JPH07501515A - ステロイドスルファターゼインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ステロイドスルフ　−ゼインヒビ　− え！眩し１肛 本発明は、ステロイドスルファターゼインヒビターとして用いられる新規化合物 、および該化合物を含有する薬学的組成物に関する。

および　′−′ ステロイド核の３−位にスルフェート基を有するステロイド前躯体マタハプロホ ルモン（本明細書中で以後ステロイドスルフェートという）は、ヒト体内におけ るステロイド代謝の中間体として重要な役割を果たすことが知られている。例え ば、エストロンスルフェートおよびデヒドロエピアンドロステロン（ＤＩｌＡ） スルフェートは、体内においてエストロンおよびエストラジオールのようなエス トロゲンの生成における中間体として重要な役割を果たすことが知られている。

例えば、エストロンスルフェートは、特に、閉経後の女性に特有な主要な循環エ ストロゲン前駆体の一つの例であることが知られており、そして***の腫瘍にお けるエストロンスルフェ−ゼ活性は、エストロゲン形成に関わる他の酵素より１ ００〜１０００倍大きい（Ｊａｍｅｓら、　５ｔｅｒｏｉｄｓ、　５０．２６９ −２７９（１９８７））。

これだけでなく、エストロンおよびエストラジオールのようなエストロゲン、特 にそれらの過剰生成は、乳ガンのような悪性状態に強（関係しており（ｅａｓｔ 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔ　ｅａｔａｎｄ　Ｐｒｏ　ｎｏｓ’ｓ：　Ｒ，Ａ、　５ｔｏ ｌ１編、　ｐｐ、　１５６−１７２．　Ｂｌａｃｋｖｅｌｌ　５ｃｉｅｎｔｉｆ ｉｃ　Ｐｕｂｌｌｃａｔｉｏｎｓ（１９＋１６）を参照のこと）、モしてエスト ロゲン生成のコントロールは、多くの抗癌治療、例えば、化学療法および手術（ 例えば、卵巣摘出および副腎摘出）の特定の標的である。内分泌治療に関心が持 たれる限りは、これまでの努力は、アロマターゼインヒビターに集中する傾向が あった。すなわち、このアロマターゼインヒビターはアロマターゼ活性を阻害す る化合物であり、この活性は、添付のエストロゲン代謝経路図（図１）に示すよ うに、アンドロゲンの変換、例えば、アンドロステンジオンおよびテストステロ ンがらエストロンおよびエストラジオールへのそれぞれの変換に関わっている。

最近出版された国際出願第Ｗ０９１／１３０８３号では、エストロゲン代謝経路 で異なる箇所、というよりはむしろ、２つの異なる箇所を標的とすることが提案 されてきた。すなわち、ステロイトスルファターゼ活性により、そしてステロイ ドスルファターゼインヒビターとしての３−モノアルキルチオホスホネートステ ロイドエステル、より詳細には、エストロン−３−モノメチルチオホスホネート を用いて、ＤＨＡスルフェートおよびエストロンスルフェートからＤＨＡおよび エストロンへのそれぞれの変換を標的とすることが提案されてきた。

本発明の第１の目的は、インビトロおよびインビボでステロイドスルファターゼ 活性を阻害し得る新規化合物を提供することである。

本発明の第２の目的は、インビトロおよびインビボの両方でステロイドスルファ ターゼインヒビターとして改善された活性を有する新規化合物を提供することで ある。

本発明の第３の目的は、ニステロゲン依存性腫瘍の治療において有効な薬学的組 成物を提供することである。

本発明の第４の目的は、乳ガンの治療において有効な薬学的組成物を提供するこ とである。

本発明の第５の目的は、哺乳動物、特にヒトのニステロゲン依存性腫瘍の治療を するための方法を提供することである。

本発明の第６の目的は、哺乳動物、特に女性の乳ガンの治療をするための方法を 提供することである。

ｌ豆Δ！１ 本発明は、ステロイドスルファターゼ阻害活性を有する（いくつかの場合では非 常に高い活性レベルである）新規化合物の発見に基づいている。これらの化合物 は、多環式アルコールのスルフェートがステロイドスルファターゼ（ＥＣ３，１ ，６，２＞活性を有する酵素の基質である、多環式アルコールのスルファミノ酸 エステル、それらのスルファミン酸エステルのＮ−アルキルおよびＮ−アリール 誘導体、ならびにそれらの薬学的に受容可能な塩である。

広（言えば、本発明の新規化合物は、式（Ｉ）の化合物であここで、Ｒ＋および Ｒ２は、それぞれ独立して、Ｈ％　アルキル、シクロアルキル、アルケニル（ｅ ｌｋｅｎｙｌ）およびアリールから選択されるか、互いに一緒になってアルキレ ン鎖中に１つまたはそれ以上のへテロ原子あるいは基を必要に応じて含有するア ルキレンを表し、−〇−多環基は、多環式アルコールの残基を表し、そのスルフ ェートは、ステロイドスルファターゼ活性（ＥＣ３，１，６，２）を有する酵素 の基質である。

本明細書中で用いられるとき、そのスルフェートがステロイドスルファターゼ活 性を有する酵素の基質である多環式アルコールとは、そのスルフェートが以下の ものである多環式アルコールに言及している。すなわち、そのスルフェートは、 次式の誘導体であり： ｐＨ７，４および３７℃で、ステロイドスルファターゼＥＣ３，１，６，２トイ ンキユベートされるときに、５０μｍｏｌより小さいに、値を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、インビボでのエストラジオールの生成に関連する、代謝経路、酵素およ びステロイド中間体を示す図式化チャートである。

ステロイドスルファターゼインヒビターとしての本発明の化合物の活性は、添付 の図面に示されている：図２は、インビトロでのヒトＭＣＦ−７細胞内のステロ イドスルファターゼ活性に関するエストロン−３−スルファメートの投与量依存 性の阻害効果を示すヒストグラムである。

図３は、インビトロでのヒトＭＣＰ−７細胞内のステロイドスルファターゼ活性 に関するエストロン−３−Ｎ、　Ｎ−ジメチルスルファメートの投与量依存性の 阻害効果を示すヒストグラムである。

図４は、インビトロでのヒトＭＣＰ−７細胞内のステロイドスルファターゼ活性 に関するエストロン−３−スルファメートおよびエストロン−３−Ｎ、Ｎ−ジメ チルスルファメートの投与量−反応の対数曲線を比較するグラフである。

図５は、インビトロでのヒト胎盤ミクロゾーム内のステロイドスルファターゼ活 性に関するエストロン−３−スルファメートの投与量依存性の阻害効果をＩＣ５ ｇ値（５０％阻害を生じるのに必要な濃度）とともに示すグラフである。

１１」す１升 １つの局面では、本発明は、新規化合物として、多環式アルコールのスルフェー トが既に与えられた定義に従ってステロイドスルファターゼ活性を有する酵素の 基質である、多環式アルコールのスルファミン酸エステル、ならびに、それらの Ｎ−アルキル、Ｎ−シクロアルキル、Ｎ−アルケニル、およヒＮ−アリール誘導 体を提供する。これらの化合物は、上記で示された式１の化合物である。

好ましくは、この多環基は、最大約４０個の炭素原子、より通常には約３０個以 下の炭素原子を含む全ての置換基を含有し得る。好ましい多環式化合物は、ステ ロイド環構造、すなわち、シクロペンタノフェナントレン骨格を含有する化合物 である。好ましくは、このスルファミル基または置換スルファミル基がその骨格 の３−位に結合された、すなわち、式■の化合物である。

ここで、Ｒ＋およびＲ２は、上記で定義されたものであり、そして、この環系Ａ ＢＣＤは、置換または非置換、飽和または不飽和のステロイド核を表し、好まし くは、エストロンまたはデヒドロエピアンドロステロンを表す。

他の好適なステロイド理系は以下の通りである：Ｋｍエストロン、すなわち： ２−０Ｈ−エストロン ２−メトキシ−エストロン ４−０Ｈ−エストロン ６α−０Ｈ−エストロン ７α−０Ｈ−エストロン １６α−０Ｈ−エストロン １６β−０■−エストロン エストラジオールおよび置換エストラジオール、すなわち：２−０Ｈ（７β−エ ストラジオール ２−メトキシ−１７β−エストラジオール４−０Ｈ−１７β−エストラジオール ６α−０Ｈ−１７β−エストラジオール７α−０Ｈ−１？β−エストラジオール １６°ａ−０）＋−１７ａ−エストラジオール１６β−０Ｈ−１’ｌａ−エスト ラジオール１６β−０１（−１７β−エストラジオール１７α−エストラジオー ル １７β−エストラジオール １７α−エチニル−１７β−エストラジオールエストリオールおよび置換エスト リオール、すなわち：エストリオール ２−０Ｈ−エストリオール ２−メトキシ−エストリオール ４−０Ｈ−エストリオール ６α−０Ｈ−エストリオール ７α−０Ｈ−エストリオール 置換デヒドロエピアンドロステロン、すなわち：６α−０Ｈ−ｙ’ヒドロエピア ンドロステロン７α−０Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン１６α−０■−デヒ ドロエピアンドロステロン１６β−０Ｈ−デヒドロエピアンドロステロン一般的 な用語では、ステロイド環系ＡＢＣＤは、種々の非妨害性置換基を含有し得る。

特に、この環系ＡＢＣＤは、１つまたはそれ以上の下記の置換基を含有し得る； ヒドロキシ、アルキル、特に低級（Ｃ＋−Ｃａ）アルキル（例えば、メチル、エ チル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、５ｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ− ブチル、ｎ−ペンチルおよび他のペンチル異性体、ならびにｎ−ヘキシルおよび 他のヘキシル異性体）、アルコキシ、°特に低級（Ｃ＋−Ｃ６）アルコキシ（例 えば、メトキシ、ニドキシ、プロポキシな　゛ど）、アルキニル（例えば、エチ ニル）、または／％ロゲン（例えば、フルオロ）。

他の好適な非ステロイド環系は、ジエチルスチルボエストロール、スチルボエス トロールおよびステロイドスルファターゼＥＣ３，１，６，２を用いて５０μｌ １ｏｌより小さいに、値を有するスルフェートを提供する他の環系を包含する。

置換される際、本発明のＮ置換化合物は、好ましくは最大１０個の炭素原子を含 有するまたはそれぞれが含有する１つまたは２つのエチルキル、Ｎ−アルケニル 、Ｎ−シクロアルキルまたはＮ−アリール置換基を含有し得る。Ｒ１および／ま たはＲ２がアルキルである場合、好ましいのは、Ｒ１およびＲ２がそれぞれ独立 して１〜５個の炭素原子を含有する低級アルキル基、すなわち、メチル、エチル 、プロピルなどから選択されるものである。好ましくは、Ｒ１およびＲ２は、共 にメチルである。Ｒ＋および／またはＲ２がアリールである場合、典型的なのは 、フェニルおよびトリル（−ＰｈＣＨ３：ｏ−１票−またはｐ−）である。Ｒ＋ およびＲ２がシクロアルキルを表す場合、典型的なのは、シクロプロピル、シク ロペンチル、シクロヘキシルナトでアル。互いに一緒になる場合、Ｒ１およびＲ ２は、典型的には、必要に応じて１つまたはそれ以上のへテロ原子または基、例 えば、５−１６−または）−員複素環（例えば、モルホリノ、ピロリジノまたは ピペリジノ）を形成する一〇−または−ＮＨ−によって仲介（ｉｎｔｅｒｒｕｐ ｔ）される、４〜６個の炭素原子からなる鎖を形成するアル牛しン基を表す。

アルキル、シクロアルキル、アルケニルおよびアリールの中で、当該化合物のス ルファターゼ阻害活性を妨げない１つまたはそれ以上の基を置換基として含有す る置換された基もここで、Ｒ１およびＲ２は、ＨまたはＣ＋−Ｃｓアルキル、す なわち、包含する。非妨害性置換基としては、例えば、ヒドロキシ、アミノ、ハ ロ、アルコ牛シ、アルキルおよびアリールを包含する。

最も好ましいものは、式ＩＩＩおよび＋Ｖの化合物である：後、真空下で溶媒を 蒸発させ、トルエンと共蒸発させて粗残エストロンー３−スルファメートおよび デヒドロエピアンドロステロン−３−スルフ１メート、およびそれらのＮ−（Ｃ ＋〜Ｃｓ）アルキル誘導体、特にジメチル誘導体（Ｒ＋・Ｒ２＝ＣＨ３）である 。

本発明のスルファミン酸エステルは、多環式アルコール（例えば、エストロンま たはデヒドロエピアンドロステロン）を塩化スルファモイルＲＩＲ２ＮＳＯ２Ｃ １と反応させることにより、すなわち、反応スキーム■により調製される二反応 ス牛−ム■を行うための条件は、以下の通りである：水素化ナトリウムおよび塩 化スルファモイルを、０°Ｃの攪拌したエストロンの無水ジメチルホルムアミド 溶液に添加する。次に、反応物を室温まで加温し、さらに２４時間攪拌し続ける 。反応混合物を炭酸水素（ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ）ナトリウムノ冷シた飽和溶 液に注入し、得られる水性相をジクロロメタンで抽出する。併せた有機抽出物を 無水Ｍｇ５Ｏａ上で乾燥する。濾過の査を得、それをさらにフラッシュクロマト グラフィーにより精製する。

必要に応じて、多環式アルコール（ステロール）内の官能基は、公知の方法で保 護され得、そしてその保護基または保護基群は反応終了時に除去され得る。

本発明のステロイドスルファターゼインヒビターは、薬剤として投与するために 、従来の薬学的製剤技術および薬学的担体、賦形剤、希釈剤などを用いて、通常 、非経口投与に適切ないかなる方法でも製剤化され得る。有効なおよその投与量 は、当該化合物のそれぞれの活性に依存して、平均体重（７０ｋｇ）の患者に対 して、１００〜８００ｍｇ７日の範囲内である。好適でより活性な化合物に対す るより通常の投与量は、２００〜８００ｍｇ７日、さらに好ましくは、２００〜 ｓｏｏ＠ｇ／日、最も好ましくは、２００〜２５０ｍｇ７日の範囲内である。そ れらは、１回投与しジメ、分割投与レジメおよび／または数日間にわたる多回投 与レジメで投与され得る。経口投与には、それらは、単位投与量当たり１００〜 ５００＋ａｇの化合物を含有する、錠剤、カプセル、溶液または懸濁液として製 剤化され得る。あるいは、そして好ましくは、これらの化合物は、適切な非経口 投与可能な担体内に非経口投与用に製剤化され、そして１日投与量を２００〜８ ００１ｇ、好ましくは２００〜５（ｌＧ＋ａｇ、より好ましくは２００〜２Ｓｈ ｇの範囲内で提供するために製剤化される。しかしながら、そのような有効な１ 日投与量は、活性成分の固有の活性および被検体の体重に依存して変化し、その ような変化は、医者の技術と判断の範囲内にある。

特定の用途としては、本発明のステロイドスルファターゼインヒビターは、別の スルファターゼインヒビターと、または、例えば、４−ヒドロキシアンドロステ ンジオン（４−０［ＩＡ）のようなアロマターゼインヒビターとの組合せのいず れかとの併用治療に用いられ得る。

以下の調製の実施例および試験データにより本発明を例示する。

実４１例」− エストロン−３−スルファメートの−１水素化ナトリウム（６０％分散体、２当 量）および塩化スルファモイル（２当量）を、０°Ｃの攪拌したエストロン（１ 当量）の無水ジメチルホルムアミド溶液に添加した。次に、反応物を室温まで加 温し、さらに２４時間攪拌し続けた。

反応混合物を炭酸水素ナトリウムの冷たい飽和溶液に注入し、得られる水性相を ジクロロメタンで抽出した。併せた有機抽出物を無水Ｍｇ５Ｏｎ上で乾燥した。

濾過後、真空下で溶媒を蒸発させ、トルエンと共蒸発させて粗残査を得、それを さらにフラッン二りロマトグラフイーにより精製する。

分析を行って以下のデータを得た： Ｊ＝８．４２Ｈｚ）。

（ｄ）、＋２０．７６　（ｄ）、１２３．５４　（ｄ）、＋２７．８９　（ｄ） 、１３９．８３　（ｓ）、、１５０．２７　（ｓ）、２７：P．８７ （ｓ、　Ｃ＝Ｏ）。

ｍＨｚ　（り：　３４９　（９）　（ｍ″）、　２７０　（１００）、　２１３ 　（２６）、　１８５　（４３）、　１７２　（３１）、　P５９ （２１）、　１４６　（３６）、　９１　（３３）、　６９　（３７）、　５７ 　（７３）、　４３　（５６）、　２９　（２４）。

野？ｇｔｌ：　６１．８７＄　６．６３＄　４．ｏ１ｚ％Ｊす１Ｌ　６１．ｑｏ ｘ　６．ｓｇｚ　３．９５ｍ（以下余白） Ｌ施１」エ エストロン−３−Ｎ−メチルスルファメートの一塩化スルファモイルを等量のＮ −メチルスルファモイルクロリドにかえる以外は実施例１の方法を繰り返した。

分析を行って以下のデータを得た： ４．６８−４．７１　（ｂｒ　ｍ、　幻次任胱、　ＩＨ，−ＮＨ）、　７．０２ −７．ｏ７　（ｍ、　２Ｈ）、　７．２６−７．３２（ｍ、　ＩＨ）。

ｍＨｚ　（１）：　３６４　［Ｍ＋Ｈ］’見立五ユ ニストロン−３−Ｎ　Ｎ−ジメチルスルファメートの一塩化スルファモイルを等 量の塩化Ｎ、Ｎ−ジメチルスルファモイルにかえる以外は実施例１の方法を繰り 返した。

分析を行って以下のデータを得た： ｊｊｌＮ−）、　７．０４　（ｂｒ　ｄ、　２１１．　Ｊ＝７．６９Ｈｚ）、　 ７．２９　（ｂｒ　ｄ、　ｉ）ｌ、　Ｊ＝７．８８Ｈｚ）−ｍＨｚ　（＄）：　 ３７７　［ｑ丁 （ν奸体自） 太夫１引土 エストロン−３−スルフ　メートによるＭＣＦ−７のステロイドスルファ　−ゼ ゛　の ステロイドスルフアターゼは、ステリルスルファターゼＥＣ３、１，６，２とし て定義される。

ステロイドスルファターゼ活性は、無傷のＭＣＦ−７ヒト乳ガン細胞を用いてイ ンビトロで測定した。このホルモン依存性細胞セルラインを広範に用いて、ヒト 乳ガン細胞成長を制御する研究を行う。それは重要なステロイドスルファターゼ 活性（Ｍａｃｌｎｄｏｅ　ｅｔ　ａｌ、　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　、　１２３ ．１２８１−１２１１７（１９８ｇ）；Ｐｕｒｏｈｉｔ　＆　Ｒｅｅｄ、　Ｉｎ ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　５０．９０１−９０５（１９９２））を有し、米国で は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（Ａ ＴＣＣ）から、そして英国では・例えば、Ｉｍｐｅｒｉａｌ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｆｕｎｄから入手可能である。細胞は、２０＋＊Ｍ　ＨＥＰＥ Ｓ、　５％ウシ胎仔血清、２ｍＭグルタミン、可欠アミノ酸および０．０７５％ 炭酸水素ナトリウムを含有する最小必要培地（ＭＥＭ）（Ｆｌｏｗ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ、　ｆｒｙｉｎｅ、スコツトランド）中で保持される。上記培地 を用いて、３０個までの２５ｃｍ２のレプリケート組織培養フラスコに、約１× １０５細胞／フラスコを接種した。細胞を８０％集密まで成長させ、培地を３日 毎に交換した。

２５ｅ■２のトリプリケート組織培養フラスコをアール平衡塩溶液（Ｅａｒｌｅ ’ｓ　Ｂａ１ａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）（ＩＣＮ　Ｆｌｏｗ、 　Ｈｉｇｈ　Ｗｙｃ。

ｗ＋ｂｅ、　Ｌｌ、に、からのＥＢＳＳ）で洗浄し、無血清ＭＥＭ（２，５ｍ１ ）中の、５μｍｏｌ（７ｘ　１０５ｄｐｉ）の［６，７−３Ｈ］エストロン−３ −スルフェート（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、　ボストン、　Ｍａ ｓｓ、、　ＵＳＡ）からの比活性６０Ｃｉ／ｍｍｏｌ）をエストロン−３−スル ファメート（１１種の濃度二〇、１ｆＭ、　０．０１μＭ、　０．１μＭ、１μ Ｍ、　０．０１μＭ、　０．１μＭ、１μＭ、　０．０１℃Ｍ。

０．１μＭ、１μＭ）とともに３７℃で３〜４時間インキュベートした。インキ ュベートした後、各フラスコを冷却し　［＋４（］エストロン（７Ｘ１０３ｄｐ ｍ）（Ａｉｅｒｓｈａ＋ｎ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｉ ＋１ｃａｌＣｅｎｔｒｅ、　Ａｍｅｒｓｈａ＋＊、　Ｕ、に、からの比活性９７ Ｃｉ／Ｉｌ＋ｎｏ＋）を入れた分離管に、培地（１１）をピペットで移した。混 合物を、トルエン（５ｍｌ）とともに３０秒間十分に振とうした。９０％より多 い［ｌ′Ｃ］エストロンおよヒ０．１％未満の［３Ｈ］エストロン−３−スルフ ェートが、この処理によって水性相から除去されたことが、実験によって示され た。有機相の一部（２ｍｌ）を除去し、蒸発させ、シンチレーション分光測定に よって残金の３１（およびＩ４０含冑量を測定した。加水分解されたエストロン −３−スルフェートの質量を、得られた３Ｈ総数（用いた培地および有機相の容 積、ならびに添加した［Ｉ４０］エストロンの回収について補正した）および基 質の比活性から計算した。実験の各バッチは、スルファターゼ陽性ヒト胎盤（陽 性コントロール）から調製されたミクロゾームおよび細胞を含まないフラスコ（ 基質の見掛けの非酵素的加水分解を評価する）のインキュベーションを含む。

細胞の単層をサポニン（Ｚａｐｏｎｉｎ）で処理した後、コールタ−カウンター を用いて、１フラスコあたりの細胞核の数を測定した。各バッチで１つのフラス コを用い、トリパン・ブルー・エクスクル−ジョン法（Ｔｒｙｐａｎ　Ｂｌｕｅ 　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、■、Ｊ、（１９７ ３）：　Ｔ’５ｓｕｅ　ｃｕｌｔｕ　ｅ　ａｎｄ　ａ　１ｉｃａｔｉｏｎ、　［ Ｋｒｕｓｅ、　Ｄ、Ｐ、　＆　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ、　Ｍ、に、編］；ｐｐ、４ ０６−４０８；Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨークに記載）を用いて 細胞膜の状態および生存度を評価した。

エストロン−３−スルファメートについてのデータを表１なら　゛びに図２およ び図４に示す。ステロイドスルファターゼ活性についての結果を、１０６個の細 胞について計算したインキ１ベーシヨン期間（２０時間）中に形成された全生成 物（エストロン＋エストラジオール）の平均±ＩＳ、　Ｄ、とじて表し、統計的 有意を示す値についての結果を、エストロン−３−スルファメートを含有しない インキュベーションに対する（阻害）減少パーセントとして表している。対応の ないスチューデントのｔ−検定を用いて結果の統計的有意を調べた。

（以下余白） た５工 実ｆｆｉ エストロン−３−Ｎ　Ｎ−ジメチルスルファメートによるＭＣＦ−７のステロイ ドスルファターゼ　の インキュベーションに、エストロン−３−スルファメートのがわりにエストロン −３−Ｎ、　Ｎ−ジメチルスルファメート（５柵の濃度二〇、Ｏ，ＯＯ１μＭ、 　０．０１℃Ｍ、　０．１μＭ、１　μＭ＞を含む以外は、実施例４に記載のも のと同じ実験プロトコールを用いてエストロン−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルスルファ メートについての結果を得た。

エストロン−３−Ｎ、　Ｎ−ジメチルスルファメートについての結果を、表Ｉ＋ および図３に示し、それぞれ表！および図２と同じ方法で表している。また、そ の投与量−反応の対数曲線を図４のエストロン−３−スルファメートと比較して いる。

１モ四士１５．０．　ｎ＝３　顛ｐ　５０．０１　顛☆ｐ≦Ｏ，０Ｏ１（枢Ｔ− 全巨〕 憲１１１１ エストロン−３−Ｎ　Ｎ−ジメチルスルファメートおよびエストロン−３−Ｎ− ジメチルスルファメートでの寸　によるＭＣＦ−７のステロイドスルファ　−ゼ ゛　の 実施例４に記載したものと同様の実験プロトコールを用いて、エストロン−３− スルファメートおよびエストロン−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルスルファメートそれぞ れによって前処理したＭＣＦ−７細胞への影響を測定した。

初めに、０．１ＨＭのエストロン−３−スルファメート、エストロン−３−Ｎ、 　Ｎ−ジメチルスルファメートまたは培地のみ（コントロール）を用いて、無傷 の単層を３７℃で２時間インキュベートし細胞を５ｍｌの培地で連続して３回洗 浄した。得られた「洗浄した」細胞を再懸濁し、５　ｐｍｏｌ　（７ｘ　１０５ ｄｐ＋ｍ）の［６，７−３Ｈｌエストロン−３−スルフェートを含有する培地中 、３７℃で３〜４時間インキュベートした。他のすべての態様は、実施例３およ び４に記載したものと同じであった。

エストロン−３−スルファメートおよびエストロン−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルスル ファメートについての結果を表ＩＩ＋に示し、表Ｉと同様の方法で表している。

（以下余白） ｋｎ工 ？　ｒｆｘ″：？土Ｉ　Ｓ−Ｄ。ｎ＝３　☆ｐ　≦０．０５　頽介ｙ　：ｆｆｌ −００１正常妊娠期のスルファターゼ陽性ヒト胎盤（産婦人科病棟、ＳＬ、　Ｍ ａｒｙ’　Ｓ病院、ロンドン）をハサミで細かく切り刻み、冷したリン酸緩衝液 （ｐｉ（７，４，５ｆ）ａＭ）で１回洗浄し、そして冷したリン酸緩衝液中に再 懸濁させた（５　ｍｌ／ｇの組織）。水中での２分間の冷却期間によって分離さ れた３つの１０秒バーストを用いて、Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザー によって均質化を行った。

２０００ｇで３０分間遠心分離（４°Ｃ）することにより、核および細胞デブリ を除去し、上清の一部（２ｍｌ）を−２０°Ｃで保存した。この上清のタンパク 質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈ　ｒａ、。

’１２．２４８−２５４（１９７６））によって測定した。

タンパク質濃度１００μｇ／ｍｌ、基質濃度２０μＭの（６，７−３旧エストロ ン−３−スルフェート（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ、ボストン、 Ｍａｓｓ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）からの比活性６０　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および３７ °Ｃで２０秒間のインキュベーション時間を用いて、インキュベージコン（１＋ ｍｌ）を行うた。８種の濃度のエストロン−３−スルファメートを用いた：Ｏμ Ｍ（すなわちコントロール）、０．０５μＭ、０．１μＭ１０．２ＨＭ、０．４ μＭ、０．６μＭ、　０．８ＨＭ、１．０μＭ０　インキユベートした後、各サ ンプルを冷却し、［＋４ｃ］エストロン（７ｘ　１０３ｄｐｍ）（Ａｍｅ１０３ ｄｐ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｒ ｅ、　Ａ＋ｎｅｒｓｈａｍ、　ＩＪ、に、からの比活性９７　Ｃｉ／ｍｍｏｌ） を入れた分離管に、培地（１１）をピペットで移した。混合物を、トルエン（５ ｍｌ）とともに３０秒間十分に振とうした。９０％より多い［＋４ｃ］エストロ ンおよび０．１％未満の［３旧エストロン−３−スルフェートが、この処理によ って水性相から除去されたことが、実験によって示された。

有機相の一部（２ｌ１ｌ）を除去し、蒸発させ、シンチレーション分光測定によ って残金の３Ｈおよび＋４０含有量を測定した。加水分解されたエストロン−３ −スルフェートの質量を、得られた３Ｈ数（用いた培地および有機相の容積、な らびに添加した［＋４Ｃ］エストロンの回収について補正した）および基質の比 活性から計算した。

エストロン−３−スルファメートについての結果を、表＋Ｖおよび図５に示す。

ステロイドスルファターゼ活性についての結果を、インキュベーション期間（時 間）中に形成された全生成物（エストロン＋ニストロジオール）、オよびコント ロールとして機能するエストロン−３−スルファメートを含有しないインキュベ ーションに対する（阻害）減少パーセントとして、表Ｉｖに表す。ステロイドス ルファターゼ活性についての結果を、エストロン−３−スルファメートの濃度に 対するコントロールからの（阻害）減少パーセントについて図４に表し、０．０ ７μＭの計算されたＩＣ５ｓ値（すなわち、コントロールに対して５０％阻害を 生じるエストロン−３−スルファメートの濃度）を含む。

０．０５６Ｍ　４３０．４　４４．０＄０．１ｐＨ３０５，９６０，２＄ ０．２μＭ　１４０．０　８１．８＄ ０．４団　８３．３　８９．２＄ ０．６＄　６１．８　９２．０＄ ０．８μＭ　４９゜２　９３．６χ １、ｏｐｈ　５１．６　９３．３＄ 尖ＪＬＪＩ エストロンートスルファメート　したラット　の　ミクロゾーム−のステロイド スルファ　−ゼ°　の３匹の雌ウィスターラット（体重８０〜Ｉ　Ｌｏｇ）から 構成される４群に、以下のものをそれぞれ１００μｌ皮下注射した（１日１回で ７日間、基剤：プロピレングリコール）：プロピレングリコール（コントロール 基剤）エストロン−３−スルファメート（ｉｏＩ１ｇ／ｋｇ／日）エストロン− ３−スルフェート（ｌｏｎｇ／ｋｇ／日）（コントロール基質） エストロン−３−スルフニー）　（Ｌｏｎｇ／ｋｇ／日）十エストロンー３−ス ルファメート（１０＋ｍｇ／ｋｇ／日）８日目にすべてのラットを犠牲にし、解 剖して肝臓を取り出した。組織源がラット肝臓であり、分離基質として［６，７ −３■］エストロン−３−スルフェートおよび［７−３）ＩＦデヒドロエピアン ドロステロン−３−スルフェートを用いてステロイドスルファターゼ活性を測定 する重複実験を行った以外は実施例６に記載したものと同じプロトコールによっ て、肝ミクロゾーム調製物を調製した。

ステロイドスルファターゼ活性についての結果を、表■に示し・インキ＝ベーシ ョン期間中に形成された全生成物を平均±ＩＳ、Ｄ、の形態で表す。エストロン −３−スルファメートで処理したラットの群から得られた組織のインキコベーン ヨンについての結果もまた、それぞれコントロールと比較した、ステロイドスル ファターゼ活性の（阻害）減少パーセントとして表す。

ｎ−ｒ婬ロン゛ニム摘製所勿を之とｔｆろステロブトスｌし々ｔ）−ｖ”；ｔ− ｔ／’ｔ１子１１±Ｉ　Ｓ、Ｄ、　ｎ＝３ を社ρ≦０．００１ Ｅ、−５＝　ｘ、ストｂ〉　−３−＾ルア１メートｏ　ｏ　ｏ　ロ　Ｑ　Ｏ。

ＯＬｎ　ＯＬ／’ｌ　Ｏｕ’ｌ　Ｏ３０マ　の　０　へ　ＣＶＪ　ｆ−Ｗ （２＃＃ｐＬ／ＬＩＯ乙７１ｏｕ４）ａｔ、ｖ−シ）１゛イｒ爬夕をΦ　ｃｏ　 ｈ　Ｃｏ　Ｌ＋’）　マ　の　へ　−０００ｏ　ロ　００００００ ΦＱ：ｌ　ｈ　ｃｏクマの〜− （’ａｕ＠、ｐ　Ｌ／ＬＩＯ乙／ＩＯＬ＋４）　’ＡＩ−Ｓ　’ｌ”４ｒ、’５ 　銖＝／＝琳調 ゾ・う１ｊ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）１、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ９２１０１５８７ ２、発明の名称 ステロイドスルファターゼインヒビター３、特許出願人 住所　イギリス国　ロンドン　ニスダブリニー７２エイゼツト。

ンヤーフィールド　ビルディング（番地なし）名称　インペリアル　カレッジ　 オブ　サイエンス、テクノロジー　アンド住所　〒５４０　大阪府大阪市中央区 域見−下目２番２７号５、補正書の提出年月日 諺１！ｌ【囲 １．薬学的に受容可能な希釈剤または担体と混合されるステロイドスルファター ゼインヒビターを含有する、薬剤調製物であって、該ステロイドスルファターゼ インヒビターが、有効ｘｔノ多環式アルコールのスルファミノ酸エステル、ある いは、それらのエステルのＮ−アルキル、Ｎ−アルケニル、Ｎ−シクロアルキル 、またはドアリール誘導体、あるいはそれらのエステルまたはＮ４換エステルの 薬学的に受容可能な塩であであるまたは含有し、該エステルのアルコール部分が 多［式アルコールのアルコール部分であり、該多環式アルコールのスルフェート がステロードスルフ１アターゼ（Ｅ、Ｃ，３，１，６，１＞活性を有する酵素に より加水分解され得る、薬剤調製物。

２、請求項１に記載の薬剤調製物であって、前記ステロイドスルファターゼイン ヒビターが下式の化合物である、薬剤調製物： ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈｌ　アルキル、アルケニル、 シクロアルキルおよびアリールカラ選択されるか、互いに一緒になってアルキレ ン鎖中に、１つまたはそれ以上のへテロ原子あるいは基を必要に応じて含有する アルキレンを表し、 そして、−〇−多環基は該多環式アルコールの残基を表す。

３、前記−〇−多環基がステロール残基を表す、請求項２に記載の薬剤調製物。

４、前記ステロールが３−ステロールである、請求項３に記載の薬剤調製物。

５、前記ステロールが、エストロン、デヒドロエピアンドロステロン、置換エス トロン、および置換デヒドロエピアンドロステロンからなる群より選択される、 請求項４に記載の薬剤調製物。

６、前記式中の前記Ｒ１およびＲ２置換基または置換基群が、Ｃｌ−Ｃｌアルキ ルである、請求項２から５のいずれか１つに記載の薬剤調製物。

７、前記Ｎ−アルキル置換基または置換基群が、Ｃｌ−Ｃｓアルキルである、請 求項６に記載の薬剤調製物。

８、前記Ｎ−アルキル置換基または置換基群が、メチル基またはメチル基群であ る、請求項６に記載の薬剤調製物。

９、エストロン−３−スルファメート。

１０、エストロン−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルスルファメート。

１１、エストロン−３−Ｎ−モノメチルスルファメート。

１２、ｌｌｉ乳動物にインビボでのステロードスルフ１ターゼ活性のインヒビタ ーを、必要に応じて併用治療レシンの一部として１つまたはそれ以上の他の化学 療法剤または他の薬学的活性化合物と混合または同時に投与する工程を包含する 哺乳動物のエストロゲン依存性腫瘍の治療をするための方法であって、該方法は 、その改善として、有効量の下式で表される化合物を含有する工程を包含する： ここで％　Ｒ＋およびＲ２は、それぞれ独立して％　Ｈ％　アルキル、アルケニ ル、シクロアルキルおよびアリールカラ選択されるか、互いに一緒になってアル キレン鎖中に１つまたはそれ以上のへテロ原子あるいは基を必要に応じて含有す るアルキレンを表し、 −〇−多環基は多環式アルコールの残基を表し、該多環式アルコールのスルフェ ートエステルは、ステロイドスルファティック活性（Ｅ、Ｃ，３，１，６，２） ヲ有ｔル酵素の基質である。

１３、前記ステロイドスルファターゼインヒビターの式中の〇−多環基が３−ス テロール残基を表す、請求項１２に記載の方法。

１４、前記３−ステロール残基が、３−エストロンおよび３−デヒドロエピアン ドロステロン残基から選択される、請求項１３に記載の方法。

ｔｓ−７ｔＨａステロイドスルフアターゼインヒビターカ、エストロン−３−ス ルファメート、エストロン−３−（Ｃｌ−Ｃｓアルキル）スルファメート、デヒ ドロエピアンドロステロン−３−スルファメートおよびデヒドロエピアンドロス テロン−３−（Ｃｌ−Ｃｓアルキル）スルファメートからなる群より選択される 、請求項１２に記載の方法。

１６、前記ステロイドスルファターゼインヒビターが、エストロン−３−スルフ ァメート、エストロン−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルスルファメートおよびエストロン −３−Ｎ−モノメチルスルファメートからなる群より選択される、請求項１２に 記載の方法。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＧＡ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，Ｆ Ｉ、　ＨＵ。

Ｊ　Ｐ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　Ｎ０９ＰＬ、　Ｒ Ｏ，ＲＵ、ＳＤ、　ＵＳ （７２）発明者　ボッター、バリー　ビクター　ロイドイギリス国　エイポン　 ビーエイ１７ユーイー、パース、バースフォード、ビーバーズ　パーク　９５

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．多環式アルコールのスルフェートがステロイドスルファターゼ活性を有する 酵素の基質である、多環式アルコールのスルファミン酸エステル、ならびに、そ れらのＮ−アルキル、Ｎ−アルケニル、Ｎ−シクロアルキル、およびＮ−アリー ル誘導体。
2. ２．請求項１に記載のスルファミン酸エステルであって、該スルファミン酸エス テルは下式で表される：▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、シ クロアルキルおよびアリールから選択されるか、互いに一緒になってアルキレン 鎖中に１つまたはそれ以上のヘテロ原子あるいは基を必要に応じて含有するアル キレンを表し、 −Ｏ−多環基は多環式アルコールの残基を表し、該多環式アルコールのスルフェ ートエステルは、ステロイドスルファティック活性（Ｅ．Ｃ．３．１．６．２） を有する酵素の基質である。
3. ３．前記多環式アルコールがステロールである、請求項２に記載のスルファミン 酸エステル。
4. ４．前記ステロールが３−ステロールである、請求項３に記載のスルファミン酸 エステル。
5. ５．前記ステロールが、エストロン、デヒドロエピアンドロステロン、置換エス トロン、および置換デヒドロエピアンドロステロンからなる群より選択される、 請求項４に記載のスルファミン酸エステル。
6. ６．前記Ｎ−アルアル置換基またはＮ−アルキル置換基群が、Ｃ１−Ｃ１０アル キルであるＮ−アルキル置換化合物である、請求項２から５のいずれか１つに記 載のスルファミン酸エステル。
7. ７．前記Ｎ−アルキル置換基またはＮ−アルキル置換基群が、Ｃ１−Ｃ５アルキ ルである、請求項６に記載のスルファミン酸エステル。
8. ８．前記Ｎ−アルキル置換基またはＮ−アルキル置換基群が、メチル基またはメ チル基群である、請求項６に記載のスルファミン酸エステル。
9. ９．エストロン−３−スルファメート。
10. １０．エストロン−３−Ｎ．Ｎ−ジメチルスルファメート。
11. １１．薬学的に受容可能な希釈剤または担体と混合されるステロイドスルファタ ーゼインヒビターを含有する、エストロゲン依存性腫瘍の治療用の薬剤調製物で あって、該ステロイドスルファターゼインヒビターが、有効量の請求項１から１ ０のいずれか１つに記載のスルファミン酸エステルであるまたは含有する、薬剤 調製物。
12. １２．哺乳動物にインビボでのステロイドスルファターゼ活性のインヒビターを 、必要に応じて併用治療レジメの一部として１つまたはそれ以上の他の化学療法 剤または他の薬学的活性化合物と混合または同時に投与する工程を包含する哺乳 動物のエストロゲン依存性腫瘍の治療をするための方法であって、該方法は、そ の改善として、有効量の下式で表される化合物を含有する工程を包含する：▲数 式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、シ クロアルキルおよびアリールから選択されるか、互いに一緒になってアルキレン 鎖中に１つまたはそれ以上のヘテロ原子あるいは基を必要に応じて含有するアル キレンを表し、 −Ｏ−多環基は多環式アルコールの残基を表し、該多環式アルコールのスルフェ ートエステルは、ステロイドスルファティック活性（Ｅ．Ｃ．３．１．６．２） を有する酵素の基質である。
13. １３．前記ステロイドスルファターゼインヒビターの式中のＯ−多環基が３−ス テロール残基を表す、請求項１２に記載の方法。
14. １４．前記３−ステロール残基が、３−エストロンおよび３−デヒドロエピアン ドロステロン残基から選択される、請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記ステロイドスルファターゼインヒビターが、エストロン−３−スルフ ァメート、エストロン−３−（Ｃ１−Ｃ５アルキル）スルファメート、デヒドロ エピアンドロステテン−３−スルファメートおよびデヒドロエピアンドロステロ ン−３−（Ｃ１−Ｃ５アルキル）スルファメートからなる群より選択される、請 求項１２に記載の方法。
16. １６．前記ステロイドスルファターゼインヒビターが、エストロン−３−スルフ ァメート、エストロン−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルスルファメートおよびエストロン −３−Ｎ−モノメチルスルファメートからなる群より選択される、請求項１２に 記載の方法。