JP3327551B2 - 流体試料中のチロキシンを検出・定量するための試薬および方法 - Google Patents

流体試料中のチロキシンを検出・定量するための試薬および方法

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、テスト試料中のチロキシンの免疫定量法に
関する。特に、本発明は、テスト試料中のチロキシンの
特異的定量法、好ましくは蛍光偏光イムノアッセイに使
用するための免疫原、該免疫原から作られる抗体および
標識化試薬に関する。
一般にチロキシンと呼ばれ、T4と略記されることが多
いアミノ酸である3,5,3',5'−テトラヨード−Ｌ−チロ
ニンは、甲状腺から分泌される主なヨードチロニンであ
る。T4は、正常な代謝および神経機能に不可欠な体中の
種々の生化学反応の調節に関与する。甲状腺機能の変化
の診断では、まず血清T4濃度を測定するのが普通であ
る。甲状腺疾患以外のいくつかの条件でもT4の血清レベ
ルの異常が生じる可能性がある。これらの状態として
は、妊娠、エストロゲンまたはアンドロゲンステロイ
ド、経口避妊薬、ヒダントインおよびサリチル酸塩、ス
トレス、高蛋白血症および低蛋白血症ならびに主要な血
清T4運搬系であるチロキシン結合グロブリン（TBG）の
血清レベルの変化を招く条件（遺伝性または後天性）が
挙げられる。
血流中のチロキシン濃度は極めて低く、非常に感度の
高い方法でのみ検出可能である。循環している全チロキ
シンの約0.05％が生理学的に活性（すなわち、遊離した
チロキシン）である。残りの循環しているチロキシンは
蛋白質、主にチロキシン結合蛋白質（TBG）に結合して
いる。また、チロキシンは他の結合蛋白質、特にチロキ
シン結合プレアルブミンおよびアルブミンにも結合す
る。初期のT4測定は、血清中の蛋白質に結合したヨウ素
またはブタノールで抽出可能なヨウ素の濃度を間接的に
測定するものであった。後に、競合的蛋白質結合（CP
B）測定法が開発された。さらに最近は、ポリクローナ
ル抗体およびモノクローナル抗体の両方を使用するラジ
オイムノアッセイが開発されている。これは、米国特許
No.4,636,478および4,888,296（Siebertら）に開示さ
れ、Ｌ−チロキシンを認識する特異的モノクローナル抗
体を使用するチロキシンのラジオイムノアッセイが開示
されている。一般に、公知のラジオイムノアッセイは、
抗体とＬ−チロキシンの結合に関連する放射能を計数す
るものである。
Ｄ−チロキシンは天然には存在しないチロキシンの異
性体である。Ｌ−およびＤ−チロキシンは共に、下記式
１で表される。
さらに最近は、蛍光偏光法がチロキシンの測定に使用
されている。蛍光偏光法は、蛍光標識した化合物が直線
偏光によって励起されると、その回転速度と逆比例する
偏光度を有する蛍光を放射するという原理に基づく。従
って、蛍光標識したトレーサー−抗体複合体が直線偏光
によって励起されると、光が吸収されて放射される間、
蛍光子（fluorophore）は回転が抑制されるので、放射
される光は高度に偏光された状態に止まる。「遊離し
た」（すなわち、抗体に結合していない）トレーサー化
合物が直線偏光によって励起されると、その回転は対応
するトレーサー−抗体抱合体よりもかなり速く、分子の
配向はよりランダムになり、従って放射される光は偏光
が解消される。すなわち、蛍光偏光は、競合的結合測定
法で生じるトレーサー−抗体抱合体の量を測定するため
の定量的手段となる。
米国特許No.4,510,251およびNo.4,614,823（Kirkemo
ら）は、各々、トレーサーとしてアミノメチルフルオレ
セン誘導体を使用するリガンド用の蛍光偏光分析法およ
びアミノメチルフルオレセン誘導体を開示している。米
国特許No.4,476,229（Finoら）は、蛍光偏光イムノアッ
セイに使用するための置換カルボキシフルオレセン（チ
ロキシン類似体を含むものなど）を開示している。米国
特許No.4,668,640（Wangら）は、置換カルボキシフルオ
レセンを使用する蛍光偏光イムノアッセイを開示してい
る。Wangらの実施例IXは、下記式： のＬ−チロキシンカルボキシフルオレセン抱合体の製造
法を開示している。
Wangらの特許およびFinoらの特許は共に、カルボキシ
フルオレセンがアミド結合によってチロキシンのアミノ
基に直接結合した抱合体を提示している。
チロキシン用に市販されている蛍光偏光イムノアッセ
イ（FPIA）の例としては、IMX、TDXおよびTDX FLX TMT4
測定法（本出願人）（以下、「市販のAbbott T4測定
法」または「市販のT4測定法」とも言う。）が挙げられ
る。これらの方法は、血清または血漿サンプルに存在す
る全チロキシン（すなわち、遊離したものと蛋白質に結
合したもの）を定量的に測定するための試薬系を含む。
これらの測定法は全て、トレーサーとしてカルボキシフ
ルオレセンで標識した同一の蛍光性T4誘導体（以下、市
販のT4トレーサー」または「市販のトレーサー」とも言
う。）；チロキシンに対する同一のヤギポリクローナル
抗体（以下、「市販のT4抗体」または「市販の抗体」と
も言う。）；および蛋白質結合チロキシンから蛋白質を
除いてチロキシンを測定のために遊離するための同一の
試薬を使用している。
FPIAは、処分する放射性物質がない点でラジオイムノ
アッセイ（RIA）よりも有利であり、FPIAは均一系測定
法であって、容易に行うことができる。しかし、市販の
Abbott TDX T4測定法は低いT4レベルを示し、ラジオイ
ムノアッセイの測定値および甲状腺機能低下の臨床上の
症状と一致しなかったことが報告されている。Levine,
S.ら,Clin.Chem.,36（10）:1838−1840（1990）参照。
発明の要旨 本発明は、テスト試料中のチロキシンを定量するため
のユニークな抗体試薬および標識化試薬を提供する。ま
た、本発明は、標識化試薬の合成法および抗体試薬の製
造に使用する免疫原の合成法を提供する。本発明の標識
化試薬および抗体試薬は、テスト試料中のチロキシンを
定量するためのイムノアッセイに使用する場合、公知方
法よりも改善が見られる。本発明の好ましい態様によれ
ば、標識化試薬および抗体試薬を、特異性を有するだけ
でなく迅速かつ均一系の有利さをも有する蛍光偏光イム
ノアッセイで使用することにより、テスト試料中のチロ
キシンの信頼できる定量が得られ、一部のヒトによって
産生される内因性免疫グロブリンＧ（以下、「IgG」と
いう。）の妨害が避けられる。
発明の詳細な説明 本発明によれば、最初に、テスト試料を標識化試薬ま
たはトレーサーおよび抗体試薬と同時または順次接触さ
せ、次いで、抗体との結合反応に関与した、または関与
しなかった標識化試薬の量をテスト試料中のチロキシン
の量の関数として測定することにより、チロキシンの特
異的定量が達成される。
テスト試料は天然の体液もしくは組織、またはその抽
出物もしくは希釈物であり、全血、血清、血漿、尿、唾
液、脳脊髄液、脳組織、便などが挙げられるが、これら
に限定されるものではない。
特に、本発明は、チロキシンの特異的定量のための蛍
光偏光イムノアッセイ（FPIA）に使用するための免疫
原、該免疫原から作られる抗体および標識化試薬に関す
る。
本明細書全体にわたって式中に示す化学構造は、Ｌも
しくはＤ異性体、またはＬおよびＤ異性体の組み合わせ
のいずれかである。しかし、全ての式において、Ｌ異性
体が最も好ましい。
本発明の抗体（ポリクローナル抗体およびモノクロー
ナル抗体の両方）は、下記一般式： ［式中、Ｐは免疫原担体物質であり、Ｘは結合部分であ
る。］の免疫原により作る。結合部分、つなぎ、スペー
サー、スペーサーアームおよびリンカーの用語は交換可
能であり、１個の規定物質（ハプテンなど）を第二の規
定物質（免疫原担体または検出可能な部分）と分離する
共有的に結合した化学因子として定義されるものであ
る。
本発明において、Ｘは好ましくは直鎖もしくは分岐
鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列し
た、飽和または不飽和の、０〜50個の炭素原子およびヘ
テロ原子（ヘテロ原子は10個以下）から成る結合部分で
あるが、ただし（１）ヘテロ原子が直接結合するのは２
個までであり、（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことが
できず、（３）環式部分は６員環か、それより小さく、
（４）分岐は炭素原子上にのみある。ヘテロ原子として
は、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられる。Ｘの例
としては、アルキレン、アラルキレンおよびアルキレン
置換シクロアルキレン基が挙げられる。なお、ここでの
定義によれば、Ｘは０であってもよい。すなわち、炭素
およびヘテロ原子が０の場合である。Ｘ＝０であれば、
結合部分が存在しないことになり、これは、Ｐが式２の
チロキシン誘導体に直接結合することを示す。
当業者であれば理解されるように、免疫原担体物質Ｐ
は従来の公知物質から選択することができ、ほとんどの
場合、蛋白質またはポリペプチドであるが、炭水化物、
多糖類、リポ多糖類、ポリ（アミノ）酸、核酸など、大
きさおよび免疫原性が十分な他の物質も使用できる。好
ましくは、免疫原担体物質が牛血清アルブミン（BS
A）、keyhole limpetヘモシアニン（KLH）、チログロ
ブリンなどの蛋白質である。
好ましい免疫原において、Ｐは牛血清アルブミン（BS
A）であり、Ｘは−NH（CH2）5C（＝Ｏ）−である。この
好ましい免疫原を以下に示す。
最も好ましいチロキシン免疫原は、式３のＬ異性体で
ある。式２および３は、当業者であれば理解されるよう
に、チロキシンと免疫原担体との1:1抱合体に限らな
い。チロキシン誘導体と免疫原担体との比は免疫原担体
の化学的に利用可能な官能基の数により規定され、合成
中の２個の物質の比率により制御される。Ｐ上のチロキ
シン誘導体による置換度は、免疫原担体上の利用可能な
官能基の１〜100％の間で変わり得る。置換レベルは、
好ましくは10〜95％であり、より好ましくは15〜85％で
ある。
本発明の標識化試薬は、下記一般式： ［式中、Ｑは検出可能な部分、好ましくは蛍光部分であ
り、Ｗは結合部分である。］を有する。好ましい標識化
試薬では、Ｑが、4'−アミノメチルフルオレセン、５−
アミノメチルフルオレセン、６−アミノメチルフルオレ
セン、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボキシフ
ルオレセン、５−および６−アミノフルオレセン、チオ
ウレアフルオレセンならびにメトキシトリアジノリル−
アミノフルオレセンから成る群から選択されるフルオレ
セン誘導体である。Ｗは、好ましくは直鎖もしくは分岐
鎖、または環式あるいはそれらの組み合わせで配列し
た、飽和または不飽和の、０〜50個の炭素原子およびヘ
テロ原子（ヘテロ原子は10個以下）から成る結合部分で
あるが、ただし（１）ヘテロ原子が直接結合するのは２
個までであり、（２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことが
できず、（３）環式部分は６員環か、それより小さく、
（４）分岐は炭素原子上にのみある。ヘテロ原子として
は、窒素、酸素、硫黄およびリンが挙げられる。Ｗの特
定の化学構造は、式２のＸの構造と同じでも異なってい
てもよい。Ｗの例としては、アルキレン、アラルキレン
およびアルキレン置換シクロアルキレン基が挙げられ
る。なお、ここでの定義によれば、Ｗは０でもよい。す
なわち、この場合、炭素およびヘテロ原子は０である。
Ｗ＝０の場合、結合部分は存在しない。これは、Ｑが式
４のチロキシン誘導体に直接結合することを示す。
好ましい標識化試薬は、下記式を有する。
最も好ましい標識化試薬は、式５のＬ異性体である。
式５の５−メチル置換フルオレセン誘導体の製造法の例
は、米国特許出願No.859,775（P.G.Mattingly、1992年
３月30日出願、「５（６）−メチル置換フルオレセン誘
導体」）に開示されている。
本発明は驚くべき特徴を有する。特異的抗体および相
補的な標識化ハプテン（標識化試薬）を製造する場合、
抗体反応を励起するために使用する免疫原および標識化
ハプテンの両方の化学構造を考慮する必要があることは
当業者であれば周知である。伝統的には、ハプテンを、
選択的抗体の達成に必須なハプテンのユニークな基から
遠く離れた部位で担体蛋白質に結合する。同様に、その
ような抗体に結合可能な標識化ハプテンを製造する場合
は、担体蛋白質の場合と同様の部位で標識をハプテンに
結合するのが通例である。そのような方法を行う理由
は、免疫系がハプテンのその部分に接近するのを担体蛋
白質が立体的に阻害する可能性があるからである。通
常、相補的な標識化ハプテンは、その標識を、ハプテン
の、免疫原がその担体蛋白質の結合に使用する部位と同
じ部位に結合することにより合成し、抗体がハプテンの
決定基に結合するのを妨害しないようにする。
従って、チロキシン上の異なる結合部位から誘導され
た本発明のチロキシン免疫原および標識化チロキシンに
より、チロキシンに特異的な抗体およびチロキシンの定
量化が改善された優れた測定法が開発されることは驚く
べきことであり、予期しなかったことである。
特に、本発明では、チロキシンのカルボン酸末端を介
して担体蛋白質に結合したチロキシン分子から免疫原を
製造したが、標識化チロキシン試薬は、標識をチロキシ
ンのアミノ末端で結合することにより製造した。
さらに、「発明の背景」で述べたように、Wangらの特
許およびFinoらの特許は、カルボキシフルオレセンがチ
ロキシンのアミノ基にアミド結合により直接結合してい
る抱合体を提示している。本発明では、検出可能な部分
がＮ−カルボキシメチル−Ｌ−チロキシンに結合部分を
介して結合しており、チロキシンの最初のアミノ基は第
二アミンであってアミドではない。さらに、Wangらの特
許およびFinoらの特許と違って、本発明の合成法は、直
交保護基を多用して所望の構造を得るために、チロキシ
ンの多段処理を必要とする。
免疫原の合成 免疫原の一般構造は図２［式中、Ｘは結合部分であ
り、Ｐは免疫原担体である。］に示す通りである。式２
の免疫原は、下記反応式に従って得ることができる。
Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシン（Ｉ）を、当業者には
周知の方法に従って、二官能性リンカー:v−Ｘ−ｙ［式
中、ｖ−および−ｙは官能基であり、一方は、Ｎ−アセ
チル−Ｌ−チロキシン（Ｉ）のカルボキシレートと反応
し、他方は、Ｐ上の化学的に利用できる官能基と反応す
る。］と結合させる。Ｘは結合部分である。当業者には
多くの二官能性リンカーが周知である。例えば、ヘテロ
二官能性リンカーは、米国特許No.5,002,883（Bieniarz
ら）に記載されている。これらのヘテロ二官能性リンカ
ーは、それらの末端の一方の官能基または他方の官能基
に対する特異性により、好ましい場合もある。同様に、
合成の便利さから、当業者には周知の、官能基ｖ−およ
び−ｙが保護された形を使用して、所望のときに保護基
を脱離してもよい（例えば、T.W.Greene and P.G.M.Wut
ts,Protective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.1
991,John Wiley and Sons参照）。
一般に、本発明の免疫原の合成では、ｖが−OH、−ハ
ロゲン（例えば、−Cl、−Br、−Ｉ）、−SHおよび−NH
R'−から成る群から選択される。R'は、Ｈ、アルキル、
アリール、置換アルキルおよび置換アリールから選択さ
れる。ｙは、ヒドロキシ（−OH）、カルボキシ（−Ｃ
（＝Ｏ）OH）、アミノ（−NH2）、アルデヒド（−CH
（＝Ｏ））およびアジド（−N3）から成る群から選択さ
れる。Ｘは、好ましくは直鎖もしくは分岐鎖、または環
式あるいはそれらの組み合わせで配列した、飽和または
不飽和の、０〜50個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテ
ロ原子は10個以下）から成る結合部分であるが、ただし
（１）ヘテロ原子が直接結合するのは２個までであり、
（２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことができず、（３）
環式部分は６員環か、それより小さく、（４）分岐は炭
素原子上にのみある。ヘテロ原子としては、窒素、酸
素、硫黄およびリンが挙げられる。Ｘの例としては、ア
ルキレン、アラルキレンおよびアルキレン置換シクロア
ルキレン基が挙げられる。なお、ここでの定義によれ
ば、Ｘは０であってもよい。すなわち、炭素およびヘテ
ロ原子が０である。Ｘ＝０であれば、結合部分が存在し
ないことになり、これは、Ｐが式２のチロキシン誘導体
に直接結合することを示す。
Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシン（５）とｖ−Ｘ−ｙと
の反応により、官能基ｙを伴う結合部分Ｘを有するつな
がれた中間化合物（II）が得られる。官能基−ｙは、当
業者に周知のいくつかの方法のいずれかにより、免疫原
担体上の官能基と反応させることができる。アミド結合
を形成すると好ましいことが多く、これは、典型的にか
なり安定である。アミド結合は、まず、スペーサーアー
ムのカルボン酸部分〔ｙ＝Ｃ（＝Ｏ）OH）〕を、1,3−
ジシクロヘキシルカルボジイミドなどの活性化試薬およ
びＮ−ヒドロキシスクシンイミドなどの添加剤と反応さ
せることにより活性化して形成する。活性型は、次い
で、免疫原担体物質を含む緩衝溶液と反応させる。ある
いは、カルボン酸基を、単離はしてもしなくてもよい
が、かなり反応性の高い混合無水物、ハロゲン化アシ
ル、イミダゾールアシルまたは混合炭酸塩に変換した
後、免疫原担体物質と結合してもよい。当業者であれ
ば、上記以外のアミド結合を形成するのに使用できる多
くの試薬があることが認められる。
末端アミン（ｙ＝−NH2）官能基を有するスペーサー
アームは、アセトニトリルまたはジメチルホルムアミド
などの適当な溶媒中で、炭酸N,N'−ジスクシンイミジル
との反応により、反応性の高いＮ−ヒドロキシスクシン
イミドウレタンに変換することができる。得られたウレ
タンは、次いで、緩衝水溶液中で免疫原担体物質と反応
させて免疫原を得る。
末端アルデヒド官能基〔ｙ＝−CH（＝Ｏ）〕を有する
スペーサーアームは、当業者には公知の方法による還元
的アミノ化により、シアノホウ水素化ナトリウムの存在
下、緩衝水溶液中で免疫原担体物質に結合することがで
きる。
あるいは、アルコール基〔ｙ＝−OH〕を含むスペーサ
ーアームは、最初にホスゲンまたはホスゲンと同等の物
質（ジもしくはトリホスゲンまたはカルボニルジイミダ
ゾールなど）と反応させて反応性の高いクロロギ酸エス
テル誘導体またはイミダゾールギ酸エステル誘導体を生
成する（通常は単離しない）ことにより免疫原担体物質
に結合することができる。ついで、その結果得られる活
性ギ酸エステルを緩衝水溶液中で免疫原担体物質と反応
させて免疫原を得る。
あるいは、ｙ＝−N3の場合、つながれた中間体は緩衝
水溶液中での光分解によりＰに結合することができる。
すなわち、式３の好ましい免疫原は、図１の反応式に
従って合成される。Ｌ−チロキシン（１）のナトリウム
塩は、Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシン（５）に変換され
る。Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシン（５）のカルボキシ
ル基は、ジシクロヘキシルカルボジイミドおよびＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミドによって活性化される（括弧内
の数字は、図１で使用される構造式に対応する。）。さ
らにリンカーの６−アミノカプロン酸〔ｖ＝−NH2,X＝
−（CH2）５−,y＝−CO2H〕と反応させると、つながれ
た中間体〔6,X＝−（CH2）５−,y＝−CO2H〕が得られ
る。次いで、ｙ−基をジシクロヘキシルカルボジイミド
およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化してＰに
結合する。当業者であればわかるように、ペプチド結合
を生成するための他の方法も同様に使用することができ
る。
免疫原と同様の方法で、スペーサーアームを、その反
応基と相補的に反応するアミノ基、水酸基またはカルボ
キシル基などの官能基を有する固体支持体に結合するこ
とができる。その結果、ハプテンに対する抗体を分離ま
たは精製するために使用できる固相となる。
すなわち、上記チロキシン誘導体は、公知の種々の常
法により免疫原担体物質Ｐに結合することができる。
抗体の産生 本発明に係る免疫原を使用し、周知の方法に従って、
本発明に係る免疫測定系に使用するための抗体（ポリク
ローナルおよびモノクローナルの両方）を作る。一般
に、ウサギ、ヤギ、マウス、モルモットまたはウマなど
の宿主動物に、１か所以上の種々の部位で、免疫原（通
常はアジュバントとの混合物）を注入する。さにら、同
じ部位または異なる部位で規則的または不規則的に注入
を行い、最適力価に達したと決定されるまで出血を行っ
て抗体力価を評価する。抗体は、宿主動物を出血させて
ある量の抗血清を得るか、体細胞雑種形成法または他の
公知方法によりモノクローナル抗体を得ることにより得
られ、例えば−20℃で保存することができる。本明細書
での抗体は、全免疫グロブリンの他に、免疫グロブリン
の抗原結合断片を含む。これらの断片の例としては、Fa
b、Ｆ（ab'）２およびFvがある。そのような断片は、公
知方法により得ることができる。
実施例４からわかるように、市販のT4トレーサーを本
発明の標識化試薬のみで置き換えると、チロキシン分析
の性能が改善される。すなわち、その分析法またはキッ
トでは、本発明の標識化試薬を、チロキシンおよび標識
化試薬の両方を認識する抗体（ポリクローナルまたはモ
ノクローナル）（好ましくは、式２および３の免疫原に
よって高められる抗体）とともに使用することができ
る。さらに、FPIAなどの競合的イムノアッセイの実施を
可能にするには、トレーサーおよびチロキシンが抗体に
競合的に結合できなければならない。抗体はチロキシン
の両方の異性体に結合可能であるけれども、テスト試料
はほとんどが生物学的試料であるため、抗体は、好まし
くはＬ−チロキシンに結合するのが好ましい。同様に、
免疫原はＬ−チロキシンの誘導体または類似体が好まし
い。標識化試薬は、テスト試料に存在する可能性がある
内因性の免疫グロブリン、すなわち、標識化試薬と結合
する予定の抗体ではないので、結合すると測定の正確さ
を妨害する抗体に結合しないか、実質的に結合しないの
が好ましい。下記実施例４において、これらの免疫グロ
ブリンは免疫グロブリンＧ（IgG）である。
標識化試薬の合成 下記に本発明の標識化試薬の合成法を記載する。これ
らの標識化試薬は、チロキシンから、（ａ）チロキシン
のカルボン酸、α−アミノ基およびフェノール基を特異
的に保護し（例えば、T.W.Greene and P.G.M.Wutts,Pro
tective Groups in Organic Synthesis,2nd ed.1991,Jo
hn Wiley and Sonsに記載の方法に従う）、次いで
（ｂ）チロキシン誘導体のα−アミノ基の保護基を選択
的に脱離し、次いで（ｃ）α−アミノ基を選択的にカル
ボアルコキシメチル化し、次いで（ｄ）チロキシン誘導
体のα−Ｎ−カルボキシメチル基およびフェノール基の
保護基を選択的に脱離し、次いで（ｅ）α−Ｎ−カルボ
キシメチル基を活性化し、次いで（ｆ）チロキシン誘導
体の活性化α−Ｎ−カルボキシメチル基を二官能性結合
部分と結合し、次いで（ｇ）検出可能な部分と結合し、
最後に（ｈ）標識化試薬のカルボン酸基の保護基を脱離
することにより合成できる。また、当業者であれば、工
程ｆおよびｇは一緒にすることができ、工程ｅのチロキ
シン誘導体に結合する前に検出可能な部分を二官能性結
合部分に結合することができることが理解されるであろ
う。
さらに詳細には、標識化試薬は、（ａ）（ｉ）チロキ
シンのナトリウム塩を塩化９−フルオレニルメトキシカ
ルボニル（FMOC−Cl）と反応させてアミノ基を保護した
後、（ii）得られたチロキシン誘導体のフェノール官能
基をアセチル化により保護し、次いで（iii）Ｎ−FMOC
−Ｏ−アセチル−チロキシンのカルボキシル基を保護し
てｔ−ブチルエステルとし、次いで（ｂ）FMOC保護基を
脱離してｔ−ブチル−Ｏ−アセチルチロキシンとし、次
いで（ｃ）ｔ−ブチル−Ｏ−アセチル−チロキシンのア
ミノ基をブロモ酢酸エチルエステルでアルキル化してｔ
−ブチル−Ｏ−アセチル−Ｎ−カルボエトキシメチルチ
ロキシンとし、次いで（ｄ）ｔ−ブチル−Ｏ−アセチル
−Ｎ−カルボエトキシメチルチロキシンのエチルエステ
ル基およびアセチル基を水酸化ナトリウム／メタノール
で加水分解し、１工程でｔ−ブチルＮ−カルボキシメチ
ル−チロキシンを得て、（ｅ）ｔ−ブチルＮ−カルボキ
シメチル−チロキシンをジシクロヘキシルカルボジイミ
ドおよびＮ−ヒドロキシスクシンイミドで活性化し、次
いで（ｆ）チロキシン誘導体を５−アミノメチルフルオ
レセンと反応させてｔ−ブチルＮ−（５−カルボキサミ
ドメチルフルオレセイニルメチル）チロキシンとし、次
いで（ｇ）ｔ−ブチルエステルをトリフルオロ酢酸によ
り加水分解して標識化試薬を得ることにより合成でき
る。この方法は、図２に示す好ましい標識化試薬の合成
で例示する。
好ましくは、上記合成方法を使用して、式４および５
の標識化試薬、より好ましくはこれらの式のＬ構造を作
る。
蛍光偏光イムノアッセイを利用するチロキシン測定法 テスト試料中のチロキシンの濃度またはレベルは、本
発明の試薬を使用して、蛍光偏光イムノアッセイ（FPI
A）で正確に定量できる。チロキシンを特異的に定量す
るためにFPIAを行うには、既知量のチロキシンを使用し
た検量線を作って試料中のチロキシンを測定する。
本発明によれば、予期せぬことに、また驚いたこと
に、式５の蛍光性の標識化試薬（またはトレーサー）の
Ｌ−異性体を使用すると、チロキシンの定量化のための
蛍光偏光イムノアッセイによる優れた測定結果が得られ
ることが見出された。
特に、予期せぬことに、また驚いたことに、この標識
化試薬の使用が矛盾した結果の回避に重要であることが
わかった。このことは、チロキシンの特異的定量化に対
して、市販のAbbott T4測定法よりも有利であることを
示す。より一般的には、トレーサーを式４のものにする
ことができる。本明細書に記載したチロキシンの特異的
定量化のための蛍光偏光イムノアッセイを行う場合、ト
レーサーの検出可能な部分の成分は、フルオレセン、ア
ミノフルオレセン、カルボキシフルオレセンなどの蛍光
性部分であり、好ましくは、５−および６−アミノメチ
ルフルオレセン、５−および６−アミノフルオレセン、
６−カルボキシフルオレセン、５−カルボキシフルオレ
セン、チオウレアフルオレセンおよびメトキシトリアジ
ノリル−アミノフルオレセンならびに同様の蛍光性誘導
体である。蛍光性のトレーサーは、トレーサーおよびT4
の両方に結合可能な抗体と組み合わせて使用することが
できる。競合的イムノアッセイの場合は、トレーサーお
よびT4が抗体に競合的に結合可能でなければならない。
チロキシンの定量化の場合、抗体試薬は、チロキシンに
結合可能であるか、チロキシンを認識することができる
抗体を含み、その抗体は、好ましくは式２の免疫原、よ
り好ましくは式３の免疫原により産生される。
抗体に結合するトレーサーの量は、テスト試料に存在
するチロキシンの量とは逆に変化する。従って、チロキ
シンおよびトレーサーの抗体結合部位に対する相対的結
合親和性がその測定系の重要なパラメータである。
一般に、蛍光偏光法は、蛍光性トレーサーが固有波長
の平面偏光で励起されると、別の固有波長の光（すなわ
ち、蛍光）を放射するという原理に基づき、与えられた
媒体におけるトレーサーの回転速度に逆比例する、入射
刺激光に関する偏光度が保持される。この性質のため
に、粘性溶液相中または比較的回転速度の遅い抗体など
の別の溶液成分に結合した場合など、回転が抑制された
トレーサー物質では、束縛のない溶液の場合より、放射
光の比較的大きい偏光度が保持される。
本発明に係るチロキシンの特異的定量化のための蛍光
偏光イムノアッセイを行う場合、チロキシンを含むと考
えられるテスト試料を、本発明に係る免疫原により産生
される抗血清またはモノクローナル抗体と、本発明に係
る免疫原により産生される抗血清またはモノクローナル
抗体の存在に対して検出可能な蛍光偏光反応を生じ得る
本発明の標識化試薬の存在下で接触させる。次いで、平
面偏光を溶液に通して蛍光偏光反応を得、その反応をテ
スト試料に存在するチロキシンの量の尺度として検出す
る。
本発明のチロキシン誘導体を通常の担体物質と結合さ
せて免疫原を合成し、次いで、それを使用して抗体を得
る。また、本発明のチロキシン誘導体を使用すると、テ
スト試料中のチロキシンを定量化するためのイムノアッ
セイにおいて検出試薬となる標識化試薬を合成すること
ができる。
蛍光偏光測定法は、IMX、TDXおよびTDXFLX TM（本出願
人）などの市販の自動装置で行うことができる。
他の測定形式 蛍光偏光測定法の他にも、他の種々の免疫測定法に従
って本発明に係るチロキシンの定量化を行うことができ
る。そのような免疫測定法としては競合的測定法および
サンドイッチ測定法があるが、これらに限定されない。
一般に、そのような免疫測定系は、免疫グロブリン（す
なわち、全抗体またはその断片）がテスト試料の特定の
分析物に結合できるかどうかに依存し、本発明の抗体ま
たはその断片が標識化試薬の標識または検出可能な部分
に結合した標識化試薬を使用して結合の程度を測定す
る。そのような標識または検出可能な部分としては、酵
素、放射性標識、ビオチン、毒素、薬物、ハプテン、DN
A、RNA、リポゾーム、発色団、化学ルミネセンス、着色
粒子および着色微粒子、蛍光性化合物（アミノメチルフ
ルオレセン、５−カルボキシフルオレセン、６−カルボ
キシフルオレセン、アミノフルオレセン、チオウレアフ
ルオレセンおよびメトキシトリアジノリル−アミノフル
オレセンなど）、ならびに蛍光性誘導体が挙げられる
が、これらに限定されない。
典型的には、そのような免疫測定系での結合の程度
は、標識化合物試薬に存在する検出可能な部分（分析物
との結合反応に関与した、または関与しなかった部分）
の量によって決定され，検出・測定される検出可能な部
分の量は、テスト試料に存在する分析物の量と関連させ
ることができる。例えば、競合的イムノアッセイ系で
は、測定される物質（リガンドということが多い。）が
検出可能な部分を伴う構造的に密接に類似した物質（ト
レーサーということが多い。）と、リガンドおよび構造
的に類似したトレーサーのその部分に特異的な抗体上の
限られた結合部位を競合する。これらの結合部位は通
常、該抗体を産生するために使用される免疫原と共有さ
れる。
テストキット 本発明に係るテストキットは、テスト試料中のチロキ
シンを定量するための本発明にかかる所望の特異的蛍光
偏光イムノアッセイを行うのに必要な必須試薬全部を含
む。テストキットは、市販のパッケージ型に入れて、必
要な試薬を含む１個以上の容器の組み合わせとして提供
され、試薬の相溶性によっては組成物または混合物とし
て提供される。
特に好ましいのは、上述した、チロキシンの定量化の
ための蛍光性トレーサー化合物および抗体を含む、テス
ト試料中のチロキシンの蛍光偏光イムノアッセイによる
定量化のためのテストキットである。なお、テストキッ
トはもちろん、公知で、使用者の観点から好ましいと考
えられる、緩衝液、希釈剤、標準物質などの他の物質を
含むことができる。
次に、本発明を下記実施例により説明するが、本発明
は下記実施例により限定されない。実施例１および２に
おいて、括弧内に示す数字は、各々、図１および２で使
用した構造式に対応する。
実施例１ Ｌ−チロキシン免疫原（７）の合成 略号:EtOH＝エタノール、NH4OH＝水酸化アンモニウ
ム、HCl＝塩酸、DMF＝ジメチルホルムアミド、NaOH＝水
酸化ナトリウム、THF＝テトラヒドロフラン、CH2Cl2＝
塩化メチレン、MeOH＝メタノール、HOAc＝酢酸 Ｌ−チロキシン ナトリウム塩・５水和物（１）（10
g、11ミリモル）を400mlのEtOH/2NNH4OH（1/1、v/v）に
ほぼ完全に溶解し、濾過し、濾液を425mlの５％HClに注
入した。得られた析出物を真空濾過により単離し、高真
空下で乾燥すると白色固体が得られた。この物質を160m
lのDMFに溶解し、100ml（1.06モル）の無水酢酸を添加
し、反応物を1.5時間攪拌した後、850mlのH2Oで希釈
し、４℃で16時間放置した。得られた析出物を濾過によ
り単離した後、350mlのEtOHおよび41mlの1N NaOHに溶
解し、2.5時間攪拌し、680mlの５％HClを添加し、その
混合物を４℃で16時間放置した。得られた析出物を真空
濾過により単離し、高真空下で乾燥すると、所望のＮ−
アセチル−Ｌ−チロキシン（５）が白色固体として8.1g
（90％）得られた。1HNMR（200MHz,CD3OD）δ7.8（s,2
H）、7.1（s,2H）、4.6〜4.7（m,1H）、2.8〜3.0（m,2
H）、2.0（s,3H）；マススペクトル（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+
820。
Ｎ−アセチル−Ｌ−チロキシン（５）（1.0g,1.2ミリ
モル）を50mlのTHFに溶解し、170mg（1.5ミリモル）の
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを添加し、300mg（1.5ミ
リモル）の1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミドを添
加して、反応物を窒素雰囲気下で３日間攪拌した。次い
で、反応物を真空濾過して不溶尿素を除去すると、40ml
の濾液が得られた。半分の濾液（20ml、0.6ミリモル）
を80mg（0.6ミリモル）の６−アミノカプロン酸と一緒
にし、反応物のpHをトリエチルアミンで９に調整して、
反応物を窒素雰囲気下で２日間攪拌した。次いで、溶媒
を真空除去し、粗生成物をシリカゲルChromatotron（Ha
rrison Research,Palo Alto,CA）上でCH2Cl2/MeOH/HOAc
（90/10/0.2,v/v）により溶離して精製すると、所望の
物質（６）黄色油状物として300mg（54％）得られた。
マススペクトル（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+933。
その酸（６）（300mg,0.322ミリモル）を25mlのTHFに
溶解し、45mg（0.39ミリモル）のＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミドを添加し、80mg（0.39ミリモル）の1,3−ジシ
クロヘキシルカルボジイミドを添加して、反応混合物を
窒素雰囲気下で16時間攪拌した。次いで、反応物を真空
濾過して不溶尿素を除去すると、16mlの濾液が得られ
た。次いで、250mg（0.0037ミリモル）の牛血清アルブ
ミンを10mlの0.05Mリン酸ナトリウム（pH＝8.0）および
10mlのDMFに溶解した溶液を攪拌し、これに4ml（0.08ミ
リモル）の濾液を添加した。反応物を３日間攪拌した
後、４の0.05Mリン酸ナトリウム（pH＝8.0）に対して
24時間、次いで４のH2Oに対して24時間透析し、凍結
乾燥すると、所望のＬ−チロキシン免疫原（７）が297m
g得られた。
実施例２ Ｌ−チロキシントレーサー（４）の合成 略号:THF＝テトラヒドロフラン、EtOAc＝酢酸エチ
ル、DMSO＝ジメチルスルホキシド、CHCl3＝クロロホル
ム、CH2Cl2＝塩化メチレン、MeOH＝メタノール、HOAc＝
酢酸、Hex＝ヘキサン、DMF＝ジメチルホルムアミド 炭酸ナトリウム（7.85g,74.1ミリモル）を480mlのH2O
に溶解し、480mlのTHFを添加し、22.0g（24.7ミリモ
ル）のＬ−チロキシン ナトリウム塩・５水和物（１）
を添加し、7.04g（27.2ミリモル）のクロロギ酸９−フ
ルオレニルメチルを添加し、反応物を30分間攪拌した。
次いで、反応物を170mlの1MHClで希釈し、EtOAc（３×7
00ml）で抽出した。EtOAc抽出物を一緒にしてNa2SO4で
脱水し、溶媒を真空除去すると、所望のＮ−FMOC生成物
がベージュ色の固体として26.3g得られた。1HNMR（300M
Hz,DMSO−D6）δ9.29（s,1H）、7.08〜7.89（m,12H）、
4.19〜4.29（m,4H）、3.06〜3.16（m,1H）、2.82（t,1
H）；マススペクトル（FAB）（Ｍ−Ｈ＋Na）+1021。
Ｎ−FMOCで保護したＬ−チロキシン（26.3g,23.2ミリ
モル）を150mlのTHFに溶解し、3.28ml（34.8ミリモル）
の無水酢酸を添加し、283mg（2.32ミリモル）の４−ジ
メチルアミノピリジンを添加し、反応物を窒素雰囲気下
で45分間攪拌した後、400mlのH2Oに注入してCHCl3（３
×400ml）で抽出した。CHCl3抽出物を一緒にしてNa2SO4
で脱水し、溶媒を真空除去した。次いで、残渣をシリカ
ゲルクロマトグラフィー（溶離液:CH2Cl2/MeOH/HOAc（9
0/10/0.4,v/v））で精製すると、所望のＯ−アセチルチ
ロキシンがベージュ色の固体として21.95g（91％）得ら
れた。1HNMR（300MHz,DMSO−D6）δ7.12〜7.91（m,12
H）、4.07〜4.31（m,4H）、3.07〜3.19（m,1H）、2.82
（t,1H）、2.29〜2.40（m,3H）；マススペクトル（FA
B）（Ｍ＋Ｈ）+1042。
Ｎ−FMOC,O−アセチルＬ−チロキシン（21.70g,19.17
ミリモル）を250mlのCH2Cl2に溶解し、０℃に冷却し、1
9.20g（95.85ミリモル）のＯ−ｔ−ブチル−N,N'−ジイ
ソプロピルイソウレア/CH2Cl2（50ml）を滴下した。次
いで、反応物を窒素雰囲気下、室温で一夜攪拌した後、
真空濾過して不溶不純物を除去し、濾液溶媒を真空除去
した。得られた残渣を300mlのEtOAc/Hex（40/60,v/v）
中で４時間攪拌し、真空濾過して不溶不純物を除去し、
濾液溶媒を真空除去した。次いで、残渣をシリカゲルク
ロマトグラフィー（溶離液:EtOAc/Hex（40/60,v/v））
で精製すると、所望のｔ−ブチルエステル（２）がベー
ジュ色の固体として9.64g（46％）得られた。1HNMR（30
0MHz,CDCl3）δ7.18〜7.82（m,12H）、4.21〜4.57（m,4
H）、3.05（s,2H）、2.39（s,3H）、1.33〜1.54（m,9
H）；マススペクトル（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+1098。
Ｎ−FMOC,O−アセテートＬ−チロキシンｔ−ブチルエ
ステル（２）（9.59g,8.04ミリモル）を40mlのDMFに溶
解し、1.12ml（8.04ミリモル）のトリエチルアミンを添
加し、反応物を窒素雰囲気下で一夜攪拌した。次いで、
1.78ml（16.1ミリモル）のブロモ酢酸エチルを添加した
後、さらに1.12ml（8.04ミリモル）のトリエチルアミン
を添加し、反応物を窒素雰囲気下でさらに２時間攪拌し
た後、200mlのH2Oに注入してEtOAc（３×200ml）で抽出
した。EtOAc抽出物を一緒にしてMgSO4で脱水し、溶媒を
真空除去した。得られた油状物を最初にシリカゲルクロ
マトグラフィー（溶離液:EtOAc/Hex（40/60,v/v））で
精製し、次いで分離用シリカゲルHPLC（溶離液:EtOAc/H
ex（20/80,v/v））で精製すると、所望のＮ−カルボキ
シメチル エチルエステル誘導体が白色固体として3.77
g（49％）得られた。1HNMR（300MHz,CDCl3）δ7.75（s,
2H）、7.19（s,2H）、4.20（q,2H）、3.39〜3.49（m,3
H）、2.80〜2.98（m,2H）、2.39（s,3H）、1.42（s,9
H）、1.27（t,3H）；マススペクトル（FAB）（Ｍ＋Ｈ）
+962。
エチルエステル中間体（3.73g,3.88ミリモル）を85ml
のMeOHに溶解し、12.4ml（31ミリモル）の10％水酸化ナ
トリウムを添加し、反応物を40分間攪拌した。次いで、
反応物を250mlのH2Oに注入し、pHを1MHClで４に調整
し、EtOAc（３×250ml）で抽出した。EtOAc抽出物を一
緒にしてMgSO4で脱水し、溶媒を真空除去すると、所望
の物質（３）が白色固体として3.29g（95％）得られ
た。1HNMR（300MHz,DMSO−D6）δ7.81（s,2H）、7.07
（s,2H）,3.52（t,1H）、3.32（s,2H）、2.89〜2.98
（m,1H）、2.20〜2.31（m,1H）、1.32（s,9H）；マスス
ペクトル（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+892。
遊離酸（３）（1.78g,2.00ミリモル）を20mlのDMFに
溶解し、230mg（2.00ミリモル）のＮ−ヒドロキシスク
シンイミドを添加し、413mg（2.00ミリモル）の1,3−ジ
シクロヘキシルカルボジイミドを添加し、反応物を窒素
雰囲気下で16時間攪拌した。次いで、反応物を真空濾過
し、濾液を884mg（2.00ミリモル）の５−アミノメチル
フルオレセン臭化水素酸塩および1.8ml（13ミリモル）
のトリエチルアミンと一緒にして、反応物を窒素雰囲気
下、暗所で16時間攪拌した後、溶媒を真空除去した。残
渣を分離用逆相C18HPLC（溶離液:H2O/MeOH/HOAc（25/75
/0.4（v/v））で精製すると、所望のｔ−ブチルエステ
ルで保護されたトレーサーが橙色の固体として1.51g（6
1％）得られた。1HNMR（300MHz,DMSO−D6）δ10.13（s,
2H）、9.29（s,1H）、8.43（t,1H）、7.85（s,1H）、7.
83（s,2H）、7.68（δ,1H）、7.12〜7.28（m,2H）、7.0
7（s,2H）、6.68（s,2H）、6.54（s,4H）、4.36〜4.61
（m,2H）、3.26〜3.50（m,3H）、2.94〜3.04（m,1H）、
2.71〜2.82（m,1H）、1.33（s,9H）；マススペクトル
（FAB）（Ｍ）+1234。
ｔ−ブチルエステルトレーサー（1.464g,1.19ミリモ
ル）を30mlのCH2Cl2/トリフルオロ酢酸（1/1,v/v）に溶
解し、５時間攪拌し、溶媒を真空除去した。粗生成物を
分離用逆相C18HPLC（溶離液:H2O/MeOH/HOAc（25/75/0.4
（v/v））で精製すると、所望のＬ−チロキシントレー
サー（４）が橙色の固体として1.01g（72％）得られ
た。1HNMR（300MHz,DMSO−D6）δ10.0〜10.3（bs,2
H）、8.31（t,1H）、7.86（s,2H）、7.83（s,1H）、7.6
4（d,1H）、7.15〜7.30（m,2H）、7.08（s,2H）、6.68
（s,2H）、6.55（s,4H）、4.31〜4.59（m,2H）、3.28〜
3.55（m,3H）、2.82〜2.99（m,2H）；マススペクトル
（FAB）（Ｍ＋Ｈ）+1179。
実施例３ 抗体の産生 免疫感作 生理的緩衝食塩水（カタログ番号：＃NDC 007−7983
−02,本出願人）に実施例１で記載した1.0mgの凍結乾燥
免疫原を含むスラリー混合物2mlを、製造者が提供する
バイアルに含まれているMPL＋TDMアジュバント溶液（カ
タログ番号：＃Ｒ−700,RIBI Immunochem Research,In
c.,Hamilton MT）に添加し、３分間激しく攪拌した。BC
F1系マウス（Jackson Laboratories,Bar Harbor,Main
e）15匹の各々に、0.1mlの注射液を与えて、皮下および
腹腔内の間に等しく分散させた。この免疫感作を２週間
ごとに繰り返して全部で４回追加免疫を行った後、２週
間後に血清サンプルを採取した。その血液を室温で２時
間インキュベートした後、血清を取り出して、−20℃以
下で保存した。
血清の評価 血清試料を市販のT4試薬パックを使用してTD X装置
（共に、本出願人製品）によりテストし、TD X T4試薬
パック（カタログコードNo.97608,本出願人）の市販のT
D X T4トレーサーに結合可能な抗体の量を蛍光偏光測定
法で測定した。スクリーニング試験は、市販のT4試薬パ
ックのT4抗体を市販のTD X希釈剤（本出願人）で置き換
えた他は、市販のTD X T4測定法の取扱説明書に記載の
ものと本質的に同じであった。テストすべき血清試料を
TD X試料台のカートリッジの試料用ウェルに加えた。血
清試料を、TD X試料台の試料用ウェルにおいて、log2の
希釈度で滴定した。９匹のマウスが市販のTD X T4トレ
ーサーに結合する抗体を産生した。非免疫感作マウス
（カタログ番号：＃5011−1380、凍結乾燥した正常マウ
ス血清、Cappel,Dunham,NC）の滴定した正常マウス血清
コントロールよりもNetP（すなわち、正味の偏光）が60
〜80mP（「mP」は「ミリ偏光」を示す。）だけ大きい、
動物＃12と指定した１匹の動物を選択した。
融合 ５か月間休息させた後、融合の３日前に、動物＃12に
25μg/mlの前融合ブースターを静脈内投与した。融合の
日に、その動物を屠殺し、脾臓細胞をIscoveの改良ダル
ベッコ培地（IMDM）（GIBCO,Grand Island,New York）
中で１回洗浄し、1000rpmで10分間遠心分離にかけた。
ペレット状の脾臓細胞をSP2/0ミエローマ細胞（Dr.Mils
tein研究室からの提供、Cambridge,United Kingdom）と
1:3の比で合わせ、IMDM中で洗浄して遠心分離にかけ
た。上清を除き、ペレットを、とんとん叩いて渦を巻か
せることにより静かに分散させながら、1mlの50％PEG
（ポリエチレングリコール）（American Type Culture
Collection,Rockville,Maryland）をペレットに１分間
添加した。30mlのIMDMをその混合物に添加し、前述した
ように遠心分離にかけた。上清をデカントし、ペレット
をHAT（ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン）
（GIBCO）、10％FBS（牛胎児血清）（Hyclone,Logan,Ut
ah）および１％STM v/v（RIBI Immunochem Research,
Inc.）とともにIMDMに再懸濁した。STMは、Salmonella
typhimuriumミトゲンを示す。STM溶液をＢ−細胞ミトゲ
ンとして添加した。融合細胞懸濁物を96ウェルの細胞培
養プレートにプレーティングした。
第一融合スクリーニング 融合の第一スクリーニングは、集密的培養の12日目に
行った。Screen Machine（IDEXX,Portland,Maine）によ
る蛍光濃縮粒子イムノアッセイ（FCPIA）では、ヤギ抗
マウスミクロ粒子を使用して、上清のハイブリッドから
分泌されるマウス抗体を捕獲する。市販のAbbott T4ト
レーサー（TDx T4測定法試薬パック、本出願人）を添加
してT4反応性（すなわち、T4に結合する）抗体を同定し
た。ハイブリッド＃１−189の相対的蛍光強度は、負の
コントロール（カタログ番号：＃5011−1380、乾燥凍結
した正常なマウス血清、Cappel,Dunham,NC）の３倍であ
り、さらに評価してクローニングするための候補として
選択した。
ハイブリッドクローニング ハイブリッド＃１−189を96ウェルの融合プレートか
ら限界希釈法（１−100でスタート,10倍ずつ106まで）
により直接クローン化した。使用したクローン用培地
は、10％v/vFBSおよび１％v/vHT（ヒポキサンチンチミ
ジン）Supplement（GIBCO）を有するIMDMであった。100
μｌの細胞懸濁物を細胞培養プレートの96ウェルの各々
に添加した。７日目にプレートに200μl/ウェルのクロ
ーン用培地を供給した。
クローンの選択 上記の「血清の評価」の項の改良TDx T4スクリーンに
基づいてクローンT4 １−189−252を選択し、さらに評
価した。T4試薬パックのポリクローナル抗血清を市販の
TDx希釈剤（本出願人）で置き換えた。クローン上清をT
Dx試料台のカートリッジの試料ウェルに添加した。TDx
カートリッジの前希釈ウェルには、０および24μg/dlの
遊離T4を重複して入れた。TDx T4 Plus測定法（以前に
本出願人から市販されたTDx装置用の測定法；この測定
法は、血清または血漿試料中の全循環T4を測定する）を
行い（以前に市販されたTDx T4 Plus測定法の取扱説明
書の記載に従う）、偏光の減少を示したモノクローナル
抗体試料を選択してさらに評価した。偏光の減少は、試
料中のT4がモノクローナル抗体のT4−FITCと競合して置
き代わることに基づく。この実験に対しては、その取扱
説明書に従って行われる現在市販のTDx T4測定法（本出
願人；この測定法も、血清または血漿試料中の全循環T4
を測定する）をTDx T4 Plus測定法の代わりに使用する
ことができた。TDx T4 Plus測定法で使用されるポリク
ローナル抗体およびトレーサーは、TDx T4測定法で使用
されるものと同じである。
同位体 T4 １−189−252として同定される細胞系から分泌さ
れるモノクローナル抗体の同位体をEIA clonotypingキ
ット（Southern Biotech,Birmingham,AL）で測定した。
その分析は、販売者の指示に従って行い、結果はIgG2
a、κの同位体を示した。
等電点電気泳動 T4 １−189−252として同定される細胞系から分泌さ
れるモノクローナル抗体の等電点（pI）を等電点電気泳
動装置（Bio Rad,Richmond,CA）により測定する。ゲル
の注入および実行は販売者の指示に従った。結果は、pI
＝7.4±0.2を示した。
細胞系の寄託 ハイブリドーマ細胞系T4 １−189−252は、ブタペス
ト条約に従ってATCC（12301 Parklawn Drive,Rockvill
e,MD 20852,U.S.A.）に寄託されている。寄託日は、199
2年９月16日であり、その細胞系のATCC番号はHB11125で
ある。このハイブリドーマにより産生されるモノクロー
ナル抗体を、本明細書ではモノクローナル抗体１−189
−252とする。
実施例４ チロキシンの蛍光偏光イムノアッセイ 一部の人の血清試料に内在する抗体は、市販のTDx、T
Dx FLxTMおよびIMx測定法において全T4の示度を不当に
低くする。これらの同じ試料をRIA法で評価すると、臨
床的診断と一致する値が得られる。これらの血清試料の
評価は、市販のAbbott T4トレーサーに対する親和力が
高い結合因子である免疫グロブリンが存在することを示
した。これは、偏光の保持力を増加してミリ偏光単位
（mP）の高い値を生じることになり、従ってT4値が低く
なる。
本発明では、実施例２のトレーサーおよびモノクロー
ナル抗体１−189−252を、市販のAbott T4FPIAと同様に
効果を発揮するように最適化すると、この新規測定法
が、上記の矛盾した示度を回避するという点でさらに有
利であることが見出された。その新規測定法は、市販の
測定法で使用されるのと同じ標準手順および希釈剤を使
用する。測定結果は、ミリ偏光単位（mP）で報告され
る。このmP単位は、記憶されている標準検量線と自動的
に対比され、分析試料中のチロキシンの濃度（μg/dl）
として表される。この方法は、市販のAbbott試薬と新規
トレーサーおよびモノクローナル抗体との両方で同じで
ある。
例えば、TDxの新しいT4測定法では、試料を標準手順
に従ってTDx分析器にかけた。TDxの新しいT4測定法の効
果は、373人の血清試料を使用して、市販のTDx T4測定
法と比較することにより評価した。T4を検出する二つの
測定法の間には好ましい一致が得られた。新規測定法で
は、試料中の０〜24μg/dlの範囲のチロキシンを検出す
ることができた。24μg/dlより大きい濃度のチロキシン
を含む試料は、最初に、例えば市販のTDx T4測定法の販
売者の指示に従って希釈すべきである。
さらに、TDx、TDx FLxTMおよびIMxの新しいT4測定法
の場合、標準検量線の最小偏光範囲は少なくとも100mP
が好ましく、より好ましくは125mPまたは130mP以上であ
る。市販の測定法は同様の偏光範囲を有する。その範囲
の上限は好ましくは300mP未満である。所望の範囲を達
成するためには、その測定法のトレーサーが使用抗体に
結合しなければならず、また、試料に内在するT4と効果
的に競合しなければならない。
さらに、T4標準検量線の偏光範囲の中央に対応するT4
とトリヨードチロニン（T3）との濃度の比を測定するこ
とにより、TDxの新規T4測定法におけるモノクローナル
抗体１−189−252とT3との交差反応性が約８％であるこ
とが確認された。交差反応性がそのように低いことは重
要である。T3がヒト血清中に存在する、T4に似た別の甲
状腺ホルモンであるからである。従って、T4の正確な測
定には、T4に対する抗体がT3と実質的に交差反応しない
ことが重要である。すなわち、そのような交差反応は約
15％以下が好ましく、より好ましくは約10％以下であ
る。
市販のT4トレーサーおよび抗体を本発明のものと比較
するために、市販のAbbott TDx T4測定法の標準手順を
使用し、１）市販のTDx T4トレーサーおよび抗体、２）
市販のTDx T4トレーサー、および、抗体は市販のものに
代えてモノクローナル抗体１−189−252、３）市販のTD
x T4抗体およびトレーサーに代えて、モノクローナル抗
体１−189−252および実施例２のトレーサー、を使用し
て、いくつかの異なる矛盾する試料を測定した。これら
の試料は、その販売者の勧める手順に従って、Abbott T
etrabead−125ラジオイムノアッセイ（T4RIA,本出願
人）にもかけて測定した。TDx測定法に関する情報は、T
Dxシステム操作マニュアルに記載してある。TDxシステ
ム操作マニュアルは、１）操作理論：蛍光偏光イムノア
ッセイ、２）操作上の注意および限界、３）毎日の始動
動作、４）維持すべき品質管理に必要な毎月および定期
的な操作を含む。非定形試料は、市販のTDx T4測定法で
はチロキシン濃度が０または異常に低いが、T4RIA測定
法ではより高レベルのチロキシン濃度を示す試料を患者
から採取した。
上記測定結果は以下の通りである。
上記結果は、T4RIA結果と比較して、予想範囲内のT4
値を与える新規トレーサー（第３欄）の有効性を示す。
本発明のトレーサーおよび抗体はまた、IMxおよびTDx
FLxTMT4測定法にも使用することができる。
トレーサーが非定形試料の不当に低いT4値の原因であ
るかどうかを決定するために、次の測定を行った。市販
のTDx試薬パックは、「Ｓ」、「Ｔ」および「Ｐ」ポッ
トと記した３本の試薬瓶を含む。ＳポットはT4抗体を含
む。Ｔポットは市販のT4トレーサーT4−FITCを含む。Ｐ
ポットは、測定するチロキシンを遊離するために蛋白質
結合チロキシンから蛋白質を脱離したT4前処理溶液を含
む。市販の測定法を次のようにして行ったが、通常はT4
抗体を含むＳポットを緩衝液で置き換えた。最初に、非
定形血清試料（表１の試料の一つ）および正常な血清試
料をテストし、その結果を表２に示す。表２に示したよ
うに、その分析法では、非定形試料に対して高いmP値が
得られた。これに対して、正常な試料のmP値はかなり低
かった。
次いで、上述の測定法（Ｓポットは抗体の代わりに緩
衝液を含む。）を表１で使用したものと同じ矛盾試料に
対して行い、その結果を下記表３に示す。１回は市販の
トレーサーを使用して測定を行い、１回は実施例２のト
レーサーを使用して行った。実施例２のトレーサーの場
合にmPの減少が認められた。これは、非定形試料に内在
する免疫グロブリンが実施例２のトレーサーに結合しな
いことを示す。
上述したように、これらの非定形血清試料の評価は、
存在する結合因子が市販のT4トレーサーに対して親和性
を有する免疫グロブリンであることを示した。測定は、
下記のHPLC、免疫ブロット分析および蛋白質Ｇセファロ
ース分離によって行った。
HPLCでは、非定形試料に存在する蛋白質を、陰イオン
交換カラムを使用するHPLCにより分離した。T4トレーサ
ーに対する結合力を有する画分を単離した。これらの画
分は、クロマトグラフィーでIgGが溶離する領域に対応
する。
さらに、選択した画分の免疫ブロット分析は、ヤギ抗
ヒトIgGで検出されるヒトIgGに対応するバンドを示し
た。
次いで、これらの選択画分を蛋白質Ｇセファロースと
ともにインキュベートした。蛋白質Ｇセファロースは、
IgGに選択的に結合する。遠心分離により蛋白質Ｇセフ
ァロースを脱離した後の上清の分析により、T4結合成分
はもはや存在しないことが示された。
本発明のトレーサーおよび抗体を使用する測定法は、
TDx、TDx FLxTMおよびIMx以外の他のFPIA装置に対して
も行うことができることは当業者であれば明らかであ
る。検出可能なチロキシンの範囲および濃度などのパラ
メータは、使用する各装置の感度などの特徴に従って最
適化される。
本発明を明確にし、理解するために、説明および実施
例によって詳細に記載したが、当業者の範囲内での種々
の改良および変更は本発明の請求の範囲内であると考え
られる。ここに示した基本的発明の自明の変化を可能に
する将来の技術的進歩も本発明の請求の範囲内である。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の合成方法によりＬ−チロキシンを牛
血清アルブミン（BSA）に結合することによる本発明の
免疫原の合成工程を示す。
図２は、本発明の合成方法による本発明の蛍光トレー
サーの合成工程を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 16/26 Ｃ０７Ｋ 16/26 Ｇ０１Ｎ 33/542 Ｇ０１Ｎ 33/542 Ａ (72)発明者 ジヨンソン，ドナルド・デイー アメリカ合衆国、イリノイ・60046、リ ンデンハースト、サンセツト・レーン・ 2309 (72)発明者 マテイングリイ・フイリツプ・ジー アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グ レイズレイク、シーフエラー・ドライ ブ・204 (72)発明者 クラリツセ，ダイアナ・イー アメリカ合衆国、イリノイ・60664、ネ パービル、ウイルデン・レーン・140・ サウス・10 (72)発明者 タイナー，ジヨアン・デイー アメリカ合衆国、イリノイ・60087、ビ ーチ・パーク、ノース・オーチヤード・ ロード・37835 (72)発明者 ペルコビツツ，メリー・エム アメリカ合衆国、イリノイ・60047・レ イク・ズーリツク、ベテイー・ドライ ブ・1184 (56)参考文献 特開 昭59−101480（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−263000（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (17)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】テスト試料中のチロキシンを定量するため
    の競合的免疫測定法において、下記工程： （ａ）テスト試料を、チロキシンおよび下記式： 【化１】 ［式中、Ｑは検出可能部分であり、Ｗは結合部分であっ
    て直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの組
    み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜50個の
    炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は10個以下）か
    ら成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するのは
    ２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むことが
    できず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、
    ４）分岐は炭素原子上にのみある。］の標識化試薬に結
    合可能な抗体を含む抗体試薬と接触させて反応溶液を形
    成する工程、および （ｂ）反応溶液中の該抗体と結合した標識化試薬の量を
    テスト試料中のチロキシンの量の関数として測定する工
    程 を含むことを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】ヘテロ原子が、窒素、酸素、硫黄およびリ
    ンから成る群から選択されることを特徴とする請求項１
    に記載の方法。
  3. 【請求項３】検出可能な部分が、酵素、発色団、蛍光性
    分子、化学発光性分子、燐光性分子および発光性分子か
    ら成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記
    載の方法。
  4. 【請求項４】抗体を、下記式： 【化２】 ［式中、（ａ）Ｐは免疫原担体物質であり、Ｘは第二結
    合部分であって直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるい
    はそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和
    の、０〜50個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子
    は10個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直
    接結合するのは２個までであり、２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結
    合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それ
    より小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあり、（ｂ）
    Ｐのチロキシン誘導体による置換度は１〜100％であ
    る。］の化合物から得られる免疫原により産生すること
    を特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 【請求項５】免疫原担体物質が牛血清アルブミン（BS
    A）、キーホールリンペットヘモシアニン（keyhole lim
    pet hemocyanin）およびチログロブリンから成る群から
    選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】免疫測定法が蛍光偏光イムノアッセイであ
    り、標識化試薬の検出可能な部分がアミノメチルフルオ
    レセイン、アミノフルオレセイン、５−カルボキシフル
    オレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、チオウレ
    アフルオレセインおよびメトキシトリアジノリル−アミ
    ノフルオレセインから成る群から選択される蛍光性部分
    であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】抗体と試料中のトリヨードチロニンとの交
    差反応が約15％以下であり、標識化試薬が試料中の内在
    性免疫グロブリンＧと結合しないことを特徴とする請求
    項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】標識化試薬が下記式： 【化３】 であり、抗体が下記式： 【化４】 ［式中、BSAは牛血清アルブミンを示し、BSAのチロキシ
    ン誘導体による置換度は１〜100％である。］の免疫原
    により得られることを特徴とする請求項１に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】下記式： 【化５】 ［式中、Ｑは検出可能な部分であり、Ｗは結合部分であ
    って直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの
    組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜50個
    の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は10個以下）
    から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するの
    は２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むこと
    ができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、
    ４）分岐は炭素原子上にのみある。］の標識化試薬。
  10. 【請求項１０】検出可能な部分が、酵素、発色団、蛍光
    性分子、化学発光性分子、燐光性分子および発光性分子
    から成る群から選択されることを特徴とする請求項９に
    記載の標識化試薬。
  11. 【請求項１１】蛍光性分子が、アミノメチルフルオレセ
    イン、アミノフルオレセイン、５−カルボキシフルオレ
    セイン、６−カルボキシフルオレセイン、チオウレアフ
    ルオレセインおよびメトキシトリアジノリル−アミノフ
    ルオレセインから成る群から選択されることを特徴とす
    る請求項10に記載の標識化試薬。
  12. 【請求項１２】下記式： 【化６】 の標識化試薬又はそのＬ−異性体の形態である標識化試
    薬。
  13. 【請求項１３】テスト試料中のチロキシンを定量化する
    ためのテストキットであって、該テストキットが、 （ａ）下記式： 【化７】 ［式中、Ｑは検出可能な部分であり、Ｗは結合部分であ
    って直鎖もしくは分岐鎖、または環式あるいはそれらの
    組み合わせで配列した、飽和または不飽和の、０〜50個
    の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子は10個以下）
    から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直接結合するの
    は２個までであり、２）Ｗは−Ｏ−Ｏ−結合を含むこと
    ができず、３）環式部分は６員環か、それより小さく、
    ４）分岐は炭素原子上にのみある。］の標識化試薬およ
    び （ｂ）テスト試料中のチロキシンおよび標識化試薬に結
    合可能な抗体を含む抗体試薬 を含むことを特徴とするテストキット。
  14. 【請求項１４】Ｑが蛍光性部分であり、アミノメチルフ
    ルオレセイン、アミノフルオレセイン、５−カルボキシ
    フルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、チオ
    ウレアフルオレセインおよびメトキシトリアジノリル−
    アミノフルオレセインから成る群から選択されることを
    特徴とする請求項13に記載のテストキット。
  15. 【請求項１５】抗体が、下記式： 【化８】 ［式中、（ａ）Ｐは免疫原担体物質であり、（ｂ）Ｘは
    結合部分であって直鎖もしくは分岐鎖、または環式ある
    いはそれらの組み合わせで配列した、飽和または不飽和
    の、０〜50個の炭素原子およびヘテロ原子（ヘテロ原子
    は10個以下）から成るが、ただし、１）ヘテロ原子が直
    接結合するのは２個までであり、２）Ｘは−Ｏ−Ｏ−結
    合を含むことができず、３）環式部分は６員環か、それ
    より小さく、４）分岐は炭素原子上にのみあり、（ｃ）
    Ｐのチロキシン誘導体による置換度は１〜100％であ
    る。］のチロキシン誘導体から得られる免疫原により産
    生されることを特徴とする請求項13に記載のテストキッ
    ト。
  16. 【請求項１６】免疫原担体物質が牛血清アルブミン、キ
    ーホールリンペットヘモシアニンおよびチログロブリン
    から成る群から選択されることを特徴とする請求項13に
    記載のテストキット。
  17. 【請求項１７】下記式： 【化９】 ［式中、Ｑは検出可能な部分であり、Ｗは結合部分であ
    る。］を有する標識化試薬であって、該標識化試薬はチ
    ロキシンに対する抗体と結合することができるが、その
    抗体との結合はＬ−チロキシンと競合的に置き代わるこ
    とができ、また、血清試料の内在性IgGとは結合できな
    い標識化試薬。
JP51759693A 1992-03-30 1993-03-29 流体試料中のチロキシンを検出・定量するための試薬および方法 Expired - Lifetime JP3327551B2 (ja)

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