸と
反応せしめて得ることが出来る。
)に記載されている公知の化合物であって、ジオキサン
等の有機溶媒中でN−ハイドロキシサクシンイミドをジ
シクロへキシルカルボジイミドの存在下、ヨード酢酸と
反応せしめて得ることが出来る。
後者はすでにファルマシア社(スウェーデン)より市販
されている公知の化合物である。
されている公知の化合物である。
これらの化学結合剤を用いてβ−Gal標識オキシトシ
ンを製造するには、まず化学結合剤のカルボキシル基あ
るいはその反応性誘導体とオキシトシンのアミン基を反
応させた後、未反応の化学結合剤を除去する。Yがカル
ホキシル基である場合lζは、カルボジイミド誘導体等
の縮合剤の存在下でアミノ基と反応せしめてペプチド結
合を形成する。一方Yがカルボキシル基の反応性誘導体
である場合には縮合剤は不要であり、取扱いも容易なこ
とから望ましい。このようにして得られた化学結合剤の
反応したオキシトシンとβ−Galの8H基とを反応せ
しめ、その結果得られたβ−Gal標識オキシトシンを
分離精製する。
ンを製造するには、まず化学結合剤のカルボキシル基あ
るいはその反応性誘導体とオキシトシンのアミン基を反
応させた後、未反応の化学結合剤を除去する。Yがカル
ホキシル基である場合lζは、カルボジイミド誘導体等
の縮合剤の存在下でアミノ基と反応せしめてペプチド結
合を形成する。一方Yがカルボキシル基の反応性誘導体
である場合には縮合剤は不要であり、取扱いも容易なこ
とから望ましい。このようにして得られた化学結合剤の
反応したオキシトシンとβ−Galの8H基とを反応せ
しめ、その結果得られたβ−Gal標識オキシトシンを
分離精製する。
オキシトシンと該化学結合剤との反応は、Yがカルボキ
シル基である場合には、オキシトシンをpll 5.0
〜7.5の緩衝液に0.01〜10(W/W )%の濃
度で溶解し、これに該化学結合剤を1〜100倍モル、
望ましくは1〜5倍モル加え、さらに水溶性カルボジイ
ミド等の縮合剤を1〜1000倍モル望ましくは1〜5
0倍モル加えて0〜50℃で5分〜24時間反応せしめ
た後、ゲル口過またはアセトン等の有機溶媒洗浄に誹り
未反応の化学結合剤を除去する。
シル基である場合には、オキシトシンをpll 5.0
〜7.5の緩衝液に0.01〜10(W/W )%の濃
度で溶解し、これに該化学結合剤を1〜100倍モル、
望ましくは1〜5倍モル加え、さらに水溶性カルボジイ
ミド等の縮合剤を1〜1000倍モル望ましくは1〜5
0倍モル加えて0〜50℃で5分〜24時間反応せしめ
た後、ゲル口過またはアセトン等の有機溶媒洗浄に誹り
未反応の化学結合剤を除去する。
Yか活性エステル等のカルホキシル基の反応性誘導体で
ある場合には、水溶性カルボジイミド等の縮合剤を使わ
ない他は、上述のYがカルボキシル基である場合と同様
の方法で行うことができる。得られた化学結合剤と反応
したオキシトシンの鷲は以下の如くして求められる。す
なわち化学結合剤とβ−Gal (7) 8 kl基と
の結合かスルフィド結合となる場合は、反応体を一定過
剰Mの2−メルカプトエタノールと反応させ、その残飯
を4.4′−ジチオジピリジンにより逆l丙疋しで求め
る。β−GalのSIi基との結合がジスルフィド結合
となる場合は、反応体を過剰の2−メルカプトエタノー
ルと反応せしめ、遊離したピリジン誘導体を分光学的に
測定して求めることが出来る。
ある場合には、水溶性カルボジイミド等の縮合剤を使わ
ない他は、上述のYがカルボキシル基である場合と同様
の方法で行うことができる。得られた化学結合剤と反応
したオキシトシンの鷲は以下の如くして求められる。す
なわち化学結合剤とβ−Gal (7) 8 kl基と
の結合かスルフィド結合となる場合は、反応体を一定過
剰Mの2−メルカプトエタノールと反応させ、その残飯
を4.4′−ジチオジピリジンにより逆l丙疋しで求め
る。β−GalのSIi基との結合がジスルフィド結合
となる場合は、反応体を過剰の2−メルカプトエタノー
ルと反応せしめ、遊離したピリジン誘導体を分光学的に
測定して求めることが出来る。
上記反応体とβ−Galの反応は、p H5,0〜9.
0好ましくはP R6,0〜8.0の緩衝液中で、β−
(Jal o)5〜1000倍モル望ましくは10〜2
00倍モルの上記反応体を用いて、0〜40℃で10分
〜48時間反応せしめる。反応後ゲル濾過を行ない、β
−Gajと反応しなかった上記反応体を除去する。
0好ましくはP R6,0〜8.0の緩衝液中で、β−
(Jal o)5〜1000倍モル望ましくは10〜2
00倍モルの上記反応体を用いて、0〜40℃で10分
〜48時間反応せしめる。反応後ゲル濾過を行ない、β
−Gajと反応しなかった上記反応体を除去する。
得られた生成物が目的のβ−Gal標識オキシトシンで
あることは、ゲル沖過の相当画分の分子基がβ−Gal
の分子量にほぼ相当するものであり、β−ualの酵素
粘性を有し、かつオキシトシン特異的抗体との免疫化学
的結合性を有することから確認することが出来る。
あることは、ゲル沖過の相当画分の分子基がβ−Gal
の分子量にほぼ相当するものであり、β−ualの酵素
粘性を有し、かつオキシトシン特異的抗体との免疫化学
的結合性を有することから確認することが出来る。
オキシトシン特異抗体を得る方法は低分子量物質いわゆ
るハブテンに対する特異抗体を作製する公知の方法を適
用することかできる。代表的方法としては、牛血清アル
ブミンをキャリヤー蛋白とする方法で、T、 L、 u
oodl’riendら(5cience 144 、
11144 (1964年))の文献に記載されてい
る。すなわち、オキシトシンと牛血清アルブミンをカル
ボジイミド法で結合後、この反応液を透析し、得られた
オキシトシンと牛血清アルブミンの結合物を等量の完全
フロインドアジaバンドと混合して乳剤とし、家兎の反
内に繰返し静注することによって抗体を匣生させる。
るハブテンに対する特異抗体を作製する公知の方法を適
用することかできる。代表的方法としては、牛血清アル
ブミンをキャリヤー蛋白とする方法で、T、 L、 u
oodl’riendら(5cience 144 、
11144 (1964年))の文献に記載されてい
る。すなわち、オキシトシンと牛血清アルブミンをカル
ボジイミド法で結合後、この反応液を透析し、得られた
オキシトシンと牛血清アルブミンの結合物を等量の完全
フロインドアジaバンドと混合して乳剤とし、家兎の反
内に繰返し静注することによって抗体を匣生させる。
以上の方法に止っで得られたβ−1jaJ標識オキシト
シンならびにオキシトシン特異抗体を用いた競合反応法
による、nlA法によるオキシトシンの測定は以上の方
法により行なうことか出来る。すなわら検体とβ−Ga
l標識オキシトシンとオキシトシン特異抗体とを混合し
抗原抗体反応を行なわせた後、未反応β−Gal標識オ
キシトシンと、オキシトシン特異抗体と結合したβ−G
a 1 g aがキシドシンとを分離せしめ、オキシト
シン特異抗体と結合したβ−ual標識オキシトシンの
量をβ−Galの酵素活性から測定する。分離方法とし
ては通常のEiA法の13/F分離法を用いることが出
来る。代表的分離方法はオキシトシン特異抗体に対する
抗体、たとえば抗つサギγ−グープリン山羊血清を加え
遠心分離を行なうパわゆる2抗体法Yある・得られた沈
でん物のβ−Gal酵累活性を公知の方法により測定す
る。酵素反応の基質としては例えばp−ニトロフェニル
−β−カラクトシドあるいは4−メチルウンベリフェリ
ル−β−ガラクトシドが挙げられるが、後者の場合生成
物が螢光を有するため高感度測定に望ましい。なお検体
中のオキシトシンの濃度は、既知濃度の標準試料浴液を
用いて同様に操作して酵素活性を測定し、それにより作
成した検量線より定量する。特に高感度を得るには、オ
キシトシンとオキシトシン特異抗体とをあらかじめ反応
せしめた後、β−(Jal標識オキシドノンを反応させ
るいわゆるディレィドアディジョン法(debλyed
acldition法)が好ましい。
シンならびにオキシトシン特異抗体を用いた競合反応法
による、nlA法によるオキシトシンの測定は以上の方
法により行なうことか出来る。すなわら検体とβ−Ga
l標識オキシトシンとオキシトシン特異抗体とを混合し
抗原抗体反応を行なわせた後、未反応β−Gal標識オ
キシトシンと、オキシトシン特異抗体と結合したβ−G
a 1 g aがキシドシンとを分離せしめ、オキシト
シン特異抗体と結合したβ−ual標識オキシトシンの
量をβ−Galの酵素活性から測定する。分離方法とし
ては通常のEiA法の13/F分離法を用いることが出
来る。代表的分離方法はオキシトシン特異抗体に対する
抗体、たとえば抗つサギγ−グープリン山羊血清を加え
遠心分離を行なうパわゆる2抗体法Yある・得られた沈
でん物のβ−Gal酵累活性を公知の方法により測定す
る。酵素反応の基質としては例えばp−ニトロフェニル
−β−カラクトシドあるいは4−メチルウンベリフェリ
ル−β−ガラクトシドが挙げられるが、後者の場合生成
物が螢光を有するため高感度測定に望ましい。なお検体
中のオキシトシンの濃度は、既知濃度の標準試料浴液を
用いて同様に操作して酵素活性を測定し、それにより作
成した検量線より定量する。特に高感度を得るには、オ
キシトシンとオキシトシン特異抗体とをあらかじめ反応
せしめた後、β−(Jal標識オキシドノンを反応させ
るいわゆるディレィドアディジョン法(debλyed
acldition法)が好ましい。
以下実施例によって本発明をさらに具体的に説明する。
実施例1 オキシトシンに対する抗体の作成80m2の
合成オキシトシン(情国臓器製)と15qの牛血浦アル
ブミンを0.3−の蒸留水に溶解し、この水溶液中に5
0 II+!/のl−エチル−8−(8−ジメチルアミ
ノプロピル)カルボジイミドの塩酸塩を0.2 tnt
の蒸留水に俗解したFiを閥下し、20”′Cで30分
間振とうする。この反応液を4 ”Cの蒸留水で24時
聞過析した。オキシトシン換算1り相当量を0、l 5
hl Na1l水浴液で1.0艷に希釈し、1−の完
全フロインドアジュバントと混合して乳剤とし、家兎の
皮肉に約0.05 rnlずつ20ケ所以上に注射し、
2週間後に開腹の上、牌内に1.5 mA注入、次いで
2週間間隔で初回と同様の皮肉注射を行ない、初回免疫
より12週後に全面採血を行なっfコ。
合成オキシトシン(情国臓器製)と15qの牛血浦アル
ブミンを0.3−の蒸留水に溶解し、この水溶液中に5
0 II+!/のl−エチル−8−(8−ジメチルアミ
ノプロピル)カルボジイミドの塩酸塩を0.2 tnt
の蒸留水に俗解したFiを閥下し、20”′Cで30分
間振とうする。この反応液を4 ”Cの蒸留水で24時
聞過析した。オキシトシン換算1り相当量を0、l 5
hl Na1l水浴液で1.0艷に希釈し、1−の完
全フロインドアジュバントと混合して乳剤とし、家兎の
皮肉に約0.05 rnlずつ20ケ所以上に注射し、
2週間後に開腹の上、牌内に1.5 mA注入、次いで
2週間間隔で初回と同様の皮肉注射を行ない、初回免疫
より12週後に全面採血を行なっfコ。
′宿性により抗血清を分離し、その力価を調べた。””
l W識オキシトシンに対して、希釈率1 : 900
0で約・15%の結合率を示した。
l W識オキシトシンに対して、希釈率1 : 900
0で約・15%の結合率を示した。
実施例2
(1)、NLLLAを化学結合剤としたβ−(jal標
識オキントシンの製造 1、00 mのり−;ζフラスコにN−ハイドロキジサ
クシンイミド4601’lli’(4mmole )、
ジシクロヘキシルカルボジイミド824 〃v(4nI
nlo l e )、ジオキサン40 meを加え、こ
の溶故甲にヨード酢酸726 rny (3,9mno
)lc )を添加し、冨温で1時間攪拌しfコ。反発後
生成した白色性IRff−F別除去し、7戸液を減圧濃
縮して淡黄色粉床i、igを得fこ。そのうら1!をク
ロロホルム10ゴで再結晶し、白色結晶656〜(2,
82mrnole ) ヲ(11コ。li’A点、マ
ススペクトル、N bt itにより1的とするN]i
IAであることを確認しfこ。
識オキントシンの製造 1、00 mのり−;ζフラスコにN−ハイドロキジサ
クシンイミド4601’lli’(4mmole )、
ジシクロヘキシルカルボジイミド824 〃v(4nI
nlo l e )、ジオキサン40 meを加え、こ
の溶故甲にヨード酢酸726 rny (3,9mno
)lc )を添加し、冨温で1時間攪拌しfコ。反発後
生成した白色性IRff−F別除去し、7戸液を減圧濃
縮して淡黄色粉床i、igを得fこ。そのうら1!をク
ロロホルム10ゴで再結晶し、白色結晶656〜(2,
82mrnole ) ヲ(11コ。li’A点、マ
ススペクトル、N bt itにより1的とするN]i
IAであることを確認しfこ。
オキシトシン0.5 mg(0,5μ+1)ole )
を0.1MのΔac1を含むQ、 l Mリン酸級衝M
(Pli 7.0 )(以下「緩衝欣」という)lf
nl中に俗解し、N M I A o) 20 my/
ldジ第4−サン浴液35μt(NRlA 2.5 μ
Inale ) ヲ加エテ、25°C15分間反応せし
めた。次いで反応液をセファデックス■G−10(Lo
anωX 20 ctn)のカラムによりゲル濾過を行
ない、未反応NHIAを除去した。
を0.1MのΔac1を含むQ、 l Mリン酸級衝M
(Pli 7.0 )(以下「緩衝欣」という)lf
nl中に俗解し、N M I A o) 20 my/
ldジ第4−サン浴液35μt(NRlA 2.5 μ
Inale ) ヲ加エテ、25°C15分間反応せし
めた。次いで反応液をセファデックス■G−10(Lo
anωX 20 ctn)のカラムによりゲル濾過を行
ない、未反応NHIAを除去した。
分取液中のヨード基の定量は次の様に行なツfs。スナ
ワち分取液o、l−に2−メルヵブ1・−1−タ) −
ルi Q Q n+uoleを加え、37°C2時14
j反応wしめた後、未反応の2−メルカプト・エタノー
ルを4,4′−ジチオジピリジンによL) $滴定を行
なっtコ。その結果分取液0.1mi中にN M I
Aと反応した。オキシトシンが27nmolc9Fj:
れでいることがわかっ1こ。
ワち分取液o、l−に2−メルヵブ1・−1−タ) −
ルi Q Q n+uoleを加え、37°C2時14
j反応wしめた後、未反応の2−メルカプト・エタノー
ルを4,4′−ジチオジピリジンによL) $滴定を行
なっtコ。その結果分取液0.1mi中にN M I
Aと反応した。オキシトシンが27nmolc9Fj:
れでいることがわかっ1こ。
L記分取11K 0. ]、 ml +、β−Gal
(7) 5 tag/、、(12,2M硫安溶液80μ
!、(β−Gal Q、74 n1nof )を緩衝液
で1.4−に希釈した溶液中に1丙下し、28°Cで1
8時間反応せしめた。次いで反応ン佼をセファローズ”
6 B (2,4cm!2jX 85cln)のカラト
によりゲル濾過を行なっTこ。β−()a10弓)子星
にはIll相当する画分を分取し、β−(JaJの酵素
活性、オキシトシン特異抗体に対する結合率を以下の様
に〔7て測定した。
(7) 5 tag/、、(12,2M硫安溶液80μ
!、(β−Gal Q、74 n1nof )を緩衝液
で1.4−に希釈した溶液中に1丙下し、28°Cで1
8時間反応せしめた。次いで反応ン佼をセファローズ”
6 B (2,4cm!2jX 85cln)のカラト
によりゲル濾過を行なっTこ。β−()a10弓)子星
にはIll相当する画分を分取し、β−(JaJの酵素
活性、オキシトシン特異抗体に対する結合率を以下の様
に〔7て測定した。
(2) β−由1の酵素活性の測定
−F記分取両分を緩衝液A (0,02M リン酸緩(
J[(pH7,0>、0.1%” SAs (11,9
i NaNa、l mM MyU/v、Q、 l M
r%1rLC1−を含む)により100倍に8釈し、試
験管にこの希釈液100μtと4−メチルウンベリフェ
リル−β−ガラクトシドの1.0X10’Mの緩衝液A
溶液100μtを加えて37°C1時間反応後、PH1
0,4のグリシン緩衝液4−を添加して反応を停止した
。この液の螢光測定をFJ起波長8651mm 、螢光
波長448 nmにて行なった。
J[(pH7,0>、0.1%” SAs (11,9
i NaNa、l mM MyU/v、Q、 l M
r%1rLC1−を含む)により100倍に8釈し、試
験管にこの希釈液100μtと4−メチルウンベリフェ
リル−β−ガラクトシドの1.0X10’Mの緩衝液A
溶液100μtを加えて37°C1時間反応後、PH1
0,4のグリシン緩衝液4−を添加して反応を停止した
。この液の螢光測定をFJ起波長8651mm 、螢光
波長448 nmにて行なった。
その結果、測定に十分な酵素活性を有することが確認さ
れた。
れた。
(3) オキシトシン特異抗体に対する結合率の測定
試験管に上記(2)と同様に分取分画を100倍に希釈
した溶液100μtならびにオキシトシン測定用緩衝液
(0,05M!Jン酸緩衝液(pH7,5)にEDTA
−2Na 872119、オルソフェナンスロリン51
1Q、NaNg 1 fを加えて1tになるように調整
し、さらに0.1%ヒト血清アルブミンを添加する)6
00μt1および1%正常ウサギ血清を含むオキシトシ
ン測定用緩衝液にて9.000倍に希釈した抗血清10
0μtを加え、4°Cで48時間インキュl\−シジン
を行なった。次いでオキシトシン測定用緩衝液にて30
倍に希釈した抗つサギr−グロブリンヤギ血渭200μ
tを加えて、4℃で24時間インキュベーションした後
、4℃でaooorWlにて30分間遠心分離し、上清
を捨てその沈澱に緩衝液Aを2tn1.加えて、書び4
”Cで30分間遠心分離(8000rp+n )しで
上清を捨て、緩衝液Aを100μを加えて、前項と同様
基質を加えてβ−Galの酵素活性を測定した。分取分
画の酵素活性と抗体と結合した酵素活性の比から結合率
を求めた。
した溶液100μtならびにオキシトシン測定用緩衝液
(0,05M!Jン酸緩衝液(pH7,5)にEDTA
−2Na 872119、オルソフェナンスロリン51
1Q、NaNg 1 fを加えて1tになるように調整
し、さらに0.1%ヒト血清アルブミンを添加する)6
00μt1および1%正常ウサギ血清を含むオキシトシ
ン測定用緩衝液にて9.000倍に希釈した抗血清10
0μtを加え、4°Cで48時間インキュl\−シジン
を行なった。次いでオキシトシン測定用緩衝液にて30
倍に希釈した抗つサギr−グロブリンヤギ血渭200μ
tを加えて、4℃で24時間インキュベーションした後
、4℃でaooorWlにて30分間遠心分離し、上清
を捨てその沈澱に緩衝液Aを2tn1.加えて、書び4
”Cで30分間遠心分離(8000rp+n )しで
上清を捨て、緩衝液Aを100μを加えて、前項と同様
基質を加えてβ−Galの酵素活性を測定した。分取分
画の酵素活性と抗体と結合した酵素活性の比から結合率
を求めた。
その結果この分取分画は30%の結合率を示し、β−G
al標識オキシトシンであることが確認された。
al標識オキシトシンであることが確認された。
実施例3 5PDPを化学結合剤としたβ−Gaz標識
オキシトシンの製造 オキシトシン0.5#v(0,5μmole )を実施
例2と同様の緩衝液1−に溶解し、これにIJIJJP
IQ〜をエタノール1−に溶解した液78 ttl (
l:IPDP 2,5μtnoleニ相当)を加え、2
8℃で30分間反応後、セファデックス■G−10(1
,0crnOX20crn)カラムによりゲル口過し、
未反応S PDPを除去した。
オキシトシンの製造 オキシトシン0.5#v(0,5μmole )を実施
例2と同様の緩衝液1−に溶解し、これにIJIJJP
IQ〜をエタノール1−に溶解した液78 ttl (
l:IPDP 2,5μtnoleニ相当)を加え、2
8℃で30分間反応後、セファデックス■G−10(1
,0crnOX20crn)カラムによりゲル口過し、
未反応S PDPを除去した。
このゲル口過による分取液中に含まれる反応したオキシ
トシンの2−ピリジルジチオ基の定量を行なった。分取
液1rnI!に2−メルカプトエタノールの5壓−緩衝
液溶液2−(128nrnole)を加え20°Cで1
5分間反応後遊離したピリジン−2−チオン量を348
0rllの吸収より測定しTこ。その結果1ゴ中に2−
ピリジルジチオ基は60.2 nmole含まれていた
。
トシンの2−ピリジルジチオ基の定量を行なった。分取
液1rnI!に2−メルカプトエタノールの5壓−緩衝
液溶液2−(128nrnole)を加え20°Cで1
5分間反応後遊離したピリジン−2−チオン量を348
0rllの吸収より測定しTこ。その結果1ゴ中に2−
ピリジルジチオ基は60.2 nmole含まれていた
。
β−Gal (1) 5 Q/ml 2.2 M 、硫
安溶液80μt(β−Gal o、 74 nmole
ニ相当)を1d(7)緩衝液で希釈した溶液中に、−
F配分取液0.5−□を滴下し、23℃で200時間反
応しめた。
安溶液80μt(β−Gal o、 74 nmole
ニ相当)を1d(7)緩衝液で希釈した溶液中に、−
F配分取液0.5−□を滴下し、23℃で200時間反
応しめた。
反応後反応液をセファローズ■6B(2,4cTnに3
X 85 cm )カラムによりゲル濾過を行ない、
β−Galの分子量にほぼ相当する分子量画分を分取し
、β−Galの酵素活性、オキシトシン特異抗体に対す
る結合率を実施例2と同様の方法により測定した。
X 85 cm )カラムによりゲル濾過を行ない、
β−Galの分子量にほぼ相当する分子量画分を分取し
、β−Galの酵素活性、オキシトシン特異抗体に対す
る結合率を実施例2と同様の方法により測定した。
その結果、測定に十分な酵素活性を有することが確認さ
れ、結合率も35%を示し、β−Gal標識オキシトシ
ンであることが確認された。
れ、結合率も35%を示し、β−Gal標識オキシトシ
ンであることが確認された。
実施例4 オキシトシン測定用検量線の作成オキシトシ
ン標準溶液はオキシトシン測定用1m 衝故に0.1%
ヒト血清アルブミンヲ加えた溶液にオキシトシンを溶解
して8〜1.000μ口旧1・/−の濃度溶液を準備し
た。
ン標準溶液はオキシトシン測定用1m 衝故に0.1%
ヒト血清アルブミンヲ加えた溶液にオキシトシンを溶解
して8〜1.000μ口旧1・/−の濃度溶液を準備し
た。
試験管にオキシトシン標準溶液200μtならびに実施
例2の第3項で調整した希釈抗血清100μtおJび血
漿400μtを加え4°Cで48時間ブレインキュベー
ションを行なった。血漿は健常人男子の血液をヘパリン
化ジオキシドシン分解酵素阻害剤を入れた冷却試験管に
採取し、よく混和した後冷却遠心を行ない、血漿を分離
し56℃で30分間の非動化後、再度遠沈し上清を一2
0℃で凍結保存したものを用いた。
例2の第3項で調整した希釈抗血清100μtおJび血
漿400μtを加え4°Cで48時間ブレインキュベー
ションを行なった。血漿は健常人男子の血液をヘパリン
化ジオキシドシン分解酵素阻害剤を入れた冷却試験管に
採取し、よく混和した後冷却遠心を行ない、血漿を分離
し56℃で30分間の非動化後、再度遠沈し上清を一2
0℃で凍結保存したものを用いた。
ブレインキュベーション後、実施例2で得られたβ−G
al標識オキシトシン100μtを添加して4 ”Cで
18時間インキュベーションを行ない、第2抗体(抗つ
サギγ−グロブリンヤギ血清)の30倍希釈液200μ
tを加えて、さらに4℃で24時間インキュベージタン
を行なった。その後4°Cで30分間遠心分llt (
8000rprn ) (、、上清を捨−c、さらに緩
衝gA2−を加えて、上記と同様の遠心分離操作を行な
い、上清を捨てた後沈澱のβ−Galの酵素活性を測定
また。
al標識オキシトシン100μtを添加して4 ”Cで
18時間インキュベーションを行ない、第2抗体(抗つ
サギγ−グロブリンヤギ血清)の30倍希釈液200μ
tを加えて、さらに4℃で24時間インキュベージタン
を行なった。その後4°Cで30分間遠心分llt (
8000rprn ) (、、上清を捨−c、さらに緩
衝gA2−を加えて、上記と同様の遠心分離操作を行な
い、上清を捨てた後沈澱のβ−Galの酵素活性を測定
また。
β−〇alの酵素活性測定は実施例2の第2項と同様の
方法で行なった。この測定の結果実施例2で得られたN
HIAを化学結合剤としたβ−Gal標識オキシトシン
を用いた場合の検量線を図−1に示す。
方法で行なった。この測定の結果実施例2で得られたN
HIAを化学結合剤としたβ−Gal標識オキシトシン
を用いた場合の検量線を図−1に示す。
実施例2で得られたβ−Gal標識オキシトシンに替え
て、実施例8で得られたS PDPを化学結合剤とした
β−Galオキシトシンを用いた場合にも同様の結果を
得たつその検量線を図−2に示す。
て、実施例8で得られたS PDPを化学結合剤とした
β−Galオキシトシンを用いた場合にも同様の結果を
得たつその検量線を図−2に示す。
いずれの化学結合剤を用いた場合ともオキシトシン標準
溶液16μun+t/@/の測定が可能であり、この串
は400μlの血漿を用いた場合は8μun+t/ml
の測定が可能であることを示す。
溶液16μun+t/@/の測定が可能であり、この串
は400μlの血漿を用いた場合は8μun+t/ml
の測定が可能であることを示す。
参考例I MBSを化学結合剤としたβ−Gal標識
オキシトシンによるオキシ]・シンの定量 オキシ1−シン05η(0,5μmo!e)を実施例2
と同様の緩衝液1 mlに溶解しMBSの5jnf /
7!テトラヒドロフラン溶液38μt(0,6μ+u
ole )を加えて、30°Cで80分間反応を行なつ
f4゜未反応MBBの除去には反応後の液をセフアデツ
クス”G −10(1,Ocrn’X20cnr )の
カラムを用いるゲル濾過法を行なった。
オキシトシンによるオキシ]・シンの定量 オキシ1−シン05η(0,5μmo!e)を実施例2
と同様の緩衝液1 mlに溶解しMBSの5jnf /
7!テトラヒドロフラン溶液38μt(0,6μ+u
ole )を加えて、30°Cで80分間反応を行なつ
f4゜未反応MBBの除去には反応後の液をセフアデツ
クス”G −10(1,Ocrn’X20cnr )の
カラムを用いるゲル濾過法を行なった。
精製[7た溶液中のM B 8と反応したオキシトシン
の定置は実施例30条件と同様過剰の2の2−メルカプ
トエタノール量を4.4′−ジチオジピリジンにより求
めて行なった。
の定置は実施例30条件と同様過剰の2の2−メルカプ
トエタノール量を4.4′−ジチオジピリジンにより求
めて行なった。
p−tiaJト(y)反応はβ−(y+II Q、75
nmoleに対しでΔIBSと反応しfこ万キシドシ
ンを55 n+nole 、 28n +nole
、 5,6n+nole 、 0.55 nmoleと
なる嵐を用いて実施例2と同様の方法でβ−(j、hl
a識オキシトシンを合成し確認した。
nmoleに対しでΔIBSと反応しfこ万キシドシ
ンを55 n+nole 、 28n +nole
、 5,6n+nole 、 0.55 nmoleと
なる嵐を用いて実施例2と同様の方法でβ−(j、hl
a識オキシトシンを合成し確認した。
上記で得られたAt 13 Hを化学結合剤として用い
1こ(1−ual標蟲オキシトシンを用いて、実施例4
の方法でオキシトシンの定量を行なっfこ。8!量線を
図3に示す。
1こ(1−ual標蟲オキシトシンを用いて、実施例4
の方法でオキシトシンの定量を行なっfこ。8!量線を
図3に示す。
未反応MBδの除去法としで、ケル濾過法に替えて、反
応1.;故を凍結乾燥した後ア±トンで未反応MB8を
洗浄除去するアセトン洗浄法を行なっ1こ場合にもほぼ
同様の恢琶線が得られ、まfこMBSと反応しr: >
オキシトシンの使用斌を変えても同様の結果であった。
応1.;故を凍結乾燥した後ア±トンで未反応MB8を
洗浄除去するアセトン洗浄法を行なっ1こ場合にもほぼ
同様の恢琶線が得られ、まfこMBSと反応しr: >
オキシトシンの使用斌を変えても同様の結果であった。
いずれの場合にも、1000μunit/−でもわずか
な結合阻否をボずのみであっ1こ。
な結合阻否をボずのみであっ1こ。
標識副キットシンによるオキシトシン
の定量
bl、 IS Sの代t) ニCiL M O) 0.
5 ’Q/ml!、 ’) オキ?ン浴股を月」いた以
外は参考例1と同様の方法にでCILMと反応し1゛こ
オキシトシン’:” j’J 、JJ肖ct!Itと同
様本反応G 11. Mの除去をゲル濾過lムに、Lり
行ない、β−1jalとの反届ならびに精製ケ行なっf
こ。
5 ’Q/ml!、 ’) オキ?ン浴股を月」いた以
外は参考例1と同様の方法にでCILMと反応し1゛こ
オキシトシン’:” j’J 、JJ肖ct!Itと同
様本反応G 11. Mの除去をゲル濾過lムに、Lり
行ない、β−1jalとの反届ならびに精製ケ行なっf
こ。
実弛例4と11用様の方法によt)OnMiを化学結合
剤こしたβ−(jal標識オキントシンケ用いて到キン
トシー/の疋rを行なっ1こ。検量線−1?図4に示す
。
剤こしたβ−(jal標識オキントシンケ用いて到キン
トシー/の疋rを行なっ1こ。検量線−1?図4に示す
。
本反応C11J〜j、の除去性として、ケルi濾過法に
(6Fえでアービトンl先浄法を行なった場合にもほぼ
同様の検量線かイりられ、またCl1M反応オキシトシ
ンの使用量を貧化させた場合も同様であつ1こ。
(6Fえでアービトンl先浄法を行なった場合にもほぼ
同様の検量線かイりられ、またCl1M反応オキシトシ
ンの使用量を貧化させた場合も同様であつ1こ。
いずれの場合にも、1000μm1旧t/ゴでもわすか
な結合阻害を4\すのみで5>っ1こ。
な結合阻害を4\すのみで5>っ1こ。
第1図は、NflIAを化学結合剤としたβ−Gal標
識オキシトシンを用いた場合のヒト血清存在下のオキシ
トシンの検量線を表わす。縦軸は結合率(%)を、横軸
はオキシトシン濃度(μU/−1対数目盛)を表わす。 第2〜第4図は、各々5PDP 、 Mn2 、 Cf
1Mを化学結合剤としたβ−Gal標識オキシトシンを
用いた場合のヒト血清存在下のオキシトシンの検量線を
表わす。縦軸、横軸は第1図と同様である。 101001000AAu/n11
識オキシトシンを用いた場合のヒト血清存在下のオキシ
トシンの検量線を表わす。縦軸は結合率(%)を、横軸
はオキシトシン濃度(μU/−1対数目盛)を表わす。 第2〜第4図は、各々5PDP 、 Mn2 、 Cf
1Mを化学結合剤としたβ−Gal標識オキシトシンを
用いた場合のヒト血清存在下のオキシトシンの検量線を
表わす。縦軸、横軸は第1図と同様である。 101001000AAu/n11
Claims (8)
- (1)一般式 で表わされる化学結合剤とオキシトシンを反応させた後
β−D−ガラクトシターセと結合させることを!待機と
するβ−D−ガラクトシターゼ標識標識オキシトンシン
造法。 - (2)蛋白のIH基と反応してスルフィド結合を形成し
得る官能基がハロゲン原子である特許請求の範囲第1項
に記載の製造法。 - (3)ハロゲン原子がヨード原子である特許請求の範囲
第2項に記載の製造法。 - (4)蛋白のSH基と反応してジスルフィド結合を形成
し得る官能基が一般式−S、−Z(Zは隣りの硫黄原子
と共に活性ジスルフィド基を形成し得る基を表わす)で
表わされる活性ジスルフィド基であるWt+請求の範囲
第1項に記載の製造法。 - (5)zか2−ピリジルチオ基、4−ピリジルチオ基ま
1こは3−カルホキシー4−ニトロフェニルチオ基であ
る特許請求の範囲第4項に記載の製造法。 - (6) カルボキシル基の反応性=>X体が活性エス
テル体である特v−+:請求の範囲@1項に記載の製造
法。 - (7) 活性エステル体がN−ヒドロキシサクシンイ
ミドエステルまたはp−ニトロフェノール乙 エステルである特許請求の範囲第÷項に記載の製造法。 - (8)一般式 X−A−4 でiわされる化学結合剤がN−サクシンイミシルヨード
アセテートまたはへ−サクシンイミジル8−(2−ピリ
ジルジチオ)プロピオネートである特許請求の範囲第1
項に記載の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8715783A JPS59211861A (ja) | 1983-05-17 | 1983-05-17 | オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP8715783A JPS59211861A (ja) | 1983-05-17 | 1983-05-17 | オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59211861A true JPS59211861A (ja) | 1984-11-30 |
Family
ID=13907150
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP8715783A Pending JPS59211861A (ja) | 1983-05-17 | 1983-05-17 | オキシトシン測定用酵素標識オキシトシンの製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59211861A (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016140063A1 (ja) * | 2015-03-04 | 2016-09-09 | 栄研化学株式会社 | オキシトシンの高感度測定法 |
WO2020241812A1 (ja) * | 2019-05-31 | 2020-12-03 | 株式会社スカイシーファーマ | 抗オキシトシンモノクローナル抗体及び該抗体を含むキット |
-
1983
- 1983-05-17 JP JP8715783A patent/JPS59211861A/ja active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016140063A1 (ja) * | 2015-03-04 | 2016-09-09 | 栄研化学株式会社 | オキシトシンの高感度測定法 |
JPWO2016140063A1 (ja) * | 2015-03-04 | 2017-12-14 | 栄研化学株式会社 | オキシトシンの高感度測定法 |
WO2020241812A1 (ja) * | 2019-05-31 | 2020-12-03 | 株式会社スカイシーファーマ | 抗オキシトシンモノクローナル抗体及び該抗体を含むキット |
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