JP2810005B2 - 微生物コレステロールデヒドロゲナーゼ、その製造方法および使用 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は酸素非依存性コレス
テロール変換酵素、特定の微生物からの該酵素の単離方
法、並びにコレステロールを測定するためのその酵素の
使用に関する。

【０００２】

【従来の技術】酵素試験を用いた血液中のコレステロー
ルの定量測定は長年にわたって臨床化学において試験さ
れた方法であった（Flegg 1973, Richmond 1973)。コレ
ステロールオキシダーゼは、コレステロール（５−コレ
ステン−３−β−オール）から４−コレステン−３−オ
ンおよびH₂O₂への酸化を触媒作用する酵素として通常使
用されている。

【０００３】

【化１】

【０００４】この場合、酸素は電子アクセプターとして
利用できる。シゾフィラム(Schizophyllum) 、ストレプ
トベルチシリウム(Streptoverticillium) 、ブレビバク
テリウム(Brevibacterium)、ノカルジア(Nocardia)、ロ
ドコッカス(Rhodococcus) またはストレプトミセスの部
類の微生物から、工業規模でこの酵素を提供（Noma＆Na
kayama 1976,欧州特許第0560983 号; Liu ら1980, Ishi
zaki 1989, Halpern 1981, Aihara ら1986, Fujishiro
ら1990, 欧州特許第0452112 号）することが確立されて
いる。

【０００５】しかしながら、コレステロールオキシダー
ゼの酸素依存性が重大な欠点であり、また試験の不正確
さの主たる理由である。それはしばしば試験を較正する
際に問題を生じる。何となれば、酸素分圧に対する依存
性が高度依存性をもたらすだけでなく、試験の温度依存
性をもたらすからである。さらに、カップリング着色反
応により、コレステロールオキシダーゼを用いて血液か
らのコレステロールを定量測定することは、生成される
H₂O₂のために干渉を受け易い。H₂O₂は、例えば、ビリル
ビンまたは薬剤とのその高い反応性のために反応平衡か
ら除去される。

【０００６】嫌気性微生物（ユウバクテリウム・エスピ
ー(Eubacterium sp.)）または温血動物の肝臓組織から
得られる酸素非依存性コレステロール変換酵素、即ち、
NAD依存性またはNADP依存性のコレステロールデヒドロ
ゲナーゼがドイツ特許第2649749 号明細書に記載されて
いる。この出願に記載された酵素の重大な欠点は、酵素
も不活性ガス雰囲気下で単離されなければならないこと
である。その方法のスケールアップおよび大規模での前
記酵素の提供は実施可能性がない。更に、その酵素は補
因子としてNAD(P)を必要とし、その結果、更なる反応工
程（酵素的または化学的）が着色形成に必要である。こ
れは通常、コストの増大および干渉に対する高い感受性
をもたらす。適当なNAD(P)非依存性デヒドロゲナーゼ
は、例えば、グルコースまたはグリセロールの如きその
他の基質についてのみ以前より知られていた(Duine 199
1, Ameyamaら 1985, Ameyama 1982,欧州特許第0354441
号,Ameyama ら1981, 欧州特許第0120440 号）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、上記の欠点を解決するコレステロール変換酵素を提
供することである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】その目的は、人工電子ア
クセプター（媒介物質）を使用し、かつ特定の微生物か
ら得られる酵素変換酵素により達成される。特に、未置
換または置換ベンゾキノン誘導体、インドフェノール誘
導体およびニトロソアニリン誘導体が人工電子アクセプ
ター（媒介物質）として考えられる。置換ベンゾキノン
化合物およびニトロソアニリン化合物の中で、芳香族骨
格に非電子吸引残基、例えば、低級アルキル基を有する
化合物が好ましい。10個までの炭素原子を有するアルキ
ル基がこの場合に特に好適であることがわかった。

【０００９】特に、メチル−１，４−ベンゾキノン(MB
Q) 、ｐ−ベンゾキノン(PBQ) およびＮ，Ｎ−ジメチル
−４−ニトロソアニリン(NA)だけでなく、２，６−ジク
ロロフェノール−インドフェノール(DCIP)およびＮ，Ｎ
−ビス−２（ヒドロキシエチル）−ｐ−ニトロソ−アニ
リンが人工電子アクセプターとして好適であることがわ
かった。

【００１０】本発明の酵素の主な利点は、電子を酸素ま
たはNAD(P)に転移する代わりに、電子をシグナル産出に
直接利用し得る人工電子アクセプターに直接転移するこ
とである。コレステロールオキシダーゼを使用する古典
的試験方法とは対照的に、測定系は酸素分圧から独立し
ている。こうして酸素干渉が避けられる。 本発明の酵
素は、特に、放線菌類または担子菌類の種の如き微生物
中で生じる。特に、特定のロドコッカス株およびストレ
プトミセス株（ロドコッカス・エスピー(Rhodococcus s
pec.)BMTU3899 DSM 9444 、ロドコッカス・エリスロポ
リス(Rhodococcus erythropolis)DSM 743、ストレプト
ミセス・ハイグロスコピクス(Streptomyces hygroskopi
cus)DSM 40771)から適当なコレステロールデヒドロゲナ
ーゼ(chol-DH) を単離することが可能であった。菌類株
の場合、特定の担子菌類種（フラムリナ・ベルチペス(F
lammulina velutipes) DSM 1658 、コプリヌス・コマタ
ス(Coprinus comatus) DSM 1746 、トラメテス・ベルシ
カラー(Trametes versicolor)BMTU 3107, DSM 9443) が
主として本発明のコレステロールデヒドロゲナーゼの起
源として適することがわかった。

【００１１】さらに、本発明の酵素は、最適pH値範囲が
pH6〜10、および最適温度が25℃〜40℃であることを特
徴とする。さらに、その酵素は高温安定性を示す。安定
剤を添加しなくても、その酵素は60℃で約30分後に依然
としてその初期活性の少なくとも90％、また通常依然と
して98〜100 ％を有する（図１）。本発明のchol-DH
は、pH7.0 〜8.0 の範囲で最高のpH安定性を示す（図
２）。

【００１２】更に、その酵素は約55,000 Da (SDS-PAGE)
の見掛け分子量を特徴とする。chol-DH の等電点は約pH
8.6 にある（アンフィライ(Amphilie)PAG プレートpH3.
5 9.5;2,5 時間、1500 V、30 mA および30 W) 。さら
に、本発明はコレステロールデヒドロゲナーゼを含む好
適な細菌株または菌類株が最初に好適な増殖培地中で培
養されるコレステロールデヒドロゲナーゼの製造方法に
関する。好適な増殖培地は酵母エキス基礎をベースとし
ており、そして他の通常の栄養塩および微量要素に加え
て約0.5 〜５g/l の濃度のコレステロールを含む。特
に、細菌株を増殖する場合、発現の倍加がトリプシン処
理の大豆(tryptic soy)（Difco、製品番号0370）で得ら
れた。さらに、発現の４倍の更なる増大が、洗剤、例え
ば、トゥイーン80(Tween 80 ; 0.1 〜５％; (w/v))を添
加することにより得られた。この場合、タウロコレート
もまた好適であることがわかった。続いて、酵素が分画
硫酸アンモニウム沈殿、透析及び一つまたは幾つかのク
ロマトグラフィー精製工程により培養上清みから単離さ
れる。特に、最初にヒドロキシアパタイト、続いてフェ
ニル−セファロースおよびスーパーデックス200 カラム
を使用する場合にchol-DH のクロマトグラフィー精製に
有利であることがわかった。バイオマスからの酵素の単
離は、その他に好適な溶解緩衝液および細胞分断用の手
段を使用して同様に行われる。このプロセスにおいて、
細胞は化学的、酵素的（例えば、リゾチーム処理）また
は機械的（圧力、細胞粉砕機、ガラスビーズ等）に分断
し得る。細胞分断及び有機溶媒による酵素の抽出後に、
酵素画分を洗浄することが有利である。

【００１３】この方法において、chol-DH は少なくとも
99％の純度（例えば、SDS-PAGEまたはRP-HPLC;これらの
方法は当業者に知られている）、２〜３ U/mg の比活性
および約10％の収率（硫酸アンモニウム沈殿後、即ち、
脂質等のごとき高分子量成分の分離後の透析物に関し
て）で得ることができた。さらに、本発明は生物試料、
例えば、臨床化学において使用される生物試料中の全コ
レステロール（遊離または結合）を測定するための本発
明の酵素の使用に関する。この方法において、chol-DH
活性はコレステノンの生成、または添加されたレドック
ス媒介物質の還元のいずれかにより測定される。コレス
テノンの生成は、例えば、HPLC方法を用いて監視され、
またはレドックス媒介物質の還元は光度計測若しくは電
気化学的に監視される。

【００１４】全コレステロール（遊離または結合）測定
用の相当する試薬は、通常、コレステロールエステラー
ゼ、酸素非依存性コレステロールデヒドロゲナーゼ、緩
衝液、必要により安定剤および／または表面活性剤、並
びにコレステノンまたは還元された媒介物質を測定する
ための系を含む。コレステノンを測定するのに適した系
は当業者に知られている。還元された媒介物質の測定
は、直接に、即ち、使用される媒介物質に応じて300 〜
700 nmの波長における吸光度の低下の測定により行い得
る。DCIP、PBQ またはMBQ を使用する場合、吸光度の低
下は約600 nmの波長で分光分析により監視される。

【００１５】このような試薬の定量的組成は約0.02〜4
U/mlのコレステロールエステラーゼ、0.02〜4 U/mlの酸
素非依存性chol-DH および0.01〜10mM、好ましくは0.05
〜１mMの電子アクセプターである。試薬が界面活性剤、
例えば、テシット(Thesit)またはコレートを含む場合に
は、その濃度は0.1 〜10％(w/v) であることが適当であ
る。

【００１６】本発明の方法および試薬は、特に血清、血
液、血漿等の如き生物試料中の結合コレステロールおよ
び遊離コレステロールの非常に迅速かつ完全な測定を可
能にする。特別な利点は、追加の測定反応がこれに対に
される必要がなく、かつ測定が一般的な簡単なフォトメ
ーターで直接行い得ることである。

【００１７】図１： 温度ストレス下のchol-DH (1.0 U
/ml)の安定性；適当な温度における水浴中の30分間のイ
ンキュベーション；chol-DH が初期活性に対して記載さ
れる。 図２： 種々のpH条件下で25℃で３時間にわたってスト
レスを受けた場合のchol-DH (1.0 U/ml)の安定性；chol
-DH が初期活性に対して記載される。 使用した緩衝液：pH 3.０-6.0: 0.2MのNa₂HPO₄/クエン
酸塩緩衝液 pH 7.０-9.0: 0.2MのK₂HPO₄/KOH緩衝液

【００１８】文献 1. Flegg, H.M. (1973) 酵素方法による血清コレステ
ロールの測定の研究 Ann.Clin.Biochem. 10: 79 2. Richmond, W. (1973) ノカルジア・エスピーからの
コレステロールオキシダーゼの調製および性質並びに血
清中の全コレステロールの酵素アッセイへのその応用 Clin.Chem. 19: 1350-1356 3. Noma, A.＆Nakayama, K. (1976) 異なる起源からの
コレステロールオキシダーゼに関する比較研究 Clin.Chim.Acta 73: 487-496 4. Liu, W., Cheng, C.＆Su, Y. (1980) コレステロー
ルオキシダーゼ産生細菌の単離および同定 Proc.Natl.Sci.Counc.ROC 4: 433-437 5. Ishizaki, T., Hirayama, N., Shinkawa, H., Nim
i, O.＆Murooka, Y. (1989) ストレプトミセス・エス
ピーからのコレステロールオキシダーゼの遺伝子のヌク
レオチド配列 J.Bacteriol. 171: 596-601

【００１９】6. Halpern, M.G. (1981) 細菌からのコ
レステロールオキシダーゼ、3-22頁;微生物起源からの
工業的酵素、Noyes Data Corporation 7. Aihara, H., Watanabe, K.＆Nakamura, R. (1986)
３種のロドコッカス株中のコレステロールオキシダーゼ
の産生の特徴づけ J.Appl.Bacteriol. 61: 269-274 8. Fujishiro, K., Ohta, T., Hasegawa, M., Yamaguc
hi, K., Mizukami, T.＆Uwajima, T. (1990) 臨床分析
に広く使用される酵素であるブレビバクテリウムステロ
リカムATCC 21387からのコレステロールオキシダーゼの
遺伝子の単離および同定 Biochem.Biophys.Research Communications 172: 721-7
27 9. Fujishiro, K. ＆Uwajima, T. (1991) コレステロ
ールオキシダーゼ 欧州特許第0452112 A1 10. Duine, J.A. (1991) キノプロテイン：キノノイド
補因子ピロロキノリンキノン、トパキノンまたはトリプ
トファン−トリプトファンキノンを含む酵素 Eur.J.Bi
ochem. 200: 271-284 11. Ameyama, M., Shinagawa, E., Matsushita, K.＆Ad
achi, O. (1985) グルコノバクター・インダストリウス
からの膜結合グリセロールデヒドロゲナーゼの可溶化、
精製および性質 Agric.Biol.Chem. 49: 1001-1010 12. Ameyama, M. (1982) 膜結合デヒドロゲナーゼによ
るD-グルコース、D-フラクトース、D-グルコネート、2-
ケト-D- グルコネート、アルデヒド、およびアルコール
の酵素的微量測定 Methods Enzymol. 28: 20-29 13. Ameyama, M. (1990) NAD(P)-unabhangige Glycerin
dehydrogenase, Verfahren zu deren Herstellung sowi
e deren Verwendung zur Bestimmung von Glycerin und
Triglyceriden. 欧州特許第0120440 B1 14. Ameyama, M., Shinagawa, E., Matsushita, K.＆Ad
achi, O. (1981) グルコノバクター・スボキシダンスの
D-グルコースデヒドロゲナーゼ：可溶化、精製および特
徴づけ Agric.Biol.Chem. 45: 851-861 15. Hoenes, J. (1990) Verfahren zu kolorimetrische
n Bestimmung eines Analyten mittels enzymatischer
Oxidation. 欧州特許第0354441 A1 下記の実施例により本発明を更に具体的に説明する。

【００２０】

【発明の実施の形態】

実施例１：コレステロールデヒドロゲナーゼを含む微生
物の培養 1.1 細菌 コレステロールデヒドロゲナーゼは、例えば、下記の生
物から単離し得る。ロドコッカス・エリスロポリス DMS
743 ロドコッカス・エスピーBMTU 3899, DSM 9444 ストレプトミセス ハイグロスコピクス DSM 40771 これらの細菌株を既知の方法に従って培養した。細菌株
の純粋スミアを標準Ｉ栄養寒天プレート（Merck 製品番
号7881) で作製した。これらの純粋スミアで開始して、
予備培養物を標準Ｉ栄養ブロース（Merck 製品番号788
2) で作製した。このために、250 mlの三角フラスコ中
の50mlの栄養ブロースに純粋スミアの単一培養物を接種
し、そしてインキュベーション室中で水平シェーカーで
150rpmで28℃で24時間インキュベートした。これらの予
備培養物は、上記の増殖培地中で主培養物を作製するた
めの開始点であった。このために、2.0 リットルの三角
フラスコ中の増殖培地800 mlに予備培養物15mlを接種
し、そしてインキュベーション室中で水平シェーカーで
150rpmで28℃で60時間インキュベートした。 下記の増
殖培地を使用した。培地の全ての成分を蒸留水に溶解し
た。 増殖培地： Na₂HPO₄ ・2H₂O 5.25 g/l KH₂PO₄ 1.50 g/l NaCl 0.10 g/l MgSO₄ ・7H₂O 0.10 g/l 酵母エキス 0.50 g/l NH₄Cl 1.00 g/l 微量要素（溶液） 1.00 ml/l コレステロール溶液 100.00 ml/l 微量要素（溶液）： MnCl₂ ・4H₂O 0.50 mg/l ZnSO₄ ・7H₂O 1.00 mg/l CuSO₄ ・5H₂O 0.50 mg/l CoCl₂ ・6H₂O 0.50 mg/l NiCl₂ ・6H₂O 0.50 mg/l Na₂MoO₄ ・2H₂O 0.05 mg/l FeCl₃ ・6H₂O 1.50 mg/l コレステロール懸濁液： コレステロール 10.0 g/l トゥイーン80 7.5 g/l 酵素活性は、培養上清み中だけでなく、バイオマス中で
も測定できた。 1.2 菌類 担子菌類(Basidiomyces species)からのchol-DH の例例1.2.1 100 mlの三角フラスコ中に0.1 ％の酵母エキス（Difc
o）、0.2 ％の酒石酸アンモニウム、0.1 ％のKH₂PO₄、
0.05％のMgSO₄ 、0.05％のKCl および１％のグルコース
を含む栄養液20mlに、フラムリナ・ベルチペスBMTU 368
3, DSM 1658 を接種した。この予備培養物を振とうしな
がら28℃で６日間インキュベートした。

【００２１】主培養物として、上記の培養物を、２リッ
トルの三角フラスコ中にpH6.0で0.5％の酵母エキス（Di
fco）、１％の麦芽エキス、0.001 ％のFeCl₃ 、１％の
グルコースを含む栄養液500 mlに添加し、そしてシェー
カーで更に６日間インキュベートした。培養後に、細胞
を濾過により分離した。

【００２２】3.5 mU/ml の酵素活性を培養上清み中で検
出できた。 光度計測方法：２，６−ジクロロフェノール−インドフ
ェノール(DCIP)をレドックス媒介物質として使用して担
子菌類からのchol-DH 活性を測定した。DCIPの還元を60
0 nmにおける吸光度の低下により測定した。

【００２３】使用した試薬： 1. 0.1 MのMOPS/KOH、pH7.5 2. 緩衝液１中の２mM DCIP 3. 緩衝液１中の５％ Naコレート／５％のNaデオキシ
コレート 4. カタラーゼ（BMカタログNo. 0156744) 5. 緩衝液３中に溶解した15mMのコレステロールブランク 試料 緩衝液１ 729 μl 729 μl DCIP (2) 66 μl 66 μl カタラーゼ (4) 5 μl 5 μl 溶液 (3) 50 μl 50 μl 酵素試料 50 μl 50 μl （約10 mU/ml) 混合し、前反応が完結されるまで待つ コレステロール (5) 100 μl 溶液 (3) 100 μl 混合し、A₆₀₀で測定する chol-DH 活性を以下のようにして測定する。

【００２４】１単位は、試験条件（37℃、pH7.0)下で１
分当たりに１μモルのコレステロールをコレステノンに
酸化し、同時に１μモルのDCIP_oxを還元する酵素活性で
ある。

【００２５】

【数１】

【００２６】例1.2.2 フラムリナ・ベルチペスBMTU 3683 の予備培養液100 ml
を例1.2.1 に記載されたようにして培養し、そして肩口
が円錐形をした５リットルの広口の試薬びん中に、0.3
％の酵母エキス（Difco）、１％のポリペプトンM66(Mer
ck）、0.3 ％のKH₂PO₄、0.1 ％のMgSO₄ 、１％のグルコ
ースを含む栄養液1.7 リットルに添加した。培養液を振
とうしながら28℃で６日間インキュベートした。

【００２７】2.7 mU/ml の活性を20 mU/mgタンパク質の
比活性を有する培養上清み中で測定した。上清みを0.1
％のトゥイーン80と混合し、そしてジアフィルトレーシ
ョン(diafiltration)（10 kD 膜、Filtron Ultrasette
（商標))により濃縮した。このプロセスで20mMのトリス
/HCl pH7.5で洗浄した濾液を５cmのDEA 膜（Sartoriu
s）に適用し、0.3MのNaCl (溶離液１）または0.6MのNaC
l (溶離液２）で溶離した。溶離液１は0.24 U/mg タン
パク質の比活性を有する0.7 U の全活性を含み、溶離液
２は1.03 U/mg の比活性を有する0.3 U を含んでいた。

【００２８】例1.2.3 0.3 ％の酵母エキス、１％のポリペプトン（Merck）、
0.3 ％のKH₂PO₄、0.1％のMgSO₄ 、１％の澱粉を含む栄
養液20mlにトラメテス・ベルシカラーBMTU 3107, DSM 9
445 を接種した。28℃における増殖５日後に、培養液を
同培地500 mlに移し、２リットルの三角フラスコ中で更
に５日間振とうした。1.5 mU/ml の活性を培養濾液中で
測定した。

【００２９】例1.2.4 コプリヌス・コマタスBMTU 3680, DSK 1476 を例1.2.4
に記載されたようにして培養した。0.4 mU/ml の活性を
培養濾液中で測定した。 実施例２：コレステロールデヒドロゲナーゼの単離 a)上清みからの単離 ロドコッカス・エスピー (DSM 9444) の醗酵の培養上清
みを50mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.0 に対しジアフィ
ルトレーション（30,000の開放チャンネル膜）にかけ
た。chol-DH をジアフィルトレートから硫酸アンモニウ
ムを用いて沈殿させた。このプロセスにおいて、外来タ
ンパク質を最初の工程（1.2Mの硫酸アンモニウム）で除
去し、次にchol-DH を2.4Mの硫酸アンモニウムで定量的
に沈殿させた。沈殿を10mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.
0 に溶解し、この緩衝液に対して透析した。chol-DH を
ヒドロキシルアパタイト（pH6.8)、フェニルセファロー
ス及びスーパーデックス-200（pH7.0)によるクロマトグ
ラフィーにより精製した。

【００３０】ヒドロキシルアパタイト分離において、カ
ラム(V=40 ml) を最初に10℃及び40ml／時間の流量で緩
衝液Ａ（10mMのKH₂PO₄/KOH; pH6.8 ＋0.3 mMのCaCl₂)で
平衡にした。200 mlの緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂ（350 mM
のKH₂PO₄/KOH; pH6.8 ＋10mMのCaCl₂)の勾配を分離に使
用した。合計200 mgのタンパク質をカラムにかけ、その
試料は５mg/ml のタンパク質濃度を有していた。

【００３１】出発緩衝液（50mMのKH₂PO₄/KOH; pH7.0 、
1Mの硫酸アンモニウム）中で平衡にされたフェニルセフ
ァロース（10mlのカラム）が更に別の精製工程として好
適である。全ての工程は、10℃及び時間当たり１カラム
容積の流量で行った。カラムにタンパク質20mgを装填
し、その試料のタンパク質濃度は２mg/ml であった。溶
離の勾配を、50mlの出発緩衝液および50mlの緩衝液Ｂ
（10mMのKH₂PO₄/KOH; pH7.0; 0.1％のテシット）を用い
て調節した。

【００３２】外来タンパク質の更なる分離を、スーパー
デックス-S200 によるゲル濾過クロマトグラフィーを用
いて行った。カラムを室温で１ml/ 分の流量で200mM の
KH₂PO₄/KOH; pH7.0; 0.1％のテシットで平衡にした。１
ml（ほぼ５mgのタンパク質）の試料容積をアプライした
後、分離を上記の緩衝液で行う。記載された精製スキー
ムを使用して、99％より高いSDS-PAGE（またはRP-HPLC)
純度および2.4 U/mgの比活性〔実施例3a) の活性試験に
基く；ピアス(Pierce)に従ったタンパク質測定、BSA 標
準物質を用いたBCA-アッセイ]並びに９％の収率[硫酸ア
ンモニウム沈殿後の透析物に対して；実施例3a) に記載
されたchol-DH 活性の測定]を得た。 b)バイオマスからの単離 50mMのリン酸カリウム緩衝液pH7.0 を全ての細胞分断の
標準緩衝液（溶解緩衝液）として使用した。

【００３３】ガウリンプレス 低温凍結バイオマス4g（湿潤重量）を、１mg/ml のリゾ
チームを含む溶解緩衝液40ml中で解凍し、30分間インキ
ュベートした。その分断を1000バールで行った。分断中
に放出されたDNA を、0.5 mg/ml のDNase および2.5 mg
/ml のMgSO₄ ・7H₂Oを添加して、25℃で30分間インキュ
ベートすることにより消化した。chol-DH をa)に記載さ
れたようにして遠心分離(SS 34、19,000 rpm、４℃で30
分間）した後、上清みから精製することができる。

【００３４】細胞微粉砕機(IMA粉砕装置Ｓ） 低温凍結バイオマス1g（湿潤重量）を１mg/ml のリゾチ
ームを含む溶解緩衝液中で解凍し、25℃で30分間インキ
ュベートした。細胞微粉砕機中の処理の前に、10mlのガ
ラスビーズ（φ0.25-0.30mm)をその混合物に添加した。
それを4000 rpmで４℃で2 x 4 分間分断した。ガラスビ
ーズを除去した後、破壊した細胞の懸濁液を静かに注い
だ。できるだけ定量的な収率を得るために、ガラスビー
ズを溶解緩衝液で２回洗浄した。細胞破片を遠心分離(S
S 34、19,000 rpm、30分間、４℃）により沈降させた。
chol-DH は、a)に記載されたようにして上清みから精製
することができる。

【００３５】膜抽出 細胞微粉砕機もしくはガウリンプレス分断からの細胞ま
たは全細胞（1gの湿潤重量、低温凍結したもの）の沈降
物を５mlの有機溶媒（酢酸ブチル、ｎ−ブタノールまた
は酢酸エチル）中で洗浄し、続いて溶解緩衝液10mlで洗
浄した。次にchol-DH を、水浴中で攪拌しながら洗浄細
胞を１％のテシットを含む溶解緩衝液５ml中で30分間イ
ンキュベートすることにより細胞エンベロープから抽出
した。抽出調製物を遠心分離(SS 34、19,000 rpm、30分
間、４℃）し、chol-DH をa)に記載されたようにして上
清みから精製することができた。

【００３６】実施例３：chol-DH 活性の測定 酵素試料を実施例2a) に記載されたようにして精製し、
続いてコレステロールを変換するその性質を下記の方法
で評価した。 a) HPLC方法 酵素試験を使用して、酵素反応が特定の期間にわたって
進行し、その後タンパク質変性剤を添加することにより
それを停止する間に生成されたコレステノンを定量化す
ることにより、chol-DH 活性を測定した。その後、生成
物の量を測定し、１分間および酵素溶液の容積単位（＝
容積活性）またはタンパク質の重量単位（＝比活性）当
たりのμモルとして表した。

【００３７】生成されたコレステノンを、chol-DH 反応
を停止した後にHPLC分析により定量化した。 カラム： VYDAC ５Ｃ18−カラム（37℃に温めた） 移動溶媒： 100 ％のメタノール（イソクラチック） 流量： １ml/ 分 検出： 210 nm→コレステロールおよびコレステ
ノン 240 nm→コレステノン 操作時間： 10分間 下記の試薬を使用した。 1. 50mMのメチル−１，４−ベンゾキノン（H₂O 中) 2. 0.4 ％のコレステロール溶液：50mMのリン酸カリウ
ム緩衝液pH7.0 中10％の１−プロパノール、10％のテシ
ット 3. H₂O 再蒸留 4. 氷酢酸 5. 酢酸エチルエッペンドルフ管へのピペット注入 ブランク 試料 酵素試料（30−40 mU/ml¹⁾) 100 μl 100 μl MBQ (1) - 20 μl H₂O (3) 20 μl - コレステロール (2) 100 μl 100 μl 37℃で水浴中で混合し、インキュベートし(10-60分間) 、続いて下記の物質で停 止する 氷酢酸 (4) 15 μl 15 μl 混合し、下記の溶媒を添加する 酢酸エチル 200 μl 200 μl エッペンドルフシェーカーで30分間振とうすることにより抽出し、素早く遠心分 離（エッペンドルフ遠心分離機）し、そしてHPLC分析のために上の酢酸エチル相 を除去する ¹⁾ 実施例3a) に記載のchol-DH 活性 chol-DH 活性を以下のようにして測定する。

【００３８】最初にHPLC方法のための較正線を、コレス
テノン（酢酸エチルに溶解）を使用して確立した。１単
位は、試験条件（37℃、pH7.0)下で毎分１μモルのコレ
ステロールをコレステノンに酸化する酵素活性である。
この場合、chol-DH 活性は、試験混合物とブランク（上
記を参照のこと）とのコレステノン濃度の差から誘導す
る。

【００３９】

【数２】

【００４０】b) 光度計測方法 ２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール(DCIP)
をレドックス媒介物質として使用してchol-DH 活性試験
を行った。 コレステロール＋DCIP_OX→４−コレステン−３−オン＋
DCIP_red DCIPの還元は、600 nmにおける吸光度の低下により測定
することができた。

【００４１】使用した試薬： 1. 50mMのKH₂PO₄/KOH緩衝液(pH7.0) 2. 0.4 ％のコレステロール溶液：50mMのKPP(pH7.0)中
10％の１−プロパノール、10％のテシット 3. 緩衝液 (1)中４mMのDCIP 4. カタラーゼ(BM カタログ番号0156744) 5. 緩衝液 (1)中10％の１−プロパノール／テシット溶
液セミミクロキュベットへのピペット注入 ブランク 試料 緩衝液 (1) 720 μl 720 μl DCIP (3) 25 μl 25 μl カタラーゼ 5 μl 5 μl 酵素試料 100 μl 100 μl （約10 mU/ml²⁾) 混合し、予備反応が完結されるまで待つ 溶液 (5) 150 μl - コレステロール (2) - 150 μl 混合し、A₆₀₀を測定する 2) 実施例3a) に記載の chol-DH活性 chol-DH 活性を、以下のようにして測定する。

【００４２】１単位は、試験条件（37℃、pH7.0)下で毎
分１μモルのコレステロールをコレステノンに酸化し、
同時に１μモルのDCIP_OXを還元する酵素活性である。

【００４３】

【数３】

【００４４】c) 電気化学的方法 chol-DH 活性を、電気化学的測定ステーションにおける
還元されたレドックス媒介物質の定量的測定により測定
する。メチル−１，４−ベンゾキノンをレドックス媒介
物質として使用する。

【００４５】

【化２】

【００４６】生成されたメチルヒドロキノンの測定を24
0mV の測定電圧でダミー（グラファイトペーストで印刷
されたプラスチック支持体）につき行う。下記の試薬を
使用した。 1. 50mMのメチル−１，４−ベンゾキノン（H₂O 中) 2. 0.4 ％のコレステロール溶液：50mMのリン酸カリウ
ム緩衝液(pH7.0)中10％の１−プロパノール、10％のテ
シット 3. H₂O 再蒸留 4. 氷酢酸エッペンドルフ管へのピペット注入 ブランク 試料 酵素試料（0.1-0.2 U/ml³⁾) 50 μl 50 μl MBQ (1) - 10 μl H₂O (3) 10 μl - コレステロール (2) 50 μl 50 μl 37℃で水浴中で混合し、インキュベートし(10-30分間) 、続いて下記の物質で停 止する 氷酢酸 (4) 7μl 7μl ダミーにつき一定（約2.5 分）まで電流を測定する ³⁾ 実施例3a) に記載のchol-DH 活性 chol-DH 活性を以下のようにして測定する。

【００４７】最初に較正線を、標準物質としてメチルヒ
ドロキノンを使用する試験条件のもとに確立した。Δｃ
(MHQ)をブランクと試料とのMHQ 濃度の差から計算す
る。１単位は、試験条件（37℃、pH7.0)下で毎分１μモ
ルのコレステロールをコレステノンに酸化し、同時に１
μモルのメチル−１，４−ベンゾキノンをメチルヒドロ
キノンに還元する酵素活性である。

【００４８】

【数４】

【００４９】Ｆ＝試料の希釈係数 d) 使用したレドックス媒介物質の変化 メチル−１，４−ベンゾキノンは別として、その他のレ
ドックス媒介物質がchol-DH の電子アクセプターとして
適している。chol-DH 活性をHPLC方法により測定した。
chol-DH の人工電子アクセプターとして利用できる種々
のレドックス媒介物質を表１に掲げる。

【００５０】

【表１】 媒介物質 chol-DH ［％］ メチル−１，４−ベンゾキノン (MBQ) 100 ｐ−ベンゾキノン (PBQ) 109 テトラクロロ−ｐ−ベンゾキノン 27 ２，６−ジクロロフェノール−インドフェノール (DCIP) 52 Ｎ，Ｎ−ジメチル−４−ニトロソアニリン (NA) 95 Ｎ，Ｎ−ビス−２（ヒドロキシエチル）ｐ−ニトロソアニリン 45 実施例４：コレステロール濃度の測定 下記の試験順序を用いて、本発明のchol-DH がコレステ
ロール濃度を測定するのに適していることが示された。

【００５１】反応スキーム：

【００５２】

【化３】

【００５３】使用した試薬： 1. 50mMのKH₂PO₄/KOH緩衝液(pH7.0)、1.5 ％の１−プ
ロパノール、1.5 ％のテシット 2. 緩衝液 (1)中４mMのDCIP 3. カタラーゼ(BM カタログ番号0156744) 4. chol-DH 溶液：50mMのKH₂PO₄/KOH緩衝液(pH7.0)中
１ U/ml[最終濃度；実施例3a)に従って測定した] 操作： 吸光度の低下を600 nmで測定する。 測定放射線： 600 nm 経路の長さ： 1.0 cm 試験容積： 1.0 ml 測定温度： 37℃セミミクロキュベットへのピペット注入 緩衝液 (1) 770 μl DCIP (2) 25 μl カタラーゼ (3) 5 μl chol-DH 溶液 (4) 100 μl 混合し、インキュベートし、添加する コレステロール試料 100 μl 混合し、30分後にA₆₀₀を測定する 計算：

【００５４】

【数５】

【００５５】実施例５：種々の酸素飽和におけるchol-D
H 活性 減少した酸素条件、大気条件及び酸素飽和条件下で、HP
LC方法 [実施例3a]によりchol-DH 活性を測定した。試
験混合物を脱気し(10 分間）、続いて窒素でガス流入(1
0 分間）することにより酸素の減少を行った。更に、試
験操作を嫌気チャンバー中で行う。H₂O₂（試験系中0.01
％の最終濃度）およびカタラーゼ（試験系中40 U/ml の
最終濃度）を添加することにより、酸素による飽和をO₂
再生系を用いて行った。

【００５６】酸素は試験に干渉しないことが判明した
（表２）。

【００５７】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】温度ストレス下のchol-DH (1.0 U/ml)の安定性
を示す図。

【図２】種々のpH条件下で25℃で３時間にわたってスト
レスを受けた場合のchol-DH (1.0 U/ml)の安定性を示す
図。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｒ 1:55） (72)発明者 ステファン グロス ドイツ連邦共和国 Ｄ−80337 ミュン ヘン カプチネルシュトラッセ 25エイ チ (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 9/04 C12Q 1/32 C12Q 1/60 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims (7)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 酵素が人工電子アクセプターを使用する
   ことを特徴とする、６０℃で約３０分後に少なくとも９
   ０％の残留活性を有し、約７，０〜８，０のｐＨ範囲で
   最大活性を有し、かつ約５５，０００Ｄａ（ＳＤＳ−Ｐ
   ＡＧＥ）の見掛け分子量を有し、放線菌類または担子菌
   類のグループの微生物から得られる酸素非依存性コレス
   テロール変換酵素。
2. 【請求項２】 ベンゾキノン誘導体、インドフェノール
   誘導体またはニトロソアニリン誘導体を人工電子アクセ
   プターとして使用する請求項１に記載の酵素。
3. 【請求項３】 酵素が電子アクセプターとしてメチル−
   １，４−ベンゾキノン、ｐ−ベンゾキノン、Ｎ，Ｎ−ジ
   メチル−４−ニトロソアニリン、２，６−ジクロロフェ
   ノールーインドフェノールまたはＮ，Ｎ−ビス−２（ヒ
   ドロキシエチル）ｐ−ニトロソーアニリンを使用する請
   求項１または２に記載の酵素。
4. 【請求項４】 ロドコッカス・エスピーＢＭＴＵ ３８
   ９９（ＤＳＭ ９４４４）、ロドコッカス・エリスロポ
   リス（ＤＳＭ ７４３）、ストレプトミセス・ハイグロ
   スコピクス（ＤＳＭ ４０７７１）、フラムリナ・ベル
   チペス（ＤＳＭ １６５８）、コプリヌス・コマタス
   （ＤＳＭ １４７６）またはトラメテス・ベルシカラー
   ＢＭＴＵ ３１０７（ＤＳＭ ９４４３）から得られる
   請求項１〜３のいずれか１項に記載の酵素。
5. 【請求項５】 最初に酵母エキスをベースとする予備培
   養物を製造し、続いて、所望により先に細胞を分断した
   後、酵素を分画沈殿および段階的クロマトグラフィー精
   製により培養上清または細菌のバイオマスから単離する
   ことを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の
   酵素の製造方法。
6. 【請求項６】 ６０℃で約３０分後に少なくとも９０％
   の残留活性を有し、約７，０〜８，０のｐＨ範囲で最大
   活性を有し、かつ約５５，０００Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧ
   Ｅ）の見掛け分子量を有する、放線菌類または担子菌類
   のグループの微生物からの酸素非依存性コレステロール
   デヒドロゲナーゼを使用し、そして所望により、コレス
   テロールエステラーゼを存在させることを特徴とする，
   コレステロール変換酵素の存在下のコレステロールの測
   定方法。
7. 【請求項７】 ６０℃で約３０分後に少なくとも９０％
   の残留活性を有し、約７，０〜８，０のｐＨ範囲で最大
   活性を有し、かつ約５５，０００Ｄａ（ＳＤＳ−ＰＡＧ
   Ｅ）の見掛け分子量を有し、放線菌類または担子菌類の
   グループの微生物から得られる酸素非依存性コレステロ
   ールデヒドロゲナーゼ、安定剤、媒介物質、所望により
   コレステロールエステラーゼ、緩衝液および洗剤を含む
   ことを特徴とするコレステロールの測定用試薬。